マイクロキャリア上での多能性幹細胞の培養
本発明は、多能性幹細胞をマイクロキャリア上で増殖、増量及び分化させる方法を目的とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国特許公開番号第６１／１１６，４４７号（２００８年１１月２０日出願）に対する優先権を請求する。
【０００２】
（発明の概要）
本発明は、多能性幹細胞をマイクロキャリア上で増殖、増量（expansion）及び分化させるための方法を目的とする。
【背景技術】
【０００３】
多能性幹細胞（例えば胚性幹細胞など）は、全ての成体型細胞へと分化する能力を有する。そのため、胚性幹細胞は、疾病、感染又は先天性異常の結果として損傷した器官のための、置換細胞源及び置換組織源になり得る。胚性幹細胞を置換細胞源として用いるのを可能にするには、試験管内で多能性を維持しつつ細胞を増殖することの困難さがネックになっている。
【０００４】
現行の、未分化の胚性幹細胞を培養する方法では、例えばフィーダー細胞層の存在下で胚性幹細胞を培養するなどの、複雑な培養条件が必要とされる。あるいは、フィーダー細胞培養物に曝露することによって得られる培地を、胚性幹細胞の培養に使用する場合もある。これらの方法を用いる培養系では、多くの場合、培養される幹細胞の生物種とは異なる種から得られた細胞（異種細胞）が使用される。加えて、これらの培養系には動物の血清が添加される場合がある。
【０００５】
胚性幹細胞は、研究及び薬剤スクリーニング用に将来性のある資源を提供する。現在のところ、ヒト胚性幹細胞株の大規模培養には問題が多く、大きな課題が提供される。現行の、インビトロでの多能性幹細胞増殖方法は、組織培養用フラスコにおいて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質又はフィーダー細胞でプレコートされた、平面状表面上で実施される。また、平面培養では、表面積が多能性幹細胞の長期増殖をサポートできないという限界性から、頻繁に継代培養する必要がある。マイクロキャリア系の多能性幹細胞培養法は、解決法を提供し得る。マイクロキャリアは表面積対容積比が大きく、したがって平面状表面上での、多能性幹細胞の増殖にまつわる表面積制限を排除する。
【０００６】
例えば、Ｆｏｋらは、未分化のＥＳＣ−マイクロキャリアと凝集体の培養物を増殖させるための、撹拌懸濁培養系を開示する（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５；２３：１３３３〜１３４２．）。
【０００７】
他の例では、Ａｂｒａｎｃｈｅｓらは、表面にコラーゲン層を備えるデキストランマトリックスから構成された、ミクロ孔質のマイクロキャリアであるＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が、スピナーフラスコ中でマウスＳ２５ ＥＳ細胞株の増量を支持する能力について試験を開示する（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６（２００７），ｐｐ．１２１１〜１２２１．）。
【０００８】
他の例では、米国特許第２００７０２６４７１３号は、未分化の幹細胞を懸濁液中で培養するための方法、具体的には容器中のマイクロキャリア上で幹細胞を培養する方法について開示する。
【０００９】
他の例では、国際公開第２００６１３７７８７号は、細胞をマイクロキャリア上で培養するために使用される、マイクロタイタープレートなどの中実支持体に付着させたビーズなどの、微粒子状の物質すなわちマイクロキャリアを含む、スクリーニングツールを開示する。
【００１０】
他の例では、国際公開第２００８００４９９０号は、培養時の幹細胞の付着、生存及び／又は増殖を促進する方法を開示し、この方法は、正電荷支持表面上で幹細胞を培養することを含む。
【００１１】
他の例では、国際公開第２００７０１２１４４号は、支持表面と、支持表面に結合させた合成付着性ポリペプチドと、を含むバイオリアクターを開示し、ここでこの合成付着性ポリペプチドは、胚性幹細胞又は多能性細胞への高い結合親和性により特徴付けられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、多能性幹細胞をマイクロキャリア上で増殖、増量及び分化させる方法を提供する。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞の増殖方法を提供し、この方法は以下の
ａ．多能性幹細胞集団を、第１容量のマイクロキャリアに付着させる工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、第１容量のマイクロキャリア上で培養する工程と、
ｃ．多能性幹細胞を、第１容量のマイクロキャリアから取り外す工程と、
ｄ．多能性幹細胞集団を、第２容量のマイクロキャリアへと付着させる工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤は、マイクロキャリアへのヒト胚性幹細胞の付着と増殖を促進する。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上で、２日間にわたって静置培養により増殖させた、Ｈ９細胞の画像。細胞は、１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ２７６３２（（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を添加した、あるいは不添加の、マウス胚性線維芽細胞馴化培地（ＭＥＦ−ＣＭ）で培養した（それぞれＡ及びＢ）。
【図２】マイクロキャリア上でのＨ９細胞の増殖。Ｈ９細胞を様々なマイクロキャリアに付着させ、３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。Ｐｌａｓｔｉｃマイクロキャリアと、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦマイクロキャリアと、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）と、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリアを使用した（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。３日間の増殖後に、細胞はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）において、マイクロキャリアに対する最も良好な細胞付着性を示した。マイクロキャリアに付着せずに凝集塊を形成した細胞を矢印で示す。
【図３】マイクロキャリア上でのＨ９細胞の増殖。Ｈ９細胞を、３７℃にて固定式プラットフォーム上の６ウェルディッシュ中で、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びＭＥＦ−ＣＭの存在下で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦマイクロキャリア、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリア及びＰｌａｓｔｉｃマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に付着させた。初期細胞播種密度は、０日での値である。３日目及び５日目の細胞数を示す。
【図４】マイクロキャリアに付着後のＨ１細胞の画像。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦマイクロキャリア、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリア、及びＰｌａｓｔｉｃマイクロキャリアに付着させた細胞の３、５及び７日目の画像を示す。細胞は、３７℃にて固定式プラットフォーム上の１２ウェルディッシュ中で、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を含有するＭＥＦ−ＣＭで増殖させた。Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリア及びＰｌａｓｔｉｃマイクロキャリアに結合させた細胞は、独立して凝集塊を形成した（Ｇ、Ｈ中の矢印）。
【図５】マイクロキャリアに付着後のＨ１細胞の画像。Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に付着させた細胞の３、５及び７日目の写真を示す。細胞は、３７℃にて固定式プラットフォーム上の１２ウェルディッシュ中で、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を含有するＭＥＦ−ＣＭで増殖させた。
【図６】マイクロキャリア上でのＨ１細胞の増殖。Ｈ１細胞を、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、及びＰｌａｓｔｉｃマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に付着させ、３７℃にて固定式プラットフォーム上の、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びＭＥＦ−ＣＭが存在している１２ウェルディッシュ中に設置した。初期細胞播種密度は、０日での値である。３、５及び７日目の細胞数を示す。最初の播種密度は、ラインにより示されるように１３，３３３個細胞／ｃｍ2であった。
【図７】様々な濃度のＲｈｏキナーゼ阻害剤存在下での、マイクロキャリア上でのＨ９細胞の増殖。固定式プラットフォーム上の、１２ウェルプレート中で細胞を増殖させ、４日目及び７日目に計数して付着率と増殖率を決定した。Ａ．Ｈ９細胞を１、２．５、５又は１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を含有するＭＥＦ−ＣＭ中で増殖させた。Ｂ．Ｈ９細胞を、０．５、１、２．５又は５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）含有ＭＥＦ−ＣＭ中で増殖させた。
【図８】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤濃度を減少させてＨ１細胞を増殖させた。２日間にわたって、濃度を減少させたＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）又はＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）（１０μＭ／５μＭ、２．５μＭ／０．５μＭ若しくは１．０μＭ／０．５μＭ）、又は０．２５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）の存在下で、Ｈ１ｐ３８細胞を継続的に増殖させた。細胞はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）に付着させた（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ）。細胞を播種後３、５及び７日目に計数した。
【図９】スピナーフラスコ中での、異なった播種密度でのマイクロキャリアへの細胞付着の判定。Ｈ１細胞を、写真の左側に掲載した密度でＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上に播種した；低密度（０．４×１０4個細胞／ｃｍ2）、中間密度（１．２×１０4個細胞／ｃｍ2）又は高密度（３×１０4個細胞／ｃｍ2）。３、５及び７日目に細胞を撮像し、細胞の付着したマイクロキャリアの百分率を判定した（画像に組み込んである）。
【図１０】スピナーフラスコ中のマイクロキャリア上での細胞増殖は、初期播種密度により影響を受ける。Ｈ１細胞を、写真の左側に掲載した密度でＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上に播種した；低密度（０．４×１０4個細胞／ｃｍ2）、中間密度（１．２×１０4個細胞／ｃｍ2）又は高密度（３×１０4個細胞／ｃｍ2）。３、５及び７日目で細胞をマイクロキャリアから解離させ計数した。
【図１１】スピナーフラスコ中での、異なった播種密度でのマイクロキャリア上での細胞増殖率の判定。Ｈ１細胞を、異なる播種密度でＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上に播種した；低密度（０．４×１０4個細胞／ｃｍ2）、中間密度（１．２×１０4個細胞／ｃｍ2）又は高密度（３×１０4個細胞／ｃｍ2）。３、５及び７日目で細胞をマイクロキャリアから解離させ計数した。細胞数の倍数増加を初期播種密度と比較して示す。
【図１２】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させたＨ１細胞を培養の７日目以降に撮像した。細胞には３日目以降はＲｈｏキナーゼ阻害剤不含ＭＥＦ−ＣＭを供給した。細胞はマイクロキャリアに付着したままであった。
【図１３】Ｈ９細胞の増殖及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上のＨ９細胞の解離。Ａ、Ｂ：ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア上（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）で６日間増殖させたＨ９細胞の１０ｘ及び２０ｘ画像。Ｃ：１０分間にわたって０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡでＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）から解離させた細胞の２０ｘ画像。Ｄ：１０分間にわたってＴｒｙｐＬＥ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓでＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）から解離させた細胞の２０ｘ画像。
【図１４】マイクロキャリアからのＨ９細胞の解離。固定式プラットフォーム上のＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上で増殖させたＨ９細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ又は０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで解離させた。細胞数及びそれらの生存率をそれぞれＡ及びＢに示す。
【図１５】マイクロキャリアからのＨ１細胞の解離。スピナーフラスコ中の、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させたＨ１細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はコラゲナーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）で解離させた。細胞数及びそれらの生存率をそれぞれＡ及びＢに示す。
【図１６】ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア上で増殖させたＨ９細胞は、マイクロキャリア間を移動しなかった。
【図１７】継代数４３のＨ９を、スピナーフラスコ中の、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア上で５継代にわたって増殖させた。細胞を２〜３日毎に計数し、細胞が１〜２×１０5個細胞／ｃｍ2に達した時点で継代した。
【図１８】継代数４３のＨ９細胞を、スピナーフラスコ中の、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で、５継代にわたって増殖させた。細胞を２〜３日毎に計数し、細胞が１〜２×１０5個細胞／ｃｍ2に達した時点で継代した。
【図１９】蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）はスピナーフラスコ内で増殖させたＨ９細胞の多能性を示す。Ａ：ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア上で増殖させた継代数４３のＨ９細胞の大多数は多能性タンパク質を発現する。継代数１及び３の細胞は、ＴＲＡ−１−８１については評価しなかった。Ｂ：Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上で増殖させた継代数４３のＨ９細胞の大多数は多能性タンパク質を発現する。継代数１の細胞は、ＴＲＡ−１−８１については評価しなかった。
【図２０】継代数４９のＨ１細胞を、スピナーフラスコ中のＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で、５継代にわたって増殖させた。細胞を２〜３日毎に計数し、細胞が４〜８×１０4個細胞／ｃｍ2に達した時点で継代した。
【図２１】継代数４９のＨ１細胞を、スピナーフラスコ中のＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で、５継代にわたって増殖させた。細胞を２〜３日毎に計数し、細胞が１〜２×１０5個細胞／ｃｍ2に達した時点で継代した。
【図２２】蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）は、スピナーフラスコ内で増殖させたＨ１細胞の多能性を示す。
【図２３】マイクロキャリア上のＨ１及びＨ９細胞の集団倍加。３日目から、以降経過させた日数についての集団倍加回数を算出した（５、６又は７日目）。
【図２４】制限培地中のマイクロキャリア上でＨ９細胞を培養した。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（ＨＩＩ，（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ））又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（Ｃ３，（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ））上で細胞を培養した。細胞を、以下の培地のいずれかで、マイクロキャリア上で培養した；ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）、ＳｔｅｍＰｒｏ又はＭＥＦ−ＣＭ。１０μＭのＹ２７６３２（Ｙ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））又は２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｈ，（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ））を培地に加えた。播種後３、５及び７日目の増殖率を測定した。
【図２５】制限培地中のマイクロキャリア上で、継代数３８のＨ１細胞を培養した。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（ＨＩＩ，（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ））マイクロキャリア又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（Ｃ３，（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ））マイクロキャリア上で細胞を培養した。細胞を、以下の培地のいずれかで、マイクロキャリア上で培養した；ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）、ＳｔｅｍＰｒｏ及びＭＥＦ−ＣＭ。１０μＭのＹ２７６３２（Ｙ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））又は２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｈ，（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ））を培地に加えた。播種後３、５及び７日目の増殖率を測定した。
【図２６】継代数５０のＨ１細胞を、スピナーフラスコ中の、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ））マイクロキャリア上で、制限培地を用いて培養した。Ａ：スピナーフラスコ中のＭＥＦ−ＣＭで３、７又は９日間にわたって増殖させた後の、継代数５０のＨ１細胞の画像。Ｂ：ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中で３、７又は９日間にわたって増殖させた継代数５０のＨ１細胞の画像。矢印が指す細胞クラスターは、マイクロキャリアに付着していない。
【図２７】スピナーフラスコ中で５回継代したヒト胚性幹細胞の分化。Ａ：継代数４３のＨ９細胞を、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で５回継代した。Ｂ：継代数４９のＨ１細胞を、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で５回継代した。両方の細胞型を共にマイクロキャリアから放出させ、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）でコートしたプレートに播種した。８０〜９０％コンフルエントの細胞で、胚性幹細胞が胚体内胚葉へと分化し得るようなプロトコルを実施した。次いで胚体内胚葉マーカーのＣＸＣＲ４を発現している細胞の百分率について、細胞をＦＡＣＳで解析した。ＣＸＣＲ４陽性細胞のパーセントをプロットの右上の角に記載する。
【図２８】マイクロキャリア上での、胚体内胚葉へのＨ１細胞の分化。このＦＡＣＳプロットは、胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４を発現している細胞の百分率を示す。陽性パーセントを右上の角に記載する。処理前に全ての細胞をスピナーフラスコ中のマイクロキャリア上で増量させた。Ａ：分化前に、継代数４０のＨ１細胞を５回継代し、次いで６日間にわたってＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させた。Ｂ：分化前に、継代数４０のＨ１細胞を１回継代し、次いで８日間にわたってＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させた。Ｃ：分化前に、継代数５０のＨ１細胞を１回継代し、次いで６日間にわたってＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上で増殖させた。
【図２９】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上での、胚体内胚葉へのＨ１細胞の分化。Ａ：継代数４０のＨ１細胞を、マイクロキャリア上で８日間にわたって増殖させた。Ｂ：継代数４０のＨ１細胞を、マイクロキャリア上で１１日間にわたって増殖させた。両方の細胞集団を共に、次いで３７℃にて固定式プラットフォーム上で、胚体内胚葉へと分化させた。このＦＡＣＳプロットは、胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４を発現している細胞の百分率を示す。陽性パーセントを右上の角に記載する。
【図３０】胚体内胚葉への、マイクロキャリア上で培養したヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の分化。ＣＸＣＲ４陽性細胞パーセントについてのＦＡＣＳ結果をＹ軸に示す。Ｈ１細胞は、分化前及び分化時にＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で増殖させた。
【図３１】膵臓内胚葉細胞への、マイクロキャリア上で培養したヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の分化。ＣＴ値を、膵臓内胚葉マーカーのＮｇｎ３、Ｎｋｘ６．１及びＰｄｘ１についてＹ軸に示す。Ｈ１細胞を、ＤＭＥＭ−高グルコース（ＨＧ）培地又はＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｆ１２）培地のいずれかの培地中で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（ＨＩＩ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）（Ｃ１）又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（Ｃ３）マイクロキャリア上で分化させた。分化プロトコルは１３日間続いた。
【図３２】膵臓ホルモン産生細胞への、マイクロキャリア上で培養したヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の分化。ＦＡＣＳにより測定した陽性細胞パーセントを、膵臓ホルモンの細胞マーカーのシナプトフィジン、グルカゴン及びインスリンについてＹ軸で示す。Ｈ１細胞を２つの異なる濃度、１０×１０5（１０）又は２０×１０5（２０）で、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（Ｃ−３）マイクロキャリア上に播種した。ＤＭＥＭ−高グルコース（ＨＧ）中で、４〜９日間にわたって細胞を分化させ、更にＨＧ又はＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｆ１２）培地で１０日〜２４日間分化させた。
【図３３】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上での、内分泌細胞へのＨ１細胞の分化。Ｈ１細胞を、膵臓内胚葉（１４日）を経て、膵内分泌細胞へと分化させ、膵内分泌細胞（２１日）をインスリン発現細胞（２８日）へと分化させた。Ｐｄｘ１、グルカゴン及びインスリンの遺伝子発現レベルを測定した（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ）。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）（Ｃ３）上で増殖、分化させたＨ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートした６ウェルディッシュ（平面）上で増殖、分化させた細胞と比較した。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させた細胞についての遺伝子発現の値は３つ組で採った。
【図３４】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上での、胚体内胚葉（ＤＥ）へのＨ９細胞の分化。ＣＸＣＲ４発現のＦＡＣＳプロット。胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４についての陽性細胞パーセントを、右上の角に記載する。Ａ：継代数３９のＨ９細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートした６ウェルディッシュ上で増殖させ、ＤＥへと分化させた。Ｂ、Ｃ：スピナーからのＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上のＨ９細胞の、２つ組サンプルを、１２ウェルディッシュに設置し、固定式プラットフォーム上でインキュベートした。
【図３５】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上での、インスリン発現細胞へのＨ９細胞の分化。Ｈ９細胞を、膵臓内胚葉（１４日）を経て、膵内分泌細胞へと分化させ、内分泌細胞（２２日）をインスリン発現細胞（２９日）へと分化させた。Ｐｄｘ１、グルカゴン及びインスリンの遺伝子発現レベルを測定した（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ）。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）（Ｃ３）上で増殖、分化させたＨ９細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートした６ウェルディッシュ（平面）上で増殖、分化させた細胞と比較した。
【図３６】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で５継代にわたって培養し、次いで記載の平面状基材上に移して培養し、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養したヒト胚性幹細胞での多能性の維持性。パネルＡは、フローサイトメトリーにより検出されたものとして、多能性マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１６０及びＴｒａ−１８１の発現を記す。パネルＢは、リアルタイムＰＣＲにより検出されたものとして、多能性マーカーＮａｎｏｇ、Ｐｏｕ５Ｆ１、ＳＯＸ２及びＺＦＰ４２、並びに分化マーカーＦＯＸＡ２、ＦＯＸＤ３、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４及びＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現を記す。
【図３７】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で５継代にわたって培養し、次いで記載の平面状基材上に移して培養し、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養したヒト胚性幹細胞による、胚体内胚葉形成。パネルＡは、フローサイトメトリーにより検出されたものとして、ＣＸＣＲ４の発現を記す。パネルＢは、リアルタイムＰＣＲにより検出されたものとして、記載のマーカーの発現を記す。
【図３８】ヒト胚性幹細胞をＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で５継代にわたって培養し、次いでＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）平面状基材上に移し培養することによる胚体内胚葉形成。記載の遺伝子の発現はフローサイトメトリーにより測定した。
【図３９】平面状基材上で培養したヒト胚性幹細胞は多能性を維持する。ＴｒｙｐＬＥ（商標）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はコラゲナーゼ処理したＨ１ヒトＥＳ細胞由来のｍＲＮＡサンプルを回収し、ｍＲＮＡの多能性遺伝子発現について解析した。細胞を、１継代の４日間にわたって、ＭＡＴＲＩＧＥＬにてＭＥＦ馴化培地で培養して増殖させ（Ａ）、あるいは１継代にわたって、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）にて、Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＭＥＦ馴化培地で増殖させ（Ｂ）、あるいは２継代にわたって、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）にて、Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＭＥＦ馴化培地で増殖させた（Ｃ）。
【図４０】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、ＰＲＩＭＡＲＩＡにてＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いて分割比１：４、１：８又は１：１６で継代して、７継代を超えてＰＲＩＭＡＲＩＡにて増殖させたＨ１ヒト胚性幹細胞（継代数４５を超える）を、多能性（Ａ）及び胚体内胚葉への分化能（Ｂ）について試験した。対照は、１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬにて増殖させ、コラゲナーゼで処理した、継代数４８のＨ１ヒト胚性幹細胞である。１０ｍＡ＝Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）に１０分曝露して継代。１０ｍＴ＝ＴｒｙｐＬＥ（商標）に１０分曝露して継代。１：４、１：８又は１：１６は継代比を意味する。Ｐ（Ｘ）は、ＭＥＦフィーダーからＰｒｉｍａｒｉａ（商標）プラスチックへと移動させて以降の継代数を意味する。
【図４１】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いてＰＲＩＭＡＲＩＡにて１：４比で継代して、７継代を超えてＰＲＩＭＡＲＩＡにて増殖させたＨ１ヒト胚性幹細胞（継代数４５を超える）を、多能性マーカー及び分化マーカーのｍＲＮＡ発現について試験した。対照は、継代数３７の細胞集団で開始する。１０分Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）＝Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）に１０分曝露して継代。Ｐ（Ｘ）は、ＭＥＦフィーダーからＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）プラスチックへと移動させて以降の継代数を意味する。
【図４２】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いてＰＲＩＭＡＲＩＡにて分割比１：８で継代して、７継代を超えてＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）にて増殖させたＨ１ヒト胚性幹細胞（継代数４５を超える）を、多能性マーカー及び分化マーカーのｍＲＮＡ発現について試験した。対照は、継代数３７の細胞集団で開始する。１０分Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）＝Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）に１０分曝露して継代。Ｐ（Ｘ）は、ＭＥＦフィーダーからＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）プラスチックへと移動させて以降の継代数を意味する。
【図４３】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いてＰＲＩＭＡＲＩＡにて分割比１：１６で継代して、７継代を超えてＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）にて増殖させたＨ１ヒト胚性幹細胞（継代数４５を超える）を、多能性マーカー及び分化マーカーのｍＲＮＡ発現について試験した。対照は、継代数３７の細胞集団で開始する。１０分Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）＝Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）に１０分曝露して継代。Ｐ（Ｘ）は、ＭＥＦフィーダーからＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）ｐｌａｓｔｉｃへと移動させて以降の継代数を意味する。
【図４４】Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）平面状基材（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）にて増殖させ、次いで播種の３日後にマイクロキャリアに移動させた、Ｈ１細胞の画像。Ａ〜Ｃ：Ｈ１細胞をＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上に播種した。Ｄ〜Ｆ：細胞をＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ マイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上に播種した。Ａ、Ｄ：Ｈ１細胞は、マイクロキャリアへと移す前に、１０分間のＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）処理により、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）平面状基材（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）プレートにて継代した。Ａ、Ｅ：Ｈ１細胞は、マイクロキャリア上に移す前に、１０分間のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理を用いて、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）平面状基材（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）プレートにて継代した。Ｃ、Ｆ：継代数４６のＨ１細胞は、マイクロキャリアへと移す前に、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、ＭＡＴＩＲＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートプレートにて継代した。
【図４５】Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）平面状基材（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）にて増殖させ、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアへと移したＨ１細胞の多能性。ＦＡＣＳ解析は、多能性細胞表面タンパク質の発現を示す。細胞を、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）での継代時に３〜１０分間にわたってＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で処理した。
【図４６】Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）にて増殖させ、次いでＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）へと移したＨ１細胞の分化。胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４の細胞表面発現についてのＦＡＣＳ解析。細胞を、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）での継代時に３〜１０分間にわたってＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で処理した。
【図４７】マイクロキャリア上での培養前にセルロース混合エステルからなる平面状基材にて培養したヒト胚性幹細胞のＦＡＣＳ解析。
【図４８】マイクロキャリア上での培養及び分化の前に、セルロース混合エステルからなる平面状基材で培養したヒト胚性幹細胞の、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーの発現に関するＦＡＣＳ解析。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
開示を明確にするために、本発明の「発明を実施するための形態」を、限定を目的とすることなく、本発明の特定の特徴、実施形態、又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【００１６】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルで自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。同様に、幹細胞は、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能細胞へと分化する能力によって、並びに移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全てではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても特徴付けられる。
【００１７】
