本発明は、低レベルのマイクロサテライト不安定性（ＭＳＳ）を示す腫瘍に対して、高レベルのマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）を示す結腸直腸腫瘍において過剰発現され、したがって、患者においてＭＳＩ−Ｈを同定するために使用でき、さらに患者の予後に役立ち、疾患の進行／退縮をモニターし、適当な治療計画を同定し、治療の有効性を評価するために使用できる核酸配列に関する。

【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
結腸直腸癌腫は悪性新生物性疾患である。西欧諸国、特に、米国では、結腸直腸癌腫の罹患率が高い。この種の腫瘍は、リンパ管および脈管によって転移することが多い。結腸直腸癌腫を患う多数の患者が、この疾患のために最終的に死亡する。実際、米国単独で、毎年、６２，０００人が結腸直腸癌腫のために死亡すると推定されている。
【０００２】
しかし、結腸直腸癌は、早期に診断されれば、癌組織の外科的切除によって効果的に治療できる。結腸直腸癌は結腸直腸上皮において始まり、通常、進行の初期ステージの間は広範に血管新生していない（ひいては、浸潤性でない）。結腸直腸癌は、結腸または直腸の上皮層における単一の変異細胞のクローン増殖に起因すると考えられている。全身に広がる、高度に血管新生化した、浸潤性の、最終的な、転移性癌への移行には、通常、１０年以上かかる。癌が浸潤する前に検出されれば、癌組織の外科的切除が有効な治療法である。しかし、結腸直腸癌は、疼痛および黒いタール状の便といった臨床症状の出現時にのみ検出されることが多い。一般に、このような症状は、疾患が十分に確立された場合にのみ、多くは転移が起こった後に存在し、患者の予後は、癌組織の外科的切除後でさえ悪い。したがって、結腸直腸癌の早期検出は、検出によってその死亡率を大幅に低減できるという点で重要である。
【０００３】
内視鏡検査などの侵襲的診断法により、ポリープなどの癌の可能性がある増殖の直接的視覚的同定、除去および生検が可能となる。内視鏡検査は高額であり、不快なものであり、本質的に危険なものであるので、結腸直腸癌を有するものを同定するために集団をスクリーニングするための実用的ツールではない。結腸直腸癌または前癌状態の存在を示す特徴についての糞便サンプルの非侵襲的分析が、初期診断のための好ましい代替法であるが、この目的を確実に達成する公知の診断法はどれも利用できる状態ではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、低レベルのマイクロサテライト不安定性（ＭＳＳ）を示す腫瘍に対して、高レベルのマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）を示す結腸直腸腫瘍において過剰発現され、したがって、患者においてＭＳＩ−Ｈを同定するために使用でき、さらに患者の予後に役立ち、疾患の進行／退縮をモニターし、適当な治療計画を同定し、治療の有効性を評価するために使用できる核酸配列に関する。
【０００５】
一態様では、本発明は、被験体において結腸癌の存在を検出する方法であって、前記被験体から生体サンプルを得るステップと、前記サンプルにおいて配列番号１〜３４のうち１種以上の配列の存在を検出するステップであって、前記の１種以上の配列の存在が前記被験体における結腸癌を示すステップとを含む方法を提供する。
【０００６】
一実施形態では、結腸癌を有していないことがわかっている対照被験体における前記配列の発現レベルと比較して、少なくとも２倍の前記配列の過剰発現が、前記被験体における結腸癌の存在を示す、前記配列の発現レベルを調べるステップ。
【０００７】
さらなる実施形態では、検出するステップは、前記生体サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で1種以上の前記配列とハイブリダイズする核酸プローブと接触させるステップと、前記核酸プローブの、前記の１種以上の前記配列とのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、ハイブリダイゼーションの検出が前記サンプルにおける前記の１種以上の配列の存在を示すステップとを含む。
【０００８】
一実施形態では、核酸プローブは検出可能なように標識されている。
【０００９】
さらなる実施形態では、被験体はヒトである。
【００１０】
もう1つの態様では、本発明はまた、被験体において結腸癌の存在を検出する方法であって、前記被験体から生体サンプルを得るステップと、前記サンプルにおいて、配列番号３５〜６８のうち１種以上のアミノ酸配列の存在を検出するステップであって、前記の１種以上の配列の存在が前記被験体における結腸癌を示すステップとを含む方法を提供する。
【００１１】
一実施形態では、検出するステップは、前記生体サンプルを、前記の１種以上のアミノ酸配列と結合できるポリペプチドリガンドと、前記ポリペプチドリガンドが前記の１種以上のアミノ酸配列と結合するのを可能にする条件下で接触させるステップと、前記ポリペプチドリガンドの、前記の１種以上のアミノ酸配列との結合を検出するステップであって、結合の検出が前記サンプルにおける前記の１種以上のアミノ酸配列の存在を示すステップとを含む。
【００１２】
一実施形態では、ポリペプチドリガンドは抗体である。
【００１３】
さらなる実施形態では、ポリペプチドリガンドは、検出可能な標識を含む。
【００１４】
一実施形態では、被験体はヒトである。
【００１５】
もう1つの態様では、本発明はまた、個体においてマイクロサテライト不安定性を検出する方法であって、前記個体において配列番号１〜３４のうち１種以上の配列の発現を測定するステップを含み、前記配列が、マイクロサテライト不安定性を有していないことがわかっている個体における前記配列の発現と比較して少なくとも２倍過剰発現される場合に、マイクロサテライト不安定性が検出される方法を提供する。
【００１６】
一実施形態では、測定するステップは、前記個体から結腸直腸組織サンプルを得るステップと、前記サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記の配列番号１〜３４のうち１種以上の配列とハイブリダイズできる核酸プローブと接触させるステップと、前記核酸プローブの、前記の配列番号１〜３４のうち１種以上の配列とのハイブリダイゼーションを検出するステップとを含む。
【００１７】
一実施形態では、個体はヒトである。
【００１８】
さらなる実施形態では、核酸プローブは検出可能なように標識されている。
【００１９】
もう1つの態様では、本発明はまた、マイクロサテライト不安定性を有する結腸組織を同定する方法であって、個体から結腸組織サンプルを得るステップと、配列番号１〜３４のうち1種以上の配列の発現を検出するステップとを含み、前記の配列番号１〜３４のうち1種以上の配列の発現が、マイクロサテライト不安定性を有していないことがわかっている結腸組織サンプルにおける同一配列の発現よりも少なくとも２倍多い場合に、マイクロサテライト不安定性を有する結腸組織が検出される方法を提供する。
【００２０】
一実施形態では、検出するステップは、前記結腸組織サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記の配列番号１〜３４のうち１種以上の配列とハイブリダイズできる核酸プローブと接触させるステップと、前記核酸プローブの、前記の１種以上の配列とのハイブリダイゼーションを検出するステップと含み、ハイブリダイゼーションの検出が、前記の配列番号１〜３４のうち1種以上の配列の発現を示す。
【００２１】
一実施形態では、核酸プローブは検出可能なように標識されている。
【００２２】
一実施形態では、個体はヒトである。
【００２３】
一実施形態では、結腸組織サンプルは腫瘍サンプルである。
【００２４】
さらなる実施形態では、腫瘍は悪性腫瘍である。
【００２５】
もう1つの態様では、本発明はまた、被験体において癌またはその前癌性状態の発症、進行または退縮をモニターする方法であって、第1の時点で、被験体の生体サンプルにおいて、配列番号１〜３４からなる群から選択される１種以上の核酸配列を含む１種以上の核酸配列の発現を検出するステップと、その後の時点で、ステップ（ａ）を反復するステップと、ステップ（ａ）および（ｂ）で検出される発現レベルを比較するステップとを含み、発現レベルの変化が被験体における癌またはその前癌性状態の進行を示す方法を提供する。
【００２６】
一実施形態では、発現レベルの変化は上昇または低下のいずれかである。
【００２７】
さらなる実施形態では、上昇または低下は少なくとも２倍の上昇または低下である。
【００２８】
もう1つの態様では、本発明はまた、被験体において癌またはその前癌性状態の予後を調べる方法であって、被験体の生体サンプルにおいて、配列番号１〜３４からなる群から選択される１種以上の核酸配列を含む１種以上の核酸配列の発現レベルを検出するステップと、ステップ（ａ）において検出された発現レベルを前記核酸配列の参照発現レベルと比較するステップと、ステップ（ｂ）における比較に基づいて被験体の予後を評価するステップとを含む方法を提供する。
【００２９】
一実施形態では、参照発現レベルは、癌のないサンプルまたは正常サンプルにおける前記核酸配列の発現レベルである。
【００３０】
さらなる実施形態では、参照発現レベルは、攻撃的な形態に進行しないことがわかっている癌サンプルにおける前記核酸配列の発現レベルである。
【００３１】
一実施形態では、参照発現レベルは、ＭＳＳ結腸腫瘍における前記核酸配列の発現レベルである。
【００３２】
もう1つの態様では、本発明はまた、被験体において癌を阻害する試験化合物の有効性を調べる方法であって、ａ）被験体から得た、試験化合物に曝露された第1の生体サンプルにおける１種以上の核酸配列の発現レベルを、ｂ）被験体から得た、試験化合物に曝露されていない第２の生体サンプルにおける前記核酸配列の発現レベルと比較するステップを含み、前記核酸配列が配列番号１〜３４からなる群から選択される１種以上の核酸配列を含み、前記ヌクレオチド配列の発現レベルの少なくとも２倍の変化が、試験化合物が被験体において癌を阻害するために有効であるという指標である方法を提供する。
【００３３】
一実施形態では、発現レベルの変化は上昇または低下のいずれかである。
【００３４】
さらなる実施形態では、本発明はまた、被験体において、癌を阻害する療法の有効性を調べる方法であって、ａ）被験体に療法の少なくとも一部を提供する前に被験体から得た第1の生体サンプルにおける１種以上の核酸配列の発現レベルを、ｂ）療法の少なくとも一部の提供の後に被験体から得た第２の生体サンプルにおける前記ヌクレオチド配列の発現レベルと比較するステップを含み、前記ヌクレオチド配列が配列番号１〜３４からなる群から選択される１種以上の核酸配列を含み、前記核酸配列の発現レベルの少なくとも２倍の変化が、療法が被験体において癌を阻害するために有効であるという指標である方法を提供する。
【００３５】
一実施形態では、発現レベルの変化は上昇または低下のいずれかである。
【００３６】
もう1つの態様では、本発明はまた、被験体において癌を阻害する組成物を選択する方法であって、被験体から癌細胞を含む第1の生体サンプルを得るステップと、複数の試験組成物の存在下でサンプルのアリコートを別個に曝露するステップと、（ｂ）から得たアリコートの各々における１種以上の核酸配列の発現レベルを、（ａ）によって作製したサンプルにおける発現レベルと比較するステップであって、前記核酸配列が配列番号１〜３４からなる群から選択される１種以上の核酸配列を含むステップと、試験組成物を含む一アリコートにおいて前記核酸配列の発現レベルの少なくとも２倍の変化を誘導する試験組成物の1種を選択するステップとを含む方法を提供する。
【００３７】
一実施形態では、発現レベルの変化は上昇または低下のいずれかである。
【００３８】
もう1つの態様では、本発明はまた、被験体において癌の発症、進行または退縮をモニターする方法であって、第1の時点で、第1の生体サンプルを、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドと特異的に結合する１種以上のポリペプチドリガンドと接触させ、ポリペプチドリガンドとポリペプチドの間の特異的結合を調べるステップと、その後の時点で、第２の生体サンプルを、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドと特異的に結合する前記ポリペプチドリガンドと接触させ、ポリペプチドリガンドとポリペプチドの間の特異的結合を調べるステップと、第1の生体サンプルにおける特異的結合を、第２の生体サンプルにおける特異的結合と比較するステップであって、特異的な結合の大幅な変化が癌の発症、進行または退縮の指標であるステップとを含む方法を提供する。
【００３９】
もう1つの態様では、本発明はまた、被験体において癌またはその前癌性状態の予後を調べる方法であって、癌を有する被験体から得た生体サンプルを、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む１種以上のポリペプチドと特異的に結合する１種以上のポリペプチドリガンドと接触させるステップと、特異的結合を調べるステップと、サンプルにおけるポリペプチドリガンドとポリペプチドの間の特異的結合を、癌のないサンプルにおけるか、または攻撃的な形態に進行しないことがわかっている癌サンプルのいずれかにおけるポリペプチドリガンドとポリペプチドの間の特異的結合と比較するステップと、ステップ（ｃ）における比較に基づいて被験体の予後を評価するステップとを含む方法を提供する。
【００４０】
なおさらなる態様では、本発明はまた、被験体において癌を阻害する試験化合物の有効性を調べる方法であって、ａ）被験体から得た、試験化合物に曝露されていない第1の生体サンプルにおける、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドと特異的に結合する１種以上のポリペプチドリガンドと、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドの間の結合を、ｂ）被験体から得た、試験化合物に曝露された第２の生体サンプルにおける、前記ポリペプチドリガンドと前記ポリペプチドの特異的結合と比較するステップであって、特異的結合の大幅な変化が、試験化合物が被験体において癌を阻害するために有効であるという指標であるステップを含む方法を提供する。
【００４１】
もう1つの態様では、本発明は、被験体において癌を阻害する療法の有効性を調べる方法であって、治療前に被験体から得た第1の生体サンプルにおける、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドと特異的に結合する１種以上のポリペプチドリガンドと、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドの間の結合を、治療後に被験体から得た第２の生体サンプルにおける、前記ポリペプチドリガンドと前記ポリペプチドの特異的結合と比較するステップであって、特異的結合の大幅な変化が、試験化合物が被験体において癌を阻害するために有効であるという指標であるステップを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
孤発性結腸直腸癌では、ゲノム不安定性の２つの主な機構が役割を果たすことが発見されている。第１のものは、染色体不安定性として知られ、ｋｉ−ｒａｓなどの一連の発癌遺伝子の活性化ならびにｐ５３およびＡＰＣなどの腫瘍抑制遺伝子の不活性化を含む一連の遺伝子の変異に起因している。染色体不安定性を示す細胞は、数十万のＤＮＡ塩基に影響を及ぼす異型接合性の喪失などの大規模な染色体変化を示す。マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）として知られる第２の機構は、最初、遺伝性非ポリポーシス結腸癌において記載され、孤発性結腸直腸癌の１２〜１５％でも見られる。ＭＳＩの示すものは、マイクロサテライトとして知られる短い反復ＤＮＡ配列の広範囲に及ぶ突然変異である。ＭＳＩ腫瘍は、粘液性組織像、顕著なリンパ性浸潤、近位位置（脾彎曲部の近位）、あまり分化していないことおよびより好都合ステージ分布（すなわち、癌進行の初期ステージで同定される）を特徴とする、特徴的な表現型を有する（例えば、ゲルバズ(Gervaz)ら、２００３、スイス・サージェリー(Swiss Surgery)、９：３参照）。当技術分野では、ＭＳＩ腫瘍を迅速かつ正確に検出する方法と、ＭＳＩ結腸直腸腫瘍を有する患者の予後および治療計画を決定するための信頼できる判定基準とが必要である。
【００４３】
本発明は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＳ）を示さない腫瘍と比較して、マイクロサテライト不安定として分類される（ＭＳＩ−Ｈ；分類は以下でさらに説明する）ヒト結腸直腸腫瘍では、特定の遺伝子配列が過剰発現されるという発見に幾分か基づいている。より具体的には、本発明は、マイクロサテライト不安定性を示さない結腸直腸腫瘍と比較して、高度のマイクロサテライト不安定性を有する（ＭＳＩ−Ｈ）結腸直腸腫瘍において少なくとも２倍過剰発現される、３４種の遺伝子配列に関する。したがって、一実施形態では、ＭＳＩ−Ｈ結腸直腸腫瘍における遺伝子過剰発現の発見が、個体において結腸癌を検出および予測する手段を提供する。本発明は、結腸癌を有する疑いのある個体から生体サンプルを得、続いて、核酸プローブを用いてスクリーニングし、本明細書に記載される１種以上の遺伝子配列が少なくとも２倍過剰発現されているかどうかを調べることができる方法を提供する。１種以上の本発明の遺伝子配列の少なくとも２倍の過剰発現を同定することにより、当業者が個体をＭＳＩ−Ｈ対ＭＳＩ−Ｌ対ＭＳＳである結腸直腸癌を有するとして分類することが可能となり、これによって、開業医に個体についての有益な予後情報が提供される。好ましい実施形態では、本発明は、本発明の１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー配列の過剰発現に基づいて、患者における結腸直腸癌の予後、治療経過、治療の有効性を調べる方法ならびに進行および／または退縮および／または再発をモニターする方法を提供する。
【００４４】
したがって、本発明は、結腸直腸癌およびマイクロサテライト不安定性の検出に有用であるＭＳＩ特異的マーカー(核酸配列:配列番号１〜３４;アミノ酸配列：３５〜６８）を提供する。本発明によれば、ＭＳＩ−Ｈマーカーはまた、結腸直腸癌の発生を予測するために、および結腸直腸癌の発症に対する個体の素因を調べるためにも使用できる。
【００４５】
定義
本明細書において、「マイクロサテライト不安定性」（ＭＳＩ）とは、正常組織と比較した際の、腫瘍内の短いヌクレオチドリピート（マイクロサテライト）の拡大または収縮を指す。ＭＳＩは個々の腫瘍表現型を説明するものではなく、代わりに、１種以上の所与の遺伝子マーカーでの不安定性の観察を指す。マイクロサテライトは、短いモチーフ（通常、１〜５ヌクレオチド長）が数回反復されているＤＮＡである。一般的なモノヌクレオチドリピートマイクロサテライトは、例えば、ひと続きの１３個のアデノシン、略して（Ａ）_１３であり得る。ヒトにおいて最もよく見られるマイクロサテライトは、シトシンおよびアデニンのジヌクレオチドリピート、（ＣＡ）_ｎであり、これは、その生殖細胞系中の何万もの位置で生じる。マイクロサテライトリピートは、減数分裂において拡大または収縮（延長化または短縮化）する傾向がある。これらの拡大または収縮は、通常ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質（ＭＭＲ）によって修復されるが、ＭＭＲの欠損がこのようなマイクロサテライト修飾の継続をもたらす場合があり、その結果、マイクロサテライト不安定性と呼ばれる。ＭＳＩは３つのカテゴリー：ＭＳＩ−Ｈ、ＭＳＩ−ＬおよびＭＳＳ（マイクロサテライト安定）に細分される。ＭＳＩ−Ｈ、ＭＳＩ−ＬおよびＭＳＳ腫瘍は、ボーランド(Boland)ら（以下でさらに詳細に論じられる、１９９８、キャンサー・リサーチ(Cancer Research)５８、５２４８）に記載のとおり定義される。
【００４６】
本明細書において、「生体サンプル」とは、個体から得た組織サンプル、細胞サンプルまたは液状サンプルを指す。本明細書において「生体サンプル」とは、細胞、循環細胞（例えば、血中循環細胞）、指定の解剖学的位置または指定の細胞種（例えば、結腸細胞、胃腸細胞、癌細胞など）から得た細胞、組織サンプルまたはリンパ、胆汁、血清、血漿、尿、滑液、血液、ＣＳＦ、粘膜分泌物などの生理液または糞便などのその他の生理学的サンプルを指す場合がある。生体サンプルは結腸組織であることが好ましい。配列番号１〜３４のうち１種以上などの本発明のＭＳＩ関連マーカーは、適した「生体サンプル」において検出でき、特異的結腸直腸癌関連マーカーの検出にとっての生体サンプルの個々の種類の適合性は、当業者によって容易に調べることができる。
【００４７】
本明細書において「検出」とは、サンプル中の分子の有無の同定を指す。検出される分子がポリペプチドである場合には、検出というステップは、ポリペプチドを、検出可能なように標識されている抗体などのペプチドリガンドと結合することによって実施できる。検出可能な標識は、独立にか、または刺激に応じてのいずれかで、観察可能なシグナルを生成し得る分子である。検出可能な標識は、それだけには限らないが、蛍光標識、色素生産性標識、発光標識または放射性標識であり得る。標識を「検出」する方法としては、標準または共焦点顕微鏡に適応した定量的および定性的方法、ＦＡＣＳ分析ならびにマルチウェルプレート、アレイまたはマイクロアレイに関連するハイスループット法に適応したものが挙げられる。当業者ならば、所与の蛍光ポリペプチドまたは色素からの蛍光発光を検出するための適当なフィルターセットおよび励起エネルギー源を選択できる。本明細書において「検出」とはまた、検出されるポリペプチドに対する多重ペプチドリガンドの使用を含み、これでは、多重抗体は、検出されるポリペプチド上の異なるエピトープと結合できる。この方法に用いる抗体は、２種以上の検出可能な標識を使用でき、これとしては例えば、ＦＲＥＴペアが挙げられる。配列番号３５〜６８のうちの１種以上などのポリペプチド分子は、検出可能なシグナルのレベルが検出可能な標識のバックグラウンドレベルよりも、ともかく大きい場合に、または測定される核酸のレベルが対照サンプルにおいて測定されるレベルよりも、ともかく大きい場合に、本発明によれば「検出される」。
【００４８】
本明細書において「検出」とは、標的核酸分子（例えば、配列番号１〜３４のうち１種以上の核酸分子）の存在を検出することを指すので、直接的または間接的に標識されたプローブ核酸分子（生体サンプル中、例えば、細胞中の標的、例えば、配列番号１〜３４のうち１種以上の配列とｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってハイブリダイズできる）によって生じたシグナルが測定されるか、観察されるプロセスを指す。したがって、プローブ核酸の検出は、標的核酸の存在、ひいては検出を直接的に示す。例えば、プローブ核酸上の検出可能な標識が蛍光標識である場合には、プローブ核酸上の蛍光標識が適当な波長によって励起される際に発せられる光を観察または測定することによって標的核酸を「検出し」、または検出可能な標識が蛍光／クエンチャーペアである場合には、プローブ核酸上に存在する蛍光／クエンチャーペアが会合または解離する際に発せられる光を観察または測定することによって標的核酸を「検出し」、プローブ核酸の検出が標的核酸の検出を示す。検出可能な標識が放射性標識である場合には、標的核酸を、放射標識されたプローブとのハイブリダイゼーションの後に、例えば、オートラジオグラフィーによって「検出する」。蛍光標識、放射性標識およびその他の化学標識を「検出する」方法および技術は、オーズベル(Ausubel)ら（１９９５、ショート・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Short Protocols in Molecular Biology.)、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(John Wiley and sons Inc.)に見ることができる。あるいは、核酸は「間接的に検出する」こともでき、これでは、酵素活性などの部分を、標的とハイブリダイズするプローブ核酸と結合させ、これによって適当な基質の存在下で検出が可能となるか、または特異的抗原もしくはその他のマーカーを結合させ、これによって抗体またはその他の特異的指示薬の添加による検出が可能となる。あるいは、生体サンプルから調製した核酸サンプルを、標的核酸配列の一部とハイブリダイズするよう特別に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することによって、標的核酸分子を検出できる。それだけには限らないが、ＴａｑＭａｎなどの定量的増幅法を用いて、本発明の標的核酸を「検出」することもできる。本明細書において核酸分子は、測定される核酸（例えば、定量的ＰＣＲによって）のレベル、または検出可能な標識によって提供される検出可能なシグナルのレベルが、バックグラウンドまたは対照レベルをともかく上回る場合に「検出される」。
【００４９】
本明細書において「検出」とはまた、患者における結腸直腸癌の検出、好ましくは、早期の検出をさらに指し、ここで「早期」の検出とは、デュークスステージＡの結腸直腸癌の検出、または好ましくは、結腸直腸癌を形態的に個々のデュークスステージに分類できる時点の前の検出を指す。本明細書において「検出」とは、上記で示される同一検出基準を用いる、個体における結腸直腸癌再発の検出をさらに指す。本明細書において「検出」とは、治療薬での治療の前および／または後の結腸直腸癌の程度の変化の測定をさらに指す。この場合には、治療薬に応じた結腸直腸癌の程度の変化とは、治療薬の不在下における発現レベルと比較して、治療薬の存在に応じて少なくとも１０％の、臨床サンプル中に存在する、１種以上の本発明のＭＳＩ−Ｈマーカーの発現の増加または減少、あるいは、ＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチド（例えば、配列番号３５〜６８のうち１種以上）の量の増加または減少を指す。
【００５０】
本明細書において、用語「発現レベルの変化」とは、発現を評価するために用いられるアッセイの標準誤差よりも大きい量の、対照レベルからの、試験サンプルにおけるヌクレオチド配列の発現レベル（例えば、発現される核酸のレベルの測定および／または産生されるタンパク質のレベルの測定）の上昇または低下を指す。変化は少なくとも約２倍であることが好ましく、３倍、４倍、５倍または１０倍に達することがより好ましい。上昇については、変化は、試験サンプルにおける発現レベルを、対照レベルと比較することによって求める。低下については、変化は対照レベルを、試験サンプルにおける発現レベルと比較することによって求める。あるいは、低下は、試験サンプルにおける発現レベルを、対照レベルと比較することによって求め、発現レベルの低下は少なくとも約１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、６５％、８０％またはそれよりも多くである。用語「特異的結合の大幅な変化」とは、癌のないサンプルにおける特異的結合からの、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、好ましくは、少なくとも約４０％、５０％、より好ましくは、少なくとも約６０％、７０％または９０％の増加または減少のいずれかを指す。
【００５１】
本明細書において、用語「１種以上の核酸配列の発現レベル」とは、生体サンプル中に存在する、対応する遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量（またはｍＲＮＡに転写されるＤＮＡの量）を指す。発現レベルは、対照サンプルに由来するレベルと、または対照サンプルの予想されるレベルと比較してもしなくても検出できる。
【００５２】
本明細書において、用語「１種以上の核酸配列の対照発現レベル」とは、健常な、癌のない被験体を代表する生体サンプル中に存在する、対応する遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量（またはｍＲＮＡに転写されるＤＮＡの量）を指す。用語「対照発現レベル」とはまた、健常な、癌のない被験体から得た測定に基づいて先に確立されている、癌のない集団を代表するｍＲＮＡの確立されたレベルを指す場合もある。
【００５３】
本明細書において、「ＭＳＩ−Ｈマーカー配列」とは、配列番号３５〜６８のアミノ酸配列をコードし、本発明によって、マイクロサテライト不安定性を有する結腸直腸腫瘍組織において過剰発現されていると同定されている配列番号１〜３４の核酸配列を指す。本発明のＭＳＩ−Ｈマーカー配列には、配列番号１〜３４の核酸配列と配列番号３５〜６８のアミノ酸配列の双方が含まれる。本発明のＭＳＩ−Ｈマーカー配列は、結腸直腸癌の検出、生体サンプルにおけるマイクロサテライト不安定性の同定および結腸癌の進行の予測に有用なツールを提供する。
【００５４】
