マイクロチャンバアレイを用いた蛍光偏光解消法による標的物質測定方法
【課題】蛍光偏光解消法による試料溶液中の微量標的物質の濃度を測定する方法を提供する。
【解決手段】本発明の標的物質測定方法は、試料溶液と、試料溶液中に存在が疑われる標的物質に結合可能な蛍光標識物質を混合する工程と、得られた混合液を、マイクロチャンバアレイの各マイクロチャンバに分注する工程と、蛍光偏光解消法により、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出することにより、生体試料中の標的物質の濃度を測定する工程とを備える。
【解決手段】本発明の標的物質測定方法は、試料溶液と、試料溶液中に存在が疑われる標的物質に結合可能な蛍光標識物質を混合する工程と、得られた混合液を、マイクロチャンバアレイの各マイクロチャンバに分注する工程と、蛍光偏光解消法により、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出することにより、生体試料中の標的物質の濃度を測定する工程とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光偏光解消法による試料溶液中の標的物質の濃度を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の検体について測定を行なう生理活性物質の探索におけるハイスループットスクリーニングあるいは体外診断システムにおいて、効率よく試験を実施するためには、簡便性、感度、安定性に優れた検出系を用いる必要がある。これまでこれらの検出系としては大きく分けて紫外可視吸光法、化学発光・生物発光法、放射性同位元素（ＲＩ）を用いる検出系が用いられてきた。
【０００３】
このうち蛍光法は高選択性・高感度が期待できる検出系であり、紫外可視吸光法とともによく用いられている。また、蛍光法はＲＩを用いる方法に比べ測定時間が短くてすむだけでなく、管理区域内での操作の必要がない、放射性廃棄物の問題がないという点においても優れており、ＲＩを用いた方法からの転換も行なわれてきている。
【０００４】
しかし、化合物ライブラリ−あるいは血液成分を含む臨床検体などの多数の検体について試験を行なう場合、蛍光を発する検体も含まれていることがあり、その夾雑蛍光により測定がしばしば妨害されるという問題点がある。
【０００５】
蛍光偏光解消法は、１９２６年にＰｅｒｒｉｎらによって確立された大きな分子ほど回転ブラウン運動の回転速度が遅くなることを利用した方法である。蛍光性分子により標識された小さな分子は、回転速度が速いため蛍光の偏光が解消され、蛍光偏光度Ｐは小さい値を示す。一方、大きな分子の場合は回転速度が遅いため蛍光の偏光は解消せず、Ｐは大きな値を示す（非特許文献１）。つまり、標的物質に結合可能な蛍光標識物質と標的物質が結合するとＰは増大することになる。このＰの変化を測定することで、該標的物質の試料溶液中の濃度を測定することができる。
【０００６】
尚、蛍光偏光度は、以下の式によって計算される。
Ｐ＝（ＩＨ−ＩＬ）／（ＩＨ＋ＩＬ）
（式中、ＩＨは、励起光の偏光面に平行な平面で偏光された発光強度であり、ＩＬは励起光の偏光面に垂直な平面で偏光された発光強度である。）
【０００７】
また、蛍光偏光解消法の指標として蛍光異方性ｒも用いられる。この場合も蛍光偏光度Ｐと同様に、蛍光異方性ｒの値の変化を測定することで、該標的物質の試料溶液中の濃度を測定することができる。蛍光偏光度Ｐと蛍光異方性ｒとの関係は以下の式で表すことができる。
ｒ＝２Ｐ/（３−Ｐ）
【０００８】
蛍光偏光解消法による標的物質の試料溶液中の濃度を測定する具体例としては、蛍光偏光免疫測定法（FPIA法）が挙げられる。この方法は、特に血中薬剤濃度のような比較的分子量の小さい物質の測定に用いられ、抗原-抗体反応と、蛍光偏光度との関係から検量線を用いて標的物質の濃度を求めるものである。蛍光偏光免疫測定法は既に確立された技術である（特許文献１）。
【０００９】
蛍光偏光解消法では、標的物質が結合した結合型の蛍光標識物質と、標的物質が結合していない遊離型の蛍光標識物質を分離（Ｂ／Ｆ分離）することなく、ホモジニアスアッセイ系で該標的物質の試料溶液中の濃度を測定することができる。しかしながら、試料溶液中に標的物質が極めて少ない場合、多量に存在する遊離型の蛍光標識物質の影響が強く、結合型の蛍光標識物質の正確な検出が困難になる等の問題があった。従って、蛍光偏光解消法では、極めて微量な標的物質の検出は難しく、より高感度に微量標的物質を測定する蛍光偏光解消法の開発が望まれていた。
【００１０】
また、昨今、ゲノミクスやプロテオミクスで数多くの遺伝子やタンパク質の機能を解析するにあたり、微量なサンプルを用い、高速な解析を行うことが必要になってきている。このようなニ−ズに対応するために、微量かつ高速な解析用のＤＮＡチップやプロテオチップなどの開発が進められている。そして、微細加工技術の進歩から極微小なチャンバ−（マイクロチャンバ）を作製することが可能になった。更に、ＣＣＤカメラおよびコンピューター処理を利用して、定性的、半定量的に解析することも可能になっている。
【００１１】
マイクロチャンバアレイは、プレ−ト上に複数のマイクロチャンバを備えたものであり、既に酵素活性を有するタンパク質、微生物のスクリ−ニング及び一分子酵素活性検出等の利用が報告されている（特許文献２、特許文献３）。
【非特許文献１】Ｐｅｒｒｉｎ、 Ｆ. Ｊ. Ｐｈｙｓ. Ｒａｄ. １、 ３９０−４０１、 １９２６
【特許文献１】特開昭５７−０５８６９５号公報
【特許文献２】特開２００６−０６１０２３号公報
【特許文献３】特許第３７２７０２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、蛍光偏光解消法による試料溶液中の微量標的物質の濃度を測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）試料溶液と、試料溶液中に存在が疑われる標的物質に結合可能な蛍光標識物質を混合する工程と、得られた混合液を、マイクロチャンバアレイの各マイクロチャンバに分注する工程と、蛍光偏光解消法により、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出することにより、生体試料中の標的物質の濃度を測定する工程と、を備えた標的物質測定方法；
（２）前記試料溶液が、生体試料である（１）に記載の標的物質測定方法；
（３）前記標的物質が、タンパク質又はＤＮＡである、（１）又は（２）に記載の標的物質測定方法；
（４）前記蛍光標識物質が、蛍光標識抗体、蛍光標識抗原又は蛍光標識プロ−ブである、（１）〜（３）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（５）前記蛍光標識物質の蛍光発色団が有機系蛍光発色団からなる、（１）〜（４）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（６）前記蛍光標識物質の蛍光発色団が６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンである（１）〜（５）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（７）前記マイクロチャンバの開口の直径が、０．１〜４０μｍである、（１）〜（６）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（８）前記マイクロチャンバの深さが、１００〜２０００ｎｍである、（１）〜（７）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（９）前記マイクロチャンバの容積が０．００１〜２５０００ｆＬである、（１）〜（８）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（１０）前記マイクロチャンバアレイが有するマイクロチャンバの数が、１ｃｍ２あたり１０〜１０１２個である（１）〜（９）のいずれか１に記載の標的物質測定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、遊離型の蛍光標識物質等の影響を受けない、蛍光偏光解消法による高感度な試料溶液中の微量標的物質の濃度を測定する、標的物質測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の実施形態における、試料溶液としては、後述するマイクロチャンバに分注可能なものであれば、特に制限されるものではないが、生体試料が好ましい。生体試料としては、特に体液が好ましく、例えば、血液、血清、血漿、尿、汗、組織液あるいは組織の可溶化液等が挙げられる。
【００１６】
本実施形態において、標的物質としては、溶液中に存在し後述する蛍光標識物質と結合するものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類及び細胞等が挙げられ、特にタンパク質及びＤＮＡが好ましい。
【００１７】
本実施形態において、蛍光標識物質としては、標的物質との特異的な結合能を有し、蛍光偏光解消法による検出が可能なものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、蛍光標識抗体、蛍光標識抗原、蛍光標識タンパク、蛍光標識ペプチド及び蛍光標識DNAプロ−ブ等が挙げられる。
【００１８】
また、蛍光標識物質の蛍光発色団としては、蛍光偏光解消法を用いて標識蛍光標識物質が結合した標的物質と遊離の蛍光標識物質を検出できる化合物であれば、特に制限されるものではないが、有機系蛍光発色団が好ましく、例えば、ロ−ダミン、ピレン、ジアルキルアミノナフタレン及びシアニンの骨格を有する化合物が挙げられる。また、特にピレン骨格を有する化合物が好ましく、より具体的には６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンが挙げられる。
【００１９】
尚、６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンは公知の蛍光発色団であり、その合成方法等は特に制限されるものではなく、公知の化学合成法を用いて合成することができる。