幹細胞は、それらの発達能力により：（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系統の小集合を生じるが、全て特定の組織、器官又は生理的システム内で生じる能力を有することを意味する多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生できる）、（４）多能性幹細胞と比較して限定された細胞系統の小集合を生じる能力を有することを意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系統を生じる能力を有することを意味する単能性（例えば、精子形成幹細胞）に分類される。
【００１８】
分化は、特殊化されていない細胞（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化誘導された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「コミットした」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「コミットした」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合へと分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に設置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。
【００１９】
培養時の細胞を記載するために、様々な用語が使用される。「維持」は、一般に、細胞増殖及び／又は細胞分裂を促進する条件下で増殖培地に設置した細胞を指し、この細胞は細胞数のより大きな集団をもたらす場合ももたらさない場合もある。「継代」は、細胞増殖及び／又は細胞分裂を促進する条件下で、細胞を１番目の培養容器から取り出し、それらの細胞を２番目の培養容器へと設置するプロセスを指す。
【００２０】
特定の細胞集団又は細胞株は、しばしば継代された回数によって呼称されるか特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団はＰ１０培養と呼ばれる場合がある。初代培養、すなわち組織から細胞を単離した後の最初の培養はＰ０と称される。最初の継代培養後、細胞は二次培養物（Ｐ１又は継代数１）と称される。２回目の継代培養の後では細胞は三次培養物（Ｐ２又は継代数２）となる、といった具合である。当業者であれば、継代期間中に集団は何度も倍加し得るものであり、したがってある培養の集団倍加の回数は継代数よりも大きいことが理解されるであろう。各継代間の期間中の細胞の増量（すなわち集団倍加数）は、限定するものではないが、播種密度、基質、培地、増殖条件、及び継代間の時間などを含む多くの因子に依存する。
【００２１】
「β−細胞系」は、転写因子ＰＤＸ−１と、以下の転写因子：ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、又はＰａｘ６のうちの少なくとも１つに関する遺伝子の発現が陽性である細胞を指す。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、β細胞が挙げられる。
【００２２】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカー：ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞には、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞を含む。
【００２３】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１ α、ＨＮＦ−６、又はＨＢ９。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞には、膵臓内胚葉細胞を含む。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、又はＰＴＦ−１ α。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞には、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ−細胞系の細胞を含む。
【００２５】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を有する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわちＣＸＣＲ４、ＨＮＦ−３ β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１を発現する。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞の集団を指す：ＳＯＸ−７、ＡＦＰ又はＳＰＡＲＣ。
【００２７】
本明細書で使用するとき、「マーカー」は、対象とする細胞内で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルの核酸マーカー又はポリペプチドマーカーは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００２８】
本明細書で使用するとき、「中内胚葉細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７又はＧＡＴＡ−６。
【００２９】
本明細書で使用するとき「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを分泌できる細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「前原始線条細胞」は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す：Ｎｏｄａｌ、又はＦＧＦ８。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「原始線条細胞」は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す：Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４。
【００３３】
マイクロキャリア
「マイクロキャリア」は、足場依存性の細胞を培養する際に、この細胞の付着及び増殖に有用な粒子、ビーズ又はペレットを指す。「マイクロキャリア」は以下の特性を有する：（ａ）（マイクロキャリア又は細胞に、有意なせん断ダメージを引き起こさないような撹拌速度での）懸濁培養で使用可能な程度に十分小さい；（ｂ）中実である、あるいは表面に多孔性コーティングを備える中実コアを有している；及び（ｃ）表面（多孔性キャリアの場合、外側表面と内側表面）が正又は負に帯電し得る。一態様では、マイクロキャリアは全般的に約１５０〜３５０μｍの粒径を有し、かつ約０．８〜２．０ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。有用なマイクロキャリアとしては、限定するものではないが、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ２（登録商標）、又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が挙げられる。
【００３４】
他の態様では、マイクロキャリアは中実キャリアである。中実キャリアは、接着細胞（例えば、付着依存性の細胞）に特に好適である。キャリア粒子はまた、多孔性マイクロキャリアであってもよい。
【００３５】
「多孔性マイクロキャリア」は、付着依存性の細胞を培養する際に、この細胞の付着及び増殖に有用な粒子を指す。多孔性マイクロキャリアは以下の特性を有する：（ａ）（マイクロキャリア又は細胞に、有意なせん断ダメージを引き起こさないような撹拌速度での）懸濁培養で使用可能な程度に、十分小さい；（ｂ）細胞を粒子の内部空間へと遊走させるのに十分な大きさの孔と内部空間とを有する、及び（ｃ）（外側及び内側）表面が正又は負に帯電し得る。一連の実施形態の１つでは、キャリアは（ａ）全般的に約１５０〜３５０μｍの粒径を有し；（ｂ）約１５〜約４０μｍの平均孔開口径を有する孔を有し；及び（ｃ）約０．８〜２．０ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。いくつかの実施形態では、正電荷はＤＥＡＥ（Ｎ，Ｎ，−ジエチルアミノエチル）基により提供される。有用な多孔性マイクロキャリアとしては、限定するものではないが、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １（登録商標）及びＣｙｔｏｐｏｒｅ ２（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。マイクロキャリアは任意の形状であってよいが、通常はほぼ球状の形状であり、かつマクロ若しくはマイクロ多孔性、又は中実性であり得る。
【００３６】
多孔型及び中実型のマイクロ粒子キャリアのいずれもが供給元より市販されている。市販のマイクロキャリアの例としてはＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が挙げられ、これらの両方がＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのデキストラン系マイクロキャリアである。市販の多孔性マイクロキャリアとしては、同様にＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ製品並びにＣｙｔｏｐｏｒｅ製品が挙げられる。Ｂｉｏｓｉｌｏｎ（ＮＵＮＣ）及びＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ（Ｐｅｒｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ）もまた市販されている。更なる態様では、マイクロキャリアはポリカーボネート又はセルロース混合エステルから構成され、あるいはこれらでコートされ得る。
【００３７】
本発明での使用に好適なマイクロキャリアは、天然由来の又は合成的に誘導された材料から構成され得る。例としては、コラーゲン系マイクロキャリア、デキストラン系マイクロキャリア、又はセルロース系マイクロキャリア、並びにガラス、セラミックス、ポリマー、又は金属が挙げられる。マイクロキャリアはタンパク質不含であっても、あるいはタンパク質（例えばコラーゲン）でコートされていてもよい。更なる態様では、マイクロキャリアは、マイクロキャリアへの細胞の結合性を高める、及びマイクロキャリアからの細胞の放出を高める化合物から構成されてもよく、あるいは化合物でコートされてもよく、限定するものではないが、このような化合物としてはポリ（モノステアロイルグリセリドココハク酸）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、リジン、ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ビトロネクチンが挙げられる。
【００３８】
細胞培養物用のマイクロキャリア
マイクロキャリア培養は、足場依存性の細胞（例えばヒト胚性幹細胞）の実用的な高収率培養を可能にする技術である。マイクロキャリアは、特に数ミリリットル〜１０００Ｌを超える範囲の培養容量でヒト胚性幹細胞などの細胞を培養するために開発されてきた。マイクロキャリアは生物学的に不活性であり、撹拌式マイクロキャリア培養法に、丈夫であるが非剛性の基材を提供する。マイクロキャリアは透明であり得、付着した細胞の顕微鏡検査が可能である。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）は、架橋デキストランマトリックスに化学結合させた、変性コラーゲンの薄い層から構成される。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）の変性コラーゲン層は、トリプシン及びコラゲナーゼが挙げられる、様々なプロテアーゼにより消化されやすく、細胞の生存率、機能及び完全性を最大限維持しつつ、細胞をマイクロキャリアから取り外すという性能を提供する。
【００３９】
タンパク質不含マイクロキャリアをヒト胚性幹細胞の培養に使用することもできる。例えば、商品名ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，ＭＩ．）で販売されている、製造及び研究又は調査用途に使用するためのマイクロキャリアは、表面に、マイクロキャリアに正電荷表面をもたらすカチオン性トリメチルアンモニウムが付着している、改質ポリスチレンビーズである。ビーズ直径範囲は、直径約９０〜約２００マイクロメートルである。
【００４０】
マイクロキャリアに基づく細胞培養法は、多くの用途において、下流の加工のし易さを含む、多くの利点を提供した。マイクロキャリアは通常ほぼ球状の形状であり、かつ多孔性であるか中実であるかのいずれかであり得る。細胞付着用のマイクロキャリアの使用は、付着依存性の細胞の増殖を目的とする撹拌槽及び関連するリアクターの使用を容易にした。細胞は、容易に懸濁されたマイクロキャリアに付着した。懸濁可能である必要があることから、マイクロキャリアの物理的パラメーターは制限される。したがって、マイクロキャリアは一般には５０〜２０００マイクロメートルの範囲の中央粒径を有する。一部の用途では、中実型のマイクロキャリアが約１００〜約２５０マイクロメートルの範囲である一方で、多孔型のマイクロキャリアは約２５０〜約２５００マイクロメートルの範囲である。これらの寸法範囲は、多くの付着依存性の細胞を収容するのに十分な程度に大きく、かつ撹拌リアクター内での使用に好適な特性を有する懸濁液を形成するのに十分小さいマイクロキャリアの選別を可能にする。
【００４１】
マイクロキャリア及び同様物などを使用するに当たり考慮される因子は：付着効率、免疫原性、生体適合性、生分解能、コンフルエントに到達するまでの時間、単位表面積あたりの最大付着可能密度が挙げられる付着細胞の増殖パラメーター、必要とされる箇所での脱着技術、及び脱着効率、培養条件の拡張性並びにスケールアップ条件下での培養均一性、スケールアップ脱着手順を成功裏に実施する能力、及びマイクロキャリアが移植に使用可能かどうか、である。これらの検討事項は、マイクロキャリアの表面特性、並びにマイクロキャリアの多孔性、直径、密度及び操作特性により影響を受け得る。
【００４２】
例えば、マイクロキャリアの密度は検討事項である。密度が過剰だと、マイクロキャリアが懸濁液から沈殿する場合があり、あるいは培養容器の底に完全に沈殿したままである傾向があり、ひいてはリアクター内で混合する細胞、培養培地及びガス相の大容量性が乏しくなる場合がある。一方で、密度が低すぎる場合には、マイクロキャリアに過剰な流動性が生じ得る。１．０２〜１．１５ｇ／ｃｍ3の密度が、多くのマイクロキャリアについて一般的である。
【００４３】
リアクターに加えることのできる、マイクロキャリアの小さな直径と粒子容量は、マイクロキャリアに、ローラーボトル法又は付着依存性の細胞を増殖させるための他の方法（例えばプレート法）で見出されるものよりもはるかに大きい実質表面積を提供させる。多孔性マイクロキャリアは、単位容量又は単位重量当たりで更に大きい表面積を提供する。これらの多孔性マイクロキャリアは、付着依存性の細胞の増殖に利用可能な大きい空洞を保有する。これらの空洞は表面積を非常に増加させ、例えば混合時又はガス噴霧時のせん断ストレスなどのような、有害な機械的影響から細胞を保護し得る。
【００４４】
マイクロキャリア表面は、細胞付着性と細胞増殖性を高めるためにテクスチャ加工処理することができる。マイクロキャリア表面のテクスチャ加工は、限定するものではないが、型成形、鋳造、リーチング及びエッチングが挙げられる技術によりなされる。テクスチャ加工表面の特徴の解像度（resolusion）は、ナノスケールであり得る。テクスチャ加工表面は、マイクロキャリア表面上に特異的な細胞設置を誘導するために使用することもできる。多孔性マイクロキャリア内の孔表面も同様に、細胞付着性と細胞増殖性を高めるためにテクスチャ加工することができる。孔表面のテクスチャ加工は、限定するものではないが、例えば型成形、鋳造、リーチング及びエッチングなどの技術によりなされる。
【００４５】
マイクロキャリア表面は、マイクロキャリア表面に特異的な電荷を付与するためにプラズマコートされていてもよい。これらの電荷は、細胞付着性と細胞増殖性を高め得る。
【００４６】
他の実施形態では、マイクロキャリアは、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどの熱応答性ポリマーから構成され、又はこのようなポリマーでコートされ、すなわち電気機械的特性を有する。
【００４７】
多孔性でかつ中実型のマイクロ粒子キャリアのいずれもが供給元より市販されている。市販の中実マイクロキャリアの例としてはＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が挙げられ、これらの両方がＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのデキストラン系マイクロキャリアである。市販の多孔性マイクロキャリアとしては、同様にＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ製品並びにＣｙｔｏｐｏｒｅ製品が挙げられる。Ｂｉｏｓｉｌｏｎ（ＮＵＮＣ）及びＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ（Ｐｅｒｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ）もまた市販されている。
【００４８】
マイクロキャリアには、生物活性剤を含有させることもできる。マイクロキャリアにはまた、細胞の増殖若しくは機能、又は組織環境を制御し得る生物活性剤を含有させることができ、限定するものではないがこれらの因子としては線維芽細胞増殖因子、エリスロポエチン、血管内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、骨形成タンパク質、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子が挙げられる。完全な因子、模倣体又はこれらの活性断片を使用することができる。
【００４９】
マイクロキャリアに第２の細胞種を播種して、多能性幹細胞と共培養することもできる。一実施形態では、２種（又はそれ以上）の細胞型は、個々のマイクロキャリアに均一な割合で又は不均一な割合で付着し得る。２種以上の細胞種を、マイクロキャリア上に同時に播種することができ、あるいはそれらを異なる時点で播種することもできる。特異的な細胞型をマイクロキャリアの特異的な領域へと優先的に付着させるような様式で、マイクロキャリアを処理することができる。更なる実施形態では、単一の又は複数の細胞種が付着しているマイクロキャリアを、培養容器にて、懸濁液の状態で培養された第２の細胞種と共培養することができる。
【００５０】
例えば第２の細胞種としては、上皮細胞（例えば口腔粘膜細胞、胃腸管細胞、鼻粘膜上皮細胞、呼吸器上皮細胞、膣上皮細胞、角膜上皮細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、皮膚線維芽細胞、ケラチノサイト、血管内皮細胞（例えば大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞及び血管内皮前駆細胞（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、肝細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、ストローマ細胞、及び他の軟組織細胞又は前駆細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、島細胞、神経細胞（限定するものではないが、ニューロン、星状細胞、シュワン細胞、腸グリア細胞（enteric glial cells）、オリゴデンドロサイト）を挙げてもよい。
【００５１】
多能性幹細胞
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１種以上、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーを発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が消失し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は、一般にアルカリホスファターゼ活性を有し、この活性は、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆ．）により説明されるように、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、基質としてＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを使用して展開させることにより検出することができる。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
【００５２】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉の全ての細胞に分化し得るものである。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３胚葉からの細胞型のエビデンスについて組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在について評価することにより決定することができる。
【００５３】
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定し、次いで確立された、対応する霊長類種の核型と比較することができる。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、この「正常な核型」は、細胞が正倍数体であり、全てのヒト染色体が存在し、かつ著しく変更されてはいないことを意味する。
【００５４】
多能性幹細胞源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織、胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系が挙げられる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。同様に、例えば成体体細胞などの非多能性細胞由来の多能性幹細胞も好適である。
【００５５】
本発明での使用に好適なマイクロキャリアへの多能性幹細胞の付着
多能性幹細胞は、マイクロキャリアに付着させる前に、当該技術分野の任意の方法により、平面状基材にて培養してもよい。例えば多能性幹細胞は、細胞外マトリックスタンパク質（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ）で処理した平面状基材にて培養することができる。別の方法としては、多能性幹細胞は、フィーダー細胞層を播種した平面状基材にて培養することもできる。
【００５６】
一実施形態では、多能性幹細胞は胚性幹細胞である。別の実施形態では、胚性幹細胞はヒトのものである。
【００５７】
本発明の一態様では、多能性幹細胞は、平面状基材から細胞を放出させるプロテアーゼで、多能性幹細胞を処理することにより、平面状基材から放出される。例えばこのようなプロテアーゼは、コラゲナーゼ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、トリプシン及び同様物などであり得る。
【００５８】
一実施形態では、多能性幹細胞は、この細胞を約５〜約１０分にわたってＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）で処理することにより、マイクロキャリア基材から放出される。
【００５９】
一実施形態では、多能性幹細胞は、この細胞を約１０〜約２０分にわたって０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで処理することにより、マイクロキャリア基材から放出される。
【００６０】
一実施形態では、多能性幹細胞は、この細胞を約５〜約２０分にわたってＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで処理することにより、マイクロキャリア基材から放出される。
【００６１】
一実施形態では、多能性幹細胞は、この細胞を約５〜約１０分にわたって１０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼで処理することにより、マイクロキャリア基材から放出される。
【００６２】
放出された多能性細胞は、特定の密度でマイクロキャリアを含有している培地に加える。一実施形態では、多能性幹細胞は、約４，０００〜約３０，０００個細胞／ｃｍ2マイクロキャリアで播種される。
【００６３】
放出された多能性細胞は、マイクロキャリアを含有している培地に加える。一実施形態では、多能性幹細胞の付着性は、多能性幹細胞をＲｈｏキナーゼ阻害剤で処理することにより増加する。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤はＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）であり得る。あるいは、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤はＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドである。
【００６４】
一実施形態では、多能性幹細胞は約１μＭ〜約１０μＭの濃度のＹ２７６３２で処理される。一実施形態では、多能性幹細胞は約１０μＭの濃度のＹ２７６３２で処理される。
【００６５】
一実施形態では、多能性幹細胞は約０．２５μＭ〜約５μＭの濃度のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドで処理される。一実施形態では、多能性幹細胞は約２．５μＭの濃度のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドで処理される。
【００６６】
マイクロキャリアを含有している培地は撹拌してもよい。本発明で使用するとき、「撹拌」は培養培地の運動であり得る。このような撹拌は、手動で、あるいは例えば固定式プラットフォーム、スピナーフラスコ、及び同様物などのような装置で実施することができる。一実施形態では、マイクロキャリアを含有している培地は、手による運動を用いることで撹拌される。マイクロキャリアと細胞とを含有しているディッシュは、３０秒未満にわたって前後に動かされる。
【００６７】
マイクロキャリアを含有している培地を撹拌してもよい。一実施形態では、マイクロキャリアを含有している培地は、スピナーフラスコの使用により撹拌される。スピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）は、ビーズ型に応じて３０〜７０ＲＰＭに設定した撹拌プレートに設置する。
【００６８】
別の実施形態では、マイクロキャリアを含有している培地は、固定式プラットフォーム（Ｖａｒｉ−ｍｉｘ，Ｂａｒｎｓｔｅａｄ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，Ｉｏｗａ）の使用により撹拌される。固定式プラットフォームの速度は、２秒につき約１回転である。
【００６９】
マイクロキャリア上の多能性幹細胞の分化
一実施形態では、多能性幹細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へとマイクロキャリア上で分化し得る。あるいは、多能性幹細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へとマイクロキャリア上で分化し得る。あるいは、多能性幹細胞は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へとマイクロキャリア上で分化し得る。
【００７０】
別の実施形態では、多能性幹細胞は、マイクロキャリア上で増殖させ、次いで胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと平面状表面上で分化させることができる。あるいは、多能性幹細胞は、マイクロキャリア上で増殖させ、次いで胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと平面状表面上で分化させることができる。あるいは、多能性幹細胞は、マイクロキャリア上で増殖させ、次いで膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと平面状表面上で分化させることができる。
【００７１】
本発明の方法に従って処理された多能性幹細胞は、当該術分野における任意の適当な方法によって他の様々な細胞型に分化させることができる。例えば、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、神経細胞、心臓細胞、肝細胞などに分化させることができる。
【００７２】
例えば、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、国際公開第２００７０３０８７０号に開示される方法に従って神経前駆細胞及び心筋細胞に分化させることができる。
【００７３】
別の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、米国特許第６，４５８，５８９号に開示される方法に従って肝細胞に分化させることができる。
【００７４】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞は、当該技術分野における任意の方法により、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７５】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３、１５３４〜１５４１（２００５年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７６】
例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１６５１〜１６６２（２００４）により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７７】
例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９〜３８（２００７）により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７８】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７９】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群より選択される。本発明での使用に好適なものは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００８０】
他の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、血清は不含でアクチビンＡを含有している培地中で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と共に培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び様々な濃度の血清と共に培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている。
【００８１】
他の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、血清は不含でアクチビンＡを含有している培地中で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と共に培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）に開示されている。
【００８２】
他の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、血清は不含でアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含有している培地中で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドは除去し、細胞をアクチビンＡ及び血清と共に培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【００８３】
他の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、米国特許出願第１１／７３６，９０８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示される方法に従い、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００８４】
他の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、米国特許出願第１１／７７９，３１１号に記載の方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００８５】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞は、当該技術分野における任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００８６】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００８７】
例えば、本発明の方法に従って得られる、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、この胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理し、次いで繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去した後に、レチノイン酸、繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。
【００８８】
例えば、本発明の方法に従って得られる、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、この胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第１１／７３６，９０８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従いレチノイン酸及び少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【００８９】
例えば、本発明の方法に従って得られる、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びエキセンディン４で処理し、次いでＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びエキセンディン４を含有している培地を除去し、続いてエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地で細胞を培養することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【００９０】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有している培地で培養し、次にエキセンディン４を含有している培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有している培地で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【００９１】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びエキセンディン４を含有している培地で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【００９２】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有している培地で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【００９３】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第１１／７３６，９０８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【００９４】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第１１／７７９，３１１号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【００９５】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第１１／７３６，９０８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【００９６】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第１１／７７９，３１１号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【００９７】
膵内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３及びＰＴＦ−１ αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを発現することができる：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。本発明で使用するのに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現している細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【００９８】
本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤＸ１と、以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、又はＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞である。
【００９９】
以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１００】
実施例１：マイクロキャリアに対するヒト胚性幹細胞の付着及び増殖
ヒト胚性幹細胞がマイクロキャリア上に付着しかつ増殖し得るか否かを判定するために、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓにより、継代数５２のＨ９細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートプレートから放出させた。次いでそれらをマイクロキャリアとＭＥＦ−ＣＭと共にインキュベートした。製造元からの取扱説明書に従い、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦ（ＰＮ）、Ｐｌａｓｔｉｃ（Ｐ）、ＰｌａｓｔｉｃＰｌｕｓ（ＰＰ）、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｈ）、コラーゲン（Ｃｏｌ）及びＦＡＣＴ ＩＩＩ（ＳｏｌｏＨｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリアの懸濁液を調製した。毎日の観察結果に基づき、表１はＨ９細胞の、３７℃にて２日経過後の、マイクロキャリアに対する付着と増殖を記載する。試験したほとんどのマイクロキャリアに対して、大部分の細胞は付着及び／又は増殖しなかった。Ｈ９細胞は、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に対しては付着し増殖したが、画像で示される細胞−ビーズ凝集体は、２日間の静置培養後にはより少なくなった（図１Ｂ）。
【０１０１】