本明細書において、単数形または複数形のいずれかで用いられる、用語「癌性細胞」または「癌細胞」とは、宿主生物に対して病的にする悪性形質転換を受けている細胞を指す。悪性形質転換は、細胞および／または遺伝子発現プロフィールの遺伝子構成の変化を幾分かは含む、一段階プロセスであるか、または多段階プロセスである。悪性形質転換は、自発的に起こる場合もあるし、あるいは薬物もしくは化学治療、放射線、その他の細胞との融合、ウイルス感染または特定の遺伝子の活性化もしくは不活化などの事象もしくは事象の組み合わせによって起こる場合もある。悪性形質転換はｉｎ ｖｉｖｏで起こる場合もあるし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる場合もあり、必要ならば、実験的に誘導することもできる。悪性細胞は明確な腫瘤内に見い出すことができ、その他の身体の位置に転移している場合もある。癌細胞の特徴は、宿主によって制御できない方法で増殖する傾向であるが、個々の癌細胞と関連している病理学はいずれの形もとり得る。原発癌細胞（すなわち、悪性形質転換部位付近から得た細胞）は、十分に確立した病理学技術、特に、組織学的検査によって非癌性細胞と容易に識別できる。本明細書において、癌細胞の定義は、原発癌細胞だけでなく、癌細胞の祖先に由来する細胞はいずれも含む。これとしては、転移した癌細胞および癌細胞に由来するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物および細胞株が挙げられる。
【００５５】
本明細書において、用語「有効性」とは、細胞増殖性障害を引き起こすか、細胞増殖性障害の一因となる細胞増殖のある程度の阻害か、または細胞増殖性障害を引き起こすか、細胞増殖性障害の一因となる因子（例えば、増殖因子）の産生のある程度の阻害を指す。「治療有効性」とは、細胞増殖性障害の１以上の症状の軽減を指す。癌の治療に関しては、治療有効性とは、以下のうち１以上を指す：１）癌細胞数の減少、２）腫瘍の大きさの減少、３）末梢臓器への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度の遅延、好ましくは、停止）、３）腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の遅延、好ましくは、停止）、４）腫瘍増殖のある程度の阻害および／または５）障害と関連している１以上の症状のある程度の軽減。癌以外の細胞増殖性障害の治療に関しては、治療有効性とは、１）障害を引き起こす細胞の増殖のある程度の阻害、２）障害を引き起こす因子（例えば、増殖因子）の産生のある程度の阻害および／または３）障害と関連している１以上の症状のある程度の軽減のいずれかを指す。
【００５６】
本明細書において、用語「検出可能な標識」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能な組成物を指す。
【００５７】
本明細書において、用語「ポリヌクレオチドプローブ」とは、１以上の種類の化学結合によって、通常、相補的塩基対形成によって、通常、水素結合形成によって、相補的配列の標的核酸と結合できる核酸を指す。本明細書において、プローブには、天然（すなわち、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）または塩基で改変されたもの（７−デアザグアノシン、イノシンなど）または糖部分で改変されたものが含まれる。さらに、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを干渉しない限りは、ホスホジエステル結合以外の結合によって結合されていてもよい。したがって、例えば、プローブは、構成塩基が、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって結合しているペプチド核酸であり得る。当業者には理解されるであろうが、プローブは、完全な相補性を欠く標的配列と結合できるが、プローブ配列はハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて変わる。プローブは、同位元素、発色団、ルミフォア(lumiphore)、色素源などで直接標識されているか、ビオチンなどで間接標識され、それにストレプトアビジン複合体が後に結合できることが好ましい。プローブの有無をアッセイすることによって、選択配列または部分配列の有無を検出できる。
【００５８】
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の鎖が塩基対形成によって相補鎖と結合するいずれかのプロセスを指す。
【００５９】
本明細書において、用語「被験体」とは、ヒトまたは非ヒト生物のいずれかを指す。
【００６０】
本明細書において、「個体」とは、哺乳類、好ましくは、ヒトを指す。
【００６１】
本明細書において、「リガンド」とは、ポリペプチドまたは核酸と結合できる分子を指す。本発明において有用な「ポリペプチドリガンド」としては、それだけには限らないが、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆｖ、ｓｃＦＶもしくはＦａｂ）、小分子または核酸アプタマーが挙げられる。本明細書において「リガンド」とはまた、相補的な核酸分子またはポリペプチド分子と結合できる、「核酸リガンド」、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを指す場合もある。
【００６２】
本明細書において用語「抗体」とは、例えば、いずれかのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の全抗体を対象とし、その断片および脊椎動物、例えば、哺乳類タンパク質と特異的に反応する一本鎖抗体も含む。抗体は従来技術を用いて断片化でき、断片は全抗体について上記で記載されるものと同じように有用性についてスクリーニングできる。したがって、この用語は、特定のタンパク質と選択的に反応できる、抗体分子の、タンパク質分解によって切断されたか、組換えによって調製された部分のセグメントを含む。このようなタンパク質分解性および／または組換え断片のそれだけには限らない例として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖおよびペプチドリンカーによって結合されているＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは共有結合または非共有結合して、２以上の結合部位を有する抗体を形成している場合もある。本発明は、ポリクローナル、モノクローナルまたは抗体のその他の精製された調製物および組換え抗体を含む。
【００６３】
本明細書において、用語「核酸」とは、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、必要に応じて、リボ核酸（ＲＮＡ）を指す。この用語はまた、同等物として、ヌクレオチド類似体で作製されたＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの類似体、ならびに、記載されている実施形態に適用できる、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されなくてはならない。ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡは、核酸と呼ばれ得る分子の代表的な例である。
【００６４】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書では、遺伝子産物を言及する場合には同義的に用いる。本明細書において「ポリペプチド」とは、いずれかの種類のポリペプチド、例えば、ペプチド、ヒトタンパク質、ヒトタンパク質の断片、非ヒト供給源由来のタンパク質またはタンパク質の断片、遺伝子操作した種類のタンパク質またはタンパク質の断片、酵素、抗原、薬物、細胞シグナル伝達に関与している分子、例えば、受容体分子、免疫グロブリンスーパーファミリーのポリペプチドをはじめとする抗体、例えば、抗体ポリペプチドまたはＴ細胞受容体ポリペプチドを指す。
【００６５】
本明細書において、用語「発現のレベル」または「発現レベル」とは、所与の核酸の測定可能な発現を指す。核酸の発現のレベルは、当技術分野で周知の方法によって求める。「発現のレベル」または「発現レベル」は、当技術分野で周知の方法にしたがって、標識された標的核酸を用いるハイブリダイゼーション分析によって測定できる（例えば、オーズベル(Ausubel)ら、ショート・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Short Protocols in Molecular Biology)、第３版、１９９５、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(John Wiley and sons Inc.)参照）。標的核酸上の標識は発光標識、酵素標識、放射性標識、化学標識または物理的標識である。標的核酸は蛍光分子で標識することが好ましい。好ましい蛍光標識としては、フルオレセイン、アミノクマリン酢酸、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド(Texas Red)、Ｃｙ３およびＣｙ５が挙げられる。あるいは、「発現のレベル」は、定量的増幅プロトコール、例えば、当業者に公知のＴａｑＭａｎによって測定できる。
【００６６】
本明細書において「差次的発現」とは、核酸配列の発現の、少なくとも約２倍の、少なくとも約３倍、少なくとも１０倍、または少なくとも最大約５０倍またはそれより多い増加または減少を指す。同様に「過剰発現」とは、核酸配列の発現の少なくとも約２倍の、少なくとも約３倍の、少なくとも約１０倍の、または少なくとも最大約５０倍またはそれより多い増加を指す。好ましい実施形態では、配列番号１〜３４のうち１種以上の配列は、少なくとも約２倍の平均で過剰発現されることが、少なくとも２正常個体における平均発現レベルと比較して結腸癌を有する少なくとも２個体において測定される場合に、あるいは、隣接する健常な結腸組織サンプルと比較して個体から得た結腸癌サンプルにおいて測定される場合に、過剰発現される。細胞の表現型を調べる（例えば、結腸癌またはマイクロサテライト不安定性を検出する）方法は、ストリンジェントな条件下で配列番号１〜３４のうち１種とハイズリダイズする少なくとも１種の核酸の、正常細胞と比較した差次的発現であって、核酸が少なくとも少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約１０倍または少なくとも最大約５０倍またはそれよりも多く差次的に発現される発現の検出を含み得る。あるいは、細胞の表現型を調べる方法は、配列番号１〜３４を含む少なくとも１種の核酸の、正常細胞と比較した差次的発現の検出を含み得る。
【００６７】
本明細書において「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、第１の核酸配列の、第２の核酸配列とのハイブリダイゼーションを可能にする、温度およびバッファー組成の条件を指し、高度または中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件のいずれかを指すことが好ましい。したがって、「高ストリンジェンシー条件」とは、互いに極めて類似している核酸配列のみがハイブリダイズする条件である。配列は、中程度ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合には、互いにあまり類似していない場合もある。個々のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する詳細な条件としては、イオン強度、温度およびホルムアミドなどの不安定化剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、その塩基組成、２種の配列間のミスマッチした塩基対のパーセント、その他の非同一配列内での配列のサブセット（例えば、リピートの短い一続き）の出現頻度などの因子に関しても挙げられる。洗浄は、条件が、互いにハイブリダイズする配列間の最小レベルの類似性を調べるよう設定されているステップである。一般に、２種の配列間の１％ミスマッチは、相同ハイブリダイゼーションのみが生じる最低温度から、いずれかの選択したＳＳＣ濃度の溶解温度（Ｔ_ｍ）の１℃低下をもたらす。一般に、ＳＳＣの濃度を倍にすることによって、Ｔ_ｍの約１７℃の増加がもたらされる。洗浄温度は、これらのガイドラインを用い、求められるミスマッチのレベルに応じて経験的に決定することができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)（オーズベル(Ausubel)，Ｆ．Ｍ．ら編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(John Wiley and sons Inc.)、１９９５、補足を含む最新版）中、２．１０．１〜２．１０．１６および６．３．１〜６．３．６頁に説明されている。
【００６８】
本明細書において「高ストリンジェンシー条件」とは、概して、（１）６５℃で、１×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸Ｎａ_３−２Ｈ_２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ７．０に）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（２）４２℃で、１×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（３）６５℃で、１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ Ｎａ_２−ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）（１Ｍ ＮａＨＰＯ_４＝１リットルあたり１３４ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、４ｍｌ ８５％Ｈ_３ＰＯ_４）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（４）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハート液（１００×＝１０ｇフィコール４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、５００ｍｌまでの水）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（５）６５℃で、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、１％ＳＤＳ、１００：ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡまたは（６）４２℃で、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００：ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡのいずれかでのハイブリダイゼーションと、（１）６５℃で、０．３〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳまたは（２）６５℃で、１ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳのいずれかの高ストリンジェンシー洗浄を指す。上記条件は、５０塩基対またはそれより長いＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに用いられるものとする。ハイブリッドが１８塩基対の長さよりも短いと考えられる場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ハイブリッドの算出されるＴ_ｍの温度（ここで、℃でのＴ_ｍ＝（２×ＡおよびＴ塩基の数）＋（４×ＧおよびＣ塩基の数））よりも５〜１０℃低くなくてはならない。約１８〜約４９塩基対の長さであると考えられるハイブリッドについては、℃でのＴ_ｍ＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ_１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ））−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）（式中、「Ｍ」は一価の陽イオン（例えば、Ｎａ^＋）のモル濃度であり、「Ｌ」は塩基対でのハイブリッドの長さである）。
【００６９】
「中程度ストリンジェンシー条件」とは、（１）６５℃で、４×ＳＳＣ、（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸Ｎａ_３−２Ｈ_２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ７．０に）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（２）４２℃で、４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（３）６５℃で、１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ Ｎａ_２−ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）（１Ｍ ＮａＨＰＯ_４＝１リットルあたり１３４ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、４ｍｌ ８５％Ｈ_３ＰＯ_４）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（４）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハート液（１００×＝１０ｇフィコール４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、５００ｍｌまでの水）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（５）６５℃で、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡまたは（６）４２℃で、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００：ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡのいずれかでのハイブリダイゼーションと、６５℃で、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳという中程度ストリンジェンシー洗浄を指す。上記条件は５０塩基対またはそれより長いＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに用いられるものとする。ハイブリッドが１８塩基対の長さよりも短いと考えられる場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ハイブリッドの算出されるＴ_ｍの温度（ここで、℃でのＴ_ｍ＝（２×ＡおよびＴ塩基の数）＋（４×ＧおよびＣ塩基の数））よりも５〜１０℃低くなくてはならない。約１８〜約４９塩基対の長さであると考えられるハイブリッドについては、℃でのＴ_ｍ＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ_１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ））−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）（式中、「Ｍ」は一価の陽イオン（例えば、Ｎａ^＋）のモル濃度であり、「Ｌ」は塩基対でのハイブリッドの長さである）。
【００７０】
本明細書において、用語、特異的「結合」または「特異的に結合」とは、抗体と、タンパク質またはペプチドとの相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質上の特定の構造（すなわち、抗原決定基またはエピトープ）の存在に応じて変わる。言い換えれば、抗体は、タンパク質全般ではなく、特異的タンパク質構造を認識し、結合している。例えば、抗体がエピトープＡに特異的である場合には、標識された「Ａ」と抗体とを含む反応物中の、エピトープＡ（すなわち、遊離の、標識されていないＡ）を含有するタンパク質の存在は、抗体と結合される標識されたＡの量を低減させる。
【００７１】
本明細書において、「結腸癌を発症する素因」とは、「結腸癌を発症する素因がある」いずれかの所与の個体集団が、結腸癌を発症する素因のない同様の集団よりも、結腸癌の罹患率の少なくとも１０％の増加を有する状態を指す。本明細書において「結腸癌を発症する素因」とはまた、個体の結腸組織において、本発明の１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー配列の発現が、正常個体における発現レベルと比較して少なくとも２倍過剰発現されていると同定される、個体の状態を指す。
【００７２】
ＭＳＩ−Ｈマーカー配列
マイクロサテライト不安定性
マイクロサテライト不安定性とは、正常組織と比較した際の、腫瘍内の短いヌクレオチドリピート（マイクロサテライト）の拡大または収縮を指す。ＭＳＩは個々の腫瘍表現型を説明するものではなく、代わりに、所与の遺伝子マーカーでの不安定性の観察を指す。ＭＳＩは３つのサブカテゴリーに細分される。第１のものはＭＳＩ−Ｈを特徴とし、これではマーカーの大部分がＭＳＩを示す。第２のものはＭＳＩ−Ｌであり、これでは、マーカーのうち少数しかＭＳＩを示さない。第３のものはＭＳＳであり、これではマーカーは見かけの不安定性を欠いている。所与の腫瘍のＭＳＩ状態は、モノヌクレオチドリピートを含む２種のマーカー（ＢＡＴ２６およびＢＡＴ２５、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号９８３４５０８および９８３４５０５）と、ジヌクレオチドリピートを有する３種のマーカー（Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ２Ｓ１２３およびＤ１７Ｓ２５０、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号１８１１７１、１８７９５３および１７７０３０）とを含む遺伝子マーカーのパネルにおいてマイクロサテライト不安定性に注目することによって調べる。ＭＳＩ−Ｈ腫瘍は、この参照パネルを用い、２種以上のマーカーにおいて不安定性を有すると定義され、他方、ＭＳＩ−Ｌ腫瘍は１種のマーカーにおいて不安定性を有すると定義される。見かけの不安定性を全く示さない腫瘍はＭＳＳ群に含めることができる。上記の５種の主要マーカーに加え、マイクロサテライト不安定性についてさらなるマーカーを調べることができ、これとしては、それだけには限らないが、ＢＡＴ４０、ＢＡＴ３４Ｃ４、ＴＧＦ−β−Ｒ１１、ＡＣＴＣ（６３５／６３６）、Ｄ１８Ｓ５５、Ｄ１８Ｓ５８、Ｄ１８Ｓ６１、Ｄ１８Ｓ６４、Ｄ３Ｓ１０２９、Ｄ１０Ｓ１９７、Ｄ１３Ｓ１７５、Ｄ１７Ｓ５８８、Ｄ５Ｓ１０７、Ｄ８Ｓ８７、Ｄ１８Ｓ６９、Ｄ１３Ｓ１５３、Ｄ１７Ｓ７８７、Ｄ７Ｓ５１９およびＤ２０Ｓ１００が挙げられる。５種のマーカーの主要パネルよりも多くを用いる場合には、ＭＳＩ−Ｈは、試験したマーカーの＞３０〜４０％においてＭＳＩを有すると定義され、他方、ＭＳＩ−Ｌ群は、マーカーの＜３０〜４０％においてＭＳＩを示す。ＭＳＩ−Ｈ対ＭＳＩ−Ｌ対ＭＳＳを特性決定する判定基準についての記述は、例えば、ボーランド(Boland)ら、１９９８、キャンサー・リサーチ(Cancer Research)５８、５２４８頁に見ることができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
ＭＳＩ−ＨおよびＭＳＩ−Ｌ／ＭＳＳ腫瘍間の区別は、結腸直腸癌の予後、治療およびモニタリングにとって重要である。例えば、ＭＳＩ状態（すなわち、ＭＳＩ−Ｈ、ＭＳＩ−ＬまたはＭＳＳのような腫瘍の分類）は、ステージIIおよびステージIII結腸癌におけるフルオロウラシルを用いるアジュバントをベースとする化学療法の利益の予測因子であることがわかっている（リビック(Ribic)ら、２００３、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(New England Journal of Medicine)３４９、２４７頁）。さらに、ＭＳＩ−Ｈ腫瘍の近位解剖学的位置が、患者におけるより好都合な予後と関連しており（例えば、より高い生存率、ボーランド(Boland)ら；ゲルバズ(Gervaz)ら、２００３、スイス・サージェリー(Swiss Surgery)、９：３およびルビック(Rubic)ら）、ＭＳＩ−Ｈ腫瘍は、より好都合なステージ区分と相関があり、ＭＳＩ−Ｈ腫瘍の大部分は、ステージII結腸直腸癌に分類される（グレベズ(Gervaz)ら）。したがって、以下にさらに記載するように、結腸直腸腫瘍の同定およびＭＳＩ状態への分類は、開業医に患者の診断、予後および最適な治療計画に関して臨床情報を提供する。
【００７４】
従来、結腸直腸癌腫瘍のＭＳＩ状態は、上記のマーカーについての遺伝子スクリーニングによって検出されてきた。この方法のＭＳＩステージングは、些細なことではなく、厄介なことであり、時間がかかり、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはその他の適した方法によって分離されている正常対腫瘍ＤＮＡバンドの比較を必要とする（例えば、バパット(Bapat)ら、１９９９、ヒューマン・ジェネティクス(Human Genetics)、１０４、１６７参照）。また、上記のマーカーパネルを用いるＭＳＩの遺伝子検出にはまた、腫瘍細胞集団を濃縮するために腫瘍組織の顕微解剖を含めなければならないことが一般に認められている（例えば、ボーランド(Boland)ら、同文献、参照）。対照的に本発明は、本明細書に記載される、ＭＳＩ−Ｈマーカー遺伝子のうち１種以上の過剰発現を検出することによって腫瘍のＭＳＩ状態を調べる手段を提供する。したがって、本発明は、今日まで当技術分野において用いられているＭＳＩ検出のための遺伝学的（すなわち、マーカーパネル）アプローチの代替法を提供し、結腸直腸癌を有する患者の予後、ステージングおよび治療計画を決定するために有用である。
【００７５】
本発明は、本明細書に開示されるＭＳＩ−Ｈマーカー配列のうち１種以上の過剰発現を検出することによる結腸癌およびマイクロサテライト不安定性の検出に関する。本発明は、正常結腸組織と比較してＭＳＩ−Ｈ結腸直腸腫瘍において少なくとも２倍過剰発現されていると同定されたマーカー配列自体にも同様に関する。
【００７６】
さらに、本発明は、結腸組織または細胞において、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列によってコードされる１種以上のポリペプチド配列を同定することによる癌の検出を包含する。あるいは、本発明は、個体において結腸直腸癌を検出する方法であって、個体から得た生体サンプルにおいて、１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー核酸配列および少なくとも１種のさらなる結腸直腸癌関連マーカーの過剰発現を検出することによって結腸直腸癌を同定する方法に関する。本発明のＭＳＩ−Ｈマーカー配列としては、配列番号１〜３４のうち１種以上に示される核酸配列を有するもの、あるいは、配列番号３４〜６８に示される、列挙されたポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列が挙げられる。
【００７７】
ＭＳＩ−Ｈマーカーの核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１〜３４および３５〜６８に示されている（表１および配列表に示されるように）。本発明は、結腸直腸癌またはＭＳＩを検出する方法におけるＭＳＩ−Ｈマーカー配列の直接検出に関するが、本発明は、さらに、それに相補的な配列、または配列番号１〜３４の配列と特異的にハイブリダイズする配列の検出にも関する。本発明はまた、臨床サンプルにおける、配列番号３５〜６８の配列またはその断片をコードする核酸分子の存在を検出することによる結腸直腸癌またはＭＳＩの検出に関する。
【００７８】
本発明のもう１つの態様は、低、中または高ストリンジェンシー下、好ましくは、中または高条件下で、配列番号１〜３４のうち１種以上によって表される核酸配列、またはそれに相補的な配列とハイブリダイズする核酸の検出によるＭＳＩ−Ｈの検出を提供する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件とは、第１の核酸配列の、第２の核酸配列とのハイブリダイゼーションを可能にする、温度およびバッファー組成の条件を指し、条件により、互いにハイブリダイズする配列間の同一性の程度が決まる。したがって、「高ストリンジェンシー条件」とは、互いに極めて類似している核酸配列のみがハイブリダイズする条件である。中程度ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合には、配列が互いにあまり類似していない場合もある。低ストリンジェンシー条件下では、２種の配列がハイブリダイズするのに、さらにより低い類似性しか必要でない。ハイブリダイゼーションが全く生じないストリンジェンシーレベルから、ハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルにハイブリダイゼーション条件を変えることによって、所与の配列がそれに最も類似している配列とハイブリダイズする条件を決定することができる。個々のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する詳細な条件としては、イオン強度、温度およびホルムアミドなどの不安定化剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、その塩基組成、２種の配列間のミスマッチした塩基対のパーセント、その他の非同一配列内での配列のサブセット（例えば、リピートの短い一続き）の出現頻度などの因子に関しても含まれる。洗浄は、条件が、互いにハイブリダイズする配列間の最小レベルの類似性を調べるよう設定されているステップである。一般に、２種の配列間の１％ミスマッチが、相同ハイブリダイゼーションのみが生じる最低温度から、いずれかの選択したＳＳＣ濃度の溶解温度（Ｔ_ｍ）の１℃低下をもたらす。一般に、ＳＳＣの濃度を倍にすることによって、Ｔ_ｍの約１７℃の増加がもたらされる。洗浄温度は、これらのガイドラインを用い、求められるミスマッチのレベルに応じて経験的に決定することができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)（オーズベル(Ausubel)，Ｆ．Ｍ．ら編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(John Wiley and sons Inc.)、１９９５、補足を含む最新版）中、２．１０．１〜２．１０．１６および６．３．１〜６．３．６頁に説明されている。