【００２０】
ここで、使用する蛍光発色団の骨格を選択する際は、標識蛍光標識物質及び標的物質から分子量変化を考慮して、適宜、励起波長、蛍光波長、ストークスシフト、及び蛍光寿命等の最適化を行うことができる。この際、励起波長と蛍光波長との波長差である、ストークスシフトは、５ｎｍ以上であることが好ましく、特に２０ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光発色団の蛍光寿命（蛍光緩和時間）は、１ナノ秒〜１０００ナノ秒の範囲が好ましく、特に５０ナノ秒〜５００ナノ秒の範囲が好ましい。
【００２１】
より具体的には、分子量変化が５０００〜５万、即ち、蛍光標識物質が結合した標的物質の分子量が数千から数万の場合の場合、１ナノ秒〜１５ナノ秒の蛍光寿命を有する蛍光発色団が好ましく、このような蛍光発色団の例としては、シアニン、ローダミン等が挙げられる。分子量変化が５万〜５０万程度の場合、即ち、蛍光標識物質が結合した標的物質の分子量が数万から数十万の場合、５０ナノ秒〜５００ナノ秒の蛍光寿命を有する蛍光発色団が好ましい。このような蛍光発色団の例としては、ジアルキルアミノナフタレン、ピレン誘導体等が挙げられ、特に６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンが好ましい。分子量変化が約５０万から約５００万程度の場合、即ち、蛍光標識物質が結合した標的物質の分子量が数十万から数百万の場合、１００ナノ秒〜約１０００ナノ秒の蛍光寿命を有する蛍光発色団が好ましい。このような蛍光発色団の例として、ピレン誘導体、金属錯体等が挙げられる。
【００２２】
本実施形態における、マイクロチャンバアレイとしては、標識蛍光標識物質が結合した標的物質を一つずつ分注できるマイクロチャンバを複数有するものであれば、特に制限されるものではないが、１ｃｍ２のマイクロチャンバアレイにマイクロチャンバを１０〜１０１２個、特に１００〜１０８個有するものが好ましい。
【００２３】
ここで、マイクロチャンバとしては、標識蛍光標識物質が結合した標的物質の大きさによって、所望の開口、深さ及び容積を設定すればよく、特に制限されるものではないが、例えば、標的物質がタンパク質やＤＮＡの場合、マイクロチャンバの開口の直径は０．１〜４０μｍ、深さは１００〜２０００ｎｍ、容積は０．００１〜２５０００ｆＬのものが好ましく、特に、容積が１０００ｆＬ以下のものが好ましい。
【００２４】
また、マイクロチャンバアレイの作製方法は、公知の作製方法を使用すれば良く、特に制限されるものではないが、例えば、通常のフォトリソグラフィ法を用いて作製することができる。
【００２５】
フォトリソグラフィ法によるマイクロチャンバアレイの作製方法の一実施形態を、図１に模式的に示した。ガラス基板１上に金膜２を蒸着し、金膜２上をフォトレジストにてコーティングしフォトレジストコート３を形成し、所定のパターンのクロム膜を有するパターンガラス４をフォトレジストコート３に置き、紫外線５を照射する（図１Ａ）。次いで、紫外線５が照射されたフォトレジストコート３上のフォトレジストを除去し、フォトレジスト膜６が金膜２に残ったもの、即ち、フォトレジストをパターニングしたものを鑄型７とする（図１Ｂ）。フォトレジスト膜６が残留する部分は、マイクロチャンバ８に対応する鑄型部分である。従って、フォトレジスト膜６の寸法は、形成されるべきマイクロチャンバ８と実質的に同一の寸法を有するべきである。
【００２６】
次に、ＰＤＭＳと硬化剤を所定の比率で混合させた液状ＰＤＭＳ９を調製した後、その液状ＰＤＭＳ９を鑄型７上に適用し、その状態で液状ＰＤＭＳ９を硬化させる（図１Ｃ）。この過程において、硬化を促進させるために、液状ＰＤＭＳ９を担持した鑄型７は、約８０℃で約６０分間加熱することが好ましい。かくして、液状ＰＤＭＳ９の硬化が完了し、ＰＭＤＳからなるマイクロチャンバアレイ１０が鑄型７から剥がされる（図１Ｄ）。なお、この実施形態においては、マイクロチャンバアレイ１０は、金膜２に載置された状態で硬化したＰＤＭＳであり、何等化学的な処理を施すことなく、容易に剥離することができる。
【００２７】
図１Ｅは、マイクロチャンバアレイ１０をマイクロチャンバ８の開口方向から見た図である。本実施形態のマイクロチャンバ８の形状は円柱であるが、その他の形状であってもよい。また、本実施形態では、紫外線により感光した部分が除去されるポジ型フォトレジストを用いて鋳型を作製したが、感光した部分が残るネガ型フォトレジストを用いても良い。
【００２８】
上記の方法でマイクロチャンバアレイ１０を作製した場合、例えば、試料溶液１２の液滴を保持したスライドグラス１１上に、マイクロチャンバアレイ１０を載置することにより、容易に、各マイクロチャンバ８に試料溶液１２を分注することができる（図２）。このように、マイクロチャンバアレイ１０をスライドグラス１１に載置するだけで、試料溶液１２を分注することができ、使用者が特にマイクロチャンバアレイ１０の使用に熟練を要することはない（図２Ａ）。また、該マイクロチャンバアレイを用いることで、分注される試料溶液１２の体積は、マイクロチャンバ８により定められ、有機溶媒中に液滴を噴霧し懸架する場合に比べ、液滴のばらつきは、実質的に小さく若しくは無くなる（図２Ｂ）。
【００２９】
また、本実施形態では、マイクロチャンバアレイ１０とスライドグラス１１を載置することにより、容器部１３を構成しているが（図３Ａ）、例えば、スライドグラス１４と貫通孔を有するＰＤＭＳ１５を貼り合わせることにより作製したマイクロチャンバアレイを、スライドグラス１１に載置することにより、容器部１３を構成するようになっていてよい（図３Ｂ）。
【００３０】
ここで、容器部１３の少なくとも一部は、水に対し実質的に不透過性を有する高分子樹脂から構成されているものが好ましく、また、高分子樹脂が空気に対して透過性を有するものが特に好ましい。これにより、封入された液滴の漏洩がなく、更に、空気透過性を有するため、空気が容器部１３外へ透過して消散され、容器部１３内に空気が残留することを確実に回避することができる。
【００３１】
本実施形態において、マイクロチャンバアレイの材料としては、フォトリソグラフィ法により形成された鑄型を用いることで、マイクロチャンバアレイを形成できるものであれば、特に制限されるものではないが、水に対し実質的に不透過性を有する高分子樹脂から構成されているものが好ましく、また、高分子樹脂が空気に対して透過性を有するものが特に好ましい。例えば、ポリジメチルシロキサン 、シリコン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート及びポリカーボネートが挙げられ、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。また、特に容器部の少なくとも一部又は第二の部材は、ＰＤＭＳにより形成されていることが好ましい。勿論、マイクロチャンバアレイ全体がＰＤＭＳにより形成されていてもよい。
【００３２】
本実施形態において、蛍光偏光解消法により、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出する方法としては、マイクロチャンバアレイにおける蛍光偏光度を測定し、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを特定できるものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、偏光フィルターを組み込んだ蛍光顕微鏡、偏光フィルターを組み込んだＣＣＤカメラと励起光源を合わせたシステム、偏光フィルターを組み込んだ蛍光光度計などが用いられる。
【００３３】
より具体的には、標的物質を含む試料と蛍光標識物質とを溶液中で混合した後、マイクロチャンバアレイに混合液を分注し、各マイクロチャンバにおける蛍光標識物質の蛍光偏光度を測定することで、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出する。必要であれば、標的物質の不在下での、蛍光標識物質の蛍光偏光度もまた測定する。測定は、穏和な温度（１０℃〜４０℃）で、一定温度で行うことが好ましい。
【００３４】
蛍光偏光度の測定は、標的物質と蛍光標識物質との混合から所定の時間後に測定してもよく、あるいは、単位時間あたりの蛍光偏光度変化を測定してもよい。標的物質と蛍光標識物質との結合が完全に終了した時点で測定することにより、より再現性のある測定値が得られる。
【００３５】
このように、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出し、検出されたマイクロチャンバの数とマイクロチャンバアレイが有するマイクロチャンバの数の比較等により、容易に試料溶液中に含まれる標的物質の濃度を測定することができる。
【００３６】
例えば、１ｆＬのマイクロチャンバを１０８個有するマイクロチャンバアレイを使用した場合、０．１μＬの試料溶液がマイクロチャンバアレイに分注されることになる。ここで、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバの数が６個であった場合、０．１μＬ中に標的物質が６個含まれていたことになるから、試料溶液中の標的物質の濃度は１０−１６Ｍとなる。
【００３７】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
＜マイクロチャンバアレイの作製＞
ガラス基板上に金の薄膜を蒸着し、金の薄膜上をフォトレジストにてコ−ティングし、直径１μｍ、高さ１μｍの円柱を１μｍ間隔で、縦横に１００００個、総計１０８個有するようにクロム膜を形成するガラスをフォトレジストコ−ト上に載置し、紫外線を照射する。次いで、紫外線が照射されたフォトレジストを除去し、フォトレジスト膜が金膜に残ったもの、即ち、フォトレジストをパタ−ニングしたものを鑄型として使用した。
【００３９】
ＰＤＭＳと硬化剤を重量比１０：１で混合させた液状ＰＤＭＳを調製し、その液状ＰＤＭＳを鑄型に適用し、その状態でＰＭＤＳを８０℃で６０分間硬化させる。ＰＭＤＳの硬化が完了した後、ＰＭＤＳを鑄型から剥がしマイクロチャンバアレイを作製した。