マイクロキャリアに対するヒト胚性幹細胞の付着性と増殖性を改善するために、Ｒｈｏ結合コイルドコイル形成タンパク質セリン／スレオニンキナーゼの低分子阻害剤である、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を培地に添加した。具体的には、Ｙ２７６３２，Ｙ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を使用した。１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭは毎日交換した。１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）の存在下で、Ｈ９細胞は試験した全てのマイクロキャリアに付着し、凝集体を形成した（表２）。画像解析によると、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）で増殖させたヒト胚性幹細胞は、他のマイクロキャリアについて試験したヒト胚性幹細胞よりも、付着しかつ増殖しているように見えた。加えてＨ９細胞は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で、より良好にＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に付着した（図１Ａと図１Ｂとの比較による）。
【０１０２】
細胞治療用途のためのヒト胚性幹細胞の増量は、製品需要を満たす必要がある。現行の最も良好な増量技法としては、スピナーフラスコ法とバイオリアクター法が挙げられる。これらの技術のいずれもが、懸濁液中のマイクロキャリアの物理的な移動を必要とする。マイクロキャリア上でのヒト胚性幹細胞の増殖に対する移動効果を判定するために、６又は１２ウェルディッシュを、３７℃のインキュベーター内の固定式プラットフォームに設置した。３日間の増殖後、一部のマイクロキャリアから細胞凝集体が放出され始めた。図２のＡ、Ｂ、Ｄは、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓ、Ｐｌａｓｔｉｃ又はＰｒｏｎｅｃｔｉｎマイクロキャリアから脱着した細胞凝集体を記す。対照的に、図２Ｃの細胞は、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に付着したまま留まりかつ増殖した。実施例４は、Ｖｉａｃｏｕｎｔ Ｆｌｅｘを装備したＧｕａｖａ ＰＣＡ−９６（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で細胞を計数するのに先立つ、脱着法を記載する。マイクロキャリア上の細胞の増殖速度を測定することで、播種時の開始細胞数と比較して、３日目の細胞数が減少していることが明らかになった。これは、５日目に実験が終了するまでの間増量が続けられる細胞の、マイクロキャリアへの初期付着が乏しいことに由来する可能性が高い。Ｈ９細胞は、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に対し、他の種類のビーズと比較して最も速い増殖速度を有していたが、これはＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に対する、細胞のより良好な付着性に由来するものである可能性が高い（図２、３）。このことは、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）が、懸濁液中のＨ９細胞の増殖を支持し得ることを実証する。これは以降に繰り返される節の後に更に実証された。実施例５を参照されたい。
【０１０３】
ラージスケールでの増量のために、Ｈ１ヒト胚性細胞株をマイクロキャリア上での増殖性について同様に試験した。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）がＨ９細胞株の付着に必要とされたことから、この阻害剤はＨ１細胞についても同様に必要とされるであろうと推測された。Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ、Ｐｌａｓｔｉｃ、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦ、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリア（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を、製造元からの取扱説明書に従って調製した。継代数４７のＨ１ヒト胚性幹細胞を、約１３，３３３個細胞／マイクロキャリアｃｍ2（１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ中）で播種した。細胞とマイクロキャリアを、３７℃にて固定式プラットフォーム上の、１２ウェルの組織培養用無処理ディッシュ（１２ウェルあたり１５ｃｍ2）内に設置して、マイクロキャリアと培地に運動させた。３、５及び７日目後に、１つのウェルを画像化し、採取し、計数した。細胞の付着能は、ビーズの種類に依存した。Ｈ９細胞株で観察されたものと同様の結果が、Ｈ１細胞株についても観察された。具体的には、Ｐｌａｓｔｉｃ、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓ又はＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦマイクロキャリア上に播種した細胞は十分に付着せず、及び／又は十分に増殖しなかった（図４）。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上に播種した細胞は十分に付着し、かつ十分に増殖した（図５）。実施例４に従って細胞を脱着し、収率について計数した。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）で増殖させた細胞は、培養７日後に最も大きい細胞数を呈した（図６）。
【０１０４】
実施例２：細胞の付着及び増殖のためのＹ２７６３２及び他のＲｈｏキナーゼ阻害剤の、至適濃度
マイクロキャリアに対するヒト胚性幹細胞の付着と増殖を最も支持するＲｈｏキナーゼ阻害剤濃度を決定するため、以下の実験を実施した。
【０１０５】
継代数４４のＨ９細胞の、１３，３３３個細胞／ｃｍ2の開始アリコートを、１２ウェルの組織培養用無処理プレートの単一ウェル内で、１５ｃｍ2マイクロキャリア上に播種した。３７℃にて固定式プラットフォームに設置する前に、細胞を３７℃にて少なくとも６０分間静置した。細胞を加える前に、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリアを、製造元から指示された通りに調製した。濃度範囲が１０、５、２．５又は１μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２、あるいは濃度範囲が５、２．５、１又は０．５μＭの（Ｓ）−（＋）−４−グリシル−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピンジヒドロクロリド（Ｇｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｈ），Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）を添加したＭＥＦ−ＣＭで細胞を増殖させた。培地を毎日交換し、収率と生存率について、１ウェルの細胞を播種後４日目と７日目に計数した（図７Ａ及びＢ）。全般的に、１０又は５μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）が最も良好な細胞増殖を示し（７日目）、その一方で２．５及び１．０μＭで最も良好な接着性を有しているように見えた（４日目）。濃度１及び０．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）は最も良好な細胞増殖を示し（７日目）、その一方で５μＭで最も良好な接着性を有しているように見えた（４日目）。
【０１０６】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、アポトーシスを促進すると特徴付けられてきたことから、次の用量設定法を試行した。継代数４８のＨ１細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓでＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートプレートから解離させた。次いで１２ウェルの、組織培養用無処理プレートの単一ウェル内の１５ｃｍ2マイクロキャリア上に、細胞を播種した。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリアを、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の量を減少させて試験した：１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を１日目に使用し、次いで０．５μＭを２日目に使用（Ｙ１０／５μＭ）；２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）を１日目に、続いて０．５μＭを２日目に使用（Ｈ２．５／０．５μＭ）；１μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）を１日目に、０．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）を２日目に使用（Ｈ１／０．５μＭ）；あるいは０．２５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）をＭＥＦ−ＣＭに毎日添加（Ｈ０．２５μＭ）。３７℃にて固定式プラットフォームに設置する前に、３７℃にてＨ１細胞及びマイクロキャリアを３時間にわたって４５分毎に撹拌した。３７℃にて固定式プラットフォームでの３、５及び７日目に細胞を計数した（図８）。全般的に、Ｇｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）の最良の濃度は、１日目では１〜２．５μＭであり、２日目では０．５μＭであり、以降では化合物は断った。細胞は、試験した全てのマイクロキャリアについて、これらの濃度のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）で、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）と比較して同様の増殖速度を示した。０．２５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）で細胞を維持した場合、細胞収率は乏しかった。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を最小量で用いることは、プロセス費用を低減することにもつながり、かつ細胞増殖についても有益なものであり得る。同様にこれらのデータは、ヒト胚性幹細胞がマイクロキャリアへの付着性及び増殖性を維持するためには、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は必要とされないことを示す。
【０１０７】
実施例３：マイクロキャリア上での接着及び増殖に対する細胞密度の効果
播種密度の改善は、必要とされる細胞の総数を減少させるための一手段である。適切な播種密度を決定するために、４ｘ対物視野あたりのマイクロキャリア数を計数した。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）を含有している、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭの入った１０ｃｍプレートに、０．４×１０4個細胞／ｃｍ2（低密度）、１．２×１０4個細胞／ｃｍ2（中間密度）、又は３×１０4個細胞／ｃｍ2（高密度）の密度でＨ１細胞を播種した。次いでプレートを、３７℃で６時間にわたり、４５分毎に撹拌した。３７℃にて３０ｒｐｍのスピナーフラスコ（実施例５に記載）内の、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ ５０ｍＬに、細胞及びマイクロキャリアを移した。２４時間後に、５μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ ２５ｍＬを添加した。２４時間後、回転速度を４０ｒｐｍに上昇させた。培養の３日目及び５日目に、７５ｍＬのうちの５０ｍＬを除去し、ＭＥＦ−ＣＭで交換した。６時間、３日、５日及び７日の時点で、スピナーフラスコからアリコートを取って画像を撮影した。細胞の付着したマイクロキャリアの百分率を、図９の画像の右下に記載する。播種後３日目では、細胞でコートされたマイクロキャリアの数は開始播種密度と対応したが、低密度で播種した細胞では、細胞でコートされたマイクロキャリアの数は５日目及び７日目でも増加しなかった。このことは、０．４×１０4個細胞／ｃｍ2が、細胞をマイクロキャリアへと組み込ませて凝集体にするのに十分な細胞数ではないことを意味する。３×１０4個細胞／ｃｍ2では、細胞が付着したマイクロキャリアの数は、１．２×１０4個細胞／ｃｍ2を播種した場合の５日目及び７日目と同様であった（図９）。細胞数を見た場合、高密度での細胞播種では、より多くの細胞がマイクロキャリアに付着していることは明らかである（図１０）。開始播種細胞数と比較しての倍率変化（fold change）の解析では、高密度播種した培養物において、３日目及び５日目に、より多数の細胞が付着していたことを明らかになった（図１１）。７日目には、対照と高密度播種培養物は、それらの開始播種密度から、細胞数について同様の倍率で変化した。これらのデータから、我々は、Ｈ１細胞をマイクロキャリア上に効果的に付着させ、増殖させるためには、１．２×１０4個細胞／ｃｍ2が最小の細胞数であると結論付けた。より高い播種密度へと移行させることは、細胞の増量に必要とされる日数を減少させる助けとなり得る。
【０１０８】
実施例４：マイクロキャリアからの細胞の解離
増殖速度を判定するためには、マイクロキャリアから細胞を解離させる必要がある。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を除去しても、Ｈ１細胞はマイクロキャリアから解離しなかった（実施例２、図１２）。マイクロキャリアから細胞を解離する前に、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上のＨ９細胞を、倍率１０ｘ及び２０ｘで画像解析した（それぞれ図１３Ａ，Ｂ）。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上のＨ９細胞を酵素処理することで、生存細胞を脱着させた（図１３Ｃ，Ｄ及び１４）。３７℃にて固定式プラットフォーム上で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）を含有する６ウェルディッシュ中で、６日間にわたってＨ９細胞を増殖させた。マイクロキャリアに付着させた細胞を１５ｍＬコニカルチューブに設置し、マイクロキャリアを沈殿させた後に培地を吸引除去した。沈殿したマイクロキャリアを４ｍＬのＰＢＳ（マグネシウムイオン及びカルシウムイオン不含）で３回洗浄し、重量沈降によりマイクロキャリアを沈殿させた。ＰＢＳを吸引除去し、１ｍＬのＰＢＳを加えた。細胞を有するマイクロキャリアを、１２ウェルの組織培養用無処理プレートの単一ウェルに移した。プレートを、マイクロキャリアを沈殿させることができるような角度で静止させた。ＰＢＳを吸引除去し、１ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）又は０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡをウェルに加えた。プレートを、３７℃にて固定式プラットフォーム上に、１０〜２０分間にわたって設置した。プレートを取り外し、３ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＭＥＦ−ＣＭをウェルに添加した。培地を激しくピペッティングし、細胞を放出させた（図１３Ｃ，Ｄ）。顕微鏡下でのマイクロキャリアの観察は、細胞がマイクロキャリアから脱着したことを決定づけた。次いで細胞を、２００×ｇで５分間にわたって遠心した。培地を吸引除去し、ペレットを１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＭＥＦ−ＣＭ培地に再懸濁した。次いでＶｉａｃｏｕｎｔ ｄｙｅを用いて、Ｇｕａｖａ ＰＣＡ−９６（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で細胞を計数した。具体的には、培地で適切に希釈した２００μＬ容量の細胞を、２μＬのＶｉａｃｏｕｎｔと共に１０分間にわたってインキュベートした。生存率と細胞数を決定した（図１４）。ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ及びトリプシン／ＥＤＴＡの両方が、細胞をマイクロキャリアから効率的に解離した。
【０１０９】
ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓがマイクロキャリアから細胞を放出し、及びこれはＧＭＰ製品として利用可能なものであることから、他の可能性のある解離剤、具体的にはコラゲナーゼ及びＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）について試験を行った。継代数４８のＨ１細胞を、スピナーフラスコ中（実施例５）で１０日間にわたって増殖させた。次いでマイクロキャリアを回収し、５０ｍＬのコニカルチューブに移した。細胞を上記のようにＰＢＳで洗浄し、１２ウェルのプレートに移した。ＰＢＳを吸引除去し、１ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はコラゲナーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）をウェルに添加して、３７℃にて固定式プラットフォームに５〜１０分にわたって設置した。細胞／マイクロキャリアをＤＭＥＭ／Ｆ１２に激しく再懸濁し、次いで解離した細胞とマイクロキャリアを５０ｍＬのコニカルチューブ上で４０μｍのセルストレイナーを通して濾過した。ウェルを追加の培地２ｍＬで洗浄し、同様にセルストレイナーに加えて、２００×ｇで５分にわたって遠心した。次いで細胞を１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁し、上記のように細胞を計数するために希釈した。細胞生存率は、試験した全ての酵素で類似していた。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）とＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓは、５分及び１０分のインキュベーション後に同様の数の細胞を放出した（図１５）。これは、マイクロキャリア上のヒト胚性幹細胞のための細胞解離剤としての、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）とＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓの適合性を実証する。
【０１１０】
実施例５：マイクロキャリア上の未分化の多能性幹細胞の増殖
マイクロキャリア上の細胞を増量させるためには、細胞を、マイクロキャリアから脱着又は酵素的に解離させ、かつ新しいマイクロキャリアへと再付着させることができなければならない。マイクロキャリア上での一般的な細胞増殖方法は、細胞の脱着及び再付着特性に依存する。以下の実験は、これがヒト胚性幹細胞の特徴ではなかったことを示す。具体的には、継代数４３のＨ９細胞をＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上に播種し、１２５ｍＬのスピナーフラスコ中でインキュベートした（以下を参照のこと）。フェノールレッドが培地中に存在し、かつＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアにより取り込まれた（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）。８日間の増殖後に、マイクロキャリア上の細胞のアリコート１０ｍＬを、フェノールレッド不含ＭＥＦ−ＣＭと、４４０ｍｇのＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアと、５μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）とを含有している、新しいスピナーフラスコに設置した。３７℃にて３０ｒｐｍ回転でのインキュベーションの５日目に、マイクロキャリアを取り出して画像を得た（図１６）。黒っぽいマイクロキャリアは、フェノールレッドを含有している培地で増殖したＨ９細胞で覆われた、マイクロキャリアを示す。色味の明るいマイクロキャリアは、新しく加えたマイクロキャリアである。Ｈ９細胞が脱着し、新しいマイクロキャリアに再付着することが見込まれていたが、細胞は再付着する代わりに新しいマイクロキャリアと共に凝集体を形成した。色味の明るくないマイクロキャリアには細胞が付着しており、この細胞が黒っぽいマイクロキャリアとの凝集体を形成していないことは、細胞はマイクロキャリアから脱着しかつマイクロキャリアへと再付着することはできなかったことを示唆する。マイクロキャリア上の細胞の増殖を伝播させるためには、細胞をマイクロキャリアから酵素的に解離させる必要があった（実施例４を参照されたい）。
【０１１１】
現在では、ヒト胚性幹細胞をマイクロキャリア上で増殖させる方法が確立されているので、どのようにしてヒト胚性幹細胞をラージスケールのスピナーフラスコ中で増殖させるかを決定する必要がある。スピナーフラスコは、高密度系での細胞の増量を可能にする。これは空間の節約であり、バイオリアクター内で細胞を増量させるための第１工程であると考えられる。ヒト胚性幹細胞の、スピナーフラスコ中で増殖する能力について試験するために、継代数４３のＨ９細胞を１２５ｍＬのスピナーフラスコ中に播種した。細胞は、まず１０ｃｍプレート中でマイクロキャリアに付着させてからスピナーフラスコに移した。具体的には、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓと共に３７℃で５分間インキュベートすることで、Ｈ９細胞を２枚の６ウェルディッシュから放出させた。細胞はコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）で処理し、１：３０増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートプレートに播種した後に、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで処理した。細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁し、Ｖｉａｃｏｕｎｔを用いてＧｕａｖａ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで計数した。遠心後に、３×１０6個の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭと、製造元からの取扱説明書に従って調製した２５０ｃｍ2のＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）とを含有している、１０ｃｍのプレートに播種した。ディッシュを３７℃に設置し、穏やかに回転させ、４．５時間にわたって４５分毎に一度撹拌した。次いで細胞、マイクロキャリア及び培地を１２５ｍＬのスピナーフラスコに移した。次いでスピナーフラスコには１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ５０ｍＬを充填し、３７℃にて撹拌プレートに４０ｒｐｍで設置した。翌日、培地を交換し、５μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ７５ｍＬで充填した。撹拌速度は７０ｒｐｍに上昇させた。培地にはＹ２７６３２化合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を加えずに１日おきに交換した。実施例４に記載の方法に従って細胞を継代し、３×１０6個の細胞を、２５０ｃｍ2の新しいマイクロキャリアに再播種した。培養物は、１〜２×１０5個細胞／ｃｍ2コンフルエントに達したときに継代した。この操作を５継代実施した（図１７）。各継代での多能性マーカー発現では、細胞の８０〜９５％が多能性マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ３、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１を発現していたと評価された（図１９Ａ）。同様の実験を、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で、継代数４３のＨ９細胞についても実施した（図１８，１９Ｂ）。全般的に、細胞はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリアのどちらでも良好に増殖し、かつ多能性を保持した。スピナーフラスコ中で５回継代した後に核型解析を実施したところ、細胞の１．５％で、１２番染色体の異常なトリソミーが示された。これらの細胞は、実験の終了時には継代数５０付近であることから、観察されるこのような異常は一般的に生じる恐れがある。細胞継代数が低い状態で開始した場合に、このような仮定が生じるか試験した。
【０１１２】
継代数４８と継代数４９のＨ１細胞株についても、同様の実験を実施した。回転速度と播種密度を除き、全てのパラメーターは同様のままであった。スピナーフラスコの回転速度は、初日はオーバーナイトで３０ｒｐｍであり、以降の日では４０ｒｐｍに上昇させた。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）の場合の播種密度は約１１，０００個細胞／ｃｍ2であった一方で、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）の場合の播種密度は約７，０００個細胞／ｃｍ2であった。播種した細胞数はスピナーフラスコあたり３×１０6個細胞で一定であった。マイクロキャリアの重量は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）の場合、１００ｍｇで一定であった。Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）がＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアを上回る１つの利点は、それらのより大きな表面積である。図２０及び２１は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）のそれぞれの上でのＨ１細胞の増量を示す。細胞は５回の継代にわたって多能性を維持していた（図２２）。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上のＨ１細胞の核型解析は、試験した細胞の１０％で、Ｙ染色体に重複があることを明らかにした。これらのＨ１細胞はマイクロキャリア上に継代数４８で継代され、その後５回継代された後に解析された。平面状表面上のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）で増殖させた継代数５５のＨ１細胞は、正常な核型を有していた。３日間と経過日数間（５、６又は７日間）との間での、これらの細胞の倍加速度解析では、全般的に倍加時間に変化は見られなかった（図２３）。Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア上で増殖させたＨ１細胞及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上で増殖させたＨ９細胞は、ほとんど一定の倍加時間を示した（表３）。
【０１１３】
実施例６：制限培地中のマイクロキャリア上でのヒト胚性幹細胞の増殖
治療用製品を製造するためには、ヒト胚性幹細胞培養培地からいずれの動物成分も除外されていることが好ましい。現在、ヒト胚性幹細胞は、マウス胚性線維芽細胞を用いて馴化させた培地（ＭＥＦ−ＣＭ）中の、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）上で維持されている。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）及びＭＥＦ−ＣＭのいずれもがマウス細胞由来である。加えて、ＭＥＦ−ＣＭは高価であり、培地を生成するのに時間がかかる。ヒト胚性幹細胞が、制限培地を含むマイクロキャリア上で維持され得るかを判断するために、Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）又はＭＥＦ−ＣＭ中の、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）又は２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）の存在下で、Ｈ９細胞をＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア上に播種した。細胞を、３７℃にて固定式プラットフォーム上の１２ウェルディッシュ中に設置した。細胞を３、５及び７日目に計数した。継代数３９のＨ９細胞はＭＥＦ−ＣＭ中で、どちらの種類のビーズ上でも増殖し、一般的な増量特性を示した（図２４）。ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中で増殖させた同様の細胞は、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）の存在下で、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で良好に増殖したが、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア上では低い増殖率を呈した。２０回にわたって継代することでＳｔｅｍＰｒｏ培地に馴化された、継代数６４のヒト胚性幹細胞株Ｈ９（継代数６４のＨ９）細胞は、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）の存在下で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）のいずれでも良好に増殖した。驚くべきことに、これらの細胞は、２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）の存在下では、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上では良好には増殖しなかった。したがって、マイクロキャリアの種類、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、及び培地の全てが、ヒト胚性幹細胞の増殖能を決定する役割を果たす。
【０１１４】
継代数３８のＨ１ヒト胚性幹細胞を、１２ウェルのディッシュに、ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）又はＭＥＦ−ＣＭ中のＲｈｏキナーゼ阻害剤の、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）又は２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）又はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアのいずれかに播種した。細胞を３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。細胞を３、５及び７日目に計数した。ＭＥＦ−ＣＭ中でＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）の存在下で増殖させた細胞は、両方の種類のマイクロキャリアで一般的な増量特性を示したが、Ｇｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）の存在下では、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）に対して乏しい増殖率を示した（図２５）。ｍＴＥＳＲ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）は、どちらのＲｈｏキナーゼ阻害剤の存在下でも、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ マイクロキャリア上でＨ１細胞を増殖させたが、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリアに対しては低い増殖率が示された。
【０１１５】
ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアで良好に増殖した所与の継代数５０のＨ１細胞のうちの３×１０6個を、２５０ｃｍ2のＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアに播種した。３７℃で、５時間にわたって４５分ごとに手で撹拌しながら、１０ｃｍ2のディッシュ中でインキュベートした。１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を添加したｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を、１日おきに交換した。この操作を、ＭＥＦ−ＣＭで増殖させた細胞についても並行して実施した（実施例５）。ＭＥＦ−ＣＭで増殖させた細胞とは異なり、ｍＴＥＳＲ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）で増殖させた細胞は７日目にＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアから脱着し始めた（図２６Ａ対２６Ｂ）。このことは、ヒト胚性幹細胞にＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に対する付着性及び増殖性を維持させるためには、ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）に追加の成分を加える必要があることを示す。
【０１１６】
実施例７：マイクロキャリア上でのヒト胚性幹細胞の分化
ヒト胚性幹細胞がマイクロキャリア上で増量可能であることから、これらの細胞の分化の可能性が決定されるべきである。継代数４３のヒト胚性幹細胞株Ｈ９の細胞を、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で５回継代した。５回目の継代で、細胞をマイクロキャリア上で６日間にわたって増殖させた後、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓを用いてマイクロキャリアから解離させた（実施例４を参照されたい）。次いで細胞を、１：３０ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）：ＤＭＥＭ／Ｆ１２コートしたプレートに設置した。細胞がプレート上で８０〜９０％コンフルエントに達した後、細胞を分化誘導剤に曝露させた。１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）と、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ）と、８ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）とを添加した、２％ウシ血清アルブミンフラクションＶ（脂肪酸不含）（ＦＡＦ ＢＳＡ，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｏｈｉｏ）含有ＲＰＭＩで細胞を２日間にわたって処理することで、胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化を実施した。細胞は、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）と、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）とを添加した、２％ ＦＡＦ ＢＳＡ含有ＲＰＭＩで更に２日にわたって処理した。培地は毎日交換した。胚体内胚葉の細胞表面マーカーのＣＸＣＲ４についてＦＡＣＳ解析を実施したところ、８７％の細胞がマーカータンパク質を発現していたことが示された（図２７Ａ）。継代数４９のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で５回継代して増殖させて、同様の実験を実施したところ、マイクロキャリア上で分化した細胞の９１％がＣＸＣＲ４を発現していたことが明らかになった（図２７Ｂ）。このことは、マイクロキャリア上で増殖させた細胞は、インスリン産生細胞に分化するための第１段階である、胚体内胚葉へと分化できるということを実証している。
【０１１７】
３種のマイクロキャリア、すなわちＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）は、Ｈ１細胞を付着させ、増殖させる。これらの３種のマイクロキャリア上で、Ｈ１細胞の分化を実施した。スピナーフラスコ中のこれらのマイクロキャリア上で、様々な継代数（１〜５回）で細胞を増殖させた（実施例５）。マイクロキャリアと細胞との懸濁液の、６〜８日間にわたる継代後のアリコートを、６又は１２ウェルのプレートに移した。１２ウェルプレートあたり合計１５ｃｍ2のマイクロキャリアと細胞を、あるいは６ウェルプレートあたり３０ｃｍ2マイクロキャリアと細胞を移した。次いで分化誘導培地をプレートのウェルに加え、このプレートを３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）と、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ）と、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）とを添加した、２％ウシ血清アルブミンフラクションＶ（脂肪酸不含）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｏｈｉｏ）含有ＲＰＭＩで、２日間にわたって細胞を処理することで、胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化を実施した。１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）と、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）とを添加した２％ ＦＡＦ ＢＳＡ含有ＲＰＭＩで、更に２日間にわたって細胞を処理した。培地は毎日交換した。胚体内胚葉の細胞表面マーカーのＣＸＣＲ４について、ＦＡＣＳ解析を実施した（図２８）。胚体内胚葉への分化を支持してＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア、及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリアで細胞を増殖させたものではそれぞれ８７％と９２％であった一方で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアはこの実験で試験した他のマイクロキャリアと同程度には分化を支持しなかった（４２％）。
【０１１８】
細胞密度がマイクロキャリア上の細胞の分化に影響を及ぼすか否かを判断するために、継代数４０のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、スピナーフラスコ中のＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で、８日間又は１１日間のいずれかで増殖させた。次いで約１５ｃｍ2当量のマイクロキャリアと細胞とを６ウェルディッシュに設置し、固定式プラットフォーム上に設置した。次いで細胞を、上記のような胚体内胚葉分化誘導培地中でインキュベートした。４日後に、ＣＸＣＲ４発現について細胞をＦＡＣＳにより解析した。スピナーフラスコ中で６日間にわたって増殖させた細胞の８７％がＣＸＣＲ４を発現していた一方で、スピナーフラスコ中で１１日間にわたって増殖させた細胞では、５６％がＣＸＣＲ４を発現していた（図２９）。このことは、分化させる前の細胞の培養日数が重要であることを実証し、具体的には、細胞密度が高すぎる場合には、細胞が効率的に分化できなくなる場合があることを実証する。