【００７９】
高ストリンジェンシー条件は、（１）６５℃で、１×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸Ｎａ_３・２Ｈ_２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ７．０に）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（２）４２℃で、１×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（３）６５℃で、１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ Ｎａ_２−ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）（１Ｍ ＮａＨＰＯ_４＝１リットルあたり１３４ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、４ｍｌ ８５％Ｈ_３ＰＯ_４）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（４）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハート液（１００×＝１０ｇフィコール４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、５００ｍｌまでの水）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（５）６５℃で、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、１％ＳＤＳ、１００：ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡまたは（６）４２℃で、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００：ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡのいずれかでのハイブリダイゼーションと、（１）６５℃で、０．３〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳまたは（２）６５℃で、１ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳのいずれかの高ストリンジェンシー洗浄を用いることができる。上記条件は、５０塩基対またはそれより長いＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに用いられるものとする。ハイブリッドが１８塩基対の長さよりも短いと考えられる場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ハイブリッドの算出されるＴ_ｍの温度（ここで、℃でのＴ_ｍ＝（２×ＡおよびＴ塩基の数）＋（４×ＧおよびＣ塩基の数））よりも５〜１０℃低くなくてはならない。約１８〜約４９塩基対の長さであると考えられるハイブリッドについては、℃でのＴ_ｍ＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ_１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）（式中、「Ｍ」は一価の陽イオン（例えば、Ｎａ^＋）のモル濃度であり、「Ｌ」は塩基対でのハイブリッドの長さである）。
【００８０】
中程度ストリンジェンシー条件は、（１）６５℃で、４×ＳＳＣ、（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸Ｎａ_３・２Ｈ_２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ７．０に）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（２）４２℃で、４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（３）６５℃で、１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ Ｎａ_２−ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）（１Ｍ ＮａＨＰＯ_４＝１リットルあたり１３４ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、４ｍｌ ８５％Ｈ_３ＰＯ_４）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（４）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハート液（１００×＝１０ｇフィコール４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、５００ｍｌまでの水）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（５）６５℃で、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡまたは（６）４２℃で、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００：ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡのいずれかでのハイブリダイゼーションと、６５℃で、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳという中程度ストリンジェンシー洗浄を用いることができる。上記条件は５０塩基対またはそれより長いＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに用いられるものとする。ハイブリッドが１８塩基対の長さよりも短いと考えられる場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ハイブリッドの算出されるＴ_ｍの温度（ここで、℃でのＴ_ｍ＝（２×ＡよびＴ塩基の数）＋（４×ＧおよびＣ塩基の数））よりも５〜１０℃低くなくてはならない。約１８〜約４９塩基対の長さであると考えられるハイブリッドについては、℃でのＴ_ｍ＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ_１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）（式中、「Ｍ」は一価の陽イオン（例えば、Ｎａ^＋）のモル濃度であり、「Ｌ」は塩基対でのハイブリッドの長さである）。
【００８１】
低ストリンジェンシー条件は、（１）５０℃で、４×ＳＳＣ、（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸Ｎａ_３・２Ｈ_２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ７．０に）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（２）４０℃で、６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（３）５０℃で、１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ Ｎａ_２−ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）（１Ｍ ＮａＨＰＯ_４＝１リットルあたり１３４ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、４ｍｌ ８５％Ｈ_３ＰＯ_４）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（４）４０℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハート液（１００×＝１０ｇフィコール４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、５００ｍｌまでの水）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、（５）５０℃で、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、１％ＳＤＳ、１００：ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡまたは（６）４０℃で、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００：ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡのいずれかでのハイブリダイゼーションと、５０℃で、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳまたは（２）０．５％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳのいずれかの低ストリンジェンシー洗浄を用いることができる。上記条件は、５０塩基対またはそれより長いＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに用いられるものとする。ハイブリッドが１８塩基対の長さよりも短いと考えられる場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ハイブリッドの算出されるＴ_ｍの温度（ここで、℃でのＴ_ｍ＝（２×ＡおよびＴ塩基の数）＋（４×ＧおよびＣ塩基の数））よりも５〜１０℃低くなくてはならない。約１８〜約４９塩基対の長さであると考えられるハイブリッドについては、℃でのＴ_ｍ＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ_１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）（式中、「Ｍ」は一価の陽イオン（例えば、Ｎａ^＋）のモル濃度であり、「Ｌ」は塩基対でのハイブリッドの長さである）。
【００８２】
遺伝暗号の縮重のために、配列番号１〜３４に示されるヌクレオチド配列とは異なる配列、またはそれに相補的な配列を有するＭＳＩ−Ｈマーカー核酸の検出も、本発明の範囲内である。このような核酸は、機能的に同等なペプチド（すなわち、同等または同様の生物活性を有するペプチド）をコードするが、配列は、遺伝暗号の縮重のために配列表に示される配列とは異なっている。例えば、いくつかのアミノ酸は、２種以上のトリプレットによって指定される。同一のアミノ酸または同義語を指定するコドン（例えば、各々ヒスチジンをコードするＣＡＵとＣＡＣ）は、ポリペプチドのアミノ酸配列には影響を及ぼさない「サイレント」突然変異をもたらし得る。しかし、主題ポリペプチドのアミノ酸配列の変化を本当に導くＤＮＡ配列多型が哺乳類の間には存在すると予測される。当業者には理解されることであるが、ポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードする核酸の１種以上のヌクレオチドにおけるこれらの変異（例えば、ヌクレオチドの最大約３〜５％）は、天然の対立遺伝子変異のために所与の種の個体間に存在し得る。
【００８３】
本発明はまた、その範囲内に、ストリンジェントな条件（少なくとも、６５℃で、約４×ＳＳＣ、または少なくとも、４２℃で、約４×ＳＳＣ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７０７，８２９号参照）下で、配列番号１〜３４のうちの１種の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドとハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む。これは、配列番号１〜３４の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、プローブが、相補配列を含む遺伝子またはｍＲＮＡ（生体材料の）と優先的にハイブリダイズし、これによって、選択したプローブと独特にハイブリダイズする生体材料の核酸の同定および検出が可能となることを意味する。１５ヌクレオチドより多いプローブを用いることもできるが、１５ヌクレオチドは独特な同定にとって十分な配列に相当する。
【００８４】
配列番号１〜３４のうち１種以上の配列、その一部またはそれに相補的な配列を有するポリヌクレオチドの構築物は、例えば、プローブを作製するために有用であり、当業者に周知の方法を用いて合成によって製造することができ、または天然供給源（例えば、ヒト細胞）から得ることもできる（例えば、サムブロック(Sambrook)ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第２版、（コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク州、１９８９）参照）。
【００８５】
一実施形態では、本発明のＭＳＩ−Ｈマーカーポリヌクレオチド配列として、配列番号１〜３４の配列のうち1種以上と、少なくとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％または９８％同一である配列が挙げられる。あるいは、本発明は、個体において検出でき、ひいては、結腸直腸癌を示す、配列番号１〜３４の核酸配列と相補的であるｍＲＮＡ配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％または９８％同一である核酸配列によってコードされるＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドを含む。特に好ましいポリペプチドとしては、配列番号３５〜６８のもの、またはその断片、または配列番号３５〜６８のうち１種以上のアミノ酸配列と配列において少なくとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるポリペプチド配列がある。
【００８６】
本発明は、個体から得た生体サンプルにおいて、1種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーポリヌクレオチド配列またはＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドの過剰発現を同定することによって結腸直腸癌を検出する方法に加え、同一サンプルにおいて（例えば、同一血清、組織または細胞サンプルにおいて）、少なくとも１種のその他の結腸直腸癌関連マーカーに加えて１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーの存在を同定することによって癌を検出する方法をさらに含む。
【００８７】
マーカーパネル
本発明の一実施形態では、個体から得た生体サンプルを２種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーのパネルに対してスクリーニングする。すなわち、配列番号１〜３４のうち２種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー配列が、癌ではないとわかっている生体サンプルにおける同一配列と比較して少なくとも２倍過剰発現されていると同定される場合にＭＳＩ−Ｈが検出されるといわれる、ＭＳＩ−Ｈを検出する方法を提供する。
【００８８】
さらなる実施形態では、パネルにおいて、本発明の1種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー配列を、マーカー核酸およびアミノ酸配列をはじめとする１種以上のさらなる結腸直腸癌特異的マーカーと組み合わせることができる。本発明において有用な「結腸直腸癌関連マーカー」とは、結腸直腸癌を有する個体から得た結腸直腸癌細胞、組織または血清において、結腸直腸癌を有さない個体から得た細胞、組織または血清における発現のレベルと比較して少なくとも１０％の過剰発現または過少発現を示すポリペプチドまたは核酸配列を指す。以下の表２は、本発明において有用な「結腸直腸癌関連マーカー」のリスト（ただし、本発明において有用な結腸直腸癌関連マーカーは表２に示されるものに限定されない）およびその「配列表」に示される配列との一致を示す。
【００８９】
【表１】

【表２】

【００９０】
本発明において有用な、結腸直腸癌関連マーカーのさらなる限定されない例としては、ポリペプチド上に存在する炭水化物エピトープまたはこのようなエピトープを認識し、結合できる核酸分子および／または抗体分子であり得、炭水化物エピトープは個体において結腸直腸癌の存在と関連があるとわかっている。このような炭水化物エピトープは、２種以上の関連のないタンパク質またはポリペプチド上に存在し得る。一実施形態では、このような炭水化物エピトープは、ＣＡ１９−９であり、シアリル−ルイス^ａとしても知られ、血液型抗原と関連しており、分岐した、種々の糖タンパク質または糖脂質と共有結合している５糖構造からなる炭水化物エピトープとしてモノクローナル抗体によって規定される腫瘍マーカーである。これらのタンパク質は、主にムチンファミリーに属し、脂質は、通常、膜結合型である。ＣＡ１９−９エピトープは、通常、複合体の末端部分、いずれかの高分子上のＯ結合型炭水化物構造である。「結腸直腸癌関連マーカー」のような、本発明において有用な種々の炭水化物エピトープとして規定されるその他の腫瘍マーカーとしては、種々のタンパク質骨格上にある三重にシアル化されたＴｎ抗原であるＴａｇ７２抗原の存在を示すＣＡ７２−４；種々のぺプチドにＯ−結合した、シアル化ｎ−アセチルガラクトサミン部分である、トムゼン−フリーデンリッヒ(Thomsen Freidenreich)抗原（ＴＦ）；種々のペプチドにＯ結合した、末端ｎ−アセチルガラクトサミン部分を含まないＴＦ抗原の骨格である、Ｔｎおよびシアル化Ｔｎ（ｓＴｎ）；シアル化ルイス式Ａ血液型抗原に対応するエピトープであるＣＡ５０；ｍｕｃ−１上のＣＨＯ部分であるＣＡ５４９；シアル化ＣＨＯであるＣＡ２４２；シアル酸が結合した脂質、すなわち、タンパク質が結合していない脂質であるＬＡＳＡ；膵臓関連ムチン様ＣＨＯ抗原であるＤｕ−ＰＡＮの１〜５のが挙げられる。これらの有用な結腸癌特異的抗原およびその他のものは、当技術分野では公知であり、例えば、「セロロジカル・キャンサー・マーカーズ(Serological Cancer Markers)、セル(Sell)，Ｓ．編、１９９２、ヒュマーナ・プレス社(Humana Press Inc.)、ニュージャージー州、トトワ(Totowa)に記載されている。
【００９１】
配列相同性の算出
一実施形態では、本発明は、高ストリンジェンシー条件下での、プローブおよび／またはプライマーの、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列とのハイブリダイゼーションを可能にするよう、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列の一部と相補的であるか、またはＭＳＩ−Ｈマーカー配列の一部と十分に相同であるプローブおよび／またはプライマーを用いることによって、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列またはそれに相同な配列の存在を検出することによる、個体におけるＭＳＩ−Ｈの検出に関する。本発明の配列は、配列番号１〜３４のＭＳＩ−Ｈマーカーと、少なくとも５０％相同であり、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列（または、場合によっては、１種以上のさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする配列）と６０％、７０％、８０％、９０％相同、最大完全配列同一性であることが好ましい。
【００９２】
本明細書に示される配列のいずれかに関して配列同一性は、配列のうちいずれか１種以上を、別の配列と簡単に「視認」比較（すなわち、忠実な比較）し、その他の配列が、配列（類）と、例えば、少なくとも８０％の配列同一性を有しているかどうかを確かめることによって調べることができる。
【００９３】
相対的な配列同一性はまた、同一性を調べるためのいずれかの適したアルゴリズムを用いて２種以上の配列間の同一性％を算出できる市販のコンピュータプログラムによって、例えば、デフォルトパラメーターを用いて、調べることができる。このようなコンピュータプログラムの代表例として、ＣＬＵＳＴＡＬがある。２種の配列間の同一性および類似性を調べるその他のコンピュータプログラム法としては、それだけには限らないが、ＧＣＧプログラムパッケージ(デベロー(Devereux)ら、１９８４、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)１２、３８７）およびＦＡＳＴＡ（アッシュル(Atschul)ら、１９９０、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)４０３〜４１０頁）が挙げられる。
【００９４】
相同性％は、連続配列にわたって算出できる。すなわち、ある配列を他の配列と整列させ、ある配列中の各アミノ酸を、他の配列中の対応するアミノ酸と一度に一残基、直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップなしアラインメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実施される。
【００９５】
これは極めて簡単で一貫した方法であるが、例えば、そうでなければ同一の配列対において、１つの挿入または欠失が以下のアミノ酸残基をアラインメントから出させるということを考慮できず、ひいては、大域アラインメントを実施すると相同性％が大きく低下してしまう可能性がある。したがって、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに過度にペナルティーを課すことなく挿入および欠失の可能性を考慮する最適アラインメントが得られるよう設計されている。これは、局所相同性を最大にしようと配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【００９６】
しかし、これらのより複雑な方法では、同数の同一アミノ酸について、２種の比較されている配列間のより高い関連性を反映する、できる限り少ないギャップを含む配列アラインメントが、多数のギャップを含むものよりも高スコアを達成するよう、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てる。ギャップの存在に比較的高いコストを、ギャップ中の続きの各残基にはより小さいペナルティーを課す「アフィニティーギャップコスト」が通常用いられる。これは最も一般的に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーにより、当然、より少ないギャップしか含まない最適化されたアラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティーを改変することが許容されている。しかし、配列比較のためにこのようなソフトウェアを用いる場合にはデフォルト値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシン・ベネフィット・パッケージ(Wisconsin Bestfit package)を用いる場合には、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップに対して−１２であり、各伸長に対して−４である。
【００９７】
したがって、最大相同性％の算出には、まず、ギャップペナルティーを考慮した、最適アラインメントの作成が必要である。このようなアラインメントを実施するための適したコンピュータプログラムとして、ＧＣＧウィスコンシン・ベネフィット・パッケージ（ウィスコンシン大学、米国；デベロー(Devereux)ら、１９８４、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)１２、３８７頁）がある。配列比較を実施できるその他のソフトウェアの例としては、それだけには限らないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（オーズベル(Ausubel)ら、１９９５、ショート・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Short Protocols in Molecular Biology.)、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(John Wiley and sons Inc.)、ＦＡＳＴＡ（アッシュル(Atschul)ら、１９９０、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)４０３〜４１０頁）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは双方とも、オフラインおよびオンライン検索に利用できる（オーズベル(Ausubel)ら、１９９９、前掲、７−５８〜７−６０頁）。
【００９８】
最終相同性％は同一性という点で測定できるが、アラインメントプロセス自体は通常、全か無かの対比較に基づいているわけではない。そうではなく、スコアを化学的類似性又は進化距離に基づいて各対比較に割り当てる、スケールド類似性スコアマトリックスが一般に用いられる。よく用いられるこのようなマトリックスの例としては、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴプログラム一式のデフォルトマトリックス−がある。ＧＣＧウィスコンシンプログラムは、通常、公開デフォルト値または提供されている場合には、カスタム記号比較表のいずれかを用いる。ＧＣＧパッケージの公開デフォルト値を用いることが好ましく、またその他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスを用いることが好ましい。
【００９９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、パラメーターをデフォルト値に設定して用いることが有利である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ワールドワイドウェブ上、ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlに詳述されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。検索パラメーターは以下の通り規定し、規定のデフォルトパラメーターに設定することが有利であり得る。
【０１００】
ＢＬＡＳＴによって評価した場合「実質的に同一」とは、少なくとも約７、好ましくは、少なくとも約９、もっとも好ましくは１０以上のＥＸＰＥＣＴ値でマッチする配列と同等とみなすことが有利である。ＢＬＡＳＴ検索におけるＥＸＰＥＣＴのデフォルト閾値は、通常、１０である。
【０１０１】
ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘで働く発見的検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、有用性を、カーリン(Karlin)およびアルトシュル(Altschul)の統計的手法を、２，３増強して用いるその発見によるものであるとする（カーリン(Karlin)およびアルトシュル(Altschul)１９９０、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス・オブ・ユーエスエー(Proceedings of National Academic Science of USA)８７：２２６４〜６８頁、カーリン(Karlin)およびアルトシュル(Altschul)、１９９３、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス・オブ・ユーエスエー(Proceedings of National Academic Science of USA)９０、５８７３〜７頁、http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html参照）。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えば、クエリー配列に対する相同性を同定するための配列類似性検索に合わせて作られている。配列データベースの類似性検索における基礎的な問題の議論については、アルトシュル(Altschul)ら、ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)６、１１９〜１２９頁参照。