【実施例２】
【００４０】
＜６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンの合成＞
６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１は反応式Ｉに従って合成した。但し、反応式Ｉ中においてβ−シクロデキストリンに導入された置換基の位置は不定であり、理論上、位置混合物が生じる場合は位置異性体混合物として取り扱った。
【００４１】
【化１】
反応式Ｉ
【００４２】
（１）６Ａ、６Ｘ−ジメシチル−β−シクロデキストリン２の合成
反応式Ｉに従い、β−シクロデキストリンから６Ａ、６Ｘ−ジメシチル−β−シクロデキストリン２を合成した。すなわち、１００ｍＬのピリジンにβ−シクロデキストリン（５.６７５g、 ５ｍｍｏｌ）を撹拌しながら溶解し、これに室温にて塩化メシチレンスルホニル （１.０９４g、 ５ｍｍｏｌ）を撹拌しながら加え、２時間撹拌した。さらに塩化メシチレンスルホニル （１.０９４g、 ５ｍｍｏｌ）を追加し、２時間撹拌したのち塩化メシチレンスルホニル（１.０９４g、 ５ｍｍｏｌ）を追加し、３時間撹拌した。その後、さらに塩化メシチレンスルホニル（１.０９４g、 ５ｍｍｏｌ）を追加し、２時間撹拌した。２０ｍｍｏｌ（３６０μＬ）の水を加えてクエンチした後、ピリジンを留去、約５０ｍＬに濃縮し、アセトンにて結晶化した。粗結晶を温水（１００ｍＬ）に溶解し、熱いままＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマト（６０ｍＬ）にアプライした。温水４００ｍＬで洗浄後（β−シクロデキストリンが溶出）、温３０％ メタノ−ル（４００ｍＬ）および常温の４０％メタノ−ル（２００ｍＬ）で６−Ｏ−メシチル−β−シクロデキストリン（２.７７g、 ２.１ｍｍｏｌ、 ４２％）を溶出した後、６Ａ、６Ｘ−Ｏ−ジメシチル−β−シクロデキストリン ２ （位置異性体混合物）を得た。
収量：１．１５ｇ（１５％）
Ｃ６０Ｈ９０Ｏ３９Ｓ２ （ＭＷ; １４９９.５） ＬＣ−ＥＳＩ/ＭＳ/ＭＳ：ｍ/ｚ １５２１（Ｍ＋ＮＡ）
【００４３】
（２）６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−メシチル−β−シクロデキストリン３の合成
続いて反応式Ｉに従い６Ａ、６Ｘ−ジメシチル−β−シクロデキストリン２から６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−メシチル−β−シクロデキストリン３を合成した。すなわち、１５ｍＬの乾燥させたジメチルスルホキシドに６Ａ、６Ｘ−Ｏ−ジメシチル−β−シクロデキストリン ２ （１.２５ｇ、 ０.８３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら溶解した。室温にて撹拌しながらカリウムｔ−ブトキシド（９３.６ｍｇ、 ０.８３ｍｍｏｌ）及び１−ピレンブチリック酸（２４０ｍｇ、 ０.８３ｍｍｏｌ）を溶解したジメチルスルホキシド溶液（５ｍＬ）を添加した。その後、８０℃にて３時間加熱し反応後、１Ｌのアセトンを加え結晶化した。アセトンで洗浄後、粗結晶を５０ｍＬの水に溶解してＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマト（２０ｍＬ）にアプライし、１Ｌの水、１Ｌの４０％ メタノ−ル、１Ｌの６０％ メタノ−ルで洗浄後、１Ｌの８０％メタノ−ルで溶出し、６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−メシチル−β−シクロデキストリン ３ （位置異性体混合物）を得た。
収量：４１０ｍｇ（３１％）
Ｃ７１Ｈ４９Ｏ３８Ｓ （ＭＷ; １５８７.５） ＬＣ−ＥＳＩ/ＭＳ/ＭＳ：ｍ/z １６０９（Ｍ＋ＮＡ）
【００４４】
（３）６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４の合成
続いて反応式Ｉに従い６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−メシチル−β−シクロデキストリン３から６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４を合成した。すなわち、先に得た ６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−メシチル−β−シクロデキストリン３ （８０ｍｇ、 ０.０５ｍｍｏｌ）を１ｍＬの乾燥させたジメチルスルホキシドに撹拌しながら溶解し、これにコハク酸（１１８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を続けて添加し、溶解した。室温にて撹拌しながらカリウムｔ−ブトキシド（１１２ｍｇ、 １ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（１ｍＬ）をゆっくり添加した。その後、８０℃にて４８時間撹拌した。反応後、反応液をろ過後、反応液に５０ｍＬのアセトンを加え、結晶化した。アセトンにて洗浄後、粗結晶を２０ｍＬの水に溶解してＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマトグラフィ−（２０ｍＬ）にアプライした。５００ｍＬの水、５００ｍＬの４０％ メタノ−ルで洗浄後、５００ｍＬの６０％ メタノ−ル及び５００ｍＬの８０％ メタノ−ルにて溶出したが、原料の３と反応生成物が分離せず溶出したため、これらの溶出液を濃縮し、炭酸ナトリウムにより反応生成物である６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４をナトリウム塩とした後、ＨＰＬＣにより分離・精製を行なった。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
カラム：コスモシル ５Ｃ１８−ＡＲ−３００ ４.６ｍｍ Ｘ １５０ｍｍ、流速：１ｍＬ/ｍｉｎ、検出波長：２５０−５００ｎｍ、
溶離液：３０−１００％ メタノ−ル
グラジエント：
【００４５】
【表１】
【００４６】
上記条件で１１〜１３ｍｉｎのピ−クを分取し、留去し６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４のナトリウム塩（１６ｍｇ）を得た。これに１Ｎ塩酸を加え、４をカルボン酸体とし白濁した溶液を一旦、留去した。結晶をメタノ−ルに再溶解後、シリカゲル薄層クロマトグラフィ−（イソプロピルアルコ−ル:酢酸エチル:水=７:７:５）により展開し、Ｒｆ０.６のバンドから６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４ （位置異性体混合物）を得た。
収量：１５ｍｇ（２０％）
Ｃ６６Ｈ８８Ｏ３９ （ＭＷ; １５０５.４） ＬＣ−ＥＳＩ/ＭＳ/ＭＳ：ｍ/z １５４９（Ｍ−Ｈ＋２ＮＡ）
【００４７】
（４）６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１の合成
続いて反応式Ｉに従い６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４から６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１を合成した。すなわち、反応容器に ６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４ （２.２５ｍｇ、 １.５μｍｏｌ）を量り取り、撹拌しながらＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、 １７.３ｍｇ、 １５０μｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（０.５ｍＬ）を添加した。これにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、 ３１.０ｍｇ、 １５０μｍｏｌ） のジメチルホルムアミド溶液（０.５ｍＬ）を撹拌しながら添加した。室温にて撹拌し反応開始１.５時間後からＨＰＬＣにて生成物ピ−クの分取・精製を行なった。位置異性体混合物であることに由来する分離不十分な３本の生成物のピ−クが認められたが、いずれもマススペクトルにより６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１（位置異性体）であることを確認したためこれら３本の画分（１５から１７ｍｉｎ）を合わせて分取した（ ＨＰＬＣ条件は６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４の精製時と同じ）。移動相を留去後、６.５ｍｇの白色結晶を得た。マススペクトルにて確認したところ６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１以外にＤＣＣの分解物であるジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）が含まれることが示されたが、これはUV領域において吸収を持たず、また、６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１が少量であること、ＤＣUと６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１との分離が困難であること、ＤＣUがこの後の６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１とタンパクとの反応を妨害しないことが予想されるため、この白色結晶をそのままタンパクの標識に用いた。
Ｃ７０Ｈ９１Ｏ４１Ｎ （ＭＷ; １６０２.４５） ＬＣ−ＥＳＩ/ＭＳ/ＭＳ：ｍ/ｚ １６２４（Ｍ＋ＮＡ）
【実施例３】
【００４８】
＜蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を用いた試料溶液中のウサギＩｇＧの濃度測定＞