【０１１９】
付着性と増殖性が十分であると判断された３種のマイクロキャリアの全てで、ヒト胚性幹細胞が膵臓内胚葉細胞へと分化し得るか否かを判断するために、継代数４１のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（継代数４１のＨ１）を、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上に播種した（実施例１を参照されたい）。製造元の取扱説明書に従ってマイクロキャリアを調製した。３０ｃｍ2のマイクロキャリアを、低接着性の６ウェルプレートに移した。２枚の１０ｃｍ2プレートから、製造元からの取扱説明書に従って、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓによりＨ１細胞を解離させた。１ウェルあたり５×１０5個細胞で、細胞を播種した。実施例３に記載の方法に従って、ビーズへの細胞の付着を実施した。簡潔に述べると、細胞とマイクロキャリアを、３７℃にて、１０μＭのＹ２７６３２添加ＭＥＦ馴化培地中で４時間にわたって、１時間ごとに簡単に撹拌しながらインキュベートした。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア及びＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア上の細胞を、固定式プラットフォーム上に設置した。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上の細胞は、一晩静置した。以降、培地はＹ２７６３２不含の培地で毎日交換した。
【０１２０】
この実験では、乏しい付着性に起因して、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）プレートの細胞の大多数が、もはやマイクロキャリアに付着していなかった。しかしながら、より長い付着時間及び／又はより低速に固定された速度では、細胞付着性は改善され得る。７日後に、２％ ＢＳＡ（脂肪酸不含（ＦＡＦ））（Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）含有ＲＰＭＩと、以下の増殖因子：ｂＦＧＦ（８ｎｇ／ｍＬ，（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ））、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ，（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ））、Ｗｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））とを用い、細胞を胚体内胚葉へと分化させた。４日間にわたる第２の分化を通して、Ｗｎｔ３ａは不含の同様の培地で細胞を処理した。４日後の、２つ組試料のＦＡＣＳ解析では、７７〜８３％の細胞でＣＸＣＲ４レベルが陽性だったことが明らかになった。胚体内胚葉発現は、異なるマイクロキャリア上で増殖させた細胞間で、等価であった。図３０を参照されたい。
【０１２１】
次いで、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ））、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、２％ ＦＡＦ ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥＭ−ＨＧにより、細胞を更に２日間にわたって分化させた。これを、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ））、レチノイン酸（２μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、１％ Ｂ−２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥＭ−ＨＧにより、４日間にわたって処理した。次いで、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＤＡＰＴ（１μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（１μＭ，（Ａｘｘｏｒａ，ＣＡ））を添加した、１％ Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１３日，膵臓内胚葉，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ））含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥＭ−ＨＧにより、細胞を３日間にわたって分化させた。図３１は、Ｑ−ＰＣＲにより、膵臓特異的な遺伝子のＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＮＧＮ３の発現レベルを示す。ＣＴ値は、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア上で分化させた細胞が、効率的に分化せず、必要なβ細胞前駆体細胞マーカーを発現しないことを明瞭に示す。細胞は、３種のマイクロキャリアの全てで効率的に胚体内胚葉へと分化したが、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアでは、膵臓前駆体への更なる分化は効率的ではなかった。
【０１２２】
ヒト胚性幹細胞が、インスリン産生細胞へと更に分化し得るか否かを判断するために、継代数４５のＨ１細胞をＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させ、上記と同様に分化させた。簡潔に述べると、製造元からの取扱説明書に従って、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓにより、１０ｃｍ2プレートからＨ１細胞を解離させた。６ウェルプレートのウェルあたり１又は２×１０6個細胞で細胞を播種した。ビーズへの細胞の付着を実施例３に記載する。簡潔に述べると、細胞とマイクロキャリアとを、１０μＭのＹ２７６３２を添加したＭＥＦ馴化培地中で、３７℃にて４時間にわたって、１時間ごとに簡単に撹拌しながらインキュベートした。次いで細胞を、一晩静置してインキュベートした。２日目に、培地を５μＭのＹ２７６３２を添加したＭＥＦ馴化培地に交換し、プレートを固定式プラットフォーム上に設置した。以降毎日、培地をＹ２７６３２は不含の培地と交換した。５日目に、培地を胚体内胚葉分化誘導培地（以下の増殖因子：ｂＦＧＦ（８ｎｇ／ｍＬ，（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ））、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ，（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ））、Ｗｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））を添加した、２％ ＢＳＡ（脂肪酸不含（ＦＡＦ））（Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）含有ＲＰＭＩ）と交換した。分化誘導の２日目及び３日目に、Ｗｎｔ３ａは不含の同様の培地で細胞を処理した。３日後の、２つ組試料のＦＡＣＳ解析では、９７〜９８％の細胞でＣＸＣＲ４レベルが陽性だったことが明らかになった。次いで、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）），ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、２％ＦＡＦ ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）含有ＤＭＥＭ−高グルコース（ＨＧ）により、更に２日間にわたって細胞を分化させた。これを、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ））、レチノイン酸（２μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、１％ Ｂ−２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）含有ＤＭＥＭ−ＨＧにより、４日間にわたって処理した。次いで、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＤＡＰＴ（１μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（１μＭ，（Ａｘｘｏｒａ，ＣＡ））を添加した、１％ Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）含有ＤＭＥＭ−ＨＧ又はＤＭＥＭ−Ｆ１２により、細胞を３日間にわたって分化させた。続いてこれを、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（１μＭ，（Ａｘｘｏｒａ，ＣＡ））を添加したＤＭＥＭ−ＨＧ又はＤＭＥＭ−Ｆ１２中で、７日間にわたって分化させた。最終分化はそれぞれＤＭＥＭ−ＨＧ又はＤＭＥＭ−Ｆ１２で５日間だった。合計２４日間にわたる分化が、膵臓内分泌ホルモンの発現を誘導する。図３２は、このエンドポイントの細胞の、ＦＡＣＳ解析結果を示す。播種密度が最も高く、かつ６〜２４日間にわたってＤＭＥＭ−ＨＧで分化させた細胞が、最も高レベルのインスリン発現を有していた（図３２）。
【０１２３】
別の方法としては、ヒト胚性幹細胞がインスリン産生細胞へと分化し得るか否かを判断するために、７日間にわたって継代数４４のＨ１細胞を、スピナーフラスコ中のＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で増殖させた（実施例５を参照されたい）。１５ｃｍ2／ウェルで、細胞とマイクロキャリアとを１２ウェルプレートに移し、これを３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。ＲＭＰＩの代わりにＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加して、細胞を上記のように胚体内胚葉へと分化させた。４日後のＦＡＣＳ解析では、３つ組解析において、７５〜７７％の細胞でＣＸＣＲ４レベルが陽性だったことが明らかになった。次いで、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ））、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、２％ウシ血清アルブミンフラクションＶ（脂肪酸不含）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２により、細胞を更に３日間にわたって分化させた。これを、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ））、レチノイン酸（２μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、１％ Ｂ−２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２により、４日間にわたって処理した。次いで、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ネトリン４（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＤＡＰＴ（１μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（１μＭ，（Ａｘｘｏｒａ，ＣＡ））を添加した、１％ Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１５日，膵臓内胚葉，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ））含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２により、細胞を３日間にわたって分化させた。続いてこれを、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（１μＭ，（Ａｘｘｏｒａ，ＣＡ））を添加した、１％ Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２１日，膵内分泌細胞，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ））含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で６日間処理した。７日間にわたる最終処理では、１％ Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２８日，インスリン発現細胞，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ））を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いた。図３３は、Ｑ−ＰＣＲにより、膵臓特異的な遺伝子のインスリン、Ｐｄｘ１及びグルカゴンの発現レベルを示す。マイクロキャリアについてのデータは、前出のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートした平面状表面で分化させた継代数４２のＨ１細胞と比較する。マイクロキャリアで分化させた細胞では、これらの膵臓特異的遺伝子の発現レベルは、平面状表面で分化させた細胞と比較して同様であるか、あるいはそれよりも勝っている。
【０１２４】
同様の実験を、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で及び拡張型スピナーフラスコ中で継代した、継代数３８のＨ９細胞で実施した。１５ｃｍ2のマイクロキャリアと細胞とのアリコートを１２ウェルプレートに設置し、分化誘導培地と共に、固定式プラットフォーム上に設置した。これを、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートした６ウェルプレート上に設置した、細胞と比較した。ＲＰＭＩとサプリメント（supplements）の中で胚体内胚葉への細胞の分化を実施したところ、平均して８３％の細胞がＣＸＣＲ４を発現していたのに対して（試料は２つ組）、平面状基材上では７２％の細胞がＣＸＣＲ４を発現していた（図３４）。更に膵臓内胚葉（１５日）、膵内分泌細胞（２２日）及びインスリン発現細胞（２９日）への分化では、マイクロキャリア上で増殖させた細胞と、平面状基材上で増殖させた細胞との間では、インスリン及びグルカゴンについて同様の発現レベルが示された（図３５）。培地成分は、更に１日内分泌細胞分化誘導成分で処理した、上記のＨ１分化誘導実験について列挙したものと同一のものであった。インスリン発現ステージでは、細胞は２２日のものと比較してインスリン発現の驚くべき減少を示した。この減少は、マイクロキャリア試料及び平面試料の双方で指摘されたことから、付着基材によるものである可能性は低い。このことは、Ｈ９細胞が、マイクロキャリア上でも少なくとも膵内分泌細胞へと良好に分化し得るということを示す。
【０１２５】
全般的に、２種の異なるヒト胚性幹細胞株のＨ１とＨ９は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で膵内分泌細胞へと分化でき、これらの細胞をラージスケールの培養系で増量及び分化させることの可能性を実証する（図１７、２１、３３及び３５）。ヒト胚性幹細胞は、少なくとも３種のマイクロキャリアビーズに付着及び増殖できたが、この細胞は少なくとも胚体内胚葉へと分化し得る（図２８）。これらの結果は、治療用途のためにヒト胚性幹細胞を増殖させ分化させ得る方法を実証する。
【０１２６】
実施例８：３Ｄマイクロキャリア系培養法で単独の細胞として継代したヒト胚性幹細胞は、多能性を維持しつつ、ＥＣＭ不含表面に移して培養することができる。
Ｈ１ヒト胚性幹細胞を、実施例５に記載の方法に従ってマイクロキャリア上で培養した。細胞をマイクロキャリアから取り外し、３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを添加したＭＥＦＣＭ１６と共に、Ｎｕｎｃ４、Ｎｕｎｃ１３、ＣＥＬＬＢＩＮＤ（商標）、又はＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）平面状表面に蒔いた。細胞は６ウェルプレートに１００，０００個細胞／ｃｍ2の密度で播種し、次いで各表面上で更に１継代培養した。次いで細胞を、ＴｒｙｐＬＥで浮かせてフローサイトメトリーにより多能性マーカーについて試験するか、ｍＲＮＡ精製及びｑＲＴ−ＰＣＲのためにウェル中でＲＬＴに溶解させるか、あるいは胚体内胚葉へと分化させるかした。２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを添加したＲＰＭＩ培地で２４時間にわたって細胞を処理することで、分化を誘導した。次いで培地を、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを添加したＲＰＭＩ培地に交換し、更に４８時間にわたって培地を毎日交換した。
【０１２７】
フローサイトメトリー又はｑＲＴ−ＰＣＲのいずれかを用いて多能性マーカーにより測定したところ、マイクロキャリア上で培養した後にＮｕｎｃ４、Ｎｕｎｃ１３、ＣｅｌｌＢＩＮＤ又はＰｒｉｍａｒｉａ組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）平面状表面へと移した細胞は、各平面状表面上で２回継代した後に多能性を維持していた（図３６）。加えて細胞は、フローサイトメトリー又はｑＲＴ−ＰＣＲのいずれかにより測定されるものとして、胚体内胚葉運命への分化能を維持していた（図３７）。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で継代し、胚体内胚葉へと分化させたＨ１及びＨ９ヒト胚性幹細胞の比較試験でも、同様の結果が得られた（図３８）。
【０１２８】
これらの結果は、ヒト胚性幹細胞を、マイクロキャリア上で継代した後に、次いで多能性を維持しつつ他の表面上で培養することができることを示す。細胞を他の表面へと移して効率的に分化誘導することもできる。
【０１２９】
実施例９：ヒト胚性幹細胞は、有糸分裂を不活性化した線維芽細胞フィーダー上でのクラスター／コロニー形式の培養から、少なくとも１０回の継代にわたる、ＥＣＭ不含表面上での単独細胞としての培養へと、多能性を損なうことなく、及び線維芽細胞フィーダーを手動で除去することなく直接移行させることができる。
ヒト胚性幹細胞株は、現在のところ、単独の細胞が増殖したコロニー、又は胚盤胞由来の少数の細胞のクラスターを発展させる方法に由来する。次いでこのコロニーを連続的に継代し、細胞株を構成するのに十分な細胞クラスター／コロニーが利用できるようになるまで増殖させる。ヒト胚性幹細胞の多能性と核型安定特性を維持することを目的として、一度細胞株が誘導されると、高度に再現性のあるヒト胚性幹細胞培養のための、当該技術分野の現行の標準方法では、有糸分裂不活性化線維芽細胞のフィーダー細胞層上の、ヒト胚性幹細胞クラスター／コロニーを維持し、及び手作業での撹乱（manual disruption）又はコラゲナーゼ若しくは中性プロテアーゼ若しくはこれらのブレンドでの穏やかな酵素的大容量継代を用いて、細胞を継代する。これらの継代法はヒト胚性幹細胞クラスターを維持し、かつヒト胚性幹細胞の、コロニー形式の増殖を促進する。安定したヒト胚性幹細胞株の確立後、この細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）基質へと移すことができる。しかしながら、細胞を線維芽細胞フィーダー上で増殖させるかあるいはＥＣＭ基質上で増殖させるかのいずれにせよ、技術者に具体的に指示されるヒト胚性幹細胞に関して推奨される継代法は、ヒト胚性幹コロニーを十分に解離させはしない。
【０１３０】
現行の最も良好な、哺乳類細胞のラージスケール培養の実施法は、３次元培養容器を使用するものである。この容器は恒常性、つまり一定の状態を厳密に維持し、かつ足場依存性の細胞を支持するためにマイクロキャリアを組み込むことができる。しかしながら、ヒト胚性幹細胞培養（線維芽細胞フィーダー上又はＥＣＭ基質上で増殖させる）、及びクラスター／コロニー形式での培養に使用される現行の標準法は、マイクロキャリア上でのヒト多能性胚性幹細胞培養物の良好な増殖及び維持に対して技術的な障害を提起することになるが、それは、これらの方法をラージスケールでのマイクロキャリア培養に転用するのは容易ではないからである。マイクロキャリアでヒト胚性幹細胞を効果的に増殖させるためには、ヒト胚性幹細胞培養物は、当該技術分野の現行標準法でのようなコロニー又はクラスターとしてではなく、単独細胞として継代可能であるべきである。加えて、ヒト胚性幹細胞は、フィーダー細胞層又はＥＣＭ基質無しに増殖可能であるべきである。
【０１３１】
我々は、これらの技術的障害に取り組む方法を以下に記載する。我々は、有糸分裂不活性化線維芽細胞フィーダー層上のクラスター／コロニーに基づくヒト胚性幹細胞培養を、線維芽細胞フィーダー層、又はＭＡＴＲＩＧＥＬ若しくは他の細胞外マトリックス基質でコートした表面が下層として存在する必要のない単独細胞培養系へと、直接転換する方法を実証する。この方法は、何らかの方法により線維芽細胞フィーダー細胞を手動で除去する必要のない、あるいは総細胞集団から多能性細胞を選別する必要のない、ヒト胚性幹の大容量の継代を活用することで、培養を、コロニー形式の線維芽細胞フィーダー系培養から、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、ＰＲＩＭＡＲＩＡでの、フィーダー不含／マトリックス不含の培養へと直接転換する。この方法は、必要量を制御するように付着させるための密閉容器で達成でき、並びに多能性及び胚体内胚葉への分化能を保持し、かつ線維芽細胞の細胞集団は含有しない、非常に均質なヒト胚性幹培養物を生成する。
【０１３２】
方法：培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄し、次いで細胞を解離酵素（コラゲナーゼ，Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標），又はＴｒｙｐＬＥ）で処理することにより、細胞をルーチン的に継代した。コラゲナーゼは濃度１ｍｇ／ｍＬで使用した；Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥは、１Ｘ貯蔵濃度で使用した。全ての酵素は室温に戻してから使用した。２％ ＢＳＡのＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液を各ウェルに添加し、細胞を酵素で処理した後に、この細胞を溶液に均一に懸濁した。次いで細胞を２００ｇで５分間にわたって遠心し、細胞ペレットと、追加の、２％ ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液とを、再懸濁した細胞に加え、この細胞懸濁液を５０ｍＬの滅菌コニカルチューブに分注して２００ｇで５分間にわたって遠心した。
【０１３３】
我々は連続的な方法を用い、ＭＥＦ系培地をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）、ＴｒｙｐＬＥ（商標）、又はコラゲナーゼのいずれかで処理し、クラスター／コロニー形式のヒト胚性幹細胞をＰｒｉｍａｒｉａ表面に高密度継代することで、線維芽細胞フィーダーを除去した。最初の継代で、細胞を、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）馴化培地（ＣＭ）に１：３０希釈したＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートしたＴ−２５フラスコに蒔くか、あるいは細胞を、Ｔ−２５ ＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）培養フラスコ中の、３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを添加したＭＥＦ−ＣＭに蒔くかした。全ての細胞を１：３．５の分割比で蒔き、かつ細胞を１０分間にわたって酵素に曝露した。ＴｒｙｐＬＥ（商標）又はＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）で浮かせた細胞の細胞数を、トリパンブルー染色した細胞を血球計算板を用いて計数することで判定した。細胞を蒔いた後、培地は毎日交換し、ＭＥＦ−ＣＭ＋３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドに蒔いたこの細胞に、毎日ＭＥＦ−ＣＭ＋１μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを供給し、多能性及び分化に関するｍＲＮＡマーカーの発現について、試料を解析した。マトリックス不含条件下で、単独細胞として２回継代したｈＥＳＣｓは、多能性遺伝子の遺伝子発現を維持し、かつ分化遺伝子の発現は阻害した（図３９）。
【０１３４】
２回目の継代：ＴｒｙｐＬＥ（商標）又はＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）に１０分曝露することで、細胞を分割比１：４で継代した。我々はまた、細胞を処理し、脱着についてモニターすることにより経験的に決定した、より短い酵素曝露時間を導入した。我々は、細胞を浮き上がらせるのには、ＴｒｙｐＬＥ（商標）に対しては３分間の曝露、及びＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）に対しては５分間の曝露で十分であることを観察した。酵素で細胞を処理した後に、細胞を上記のように継代し、細胞ｍＲＮＡのアリコートを、継代時にｑＲＴ−ＰＣＲ用に採取した。
【０１３５】
３回目の継代：コンフルエンスに達したら細胞をＰＢＳで洗浄し、３分若しくは１０分（ＴｒｙｐＬＥ（商標））又は５分若しくは１０分（Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標））かけて酵素によりバラバラにし、２％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２に懸濁し、遠心し、２％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で再度洗浄し、遠心し、次いで再懸濁して各培地に蒔いた。この継代時には、細胞を１：４比で、並びに同様に更に２種の分割比（１：８及び１：１６）で蒔いた。各継代時に、細胞ｍＲＮＡのアリコートをｑＲＴ−ＰＣＲ用に採取した。
【０１３６】
４回目以降の継代：２回目及び３回目の継代時に採用された、酵素への曝露時間と継代比についての条件を、４回目以降の継代でも維持した。培養物がコンフルエンスまで増殖したら、細胞をＰＢＳで洗浄し、特定の時間をかけて酵素によりバラバラにし、２％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２に懸濁し、遠心し、２％ ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で再度洗浄し、遠心し、次いで再懸濁して各培地に特定の蒔き込み比で蒔いた。ＰＲＩＭＡＲＩＡに細胞を蒔くための培地には、蒔く際に３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを添加した。細胞を蒔いた後、培地は毎日交換し、ＭＥＦ−ＣＭ＋３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドに蒔いたこの細胞に、毎日ＭＥＦ−ＣＭ＋１μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを供給した。継代時に、ｑＲＴ−ＰＣＲ用に細胞ｍＲＮＡのアリコートを採取した。
【０１３７】
８回を超える継代時には、継代終了時に、多能性表面マーカーに関するフローサイトメトリーによって（図４０）、並びに多能性マーカー及び分化マーカーに関するｑＲＴ−ＰＣＲによって（図４１、４２及び４３）、多能性について細胞を解析した。２％ ＢＳＡと、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａと、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと、３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドとを添加したＲＰＭＩ培地で２４時間にわたって細胞を処理することで、細胞を同様に胚体内胚葉へと分化させた。次いで培地を、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ１１５２ジヒドロクロリドを添加したＲＰＭＩ培地に交換し、更に４８時間にわたって培地を毎日交換した。次に、胚体内胚葉へと分化させた試料を、フローサイトメトリーによって、胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４の存在について試験した（図４０）。
【０１３８】
これらの結果は、コロニー形式の、線維芽細胞フィーダー系培養物から、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下の、ＰＲＩＭＡＲＩＡでのフィーダー不含／マトリックス不含培養への大容量の継代は、多能性及び胚体内胚葉への分化能を保持し、かつ線維芽細胞の細胞集団は含有しない非常に均質なヒト胚性幹細胞培養物を生じることを示す。
【０１３９】
実施例１０：組織培養用プラスチックからマイクロキャリアへのヒト胚性幹細胞の移動
Ｈ１細胞を、ＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）組織培養プレート（実施例９の方法）で培養し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓにより３〜５分処理することで放出させ、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ中にＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）又はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリアを含む６ウェルの組織培養用無処理プレートに播種した。対照として、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）でコートしたプレートで増殖させ、かつコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて継代した、継代数４６のＨ１細胞を放出させ、同様の方法でマイクロキャリアに播種した。プレートを、３７℃で５時間にわたって、４５分ごとに手で撹拌しながらインキュベートした。次いでプレートを３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。培地は、毎日１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭで交換した。画像解析は、３日目の時点で、マイクロキャリアに対する細胞の良好な付着を示す（図４４）。７日後に細胞を放出させ（以下の実施例４に記載）、多能性マーカーのＣＤ９、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１に関してＦＡＣＳで解析した（図４５）。多能性マーカーのほとんどが、９０〜１００％の細胞で発現していた。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリアで増殖させようが、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリアで増殖させようが、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）で継代した細胞とＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で継代した細胞の間に明瞭な違いは存在しない。全般的に、細胞は、ＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）細胞培養用プラスチックからマイクロキャリアに移した場合に多能性を保持した。
【０１４０】
次に、マイクロキャリア上のこれらのＨ１細胞は、胚体内胚葉へと分化した。この方法は実施例７に記載する。分化の４日後に、Ｈ１細胞をマイクロキャリアから放出させ、ＦＡＣＳ解析を実施したところ、８２％を超える細胞がＣＸＣＲ４を発現していることが示された。図４６を参照されたい。細胞は、マイクロキャリアの種類又はＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から継代する際の酵素には関係なく、胚体内胚葉へと効率的に分化した。これは増量系の柔軟性を証明し、かつプラスチック及びマイクロキャリア上にマトリックスを必要とすることなく細胞を増殖させる。
【０１４１】
実施例１１：セルロース混合エステルからなる平面状基材からマイクロキャリアへのヒト胚性幹細胞の移動
米国特許出願第６１／１１６，４５２号に開示の方法に従って、セルロース混合エステルからなる平面状基材で、Ｈ１細胞を１２継代にわたって培養した。ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで３〜５分処理することで平面状基材から細胞を放出させ、１０ｍＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ中にＣＹＴＯＤＥＸ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア又はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリアを含む６ウェルの組織培養用無処理プレートに播種した。対照として、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）でコートしたプレートで増殖させ、かつコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて継代した、継代数４４のＨ１細胞を放出させ、同様の方法でマイクロキャリアに播種した。プレートを、３７℃で５時間にわたって、４５分ごとに手で撹拌しながらインキュベートした。次いでプレートを３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。培地は毎日交換した。７日後に細胞を放出させ（実施例４に記載）、多能性マーカーのＣＤ９、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１に関してＦＡＣＳで解析した（図４７）。ほとんどの多能性マーカーが、９０％を超える細胞で発現していた。ＣＹＴＯＤＥＸ ３（登録商標）マイクロキャリアで増殖させた細胞と、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアで増殖させた細胞との間に明瞭な違いは存在しなかった。継代数４４のＨ１対照細胞は、多能性が他の実験により確認されていたことから、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアで増殖させた後の多能性について試験しなかった（実施例５を参照されたい）。全般的に、細胞は、セルロース混合エステルからなる平面状基材からマイクロキャリアへと移した場合にも多能性を維持していた。
【０１４２】
次に、実施例７に記載の方法に従って、マイクロキャリア上のＨ１細胞を胚体内胚葉へと分化させた。分化の４日後に、Ｈ１細胞をマイクロキャリアから放出させ、ＦＡＣＳ解析を実施したところ、６５％を超える細胞がＣＸＣＲ４を発現していることが示された（図４８）。細胞は、マイクロキャリアの種類とは無関係に効率的に胚体内胚葉へと分化した。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア上で胚体内胚葉へと分化した細胞の数は少数であったように思われる。細胞の分化能は、増量系の柔軟性を証明する。加えて細胞を、動物成分マトリックスに対する任意の必要性を除去して、メンブレン及びマイクロキャリア上に直接増殖させかつ分化させることができる。
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
【表２】
【０１４５】
【表３】
【０１４６】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国特許公開番号第６１／１１６，４４７号（２００８年１１月２０日出願）に対する優先権を請求する。
【０００２】
（発明の概要）
本発明は、多能性幹細胞をマイクロキャリア上で増殖、増量（expansion）及び分化させるための方法を目的とする。
【背景技術】
【０００３】
多能性幹細胞（例えば胚性幹細胞など）は、全ての成体型細胞へと分化する能力を有する。そのため、胚性幹細胞は、疾病、感染又は先天性異常の結果として損傷した器官のための、置換細胞源及び置換組織源になり得る。胚性幹細胞を置換細胞源として用いるのを可能にするには、試験管内で多能性を維持しつつ細胞を増殖することの困難さがネックになっている。
【０００４】
現行の、未分化の胚性幹細胞を培養する方法では、例えばフィーダー細胞層の存在下で胚性幹細胞を培養するなどの、複雑な培養条件が必要とされる。あるいは、フィーダー細胞培養物に曝露することによって得られる培地を、胚性幹細胞の培養に使用する場合もある。これらの方法を用いる培養系では、多くの場合、培養される幹細胞の生物種とは異なる種から得られた細胞（異種細胞）が使用される。加えて、これらの培養系には動物の血清が添加される場合がある。
【０００５】
胚性幹細胞は、研究及び薬剤スクリーニング用に将来性のある資源を提供する。現在のところ、ヒト胚性幹細胞株の大規模培養には問題が多く、大きな課題が提供される。現行の、インビトロでの多能性幹細胞増殖方法は、組織培養用フラスコにおいて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質又はフィーダー細胞でプレコートされた、平面状表面上で実施される。また、平面培養では、表面積が多能性幹細胞の長期増殖をサポートできないという限界性から、頻繁に継代培養する必要がある。マイクロキャリア系の多能性幹細胞培養法は、解決法を提供し得る。マイクロキャリアは表面積対容積比が大きく、したがって平面状表面上での、多能性幹細胞の増殖にまつわる表面積制限を排除する。
【０００６】
例えば、Ｆｏｋらは、未分化のＥＳＣ−マイクロキャリアと凝集体の培養物を増殖させるための、撹拌懸濁培養系を開示する（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５；２３：１３３３〜１３４２．）。
【０００７】
他の例では、Ａｂｒａｎｃｈｅｓらは、表面にコラーゲン層を備えるデキストランマトリックスから構成された、ミクロ孔質のマイクロキャリアであるＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が、スピナーフラスコ中でマウスＳ２５ ＥＳ細胞株の増量を支持する能力について試験を開示する（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６（２００７），ｐｐ．１２１１〜１２２１．）。
【０００８】
他の例では、米国特許第２００７０２６４７１３号は、未分化の幹細胞を懸濁液中で培養するための方法、具体的には容器中のマイクロキャリア上で幹細胞を培養する方法について開示する。
【０００９】
他の例では、国際公開第２００６１３７７８７号は、細胞をマイクロキャリア上で培養するために使用される、マイクロタイタープレートなどの中実支持体に付着させたビーズなどの、微粒子状の物質すなわちマイクロキャリアを含む、スクリーニングツールを開示する。
【００１０】
他の例では、国際公開第２００８００４９９０号は、培養時の幹細胞の付着、生存及び／又は増殖を促進する方法を開示し、この方法は、正電荷支持表面上で幹細胞を培養することを含む。
【００１１】