【０１０２】
ワールドワイドウェブ上、ncbi.nlm.nih.govで入手できる５種のＢＬＡＳＴプログラムは、以下のタスクを実行する：ｂｌａｓｔｐ−タンパク質配列データベースに対してアミノ酸クエリー配列を比較する；ｂｌａｓｔｎ−ヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチドクエリー配列を比較する；ｂｌａｓｔｘ−タンパク質配列データベースに対してヌクレオチドクエリー配列の６通りのフレーム概念的翻訳産物（両鎖）を比較する；ｔｂｌａｓｔｎ−６通り全てのリーディングフレーム（両鎖）で動的に翻訳されるヌクレオチド配列データベースに対してタンパク質クエリー配列を比較する；ｔｂｌａｓｔｘ−ヌクレオチド配列データベースの６通りのフレーム翻訳に対してヌクレオチドクエリー配列の６通りのフレーム翻訳を比較する。
【０１０３】
ＢＬＡＳＴは、以下の検索パラメータを用いる。
【０１０４】
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ−各検索のスコアのヒストグラムを示す；デフォルトはイエス。（ＢＬＡＳＴマニュアル中、パラメータＨ参照）。
【０１０５】
ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ−報告されるマッチする配列の簡単な説明の数を、指定数に限定する；デフォルト限定は１００個の説明である。（マニュアル頁中、パラメータＶ参照）。
【０１０６】
ＥＸＰＥＣＴ−データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性の閾値；デフォルト値は、カーリン(Karlin)およびアルトシュル(Altschul)（１９９０）の確率論的モデルにしたがって、単に偶然によって１０種のマッチが見い出されることが期待されるように１０である。マッチに基づく統計的有意性がＥＸＰＥＣＴ閾値よりも大きい場合には、マッチは報告されない。ＥＸＰＥＣＴ閾値が低いほどより厳しく、マッチが報告される機会がより少なくなる。小数値は許容される。（ＢＬＡＳＴマニュアル中、パラメータＥ参照）。
【０１０７】
ＣＵＴＯＦＦ−スコアの高いセグメント対を報告するためのカットオフスコア。デフォルト値はＥＸＰＥＣＴ値（上記参照）から算出される。ＨＳＰは、それらに基づく統計的有意性がＣＵＴＯＦＦ値に等しいスコアを有する単独のＨＳＰに基づくであろうものと少なくとも同程度に高い場合にのみデータベース配列について報告される。ＣＵＴＯＦＦ値が高いほどより厳しく、マッチが報告される機会がより少なくなる。（ＢＬＡＳＴマニュアル中、パラメータＳ参照）。通常、有意性閾値は、ＥＸＰＥＣＴを用いてより直観的に処理され得る。
【０１０８】
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ−スコアの高いセグメント対（ＨＳＰ）が報告されるデータベース配列を、指定数に限定する；デフォルト限界は５０である。これよりも多くのデータベース配列が、報告するための統計的有意性の閾値をたまたま満たす場合には（以下のＥＸＰＥＣＴおよびＣＵＴＯＦＦ参照）、最大の統計的有意性に基づくマッチのみが報告される。（ＢＬＡＳＴマニュアル中、パラメータＢ参照）。
【０１０９】
ＭＡＴＲＩＸ−ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸの代替スコアリングマトリックスを指定する。デフォルトマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２である（ヘニコフ(Henikoff)＆ヘニコフ(Henikoff)、１９９２）。有効な代替選択としては、ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０およびＩＤＥＮＴＩＴＹが挙げられる。ＢＬＡＳＴＮの代替スコアリングマトリックスは利用できない；ＢＬＡＳＴＮリクエストにおいてＭＡＴＲＩＸ指令を指定すると、エラーレスポンスが返される。
【０１１０】
ＳＴＲＡＮＤ−ＴＢＬＡＳＴＮ検索を、データベース配列の上部または下部の鎖だけに限定する；または、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸもしくはＴＢＬＡＳＴＸ検索を、クエリー配列の上部もしくは下部の鎖のリーディングフレームだけに限定する。
【０１１１】
ＦＩＬＴＥＲ−ウットン(Wootton)＆フェデルヘン(Federhen)（１９９３）コンピューターズ・アンド・ケミストリー(Computers and Chemistry)１７、１４９〜１６３頁のＳＥＧプログラムによって決定される、構造上の複雑性の低いクエリー配列のセグメントまたはクラベリー(Claverie)＆ステイツ(States)（１９９３）コンピューターズ・アンド・ケミストリー(Computers and Chemistry)１７、１９１〜２０１頁のＸＮＵプログラムによって、もしくはＢＬＡＳＴＮについては、タツソフ(Tatusov)＆リップマン(Lipman)のＤＵＳＴプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照）によって決定される、短い周期性内部リピートからなるセグメントをマスクして除外する。フィルタリングによって、統計的有意であるが生物学的には興味深いものではない報告をｂｌａｓｔ出力から排除し（例えば、共通酸性、塩基性またはプロリンリッチ領域に対するヒット）、データベース配列に対する特定のマッチングに利用できる、より生物学的に興味深い領域のクエリー配列を残すことができる。
【０１１２】
フィルタープログラムによって見い出される複雑性の低い配列は、ヌクレオチド配列においては文字「Ｎ」を用いて（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）、タンパク質配列においては文字「Ｘ」を用いて（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）置き換えられる。
【０１１３】
フィルタリングは、データベース配列ではなくクエリー配列（またはその翻訳産物）にのみ適用される。デフォルトフィルタリングはＢＬＡＳＴＮについてはＤＵＳＴであり、その他のプログラムについてはＳＥＧである。
【０１１４】
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴにおいて配列に適用した場合に、ＳＥＧ、ＸＮＵまたは両方によってマスクされるものが何もないことは珍しいことではなく、フィルタリングには常に効果をもたらすと期待してはならない。さらに、配列が完全にマスクされる場合もあり、このことは、フィルタリングされていないクエリー配列に対して報告されるいずれのマッチの統計的有意性も疑わしいはずであるということを示す。
【０１１５】
ＮＣＢＩ−ｇｉ−出力に、受託名および／または遺伝子座名の他、ＮＣＢＩ ｇｉ識別子を示させる。
【０１１６】
配列比較は、ワールドワイドウェブ上、ncbi.nlm.nih.gov/BLASTで提供される簡単なＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて実施することが最も好ましい。本発明のいくつかの実施形態では、配列同一性を調べる場合にギャップペナルティーを用いない。
【０１１７】
プローブおよびプライマー
ＭＳＩ−Ｈマーカーのヌクレオチド配列は、本発明において、血清、結腸細胞または組織などの生体サンプルにおいてＭＳＩ−Ｈマーカー核酸配列を同定するために設計されたプローブおよびプライマーを作製するために有用である。プローブ／プライマーとして有用であるヌクレオチド配列としては、配列番号１〜３４のすべてもしくは一部、またはそれに相補的な配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号１〜３４のすべてもしくは一部とハイブリダイズする配列が挙げられる。例えば、本発明はまた、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーであって、オリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下で、配列番号１〜３４のセンスもしくはアンチセンス配列の、少なくともおよそ８、好ましくは、約１２、好ましくは、約１５、好ましくは、約２５、より好ましくは、約４０の連続ヌクレオチド、最大全長、またはそれに相補的な配列、または天然に存在するその突然変異体とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むプローブ／プライマーを提供する。例えば、配列番号１〜３４、またはそれに相補的な配列のうちの１種で表される核酸に基づくプライマーを反応に用いて、患者の臨床サンプルから得たｍＲＮＡサンプル内に含まれる鋳型核酸（例えば、プライマー配列が誘導されたＭＳＩ−Ｈマーカー）を増幅することができる。
【０１１８】
ＭＳＩ−Ｈマーカー配列をコードする核酸配列に基づくプローブは、ＭＳＩ−Ｈマーカー自体を検出するのに有用であるだけでなく、患者において野生型ＭＳＩ−Ｈマーカー配列の突然変異体を検出する方法も提供できる。野生型ＭＳＩ−Ｈマーカー配列に相補的であり、突然変異遺伝子とミスマッチを形成できる核酸プローブが提供され、これによって酵素的切断もしくは化学的切断による、または電気泳動移動度のシフトによる検出が可能となる。同様に、主題配列に基づくプローブを用いて、例えば、予後アッセイまたは診断アッセイにおいて用いるための、転写物または転写物もしくは相同タンパク質をコードするゲノム配列を検出できる。好ましい実施形態では、核酸プローブは、それに結合しており、検出され得る標識基をさらに含む。例えば、標識基は放射性同位元素、蛍光化合物、化学発光化合物、発色性化合物、酵素および酵素補助因子から選択される。
【０１１９】
配列番号３５〜６８のＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチド配列に対するプローブ、プライマーまたは抗体の作製にとって有用な、開示された核酸を含む全長ｃＤＮＡ分子は以下の通りに得ることができる。ＭＳＩ−Ｈマーカーの核酸配列（配列番号１〜３４）または配列番号１〜３４の配列の少なくともおよそ８、好ましくは、約１２、好ましくは、約１５、好ましくは、約２５、より好ましくは、約４０のヌクレオチド、最大全長を含むその一部、またはそれに相補的な配列をハイブリダイゼーションプローブとして用い、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６５４，１７３号「セクレテッド・プロテインズ・アンド・ポリヌクレオチド・エンコーディング・ゼム(Secreted Proteins and Polynucleotides Encoding Them)」に記載される、プローブ設計法、クローニング法およびクローン選抜技術を用いて、ハイブリダイズするｃＤＮＡライブラリーのメンバーを検出できる。ｃＤＮＡのライブラリーは、正常または腫瘍組織などの選択した組織から、または、例えば、薬剤物質で治療された哺乳類の組織から作製することができる。核酸とｃＤＮＡは双方とも発現された遺伝子に相当するので、組織は核酸を作製するために用いたものと同一であることが好ましい。あるいは、多数のｃＤＮＡライブラリーが市販されている。（サムブロック(Sambrook)ら、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)：ア・ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual)、第２版、（コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor Press)１９８９）。ライブラリー構築用細胞種の選択は、関連遺伝子が公知である核酸によってコードされるタンパク質を同定した後に行うことができる。これによって、どの組織および細胞種が関連遺伝子を発現しそうであるか、したがって、ｃＤＮＡを作製するためのｍＲＮＡを含んでいるかが示される。
【０１２０】
核酸より大きい、好ましくは、天然メッセージの全配列を含むライブラリーのメンバーを得ることができる。全ｃＤＮＡが得られていることを確認するには、ＲＮＡ保護実験を以下のとおり実施すればよい。全長ｃＤＮＡの、ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、ＲＮＡをＲＮアーゼ分解から保護できる。ｃＤＮＡが全長でない場合には、ハイブリダイズされていないｍＲＮＡの一部がＲＮアーゼ分解に付され得る。当技術分野では公知であるが、これは、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動移動度の変化によって、または放出されるモノリボヌクレオチドを検出することによってアッセイできる。サムブロック(Sambrook)ら、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)：ア・ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual)、第２版、（コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor Press)１９８９）。部分ｃＤＮＡの末端の５’のさらなる配列を得るためには、５’ＲＡＣＥ（ＰＣＲプロトコールズ(PCR Protocols)：ア・ガイド・トゥー・メソッヅ・アンド・アプリケーションズ(A Guide to Methods and Applications)（アカデミック・プレス社(Academic Press, Inc.)１９９０）を実施すればよい。
【０１２１】
ゲノムＤＮＡ（例えば、ＭＳＩ−ＨマーカーゲノムＤＮＡ）は、全長ｃＤＮＡの単離と同様の方法で核酸を用いて単離できる。簡単には、核酸またはそのタンパク質を、ゲノムＤＮＡのライブラリーのプローブとして使用できる。ライブラリーは、核酸を作製するために用いた細胞種から得ることが好ましい。ゲノムＤＮＡは、実施例において本明細書に記載される生体物質から得ることがより好ましい。このようなライブラリーは、サムブロック(Sambrook)ら、９．４〜９．３０頁に詳述される、Ｐ１またはＹＡＣなどのゲノムの大きなセグメントを保持するのに適したベクター中にあってもよい。さらに、ゲノム配列は、例えば、リサーチ・ジェネティクス社(Research Genetics, Inc)、米国、アラバマ州、ハントビル(Huntville)から市販されているヒトＢＡＣライブラリーから単離できる。さらなる５’または３’配列を得るには、サムブロック(Sambrook)らに記載される染色体歩行を実施すればよく、その結果、ゲノムＤＮＡの隣接し、重複するフラグメントが単離される。当技術分野では公知であるが、これらは、制限消化酵素およびＤＮＡリガーゼを用いてマッピングおよび統合することができる。
【０１２２】
本発明の核酸を用いることによって、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、プローブするための古典的方法およびＰＣＲ法の双方を用いて対応する全長遺伝子を単離できる。いずれかの方法を用い、いくつかの細胞種でノーザンブロットを実施し、どの細胞株が注目する遺伝子を最高率で発現するかを調べられることが好ましい。
【０１２３】
サムブロック(Sambrook)ら、前掲におけるｃＤＮＡライブラリーを構築する古典的方法。これらの方法を用い、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、ウイルスまたは発現ベクターに挿入することができる。通常、ポリ（Ｔ）プライマーを用いて、ポリ（Ａ）テールを含むｍＲＮＡのライブラリーを作製することができる。同様に、ｃＤＮＡライブラリーは、本ＭＳＩ配列またはその一部をプライマーとして用いて作製できる。
【０１２４】
ＰＣＲ法を用いて、所望の挿入部分を含むｃＤＮＡライブラリーのメンバーを増幅できる。この場合には、所望の挿入部分は、本発明のＭＳＩポリペプチドマーカーをコードする配列に対応する全長ｃＤＮＡに由来する配列を含み得る。このようなＰＣＲ法としては、遺伝子トラッピングおよびＲＡＣＥ法が挙げられる。
【０１２５】
遺伝子トラッピングは、ｃＤＮＡライブラリーのメンバーをベクターに挿入することを必要とし得る。次いで、ベクターを変性して一本鎖分子を作製できる。次いで、基質が結合しているプローブ、例えば、ビオチン化オリゴを用いて注目するｃＤＮＡ挿入部分をトラッピングできる。ビオチン化プローブはアビジンが結合している固体基質と結合できる。ＰＣＲ法を用いて、トラッピングされたｃＤＮＡを増幅できる。全長遺伝子に相当する配列をトラッピングするには、標識したプローブ配列は、配列番号１〜３４の核酸またはそれに相補的な配列に基づくものであり得る。ランダムプライマーまたはライブラリーベクターに特異的なプライマーを用いて、トラッピングされたｃＤＮＡを増幅することができる。このような遺伝子トラッピング技術は、グルバー(Gruber)ら、ＰＣＴ ＷＯ９５／０４７４５およびグルバー(Gruber)ら、米国特許第５，５００，３５６号に記載されている。遺伝子トラッピング実験を実施するためのキットが、例えば、ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)、米国、メリーランド州、ゲイサーズバーグから市販されている。
【０１２６】
「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」またはＲＡＣＥとは、いくつかの異なるＲＮＡからｃＤＮＡを増幅するＰＣＲ法である。ｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドリンカーにライゲーションし、２種のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅することができる。一方のプライマーは、全長配列が望まれる本核酸に由来する配列に基づくものであり得、第２のプライマーは、ｃＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドリンカーとハイブリダイズする配列を含み得る。この方法の説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／１９１１０に報告されている。
【０１２７】
ＲＡＣＥの好ましい実施形態では、ｃＤＮＡ末端と連結している任意のアダプター配列とアニーリングするよう共通プライマーを設計できる（アプテ(Apte)およびシーベルト(Siebert)、バイオテクニークス(Biotechniques)１５、８９０〜８９３頁、１９９３；エドワーズ(Edwards)ら、ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ(Nucleic Acids Research)１９、５２２７〜５２３２頁、１９９１）。単一遺伝子特異的ＲＡＣＥプライマーが共通プライマーと対形成する場合には、単一遺伝子特異的プライマーと共通プライマーの間の配列の優先的な増殖が生じる。ＲＡＣＥにおいて使用するように改変された市販のｃＤＮＡプールを利用できる。
【０１２８】
全長ｃＤＮＡまたは遺伝子を得ると、サムブロック(Sambrook)１５．３〜１５．６３に詳述される、位置指定突然変異誘発によって変異体をコードするＤＮＡを調製できる。置換されるコドンまたはヌクレオチドの選択は、タンパク質構造および／または機能の変更を達成するためのアミノ酸の任意の変更に関する本明細書における開示内容に基づくものであり得る。
【０１２９】
生体物質、例えば、結腸組織からＤＮＡまたはＲＮＡを得る代替法として、本発明の核酸のうち１種以上の配列を有するヌクレオチドを含む核酸を合成できる。したがって、本発明は、核酸分子の複製および発現をはじめとする１種以上の生物学的操作に適した、約８ヌクレオチドの長さ（ストリンジェントな条件下で配列番号１〜３４の核酸配列とハイブリダイズするか、または配列番号１〜３４の核酸配列と少なくとも８０％同一である、少なくとも１２の連続ヌクレオチド、またはそれに相補的な配列に対応する）〜最大長の範囲の核酸分子を包含する。本発明は、それだけには限らないが、（ａ）本発明のＭＳＩ−Ｈマーカーポリヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列の各々によって表される全遺伝子の大きさを有する核酸、（ｂ）融合タンパク質の発現を可能にするよう機能しうる形で連結している、少なくとも１種のさらなる遺伝子も含む（ａ）の核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）を含む発現ベクター、（ｄ）（ａ）または（ｂ）を含むプラスミドおよび（ｅ）（ａ）または（ｂ）を含む組換えウイルス粒子を含む。
【０１３０】
本発明の核酸の配列は制限されず、Ａ、Ｔ、Ｇおよび／またはＣ（ＤＮＡについては）およびＡ、Ｕ、Ｇおよび／またはＣ（ＲＮＡについては）またはをイノシンおよびシュードウリジンをはじめとするその修飾された塩基のいずれの配列であってもよい。配列の選択は所望の機能に応じて変わり、所望のコーディング領域、所望のイントロン様領域および所望の調節領域によって決定できる。
【０１３１】
プローブ調製
プローブ核酸の、患者サンプルとのハイブリダイゼーションの前に、核酸サンプルを、その後のハイブリダイゼーションの検出を容易にするよう調製しなくてはならない。結腸直腸癌またはＭＳＩについてスクリーニングされる個体から得た核酸サンプルは、１種以上の化学結合によって、通常、相補的塩基対形成によって、通常水素結合形成によって、相補的配列の核酸プローブによって結合され得る。
【０１３２】
配列番号１〜３４のＭＳＩ−Ｈマーカー配列のうち１種以上、および場合によっては、少なくとも１種のさらなる結腸直腸癌関連マーカーとハイブリダイズし、ひいては、その存在を同定するために、本発明において有用なプローブは、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列のうち１種以上、および場合によっては、少なくとも１種のさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードするｍＲＮＡ転写物に由来するポリヌクレオチド分子とハイブリダイズするよう設計できる。本明細書において「ｍＲＮＡ転写物に由来するポリヌクレオチド」とは、ｍＲＮＡ転写物またはその部分配列の合成がその鋳型として最終的に役立ったポリヌクレオチドを指す。したがって、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどは、すべてｍＲＮＡ転写物に由来し、このように導かれた生成物の検出は、サンプル中の最初の転写物の存在および／または不在を示す。したがって、適した標的核酸サンプルとしては、それだけには限らないが、遺伝子または遺伝子類のｍＲＮＡ転写物（すなわち、ＭＳＩ−Ｈマーカーまたは結腸直腸癌関連マーカー）、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、遺伝子または遺伝子類から増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどが挙げられる。本明細書において用いられるポリヌクレオチドプローブは、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列のうち１種以上、または場合によっては、少なくとも１種のその他の結腸直腸癌関連マーカーをコードする配列とハイブリダイズするよう設計されていることが好ましい。
【０１３３】
核酸プローブは、当業者に周知の技術を用いて作製できる（例えば、サムブロック(Sambrook)ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)（第２版）、１〜３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)（１９８９））またはカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)、Ｆ．オースベル(Ausubel)ら編、グリーン・パブリッシング・アンド・ウィレー・インターサイエンス(Greene Publishing and Wiley Interscience)、ニューヨーク（１９８７）参照）。
【０１３４】
プローブ核酸の、サンプル中の標的配列とのハイブリダイゼーションを測定するために、プローブ核酸を検出可能な標識で標識することが好ましい。分子と結合しているか、または分子中に組み込まれている、任意の分析的に検出可能なマーカーを本発明に使用できる。分析的に検出可能なマーカーとは、分析的に検出され、定量される、いずれかの分子、部分または原子を指す。
【０１３５】
本発明において使用するのに適した検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電子的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。本発明において有用な標識としては、標識ストレプトアビジンコンジュゲートで染色するためのビオチン、磁性ビーズ（例えば、ダイナビーズ(Dynabeads)ＴＭ）、蛍光色素（例えばフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、３５Ｓ、^１４Ｃまたは^３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいてよく用いられるその他のもの）およびコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)ビーズなどの比標識が挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、同３，８５０，７５２号、同３，９３９，３５０号、同３，９９６，３４５号、同４，２７７，４３７号、同４，２７５，１４９号および同４，３６６，２４１号が挙げられる。
【０１３６】
このような標識を検出する手段は当業者にはよく知られている。したがって、例えば、放射標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出でき、蛍光マーカーは、発光される光を検出するための光検出器を用いて検出できる。酵素標識は通常、酵素を基質とともに提供することと、酵素の基質に対する作用によって生じた反応生成物を検出することとによって検出し、比色標識は、有色標識を簡単に可視化することによって検出する。
【０１３７】
標識は、当業者に周知のいくつかの手段のうちいずれによって核酸プローブに組み込んでもよい。しかし、好ましい実施形態では、プローブポリヌクレオチドの調製における増幅ステップの際に、プローブに標識を同時に組み込む。したがって、例えば、標識したプライマーまたは標識したヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはその他の増幅反応によって、標識した増幅産物、ひいては、標識したプローブが提供される。
【０１３８】
あるいは、標識はプローブに直接付加してもよい。ポリヌクレオチドに標識を結合させる手段は、当業者にはよく知られており、これとしては、例えば、ニックトランスレーションまたは末端標識（例えば、標識したＲＮＡを用いる）と、それに続く、サンプルポリヌクレオチドと標識（例えば、フルオロフォア）とを連結する、ポリヌクレオチドリンカーの結合（ライゲーション）が挙げられる。
【０１３９】
好ましい実施形態では、蛍光修飾は、シアニン色素、例えば、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５ ｄＵＴＰ、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５ ｄＣＴＰ（アマシャム・ファルマシア(Amersham Pharmacia)）またはアレクサ色素（カーン(kahn)，Ｊ．、サイモン(Simon)，Ｒ．、ビットナー(Bittner)，Ｍ．、チェン(Chen)，Ｙ．レイトン(Leighton)，Ｓ．Ｂ．、ポヒダ(Pohida)，Ｔ．、スミス(Smith)，Ｐ．Ｄ．、 チャン(Jiang)，Ｙ．、グーデン(Gooden)，Ｇ．Ｃ．、トレント(Trent)，Ｊ．Ｍ．＆メルツァー(Meltzer)，Ｐ．Ｓ．（１９９８）キャンサー・リサーチ(Cancer Research)５８、５００９５０１３）によってである。
【０１４０】
好ましい実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＩ−Ｈマーカー配列のうち１種以上とハイブリダイズできるプローブ核酸と、少なくとも１種のさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする核酸配列とハイブリダイズできるプローブ核酸とを、試験サンプル（例えば、血清サンプル）と同時ハイブリダイズさせる。この実施形態では、比較のために用いる２種のプローブサンプルは、区別可能な検出シグナルを生じる異なる蛍光色素で標識する。例えば、ＭＳＩ核酸マーカー配列とハイブリダイズ可能なプローブをＣｙ５を用いて標識し、もう一方の結腸直腸関連マーカーとハイブリダイズ可能なプローブをＣｙ３を用いて標識する。異なって標識された標的サンプルを、同じマイクロアレイと同時にハイブリダイズする。