１）蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体の調製
６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンを用いて抗ウサギＩｇＧヤギ抗体の蛍光標識を行なった。すなわち、抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（０．８ｍｇ、５．３ｎｍｏｌ）をセントリコン１００にてバッファ交換し、５００μＬの５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファｐＨ９．７６溶液とする。実施例２で得られた６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンの粗結晶(１．３ｍｇ、理論最大含量は１μｍｏｌ)を１２．５μＬのジメチルホルムアミドに溶解した後、ウサギＩｇＧヤギ抗体の溶液に添加し、４℃にて１５時間撹拌した。
反応後、反応液に２００μＬの５０ｍＭ トリス塩酸バッファ ｐＨ８．０を添加した。これを５０ｍＭトリス塩酸バッファｐＨ８．０によりバッファ置換したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（５ｍＬ）にアプライした。５０ｍＭ トリス塩酸バッファｐＨ８．０により溶出。各フラクションは５滴ずつ分画し、ＵＶスペクトルを測定してタンパク及びピレンの吸収の認められたフラクションを合わせた(６００μＬ)。この溶液についてバイオラッド社製タンパク定量キットによりタンパク濃度を求めたところ１．１ｍｇ／ｍＬとなった(抗ウサギＩｇＧヤギ抗体のモル濃度は７．３μＭ)。また３４５ｎｍの吸光度およびピレンのモル吸光係数（５ｘ１０４）からピレンの濃度は２０μＭと求められた。このことから抗ウサギＩｇＧヤギ抗体には1分子当たり平均２．７個の６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンが結合したことが確かめられた。
【００４９】
２）試料溶液中のウサギＩｇＧと蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体との混合
試料溶液は、ウサギＩｇＧを２０ｍＭ ＰＢＳ (ｐＨ７．３)によって、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ及び１ｆＭにすることで調製した。それぞれの試料溶液５μＬと、１）で調製した蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を２０ｍＭ ＰＢＳ （ｐＨ７．３）にて２ｎＭに希釈した溶液５μＬとを混合し反応液とした。尚、試料溶液及び蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体溶液はいずれも３７℃に設定し、また混合した時点を反応開始０分とした。
【００５０】
３）蛍光偏光解消法による蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体と結合したウサギＩｇＧのマイクロチャンバの検出
混合液５μＬを速やかにスライドグラスに滴下し、実施例１で作製したマイクロチャンバアレイを、スライドグラス上の混合液に置くことで、マイクロチャンバアレイの各マイクロチャンバに混合液を分注した。スライドグラス上に残った混合液を、濾紙によって除去し、５分、８分、１０分の蛍光偏光度を偏光フィルター励起光側と蛍光側ともに組み込んだ蛍光顕微鏡システム（オリンパス社）によって、蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体と結合したウサギＩｇＧの存在するマイクロチャンバを検出した。検出結果から導き出した試料溶液中のウサギＩｇＧの測定結果を図４に示す。尚、測定温度は３７℃に設定した。
＜比較例１＞
【００５１】
実施例３と同様の方法で調製した蛍光標識抗ウサギＩｇＧ抗体及び試料溶液を用いて、蛍光偏光度を蛍光偏光測定オプションつき蛍光分光光度計FLS920（浜松ホトニクス社）によって測定した。即ち、２０ｍＭ ＰＢＳ (ｐＨ７．３)にて２ｎＭに希釈した蛍光標識抗ウサギＩｇＧ抗体溶液５０μＬを蛍光セルに入れた後、各濃度に調整した試料溶液５０μＬを該蛍光セルに添加して測定を開始し、５分、８分、１０分の蛍光偏光度を測定した。尚、測定温度は３７℃に設定した。測定結果を図５に示す。
【００５２】
図４及び図５から明らかなように、マイクロチャンバアレイを用いた蛍光偏光解消法による試料溶液の濃度測定は、１０ｆＭ以下の低濃度でも測定が可能であるのに対し、通常の蛍光偏光解消法による試料溶液の濃度測定では、１０ｐＭ以下の濃度では、正確な濃度測定ができなかった。
【実施例４】
【００５３】
＜蛍光標識ＤＮＡプロ−ブを用いた試料溶液中のＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡの濃度測定＞
１）蛍光標識プロ−ブの調製
６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンを用いてＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡに対し相補的であり、５'末端にアミノ基を有する１５塩基のＤＮＡプローブ（以下Ｍ１３プローブという）の蛍光標識を行なった。すなわち、Ｍ１３プローブ（１０ｎｍｏｌ）を５００μＬの５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファｐＨ９．７６溶液とする。実施例２で得られた６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンの粗結晶(１．３ｍｇ、理論最大含量は１μｍｏｌ)を１２．５μＬのジメチルホルムアミドに溶解した後、Ｍ１３プローブの溶液に添加し、４℃にて１５時間撹拌した。
【００５４】
反応後、フォトダイオードアレイを検出器として持つHPLCにより分離・精製を行った。この際、目的とする蛍光標識Ｍ１３プローブは、ＤＮＡとピレンの吸収を持つピークとして分取した。ＨＰＬＣにより分離・精製を行なった。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
【００５５】
カラム：コスモシル ５Ｃ１８−ＡＲ−３００ ４.６ｍｍ Ｘ １５０ｍｍ
流速：１ｍＬ/ｍｉｎ
検出波長：２５０−５００ｎｍ
溶離液：３０−１００％ アセトニトリル
グラジエント：
【００５６】
【表２】
※TEAA トリエチルアミン-酢酸バッファ
【００５７】
分取した溶液５００μＬについて２６０ｎｍの吸光度によりＤＮＡ濃度を求めたところ５．０μMとなった。また３４５ｎｍの吸光度およびピレンのモル吸光係数（５ｘ１０４）からピレンの濃度は４．６μＭと求められた。このことからＭ１３プローブには1つ当たり平均０．９２個の６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンが結合したことが確かめられた。
２）試料溶液中のＭ１３ ｓｓＤＮＡと蛍光標識プロ−ブとの混合
試料溶液は、（M13 mp18 ssDNA）を（0.1N NaClを含む10mM Tris-HCl (pH8.0)）によって、10nM、（1）nＭ、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM及び1fＭにすることで調製した。それぞれの試料溶液（5）μＬと、１）で調製した蛍光標識（M13）プローブを0.1N NaClを含む10mM Tris-HCl (pH8.0)で2nMに希釈した溶液（5）μＬとを混合し混合液とした。尚、試料溶液及び蛍光標識（M13）プローブはいずれも３７℃に設定し、また混合した時点を反応開始０分とした。
【００５８】
３）蛍光偏光解消法による蛍光標識プロ−ブと結合したＭ１３ ｓｓＤＮＡのマイクロチャンバの検出
混合液５μＬを速やかにスライドグラスに滴下し、実施例１で作製したマイクロチャンバアレイを、スライドグラス上の混合液に置くことで、マイクロチャンバアレイの各マイクロチャンバに混合液を分注した。スライドグラス上に残った混合液を、濾紙によって除去し、５分、８分、１０分の蛍光偏光度を偏光フィルター励起光側と蛍光側ともに組み込んだ蛍光顕微鏡システム（オリンパス社）によって、蛍光標識Ｍ１３プローブと結合したＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡの存在するマイクロチャンバを検出した。検出結果から導き出した試料溶液中のＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡの測定結果を図６に示す。尚、測定温度は３７℃に設定した。
＜比較例２＞
【００５９】
実施例４と同様の方法で調製した蛍光標識Ｍ１３プローブ及び試料溶液を用いて、蛍光偏光度を蛍光偏光測定オプションつき蛍光分光光度計ＦＬＳ９２０（浜松ホトニクス社）によって測定した。即ち、０．１Ｎ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により２ｎＭに希釈した蛍光標識Ｍ１３プローブ溶液 ５０μＬを蛍光セルに入れた後、各濃度に調整した試料溶液５０μＬを該蛍光セルに添加して測定を開始し、５分、８分、１０分の蛍光偏光度を測定した。尚、測定温度は３７℃に設定した。測定結果を図７に示す。
【００６０】
図６及び図７から明らかなように、マイクロチャンバアレイを用いた蛍光偏光解消法による試料溶液の濃度測定は、１０ｆＭ以下の低濃度でも測定が可能であるのに対し、通常の蛍光偏光解消法による試料溶液の濃度測定では、１０ｐＭ以下の濃度では、正確な濃度測定ができなかった。
【００６１】
以上の結果から、本発明の標的物質測定方法は、従来の蛍光偏光解消法による試料溶液中の標的物質の濃度の測定方法に比し、極めて低濃度の標的物質の濃度が測定可能なことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】フォトリソグラフィ法によるマイクロチャンバアレイの作製方法の一実施形態を示した図である。