他の例では、国際公開第２００７０１２１４４号は、支持表面と、支持表面に結合させた合成付着性ポリペプチドと、を含むバイオリアクターを開示し、ここでこの合成付着性ポリペプチドは、胚性幹細胞又は多能性細胞への高い結合親和性により特徴付けられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、多能性幹細胞をマイクロキャリア上で増殖、増量及び分化させる方法を提供する。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞の増殖方法を提供し、この方法は以下の
ａ．多能性幹細胞集団を、第１容量のマイクロキャリアに付着させる工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、第１容量のマイクロキャリア上で培養する工程と、
ｃ．多能性幹細胞を、第１容量のマイクロキャリアから取り外す工程と、
ｄ．多能性幹細胞集団を、第２容量のマイクロキャリアへと付着させる工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤は、マイクロキャリアへのヒト胚性幹細胞の付着と増殖を促進する。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上で、２日間にわたって静置培養により増殖させた、Ｈ９細胞の画像。細胞は、１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ２７６３２（（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を添加した、あるいは不添加の、マウス胚性線維芽細胞馴化培地（ＭＥＦ−ＣＭ）で培養した（それぞれＡ及びＢ）。
【図２】マイクロキャリア上でのＨ９細胞の増殖。Ｈ９細胞を様々なマイクロキャリアに付着させ、３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。Ｐｌａｓｔｉｃマイクロキャリアと、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦマイクロキャリアと、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）と、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリアを使用した（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。３日間の増殖後に、細胞はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）において、マイクロキャリアに対する最も良好な細胞付着性を示した。マイクロキャリアに付着せずに凝集塊を形成した細胞を矢印で示す。
【図３】マイクロキャリア上でのＨ９細胞の増殖。Ｈ９細胞を、３７℃にて固定式プラットフォーム上の６ウェルディッシュ中で、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びＭＥＦ−ＣＭの存在下で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦマイクロキャリア、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリア及びＰｌａｓｔｉｃマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に付着させた。初期細胞播種密度は、０日での値である。３日目及び５日目の細胞数を示す。
【図４】マイクロキャリアに付着後のＨ１細胞の画像。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦマイクロキャリア、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリア、及びＰｌａｓｔｉｃマイクロキャリアに付着させた細胞の３、５及び７日目の画像を示す。細胞は、３７℃にて固定式プラットフォーム上の１２ウェルディッシュ中で、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を含有するＭＥＦ−ＣＭで増殖させた。Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリア及びＰｌａｓｔｉｃマイクロキャリアに結合させた細胞は、独立して凝集塊を形成した（Ｇ、Ｈ中の矢印）。
【図５】マイクロキャリアに付着後のＨ１細胞の画像。Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に付着させた細胞の３、５及び７日目の写真を示す。細胞は、３７℃にて固定式プラットフォーム上の１２ウェルディッシュ中で、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を含有するＭＥＦ−ＣＭで増殖させた。
【図６】マイクロキャリア上でのＨ１細胞の増殖。Ｈ１細胞を、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、及びＰｌａｓｔｉｃマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に付着させ、３７℃にて固定式プラットフォーム上の、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びＭＥＦ−ＣＭが存在している１２ウェルディッシュ中に設置した。初期細胞播種密度は、０日での値である。３、５及び７日目の細胞数を示す。最初の播種密度は、ラインにより示されるように１３，３３３個細胞／ｃｍ2であった。
【図７】様々な濃度のＲｈｏキナーゼ阻害剤存在下での、マイクロキャリア上でのＨ９細胞の増殖。固定式プラットフォーム上の、１２ウェルプレート中で細胞を増殖させ、４日目及び７日目に計数して付着率と増殖率を決定した。Ａ．Ｈ９細胞を１、２．５、５又は１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を含有するＭＥＦ−ＣＭ中で増殖させた。Ｂ．Ｈ９細胞を、０．５、１、２．５又は５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）含有ＭＥＦ−ＣＭ中で増殖させた。
【図８】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤濃度を減少させてＨ１細胞を増殖させた。２日間にわたって、濃度を減少させたＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）又はＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）（１０μＭ／５μＭ、２．５μＭ／０．５μＭ若しくは１．０μＭ／０．５μＭ）、又は０．２５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）の存在下で、Ｈ１ｐ３８細胞を継続的に増殖させた。細胞はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）に付着させた（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ）。細胞を播種後３、５及び７日目に計数した。
【図９】スピナーフラスコ中での、異なった播種密度でのマイクロキャリアへの細胞付着の判定。Ｈ１細胞を、写真の左側に掲載した密度でＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上に播種した；低密度（０．４×１０4個細胞／ｃｍ2）、中間密度（１．２×１０4個細胞／ｃｍ2）又は高密度（３×１０4個細胞／ｃｍ2）。３、５及び７日目に細胞を撮像し、細胞の付着したマイクロキャリアの百分率を判定した（画像に組み込んである）。
【図１０】スピナーフラスコ中のマイクロキャリア上での細胞増殖は、初期播種密度により影響を受ける。Ｈ１細胞を、写真の左側に掲載した密度でＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上に播種した；低密度（０．４×１０4個細胞／ｃｍ2）、中間密度（１．２×１０4個細胞／ｃｍ2）又は高密度（３×１０4個細胞／ｃｍ2）。３、５及び７日目で細胞をマイクロキャリアから解離させ計数した。
【図１１】スピナーフラスコ中での、異なった播種密度でのマイクロキャリア上での細胞増殖率の判定。Ｈ１細胞を、異なる播種密度でＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上に播種した；低密度（０．４×１０4個細胞／ｃｍ2）、中間密度（１．２×１０4個細胞／ｃｍ2）又は高密度（３×１０4個細胞／ｃｍ2）。３、５及び７日目で細胞をマイクロキャリアから解離させ計数した。細胞数の倍数増加を初期播種密度と比較して示す。
【図１２】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させたＨ１細胞を培養の７日目以降に撮像した。細胞には３日目以降はＲｈｏキナーゼ阻害剤不含ＭＥＦ−ＣＭを供給した。細胞はマイクロキャリアに付着したままであった。
【図１３】Ｈ９細胞の増殖及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上のＨ９細胞の解離。Ａ、Ｂ：ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア上（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）で６日間増殖させたＨ９細胞の１０ｘ及び２０ｘ画像。Ｃ：１０分間にわたって０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡでＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）から解離させた細胞の２０ｘ画像。Ｄ：１０分間にわたってＴｒｙｐＬＥ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓでＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）から解離させた細胞の２０ｘ画像。
【図１４】マイクロキャリアからのＨ９細胞の解離。固定式プラットフォーム上のＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上で増殖させたＨ９細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ又は０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで解離させた。細胞数及びそれらの生存率をそれぞれＡ及びＢに示す。
【図１５】マイクロキャリアからのＨ１細胞の解離。スピナーフラスコ中の、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させたＨ１細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はコラゲナーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）で解離させた。細胞数及びそれらの生存率をそれぞれＡ及びＢに示す。
【図１６】ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア上で増殖させたＨ９細胞は、マイクロキャリア間を移動しなかった。
【図１７】継代数４３のＨ９を、スピナーフラスコ中の、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア上で５継代にわたって増殖させた。細胞を２〜３日毎に計数し、細胞が１〜２×１０5個細胞／ｃｍ2に達した時点で継代した。
【図１８】継代数４３のＨ９細胞を、スピナーフラスコ中の、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で、５継代にわたって増殖させた。細胞を２〜３日毎に計数し、細胞が１〜２×１０5個細胞／ｃｍ2に達した時点で継代した。
【図１９】蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）はスピナーフラスコ内で増殖させたＨ９細胞の多能性を示す。Ａ：ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア上で増殖させた継代数４３のＨ９細胞の大多数は多能性タンパク質を発現する。継代数１及び３の細胞は、ＴＲＡ−１−８１については評価しなかった。Ｂ：Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上で増殖させた継代数４３のＨ９細胞の大多数は多能性タンパク質を発現する。継代数１の細胞は、ＴＲＡ−１−８１については評価しなかった。
【図２０】継代数４９のＨ１細胞を、スピナーフラスコ中のＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で、５継代にわたって増殖させた。細胞を２〜３日毎に計数し、細胞が４〜８×１０4個細胞／ｃｍ2に達した時点で継代した。
【図２１】継代数４９のＨ１細胞を、スピナーフラスコ中のＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で、５継代にわたって増殖させた。細胞を２〜３日毎に計数し、細胞が１〜２×１０5個細胞／ｃｍ2に達した時点で継代した。
【図２２】蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）は、スピナーフラスコ内で増殖させたＨ１細胞の多能性を示す。
【図２３】マイクロキャリア上のＨ１及びＨ９細胞の集団倍加。３日目から、以降経過させた日数についての集団倍加回数を算出した（５、６又は７日目）。
【図２４】制限培地中のマイクロキャリア上でＨ９細胞を培養した。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（ＨＩＩ，（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ））又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（Ｃ３，（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ））上で細胞を培養した。細胞を、以下の培地のいずれかで、マイクロキャリア上で培養した；ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）、ＳｔｅｍＰｒｏ又はＭＥＦ−ＣＭ。１０μＭのＹ２７６３２（Ｙ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））又は２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｈ，（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ））を培地に加えた。播種後３、５及び７日目の増殖率を測定した。
【図２５】制限培地中のマイクロキャリア上で、継代数３８のＨ１細胞を培養した。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（ＨＩＩ，（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ））マイクロキャリア又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（Ｃ３，（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ））マイクロキャリア上で細胞を培養した。細胞を、以下の培地のいずれかで、マイクロキャリア上で培養した；ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）、ＳｔｅｍＰｒｏ及びＭＥＦ−ＣＭ。１０μＭのＹ２７６３２（Ｙ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））又は２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｈ，（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ））を培地に加えた。播種後３、５及び７日目の増殖率を測定した。
【図２６】継代数５０のＨ１細胞を、スピナーフラスコ中の、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ））マイクロキャリア上で、制限培地を用いて培養した。Ａ：スピナーフラスコ中のＭＥＦ−ＣＭで３、７又は９日間にわたって増殖させた後の、継代数５０のＨ１細胞の画像。Ｂ：ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中で３、７又は９日間にわたって増殖させた継代数５０のＨ１細胞の画像。矢印が指す細胞クラスターは、マイクロキャリアに付着していない。
【図２７】スピナーフラスコ中で５回継代したヒト胚性幹細胞の分化。Ａ：継代数４３のＨ９細胞を、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で５回継代した。Ｂ：継代数４９のＨ１細胞を、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で５回継代した。両方の細胞型を共にマイクロキャリアから放出させ、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）でコートしたプレートに播種した。８０〜９０％コンフルエントの細胞で、胚性幹細胞が胚体内胚葉へと分化し得るようなプロトコルを実施した。次いで胚体内胚葉マーカーのＣＸＣＲ４を発現している細胞の百分率について、細胞をＦＡＣＳで解析した。ＣＸＣＲ４陽性細胞のパーセントをプロットの右上の角に記載する。
【図２８】マイクロキャリア上での、胚体内胚葉へのＨ１細胞の分化。このＦＡＣＳプロットは、胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４を発現している細胞の百分率を示す。陽性パーセントを右上の角に記載する。処理前に全ての細胞をスピナーフラスコ中のマイクロキャリア上で増量させた。Ａ：分化前に、継代数４０のＨ１細胞を５回継代し、次いで６日間にわたってＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させた。Ｂ：分化前に、継代数４０のＨ１細胞を１回継代し、次いで８日間にわたってＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させた。Ｃ：分化前に、継代数５０のＨ１細胞を１回継代し、次いで６日間にわたってＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上で増殖させた。
【図２９】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上での、胚体内胚葉へのＨ１細胞の分化。Ａ：継代数４０のＨ１細胞を、マイクロキャリア上で８日間にわたって増殖させた。Ｂ：継代数４０のＨ１細胞を、マイクロキャリア上で１１日間にわたって増殖させた。両方の細胞集団を共に、次いで３７℃にて固定式プラットフォーム上で、胚体内胚葉へと分化させた。このＦＡＣＳプロットは、胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４を発現している細胞の百分率を示す。陽性パーセントを右上の角に記載する。
【図３０】胚体内胚葉への、マイクロキャリア上で培養したヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の分化。ＣＸＣＲ４陽性細胞パーセントについてのＦＡＣＳ結果をＹ軸に示す。Ｈ１細胞は、分化前及び分化時にＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で増殖させた。
【図３１】膵臓内胚葉細胞への、マイクロキャリア上で培養したヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の分化。ＣＴ値を、膵臓内胚葉マーカーのＮｇｎ３、Ｎｋｘ６．１及びＰｄｘ１についてＹ軸に示す。Ｈ１細胞を、ＤＭＥＭ−高グルコース（ＨＧ）培地又はＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｆ１２）培地のいずれかの培地中で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（ＨＩＩ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）（Ｃ１）又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（Ｃ３）マイクロキャリア上で分化させた。分化プロトコルは１３日間続いた。
【図３２】膵臓ホルモン産生細胞への、マイクロキャリア上で培養したヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の分化。ＦＡＣＳにより測定した陽性細胞パーセントを、膵臓ホルモンの細胞マーカーのシナプトフィジン、グルカゴン及びインスリンについてＹ軸で示す。Ｈ１細胞を２つの異なる濃度、１０×１０5（１０）又は２０×１０5（２０）で、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（Ｃ−３）マイクロキャリア上に播種した。ＤＭＥＭ−高グルコース（ＨＧ）中で、４〜９日間にわたって細胞を分化させ、更にＨＧ又はＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｆ１２）培地で１０日〜２４日間分化させた。
【図３３】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上での、内分泌細胞へのＨ１細胞の分化。Ｈ１細胞を、膵臓内胚葉（１４日）を経て、膵内分泌細胞へと分化させ、膵内分泌細胞（２１日）をインスリン発現細胞（２８日）へと分化させた。Ｐｄｘ１、グルカゴン及びインスリンの遺伝子発現レベルを測定した（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ）。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）（Ｃ３）上で増殖、分化させたＨ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートした６ウェルディッシュ（平面）上で増殖、分化させた細胞と比較した。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させた細胞についての遺伝子発現の値は３つ組で採った。
【図３４】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上での、胚体内胚葉（ＤＥ）へのＨ９細胞の分化。ＣＸＣＲ４発現のＦＡＣＳプロット。胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４についての陽性細胞パーセントを、右上の角に記載する。Ａ：継代数３９のＨ９細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートした６ウェルディッシュ上で増殖させ、ＤＥへと分化させた。Ｂ、Ｃ：スピナーからのＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上のＨ９細胞の、２つ組サンプルを、１２ウェルディッシュに設置し、固定式プラットフォーム上でインキュベートした。
【図３５】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上での、インスリン発現細胞へのＨ９細胞の分化。Ｈ９細胞を、膵臓内胚葉（１４日）を経て、膵内分泌細胞へと分化させ、内分泌細胞（２２日）をインスリン発現細胞（２９日）へと分化させた。Ｐｄｘ１、グルカゴン及びインスリンの遺伝子発現レベルを測定した（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ）。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）（Ｃ３）上で増殖、分化させたＨ９細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートした６ウェルディッシュ（平面）上で増殖、分化させた細胞と比較した。
【図３６】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で５継代にわたって培養し、次いで記載の平面状基材上に移して培養し、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養したヒト胚性幹細胞での多能性の維持性。パネルＡは、フローサイトメトリーにより検出されたものとして、多能性マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１６０及びＴｒａ−１８１の発現を記す。パネルＢは、リアルタイムＰＣＲにより検出されたものとして、多能性マーカーＮａｎｏｇ、Ｐｏｕ５Ｆ１、ＳＯＸ２及びＺＦＰ４２、並びに分化マーカーＦＯＸＡ２、ＦＯＸＤ３、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４及びＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現を記す。
【図３７】Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で５継代にわたって培養し、次いで記載の平面状基材上に移して培養し、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養したヒト胚性幹細胞による、胚体内胚葉形成。パネルＡは、フローサイトメトリーにより検出されたものとして、ＣＸＣＲ４の発現を記す。パネルＢは、リアルタイムＰＣＲにより検出されたものとして、記載のマーカーの発現を記す。
【図３８】ヒト胚性幹細胞をＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で５継代にわたって培養し、次いでＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）平面状基材上に移し培養することによる胚体内胚葉形成。記載の遺伝子の発現はフローサイトメトリーにより測定した。
【図３９】平面状基材上で培養したヒト胚性幹細胞は多能性を維持する。ＴｒｙｐＬＥ（商標）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はコラゲナーゼ処理したＨ１ヒトＥＳ細胞由来のｍＲＮＡサンプルを回収し、ｍＲＮＡの多能性遺伝子発現について解析した。細胞を、１継代の４日間にわたって、ＭＡＴＲＩＧＥＬにてＭＥＦ馴化培地で培養して増殖させ（Ａ）、あるいは１継代にわたって、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）にて、Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＭＥＦ馴化培地で増殖させ（Ｂ）、あるいは２継代にわたって、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）にて、Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＭＥＦ馴化培地で増殖させた（Ｃ）。
【図４０】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、ＰＲＩＭＡＲＩＡにてＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いて分割比１：４、１：８又は１：１６で継代して、７継代を超えてＰＲＩＭＡＲＩＡにて増殖させたＨ１ヒト胚性幹細胞（継代数４５を超える）を、多能性（Ａ）及び胚体内胚葉への分化能（Ｂ）について試験した。対照は、１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬにて増殖させ、コラゲナーゼで処理した、継代数４８のＨ１ヒト胚性幹細胞である。１０ｍＡ＝Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）に１０分曝露して継代。１０ｍＴ＝ＴｒｙｐＬＥ（商標）に１０分曝露して継代。１：４、１：８又は１：１６は継代比を意味する。Ｐ（Ｘ）は、ＭＥＦフィーダーからＰｒｉｍａｒｉａ（商標）プラスチックへと移動させて以降の継代数を意味する。
【図４１】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いてＰＲＩＭＡＲＩＡにて１：４比で継代して、７継代を超えてＰＲＩＭＡＲＩＡにて増殖させたＨ１ヒト胚性幹細胞（継代数４５を超える）を、多能性マーカー及び分化マーカーのｍＲＮＡ発現について試験した。対照は、継代数３７の細胞集団で開始する。１０分Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）＝Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）に１０分曝露して継代。Ｐ（Ｘ）は、ＭＥＦフィーダーからＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）プラスチックへと移動させて以降の継代数を意味する。
【図４２】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いてＰＲＩＭＡＲＩＡにて分割比１：８で継代して、７継代を超えてＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）にて増殖させたＨ１ヒト胚性幹細胞（継代数４５を超える）を、多能性マーカー及び分化マーカーのｍＲＮＡ発現について試験した。対照は、継代数３７の細胞集団で開始する。１０分Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）＝Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）に１０分曝露して継代。Ｐ（Ｘ）は、ＭＥＦフィーダーからＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）プラスチックへと移動させて以降の継代数を意味する。
【図４３】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いてＰＲＩＭＡＲＩＡにて分割比１：１６で継代して、７継代を超えてＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）にて増殖させたＨ１ヒト胚性幹細胞（継代数４５を超える）を、多能性マーカー及び分化マーカーのｍＲＮＡ発現について試験した。対照は、継代数３７の細胞集団で開始する。１０分Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）＝Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）に１０分曝露して継代。Ｐ（Ｘ）は、ＭＥＦフィーダーからＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）ｐｌａｓｔｉｃへと移動させて以降の継代数を意味する。
【図４４】Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）平面状基材（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）にて増殖させ、次いで播種の３日後にマイクロキャリアに移動させた、Ｈ１細胞の画像。Ａ〜Ｃ：Ｈ１細胞をＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上に播種した。Ｄ〜Ｆ：細胞をＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ マイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上に播種した。Ａ、Ｄ：Ｈ１細胞は、マイクロキャリアへと移す前に、１０分間のＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）処理により、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）平面状基材（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）プレートにて継代した。Ａ、Ｅ：Ｈ１細胞は、マイクロキャリア上に移す前に、１０分間のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理を用いて、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）平面状基材（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）プレートにて継代した。Ｃ、Ｆ：継代数４６のＨ１細胞は、マイクロキャリアへと移す前に、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、ＭＡＴＩＲＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートプレートにて継代した。
【図４５】Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）平面状基材（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）にて増殖させ、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアへと移したＨ１細胞の多能性。ＦＡＣＳ解析は、多能性細胞表面タンパク質の発現を示す。細胞を、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）での継代時に３〜１０分間にわたってＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で処理した。
【図４６】Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）にて増殖させ、次いでＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）へと移したＨ１細胞の分化。胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４の細胞表面発現についてのＦＡＣＳ解析。細胞を、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）での継代時に３〜１０分間にわたってＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で処理した。
【図４７】マイクロキャリア上での培養前にセルロース混合エステルからなる平面状基材にて培養したヒト胚性幹細胞のＦＡＣＳ解析。
【図４８】マイクロキャリア上での培養及び分化の前に、セルロース混合エステルからなる平面状基材で培養したヒト胚性幹細胞の、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーの発現に関するＦＡＣＳ解析。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
開示を明確にするために、本発明の「発明を実施するための形態」を、限定を目的とすることなく、本発明の特定の特徴、実施形態、又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【００１６】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルで自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。同様に、幹細胞は、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能細胞へと分化する能力によって、並びに移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全てではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても特徴付けられる。
【００１７】
幹細胞は、それらの発達能力により：（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系統の小集合を生じるが、全て特定の組織、器官又は生理的システム内で生じる能力を有することを意味する多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生できる）、（４）多能性幹細胞と比較して限定された細胞系統の小集合を生じる能力を有することを意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系統を生じる能力を有することを意味する単能性（例えば、精子形成幹細胞）に分類される。
【００１８】
分化は、特殊化されていない細胞（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化誘導された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「コミットした」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「コミットした」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合へと分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に設置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。
【００１９】
培養時の細胞を記載するために、様々な用語が使用される。「維持」は、一般に、細胞増殖及び／又は細胞分裂を促進する条件下で増殖培地に設置した細胞を指し、この細胞は細胞数のより大きな集団をもたらす場合ももたらさない場合もある。「継代」は、細胞増殖及び／又は細胞分裂を促進する条件下で、細胞を１番目の培養容器から取り出し、それらの細胞を２番目の培養容器へと設置するプロセスを指す。
【００２０】
特定の細胞集団又は細胞株は、しばしば継代された回数によって呼称されるか特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団はＰ１０培養と呼ばれる場合がある。初代培養、すなわち組織から細胞を単離した後の最初の培養はＰ０と称される。最初の継代培養後、細胞は二次培養物（Ｐ１又は継代数１）と称される。２回目の継代培養の後では細胞は三次培養物（Ｐ２又は継代数２）となる、といった具合である。当業者であれば、継代期間中に集団は何度も倍加し得るものであり、したがってある培養の集団倍加の回数は継代数よりも大きいことが理解されるであろう。各継代間の期間中の細胞の増量（すなわち集団倍加数）は、限定するものではないが、播種密度、基質、培地、増殖条件、及び継代間の時間などを含む多くの因子に依存する。
【００２１】
「β−細胞系」は、転写因子ＰＤＸ−１と、以下の転写因子：ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、又はＰａｘ６のうちの少なくとも１つに関する遺伝子の発現が陽性である細胞を指す。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、β細胞が挙げられる。
【００２２】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカー：ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞には、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞を含む。
【００２３】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１ α、ＨＮＦ−６、又はＨＢ９。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞には、膵臓内胚葉細胞を含む。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、又はＰＴＦ−１ α。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞には、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ−細胞系の細胞を含む。