【０１４１】
好ましい実施形態では、対照プローブを、ＭＳＩ核酸マーカー配列用プローブおよび／またはさらなる結腸直腸関連マーカー用プローブとともに、サンプルと同時ハイブリダイズさせることができ、これでは、対照プローブは臨床サンプル中に見られることがわかっている核酸配列とハイブリダイズでき、臨床サンプルが血清サンプルである場合には、対照配列は血清アルブミンまたはフィブリノゲンをコードする配列であり得る。
【０１４２】
抗体
本発明は、個体から得た生体サンプルにおける配列番号１〜３４のＭＳＩ−Ｈマーカー配列のうち１種以上によってコードされるポリペプチド分子（および場合によっては、少なくとも１種のさらなる結腸直腸癌関連マーカー）の存在および過剰発現を検出するステップを含む、ＭＳＩ−Ｈを検出（およびその後、ＭＳＩ状態に基づいて、予後、治療および／またはモニタリングについて患者を層別化）する方法を提供する。一実施形態では、このようなサンプル中の、１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー、またはその他のマーカーの存在は、好ましくは検出可能なように標識されており、サンプル中のＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドと、および存在すれば、その他のマーカーと結合できるポリペプチドリガンドを用いて検出する。好ましい実施形態では、ポリペプチドリガンドは抗体である。本発明の抗体としては、それだけには限らないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製される断片、抗イディオタイプ抗体、またはその他のエピトープ結合性ポリペプチドが挙げられる。本発明において、１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチド（および場合によっては、少なくとも１種のさらなる結腸直腸癌関連マーカー）を検出するために有用な抗体は、ヒト抗体またはｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｄ、一本鎖抗体またはＦｖをはじめとするその断片であることが好ましい。本発明において有用な抗体としては、完全重鎖もしくは軽鎖定常領域またはその一部またはその不在が挙げられる。本発明において有用な抗体は、認識される宿主、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ロバ、ヒツジ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリから得ることができる。一実施形態では、本発明において有用な抗体は、ヒト抗体に、より酷似するよう非抗原結合領域においてアミノ酸が置換されているが、元の結合能力は保持したままである、ヒト化抗体であり得る。ヒト化抗体を作製する方法は、テン(teng)ら、１９８３、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス・オブ・ユーエスエー(Proceedings of National Academic Science of USA)８０、７３０８〜７３１２頁；コズボール(kozbor)ら、１９８３、イミュノロジー・トゥデイ(Immunology Today)４、７２７９頁；オルソン(Olsson)ら、１９８２、メソッズ・イン・エンジモロジー(Methods In Enzymology)９２、３〜１６頁、ＷＯ９２／０６１９３；ＥＰ０２３９４００に開示されている。
【０１４３】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより大きな多重特異性のものであり得る。そのようなものとして、結腸直腸癌および／またはＭＳＩ−Ｈ、または場合によっては、２種以上のＭＳＩポリペプチドマーカーを検出するのに有用な、１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドおよび場合によっては、さらなる結腸直腸癌関連マーカーを、別個の抗体で検出することもできるし、同一抗体で検出することもできる。あるいは、多重特異性抗体は、同一タンパク質上の異なるエピトープに対して異なる特異性を示す場合がある。本発明において有用な抗体の特異性は、ＭＳＩ−Ｈマーカーまたは１種以上のさらなる結腸直腸癌関連マーカーのいずれかに対してであることが好ましいが、本発明において、結腸直腸癌を検出するために有用なポリペプチドと少なくとも９５％、９０％、８５％、７５％、６５％、５５％および少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドと結合する抗体も本発明に含まれる。また、配列番号１〜３４の配列と相補的であるか、もしくはそれとハイブリダイズする１種以上の核酸配列、または本明細書に記載される、さらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする核酸配列と相補的であるか、もしくはそれとハイブリダイズする１種以上の配列によってコードされるポリペプチド分子と結合する抗体も本発明に包含される。
【０１４４】
結腸直腸癌を検出するために有用な本発明の抗体は、それらが結合するポリペプチド分子の活性のアゴニストまたはアンタゴニストとしてさらに作用でき、したがって、結腸直腸癌を治療または予防するための治療分子として有用であり得る。
【０１４５】
それだけには限らないが、本発明の抗体の1つの重要な役割は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ検出法を含む、患者サンプル中の１種以上のＭＳＩポリペプチドマーカーまたはその他の結腸直腸癌関連マーカーの精製または検出を提供することである。本明細書に記載される結腸直腸癌の検出に有用な抗体は、単独で使用しなくてもよく、抗体ポリペプチド配列のＮまたはＣ末端で異種ポリペプチドをはじめとするその他のポリペプチドと融合させることができる。例えば、本発明において有用な抗体を、検出可能な標識と融合させ、標的ポリペプチドと結合している場合には抗体の検出を容易にすることができる。抗体ポリペプチドを検出可能なように標識する方法は、当業者に公知である。
【０１４６】
本発明において有用な抗体を製造するためは、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどをはじめ、種々の宿主を、本発明の候補遺伝子のタンパク質産物（または免疫原性特性を保持している、そのいずれかの部分、断片またはオリゴヌクレオチド）を注射することによって免疫化できる。宿主種に応じて、種々のアジュバントを使用して、免疫学的応答を増大することができる。このようなアジュバントとしては、それだけには限らないが、フロイントのもの、水酸化アルミニウムなどの無機ゲルおよびリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールが挙げられる。ＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌(Bacilli Calmette-Guerin)）およびコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)は、有用なヒトアジュバントである可能性がある。
【０１４７】
ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて作製できる。マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳類は、ＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチド、断片、その修飾型またはその変異体型の免疫原性型で免疫化できる。あるいは、動物は、1種以上のさらなる結腸直腸癌関連マーカーポリペプチドの免疫原性型を用いて免疫化できる。このような分子に免疫原性を付与する技術としては、担体とのコンジュゲーションまたは当技術分野で周知のその他の技術が挙げられる。例えば、免疫原性分子は、上記のアジュバントの存在下で投与できる。免疫化は、血漿または血清中の抗体力価を検出することによってモニターできる。抗原として免疫原を用いる標準的なイムノアッセイ手順を用いて、抗体のレベルおよび特異性を評価できる。免疫化後に抗血清を採取し、必要に応じて、血清からポリクローナル抗体を単離できる。
【０１４８】
モノクローナル抗体を作製するために、免疫化した動物から抗体産生細胞（リンパ球）を採取し、標準的な体細胞融合手順によって骨髄腫細胞と融合し、そのようにして、これらを不死化し、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は当技術分野ではよく知られている（例えば、ケーラー(Kohler)およびミルステイン(Milstein)、１０７５、ネイチャー(Nature)２５６、４９５〜４９７頁；コズボール(kozbor)ら、１９８３、イミュノロジー・トゥデイ(Immunology Today)４、７２頁、コール(Cole)ら、１９８５、モレキュラー・アンチボディーズ・イン・キャンサー・セラピー(Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy)、アレンＲ．ブリス社(Allen R. Bliss, Inc.)７７〜９６頁参照）。さらに、一本鎖抗体を作製するための記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用して、本発明の抗体を製造できる。
【０１４９】
本発明のポリペプチドと特異的に結合できる抗体断片、その断片、その修飾型およびその変異体も、公知の技術によって作製できる。例えば、このような断片としては、それだけには限らないが、抗体分子のペプシン消化によって生じ得るＦ（ａｂ’）_２断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製できるＦａｂ断片が挙げられる。ＶＨ領域およびＦＶ領域は、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌において発現させることができる（例えば、ワード(Ward)ら、１９８９、ネイチャー(Nature)３４１、５４４〜５４６頁；ヒューズ(Huse)ら、１９８９、サイエンス(Science)２４６、１２７５〜１２８１頁；マッカファティ(MaCafferty)ら、１９９０、ネイチャー(Nature)３４８、５５２〜５５４頁）。
【０１５０】
キメラ抗体、すなわち、非ヒト動物可変領域と、ヒト定常領域とを組み合わせた抗体分子も、本発明の範囲内にある。キメラ抗体分子は、例えば、マウス、ラットまたはその他の種の抗体由来の抗原結合ドメインを、ヒト定常領域とともに含む。標準法を用いて、本発明のＭＳＩ−Ｈマーカー抗原の遺伝子産物を認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体を作製できる（例えば、モリソン(Morrison)ら、１９８５、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス・オブ・ユーエスエー(Proceedings of National Academic Science of USA)８１、６８５１頁；タケダら、１９８５、ネイチャー(Nature)３１４、４５２頁；米国特許第４，８１６，５６７号；同４，８１６，３９７号参照）。ベクターおよび宿主細胞
【０１５１】
本発明は、本発明の１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーまたはその他の結腸直腸癌関連マーカーの発現を導くのに有用なベクターおよびプラスミドをさらに提供し、本明細書において提供されるベクターおよびプラスミドを発現する宿主細胞をさらに提供する。以下に記載されるように、ベクターまたはプラスミドからの発現に有用な核酸配列としては、それだけには限らないが、上記の方法によって差次的に制御されると同定されるいずれかの核酸または遺伝子配列が挙げられ、さらに治療用核酸分子、例えば、アンチセンス分子が含まれる。宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれであってもよい。ポリヌクレオチド配列を遺伝子構築物、例えば、発現ベクターに連結することと、真核生物（酵母、鳥類、昆虫もしくは哺乳類）または原核生物の（細菌細胞）いずれかの宿主に形質転換またはトランスフェクトすることとは、当技術分野で周知の標準的な手順である。
【０１５２】
ベクター
本発明の差次的に発現される核酸分子の発現に有用な、当技術分野で公知であり利用可能な多様なベクターがある。個々のベクター選択は、差次的に発現される核酸によってコードされるポリペプチドの目的とする用途に応じて明らかに変わる。例えば、選択されたベクターは、細胞種が原核生物であろうと真核生物であろうと、所望の細胞種においてポリペプチドを発現させることが可能でなければならない。多数のベクターが、原核生物ベクターの複製と、機能しうる形で連結された遺伝子配列の真核生物の発現の双方を可能にする配列を含んでいる。
【０１５３】
本発明による有用なベクターは自己複製しているものであり得る。すなわち、ベクター、例えば、プラスミドは、染色体外に存在し、その複製は宿主細胞ゲノムの複製と必ずしも直接関連していない。あるいは、ベクターの複製が宿主染色体ＤＮＡの複製と関連している場合もある。例えば、レトロウイルスベクターによって達成されるように、ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれている場合もある。
【０１５４】
本発明による有用なベクターは、注目する配列（例えば、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列）に機能しうる形で連結された、配列の転写および翻訳を可能にする配列を含むことが好ましい。連結された注目する配列の転写を可能にする配列としては、プロモーターが挙げられ、場合によっては、エンハンサーエレメントまたは連結された配列の強力な発現を可能にするエレメントも含まれる。用語「転写制御配列」とは、プロモーターと、機能しうる形で連結された核酸配列に所望の発現特性（例えば、高レベル発現、誘導可能な発現、組織または細胞種特異的発現）を付与するいずれかのさらなる配列との組み合わせを指す。
【０１５５】
選択されるプロモーターは、選択される宿主細胞において転写活性を示すいずれかのＤＮＡ配列である場合もあるし、宿主細胞において正常に発現される遺伝子から、またはその他の細胞もしくは生物において正常に発現される遺伝子から導く場合もある。プロモーターの例としては、それだけには限らないが、以下のものが挙げられる：Ａ）原核生物プロモーター−大腸菌(E.coli)ｌａｃ、ｔａｃまたはｔｒｐプロモーター、λファージＰ_ＲまたはＰ_Ｌプロモーター、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、Ｓｐ６プロモーター、枯草菌(B.subtilis)アルカリプロテアーゼプロモーターおよびＢ．ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)マルトジェニックアミラーゼプロモーターなど、Ｂ）真核生物のプロモーター−酵母プロモーター、例えば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４およびその他の解糖系遺伝子プロモーター（例えば、ヒッツマン(Hitzeman)ら、１９８０、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)２５５、１２０７３〜１２０８０頁；アルバー(Alber)＆カワサキ、１９８２、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネティクス(Journal of Molecular and Applied Genetics)１、４１９〜４３４頁参照）、ＬＥＵ２プロモーター（マルチネス−ガルシア(Martinez-Garcia)ら、１９８９、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(Molecular and General Genetics）２１７、４６４〜４７０頁）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（ジェネティック・エンジニアリング・オブ・マイクロオーガニズムス・フォー・ケミカルス(Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals)、ホレンダー(Hollaender)ら編、プレナム・プレス(Plenum Press)、ニューヨーク州中、ヤング(Young)ら、１９８２）またはＴＰＩｌプロモーター（米国特許第４，５９９，３１１号）、昆虫プロモーター、例えば、ポリヘドリンプロモーター（米国特許第４，７４５，０５１号、バスベダン(Vasuvedan)ら、１９９２、フェブス・レターズ(FEBS Lettrs)３１１、７〜１１頁）、Ｐ１０プロモーター（ブラック(Vlak)ら、１９８８、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー(Journal of General Virology)６９、７６５〜７７６頁）、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)多角体病ウイルス塩基性タンパク質プロモーター（ＥＰ３９７４８５）、バキュロウイルス前初期遺伝子プロモーター遺伝子１プロモーター（米国特許第５，１５５，０３７号および同５，１６２，２２２号）、バキュロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーター（同様に、米国特許第５，１５５，０３７号および同５，１６２，２２２号）およびＯｐＭＮＰＶ前初期プロモーター２、哺乳類プロモーター−ＳＶ４０プロモーター（スブラマニ(Subramani)ら、１９８１、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(MoIecular and Cellular Biology)１、８５４〜８６４頁）、メタロチオネインプロモーター（ＭＴ−１；パルミター(Palmiter)ら、１９８３、サイエンス(Science)２２２、８０９〜８１４頁）、アデノウイルス２主要後期プロモーター（ユー(Yu)ら、１９８４、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research)１２、９３０９〜２１頁)、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはその他のウイルスのプロモーター（トング(Tong)ら、１９９８、アンチキャンサー・リサーチ(Anticancer Research)１８、７１９〜７２５頁）または特定の細胞種においては注目する遺伝子の内因性プロモーターさえもが挙げられる。
【０１５６】
選択したプロモーターはまた、プロモーターを誘導可能または組織特異的にする配列に連結することができる。例えば、選択したプロモーターの上流に組織特異的エンハンサーエレメントを加えることによって、所与の組織または細胞種においてプロモーターがより活性になり得る。あるいは、またはさらに、プロモーターを、例えば、熱変化（温度感受性）、化学的処理（例えば、金属イオンまたはＩＰＴＧ誘導可能）による誘導を可能にするいくつかの配列エレメントのうちいずれかと連結することによって、または抗生物質誘導物質(例えば、テトラシクリン)を加えることによって、誘導可能な発現を達成できる。
【０１５７】
制御可能な発現は、例えば、薬物によって誘導可能な（例えば、テトラシクリン、ラパマイシンまたはホルモン誘導可能）発現系を用いて達成される。哺乳類細胞において用いるのに特に適している、薬物によって制御可能なプロモーターとしては、テトラサイクリンによって制御可能なプロモーターおよびグルココルチコイドステロイド、性ホルモンステロイド、エクジソン、リポ多糖類（ＬＰＳ）およびイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって制御可能なプロモーターが挙げられる。哺乳類細胞に用いるための制御可能な発現系は、必ずしもそうではないが、理想的には、制御物質に応じて非哺乳類ＤＮＡモチーフと結合する（または結合できない）転写レギュレーターと、この転写レギュレーターに対してのみ応答性である制御配列を含まなくてはならない。
【０１５８】
また、組織特異的プロモーターは、本発明の構築物をコードする差次的に発現される配列に有利に使用できる。多種多様な組織特異的プロモーターが知られている。本明細書において、用語「組織特異的」とは、所与のプロモーターが、生物のすべてではない細胞または組織において転写的に活性である（すなわち、プロモーターのポリペプチド産物の検出を可能にするほど十分な、連結している配列の発現を指示する）ことを意味する。組織特異的プロモーターは１つの細胞種においてのみ活性であることが好ましいが、例えば、特定の種類または系統の細胞種（例えば、造血細胞）で活性である場合もある。本発明による有用な組織特異的プロモーターは、本来そのプロモーターと連結している遺伝子の発現方法またはパターンと本質的に同じ方法またはパターンでの、機能しうる形で連結している核酸配列の発現に必要であり、十分な配列を含む。以下は、組織特異的プロモーターおよびそのそれぞれの組織においてそれらのプロモーターに特徴的な発現を達成するのに必要な配列を含む参照文献の非排他的リストであり、これらの参照文献の各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。本発明において有用な組織特異的プロモーターの例は以下の通りである。
ボウマン(Bowman)ら、１９９５プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス・オブ・ユーエスエー(Proceedings of National Academic Science of USA)９２、１２１１５〜１２１１９頁には、脳特異的トランスフェリンプロモーターが記載されており、シナプシンＩプロモーターはニューロン特異的であり（スコッチ(Schoch)ら、１９９６ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)２７１、３３１７〜３３２３頁)、ネスチンプロモーターは有糸分裂後ニューロン特異的であり（ウエツキら、１９９６ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)２７１、９１８〜９２４頁）、ニューロフィラメント光プロモーターはニューロン特異的であり（シャロン(Charron)ら、１９９５ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)２７０、３０６０４〜３０６１０頁）、アセチルコリン受容体プロモーターはニューロン特異的であり（ウッド(Wood)ら、１９９５ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)２７０、３０９３３〜３０９４０頁）、カリウムチャネルプロモーターは高頻度発火性ニューロン特異的である(ガン(Gan)ら、１９９６ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)２７１、５８５９〜５８６５頁）。当技術分野で公知の組織特異的転写制御配列はいずれも、疼痛にさらされた動物から得た差次的に発現される核酸配列をコードするベクターとともに有利に使用できる。
【０１５９】
プロモーター／エンハンサーエレメントに加え、本発明による有用なベクターには、適したターミネーターをさらに含めることができる。このようなターミネーターとしては、例えば、ヒト成長ホルモンターミネーター（パルミター(Palmiter)ら、１９８３、前掲)または酵母もしくは真菌宿主についてはＴＰＩ１（アルバー(Alber)＆カワサキ、１９８２前掲）またはＡＤＨ３ターミネーター（マックナイト(McKnight)ら、１９９５、エンボ・ジャーナル(EMBO Journal)４、２０９３〜２０９９頁）が挙げられる。
【０１６０】
本発明による有用なベクターにはまた、ポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０またはＡｄ５Ｅ１ｂポリ（Ａ）配列）と、転写エンハンサー配列（例えば、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ由来のもの）とを含めることができる。さらに、本発明による有用なベクターは、組換えポリペプチドを特定の細胞コンパートメントに向けるシグナル配列をコードする場合もあり、あるいは、組換えポリペプチドの分泌を指示するシグナルをコードする場合もある。
【０１６１】
ａ．プラスミドベクター
選択した宿主細胞種における注目するコード配列（例えば、ＭＳＩ−Ｈマーカーペプチド配列のコード配列）の発現を可能にするプラスミドベクターはいずれも、本発明の使用に許容される。本発明における有用なプラスミドベクターは、本発明による有用なベクターの上記の特徴のいずれかまたはすべてを有し得る。本発明による有用なプラスミドベクターとしては、それだけには限らないが、以下の例が挙げられる：細菌の−ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン(Qiagen)）ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（ストラタジーン(Stratagene)）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５（ファルマシア(Pharmacia)）、真核細胞の−ｐＷＬ_ｎｅｏ、ｐＳＶ２_ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン(Stratagene)）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ(ファルマシア(Pharmacia)）。しかし、宿主において複製可能であり、生存能力がある限りは、どんなその他のプラスミドまたはベクターを使用してもよい。
【０１６２】
ｂ．バクテリオファージベクター
本発明による有用な、いくつかの周知のバクテリオファージ由来ベクターがある。これらの中で第一のものは、挿入部分によってコードされるポリペプチドの誘導可能な発現を可能にするλベースのベクター、例えば、λＺａｐＩＩまたはλＺａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓベクター（ストラタジーン(Stratagene)）である。その他のものとしては、Ｍ１３ベースのベクターのファミリーなどの糸状バクテリオファージが挙げられる。
【０１６３】
ｃ．ウイルスベクター
本発明によれば、いくつかの異なるウイルスベクターが有用であり、細胞における１種以上の本発明のポリヌクレオチドの導入および発現を可能にするウイルスベクターはいずれも、本発明の方法における使用に許容される。外来核酸を細胞に送達するために使用できるウイルスベクターとしては、それだけには限らないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルス（αウイルス）ベクターが挙げられる。欠損レトロウイルスは、遺伝子導入において使用するために十分に特性決定されている（概説については、ミラー(Miller)、Ａ．Ｄ．（１９９０）ブロッド(blood)７６、２７１頁参照)。組換えレトロウイルスを作製するプロトコールおよびこのようなウイルスを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に感染させるプロトコールは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)、オースベル(Ausubel)、Ｆ．Ｍ．ら（編）グリーン・パブリッシング・アソシエーツ(Greene Publishing Associates)、(１９８９)、第９節、９．１０〜９．１４およびその他の標準的な実験室マニュアルに見ることができる。
【０１６４】