【図２】マイクロチャンバアレイ１０の使用方法の一実施形態を示した図である。
【図３】容器部１３の構成の実施形態を模式的に示した図である。
【図４】蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を用いた試料溶液中のウサギＩｇＧのマイクロチャンバアレイを用いた蛍光偏光解消法による濃度測定結果を示した図である。
【図５】蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を用いた試料溶液中のウサギＩｇＧの従来の蛍光偏光解消法による濃度測定結果を示した図である。
【図６】蛍光標識プロ−ブを用いた試料溶液中のＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡのマイクロチャンバアレイを用いた蛍光偏光解消法による濃度測定結果を示した図である。
【図７】蛍光標識プロ−ブを用いた試料溶液中のＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡの従来の蛍光偏光解消法による濃度測定結果を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光偏光解消法による試料溶液中の標的物質の濃度を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の検体について測定を行なう生理活性物質の探索におけるハイスループットスクリーニングあるいは体外診断システムにおいて、効率よく試験を実施するためには、簡便性、感度、安定性に優れた検出系を用いる必要がある。これまでこれらの検出系としては大きく分けて紫外可視吸光法、化学発光・生物発光法、放射性同位元素（ＲＩ）を用いる検出系が用いられてきた。
【０００３】
このうち蛍光法は高選択性・高感度が期待できる検出系であり、紫外可視吸光法とともによく用いられている。また、蛍光法はＲＩを用いる方法に比べ測定時間が短くてすむだけでなく、管理区域内での操作の必要がない、放射性廃棄物の問題がないという点においても優れており、ＲＩを用いた方法からの転換も行なわれてきている。
【０００４】
しかし、化合物ライブラリ−あるいは血液成分を含む臨床検体などの多数の検体について試験を行なう場合、蛍光を発する検体も含まれていることがあり、その夾雑蛍光により測定がしばしば妨害されるという問題点がある。
【０００５】
蛍光偏光解消法は、１９２６年にＰｅｒｒｉｎらによって確立された大きな分子ほど回転ブラウン運動の回転速度が遅くなることを利用した方法である。蛍光性分子により標識された小さな分子は、回転速度が速いため蛍光の偏光が解消され、蛍光偏光度Ｐは小さい値を示す。一方、大きな分子の場合は回転速度が遅いため蛍光の偏光は解消せず、Ｐは大きな値を示す（非特許文献１）。つまり、標的物質に結合可能な蛍光標識物質と標的物質が結合するとＰは増大することになる。このＰの変化を測定することで、該標的物質の試料溶液中の濃度を測定することができる。
【０００６】
尚、蛍光偏光度は、以下の式によって計算される。
Ｐ＝（ＩＨ−ＩＬ）／（ＩＨ＋ＩＬ）
（式中、ＩＨは、励起光の偏光面に平行な平面で偏光された発光強度であり、ＩＬは励起光の偏光面に垂直な平面で偏光された発光強度である。）
【０００７】
また、蛍光偏光解消法の指標として蛍光異方性ｒも用いられる。この場合も蛍光偏光度Ｐと同様に、蛍光異方性ｒの値の変化を測定することで、該標的物質の試料溶液中の濃度を測定することができる。蛍光偏光度Ｐと蛍光異方性ｒとの関係は以下の式で表すことができる。
ｒ＝２Ｐ/（３−Ｐ）
【０００８】
蛍光偏光解消法による標的物質の試料溶液中の濃度を測定する具体例としては、蛍光偏光免疫測定法（FPIA法）が挙げられる。この方法は、特に血中薬剤濃度のような比較的分子量の小さい物質の測定に用いられ、抗原-抗体反応と、蛍光偏光度との関係から検量線を用いて標的物質の濃度を求めるものである。蛍光偏光免疫測定法は既に確立された技術である（特許文献１）。
【０００９】
蛍光偏光解消法では、標的物質が結合した結合型の蛍光標識物質と、標的物質が結合していない遊離型の蛍光標識物質を分離（Ｂ／Ｆ分離）することなく、ホモジニアスアッセイ系で該標的物質の試料溶液中の濃度を測定することができる。しかしながら、試料溶液中に標的物質が極めて少ない場合、多量に存在する遊離型の蛍光標識物質の影響が強く、結合型の蛍光標識物質の正確な検出が困難になる等の問題があった。従って、蛍光偏光解消法では、極めて微量な標的物質の検出は難しく、より高感度に微量標的物質を測定する蛍光偏光解消法の開発が望まれていた。
【００１０】
また、昨今、ゲノミクスやプロテオミクスで数多くの遺伝子やタンパク質の機能を解析するにあたり、微量なサンプルを用い、高速な解析を行うことが必要になってきている。このようなニ−ズに対応するために、微量かつ高速な解析用のＤＮＡチップやプロテオチップなどの開発が進められている。そして、微細加工技術の進歩から極微小なチャンバ−（マイクロチャンバ）を作製することが可能になった。更に、ＣＣＤカメラおよびコンピューター処理を利用して、定性的、半定量的に解析することも可能になっている。
【００１１】
マイクロチャンバアレイは、プレ−ト上に複数のマイクロチャンバを備えたものであり、既に酵素活性を有するタンパク質、微生物のスクリ−ニング及び一分子酵素活性検出等の利用が報告されている（特許文献２、特許文献３）。
【非特許文献１】Ｐｅｒｒｉｎ、 Ｆ. Ｊ. Ｐｈｙｓ. Ｒａｄ. １、 ３９０−４０１、 １９２６
【特許文献１】特開昭５７−０５８６９５号公報
【特許文献２】特開２００６−０６１０２３号公報
【特許文献３】特許第３７２７０２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、蛍光偏光解消法による試料溶液中の微量標的物質の濃度を測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）試料溶液と、試料溶液中に存在が疑われる標的物質に結合可能な蛍光標識物質を混合する工程と、得られた混合液を、マイクロチャンバアレイの各マイクロチャンバに分注する工程と、蛍光偏光解消法により、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出することにより、生体試料中の標的物質の濃度を測定する工程と、を備えた標的物質測定方法；
（２）前記試料溶液が、生体試料である（１）に記載の標的物質測定方法；
（３）前記標的物質が、タンパク質又はＤＮＡである、（１）又は（２）に記載の標的物質測定方法；
（４）前記蛍光標識物質が、蛍光標識抗体、蛍光標識抗原又は蛍光標識プロ−ブである、（１）〜（３）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（５）前記蛍光標識物質の蛍光発色団が有機系蛍光発色団からなる、（１）〜（４）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（６）前記蛍光標識物質の蛍光発色団が６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンである（１）〜（５）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（７）前記マイクロチャンバの開口の直径が、０．１〜４０μｍである、（１）〜（６）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（８）前記マイクロチャンバの深さが、１００〜２０００ｎｍである、（１）〜（７）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（９）前記マイクロチャンバの容積が０．００１〜２５０００ｆＬである、（１）〜（８）のいずれか１に記載の標的物質測定方法；
（１０）前記マイクロチャンバアレイが有するマイクロチャンバの数が、１ｃｍ２あたり１０〜１０１２個である（１）〜（９）のいずれか１に記載の標的物質測定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、遊離型の蛍光標識物質等の影響を受けない、蛍光偏光解消法による高感度な試料溶液中の微量標的物質の濃度を測定する、標的物質測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の実施形態における、試料溶液としては、後述するマイクロチャンバに分注可能なものであれば、特に制限されるものではないが、生体試料が好ましい。生体試料としては、特に体液が好ましく、例えば、血液、血清、血漿、尿、汗、組織液あるいは組織の可溶化液等が挙げられる。
【００１６】
本実施形態において、標的物質としては、溶液中に存在し後述する蛍光標識物質と結合するものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類及び細胞等が挙げられ、特にタンパク質及びＤＮＡが好ましい。
【００１７】
本実施形態において、蛍光標識物質としては、標的物質との特異的な結合能を有し、蛍光偏光解消法による検出が可能なものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、蛍光標識抗体、蛍光標識抗原、蛍光標識タンパク、蛍光標識ペプチド及び蛍光標識DNAプロ−ブ等が挙げられる。
【００１８】
また、蛍光標識物質の蛍光発色団としては、蛍光偏光解消法を用いて標識蛍光標識物質が結合した標的物質と遊離の蛍光標識物質を検出できる化合物であれば、特に制限されるものではないが、有機系蛍光発色団が好ましく、例えば、ロ−ダミン、ピレン、ジアルキルアミノナフタレン及びシアニンの骨格を有する化合物が挙げられる。また、特にピレン骨格を有する化合物が好ましく、より具体的には６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンが挙げられる。
【００１９】
尚、６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンは公知の蛍光発色団であり、その合成方法等は特に制限されるものではなく、公知の化学合成法を用いて合成することができる。