【００２５】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を有する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわちＣＸＣＲ４、ＨＮＦ−３ β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１を発現する。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞の集団を指す：ＳＯＸ−７、ＡＦＰ又はＳＰＡＲＣ。
【００２７】
本明細書で使用するとき、「マーカー」は、対象とする細胞内で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルの核酸マーカー又はポリペプチドマーカーは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００２８】
本明細書で使用するとき、「中内胚葉細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７又はＧＡＴＡ−６。
【００２９】
本明細書で使用するとき「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを分泌できる細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「前原始線条細胞」は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す：Ｎｏｄａｌ、又はＦＧＦ８。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「原始線条細胞」は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す：Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４。
【００３３】
マイクロキャリア
「マイクロキャリア」は、足場依存性の細胞を培養する際に、この細胞の付着及び増殖に有用な粒子、ビーズ又はペレットを指す。「マイクロキャリア」は以下の特性を有する：（ａ）（マイクロキャリア又は細胞に、有意なせん断ダメージを引き起こさないような撹拌速度での）懸濁培養で使用可能な程度に十分小さい；（ｂ）中実である、あるいは表面に多孔性コーティングを備える中実コアを有している；及び（ｃ）表面（多孔性キャリアの場合、外側表面と内側表面）が正又は負に帯電し得る。一態様では、マイクロキャリアは全般的に約１５０〜３５０μｍの粒径を有し、かつ約０．８〜２．０ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。有用なマイクロキャリアとしては、限定するものではないが、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ２（登録商標）、又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が挙げられる。
【００３４】
他の態様では、マイクロキャリアは中実キャリアである。中実キャリアは、接着細胞（例えば、付着依存性の細胞）に特に好適である。キャリア粒子はまた、多孔性マイクロキャリアであってもよい。
【００３５】
「多孔性マイクロキャリア」は、付着依存性の細胞を培養する際に、この細胞の付着及び増殖に有用な粒子を指す。多孔性マイクロキャリアは以下の特性を有する：（ａ）（マイクロキャリア又は細胞に、有意なせん断ダメージを引き起こさないような撹拌速度での）懸濁培養で使用可能な程度に、十分小さい；（ｂ）細胞を粒子の内部空間へと遊走させるのに十分な大きさの孔と内部空間とを有する、及び（ｃ）（外側及び内側）表面が正又は負に帯電し得る。一連の実施形態の１つでは、キャリアは（ａ）全般的に約１５０〜３５０μｍの粒径を有し；（ｂ）約１５〜約４０μｍの平均孔開口径を有する孔を有し；及び（ｃ）約０．８〜２．０ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。いくつかの実施形態では、正電荷はＤＥＡＥ（Ｎ，Ｎ，−ジエチルアミノエチル）基により提供される。有用な多孔性マイクロキャリアとしては、限定するものではないが、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １（登録商標）及びＣｙｔｏｐｏｒｅ ２（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。マイクロキャリアは任意の形状であってよいが、通常はほぼ球状の形状であり、かつマクロ若しくはマイクロ多孔性、又は中実性であり得る。
【００３６】
多孔型及び中実型のマイクロ粒子キャリアのいずれもが供給元より市販されている。市販のマイクロキャリアの例としてはＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が挙げられ、これらの両方がＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのデキストラン系マイクロキャリアである。市販の多孔性マイクロキャリアとしては、同様にＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ製品並びにＣｙｔｏｐｏｒｅ製品が挙げられる。Ｂｉｏｓｉｌｏｎ（ＮＵＮＣ）及びＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ（Ｐｅｒｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ）もまた市販されている。更なる態様では、マイクロキャリアはポリカーボネート又はセルロース混合エステルから構成され、あるいはこれらでコートされ得る。
【００３７】
本発明での使用に好適なマイクロキャリアは、天然由来の又は合成的に誘導された材料から構成され得る。例としては、コラーゲン系マイクロキャリア、デキストラン系マイクロキャリア、又はセルロース系マイクロキャリア、並びにガラス、セラミックス、ポリマー、又は金属が挙げられる。マイクロキャリアはタンパク質不含であっても、あるいはタンパク質（例えばコラーゲン）でコートされていてもよい。更なる態様では、マイクロキャリアは、マイクロキャリアへの細胞の結合性を高める、及びマイクロキャリアからの細胞の放出を高める化合物から構成されてもよく、あるいは化合物でコートされてもよく、限定するものではないが、このような化合物としてはポリ（モノステアロイルグリセリドココハク酸）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、リジン、ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ビトロネクチンが挙げられる。
【００３８】
細胞培養物用のマイクロキャリア
マイクロキャリア培養は、足場依存性の細胞（例えばヒト胚性幹細胞）の実用的な高収率培養を可能にする技術である。マイクロキャリアは、特に数ミリリットル〜１０００Ｌを超える範囲の培養容量でヒト胚性幹細胞などの細胞を培養するために開発されてきた。マイクロキャリアは生物学的に不活性であり、撹拌式マイクロキャリア培養法に、丈夫であるが非剛性の基材を提供する。マイクロキャリアは透明であり得、付着した細胞の顕微鏡検査が可能である。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）は、架橋デキストランマトリックスに化学結合させた、変性コラーゲンの薄い層から構成される。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）の変性コラーゲン層は、トリプシン及びコラゲナーゼが挙げられる、様々なプロテアーゼにより消化されやすく、細胞の生存率、機能及び完全性を最大限維持しつつ、細胞をマイクロキャリアから取り外すという性能を提供する。
【００３９】
タンパク質不含マイクロキャリアをヒト胚性幹細胞の培養に使用することもできる。例えば、商品名ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，ＭＩ．）で販売されている、製造及び研究又は調査用途に使用するためのマイクロキャリアは、表面に、マイクロキャリアに正電荷表面をもたらすカチオン性トリメチルアンモニウムが付着している、改質ポリスチレンビーズである。ビーズ直径範囲は、直径約９０〜約２００マイクロメートルである。
【００４０】
マイクロキャリアに基づく細胞培養法は、多くの用途において、下流の加工のし易さを含む、多くの利点を提供した。マイクロキャリアは通常ほぼ球状の形状であり、かつ多孔性であるか中実であるかのいずれかであり得る。細胞付着用のマイクロキャリアの使用は、付着依存性の細胞の増殖を目的とする撹拌槽及び関連するリアクターの使用を容易にした。細胞は、容易に懸濁されたマイクロキャリアに付着した。懸濁可能である必要があることから、マイクロキャリアの物理的パラメーターは制限される。したがって、マイクロキャリアは一般には５０〜２０００マイクロメートルの範囲の中央粒径を有する。一部の用途では、中実型のマイクロキャリアが約１００〜約２５０マイクロメートルの範囲である一方で、多孔型のマイクロキャリアは約２５０〜約２５００マイクロメートルの範囲である。これらの寸法範囲は、多くの付着依存性の細胞を収容するのに十分な程度に大きく、かつ撹拌リアクター内での使用に好適な特性を有する懸濁液を形成するのに十分小さいマイクロキャリアの選別を可能にする。
【００４１】
マイクロキャリア及び同様物などを使用するに当たり考慮される因子は：付着効率、免疫原性、生体適合性、生分解能、コンフルエントに到達するまでの時間、単位表面積あたりの最大付着可能密度が挙げられる付着細胞の増殖パラメーター、必要とされる箇所での脱着技術、及び脱着効率、培養条件の拡張性並びにスケールアップ条件下での培養均一性、スケールアップ脱着手順を成功裏に実施する能力、及びマイクロキャリアが移植に使用可能かどうか、である。これらの検討事項は、マイクロキャリアの表面特性、並びにマイクロキャリアの多孔性、直径、密度及び操作特性により影響を受け得る。
【００４２】
例えば、マイクロキャリアの密度は検討事項である。密度が過剰だと、マイクロキャリアが懸濁液から沈殿する場合があり、あるいは培養容器の底に完全に沈殿したままである傾向があり、ひいてはリアクター内で混合する細胞、培養培地及びガス相の大容量性が乏しくなる場合がある。一方で、密度が低すぎる場合には、マイクロキャリアに過剰な流動性が生じ得る。１．０２〜１．１５ｇ／ｃｍ3の密度が、多くのマイクロキャリアについて一般的である。
【００４３】
リアクターに加えることのできる、マイクロキャリアの小さな直径と粒子容量は、マイクロキャリアに、ローラーボトル法又は付着依存性の細胞を増殖させるための他の方法（例えばプレート法）で見出されるものよりもはるかに大きい実質表面積を提供させる。多孔性マイクロキャリアは、単位容量又は単位重量当たりで更に大きい表面積を提供する。これらの多孔性マイクロキャリアは、付着依存性の細胞の増殖に利用可能な大きい空洞を保有する。これらの空洞は表面積を非常に増加させ、例えば混合時又はガス噴霧時のせん断ストレスなどのような、有害な機械的影響から細胞を保護し得る。
【００４４】
マイクロキャリア表面は、細胞付着性と細胞増殖性を高めるためにテクスチャ加工処理することができる。マイクロキャリア表面のテクスチャ加工は、限定するものではないが、型成形、鋳造、リーチング及びエッチングが挙げられる技術によりなされる。テクスチャ加工表面の特徴の解像度（resolusion）は、ナノスケールであり得る。テクスチャ加工表面は、マイクロキャリア表面上に特異的な細胞設置を誘導するために使用することもできる。多孔性マイクロキャリア内の孔表面も同様に、細胞付着性と細胞増殖性を高めるためにテクスチャ加工することができる。孔表面のテクスチャ加工は、限定するものではないが、例えば型成形、鋳造、リーチング及びエッチングなどの技術によりなされる。
【００４５】
マイクロキャリア表面は、マイクロキャリア表面に特異的な電荷を付与するためにプラズマコートされていてもよい。これらの電荷は、細胞付着性と細胞増殖性を高め得る。
【００４６】
他の実施形態では、マイクロキャリアは、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどの熱応答性ポリマーから構成され、又はこのようなポリマーでコートされ、すなわち電気機械的特性を有する。
【００４７】
多孔性でかつ中実型のマイクロ粒子キャリアのいずれもが供給元より市販されている。市販の中実マイクロキャリアの例としてはＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が挙げられ、これらの両方がＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのデキストラン系マイクロキャリアである。市販の多孔性マイクロキャリアとしては、同様にＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ製品並びにＣｙｔｏｐｏｒｅ製品が挙げられる。Ｂｉｏｓｉｌｏｎ（ＮＵＮＣ）及びＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ（Ｐｅｒｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ）もまた市販されている。
【００４８】
マイクロキャリアには、生物活性剤を含有させることもできる。マイクロキャリアにはまた、細胞の増殖若しくは機能、又は組織環境を制御し得る生物活性剤を含有させることができ、限定するものではないがこれらの因子としては線維芽細胞増殖因子、エリスロポエチン、血管内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、骨形成タンパク質、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子が挙げられる。完全な因子、模倣体又はこれらの活性断片を使用することができる。
【００４９】
マイクロキャリアに第２の細胞種を播種して、多能性幹細胞と共培養することもできる。一実施形態では、２種（又はそれ以上）の細胞型は、個々のマイクロキャリアに均一な割合で又は不均一な割合で付着し得る。２種以上の細胞種を、マイクロキャリア上に同時に播種することができ、あるいはそれらを異なる時点で播種することもできる。特異的な細胞型をマイクロキャリアの特異的な領域へと優先的に付着させるような様式で、マイクロキャリアを処理することができる。更なる実施形態では、単一の又は複数の細胞種が付着しているマイクロキャリアを、培養容器にて、懸濁液の状態で培養された第２の細胞種と共培養することができる。
【００５０】
例えば第２の細胞種としては、上皮細胞（例えば口腔粘膜細胞、胃腸管細胞、鼻粘膜上皮細胞、呼吸器上皮細胞、膣上皮細胞、角膜上皮細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、皮膚線維芽細胞、ケラチノサイト、血管内皮細胞（例えば大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞及び血管内皮前駆細胞（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、肝細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、ストローマ細胞、及び他の軟組織細胞又は前駆細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、島細胞、神経細胞（限定するものではないが、ニューロン、星状細胞、シュワン細胞、腸グリア細胞（enteric glial cells）、オリゴデンドロサイト）を挙げてもよい。
【００５１】
多能性幹細胞
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１種以上、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーを発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が消失し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は、一般にアルカリホスファターゼ活性を有し、この活性は、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆ．）により説明されるように、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、基質としてＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを使用して展開させることにより検出することができる。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
【００５２】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉の全ての細胞に分化し得るものである。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３胚葉からの細胞型のエビデンスについて組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在について評価することにより決定することができる。
【００５３】
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定し、次いで確立された、対応する霊長類種の核型と比較することができる。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、この「正常な核型」は、細胞が正倍数体であり、全てのヒト染色体が存在し、かつ著しく変更されてはいないことを意味する。
【００５４】
多能性幹細胞源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織、胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系が挙げられる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。同様に、例えば成体体細胞などの非多能性細胞由来の多能性幹細胞も好適である。
【００５５】
本発明での使用に好適なマイクロキャリアへの多能性幹細胞の付着
多能性幹細胞は、マイクロキャリアに付着させる前に、当該技術分野の任意の方法により、平面状基材にて培養してもよい。例えば多能性幹細胞は、細胞外マトリックスタンパク質（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ）で処理した平面状基材にて培養することができる。別の方法としては、多能性幹細胞は、フィーダー細胞層を播種した平面状基材にて培養することもできる。
【００５６】
一実施形態では、多能性幹細胞は胚性幹細胞である。別の実施形態では、胚性幹細胞はヒトのものである。
【００５７】
本発明の一態様では、多能性幹細胞は、平面状基材から細胞を放出させるプロテアーゼで、多能性幹細胞を処理することにより、平面状基材から放出される。例えばこのようなプロテアーゼは、コラゲナーゼ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、トリプシン及び同様物などであり得る。
【００５８】
一実施形態では、多能性幹細胞は、この細胞を約５〜約１０分にわたってＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）で処理することにより、マイクロキャリア基材から放出される。
【００５９】
一実施形態では、多能性幹細胞は、この細胞を約１０〜約２０分にわたって０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで処理することにより、マイクロキャリア基材から放出される。
【００６０】
一実施形態では、多能性幹細胞は、この細胞を約５〜約２０分にわたってＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで処理することにより、マイクロキャリア基材から放出される。
【００６１】
一実施形態では、多能性幹細胞は、この細胞を約５〜約１０分にわたって１０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼで処理することにより、マイクロキャリア基材から放出される。
【００６２】
放出された多能性細胞は、特定の密度でマイクロキャリアを含有している培地に加える。一実施形態では、多能性幹細胞は、約４，０００〜約３０，０００個細胞／ｃｍ2マイクロキャリアで播種される。
【００６３】
放出された多能性細胞は、マイクロキャリアを含有している培地に加える。一実施形態では、多能性幹細胞の付着性は、多能性幹細胞をＲｈｏキナーゼ阻害剤で処理することにより増加する。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤はＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）であり得る。あるいは、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤はＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドである。
【００６４】
一実施形態では、多能性幹細胞は約１μＭ〜約１０μＭの濃度のＹ２７６３２で処理される。一実施形態では、多能性幹細胞は約１０μＭの濃度のＹ２７６３２で処理される。
【００６５】
一実施形態では、多能性幹細胞は約０．２５μＭ〜約５μＭの濃度のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドで処理される。一実施形態では、多能性幹細胞は約２．５μＭの濃度のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドで処理される。
【００６６】
マイクロキャリアを含有している培地は撹拌してもよい。本発明で使用するとき、「撹拌」は培養培地の運動であり得る。このような撹拌は、手動で、あるいは例えば固定式プラットフォーム、スピナーフラスコ、及び同様物などのような装置で実施することができる。一実施形態では、マイクロキャリアを含有している培地は、手による運動を用いることで撹拌される。マイクロキャリアと細胞とを含有しているディッシュは、３０秒未満にわたって前後に動かされる。
【００６７】
マイクロキャリアを含有している培地を撹拌してもよい。一実施形態では、マイクロキャリアを含有している培地は、スピナーフラスコの使用により撹拌される。スピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）は、ビーズ型に応じて３０〜７０ＲＰＭに設定した撹拌プレートに設置する。
【００６８】
別の実施形態では、マイクロキャリアを含有している培地は、固定式プラットフォーム（Ｖａｒｉ−ｍｉｘ，Ｂａｒｎｓｔｅａｄ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，Ｉｏｗａ）の使用により撹拌される。固定式プラットフォームの速度は、２秒につき約１回転である。
【００６９】
マイクロキャリア上の多能性幹細胞の分化
一実施形態では、多能性幹細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へとマイクロキャリア上で分化し得る。あるいは、多能性幹細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へとマイクロキャリア上で分化し得る。あるいは、多能性幹細胞は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へとマイクロキャリア上で分化し得る。
【００７０】
別の実施形態では、多能性幹細胞は、マイクロキャリア上で増殖させ、次いで胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと平面状表面上で分化させることができる。あるいは、多能性幹細胞は、マイクロキャリア上で増殖させ、次いで胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと平面状表面上で分化させることができる。あるいは、多能性幹細胞は、マイクロキャリア上で増殖させ、次いで膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと平面状表面上で分化させることができる。
【００７１】
本発明の方法に従って処理された多能性幹細胞は、当該術分野における任意の適当な方法によって他の様々な細胞型に分化させることができる。例えば、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、神経細胞、心臓細胞、肝細胞などに分化させることができる。
【００７２】
例えば、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、国際公開第２００７０３０８７０号に開示される方法に従って神経前駆細胞及び心筋細胞に分化させることができる。
【００７３】
別の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、米国特許第６，４５８，５８９号に開示される方法に従って肝細胞に分化させることができる。
【００７４】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞は、当該技術分野における任意の方法により、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７５】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３、１５３４〜１５４１（２００５年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７６】
例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１６５１〜１６６２（２００４）により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７７】
例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９〜３８（２００７）により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７８】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７９】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群より選択される。本発明での使用に好適なものは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００８０】
他の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、血清は不含でアクチビンＡを含有している培地中で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と共に培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び様々な濃度の血清と共に培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている。
【００８１】
他の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、血清は不含でアクチビンＡを含有している培地中で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と共に培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）に開示されている。
【００８２】
他の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、血清は不含でアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含有している培地中で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドは除去し、細胞をアクチビンＡ及び血清と共に培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【００８３】
他の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、米国特許出願第１１／７３６，９０８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示される方法に従い、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００８４】
他の例では、本発明の方法に従って処理した多能性幹細胞は、米国特許出願第１１／７７９，３１１号に記載の方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００８５】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞は、当該技術分野における任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００８６】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００８７】
例えば、本発明の方法に従って得られる、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、この胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理し、次いで繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去した後に、レチノイン酸、繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。
【００８８】
例えば、本発明の方法に従って得られる、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、この胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第１１／７３６，９０８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従いレチノイン酸及び少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【００８９】
例えば、本発明の方法に従って得られる、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びエキセンディン４で処理し、次いでＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びエキセンディン４を含有している培地を除去し、続いてエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地で細胞を培養することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【００９０】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有している培地で培養し、次にエキセンディン４を含有している培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有している培地で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【００９１】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びエキセンディン４を含有している培地で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【００９２】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有している培地で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【００９３】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第１１／７３６，９０８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【００９４】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第１１／７７９，３１１号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【００９５】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第１１／７３６，９０８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【００９６】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第１１／７７９，３１１号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【００９７】
膵内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３及びＰＴＦ−１ αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを発現することができる：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。本発明で使用するのに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現している細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【００９８】
本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤＸ１と、以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、又はＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞である。
【００９９】
以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１００】
実施例１：マイクロキャリアに対するヒト胚性幹細胞の付着及び増殖
ヒト胚性幹細胞がマイクロキャリア上に付着しかつ増殖し得るか否かを判定するために、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓにより、継代数５２のＨ９細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートプレートから放出させた。次いでそれらをマイクロキャリアとＭＥＦ−ＣＭと共にインキュベートした。製造元からの取扱説明書に従い、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦ（ＰＮ）、Ｐｌａｓｔｉｃ（Ｐ）、ＰｌａｓｔｉｃＰｌｕｓ（ＰＰ）、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｈ）、コラーゲン（Ｃｏｌ）及びＦＡＣＴ ＩＩＩ（ＳｏｌｏＨｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリアの懸濁液を調製した。毎日の観察結果に基づき、表１はＨ９細胞の、３７℃にて２日経過後の、マイクロキャリアに対する付着と増殖を記載する。試験したほとんどのマイクロキャリアに対して、大部分の細胞は付着及び／又は増殖しなかった。Ｈ９細胞は、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に対しては付着し増殖したが、画像で示される細胞−ビーズ凝集体は、２日間の静置培養後にはより少なくなった（図１Ｂ）。
【０１０１】
マイクロキャリアに対するヒト胚性幹細胞の付着性と増殖性を改善するために、Ｒｈｏ結合コイルドコイル形成タンパク質セリン／スレオニンキナーゼの低分子阻害剤である、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を培地に添加した。具体的には、Ｙ２７６３２，Ｙ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を使用した。１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭは毎日交換した。１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）の存在下で、Ｈ９細胞は試験した全てのマイクロキャリアに付着し、凝集体を形成した（表２）。画像解析によると、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）で増殖させたヒト胚性幹細胞は、他のマイクロキャリアについて試験したヒト胚性幹細胞よりも、付着しかつ増殖しているように見えた。加えてＨ９細胞は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で、より良好にＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に付着した（図１Ａと図１Ｂとの比較による）。
【０１０２】
細胞治療用途のためのヒト胚性幹細胞の増量は、製品需要を満たす必要がある。現行の最も良好な増量技法としては、スピナーフラスコ法とバイオリアクター法が挙げられる。これらの技術のいずれもが、懸濁液中のマイクロキャリアの物理的な移動を必要とする。マイクロキャリア上でのヒト胚性幹細胞の増殖に対する移動効果を判定するために、６又は１２ウェルディッシュを、３７℃のインキュベーター内の固定式プラットフォームに設置した。３日間の増殖後、一部のマイクロキャリアから細胞凝集体が放出され始めた。図２のＡ、Ｂ、Ｄは、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓ、Ｐｌａｓｔｉｃ又はＰｒｏｎｅｃｔｉｎマイクロキャリアから脱着した細胞凝集体を記す。対照的に、図２Ｃの細胞は、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に付着したまま留まりかつ増殖した。実施例４は、Ｖｉａｃｏｕｎｔ Ｆｌｅｘを装備したＧｕａｖａ ＰＣＡ−９６（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で細胞を計数するのに先立つ、脱着法を記載する。マイクロキャリア上の細胞の増殖速度を測定することで、播種時の開始細胞数と比較して、３日目の細胞数が減少していることが明らかになった。これは、５日目に実験が終了するまでの間増量が続けられる細胞の、マイクロキャリアへの初期付着が乏しいことに由来する可能性が高い。Ｈ９細胞は、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に対し、他の種類のビーズと比較して最も速い増殖速度を有していたが、これはＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に対する、細胞のより良好な付着性に由来するものである可能性が高い（図２、３）。このことは、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）が、懸濁液中のＨ９細胞の増殖を支持し得ることを実証する。これは以降に繰り返される節の後に更に実証された。実施例５を参照されたい。
【０１０３】