レトロウイルスベクターの他、アデノウイルスも、注目する遺伝子産物をコードし、発現するよう遺伝子操作できるが、正常な溶菌性のウイルス生活環においてはその複製能力の点で不活化されている（例えば、バークナー(Berkner)ら、１９８８、バイオテクニークス(BioTechniques)６、６１６頁、ローゼンフェルド(Rosenfeld)ら、１９９１、サイエンス(Science)２５２、４３１〜４３４頁およびローゼンフェルド(Rosenfeld)ら、１９９２、セル(Cell)６８、１４３〜１５５頁）。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ｄｌ３２４またはアデノウイルスのその他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の適したアデノウイルスベクターは当業者によく知られている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および増殖性の生活環には、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする天然に存在する欠損ウイルスである。（概説については、ムジツカ(Muzyczka)ら、１９９２、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Current Topics in Microbiology & Immunology)１５８、９７〜１２９頁参照）。核酸を細胞に導入するために、トラスチン(Traschin)ら（１９８５、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(MoIecular and Cellular Biology)５、３２５１〜３２６０頁）に記載されるものなどのＡＡＶベクターを使用できる。ＡＡＶベクターを用いて、種々の核酸が種々の細胞種に導入されている（例えば、ヘルモナット(Hermonat)ら、１９８４、、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス・オブ・ユーエスエー(Proceedings of National Academic Science of USA)８１、６４６６〜６４７０頁およびトラスチン(Traschin)ら（１９８５、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(MoIecular and Cellular Biology)４、２０７２〜２０８１頁参照）。
【０１６５】
宿主細胞
注目する遺伝子を保持している組換えベクターを導入でき、ベクターが差次的に発現される配列によってコードされるペプチドを発現させることが許容されている細胞はいずれも、本発明によれば有用である。本発明の差次的に発現される分子が発現され、好ましくは検出され得る細胞はいずれも適した宿主であり、これでは、宿主細胞は哺乳類細胞であることが好ましく、ヒト細胞がより好ましい。原核生物および真核生物双方のいくつかの異なる生物に由来する宿主細胞への核酸配列の導入に適したベクターは、本明細書において上記に記載されているか、または当業者には公知である。
【０１６６】
宿主細胞は原核生物、例えば、いくつかの細菌株のいずれかであってもよいし、真核生物、例えば、酵母またはその他の真菌細胞、昆虫もしくは両生類細胞または例えば、げっ歯類、サルもしくはヒト細胞をはじめとする哺乳類細胞であってもよい。細胞は一次培養細胞、例えば、一次ヒト線維芽細胞もしくはケラチノサイトであってもよいし、または確立された細胞株、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３ＴもしくはＣＨＯ細胞であってもよい。さらに、本発明において有用な哺乳類細胞は、表現型的に正常であってもよいし、または発癌性に形質転換されていてもよい。当業者ならば、培養において、選択した宿主細胞種を容易に確立し、維持できると思われる。
【０１６７】
宿主細胞へのベクターの導入
本発明において有用なベクターは、当業者に公知のいくつかの適した方法のうちいずれかによって選択した宿主細胞に導入できる。例えば、ベクター構築物は、大腸菌バクテリオファージベクター粒子、例えば、λまたはＭ１３の場合には、感染によって、またはプラスミドベクターについては、もしくはバクテリオファージＤＮＡについては、いくつかの形質転換法のうちいずれかによって、適当な細菌細胞に導入できる。例えば、標準的な塩化カルシウム媒介性細菌形質転換は、裸のＤＮＡを細菌に導入するために未だよく用いられている（サムブロック(Sambrook)ら、１９８９、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)：ア・ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク州）が、エレクトロポレーションも使用できる（オーズベル(Ausubel)ら、１９８８、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(John Wiley and sons Inc.)、ニューヨーク州、ＮＹ））。
【０１６８】
酵母またはその他の真菌細胞へのベクター構築物の導入には、化学的形質転換法が一般に用いられる（例えば、ローズ(Rose)ら、１９９０、メソッヅ・イン・イースト・ジェネティクス(Methods in Yeast Genetics)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク州に記載されるような）。例えば、Ｓ．セレビシエ(cerevisiae)の形質転換には、細胞を酢酸リチウムで処理し、およそ１０^４コロニー形成単位（形質転換された細胞）／ＤＮＡ１μｇという形質転換効率を達成する。次いで、形質転換された細胞を、用いる選択マーカーに対して適当な選択培地上で単離する。あるいは、またはさらに、プレートまたはプレートから持ち上げたフィルターを、ＧＦＰ蛍光についてスキャンし、形質転換されたクローンを同定することもできる。
【０１６９】
哺乳類細胞への、注目する配列を含むベクターの導入については、用いる方法はベクターの形に応じて変わる。プラスミドベクターは、いくつかのトランスフェクション法、例えば、脂質媒介性トランスフェクション(「リポフェクション」)、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿などのいずれかによって導入できる。これらの方法は、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)（オーズベル(Ausubel)ら、１９８８、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(John Wiley and sons Inc.)、ニューヨーク州、ＮＹ）に詳述されている。
【０１７０】
多種多様な形質転換された細胞および形質転換されていない細胞または一次細胞の一時的トランスフェクションに適したリポフェクション試薬および方法が広く利用可能であり、このためにリポフェクションは、真核生物、特に哺乳類培養細胞へ構築物を導入する魅力的な方法となっている。例えば、リポフェクトアミン(LipofectAMINE)（商標）（ライフテクノロジーズ(Life Technologies)）またはリポタクシ(LipoTaxi)（商標）（ストラタジーン(Stratagene)）キットが利用可能である。リポフェクション用の試薬および方法を提供するその他の会社としては、バイオラッドラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories)、クローンテック(CLONTECH)、グレンリサーチ(Glen Research)、インビトロジェン(InVitrogen)、ジェイビーエルサイエンティフィック(JBL Scientific)、エムビーアイファーメンタス(MBI Fermentas)、パンベラ(Pan Vera)、プロメガ(Promega)、カンタムバイオテクノロジーズ(Quantum Biotechnologies)、シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich)およびワコーケミカルズユーエスエー(Wako Chemicals USA)が挙げられる。
【０１７１】
本発明のベクターを用いてトランスフェクションした後、構築物を（染色体内にまたは染色体外に）うまく組み入れている真核生物の（例えば、ヒトの）細胞を、上記に記載したように、トランスフェクトされた集団の、耐性遺伝子がベクターによってコードされている選択物質、例えば、抗生物質での処理によってか、または、例えば、細胞集団のＦＡＣＳもしくは接着培養の蛍光スキャニングを用いる直接スクリーニングのいずれかによって選択できる。両タイプのスクリーニングを使用できることが多く、これでは、負の選抜を用いて、構築物を取り込んでいる細胞を豊富にし、ＦＡＣＳまたは蛍光スキャニングを用いて、それぞれ、差次的に発現されるポリヌクレオチドを発現する細胞をさらに豊富にするか、細胞の特定のクローンを同定する。例えば、ネオマイシン類似体Ｇ４１８（ライフテクノロジーズ社(Life Technologies, Inc.)）を用いる負の選抜を用いて、ベクターを受け取っている細胞を同定でき、蛍光スキャニングを用いて、ベクター構築物を最大程度に発現する細胞または細胞のクローンを同定できる。
【０１７２】
検出アッセイ
本発明は、コード化された疾患又はその条件に対して、開示されたＭＳＩ−Ｈマーカー（場合によっては、さらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする１種以上の核酸配列、あるいは、ＭＳＩ−Ｈポリペプチドマーカーおよび場合によっては、少なくとも１種のさらなる結腸直腸癌関連マーカー）の過剰発現を検出することによって、結腸直腸癌を検出する方法、あるいは、被験体が結腸直腸癌を発症する危険にあるかどうかを調べる方法、あるいは、腫瘍サンプル中のＭＳＩ−Ｈの存在を調べる方法を提供する。
【０１７３】
臨床適用では、ヒト生体サンプルを、ＭＳＩ−Ｈマーカーおよび／または本明細書において同定されるその他の結腸直腸癌関連マーカーの有無および／または過剰発現についてスクリーニングできる。このようなサンプルは、例えば、ニードル生検コア、外科的切除サンプル、リンパ節組織または血清をはじめとする、組織サンプル、全細胞、細胞溶解物または単離された核酸を含み得る。上記の生体サンプルのいずれかまたはすべてを個体から得る方法は、当業者にはよく知られている。
【０１７４】
核酸分子のスクリーニング
一実施形態では、本発明の検出法は、個体から得た生体サンプルがＭＳＩ−ＨマーカーのＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡを含むかどうか、好ましくは、個々のＭＳＩ−Ｈマーカー配列が少なくとも２倍過剰発現されているかどうかを調べることを含む。注目する核酸分子の存在を調べるための技術としては、それだけには限らないが、ノーザンブロット解析、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲおよび定量的増幅が挙げられる。
【０１７５】
臨床サンプル中の標的核酸分子の検出の前に、サンプルから核酸（好ましくは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ）をまず単離し、標的配列の検出を容易にすることが好ましい。生体サンプルからＲＮＡを単離する方法は当技術分野ではよく知られており、本明細書に記載される生体サンプルからのＲＮＡ抽出には市販のキットを利用できる（例えば、ＲＮイージー(RNeasy)キット、キアゲン(QIAGEN)、カリフォルニア州、バレンシア）。
【０１７６】
あるいは、市販のＲＮＡ単離試薬、例えば、トリゾール(Trizol)（インビトロジェン(Invitrogen)、カリフォルニア州、カールズバッド）を製造業者の使用説明書にしたがって用いて、本発明の臨床サンプルから全ＲＮＡを抽出してもよい。ＲＮＡの純度および完全性は、２６０／２８０ｎｍでの吸光度および１％アガロースゲルでのＲＮＡサンプルの分離とそれに続く紫外線下での観察によって評価する。
【０１７７】
一実施形態では、ＲＮＡを単離した後、当業者に周知の方法にしたがって、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡサンプルを提供できる（例えば、オーズベル(Ausubel)ら（１９９５、ショート・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Short Protocols in Molecular Biology.)、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(John Wiley and sons Inc.)参照）。
【０１７８】
したがって、一態様では、本発明は、本明細書に開示される１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー核酸配列と特異的にハイブリダイズするか、または本明細書に記載されるさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする核酸分子とハイブリダイズできる、プローブおよびプライマーを提供する。したがって、核酸プローブは、配列番号１〜３４の配列と実質的に相補的な核酸とハイブリダイズするのに十分な、配列番号１〜３４の核酸配列の一領域を含む。プローブ／プライマーとして使用するのに好ましい核酸分子は、配列番号１〜３４の配列とハイブリダイズするのに十分な、配列番号１〜３４の配列と実質的に相補的な核酸配列の一領域さらに含み得る。さらに、プローブ／プライマーとして有用な核酸配列は、マーカー核酸配列のコード配列の一部と相補的であり、核酸配列が配列番号１〜３４またはそれに相補的な配列によって表される、少なくとも約８ヌクレオチドの長さの、少なくとも約１２ヌクレオチドの長さの、好ましくは、少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは、約２５ヌクレオチドおよび最も好ましくは、少なくとも４０ヌクレオチド、最大、コード配列のすべてまたはほぼすべてのヌクレオチド配列を含む。
【０１７９】
一実施形態では、本方法は、核酸プローブを用いて、臨床サンプル（例えば、血清サンプルまたはそれから抽出された核酸サンプル）中の１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー核酸分子の存在および過剰発現を調べることを含む。具体的には、本方法は、
１．配列番号１〜３４によって表される核酸配列またはそれに相補的な配列のコード配列の一部と相補的である、少なくとも約８ヌクレオチドの長さの、少なくとも約１２ヌクレオチドの長さの、好ましくは、少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは、約２５ヌクレオチドおよび最も好ましくは、少なくとも約４０ヌクレオチド、最大、コード配列のすべてまたはほぼすべてのヌクレオチド配列を含む核酸プローブを提供することと、
２．ＭＳＩ−Ｈマーカー核酸配列を含む可能性がある患者から生体サンプルを得ることと、
３．結腸直腸癌および／またはＭＳＩを有していないことがわかっている個体から第２の臨床サンプルを提供することと、
４．ストリンジェントな条件下で、核酸プローブを、前記の第１および第２の生体サンプル各々のＲＮＡと接触させること（例えば、ノーザンブロットにおいて、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイにおいて）と、
５．（ａ）プローブと第1の生体サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーション量を、（ｂ）プローブと第２の生体サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーション量と比較し、第２の生体サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーション量と比較した、第１の臨床サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーション量の統計的に有意な差異が、第1の生体サンプル中のＭＳＩ−Ｈマーカー配列の存在を示すことと
を含む。
【０１８０】
あるいは、本発明は、配列番号１〜３４によって表される核酸配列、またはそれに相補的な配列から導いたプローブを用いる、ＭＳＩ−Ｈマーカー核酸配列のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出を含む、ＭＳＩ−Ｈマーカーを検出する方法を提供する。ハイブリダイゼーションプローブは検出可能なように標識されていることが好ましい。本方法は、標識されたハイブリダイゼーションプローブを、結腸直腸癌を有する疑いのある個体から得た組織または細胞サンプルと接触させることと、結合していないプローブを洗い流すことと、検出可能な標識によって生じたシグナルを検出することを含み、検出可能なシグナルの検出がサンプル中のＭＳＩ−Ｈマーカー配列の存在を示し、したがって、結腸直腸癌および／またはＭＳＩの検出を可能にする。あるいは、組織または細胞を、少なくとも１種のさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする核酸配列と特異的にハイブリダイズできる、検出可能なように標識された核酸プローブとさらにハイブリダイズする。その結果、第２の検出可能なように標識されたプローブは、サンプル中のさらなる結腸直腸癌関連マーカーの存在を示し、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列の検出と併せて、個体における結腸直腸癌および／またはＭＳＩの検出を可能にする。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための具体的な方法は、当技術分野ではよく知られている。
【０１８１】
あるいは、ＰＣＲ、ノーザン解析およびタックマン(Taqman)などの方法を用いて、生体サンプル中のＭＳＩ−Ｈマーカー核酸配列の発現（および過剰発現）を検出および／または定量することができる。一実施形態では、生体サンプルから単離されたＭＳＩ−Ｈマーカー配列の所定の部分と特異的にハイブリダイズするよう設計されたプライマーを用いる逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施する。その結果、このような反応によるＰＣＲ産物の生成が、サンプル中のＭＳＩ−Ｈマーカー配列の存在を示す。ＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計する技術は、当技術分野ではよく知られている。オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、５〜１００ヌクレオチドの長さ、理想的には、１７〜４０ヌクレオチドであるが、種々の長さのプライマーおよびプローブが用いられる。増幅用プライマーは約１７〜２５ヌクレオチドであることが好ましい。本発明による有用なプライマーはまた、融解温度推定法によって特定の融解温度（Ｔ_ｍ）を有するよう設計される。オリゴ(Oligo)（商標）（エムビーアイ(MBI)、コロラド州、カスケード(Cascade)）をはじめとする市販のプログラム、プライマー３(Primer3)およびオリゴカルキュレーター(Oligo Calculator)をはじめとするインターネットで利用可能なプライマー設計およびプログラムを用いて、本発明による有用な核酸配列のＴ_ｍを算出できる。好ましくは、例えば、オリゴカルキュレーター(Oligo Calculator)によって算出される、本発明による有用な増幅プライマーのＴ_ｍは、約４５と６５℃の間であることが好ましく、約５０と６０℃の間がより好ましい。本発明による有用なプローブのＴ_ｍは、対応する増幅プライマーのＴ_ｍよりも７℃高いことが好ましい。ＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡを作製した後に、ｃＤＮＡ断片を適当なシークエンシングベクター、例えば、ＰＣＲIIベクター（ＴＡクローニングキット；インビトロジェン(Invitrogen)）にクローニングすることが好ましい。次いで、双方向で配列決定することによって各クローニングされた断片の同一性を確認する。配列決定から得られる配列は、本明細書に記載されるＭＳＩ−Ｈマーカー配列の既知配列と同一であると予測される。
【０１８２】
あるいは、ＭＳＩ−ＨマーカーｍＲＮＡ配列の存在は、ノーザン解析によって検出できる。配列が確認されたｃＤＮＡ、すなわち、本発明のＭＳＩ−Ｈマーカー配列（あるいは、さらなる結腸直腸癌関連マーカー）に相当するｃＤＮＡを用い、当技術分野で周知の技術を用いて^３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを作製する（例えば、オーズベル(Ausubel)、前掲参照）。ノーザン解析用の標識されたプローブはまた、市販のキット（プライマー−イット(Prime-It)キット、ストラタジーン(Stratagene)、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ(La Jolla)）を用いて作製することもできる。従来の記載された技術を用いて、臨床サンプルから得た全ＲＮＡのノーザン解析を実施できる。例えば、全ＲＮＡサンプルをホルムアルデヒド／ホルムアミドを用いて変性し、１％アガロース、ＭＯＰＳ−酢酸塩−ＥＤＴＡゲルにおいて２時間流す。次いで、上方への毛細血管作用によってＲＮＡをニトロセルロースメンブレンに移し、ＵＶ架橋によって固定する。メンブレンを少なくとも９０分間プレハイブリダイズさせ、４２℃で一晩ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、当技術分野で公知のように洗浄を実施する（オーズベル(Ausubel)、前掲）。次いで、−８０℃で、メンブレンを増感スクリーンとともにＸ線フィルムに一晩曝露させる。次いで、フィルムに対する曝露の後に、標識したメンブレンを可視化する。次いで、放射標識されたｃＤＮＡプローブによってＸ線フィルム上に生じたシグナルを、当技術分野で公知のいずれかの技術、例えば、フィルムをスキャニングすることと、ＮＩＨイメージ(NIH Image)（米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)、メリーランド州、ベテスダ(Bethesda)）などのコンピュータプログラムを用いて相対ピクセル強度を定量することとを用いて定量でき、これでは、ＭＳＩ−Ｈマーカー特異的プローブの、臨床サンプルとのハイブリダイゼーションの検出が、ＭＳＩ−Ｈマーカーの存在を示し、したがって結腸直腸癌を検出するために使用できる。
【０１８３】
代替実施形態では、臨床サンプル中のＭＳＩ−Ｈマーカーの存在、場合によっては、量を、転写物特異的アンチセンスプローブ（すなわち、本明細書に記載されるＭＳＩ−Ｈマーカー配列と特異的にハイブリダイズできるプローブ）を用いて実施する、タックマン(Taqman)（商標）（パーキン−エルマー(Perkin-Elmer)、カリフォルニア州、フォレスターシティー(Forester City)）技術を用いて調べることができる。このプローブはＭＳＩ−ＨマーカーＰＣＲ産物に特異的であり、クエンチャーとオリゴヌクレオチドの５'末端と複合体形成した蛍光レポータープローブとを用いて調製する。異なる蛍光マーカーを異なるレポーターと結合させることができ、これによって、一反応において２種の産物の測定が可能となる（例えば、２種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー配列、あるいは、１種のＭＳＩ−Ｈマーカー配列と少なくとも１種のさらなる結腸直腸癌関連マーカーとの測定）。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは活性化されると、その５’から３’の核酸分解活性によって蛍光レポーターを切断除去する。ここでクエンチャーを含まないレポーターが蛍光を発する。色の変化は、各指定の産物の量に比例し、蛍光光度計によって測定される。したがって、各色の量を測定でき、ＲＴ−ＰＣＲ産物を定量できる。ＰＣＲ反応は、９６ウェルプレートで実施でき、その結果、多数の個体から得たサンプルを同時に処理し、測定できる。タックマン(Taqman)（商標）システムには、ゲル電気泳動を必要としないというさらなる利点があり、標準曲線とともに用いると定量化が可能となる。したがって、タックマン(Taqman)法により、本発明のＭＳＩ−Ｈマーカー配列の発現の定量化が可能となり、このような配列の過剰発現の測定が可能となる。
【０１８４】
ポリペプチド分子のスクリーニング
当技術分野で公知のいずれかの方法によって、上記のＭＳＩ−Ｈマーカー特異的および結腸直腸癌マーカー特異的抗体を用いて、生体サンプル中の配列番号１〜３４によってコードされるＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドまたはさらなる結腸直腸癌関連マーカーの存在を検出できる。使用できるイムノアッセイとしては、それだけには限らないが、例えば、２、３例を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散法沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定化アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、タンパク質Ａイムノアッセイなどの技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられる。このようなアッセイは当技術分野では日常的なものであり、よく知られている（例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、オーズベル(Ausubel)ら編、１９９４、カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)、第１巻、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(John Wiley and sons Inc.)、ニューヨーク参照）。例示的イムノアッセイを以下に簡潔に記載する（しかし、制限しようとするものではない）。
【０１８５】
免疫沈降プロトコールは、通常、リン酸タンパク質および／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補給した、ＲＩＰＡバッファー（１％ＮＰ−４０またはトリトン(Triton)Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣＩ、ｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％トラシロール(Trasylol)）などの溶解バッファー中で細胞集団を溶解することと、細胞溶解物に注目する抗体を加えることと、一定時間（例えば、１〜４時間）の間インキュベートすることと、細胞溶解物にタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇセファロースビーズを加えることと、約１時間以上４℃でインキュベートすることと、溶解バッファー中でビーズを洗浄することと、ビーズをＳＤＳ／サンプルバッファーに再懸濁することとを含む。しかし、血清サンプルの免疫沈降の場合には、上記のプロトコールを細胞溶解ステップなしで実施する。抗体の、ＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチド（またはその他の結腸直腸癌マーカー）抗原を免疫沈降させる能力は、例えば、ウエスタンブロット解析によって評価できる。抗体の抗原との結合を増加させ、バックグラウンドを低減するよう改変できるパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物をプレクリアすること）は、当業者にはよく知られている（オーズベル(Ausubel)ら、前掲）。
【０１８６】
ウエスタンブロット解析を用いて、患者の生体サンプル中のＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドおよび場合によっては、１種以上のさらなる結腸直腸癌関連マーカーを検出できる。簡単には、ウエスタンブロット解析は、タンパク質サンプルを調製することと、ポリアクリルアミドゲル（例えば、８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）においてタンパク質サンプルを電気泳動することと、タンパク質サンプルを、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンなどのメンブレンにトランスファーすることと、ブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡもしくは脱脂乳を含むＰＢＳ）中でメンブレンをブロッキングすることと、洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中でメンブレンを洗浄することと、メンブレンを、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体（注目する抗体）でブロッキングすることと、洗浄バッファー中でメンブレンを洗浄することと、メンブレンを、ブロッキングバッファーで希釈した酵素の基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐもしくは１２５Ｉ）と結合している二次抗体（一次抗体、例えば、抗ヒト抗体を認識する）でブロッキングすることと、洗浄バッファー中でメンブレンを洗浄することと、抗原の存在を検出することとを含む。このような解析を最適化する方法は当技術分野ではよく知られている（オーズベル(Ausubel)ら、前掲）。
【０１８７】