【００２０】
ここで、使用する蛍光発色団の骨格を選択する際は、標識蛍光標識物質及び標的物質から分子量変化を考慮して、適宜、励起波長、蛍光波長、ストークスシフト、及び蛍光寿命等の最適化を行うことができる。この際、励起波長と蛍光波長との波長差である、ストークスシフトは、５ｎｍ以上であることが好ましく、特に２０ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光発色団の蛍光寿命（蛍光緩和時間）は、１ナノ秒〜１０００ナノ秒の範囲が好ましく、特に５０ナノ秒〜５００ナノ秒の範囲が好ましい。
【００２１】
より具体的には、分子量変化が５０００〜５万、即ち、蛍光標識物質が結合した標的物質の分子量が数千から数万の場合の場合、１ナノ秒〜１５ナノ秒の蛍光寿命を有する蛍光発色団が好ましく、このような蛍光発色団の例としては、シアニン、ローダミン等が挙げられる。分子量変化が５万〜５０万程度の場合、即ち、蛍光標識物質が結合した標的物質の分子量が数万から数十万の場合、５０ナノ秒〜５００ナノ秒の蛍光寿命を有する蛍光発色団が好ましい。このような蛍光発色団の例としては、ジアルキルアミノナフタレン、ピレン誘導体等が挙げられ、特に６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンが好ましい。分子量変化が約５０万から約５００万程度の場合、即ち、蛍光標識物質が結合した標的物質の分子量が数十万から数百万の場合、１００ナノ秒〜約１０００ナノ秒の蛍光寿命を有する蛍光発色団が好ましい。このような蛍光発色団の例として、ピレン誘導体、金属錯体等が挙げられる。
【００２２】
本実施形態における、マイクロチャンバアレイとしては、標識蛍光標識物質が結合した標的物質を一つずつ分注できるマイクロチャンバを複数有するものであれば、特に制限されるものではないが、１ｃｍ２のマイクロチャンバアレイにマイクロチャンバを１０〜１０１２個、特に１００〜１０８個有するものが好ましい。
【００２３】
ここで、マイクロチャンバとしては、標識蛍光標識物質が結合した標的物質の大きさによって、所望の開口、深さ及び容積を設定すればよく、特に制限されるものではないが、例えば、標的物質がタンパク質やＤＮＡの場合、マイクロチャンバの開口の直径は０．１〜４０μｍ、深さは１００〜２０００ｎｍ、容積は０．００１〜２５０００ｆＬのものが好ましく、特に、容積が１０００ｆＬ以下のものが好ましい。
【００２４】
また、マイクロチャンバアレイの作製方法は、公知の作製方法を使用すれば良く、特に制限されるものではないが、例えば、通常のフォトリソグラフィ法を用いて作製することができる。
【００２５】
フォトリソグラフィ法によるマイクロチャンバアレイの作製方法の一実施形態を、図１に模式的に示した。ガラス基板１上に金膜２を蒸着し、金膜２上をフォトレジストにてコーティングしフォトレジストコート３を形成し、所定のパターンのクロム膜を有するパターンガラス４をフォトレジストコート３に置き、紫外線５を照射する（図１Ａ）。次いで、紫外線５が照射されたフォトレジストコート３上のフォトレジストを除去し、フォトレジスト膜６が金膜２に残ったもの、即ち、フォトレジストをパターニングしたものを鑄型７とする（図１Ｂ）。フォトレジスト膜６が残留する部分は、マイクロチャンバ８に対応する鑄型部分である。従って、フォトレジスト膜６の寸法は、形成されるべきマイクロチャンバ８と実質的に同一の寸法を有するべきである。
【００２６】
次に、ＰＤＭＳと硬化剤を所定の比率で混合させた液状ＰＤＭＳ９を調製した後、その液状ＰＤＭＳ９を鑄型７上に適用し、その状態で液状ＰＤＭＳ９を硬化させる（図１Ｃ）。この過程において、硬化を促進させるために、液状ＰＤＭＳ９を担持した鑄型７は、約８０℃で約６０分間加熱することが好ましい。かくして、液状ＰＤＭＳ９の硬化が完了し、ＰＭＤＳからなるマイクロチャンバアレイ１０が鑄型７から剥がされる（図１Ｄ）。なお、この実施形態においては、マイクロチャンバアレイ１０は、金膜２に載置された状態で硬化したＰＤＭＳであり、何等化学的な処理を施すことなく、容易に剥離することができる。
【００２７】
図１Ｅは、マイクロチャンバアレイ１０をマイクロチャンバ８の開口方向から見た図である。本実施形態のマイクロチャンバ８の形状は円柱であるが、その他の形状であってもよい。また、本実施形態では、紫外線により感光した部分が除去されるポジ型フォトレジストを用いて鋳型を作製したが、感光した部分が残るネガ型フォトレジストを用いても良い。
【００２８】
上記の方法でマイクロチャンバアレイ１０を作製した場合、例えば、試料溶液１２の液滴を保持したスライドグラス１１上に、マイクロチャンバアレイ１０を載置することにより、容易に、各マイクロチャンバ８に試料溶液１２を分注することができる（図２）。このように、マイクロチャンバアレイ１０をスライドグラス１１に載置するだけで、試料溶液１２を分注することができ、使用者が特にマイクロチャンバアレイ１０の使用に熟練を要することはない（図２Ａ）。また、該マイクロチャンバアレイを用いることで、分注される試料溶液１２の体積は、マイクロチャンバ８により定められ、有機溶媒中に液滴を噴霧し懸架する場合に比べ、液滴のばらつきは、実質的に小さく若しくは無くなる（図２Ｂ）。
【００２９】
また、本実施形態では、マイクロチャンバアレイ１０とスライドグラス１１を載置することにより、容器部１３を構成しているが（図３Ａ）、例えば、スライドグラス１４と貫通孔を有するＰＤＭＳ１５を貼り合わせることにより作製したマイクロチャンバアレイを、スライドグラス１１に載置することにより、容器部１３を構成するようになっていてよい（図３Ｂ）。
【００３０】
ここで、容器部１３の少なくとも一部は、水に対し実質的に不透過性を有する高分子樹脂から構成されているものが好ましく、また、高分子樹脂が空気に対して透過性を有するものが特に好ましい。これにより、封入された液滴の漏洩がなく、更に、空気透過性を有するため、空気が容器部１３外へ透過して消散され、容器部１３内に空気が残留することを確実に回避することができる。
【００３１】
本実施形態において、マイクロチャンバアレイの材料としては、フォトリソグラフィ法により形成された鑄型を用いることで、マイクロチャンバアレイを形成できるものであれば、特に制限されるものではないが、水に対し実質的に不透過性を有する高分子樹脂から構成されているものが好ましく、また、高分子樹脂が空気に対して透過性を有するものが特に好ましい。例えば、ポリジメチルシロキサン 、シリコン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート及びポリカーボネートが挙げられ、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。また、特に容器部の少なくとも一部又は第二の部材は、ＰＤＭＳにより形成されていることが好ましい。勿論、マイクロチャンバアレイ全体がＰＤＭＳにより形成されていてもよい。
【００３２】
本実施形態において、蛍光偏光解消法により、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出する方法としては、マイクロチャンバアレイにおける蛍光偏光度を測定し、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを特定できるものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、偏光フィルターを組み込んだ蛍光顕微鏡、偏光フィルターを組み込んだＣＣＤカメラと励起光源を合わせたシステム、偏光フィルターを組み込んだ蛍光光度計などが用いられる。
【００３３】
より具体的には、標的物質を含む試料と蛍光標識物質とを溶液中で混合した後、マイクロチャンバアレイに混合液を分注し、各マイクロチャンバにおける蛍光標識物質の蛍光偏光度を測定することで、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出する。必要であれば、標的物質の不在下での、蛍光標識物質の蛍光偏光度もまた測定する。測定は、穏和な温度（１０℃〜４０℃）で、一定温度で行うことが好ましい。
【００３４】
蛍光偏光度の測定は、標的物質と蛍光標識物質との混合から所定の時間後に測定してもよく、あるいは、単位時間あたりの蛍光偏光度変化を測定してもよい。標的物質と蛍光標識物質との結合が完全に終了した時点で測定することにより、より再現性のある測定値が得られる。
【００３５】
このように、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出し、検出されたマイクロチャンバの数とマイクロチャンバアレイが有するマイクロチャンバの数の比較等により、容易に試料溶液中に含まれる標的物質の濃度を測定することができる。
【００３６】
例えば、１ｆＬのマイクロチャンバを１０８個有するマイクロチャンバアレイを使用した場合、０．１μＬの試料溶液がマイクロチャンバアレイに分注されることになる。ここで、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバの数が６個であった場合、０．１μＬ中に標的物質が６個含まれていたことになるから、試料溶液中の標的物質の濃度は１０−１６Ｍとなる。
【００３７】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
＜マイクロチャンバアレイの作製＞
ガラス基板上に金の薄膜を蒸着し、金の薄膜上をフォトレジストにてコ−ティングし、直径１μｍ、高さ１μｍの円柱を１μｍ間隔で、縦横に１００００個、総計１０８個有するようにクロム膜を形成するガラスをフォトレジストコ−ト上に載置し、紫外線を照射する。次いで、紫外線が照射されたフォトレジストを除去し、フォトレジスト膜が金膜に残ったもの、即ち、フォトレジストをパタ−ニングしたものを鑄型として使用した。
【００３９】
ＰＤＭＳと硬化剤を重量比１０：１で混合させた液状ＰＤＭＳを調製し、その液状ＰＤＭＳを鑄型に適用し、その状態でＰＭＤＳを８０℃で６０分間硬化させる。ＰＭＤＳの硬化が完了した後、ＰＭＤＳを鑄型から剥がしマイクロチャンバアレイを作製した。
【実施例２】