ラージスケールでの増量のために、Ｈ１ヒト胚性細胞株をマイクロキャリア上での増殖性について同様に試験した。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）がＨ９細胞株の付着に必要とされたことから、この阻害剤はＨ１細胞についても同様に必要とされるであろうと推測された。Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ、Ｐｌａｓｔｉｃ、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦ、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリア（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を、製造元からの取扱説明書に従って調製した。継代数４７のＨ１ヒト胚性幹細胞を、約１３，３３３個細胞／マイクロキャリアｃｍ2（１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ中）で播種した。細胞とマイクロキャリアを、３７℃にて固定式プラットフォーム上の、１２ウェルの組織培養用無処理ディッシュ（１２ウェルあたり１５ｃｍ2）内に設置して、マイクロキャリアと培地に運動させた。３、５及び７日目後に、１つのウェルを画像化し、採取し、計数した。細胞の付着能は、ビーズの種類に依存した。Ｈ９細胞株で観察されたものと同様の結果が、Ｈ１細胞株についても観察された。具体的には、Ｐｌａｓｔｉｃ、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓ又はＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦマイクロキャリア上に播種した細胞は十分に付着せず、及び／又は十分に増殖しなかった（図４）。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア上に播種した細胞は十分に付着し、かつ十分に増殖した（図５）。実施例４に従って細胞を脱着し、収率について計数した。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）で増殖させた細胞は、培養７日後に最も大きい細胞数を呈した（図６）。
【０１０４】
実施例２：細胞の付着及び増殖のためのＹ２７６３２及び他のＲｈｏキナーゼ阻害剤の、至適濃度
マイクロキャリアに対するヒト胚性幹細胞の付着と増殖を最も支持するＲｈｏキナーゼ阻害剤濃度を決定するため、以下の実験を実施した。
【０１０５】
継代数４４のＨ９細胞の、１３，３３３個細胞／ｃｍ2の開始アリコートを、１２ウェルの組織培養用無処理プレートの単一ウェル内で、１５ｃｍ2マイクロキャリア上に播種した。３７℃にて固定式プラットフォームに設置する前に、細胞を３７℃にて少なくとも６０分間静置した。細胞を加える前に、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリアを、製造元から指示された通りに調製した。濃度範囲が１０、５、２．５又は１μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２、あるいは濃度範囲が５、２．５、１又は０．５μＭの（Ｓ）−（＋）−４−グリシル−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピンジヒドロクロリド（Ｇｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｈ），Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）を添加したＭＥＦ−ＣＭで細胞を増殖させた。培地を毎日交換し、収率と生存率について、１ウェルの細胞を播種後４日目と７日目に計数した（図７Ａ及びＢ）。全般的に、１０又は５μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）が最も良好な細胞増殖を示し（７日目）、その一方で２．５及び１．０μＭで最も良好な接着性を有しているように見えた（４日目）。濃度１及び０．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）は最も良好な細胞増殖を示し（７日目）、その一方で５μＭで最も良好な接着性を有しているように見えた（４日目）。
【０１０６】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、アポトーシスを促進すると特徴付けられてきたことから、次の用量設定法を試行した。継代数４８のＨ１細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓでＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートプレートから解離させた。次いで１２ウェルの、組織培養用無処理プレートの単一ウェル内の１５ｃｍ2マイクロキャリア上に、細胞を播種した。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、又はＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリアを、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の量を減少させて試験した：１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を１日目に使用し、次いで０．５μＭを２日目に使用（Ｙ１０／５μＭ）；２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）を１日目に、続いて０．５μＭを２日目に使用（Ｈ２．５／０．５μＭ）；１μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）を１日目に、０．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）を２日目に使用（Ｈ１／０．５μＭ）；あるいは０．２５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）をＭＥＦ−ＣＭに毎日添加（Ｈ０．２５μＭ）。３７℃にて固定式プラットフォームに設置する前に、３７℃にてＨ１細胞及びマイクロキャリアを３時間にわたって４５分毎に撹拌した。３７℃にて固定式プラットフォームでの３、５及び７日目に細胞を計数した（図８）。全般的に、Ｇｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）の最良の濃度は、１日目では１〜２．５μＭであり、２日目では０．５μＭであり、以降では化合物は断った。細胞は、試験した全てのマイクロキャリアについて、これらの濃度のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）で、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）と比較して同様の増殖速度を示した。０．２５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）で細胞を維持した場合、細胞収率は乏しかった。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を最小量で用いることは、プロセス費用を低減することにもつながり、かつ細胞増殖についても有益なものであり得る。同様にこれらのデータは、ヒト胚性幹細胞がマイクロキャリアへの付着性及び増殖性を維持するためには、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は必要とされないことを示す。
【０１０７】
実施例３：マイクロキャリア上での接着及び増殖に対する細胞密度の効果
播種密度の改善は、必要とされる細胞の総数を減少させるための一手段である。適切な播種密度を決定するために、４ｘ対物視野あたりのマイクロキャリア数を計数した。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）を含有している、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭの入った１０ｃｍプレートに、０．４×１０4個細胞／ｃｍ2（低密度）、１．２×１０4個細胞／ｃｍ2（中間密度）、又は３×１０4個細胞／ｃｍ2（高密度）の密度でＨ１細胞を播種した。次いでプレートを、３７℃で６時間にわたり、４５分毎に撹拌した。３７℃にて３０ｒｐｍのスピナーフラスコ（実施例５に記載）内の、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ ５０ｍＬに、細胞及びマイクロキャリアを移した。２４時間後に、５μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ ２５ｍＬを添加した。２４時間後、回転速度を４０ｒｐｍに上昇させた。培養の３日目及び５日目に、７５ｍＬのうちの５０ｍＬを除去し、ＭＥＦ−ＣＭで交換した。６時間、３日、５日及び７日の時点で、スピナーフラスコからアリコートを取って画像を撮影した。細胞の付着したマイクロキャリアの百分率を、図９の画像の右下に記載する。播種後３日目では、細胞でコートされたマイクロキャリアの数は開始播種密度と対応したが、低密度で播種した細胞では、細胞でコートされたマイクロキャリアの数は５日目及び７日目でも増加しなかった。このことは、０．４×１０4個細胞／ｃｍ2が、細胞をマイクロキャリアへと組み込ませて凝集体にするのに十分な細胞数ではないことを意味する。３×１０4個細胞／ｃｍ2では、細胞が付着したマイクロキャリアの数は、１．２×１０4個細胞／ｃｍ2を播種した場合の５日目及び７日目と同様であった（図９）。細胞数を見た場合、高密度での細胞播種では、より多くの細胞がマイクロキャリアに付着していることは明らかである（図１０）。開始播種細胞数と比較しての倍率変化（fold change）の解析では、高密度播種した培養物において、３日目及び５日目に、より多数の細胞が付着していたことを明らかになった（図１１）。７日目には、対照と高密度播種培養物は、それらの開始播種密度から、細胞数について同様の倍率で変化した。これらのデータから、我々は、Ｈ１細胞をマイクロキャリア上に効果的に付着させ、増殖させるためには、１．２×１０4個細胞／ｃｍ2が最小の細胞数であると結論付けた。より高い播種密度へと移行させることは、細胞の増量に必要とされる日数を減少させる助けとなり得る。
【０１０８】
実施例４：マイクロキャリアからの細胞の解離
増殖速度を判定するためには、マイクロキャリアから細胞を解離させる必要がある。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を除去しても、Ｈ１細胞はマイクロキャリアから解離しなかった（実施例２、図１２）。マイクロキャリアから細胞を解離する前に、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上のＨ９細胞を、倍率１０ｘ及び２０ｘで画像解析した（それぞれ図１３Ａ，Ｂ）。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上のＨ９細胞を酵素処理することで、生存細胞を脱着させた（図１３Ｃ，Ｄ及び１４）。３７℃にて固定式プラットフォーム上で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）を含有する６ウェルディッシュ中で、６日間にわたってＨ９細胞を増殖させた。マイクロキャリアに付着させた細胞を１５ｍＬコニカルチューブに設置し、マイクロキャリアを沈殿させた後に培地を吸引除去した。沈殿したマイクロキャリアを４ｍＬのＰＢＳ（マグネシウムイオン及びカルシウムイオン不含）で３回洗浄し、重量沈降によりマイクロキャリアを沈殿させた。ＰＢＳを吸引除去し、１ｍＬのＰＢＳを加えた。細胞を有するマイクロキャリアを、１２ウェルの組織培養用無処理プレートの単一ウェルに移した。プレートを、マイクロキャリアを沈殿させることができるような角度で静止させた。ＰＢＳを吸引除去し、１ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）又は０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡをウェルに加えた。プレートを、３７℃にて固定式プラットフォーム上に、１０〜２０分間にわたって設置した。プレートを取り外し、３ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＭＥＦ−ＣＭをウェルに添加した。培地を激しくピペッティングし、細胞を放出させた（図１３Ｃ，Ｄ）。顕微鏡下でのマイクロキャリアの観察は、細胞がマイクロキャリアから脱着したことを決定づけた。次いで細胞を、２００×ｇで５分間にわたって遠心した。培地を吸引除去し、ペレットを１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＭＥＦ−ＣＭ培地に再懸濁した。次いでＶｉａｃｏｕｎｔ ｄｙｅを用いて、Ｇｕａｖａ ＰＣＡ−９６（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で細胞を計数した。具体的には、培地で適切に希釈した２００μＬ容量の細胞を、２μＬのＶｉａｃｏｕｎｔと共に１０分間にわたってインキュベートした。生存率と細胞数を決定した（図１４）。ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ及びトリプシン／ＥＤＴＡの両方が、細胞をマイクロキャリアから効率的に解離した。
【０１０９】
ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓがマイクロキャリアから細胞を放出し、及びこれはＧＭＰ製品として利用可能なものであることから、他の可能性のある解離剤、具体的にはコラゲナーゼ及びＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）について試験を行った。継代数４８のＨ１細胞を、スピナーフラスコ中（実施例５）で１０日間にわたって増殖させた。次いでマイクロキャリアを回収し、５０ｍＬのコニカルチューブに移した。細胞を上記のようにＰＢＳで洗浄し、１２ウェルのプレートに移した。ＰＢＳを吸引除去し、１ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はコラゲナーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）をウェルに添加して、３７℃にて固定式プラットフォームに５〜１０分にわたって設置した。細胞／マイクロキャリアをＤＭＥＭ／Ｆ１２に激しく再懸濁し、次いで解離した細胞とマイクロキャリアを５０ｍＬのコニカルチューブ上で４０μｍのセルストレイナーを通して濾過した。ウェルを追加の培地２ｍＬで洗浄し、同様にセルストレイナーに加えて、２００×ｇで５分にわたって遠心した。次いで細胞を１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁し、上記のように細胞を計数するために希釈した。細胞生存率は、試験した全ての酵素で類似していた。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）とＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓは、５分及び１０分のインキュベーション後に同様の数の細胞を放出した（図１５）。これは、マイクロキャリア上のヒト胚性幹細胞のための細胞解離剤としての、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）とＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓの適合性を実証する。
【０１１０】
実施例５：マイクロキャリア上の未分化の多能性幹細胞の増殖
マイクロキャリア上の細胞を増量させるためには、細胞を、マイクロキャリアから脱着又は酵素的に解離させ、かつ新しいマイクロキャリアへと再付着させることができなければならない。マイクロキャリア上での一般的な細胞増殖方法は、細胞の脱着及び再付着特性に依存する。以下の実験は、これがヒト胚性幹細胞の特徴ではなかったことを示す。具体的には、継代数４３のＨ９細胞をＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上に播種し、１２５ｍＬのスピナーフラスコ中でインキュベートした（以下を参照のこと）。フェノールレッドが培地中に存在し、かつＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアにより取り込まれた（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）。８日間の増殖後に、マイクロキャリア上の細胞のアリコート１０ｍＬを、フェノールレッド不含ＭＥＦ−ＣＭと、４４０ｍｇのＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアと、５μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）とを含有している、新しいスピナーフラスコに設置した。３７℃にて３０ｒｐｍ回転でのインキュベーションの５日目に、マイクロキャリアを取り出して画像を得た（図１６）。黒っぽいマイクロキャリアは、フェノールレッドを含有している培地で増殖したＨ９細胞で覆われた、マイクロキャリアを示す。色味の明るいマイクロキャリアは、新しく加えたマイクロキャリアである。Ｈ９細胞が脱着し、新しいマイクロキャリアに再付着することが見込まれていたが、細胞は再付着する代わりに新しいマイクロキャリアと共に凝集体を形成した。色味の明るくないマイクロキャリアには細胞が付着しており、この細胞が黒っぽいマイクロキャリアとの凝集体を形成していないことは、細胞はマイクロキャリアから脱着しかつマイクロキャリアへと再付着することはできなかったことを示唆する。マイクロキャリア上の細胞の増殖を伝播させるためには、細胞をマイクロキャリアから酵素的に解離させる必要があった（実施例４を参照されたい）。
【０１１１】
現在では、ヒト胚性幹細胞をマイクロキャリア上で増殖させる方法が確立されているので、どのようにしてヒト胚性幹細胞をラージスケールのスピナーフラスコ中で増殖させるかを決定する必要がある。スピナーフラスコは、高密度系での細胞の増量を可能にする。これは空間の節約であり、バイオリアクター内で細胞を増量させるための第１工程であると考えられる。ヒト胚性幹細胞の、スピナーフラスコ中で増殖する能力について試験するために、継代数４３のＨ９細胞を１２５ｍＬのスピナーフラスコ中に播種した。細胞は、まず１０ｃｍプレート中でマイクロキャリアに付着させてからスピナーフラスコに移した。具体的には、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓと共に３７℃で５分間インキュベートすることで、Ｈ９細胞を２枚の６ウェルディッシュから放出させた。細胞はコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）で処理し、１：３０増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートプレートに播種した後に、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで処理した。細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁し、Ｖｉａｃｏｕｎｔを用いてＧｕａｖａ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで計数した。遠心後に、３×１０6個の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭと、製造元からの取扱説明書に従って調製した２５０ｃｍ2のＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）とを含有している、１０ｃｍのプレートに播種した。ディッシュを３７℃に設置し、穏やかに回転させ、４．５時間にわたって４５分毎に一度撹拌した。次いで細胞、マイクロキャリア及び培地を１２５ｍＬのスピナーフラスコに移した。次いでスピナーフラスコには１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ５０ｍＬを充填し、３７℃にて撹拌プレートに４０ｒｐｍで設置した。翌日、培地を交換し、５μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ７５ｍＬで充填した。撹拌速度は７０ｒｐｍに上昇させた。培地にはＹ２７６３２化合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を加えずに１日おきに交換した。実施例４に記載の方法に従って細胞を継代し、３×１０6個の細胞を、２５０ｃｍ2の新しいマイクロキャリアに再播種した。培養物は、１〜２×１０5個細胞／ｃｍ2コンフルエントに達したときに継代した。この操作を５継代実施した（図１７）。各継代での多能性マーカー発現では、細胞の８０〜９５％が多能性マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ３、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１を発現していたと評価された（図１９Ａ）。同様の実験を、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で、継代数４３のＨ９細胞についても実施した（図１８，１９Ｂ）。全般的に、細胞はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリアのどちらでも良好に増殖し、かつ多能性を保持した。スピナーフラスコ中で５回継代した後に核型解析を実施したところ、細胞の１．５％で、１２番染色体の異常なトリソミーが示された。これらの細胞は、実験の終了時には継代数５０付近であることから、観察されるこのような異常は一般的に生じる恐れがある。細胞継代数が低い状態で開始した場合に、このような仮定が生じるか試験した。
【０１１２】
継代数４８と継代数４９のＨ１細胞株についても、同様の実験を実施した。回転速度と播種密度を除き、全てのパラメーターは同様のままであった。スピナーフラスコの回転速度は、初日はオーバーナイトで３０ｒｐｍであり、以降の日では４０ｒｐｍに上昇させた。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）の場合の播種密度は約１１，０００個細胞／ｃｍ2であった一方で、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）の場合の播種密度は約７，０００個細胞／ｃｍ2であった。播種した細胞数はスピナーフラスコあたり３×１０6個細胞で一定であった。マイクロキャリアの重量は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）の場合、１００ｍｇで一定であった。Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）がＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアを上回る１つの利点は、それらのより大きな表面積である。図２０及び２１は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）のそれぞれの上でのＨ１細胞の増量を示す。細胞は５回の継代にわたって多能性を維持していた（図２２）。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上のＨ１細胞の核型解析は、試験した細胞の１０％で、Ｙ染色体に重複があることを明らかにした。これらのＨ１細胞はマイクロキャリア上に継代数４８で継代され、その後５回継代された後に解析された。平面状表面上のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）で増殖させた継代数５５のＨ１細胞は、正常な核型を有していた。３日間と経過日数間（５、６又は７日間）との間での、これらの細胞の倍加速度解析では、全般的に倍加時間に変化は見られなかった（図２３）。Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア上で増殖させたＨ１細胞及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上で増殖させたＨ９細胞は、ほとんど一定の倍加時間を示した（表３）。
【０１１３】
実施例６：制限培地中のマイクロキャリア上でのヒト胚性幹細胞の増殖
治療用製品を製造するためには、ヒト胚性幹細胞培養培地からいずれの動物成分も除外されていることが好ましい。現在、ヒト胚性幹細胞は、マウス胚性線維芽細胞を用いて馴化させた培地（ＭＥＦ−ＣＭ）中の、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）上で維持されている。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）及びＭＥＦ−ＣＭのいずれもがマウス細胞由来である。加えて、ＭＥＦ−ＣＭは高価であり、培地を生成するのに時間がかかる。ヒト胚性幹細胞が、制限培地を含むマイクロキャリア上で維持され得るかを判断するために、Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）又はＭＥＦ−ＣＭ中の、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）又は２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）の存在下で、Ｈ９細胞をＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア上に播種した。細胞を、３７℃にて固定式プラットフォーム上の１２ウェルディッシュ中に設置した。細胞を３、５及び７日目に計数した。継代数３９のＨ９細胞はＭＥＦ−ＣＭ中で、どちらの種類のビーズ上でも増殖し、一般的な増量特性を示した（図２４）。ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中で増殖させた同様の細胞は、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）の存在下で、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で良好に増殖したが、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア上では低い増殖率を呈した。２０回にわたって継代することでＳｔｅｍＰｒｏ培地に馴化された、継代数６４のヒト胚性幹細胞株Ｈ９（継代数６４のＨ９）細胞は、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）の存在下で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）のいずれでも良好に増殖した。驚くべきことに、これらの細胞は、２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）の存在下では、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上では良好には増殖しなかった。したがって、マイクロキャリアの種類、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、及び培地の全てが、ヒト胚性幹細胞の増殖能を決定する役割を果たす。
【０１１４】
継代数３８のＨ１ヒト胚性幹細胞を、１２ウェルのディッシュに、ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）又はＭＥＦ−ＣＭ中のＲｈｏキナーゼ阻害剤の、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）又は２．５μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）又はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアのいずれかに播種した。細胞を３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。細胞を３、５及び７日目に計数した。ＭＥＦ−ＣＭ中でＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）の存在下で増殖させた細胞は、両方の種類のマイクロキャリアで一般的な増量特性を示したが、Ｇｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリド（Ｔｏｃｒｉｓ，ＭＯ）の存在下では、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）に対して乏しい増殖率を示した（図２５）。ｍＴＥＳＲ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）は、どちらのＲｈｏキナーゼ阻害剤の存在下でも、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ マイクロキャリア上でＨ１細胞を増殖させたが、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリアに対しては低い増殖率が示された。
【０１１５】
ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアで良好に増殖した所与の継代数５０のＨ１細胞のうちの３×１０6個を、２５０ｃｍ2のＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアに播種した。３７℃で、５時間にわたって４５分ごとに手で撹拌しながら、１０ｃｍ2のディッシュ中でインキュベートした。１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を添加したｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を、１日おきに交換した。この操作を、ＭＥＦ−ＣＭで増殖させた細胞についても並行して実施した（実施例５）。ＭＥＦ−ＣＭで増殖させた細胞とは異なり、ｍＴＥＳＲ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）で増殖させた細胞は７日目にＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアから脱着し始めた（図２６Ａ対２６Ｂ）。このことは、ヒト胚性幹細胞にＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）に対する付着性及び増殖性を維持させるためには、ｍＴＥＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）に追加の成分を加える必要があることを示す。
【０１１６】
実施例７：マイクロキャリア上でのヒト胚性幹細胞の分化
ヒト胚性幹細胞がマイクロキャリア上で増量可能であることから、これらの細胞の分化の可能性が決定されるべきである。継代数４３のヒト胚性幹細胞株Ｈ９の細胞を、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で５回継代した。５回目の継代で、細胞をマイクロキャリア上で６日間にわたって増殖させた後、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓを用いてマイクロキャリアから解離させた（実施例４を参照されたい）。次いで細胞を、１：３０ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）：ＤＭＥＭ／Ｆ１２コートしたプレートに設置した。細胞がプレート上で８０〜９０％コンフルエントに達した後、細胞を分化誘導剤に曝露させた。１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）と、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ）と、８ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）とを添加した、２％ウシ血清アルブミンフラクションＶ（脂肪酸不含）（ＦＡＦ ＢＳＡ，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｏｈｉｏ）含有ＲＰＭＩで細胞を２日間にわたって処理することで、胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化を実施した。細胞は、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）と、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）とを添加した、２％ ＦＡＦ ＢＳＡ含有ＲＰＭＩで更に２日にわたって処理した。培地は毎日交換した。胚体内胚葉の細胞表面マーカーのＣＸＣＲ４についてＦＡＣＳ解析を実施したところ、８７％の細胞がマーカータンパク質を発現していたことが示された（図２７Ａ）。継代数４９のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で５回継代して増殖させて、同様の実験を実施したところ、マイクロキャリア上で分化した細胞の９１％がＣＸＣＲ４を発現していたことが明らかになった（図２７Ｂ）。このことは、マイクロキャリア上で増殖させた細胞は、インスリン産生細胞に分化するための第１段階である、胚体内胚葉へと分化できるということを実証している。
【０１１７】
３種のマイクロキャリア、すなわちＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）は、Ｈ１細胞を付着させ、増殖させる。これらの３種のマイクロキャリア上で、Ｈ１細胞の分化を実施した。スピナーフラスコ中のこれらのマイクロキャリア上で、様々な継代数（１〜５回）で細胞を増殖させた（実施例５）。マイクロキャリアと細胞との懸濁液の、６〜８日間にわたる継代後のアリコートを、６又は１２ウェルのプレートに移した。１２ウェルプレートあたり合計１５ｃｍ2のマイクロキャリアと細胞を、あるいは６ウェルプレートあたり３０ｃｍ2マイクロキャリアと細胞を移した。次いで分化誘導培地をプレートのウェルに加え、このプレートを３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）と、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ）と、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）とを添加した、２％ウシ血清アルブミンフラクションＶ（脂肪酸不含）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｏｈｉｏ）含有ＲＰＭＩで、２日間にわたって細胞を処理することで、胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化を実施した。１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）と、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）とを添加した２％ ＦＡＦ ＢＳＡ含有ＲＰＭＩで、更に２日間にわたって細胞を処理した。培地は毎日交換した。胚体内胚葉の細胞表面マーカーのＣＸＣＲ４について、ＦＡＣＳ解析を実施した（図２８）。胚体内胚葉への分化を支持してＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア、及びＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリアで細胞を増殖させたものではそれぞれ８７％と９２％であった一方で、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアはこの実験で試験した他のマイクロキャリアと同程度には分化を支持しなかった（４２％）。
【０１１８】
細胞密度がマイクロキャリア上の細胞の分化に影響を及ぼすか否かを判断するために、継代数４０のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、スピナーフラスコ中のＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で、８日間又は１１日間のいずれかで増殖させた。次いで約１５ｃｍ2当量のマイクロキャリアと細胞とを６ウェルディッシュに設置し、固定式プラットフォーム上に設置した。次いで細胞を、上記のような胚体内胚葉分化誘導培地中でインキュベートした。４日後に、ＣＸＣＲ４発現について細胞をＦＡＣＳにより解析した。スピナーフラスコ中で６日間にわたって増殖させた細胞の８７％がＣＸＣＲ４を発現していた一方で、スピナーフラスコ中で１１日間にわたって増殖させた細胞では、５６％がＣＸＣＲ４を発現していた（図２９）。このことは、分化させる前の細胞の培養日数が重要であることを実証し、具体的には、細胞密度が高すぎる場合には、細胞が効率的に分化できなくなる場合があることを実証する。
【０１１９】
付着性と増殖性が十分であると判断された３種のマイクロキャリアの全てで、ヒト胚性幹細胞が膵臓内胚葉細胞へと分化し得るか否かを判断するために、継代数４１のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（継代数４１のＨ１）を、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）及びＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）上に播種した（実施例１を参照されたい）。製造元の取扱説明書に従ってマイクロキャリアを調製した。３０ｃｍ2のマイクロキャリアを、低接着性の６ウェルプレートに移した。２枚の１０ｃｍ2プレートから、製造元からの取扱説明書に従って、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓによりＨ１細胞を解離させた。１ウェルあたり５×１０5個細胞で、細胞を播種した。実施例３に記載の方法に従って、ビーズへの細胞の付着を実施した。簡潔に述べると、細胞とマイクロキャリアを、３７℃にて、１０μＭのＹ２７６３２添加ＭＥＦ馴化培地中で４時間にわたって、１時間ごとに簡単に撹拌しながらインキュベートした。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア及びＣｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）マイクロキャリア上の細胞を、固定式プラットフォーム上に設置した。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上の細胞は、一晩静置した。以降、培地はＹ２７６３２不含の培地で毎日交換した。
【０１２０】
この実験では、乏しい付着性に起因して、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）プレートの細胞の大多数が、もはやマイクロキャリアに付着していなかった。しかしながら、より長い付着時間及び／又はより低速に固定された速度では、細胞付着性は改善され得る。７日後に、２％ ＢＳＡ（脂肪酸不含（ＦＡＦ））（Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）含有ＲＰＭＩと、以下の増殖因子：ｂＦＧＦ（８ｎｇ／ｍＬ，（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ））、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ，（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ））、Ｗｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））とを用い、細胞を胚体内胚葉へと分化させた。４日間にわたる第２の分化を通して、Ｗｎｔ３ａは不含の同様の培地で細胞を処理した。４日後の、２つ組試料のＦＡＣＳ解析では、７７〜８３％の細胞でＣＸＣＲ４レベルが陽性だったことが明らかになった。胚体内胚葉発現は、異なるマイクロキャリア上で増殖させた細胞間で、等価であった。図３０を参照されたい。
【０１２１】