あるいは、臨床サンプル中のＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドおよび場合によっては、１種以上のさらなる結腸直腸癌関連マーカーの存在は、ＥＬＩＳＡによって検出できる。ＥＬＩＳＡは、抗原を調製することと、９６ウェルマイクロタイタープレート（またはその他の適した容器）のウェルを、抗原でコーティングすることと、検出可能な化合物、例えば、酵素の基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）と結合している注目する抗体をウェルに加えることと、一定時間インキュベートすることと、抗原の存在を検出することとを含む。ＥＬＩＳＡでは、注目する抗体を、検出可能な化合物と結合させなくてもよく、代わりに、検出可能な化合物と結合している二次抗体（注目する抗体、すなわち、ＭＳＩ−Ｈマーカーペプチドもしくは第２の結腸直腸癌関連マーカーと結合する抗体を認識する）をウェルに加えることができる。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、ウェルに抗体をコーティングしてもよい。この場合には、コーティングされたウェルに注目する抗原を加えた後に、検出可能な化合物と結合している二次抗体を加えればよい。この方法は、当業者に公知の技術にしたがって改変または最適化できる。
【０１８８】
抗体の、抗原との結合親和性および抗体／抗原相互作用のオフレイトは、競合結合アッセイによって求めることができる。このようなアッセイの一例として、漸増量の非標識抗原の存在下で、標識した抗原（例えば、３Ｈもしくは１２５Ｉで標識したＭＳＩ−Ｈマーカー配列）を、抗ＭＳＩ−Ｈマーカー抗体とともにインキュベートすることと、標識した抗原と結合している抗体を検出することとを含むラジオイムノアッセイがある。注目する抗体の、特定の抗原に対する親和性および結合オフレイトは、スキャッチャードプロット分析によるデータから求めることができる。二次抗体との競合も、ラジオイムノアッセイを用いて調べることができる。この場合には、漸増量の非標識二次抗体の存在下で、抗原を、標識した化合物（例えば、３Ｈもしくは１２５Ｉ）と結合している注目する抗体とともにインキュベートする。
【０１８９】
抗体を用いる上記検出アッセイを実施し、配列番号１〜３４の配列またはそれに相補的な配列を有する核酸によってコードされるタンパク質産物を検出することが好ましい。タンパク質産物は配列番号３５〜６８のうち１種以上の配列を有することが好ましい。さらに、上記の検出アッセイは、少なくとも１種のさらなる結腸直腸癌関連マーカーを特異的に認識し、結合する１種以上の抗体を用いて実施できる。したがって、一実施形態では、本アッセイは、試験細胞のタンパク質を、配列番号１〜３４によって表される核酸またはそれに相補的な配列の遺伝子産物に特異的な抗体と接触させることと、抗体と試験細胞のタンパク質とによる免疫複合体形成のおよその量を求めることとを含み、このような免疫複合体の検出が抗原の存在を示し、したがって、結腸直腸癌の検出を可能にする。
【０１９０】
本発明において有用なイムノアッセイとしては、上記のものが挙げられ、また、同種の手順および異種手順のどちらも、例えば、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）および比濁分析阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）も含めることができる。
【０１９１】
もう１つの実施形態では、患者の生体液（例えば、血液または尿）中の、コードされる産物、すなわち、配列番号１〜３４またはそれに相補的な配列によってコードされる産物のレベルを、その患者の細胞におけるマーカー核酸配列の発現のレベルをモニターする一手段として調べることができる。このような方法は、患者から生体液のサンプルを得るステップと、サンプル（またはサンプルから得たタンパク質）をコードされるマーカーポリペプチドに特異的な抗体と接触させるステップと、抗体による免疫複合体形成量を調べるステップとを含み、免疫複合体形成量がサンプル中のマーカーによってコードされる産物のレベルを示す。この測定は、正常個体から採取した対照サンプル中の、または同一人物から以前にもしくは後に得た１種以上のサンプル中の同一抗体による免疫複合体形成量に対して比較する場合に、特に有益である。
【０１９２】
もう１つの実施形態では、本方法を用いて、細胞中に存在するマーカーポリペプチドの量を調べることができ、次いで、これを過剰増殖性障害、例えば、結腸直腸癌の進行と関連付けることができる。マーカーポリペプチドのレベルを、細胞のサンプルが形質転換された細胞である細胞または形質転換された細胞になりやすい細胞を含むかどうかを評価するために予測的に用いることができる。さらに、本方法を用いて、形質転換されているとわかっている細胞の表現型を評価でき、表現型結果は、個々の治療計画を立てる際に有用である。例えば、サンプル細胞における極めて高レベルのマーカーポリペプチドは、癌、例えば、結腸直腸癌の強力な診断および予後マーカーである。マーカーポリペプチドレベルの観察結果を、例えば、より積極的な治療の使用に関する決定に利用できる。
【０１９３】
上記で示したように、本発明の一態様は、患者から単離した細胞との関連では、サンプル細胞においてマーカーポリペプチドのレベルが有意に低減されるかどうかを調べる検出アッセイに関する。用語「有意に低減された」とは、同様の組織起源の正常細胞と比較して、細胞が低減した細胞量のマーカーポリペプチドを有する細胞表現型を指す。例えば、細胞は、正常対照細胞の約５０％、２５％、１０％または５％未満のマーカーポリペプチドを有し得る。詳しくは、アッセイは試験細胞中のマーカーポリペプチドのレベルを評価し、好ましくは、測定されたレベルを、少なくとも１種の対照細胞、例えば、正常細胞および／または既知の表現型の形質転換された細胞において検出されたマーカーポリペプチドと比較する。
【０１９４】
本発明の特に重要なことは、正常または異常なＭＳＩ−Ｈマーカー発現のレベルを定量する能力である。ＭＳＩ−Ｈマーカーの発現、および／またはＭＳＩ−Ｈマーカーの発現レベルを、患者が結腸直腸癌を発症しやすいかどうかを評価するために、または結腸直腸癌の重篤度を調べるために、またはマイクロサテライト不安定性を有する腫瘍の存在を調べるために予測的に用いることができる。
【０１９５】
一実施形態では、組織サンプルを用い、所与のＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドを発現する細胞（すなわち、結腸細胞）の数を調べるために使用できる免疫組織化学染色によってＭＳＩ−Ｈマーカーペプチド発現を測定できる。このような染色には、組織のマルチブロックを生検またはその他の組織サンプルから採取し、プロテアーゼＫまたはペプシンのような薬剤を用いるタンパク質分解性加水分解に付す。特定の実施形態では、サンプル細胞から核画分を単離し、核画分においてマーカーポリペプチドのレベルを検出することが望ましい場合がある。
【０１９６】
組織サンプルを、ホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノールなどといった試薬で処理することによって固定する。次いで、サンプルを、所与のＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチド（または複数のＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチド）および場合によっては、さらなる結腸直腸癌関連マーカーに対する結合特異性を有する抗体、好ましくは、モノクローナル抗体とともにインキュベートする。この抗体には、その後の結合の検出のために標識を結合させることができる。サンプルを、免疫複合体を形成するのに十分な時間インキュベートする。次いで、抗体の結合を、この抗体と結合している標識によって検出する。抗体を標識していない場合は、例えば、抗マーカーポリペプチド抗体のアイソタイプに特異的である二次標識抗体を使用することができる。使用できる標識の例としては、放射性核種、フルオロフォア、化学発光標識、酵素などが挙げられる。
【０１９７】
酵素を用いる場合には、酵素の基質をサンプルに加え、着色された生成物または蛍光生成物を提供することができる。コンジュゲートにおいて使用するのに適した酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。市販にない場合には、このような抗体−酵素コンジュゲートは、当業者に公知の技術によって容易に作製できる。サンプル（血清または組織のいずれか）中のポリペプチドの存在および／または量を調べるための当業者に公知のその他のアッセイもまた、本発明に包含される。
【０１９８】
癌の予後、ステージングおよびモニタリング
一態様では、本発明は、本発明に記載の方法を用いるＭＳＩ−Ｈマーカー配列およびポリペプチドの発現レベルの調査に基づいて癌予後およびステージを調べる方法を提供する。マーカー配列の発現レベルを調べることによって以外の技術を用いて被験体において癌が検出される場合には、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列の差次的発現レベルを用いて被験体の予後およびステージを調べることができる。本明細書において、予後とは、あり得る疾患の経過および転帰の予想を指す。
【０１９９】
当技術分野では、結腸直腸癌腫瘍のＭＳＩ状態によって、臨床転帰および生存、ならびに特定の療法に対する患者の応答を予測できるということが一般に認められている。例えば、５−フルオロウラシル(flurouracil)／レバミソールおよびフルオロピリミジンベースの化学療法後に、ＭＳＩ−Ｈ結腸腫瘍を患う患者は、ＭＳＳまたはＭＳＩ−Ｌ結腸直腸癌腫瘍を有する患者と比較して、高い生存率を有することがわかっており（エラレ(Elaleh)ら、２０００オンコロジー(Oncology)５８、５２頁；エルサレイ(Elsaley)およびラコペッタ(Iacopetta)、２００１、クリニカル・コロレクタル・キャンサー(Clinical Colorectal Cancer)１、１０４頁）、また、全般的に、結腸直腸腫瘍のＭＳＩ−Ｈ状態は、化学的介入に対する、このような腫瘍のより高い感受性を示し得る（例えば、リャン(Liang)ら、２００２、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(International Journal of Cancer)１０１、５１９頁参照）。さらに、ＭＳＩ−Ｈ結腸直腸腫瘍は、ＭＳＳまたはＭＳＩ−Ｌ腫瘍と比較した全生存の改善と関連しており（グリフェ(Gryfe)ら、２０００、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(New England Journal of Medicine)３４２、６９頁；ワード(Ward)ら、２００１、ガット(Gut)４８、８２１頁）、また、初期の結腸直腸癌と関連している（キム(Kim)ら、１９９４、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー(American Journal of Pathology)１４５、１４８頁；ガファ(Gafa)ら、２０００、キャンサー(Cancer)８９、２０２５頁；ジェーンバル(Jernvall)ら、１９９９、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・キャンサー(European Journal of Cancer)３５、１９７頁）。したがって、本明細書に記載されるＭＳＩ−Ｈマーカー配列の過剰発現を用いて調べられる、結腸直腸腫瘍のＭＳＩ−Ｈ状態を予後指標として使用でき、また、これを用いて所与の患者の治療計画を設計または選択でき、また、これを用いて結腸直腸癌をステージングできる。
【０２００】
概して、癌の予後またはステージに用いる方法は、注目するサンプル中のＭＳＩ−Ｈマーカー配列の量を、対照のものと比較して、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列の発現の相対的差異を検出することを含み、これでは、差異は定質的におよび／または定量的に測定できる。例えば、１種以上のＭＳＩ−ＨマーカーＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルは、癌を含まないサンプルまたは正常サンプル中の同一ＭＳＩ−ＨマーカーＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較できる。あるいは、１種以上のＭＳＩ−ＨマーカーＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルはまた、進行しないことがわかっている癌において観察される同一ＭＳＩ−ＨマーカーＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較できる。さらに、１種以上のＭＳＩ−ＨマーカーＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルはまた、進行および／または転移することがわかっている癌において観察される同一ＭＳＩ−ＨマーカーＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較できる。
【０２０１】
また、本明細書において、癌ステージとは、癌が発現し、症状を引き起こす一連の事象を指す。さらに、ステージングとは、患者において癌状態がどのように進行しているかを説明するために用いられる過程である。ステージングシステムは、癌の種類によって異なるが、一般に、以下の「ＴＮＭ」システムを含む：Ｔによって示される腫瘍の種類、Ｎによって示される、癌が近くのリンパ節に転移しているかどうか、Ｍによって示される、癌が身体のより離れた部分に転移しているかどうか。一般に、癌が、いずれのリンパ節にも広がっておらず、一次病巣の領域のみで検出可能である場合には、ステージＩと呼ばれる。最も近いリンパ節にのみ広がっている場合には、ステージIIと呼ばれる。ステージIIIでは、通常、癌は一次病巣の部位に近接するリンパ節に広がっている。肝臓、骨、脳またはその他の部位などの身体の離れた部分に広がった癌はステージIVであり、最も進行したステージである。本発明の方法は、癌のステージングをアッセイするのに有用である。癌のステージングは、１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー核酸またはポリペプチドの発現レベルを、同一ＭＳＩ−Ｈマーカー核酸またはポリペプチドの参照発現レベルに対して調べることによって達成できる。マーカーＲＮＡまたはポリペプチドの参照発現レベルは、癌のないまたは健常なまたは癌サンプルから得たものであり得、これでは、癌は異なる進行ステージのものであってもよいし、あるいは、腫瘍によって浸潤されていない、結腸に隣接する部分に由来するものであってもよい。
【０２０２】
本発明は、ＭＳＩ−Ｈマーカー核酸またはポリペプチドの発現レベルを経時的に測定することによる、癌の進行または再発をモニターする方法をさらに提供する。一実施形態では、本方法は
（１）第1の時点で、被験体の生体サンプルにおいて、配列番号１〜３４からなる群から選択される１種以上の核酸配列を含む１種以上の核酸配列の発現を検出することと、
（２）その後の時点で、ステップ（ａ）を反復することと、
（３）ステップ（ａ）および（ｂ）において検出された発現レベルを比較することとを含み、発現レベルの変化が、被験体における癌またはその前癌性状態の進行を示す。
【０２０３】
もう１つの実施形態では、本方法は、
（１）第1の時点で、被験体の生体サンプルにおいて、配列番号３５〜６８からなる群から選択される１種以上のポリペプチド配列を含む１種以上のポリペプチドの発現を検出することと、
（２）後の時点で、ステップ（ａ）を反復することと、
（３）ステップ（ａ）および（ｂ）において検出された発現レベルを比較することとを含み、発現レベルの変化が、被験体における癌またはその前癌性状態の進行を示す。
【０２０４】
例えば、より早い時点と比較して、後の時点での１種以上の過剰発現されるＭＳＩ−Ｈマーカーヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルの上昇、または１種以上の過少発現されるＭＳＩ−Ｈマーカーヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルの低下は、癌がより重篤なステージに進行していることを示す。一方では、より早い時点と比較して、後の時点での１種以上の過剰発現されるＭＳＩ−Ｈマーカーヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルの低下、または１種以上の過少発現されるＭＳＩ−Ｈマーカーヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルの上昇は、癌が進行していないか、ゆっくりと進行していることを示す。
【０２０５】
癌の予後、ステージングおよびモニタリングにおいて用いられる方法は、種々の種類の癌に適用できる。癌の例としては、それだけには限らないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫および白血病が挙げられる。より詳しくは、癌の例としてはまた、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝細胞癌および肝細胞腫などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎細胞癌およびウィルムス腫瘍などの腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌および種々の種類の頭頸部癌が挙げられる。好ましくは、癌として乳癌、結腸癌および肺癌が挙げられる。癌が結腸癌であり、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列が、配列番号１〜３４からなる群から選択される核酸配列を含むものであることがより好ましい。
【０２０６】
療法および治療用組成物の有効性
ＭＳＩ状態により、当業者が治療戦略に関する決定を行うことが可能となるので、一態様では、本発明はまた、癌、特に、結腸癌のための従来的および非従来的な治療および療法の双方から利益を得そうである患者の評価および／またはモニタリングを可能にする方法を提供する。したがって、本発明は、癌患者を治療するための、単独で用いられる抗癌治療および療法、互いに組み合わせた抗癌治療および療法ならびに／または抗癌薬、抗腫瘍剤、化学療法および／もしくは放射線療法および／もしくは手術と組み合わせた抗癌治療および療法を受けている患者を試験することと、スクリーニングすることと、モニタリングすることとを包含する。
【０２０７】
本発明の利点は、１種またはいくつかの利用可能な癌療法から利益を受けることができる患者を長期間モニターまたはスクリーニングする能力、また好ましくは、個々の種類の療法または併用療法を受けている患者を長期間モニターし、患者が治療からどのようにうまくやっているか、治療の変化、変更または中止に値するかどうか、患者の疾患が減少しているか、寛解しているか、和らいでいるかどうか、あるいは、患者の疾患状態またはステージが進行しているか、または転移性もしくは浸潤性になっているかどうかを調べる能力である。本明細書に包含される癌治療はまた、患者において、腫瘍または腫瘍量を除去するか腫瘍または腫瘍量の大きさを減少させるための手術も含む。したがって、本発明の方法は、術後の患者の進行および疾患状態をモニターするために有用である。
【０２０８】
本発明による癌療法についての正確な患者の同定によって、治療の有効性の増大を提供することができ、患者が、療法の、不要の、命にかかわる副作用を受けるのを避けることができる。同様に、本明細書においてさらに論じられるように、本発明の方法を用いる療法経過を受けている患者をモニターする能力によって、患者が長期にわたって療法に対して十分に応答しているかどうかを調べること、投与量または送達量または送達様式を変更または調整しなくてはならないかどうかを決定すること、患者が療法の間に改善されている、または逆行している、または浸潤もしくは転移を含む、疾患のより重篤なもしくは進行したステージに入っているかどうかを確認することができる。
【０２０９】
本発明によるモニターする方法は、長時間にわたって、例えば、治療または療法経過の間、または患者の疾患の経過の間、患者の体液サンプルを試験または分析することによる、癌患者の連続または逐次試験または分析を反映するものである。例えば、連続試験では、本発明の方法にしたがって、治療の経過の間および／または疾患の経過の間、１種以上のこれらのＭＳＩ−Ｈマーカーのレベルを測定することによって、患者において、本発明の１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリペプチド）の発現レベルを観察、調査または検査する目的で、同一患者が、体液サンプル、例えば、血清または血漿を提供するか、同一患者がサンプルを採取される。
【０２１０】
同様に、患者を経時的にスクリーニングして、その疾患の状態および／または受けている癌もしくは新生物性疾患治療もしくは療法の有効性、それに対する反応および応答を調べる目的で、生体サンプル中の１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーのレベルを評価することができる。当然のことではあるが、患者が治療を受けている間ならびに臨床評価および医学的評価を受けている間の１以上の後の時点での、患者の進行および／または応答の分析および評価を補助するために、治療もしくは療法の経過の前に、または治療もしくは療法の開始時に、1種以上の治療前サンプルを患者から採取することが最適である。
【０２１１】
患者の本発明の１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーのレベルの、数日、数週間、数ヵ月、時には数年またはその種々の間隔であり得る長期にわたるモニタリングでは、治療または疾患の経過にわたって、癌患者における１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーのレベルを、正常個体における１種以上のこれらの分析物の各レベルと比較して調べるために、患者の体液サンプル、例えば、血清または血漿サンプルを、医師または臨床医などの開業医によって決められる間隔で採取する。例えば、本発明によれば、患者サンプルを、1ヶ月毎、２ヶ月毎、または１、２もしくは３ヶ月間隔を組み合わせて採取し、モニターすることができる。年４回またはそれより高頻度で患者サンプルをモニターすることが望ましい。
【０２１２】
患者において見られる１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーのレベルを、正常個体における1種以上のこれらのマーカーの各レベルと、また、例えば、試験期間前に得た患者自身のＭＳＩ−Ｈマーカーレベルと比較し、治療または疾患進行または転帰を調べる。したがって、経時的にモニターされた患者自身のＭＳＩ−Ｈマーカーレベルの使用により、比較目的で、マーカーレベル、ひいては、癌の存在および／または進行を長期間モニターするための内部人物対照として患者自身の値を提供できる。本明細書に記載されるように、治療または疾患の経過の後、長期にわたる、癌患者における１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーレベルの、正常個体における1種以上のこれらのＭＳＩ−Ｈマーカーの各レベルと比較した上昇または低下の測定は、患者の癌療法または治療の経過または転帰における、患者の癌の重篤度もしくはステージ、または進行もしくは進行がないことを調べる能力を反映するものである。
【０２１３】
癌患者におけるＭＳＩ−Ｈマーカーのレベルの上昇または低下は、正常対照範囲の発現レベルと比較して癌患者サンプルを分析することから得られた値を比較することによって求める。ＭＳＩ−Ｈマーカーは、マーカーの発現が、正常対照と比較して、癌患者おいて少なくとも２倍大きい場合に過剰発現されるといわれ、またＭＳＩ−Ｈマーカーは、マーカーの発現が、癌患者においてと比較して、正常対照において少なくとも２倍大きい場合に過少発現されるといわれる。
【０２１４】
長期にわたる患者のモニタリングでは、１種以上の患者のＭＳＩ−Ｈマーカーレベルの、正常範囲の値と比較して上昇したレベル（すなわち、少なくとも２倍過剰発現された）から、正常個体において見られる分析物のレベルのまたは分析物のレベル付近のレベルへのレベルの低下は、治療の進行もしくは有効性および／または疾患の改善、寛解、腫瘍の減少または排除などを示す。同様に、本発明の実施形態において記載されるすべての方法において、上昇した（すなわち、少なくとも２倍過剰発現された）レベルから、正常個体において見られる1種以上のこれらの分析物の各レベルへ、またはその前後への、１種以上の患者のＭＳＩ−Ｈマーカーレベルの低下を調べることは、本発明の実施後の、患者の改善、回復もしくは寛解および／または治療の進行もしくは有効性が長期にわたって確認され得る、本方法の方法のさらなる態様を提供する。
【０２１５】
本発明のもう１つの実施形態は、癌患者の疾患の経過、または癌患者の治療もしくは療法の有効性をモニターする方法を包含する。患者の治療もしくは療法としては、従来的な治療、例えば、ホルモン療法、化学療法薬療法、放射線療法または新規療法または前記のもののいずれかの組合わせが挙げられる。本方法は、疾患または癌治療の経過の間、癌患者の体液サンプル中の１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカーのレベルを測定することと、患者のサンプル中の１種以上のマーカーのレベルが、正常対照中の１種以上のこれらの分析物の各レベルと比較して少なくとも２倍変化しているかどうかを調べることを含む。本方法によれば、癌患者におけるＭＳＩ−Ｈマーカーのレベルの、正常対照におけるＭＳＩ−Ｈマーカーの各レベルと比較した変化は、患者の癌のステージ、グレード、重篤度または進行の変化および／または治療の経過の間に患者に提供される、癌治療もしくは療法の有効性もしくは利益の欠如、例えば、不十分な治療または臨床転帰を示す。
【０２１６】
当技術分野の熟練した開業医には理解されるであろうが、本発明によるモニタリング法は、疾患または疾患治療計画の経過の間に（例えば、数日、数週間、数ヵ月または場合によっては、数年後または種々の複数のこれらの間隔の後に）患者から採取したサンプルを用いて連続または逐次様式で実施し、疾患の進行もしくは転帰、および／または治療の有効性または転帰を調べることが可能となることが好ましい。サンプルが凍結または冷蔵保存を受け入れられる場合には、サンプルを患者（または正常個体）から採取し、分析の前に一定期間保存することができる。
【０２１７】
もう１つの実施形態では、本発明は、分析されるサンプル中の本発明の１種以上のマーカーのレベルの測定と併せて、１種以上のさらなる癌マーカーの量またはレベルの測定を包含する。
【０２１８】
本発明はまた、癌、例えば、結腸癌を阻害する試験組成物の有効性を評価する方法を含む。上記のように、本発明のＭＳＩ−Ｈマーカー配列の差次的発現レベルは、癌細胞、特に結腸癌細胞の癌性状態と相関関係がある。本発明のＭＳＩ−Ｈマーカー配列の発現レベルの変化は、細胞の癌性状態に起因し得るか、または細胞の癌性状態を誘導し得ると認識されている。したがって、患者において癌を阻害する組成物は、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列の発現レベルを、マーカー配列の正常発現レベル付近のレベルに変化させる。したがって、本方法は、試験組成物の存在下で維持された第1の生体サンプル中の１種以上のＭＳＩ−Ｈマーカー配列の発現レベルを、試験組成物の不在下で維持された第２の生体サンプル中の同一ＭＳＩ−Ｈマーカー配列のものと比較することを含む。１種以上のマーカー配列の発現レベルの有意な差異は、試験組成物が癌を阻害するという指標である。好ましい実施形態では、癌は結腸癌であり、ＭＳＩ−Ｈマーカー配列は配列番号１〜３４および／または３５〜６８に列挙されるものである。もう１つの実施形態では、細胞サンプルは、健常被験体または癌状態の患者のいずれかから得られた単一サンプルのアリコートであり得る。
【０２１９】
マーカー配列のモジュレーター
ＭＳＩ−Ｈマーカー配列の発現レベルの変化は、細胞の癌性状態を誘導、維持および促進する可能性があると認識されている。したがって、本発明のもう１つの態様は、細胞の分化および増殖を調節できるＭＳＩ−Ｈマーカー配列のモジュレーターを対象とする。この関連で、本発明は、マーカー配列の発現を調節する化合物を調べるアッセイを提供する。ＭＳＩ−Ｈマーカー配列によってコードされるポリペプチドまたはＭＳＩ−Ｈマーカー配列自体の生物活性を調節するために、本化合物を使用できる。化合物はまた、種々の異なる環境において、例えば、癌と関連する障害を治療または予防する医薬として有用であり得る。
【０２２０】
化合物を同定する方法は、通常、化合物をＭＳＩ−Ｈマーカー配列、その転写産物、その翻訳産物またはその他の標的と接触させるステップと、化合物がマーカー配列を調節するかどうかを調べるステップとを含む。ＭＳＩ−Ｈマーカー配列の発現を調節するには、方法は、以下のステップ、例えば、マーカー配列（例えば、細胞集団中の）を、試験化合物と、前記試験化合物がマーカー配列の発現を調節するのに有効な条件下で接触させるステップと、前記試験物質が前記配列を調節するかどうかを調べるステップのうち１以上をいずれかの有効な順序で含み得る。化合物は、細胞において配列の発現をいずれかのレベル、例えば、転写（例えば、プロモーターを調節することによる）、翻訳および／または核酸の維持（例えば、分解、安定性など）で調節できる。
【０２２１】
ポリペプチドの生物活性を調節するには、方法は、以下のステップ、例えば、ポリペプチド（例えば、細胞、溶解物中の、または単離された）を、試験化合物と、前記試験物質が前記ポリペプチドの生物活性を調節するのに有効な条件下で接触させるステップと、前記試験化合物が前記生物活性を調節するかどうかを調べるステップのうち１以上をいずれかの有効な順序で含み得る。