【００４０】
＜６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンの合成＞
６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１は反応式Ｉに従って合成した。但し、反応式Ｉ中においてβ−シクロデキストリンに導入された置換基の位置は不定であり、理論上、位置混合物が生じる場合は位置異性体混合物として取り扱った。
【００４１】
【化１】
反応式Ｉ
【００４２】
（１）６Ａ、６Ｘ−ジメシチル−β−シクロデキストリン２の合成
反応式Ｉに従い、β−シクロデキストリンから６Ａ、６Ｘ−ジメシチル−β−シクロデキストリン２を合成した。すなわち、１００ｍＬのピリジンにβ−シクロデキストリン（５.６７５g、 ５ｍｍｏｌ）を撹拌しながら溶解し、これに室温にて塩化メシチレンスルホニル （１.０９４g、 ５ｍｍｏｌ）を撹拌しながら加え、２時間撹拌した。さらに塩化メシチレンスルホニル （１.０９４g、 ５ｍｍｏｌ）を追加し、２時間撹拌したのち塩化メシチレンスルホニル（１.０９４g、 ５ｍｍｏｌ）を追加し、３時間撹拌した。その後、さらに塩化メシチレンスルホニル（１.０９４g、 ５ｍｍｏｌ）を追加し、２時間撹拌した。２０ｍｍｏｌ（３６０μＬ）の水を加えてクエンチした後、ピリジンを留去、約５０ｍＬに濃縮し、アセトンにて結晶化した。粗結晶を温水（１００ｍＬ）に溶解し、熱いままＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマト（６０ｍＬ）にアプライした。温水４００ｍＬで洗浄後（β−シクロデキストリンが溶出）、温３０％ メタノ−ル（４００ｍＬ）および常温の４０％メタノ−ル（２００ｍＬ）で６−Ｏ−メシチル−β−シクロデキストリン（２.７７g、 ２.１ｍｍｏｌ、 ４２％）を溶出した後、６Ａ、６Ｘ−Ｏ−ジメシチル−β−シクロデキストリン ２ （位置異性体混合物）を得た。
収量：１．１５ｇ（１５％）
Ｃ６０Ｈ９０Ｏ３９Ｓ２ （ＭＷ; １４９９.５） ＬＣ−ＥＳＩ/ＭＳ/ＭＳ：ｍ/ｚ １５２１（Ｍ＋ＮＡ）
【００４３】
（２）６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−メシチル−β−シクロデキストリン３の合成
続いて反応式Ｉに従い６Ａ、６Ｘ−ジメシチル−β−シクロデキストリン２から６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−メシチル−β−シクロデキストリン３を合成した。すなわち、１５ｍＬの乾燥させたジメチルスルホキシドに６Ａ、６Ｘ−Ｏ−ジメシチル−β−シクロデキストリン ２ （１.２５ｇ、 ０.８３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら溶解した。室温にて撹拌しながらカリウムｔ−ブトキシド（９３.６ｍｇ、 ０.８３ｍｍｏｌ）及び１−ピレンブチリック酸（２４０ｍｇ、 ０.８３ｍｍｏｌ）を溶解したジメチルスルホキシド溶液（５ｍＬ）を添加した。その後、８０℃にて３時間加熱し反応後、１Ｌのアセトンを加え結晶化した。アセトンで洗浄後、粗結晶を５０ｍＬの水に溶解してＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマト（２０ｍＬ）にアプライし、１Ｌの水、１Ｌの４０％ メタノ−ル、１Ｌの６０％ メタノ−ルで洗浄後、１Ｌの８０％メタノ−ルで溶出し、６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−メシチル−β−シクロデキストリン ３ （位置異性体混合物）を得た。
収量：４１０ｍｇ（３１％）
Ｃ７１Ｈ４９Ｏ３８Ｓ （ＭＷ; １５８７.５） ＬＣ−ＥＳＩ/ＭＳ/ＭＳ：ｍ/z １６０９（Ｍ＋ＮＡ）
【００４４】
（３）６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４の合成
続いて反応式Ｉに従い６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−メシチル−β−シクロデキストリン３から６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４を合成した。すなわち、先に得た ６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−メシチル−β−シクロデキストリン３ （８０ｍｇ、 ０.０５ｍｍｏｌ）を１ｍＬの乾燥させたジメチルスルホキシドに撹拌しながら溶解し、これにコハク酸（１１８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を続けて添加し、溶解した。室温にて撹拌しながらカリウムｔ−ブトキシド（１１２ｍｇ、 １ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（１ｍＬ）をゆっくり添加した。その後、８０℃にて４８時間撹拌した。反応後、反応液をろ過後、反応液に５０ｍＬのアセトンを加え、結晶化した。アセトンにて洗浄後、粗結晶を２０ｍＬの水に溶解してＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマトグラフィ−（２０ｍＬ）にアプライした。５００ｍＬの水、５００ｍＬの４０％ メタノ−ルで洗浄後、５００ｍＬの６０％ メタノ−ル及び５００ｍＬの８０％ メタノ−ルにて溶出したが、原料の３と反応生成物が分離せず溶出したため、これらの溶出液を濃縮し、炭酸ナトリウムにより反応生成物である６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４をナトリウム塩とした後、ＨＰＬＣにより分離・精製を行なった。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
カラム：コスモシル ５Ｃ１８−ＡＲ−３００ ４.６ｍｍ Ｘ １５０ｍｍ、流速：１ｍＬ/ｍｉｎ、検出波長：２５０−５００ｎｍ、
溶離液：３０−１００％ メタノ−ル
グラジエント：
【００４５】
【表１】
【００４６】
上記条件で１１〜１３ｍｉｎのピ−クを分取し、留去し６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４のナトリウム塩（１６ｍｇ）を得た。これに１Ｎ塩酸を加え、４をカルボン酸体とし白濁した溶液を一旦、留去した。結晶をメタノ−ルに再溶解後、シリカゲル薄層クロマトグラフィ−（イソプロピルアルコ−ル:酢酸エチル:水=７:７:５）により展開し、Ｒｆ０.６のバンドから６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４ （位置異性体混合物）を得た。
収量：１５ｍｇ（２０％）
Ｃ６６Ｈ８８Ｏ３９ （ＭＷ; １５０５.４） ＬＣ−ＥＳＩ/ＭＳ/ＭＳ：ｍ/z １５４９（Ｍ−Ｈ＋２ＮＡ）
【００４７】
（４）６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１の合成
続いて反応式Ｉに従い６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４から６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１を合成した。すなわち、反応容器に ６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４ （２.２５ｍｇ、 １.５μｍｏｌ）を量り取り、撹拌しながらＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、 １７.３ｍｇ、 １５０μｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（０.５ｍＬ）を添加した。これにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、 ３１.０ｍｇ、 １５０μｍｏｌ） のジメチルホルムアミド溶液（０.５ｍＬ）を撹拌しながら添加した。室温にて撹拌し反応開始１.５時間後からＨＰＬＣにて生成物ピ−クの分取・精製を行なった。位置異性体混合物であることに由来する分離不十分な３本の生成物のピ−クが認められたが、いずれもマススペクトルにより６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１（位置異性体）であることを確認したためこれら３本の画分（１５から１７ｍｉｎ）を合わせて分取した（ ＨＰＬＣ条件は６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−スクシノイル−β−シクロデキストリン４の精製時と同じ）。移動相を留去後、６.５ｍｇの白色結晶を得た。マススペクトルにて確認したところ６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１以外にＤＣＣの分解物であるジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）が含まれることが示されたが、これはUV領域において吸収を持たず、また、６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１が少量であること、ＤＣUと６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１との分離が困難であること、ＤＣUがこの後の６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリン１とタンパクとの反応を妨害しないことが予想されるため、この白色結晶をそのままタンパクの標識に用いた。
Ｃ７０Ｈ９１Ｏ４１Ｎ （ＭＷ; １６０２.４５） ＬＣ−ＥＳＩ/ＭＳ/ＭＳ：ｍ/ｚ １６２４（Ｍ＋ＮＡ）
【実施例３】
【００４８】
＜蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を用いた試料溶液中のウサギＩｇＧの濃度測定＞