次いで、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ））、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、２％ ＦＡＦ ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥＭ−ＨＧにより、細胞を更に２日間にわたって分化させた。これを、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ））、レチノイン酸（２μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、１％ Ｂ−２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥＭ−ＨＧにより、４日間にわたって処理した。次いで、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＤＡＰＴ（１μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（１μＭ，（Ａｘｘｏｒａ，ＣＡ））を添加した、１％ Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１３日，膵臓内胚葉，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ））含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥＭ−ＨＧにより、細胞を３日間にわたって分化させた。図３１は、Ｑ−ＰＣＲにより、膵臓特異的な遺伝子のＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＮＧＮ３の発現レベルを示す。ＣＴ値は、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア上で分化させた細胞が、効率的に分化せず、必要なβ細胞前駆体細胞マーカーを発現しないことを明瞭に示す。細胞は、３種のマイクロキャリアの全てで効率的に胚体内胚葉へと分化したが、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアでは、膵臓前駆体への更なる分化は効率的ではなかった。
【０１２２】
ヒト胚性幹細胞が、インスリン産生細胞へと更に分化し得るか否かを判断するために、継代数４５のＨ１細胞をＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上で増殖させ、上記と同様に分化させた。簡潔に述べると、製造元からの取扱説明書に従って、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓにより、１０ｃｍ2プレートからＨ１細胞を解離させた。６ウェルプレートのウェルあたり１又は２×１０6個細胞で細胞を播種した。ビーズへの細胞の付着を実施例３に記載する。簡潔に述べると、細胞とマイクロキャリアとを、１０μＭのＹ２７６３２を添加したＭＥＦ馴化培地中で、３７℃にて４時間にわたって、１時間ごとに簡単に撹拌しながらインキュベートした。次いで細胞を、一晩静置してインキュベートした。２日目に、培地を５μＭのＹ２７６３２を添加したＭＥＦ馴化培地に交換し、プレートを固定式プラットフォーム上に設置した。以降毎日、培地をＹ２７６３２は不含の培地と交換した。５日目に、培地を胚体内胚葉分化誘導培地（以下の増殖因子：ｂＦＧＦ（８ｎｇ／ｍＬ，（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ））、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ，（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ））、Ｗｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））を添加した、２％ ＢＳＡ（脂肪酸不含（ＦＡＦ））（Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）含有ＲＰＭＩ）と交換した。分化誘導の２日目及び３日目に、Ｗｎｔ３ａは不含の同様の培地で細胞を処理した。３日後の、２つ組試料のＦＡＣＳ解析では、９７〜９８％の細胞でＣＸＣＲ４レベルが陽性だったことが明らかになった。次いで、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）），ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、２％ＦＡＦ ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）含有ＤＭＥＭ−高グルコース（ＨＧ）により、更に２日間にわたって細胞を分化させた。これを、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ））、レチノイン酸（２μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、１％ Ｂ−２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）含有ＤＭＥＭ−ＨＧにより、４日間にわたって処理した。次いで、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＤＡＰＴ（１μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（１μＭ，（Ａｘｘｏｒａ，ＣＡ））を添加した、１％ Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）含有ＤＭＥＭ−ＨＧ又はＤＭＥＭ−Ｆ１２により、細胞を３日間にわたって分化させた。続いてこれを、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（１μＭ，（Ａｘｘｏｒａ，ＣＡ））を添加したＤＭＥＭ−ＨＧ又はＤＭＥＭ−Ｆ１２中で、７日間にわたって分化させた。最終分化はそれぞれＤＭＥＭ−ＨＧ又はＤＭＥＭ−Ｆ１２で５日間だった。合計２４日間にわたる分化が、膵臓内分泌ホルモンの発現を誘導する。図３２は、このエンドポイントの細胞の、ＦＡＣＳ解析結果を示す。播種密度が最も高く、かつ６〜２４日間にわたってＤＭＥＭ−ＨＧで分化させた細胞が、最も高レベルのインスリン発現を有していた（図３２）。
【０１２３】
別の方法としては、ヒト胚性幹細胞がインスリン産生細胞へと分化し得るか否かを判断するために、７日間にわたって継代数４４のＨ１細胞を、スピナーフラスコ中のＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で増殖させた（実施例５を参照されたい）。１５ｃｍ2／ウェルで、細胞とマイクロキャリアとを１２ウェルプレートに移し、これを３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。ＲＭＰＩの代わりにＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加して、細胞を上記のように胚体内胚葉へと分化させた。４日後のＦＡＣＳ解析では、３つ組解析において、７５〜７７％の細胞でＣＸＣＲ４レベルが陽性だったことが明らかになった。次いで、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ））、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、２％ウシ血清アルブミンフラクションＶ（脂肪酸不含）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２により、細胞を更に３日間にわたって分化させた。これを、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ））、レチノイン酸（２μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ，（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＮＪ））を添加した、１％ Ｂ−２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２により、４日間にわたって処理した。次いで、ノギン（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ネトリン４（１００ｎｇ／ｍＬ，（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ））、ＤＡＰＴ（１μＭ，（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ））、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（１μＭ，（Ａｘｘｏｒａ，ＣＡ））を添加した、１％ Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１５日，膵臓内胚葉，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ））含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２により、細胞を３日間にわたって分化させた。続いてこれを、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（１μＭ，（Ａｘｘｏｒａ，ＣＡ））を添加した、１％ Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２１日，膵内分泌細胞，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ））含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で６日間処理した。７日間にわたる最終処理では、１％ Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２８日，インスリン発現細胞，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ））を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いた。図３３は、Ｑ−ＰＣＲにより、膵臓特異的な遺伝子のインスリン、Ｐｄｘ１及びグルカゴンの発現レベルを示す。マイクロキャリアについてのデータは、前出のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートした平面状表面で分化させた継代数４２のＨ１細胞と比較する。マイクロキャリアで分化させた細胞では、これらの膵臓特異的遺伝子の発現レベルは、平面状表面で分化させた細胞と比較して同様であるか、あるいはそれよりも勝っている。
【０１２４】
同様の実験を、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で及び拡張型スピナーフラスコ中で継代した、継代数３８のＨ９細胞で実施した。１５ｃｍ2のマイクロキャリアと細胞とのアリコートを１２ウェルプレートに設置し、分化誘導培地と共に、固定式プラットフォーム上に設置した。これを、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）コートした６ウェルプレート上に設置した、細胞と比較した。ＲＰＭＩとサプリメント（supplements）の中で胚体内胚葉への細胞の分化を実施したところ、平均して８３％の細胞がＣＸＣＲ４を発現していたのに対して（試料は２つ組）、平面状基材上では７２％の細胞がＣＸＣＲ４を発現していた（図３４）。更に膵臓内胚葉（１５日）、膵内分泌細胞（２２日）及びインスリン発現細胞（２９日）への分化では、マイクロキャリア上で増殖させた細胞と、平面状基材上で増殖させた細胞との間では、インスリン及びグルカゴンについて同様の発現レベルが示された（図３５）。培地成分は、更に１日内分泌細胞分化誘導成分で処理した、上記のＨ１分化誘導実験について列挙したものと同一のものであった。インスリン発現ステージでは、細胞は２２日のものと比較してインスリン発現の驚くべき減少を示した。この減少は、マイクロキャリア試料及び平面試料の双方で指摘されたことから、付着基材によるものである可能性は低い。このことは、Ｈ９細胞が、マイクロキャリア上でも少なくとも膵内分泌細胞へと良好に分化し得るということを示す。
【０１２５】
全般的に、２種の異なるヒト胚性幹細胞株のＨ１とＨ９は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で膵内分泌細胞へと分化でき、これらの細胞をラージスケールの培養系で増量及び分化させることの可能性を実証する（図１７、２１、３３及び３５）。ヒト胚性幹細胞は、少なくとも３種のマイクロキャリアビーズに付着及び増殖できたが、この細胞は少なくとも胚体内胚葉へと分化し得る（図２８）。これらの結果は、治療用途のためにヒト胚性幹細胞を増殖させ分化させ得る方法を実証する。
【０１２６】
実施例８：３Ｄマイクロキャリア系培養法で単独の細胞として継代したヒト胚性幹細胞は、多能性を維持しつつ、ＥＣＭ不含表面に移して培養することができる。
Ｈ１ヒト胚性幹細胞を、実施例５に記載の方法に従ってマイクロキャリア上で培養した。細胞をマイクロキャリアから取り外し、３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを添加したＭＥＦＣＭ１６と共に、Ｎｕｎｃ４、Ｎｕｎｃ１３、ＣＥＬＬＢＩＮＤ（商標）、又はＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）平面状表面に蒔いた。細胞は６ウェルプレートに１００，０００個細胞／ｃｍ2の密度で播種し、次いで各表面上で更に１継代培養した。次いで細胞を、ＴｒｙｐＬＥで浮かせてフローサイトメトリーにより多能性マーカーについて試験するか、ｍＲＮＡ精製及びｑＲＴ−ＰＣＲのためにウェル中でＲＬＴに溶解させるか、あるいは胚体内胚葉へと分化させるかした。２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを添加したＲＰＭＩ培地で２４時間にわたって細胞を処理することで、分化を誘導した。次いで培地を、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを添加したＲＰＭＩ培地に交換し、更に４８時間にわたって培地を毎日交換した。
【０１２７】
フローサイトメトリー又はｑＲＴ−ＰＣＲのいずれかを用いて多能性マーカーにより測定したところ、マイクロキャリア上で培養した後にＮｕｎｃ４、Ｎｕｎｃ１３、ＣｅｌｌＢＩＮＤ又はＰｒｉｍａｒｉａ組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）平面状表面へと移した細胞は、各平面状表面上で２回継代した後に多能性を維持していた（図３６）。加えて細胞は、フローサイトメトリー又はｑＲＴ−ＰＣＲのいずれかにより測定されるものとして、胚体内胚葉運命への分化能を維持していた（図３７）。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）マイクロキャリア上で継代し、胚体内胚葉へと分化させたＨ１及びＨ９ヒト胚性幹細胞の比較試験でも、同様の結果が得られた（図３８）。
【０１２８】
これらの結果は、ヒト胚性幹細胞を、マイクロキャリア上で継代した後に、次いで多能性を維持しつつ他の表面上で培養することができることを示す。細胞を他の表面へと移して効率的に分化誘導することもできる。
【０１２９】
実施例９：ヒト胚性幹細胞は、有糸分裂を不活性化した線維芽細胞フィーダー上でのクラスター／コロニー形式の培養から、少なくとも１０回の継代にわたる、ＥＣＭ不含表面上での単独細胞としての培養へと、多能性を損なうことなく、及び線維芽細胞フィーダーを手動で除去することなく直接移行させることができる。
ヒト胚性幹細胞株は、現在のところ、単独の細胞が増殖したコロニー、又は胚盤胞由来の少数の細胞のクラスターを発展させる方法に由来する。次いでこのコロニーを連続的に継代し、細胞株を構成するのに十分な細胞クラスター／コロニーが利用できるようになるまで増殖させる。ヒト胚性幹細胞の多能性と核型安定特性を維持することを目的として、一度細胞株が誘導されると、高度に再現性のあるヒト胚性幹細胞培養のための、当該技術分野の現行の標準方法では、有糸分裂不活性化線維芽細胞のフィーダー細胞層上の、ヒト胚性幹細胞クラスター／コロニーを維持し、及び手作業での撹乱（manual disruption）又はコラゲナーゼ若しくは中性プロテアーゼ若しくはこれらのブレンドでの穏やかな酵素的大容量継代を用いて、細胞を継代する。これらの継代法はヒト胚性幹細胞クラスターを維持し、かつヒト胚性幹細胞の、コロニー形式の増殖を促進する。安定したヒト胚性幹細胞株の確立後、この細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）基質へと移すことができる。しかしながら、細胞を線維芽細胞フィーダー上で増殖させるかあるいはＥＣＭ基質上で増殖させるかのいずれにせよ、技術者に具体的に指示されるヒト胚性幹細胞に関して推奨される継代法は、ヒト胚性幹コロニーを十分に解離させはしない。
【０１３０】
現行の最も良好な、哺乳類細胞のラージスケール培養の実施法は、３次元培養容器を使用するものである。この容器は恒常性、つまり一定の状態を厳密に維持し、かつ足場依存性の細胞を支持するためにマイクロキャリアを組み込むことができる。しかしながら、ヒト胚性幹細胞培養（線維芽細胞フィーダー上又はＥＣＭ基質上で増殖させる）、及びクラスター／コロニー形式での培養に使用される現行の標準法は、マイクロキャリア上でのヒト多能性胚性幹細胞培養物の良好な増殖及び維持に対して技術的な障害を提起することになるが、それは、これらの方法をラージスケールでのマイクロキャリア培養に転用するのは容易ではないからである。マイクロキャリアでヒト胚性幹細胞を効果的に増殖させるためには、ヒト胚性幹細胞培養物は、当該技術分野の現行標準法でのようなコロニー又はクラスターとしてではなく、単独細胞として継代可能であるべきである。加えて、ヒト胚性幹細胞は、フィーダー細胞層又はＥＣＭ基質無しに増殖可能であるべきである。
【０１３１】
我々は、これらの技術的障害に取り組む方法を以下に記載する。我々は、有糸分裂不活性化線維芽細胞フィーダー層上のクラスター／コロニーに基づくヒト胚性幹細胞培養を、線維芽細胞フィーダー層、又はＭＡＴＲＩＧＥＬ若しくは他の細胞外マトリックス基質でコートした表面が下層として存在する必要のない単独細胞培養系へと、直接転換する方法を実証する。この方法は、何らかの方法により線維芽細胞フィーダー細胞を手動で除去する必要のない、あるいは総細胞集団から多能性細胞を選別する必要のない、ヒト胚性幹の大容量の継代を活用することで、培養を、コロニー形式の線維芽細胞フィーダー系培養から、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下で、ＰＲＩＭＡＲＩＡでの、フィーダー不含／マトリックス不含の培養へと直接転換する。この方法は、必要量を制御するように付着させるための密閉容器で達成でき、並びに多能性及び胚体内胚葉への分化能を保持し、かつ線維芽細胞の細胞集団は含有しない、非常に均質なヒト胚性幹培養物を生成する。
【０１３２】
方法：培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄し、次いで細胞を解離酵素（コラゲナーゼ，Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標），又はＴｒｙｐＬＥ）で処理することにより、細胞をルーチン的に継代した。コラゲナーゼは濃度１ｍｇ／ｍＬで使用した；Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又はＴｒｙｐＬＥは、１Ｘ貯蔵濃度で使用した。全ての酵素は室温に戻してから使用した。２％ ＢＳＡのＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液を各ウェルに添加し、細胞を酵素で処理した後に、この細胞を溶液に均一に懸濁した。次いで細胞を２００ｇで５分間にわたって遠心し、細胞ペレットと、追加の、２％ ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液とを、再懸濁した細胞に加え、この細胞懸濁液を５０ｍＬの滅菌コニカルチューブに分注して２００ｇで５分間にわたって遠心した。
【０１３３】
我々は連続的な方法を用い、ＭＥＦ系培地をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）、ＴｒｙｐＬＥ（商標）、又はコラゲナーゼのいずれかで処理し、クラスター／コロニー形式のヒト胚性幹細胞をＰｒｉｍａｒｉａ表面に高密度継代することで、線維芽細胞フィーダーを除去した。最初の継代で、細胞を、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）馴化培地（ＣＭ）に１：３０希釈したＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートしたＴ−２５フラスコに蒔くか、あるいは細胞を、Ｔ−２５ ＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）培養フラスコ中の、３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを添加したＭＥＦ−ＣＭに蒔くかした。全ての細胞を１：３．５の分割比で蒔き、かつ細胞を１０分間にわたって酵素に曝露した。ＴｒｙｐＬＥ（商標）又はＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）で浮かせた細胞の細胞数を、トリパンブルー染色した細胞を血球計算板を用いて計数することで判定した。細胞を蒔いた後、培地は毎日交換し、ＭＥＦ−ＣＭ＋３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドに蒔いたこの細胞に、毎日ＭＥＦ−ＣＭ＋１μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを供給し、多能性及び分化に関するｍＲＮＡマーカーの発現について、試料を解析した。マトリックス不含条件下で、単独細胞として２回継代したｈＥＳＣｓは、多能性遺伝子の遺伝子発現を維持し、かつ分化遺伝子の発現は阻害した（図３９）。
【０１３４】
２回目の継代：ＴｒｙｐＬＥ（商標）又はＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）に１０分曝露することで、細胞を分割比１：４で継代した。我々はまた、細胞を処理し、脱着についてモニターすることにより経験的に決定した、より短い酵素曝露時間を導入した。我々は、細胞を浮き上がらせるのには、ＴｒｙｐＬＥ（商標）に対しては３分間の曝露、及びＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）に対しては５分間の曝露で十分であることを観察した。酵素で細胞を処理した後に、細胞を上記のように継代し、細胞ｍＲＮＡのアリコートを、継代時にｑＲＴ−ＰＣＲ用に採取した。
【０１３５】
３回目の継代：コンフルエンスに達したら細胞をＰＢＳで洗浄し、３分若しくは１０分（ＴｒｙｐＬＥ（商標））又は５分若しくは１０分（Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標））かけて酵素によりバラバラにし、２％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２に懸濁し、遠心し、２％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で再度洗浄し、遠心し、次いで再懸濁して各培地に蒔いた。この継代時には、細胞を１：４比で、並びに同様に更に２種の分割比（１：８及び１：１６）で蒔いた。各継代時に、細胞ｍＲＮＡのアリコートをｑＲＴ−ＰＣＲ用に採取した。
【０１３６】
４回目以降の継代：２回目及び３回目の継代時に採用された、酵素への曝露時間と継代比についての条件を、４回目以降の継代でも維持した。培養物がコンフルエンスまで増殖したら、細胞をＰＢＳで洗浄し、特定の時間をかけて酵素によりバラバラにし、２％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２に懸濁し、遠心し、２％ ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で再度洗浄し、遠心し、次いで再懸濁して各培地に特定の蒔き込み比で蒔いた。ＰＲＩＭＡＲＩＡに細胞を蒔くための培地には、蒔く際に３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを添加した。細胞を蒔いた後、培地は毎日交換し、ＭＥＦ−ＣＭ＋３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドに蒔いたこの細胞に、毎日ＭＥＦ−ＣＭ＋１μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドを供給した。継代時に、ｑＲＴ−ＰＣＲ用に細胞ｍＲＮＡのアリコートを採取した。
【０１３７】
８回を超える継代時には、継代終了時に、多能性表面マーカーに関するフローサイトメトリーによって（図４０）、並びに多能性マーカー及び分化マーカーに関するｑＲＴ−ＰＣＲによって（図４１、４２及び４３）、多能性について細胞を解析した。２％ ＢＳＡと、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａと、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと、３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドとを添加したＲＰＭＩ培地で２４時間にわたって細胞を処理することで、細胞を同様に胚体内胚葉へと分化させた。次いで培地を、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び３μＭのＧｌｙｃｙｌ−Ｈ１１５２ジヒドロクロリドを添加したＲＰＭＩ培地に交換し、更に４８時間にわたって培地を毎日交換した。次に、胚体内胚葉へと分化させた試料を、フローサイトメトリーによって、胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４の存在について試験した（図４０）。
【０１３８】
これらの結果は、コロニー形式の、線維芽細胞フィーダー系培養物から、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤のＧｌｙｃｙｌ−Ｈ １１５２ジヒドロクロリドの存在下の、ＰＲＩＭＡＲＩＡでのフィーダー不含／マトリックス不含培養への大容量の継代は、多能性及び胚体内胚葉への分化能を保持し、かつ線維芽細胞の細胞集団は含有しない非常に均質なヒト胚性幹細胞培養物を生じることを示す。
【０１３９】
実施例１０：組織培養用プラスチックからマイクロキャリアへのヒト胚性幹細胞の移動
Ｈ１細胞を、ＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）組織培養プレート（実施例９の方法）で培養し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓにより３〜５分処理することで放出させ、１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ中にＣｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）又はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリアを含む６ウェルの組織培養用無処理プレートに播種した。対照として、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）でコートしたプレートで増殖させ、かつコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて継代した、継代数４６のＨ１細胞を放出させ、同様の方法でマイクロキャリアに播種した。プレートを、３７℃で５時間にわたって、４５分ごとに手で撹拌しながらインキュベートした。次いでプレートを３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。培地は、毎日１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭで交換した。画像解析は、３日目の時点で、マイクロキャリアに対する細胞の良好な付着を示す（図４４）。７日後に細胞を放出させ（以下の実施例４に記載）、多能性マーカーのＣＤ９、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１に関してＦＡＣＳで解析した（図４５）。多能性マーカーのほとんどが、９０〜１００％の細胞で発現していた。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリアで増殖させようが、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリアで増殖させようが、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）で継代した細胞とＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で継代した細胞の間に明瞭な違いは存在しない。全般的に、細胞は、ＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）細胞培養用プラスチックからマイクロキャリアに移した場合に多能性を保持した。
【０１４０】
次に、マイクロキャリア上のこれらのＨ１細胞は、胚体内胚葉へと分化した。この方法は実施例７に記載する。分化の４日後に、Ｈ１細胞をマイクロキャリアから放出させ、ＦＡＣＳ解析を実施したところ、８２％を超える細胞がＣＸＣＲ４を発現していることが示された。図４６を参照されたい。細胞は、マイクロキャリアの種類又はＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）（カタログ番号３５３８４６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から継代する際の酵素には関係なく、胚体内胚葉へと効率的に分化した。これは増量系の柔軟性を証明し、かつプラスチック及びマイクロキャリア上にマトリックスを必要とすることなく細胞を増殖させる。
【０１４１】
実施例１１：セルロース混合エステルからなる平面状基材からマイクロキャリアへのヒト胚性幹細胞の移動
米国特許出願第６１／１１６，４５２号に開示の方法に従って、セルロース混合エステルからなる平面状基材で、Ｈ１細胞を１２継代にわたって培養した。ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで３〜５分処理することで平面状基材から細胞を放出させ、１０ｍＭのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）添加ＭＥＦ−ＣＭ中にＣＹＴＯＤＥＸ ３（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）マイクロキャリア又はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリアを含む６ウェルの組織培養用無処理プレートに播種した。対照として、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）でコートしたプレートで増殖させ、かつコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて継代した、継代数４４のＨ１細胞を放出させ、同様の方法でマイクロキャリアに播種した。プレートを、３７℃で５時間にわたって、４５分ごとに手で撹拌しながらインキュベートした。次いでプレートを３７℃にて固定式プラットフォーム上に設置した。培地は毎日交換した。７日後に細胞を放出させ（実施例４に記載）、多能性マーカーのＣＤ９、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１に関してＦＡＣＳで解析した（図４７）。ほとんどの多能性マーカーが、９０％を超える細胞で発現していた。ＣＹＴＯＤＥＸ ３（登録商標）マイクロキャリアで増殖させた細胞と、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアで増殖させた細胞との間に明瞭な違いは存在しなかった。継代数４４のＨ１対照細胞は、多能性が他の実験により確認されていたことから、ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアで増殖させた後の多能性について試験しなかった（実施例５を参照されたい）。全般的に、細胞は、セルロース混合エステルからなる平面状基材からマイクロキャリアへと移した場合にも多能性を維持していた。
【０１４２】
次に、実施例７に記載の方法に従って、マイクロキャリア上のＨ１細胞を胚体内胚葉へと分化させた。分化の４日後に、Ｈ１細胞をマイクロキャリアから放出させ、ＦＡＣＳ解析を実施したところ、６５％を超える細胞がＣＸＣＲ４を発現していることが示された（図４８）。細胞は、マイクロキャリアの種類とは無関係に効率的に胚体内胚葉へと分化した。ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ，ＭＩ）マイクロキャリア上で胚体内胚葉へと分化した細胞の数は少数であったように思われる。細胞の分化能は、増量系の柔軟性を証明する。加えて細胞を、動物成分マトリックスに対する任意の必要性を除去して、メンブレン及びマイクロキャリア上に直接増殖させかつ分化させることができる。
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
【表２】
【０１４５】
【表３】
【０１４６】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の増殖方法であって、
ａ．多能性幹細胞集団を、第１容量のマイクロキャリアに付着させる工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、前記第１容量のマイクロキャリア上で培養する工程と、
ｃ．前記多能性幹細胞を、前記第１容量のマイクロキャリアから取り外す工程と、
ｄ．前記多能性幹細胞集団を、第２容量のマイクロキャリアに付着させる工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記マイクロキャリア上の多能性幹細胞を培養する工程、取り外す工程及び付着させる工程が、連続容量のマイクロキャリアを用いて繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１容量のマイクロキャリアが、デキストランマイクロキャリア及びポリスチレンマイクロキャリアからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２容量のマイクロキャリアが、デキストランマイクロキャリア及びポリスチレンマイクロキャリアからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含有している培地中で、前記第１容量のマイクロキャリアに付着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性幹細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含有している培地中で、前記第２容量のマイクロキャリアに付着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記多能性幹細胞を、酵素処理により前記第１容量のマイクロキャリアから取り外す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記多能性幹細胞を、酵素処理により前記第２容量のマイクロキャリアから取り外す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞を前記第２容量のマイクロキャリアに付着させる前に、前記細胞から前記第１容量のマイクロキャリアを取り外す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
多能性幹細胞を、インスリンを発現している細胞へとマイクロキャリア上で分化させる方法であって、
ａ．前記多能性幹細胞を、ある容量のマイクロキャリアに付着させる工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程と、
ｅ．前記膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、インスリンを発現している細胞へと分化させる工程と、を含む、方法。
【請求項１】
多能性幹細胞の増殖方法であって、
ａ．多能性幹細胞集団を、第１容量のマイクロキャリアに付着させる工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、前記第１容量のマイクロキャリア上で培養する工程と、
ｃ．前記多能性幹細胞を、前記第１容量のマイクロキャリアから取り外す工程と、
ｄ．前記多能性幹細胞集団を、第２容量のマイクロキャリアに付着させる工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記マイクロキャリア上の多能性幹細胞を培養する工程、取り外す工程及び付着させる工程が、連続容量のマイクロキャリアを用いて繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１容量のマイクロキャリアが、デキストランマイクロキャリア及びポリスチレンマイクロキャリアからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２容量のマイクロキャリアが、デキストランマイクロキャリア及びポリスチレンマイクロキャリアからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含有している培地中で、前記第１容量のマイクロキャリアに付着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性幹細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含有している培地中で、前記第２容量のマイクロキャリアに付着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記多能性幹細胞を、酵素処理により前記第１容量のマイクロキャリアから取り外す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記多能性幹細胞を、酵素処理により前記第２容量のマイクロキャリアから取り外す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞を前記第２容量のマイクロキャリアに付着させる前に、前記細胞から前記第１容量のマイクロキャリアを取り外す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
多能性幹細胞を、インスリンを発現している細胞へとマイクロキャリア上で分化させる方法であって、
ａ．前記多能性幹細胞を、ある容量のマイクロキャリアに付着させる工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程と、
ｅ．前記膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、インスリンを発現している細胞へと分化させる工程と、を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【公表番号】特表２０１２−５０９０８５（Ｐ２０１２−５０９０８５Ａ）
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３７６０３（Ｐ２０１１−５３７６０３）
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６５０６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５９７７５
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６５０６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５９７７５
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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