【０２２２】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、試験化合物と接触させることは、化合物を、サンプルにおいて遺伝子またはその産物の発現または生物活性を機能的に制御する位置におく、いずれかの適した方法および／または手段によって達成できる。機能的制御とは、どんな機構が働こうとも、化合物がその生理学的作用を発揮し得ること示す。方法および／または手段の選択は、化合物の性質ならびに遺伝子またはその産物が提示される環境の状態および種類、例えば、溶解物、単離された、または細胞集団中の（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、組織移植片など）に応じて変わり得る。例えば、細胞集団がｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物である場合には、化合物を培養培地に直接添加することによって化合物を細胞と接触させることができる。化合物が水性培地に容易には溶解できない場合には、リポソームまたは別の脂溶性担体に組み込み、次いで、細胞培養物に投与することができる。接触は、担体を用いて化合物を組み込むことによって容易になり得、注射によって、注入によってなどで、分子および複合体を送達する。
【０２２３】
遺伝子または遺伝子産物（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびポリペプチドをはじめとするＭＳＩ−Ｈマーカー）に接近できる方法で物質を投与した後、試験化合物がその発現または生物活性を調節するかどうかを調べることができる。調節は、質または量、例えば、増加する、促進する、増強する、アップレギュレートする、刺激する、活性化する、増幅する、増大する、誘導する、低減する、ダウンレギュレートする、減少する、和らげる、減少させるなど、どのような種類のものでもあり得る。また、調節量は、例えば、１％、５％、１０％、５０％、７５％、１倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍など、どんな値も包含し得る。遺伝子発現を調節することとは、例えば、試験化合物が、例えば、転写の量を達成するために、ＲＮＡスプライシングを達成するために、ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を達成するために、ＲＮＡまたはポリペプチド安定性を達成するために、ポリアデニル化またはその他のＲＮＡのプロセシングを達成するために、転写後または翻訳後プロセシング達成するためになど、その発現に対してある作用を有することを意味する。生物活性を調節することとは、例えば、ポリペプチドの機能活性が、化合物の不在下のその正常活性と比較して変更されること意味する。この作用としては、増加する、減少する、ブロックする、阻害する、増強するなどが挙げられる。
【０２２４】
試験化合物は、例えば、化学化合物、生体分子、例えば、ポリペプチド、脂質、核酸（例えば、ポリヌクレオチドのアンチセンス）炭水化物、抗体、リボザイム、二本鎖ＲＮＡ、アプタマーなど、どんな分子組成のものであってもよい。例えば、調節されるＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドが細胞表面分子である場合は、試験化合物はそれを特異的に認識し、例えば、ポリペプチドをインターナライズさせ、細胞の表面でのそのダウンレギュレーションを導く抗体であり得る。このような作用は、永久的でなくともよいが、ダウンレギュレーション作用を継続するには抗体の存在を必要とする場合がある。また、抗体を用いて、溶解物中またはその他の細胞を含まない形のポリペプチドの生物活性を調節できる。
【０２２５】
薬物スクリーニング
ＭＳＩ−Ｈマーカー核酸（配列番号１〜３４またはそれに相補的な配列）の発現を調節する、および／またはコードされるポリペプチド（例えば、配列番号３５〜６８）の生物活性を変更、例えば、阻害する化合物を同定するには、いくつかのｉｎ ｖｉｖｏ法を使用できる。
【０２２６】
薬物スクリーニングは、細胞のサンプルに試験化合物を添加し、作用をモニターすることによって実施する。試験化合物を与えない平行サンプルも対照としてモニターする。次いで、処理および未処理細胞を、それだけには限らないが、顕微鏡分析、生存力試験、複製能力、組織学的検査、細胞と関連している特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、細胞または細胞溶解物によって発現される酵素活性のレベルおよび細胞の、その他の細胞または化合物と相互作用する細胞の能力をはじめ、いずれかの適した表現型判定基準によって比較する。処理および未処理細胞間の差異は、試験化合物に起因する作用を示す。
【０２２７】
試験化合物の望ましい作用としては、癌関連マーカー核酸配列によって付与される、いずれかの表現型に対する作用が挙げられる。例として、ｍＲＮＡの過剰を制限し、コードされるタンパク質の産生を制限するか、タンパク質の機能的作用を制限する試験化合物が挙げられる。試験化合物の作用は、処理および未処理細胞間の結果を比較すると明らかである。
【０２２８】
したがって、本発明は、ＭＳＩ−Ｈマーカー核酸ｍＲＮＡが検出可能である細胞もしくは組織、またはＭＳＩ−Ｈマーカー核酸を含み、ＭＳＩ−Ｈマーカー核酸を発現できる培養細胞のいずれかを、物質がｍＲＮＡの産生を阻害できるかどうかを調べるために、物質に曝露することと、曝露された細胞又は組織中のｍＲＮＡのレベルを調べることとを含み、細胞株を物質に曝露した後のｍＲＮＡレベルの低下がマーカー核酸ｍＲＮＡ産生の阻害を示す、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＳＩ−Ｈマーカー核酸（配列番号１〜３４またはそれに相補的な配列）の発現を阻害する物質をスクリーニングする方法を包含する。
【０２２９】
あるいは、スクリーニング法は、ＭＳＩ−Ｈマーカー核酸の発現および／またはＭＳＩ−Ｈマーカータンパク質の産生を阻害するとみられる物質に対する、ＭＳＩ−Ｈマーカー核酸が過剰発現されているか、ポリペプチドが検出可能である細胞もしくは組織、またはＭＳＩ−Ｈマーカーを発現するか、もしくはＭＳＩ−Ｈマーカー核酸が過剰発現される培養細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングと、細胞または組織においてＭＳＩ−Ｈマーカーポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを調べることとを含む場合があり、細胞または組織を物質に曝露した後のマーカーポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルの低下が、マーカータンパク質産生またはマーカーポリペプチド発現の阻害を示す。
【０２３０】
本発明はまた、ＭＳＩ−ＨマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質が検出可能である腫瘍細胞または血清を有する哺乳類を、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の産生を阻害するとみられる物質に曝露することと、曝露された哺乳類の血清または腫瘍細胞中のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを調べることとを含む、マーカー核酸の発現を阻害する物質をｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングする方法を包含する。哺乳類を物質に曝露した後のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの低下は、マーカー核酸発現の阻害を示す。場合によっては、少なくとも１種のさらなる結腸直腸癌関連マーカーの発現に対する候補物質の作用も調べることができる。
【０２３１】
したがって、本発明は、マーカー核酸（配列番号１〜３４またはそれに相補的な配列）を発現する細胞を試験化合物とともにインキュベートすることと、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定することとを含む方法を提供する。本発明は、細胞集団または生体サンプル中のマーカー核酸の発現のレベルを定量的に調べる方法および物質が、細胞集団または生体サンプル中のＭＳＩ−Ｈマーカー核酸の発現のレベルを上昇または低下させることができるかどうかを調べる方法をさらに提供する。一実施形態では、物質が、細胞集団においてＭＳＩ−Ｈマーカー核酸の発現のレベルを上昇または低下させることができるかどうかを調べる方法は、（ａ）対照および物質処理細胞集団から細胞抽出物を調製するステップと、（ｂ）細胞抽出物からＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドを単離するステップと、（ｃ）ＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドと、前記ポリペプチドに特異的な抗体の間で形成される免疫複合体の量を定量する（例えば、平行して）ステップとを含む。本発明のＭＳＩ−Ｈマーカーポリペプチドはまた、その生物活性についてアッセイすることによって定量できる。ＭＳＩ−Ｈマーカー核酸発現の増加を誘導する物質は、処理細胞において形成される免疫複合体の量を、対照細胞において形成される免疫複合体の量と比較して増加させるその能力によって同定できる。同様に、ＭＳＩ−Ｈマーカー核酸の発現を減少させる物質は、処理細胞抽出物において形成される免疫複合体の量を、対照細胞と比較して減少させるその能力によって同定できる。
【０２３２】
ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって調べることができる。ｍＲＮＡレベルはまた、ＰＣＲを含む方法によって調べることができる。ハイスループットアッセイにおいて使用できる、ｍＲＮＡを測定するためのその他の高感度法、例えば、ＤＥＬＦＩＡエンドポイント検出および定量法を用いる方法が、例えば、ウェブ(Webb)およびハースカイネン(Hurskainen)（１９９６）ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・スクリーニング(Journal of Biomolecular Screening)１、１１９頁に記載されている。ＭＳＩ−Ｈマーカータンパク質レベルは、配列番号３５〜６８のタンパク質産物を特異的に認識する抗体を用いる免疫沈降または免疫組織化学によって調べることができる。
【０２３３】
薬物スクリーニングアッセイにおいて活性と同定される物質は、細胞増殖活性をブロックする能力について試験される候補である。これらの物質は、細胞、特に、結腸細胞の異常増殖、特に、結腸直腸癌を含む障害の治療にとって有用であろう。
【０２３４】
種々のアッセイフォーマットは、本開示内容に照らして十分であるが、それにもかかわらず、本明細書においてはっきりと記載されていないものも当業者によって理解される。例えば、アッセイは多数の異なるフォーマットで作製することができ、細胞を含まない系、例えば、精製されたタンパク質または細胞溶解物に基づくアッセイ、ならびに無傷の細胞を利用する細胞に基づくアッセイを含む。
【０２３５】
化合物および天然抽出物のライブラリーを調べる多数の薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間に調査される化合物数を最大にするにはハイスループットアッセイが望ましい。例えば、精製または半精製タンパク質を用いて、または溶解物を用いて、または血清から精製もしくは半精製されたタンパク質を用いて導くことができる、細胞を含まない系で実施される本発明のアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標的の変更の迅速な進行および比較的容易な検出を可能にするよう作製できるという点で「一次」スクリーニングとして好ましいことが多い。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系では、試験化合物の細胞毒性の作用および／またはバイオアベイラビリティの作用は通常無視でき、代わりに、アッセイは、主に、その他のタンパク質との結合親和性の変化または分子標的の酵素特性の変化に現れ得るような、分子標的に対する薬物の作用に焦点が合わされている。
実施例
【実施例１】
【０２３６】
差次的に発現される配列の同定
３４対の結腸直腸癌組織および対応正常隣接組織の十分に特性決定された、顕微解剖サンプルを、同意している患者から得た。各サンプルについて、結腸中の位置、疾患のステージおよびマイクロサテライト状態を調べた。ＲＮイージー(RNeasy)キット（キアゲン(QIAGEN)、カリフォルニア州、バレンシア）を製造業者の使用説明書にしたがって用いてサンプルから全ＲＮＡを抽出した。各精製ＲＮＡサンプルを、アガロースゲルで質について視覚的に検査し、リボグリーン(RiboGreen)（登録商標）アッセイ（モレキュラー・プローブス(Molecular Probes)、オレゴン州、ユージーン）を用いて定量した。
【０２３７】
差次的に発現される遺伝子を同定するために、特注の、高密度ナイロンメンブレンアレイで発現プロファイリングを実施した。バイオグリッド(BioGrid)ロボットアレイヤー(ジェノミック・ソリューションズ社(Genomic Solutions Inc.)、ミシガン州、アナーバー)を用いて、ナイトラン(Nytran)（登録商標）スーパーチャージ(SuperCharge)ナイロンメンブレン（シュライヒャー＆シェルバイオサイエンス社(Schleicher & Schuell BioScience, Inc.)、ニューハンプシャー州、キーン）上に配列を確認したＰＣＲ産物をスポットすることによってアレイを作製した。これらのアレイには１３，０００個を上回るクローンを含み、これは約５４００の別個の遺伝子に相当する。
【０２３８】
顕微解剖サンプルから単離されるＲＮＡの制限された量のために、各サンプルから１ミクログラムの全ＲＮＡを、ＲＮＡサンプルの最初の発現量を維持する、ＳＭＡＲＴ(商標)技術（ＢＤ バイオサイエンシズ(BD Biosciences)／クローンテック(Clontech)、カリフォルニア州、パロアルト）を用いて増幅した。増幅したｃＤＮＡから複合体^３３Ｐ標識プローブを調製した。対応腫瘍および正常組織から得たプローブを、同一ナイロンメンブレンとハイブリダイズさせた。ストーム(Storm)（商標）ホスホルイメージャー(Phosphorimager)（アマシャム・バイオサイエンシズ(Amersham Biosciences)、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）によってシグナルを捕らえ、アレイビジョン(ArrayVision)（商標）（イメージング・リサーチ社(Imaging Research Inc.)、カナダ、オンタリオ州、セントキャサリンズ(St. Catharines)）およびジーンスプリング(GeneSpring)ソフトウェア（シリコン・ジェネティクス(Silicon Genetics)、カリフォルニア州、レッドウッドシティー）によって分析した。
【０２３９】
発現データを、ジーンスプリング(GeneSpring)デフォルトパラメータにしたがって標準化し、スケールした。各アレイについて、各スポットのシグナルを個々のアレイ上の全スポットの平均シグナルで除した。次いで、各遺伝子のシグナルを、すべての測定から得たその遺伝子の中央値シグナルで除した。最後に、各癌サンプルから得たシグナルを、対応正常サンプルから得たシグナルで除し、各腫瘍正常対の比率データを作成した。このように表されるデータは、アレイ上の各遺伝子の過剰発現（または過少発現）倍数を示す。１．０よりも大きい値は、腫瘍組織において、正常組織と比較して過剰発現されている遺伝子を表すのに対し、１．０未満の値は過少発現される遺伝子を示した。
【０２４０】
ＭＳＩ−Ｈ腫瘍において過剰発現された遺伝子を同定するために、一連のフィルターを用いてデータセットを減少させた。全標準化データセットで開始し、パラメトリックおよびノンパラメトリック試験の双方を用いて、ＭＳＩ−Ｈ腫瘍またはＭＳＳ腫瘍のいずれかと統計的に関連している遺伝子を規定した。次いで、これら２種のセットの各々について、フィルターを用いて、ＭＳＩ−Ｈ腫瘍における最小発現レベルの高閾値を設定した。具体的には、このフィルターにより、１５腫瘍／正常対のうちいずれか１つにおいて、少なくとも７倍過剰発現されているＭＳＩ−Ｈ腫瘍中の遺伝子を選択した。最後に、ベン(Venn)ダイアグラムを利用して、これら２種の同様に導いたセットとは異なる遺伝子を調べた。この分析により、ＭＳＩ−Ｈ腫瘍において過剰発現されているが、ＭＳＳ腫瘍では過剰発現されていない３４種の遺伝子が得られた。これらの遺伝子は表１に同定されている。
【０２４１】
差次的に発現される遺伝子の一例として、図１ではＲＥＧ４が示されている。このグラフでは、１５種のＭＳＩ−Ｈ腫瘍がｘ軸の左側に、１９種のＭＳＳ腫瘍が右側に集められている。ｙ軸は、対応腫瘍／正常対各々におけるＲＥＧ４の過剰発現倍率を表す。ＲＥＧ４は、１５種のＭＳＩ−Ｈ腫瘍のうち７種において２倍より多く過剰発現されていたが、１９種のＭＳＳ腫瘍のいずれにおいても有意には過剰発現されていなかった。ＲＥＧ４の平均過剰発現倍率は、ＭＳＩ−Ｈ腫瘍では５．４であり、ＭＳＳ腫瘍では１．０であった。
【０２４２】
その他の実施形態
その他の実施形態は当業者には明らかであろう。前記の詳細な説明は明確にするためだけに提供され、単に例示的なものに過ぎないことは理解されなくてはならない。本発明の趣旨および範囲は上記の実施例に制限されず、特許請求の範囲によって包含される。
【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１】ＭＳＩ−Ｈマーカー遺伝子ＲＥＧ４の差次的発現プロフィールを示す図である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体においてマイクロサテライト不安定性を検出する方法であって、
前記個体において配列番号１〜３４のうち１種以上の配列の発現を測定し、マイクロサテライト不安定性を有していないことがわかっている個体における前記配列の発現と比較して前記配列が少なくとも２倍過剰発現される場合に、マイクロサテライト不安定性が検出されることを含む方法。
【請求項２】
測定するステップが
（ａ）前記個体から結腸直腸組織サンプルを得るステップと、
（ｂ）前記サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜３４のうち１種以上の前記配列とハイブリダイズできる核酸プローブと接触させるステップと、
（ｃ）前記核酸プローブの、配列番号１〜３４のうち１種以上の前記配列とのハイブリダイゼーションを検出するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸プローブが検出可能なように標識されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
マイクロサテライト不安定性を有する結腸組織を同定する方法であって、
（ａ）個体から結腸組織サンプル得るステップと、
（ｂ）配列番号１〜３４の配列のうち１種以上の発現を検出し、前記の配列番号１〜３４の配列のうち１種以上の発現が、マイクロサテライト不安定性を有していないことがわかっている結腸組織サンプルにおける同一配列の発現よりも少なくとも２倍大きい場合に、マイクロサテライト不安定性を有する結腸組織が検出されるステップと
を含む方法。
【請求項６】
前記の検出するステップが、
（ａ）前記結腸組織サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記の配列番号１〜３４の配列のうち１種以上とハイブリダイズできる核酸プローブと接触させるステップと、
（ｂ）前記核酸プローブの、前記の１種以上の配列とのハイブリダイゼーションを検出し、ハイブリダイゼーションの検出が前記の配列番号１〜３４の配列のうち1種以上の発現を示すステップと
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸プローブが検出可能なように標識されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記個体がヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記結腸組織サンプルが腫瘍サンプルである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍が悪性腫瘍である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
被験体において、癌またはその前癌性状態の発症、進行または退縮をモニターする方法であって、
（ａ）第1の時点で被験体の生体サンプルにおいて、配列番号１〜３４からなる群から選択される１種以上の核酸配列を含む１種以上の核酸配列の発現を検出するステップと、
（ｂ）その後の時点でステップ（ａ）を反復するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）において検出された発現レベルを比較し、発現レベルの変化が被験体における癌またはその前癌性状態の進行を示すステップと
を含む方法。
【請求項１２】
発現レベルの変化が上昇または低下のいずれかである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記上昇または低下が少なくとも２倍の上昇または低下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
被験体において癌またはその前癌性状態の予後を調べる方法であって、
（ａ）被験体の生体サンプルにおいて、配列番号１〜３４からなる群から選択される１種以上の核酸配列を含む１種以上の核酸配列の発現レベルを検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出された発現レベルを、前記核酸配列の参照発現レベルと比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における比較に基づいて被験体の予後を評価するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
参照発現レベルが、癌のないサンプルまたは正常サンプルにおける前記核酸配列の発現レベルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
参照発現レベルが、攻撃的な形態に進行しないことがわかっている癌サンプルにおける前記核酸配列の発現レベルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
参照発現レベルが、ＭＳＳ結腸腫瘍における前記核酸配列の発現レベルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
被験体において癌を阻害する試験化合物の有効性を調べる方法であって、ａ）被験体から得た、試験化合物に曝露された第1の生体サンプルにおける１種以上の核酸配列の発現レベルを、ｂ）被験体から得た、試験化合物に曝露されていない第２の生体サンプルにおける前記核酸配列の発現レベルと比較するステップを含み、前記核酸配列が配列番号１〜３４からなる群から選択される１種以上の核酸配列を含み、前記核酸配列の発現レベルの少なくとも２倍の変化が、試験化合物が被験体において癌を阻害するために有効であるという指標である方法。
【請求項１９】
発現レベルの変化が上昇または低下のいずれかである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
被験体において癌を阻害するための療法の有効性を調べる方法であって、ａ）被験体に療法の少なくとも一部を提供する前に被験体から得た第1の生体サンプルにおける１種以上の核酸配列の発現レベルを、ｂ）療法の少なくとも一部の提供の後に被験体から得た第２の生体サンプルにおける前記核酸配列の発現レベルと比較するステップを含み、前記核酸配列が配列番号１〜３４からなる群から選択される１種以上の核酸配列を含み、前記核酸配列の発現レベルの少なくとも２倍の変化が、療法が被験体において癌を阻害するために有効であるという指標である方法。
【請求項２１】
発現レベルの変化が上昇または低下のいずれかである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
被験体において癌を阻害する組成物を選択する方法であって、
（ａ）被験体から癌細胞を含む第1の生体サンプルを得るステップと、
（ｂ）複数の試験組成物の存在下でサンプルのアリコートを別個に曝露するステップと、
（ｃ）（ｂ）から得たアリコートの各々における１種以上の核酸配列の発現レベルを、（ａ）によって作製したサンプルにおける発現レベルと比較するステップであって、前記核酸配列が配列番号１〜３４からなる群から選択される１種以上の核酸配列を含むステップと、
（ｄ）試験組成物を含む一アリコートにおいて前記核酸配列の発現レベルの少なくとも２倍の変化を誘導する試験組成物の1種を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
発現レベルの変化が上昇または低下のいずれかである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
被験体において癌の発症、進行または退縮をモニターする方法であって、
（ａ）第1の時点で、第1の生体サンプルを、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドと特異的に結合する１種以上のポリペプチドリガンドと接触させ、ポリペプチドリガンドとポリペプチドの間の特異的結合を調べるステップと、
（ｂ）その後の時点で、第２の生体サンプルを、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドと特異的に結合する前記ポリペプチドリガンドと接触させ、ポリペプチドリガンドとポリペプチドの間の特異的結合を調べるステップと、
（ｃ）第1の生体サンプルにおける特異的結合と、第２の生体サンプルにおける特異的結合を比較するステップであって、特異的な結合の大幅な変化が癌の発症、進行または退縮の指標であるステップと
を含む方法。
【請求項２５】
被験体において、癌またはその前癌性状態の予後を調べる方法であって、
（ａ）癌を有する被験体から得た生体サンプルを、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む１種以上のポリペプチドと特異的に結合する１種以上のポリペプチドリガンドと接触させるステップと、
（ｂ）特異的結合を調べるステップと、
（ｃ）サンプルにおけるポリペプチドリガンドとポリペプチドの間の特異的結合を、癌のないサンプルにおけるか、または攻撃的な形態に進行しないことがわかっている癌サンプルにおけるポリペプチドリガンドとポリペプチドの間の特異的結合と比較するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）における比較に基づいて、被験体の予後を評価するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
被験体において癌を阻害する試験化合物の有効性を調べる方法であって、ａ）被験体から得た、試験化合物に曝露されていない第1の生体サンプルにおける、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドと特異的に結合する１種以上のポリペプチドリガンドと、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドの間の結合を、ｂ）被験体から得た、試験化合物に曝露された第２の生体サンプルにおける、前記ポリペプチドリガンドと前記ポリペプチドの特異的結合と比較するステップであって、特異的結合の大幅な変化が、試験化合物が被験体において癌を阻害するために有効であるという指標であるステップを含む方法。
【請求項２７】
被験体において、癌を阻害する療法の有効性を調べる方法であって、ａ）治療前に被験体から得た第1の生体サンプルにおける、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドと特異的に結合する１種以上のポリペプチドリガンドと、配列番号３５〜６８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む1種以上のポリペプチドの間の結合を、ｂ）治療後に被験体から得た第２の生体サンプルにおける、前記ポリペプチドリガンドと前記ポリペプチドの特異的結合と比較するステップであって、特異的結合の大幅な変化が、試験化合物が被験体において癌を阻害するために有効であるという指標であるステップを含む方法。

【図１】

【公表番号】特表２００８−５０７９７６（Ｐ２００８−５０７９７６Ａ）
【公表日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２３７７０（Ｐ２００７−５２３７７０）
【出願日】平成１７年７月２７日（２００５．７．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２６６４７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１５０４７
【国際公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【出願人】（５０３１０６１１１）バイエル・ヘルスケア・エルエルシー (154)
【出願人】（５０１０８３１１５）メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ (27)
【Ｆターム（参考）】