１）蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体の調製
６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンを用いて抗ウサギＩｇＧヤギ抗体の蛍光標識を行なった。すなわち、抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（０．８ｍｇ、５．３ｎｍｏｌ）をセントリコン１００にてバッファ交換し、５００μＬの５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファｐＨ９．７６溶液とする。実施例２で得られた６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンの粗結晶(１．３ｍｇ、理論最大含量は１μｍｏｌ)を１２．５μＬのジメチルホルムアミドに溶解した後、ウサギＩｇＧヤギ抗体の溶液に添加し、４℃にて１５時間撹拌した。
反応後、反応液に２００μＬの５０ｍＭ トリス塩酸バッファ ｐＨ８．０を添加した。これを５０ｍＭトリス塩酸バッファｐＨ８．０によりバッファ置換したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（５ｍＬ）にアプライした。５０ｍＭ トリス塩酸バッファｐＨ８．０により溶出。各フラクションは５滴ずつ分画し、ＵＶスペクトルを測定してタンパク及びピレンの吸収の認められたフラクションを合わせた(６００μＬ)。この溶液についてバイオラッド社製タンパク定量キットによりタンパク濃度を求めたところ１．１ｍｇ／ｍＬとなった(抗ウサギＩｇＧヤギ抗体のモル濃度は７．３μＭ)。また３４５ｎｍの吸光度およびピレンのモル吸光係数（５ｘ１０４）からピレンの濃度は２０μＭと求められた。このことから抗ウサギＩｇＧヤギ抗体には1分子当たり平均２．７個の６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンが結合したことが確かめられた。
【００４９】
２）試料溶液中のウサギＩｇＧと蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体との混合
試料溶液は、ウサギＩｇＧを２０ｍＭ ＰＢＳ (ｐＨ７．３)によって、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ及び１ｆＭにすることで調製した。それぞれの試料溶液５μＬと、１）で調製した蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を２０ｍＭ ＰＢＳ （ｐＨ７．３）にて２ｎＭに希釈した溶液５μＬとを混合し反応液とした。尚、試料溶液及び蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体溶液はいずれも３７℃に設定し、また混合した時点を反応開始０分とした。
【００５０】
３）蛍光偏光解消法による蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体と結合したウサギＩｇＧのマイクロチャンバの検出
混合液５μＬを速やかにスライドグラスに滴下し、実施例１で作製したマイクロチャンバアレイを、スライドグラス上の混合液に置くことで、マイクロチャンバアレイの各マイクロチャンバに混合液を分注した。スライドグラス上に残った混合液を、濾紙によって除去し、５分、８分、１０分の蛍光偏光度を偏光フィルター励起光側と蛍光側ともに組み込んだ蛍光顕微鏡システム（オリンパス社）によって、蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体と結合したウサギＩｇＧの存在するマイクロチャンバを検出した。検出結果から導き出した試料溶液中のウサギＩｇＧの測定結果を図４に示す。尚、測定温度は３７℃に設定した。
＜比較例１＞
【００５１】
実施例３と同様の方法で調製した蛍光標識抗ウサギＩｇＧ抗体及び試料溶液を用いて、蛍光偏光度を蛍光偏光測定オプションつき蛍光分光光度計FLS920（浜松ホトニクス社）によって測定した。即ち、２０ｍＭ ＰＢＳ (ｐＨ７．３)にて２ｎＭに希釈した蛍光標識抗ウサギＩｇＧ抗体溶液５０μＬを蛍光セルに入れた後、各濃度に調整した試料溶液５０μＬを該蛍光セルに添加して測定を開始し、５分、８分、１０分の蛍光偏光度を測定した。尚、測定温度は３７℃に設定した。測定結果を図５に示す。
【００５２】
図４及び図５から明らかなように、マイクロチャンバアレイを用いた蛍光偏光解消法による試料溶液の濃度測定は、１０ｆＭ以下の低濃度でも測定が可能であるのに対し、通常の蛍光偏光解消法による試料溶液の濃度測定では、１０ｐＭ以下の濃度では、正確な濃度測定ができなかった。
【実施例４】
【００５３】
＜蛍光標識ＤＮＡプロ−ブを用いた試料溶液中のＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡの濃度測定＞
１）蛍光標識プロ−ブの調製
６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンを用いてＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡに対し相補的であり、５'末端にアミノ基を有する１５塩基のＤＮＡプローブ（以下Ｍ１３プローブという）の蛍光標識を行なった。すなわち、Ｍ１３プローブ（１０ｎｍｏｌ）を５００μＬの５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファｐＨ９．７６溶液とする。実施例２で得られた６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンの粗結晶(１．３ｍｇ、理論最大含量は１μｍｏｌ)を１２．５μＬのジメチルホルムアミドに溶解した後、Ｍ１３プローブの溶液に添加し、４℃にて１５時間撹拌した。
【００５４】
反応後、フォトダイオードアレイを検出器として持つHPLCにより分離・精製を行った。この際、目的とする蛍光標識Ｍ１３プローブは、ＤＮＡとピレンの吸収を持つピークとして分取した。ＨＰＬＣにより分離・精製を行なった。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
【００５５】
カラム：コスモシル ５Ｃ１８−ＡＲ−３００ ４.６ｍｍ Ｘ １５０ｍｍ
流速：１ｍＬ/ｍｉｎ
検出波長：２５０−５００ｎｍ
溶離液：３０−１００％ アセトニトリル
グラジエント：
【００５６】
【表２】
※TEAA トリエチルアミン-酢酸バッファ
【００５７】
分取した溶液５００μＬについて２６０ｎｍの吸光度によりＤＮＡ濃度を求めたところ５．０μMとなった。また３４５ｎｍの吸光度およびピレンのモル吸光係数（５ｘ１０４）からピレンの濃度は４．６μＭと求められた。このことからＭ１３プローブには1つ当たり平均０．９２個の６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンが結合したことが確かめられた。
２）試料溶液中のＭ１３ ｓｓＤＮＡと蛍光標識プロ−ブとの混合
試料溶液は、（M13 mp18 ssDNA）を（0.1N NaClを含む10mM Tris-HCl (pH8.0)）によって、10nM、（1）nＭ、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM及び1fＭにすることで調製した。それぞれの試料溶液（5）μＬと、１）で調製した蛍光標識（M13）プローブを0.1N NaClを含む10mM Tris-HCl (pH8.0)で2nMに希釈した溶液（5）μＬとを混合し混合液とした。尚、試料溶液及び蛍光標識（M13）プローブはいずれも３７℃に設定し、また混合した時点を反応開始０分とした。
【００５８】
３）蛍光偏光解消法による蛍光標識プロ−ブと結合したＭ１３ ｓｓＤＮＡのマイクロチャンバの検出
混合液５μＬを速やかにスライドグラスに滴下し、実施例１で作製したマイクロチャンバアレイを、スライドグラス上の混合液に置くことで、マイクロチャンバアレイの各マイクロチャンバに混合液を分注した。スライドグラス上に残った混合液を、濾紙によって除去し、５分、８分、１０分の蛍光偏光度を偏光フィルター励起光側と蛍光側ともに組み込んだ蛍光顕微鏡システム（オリンパス社）によって、蛍光標識Ｍ１３プローブと結合したＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡの存在するマイクロチャンバを検出した。検出結果から導き出した試料溶液中のＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡの測定結果を図６に示す。尚、測定温度は３７℃に設定した。
＜比較例２＞
【００５９】
実施例４と同様の方法で調製した蛍光標識Ｍ１３プローブ及び試料溶液を用いて、蛍光偏光度を蛍光偏光測定オプションつき蛍光分光光度計ＦＬＳ９２０（浜松ホトニクス社）によって測定した。即ち、０．１Ｎ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により２ｎＭに希釈した蛍光標識Ｍ１３プローブ溶液 ５０μＬを蛍光セルに入れた後、各濃度に調整した試料溶液５０μＬを該蛍光セルに添加して測定を開始し、５分、８分、１０分の蛍光偏光度を測定した。尚、測定温度は３７℃に設定した。測定結果を図７に示す。
【００６０】
図６及び図７から明らかなように、マイクロチャンバアレイを用いた蛍光偏光解消法による試料溶液の濃度測定は、１０ｆＭ以下の低濃度でも測定が可能であるのに対し、通常の蛍光偏光解消法による試料溶液の濃度測定では、１０ｐＭ以下の濃度では、正確な濃度測定ができなかった。
【００６１】
以上の結果から、本発明の標的物質測定方法は、従来の蛍光偏光解消法による試料溶液中の標的物質の濃度の測定方法に比し、極めて低濃度の標的物質の濃度が測定可能なことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】フォトリソグラフィ法によるマイクロチャンバアレイの作製方法の一実施形態を示した図である。
【図２】マイクロチャンバアレイ１０の使用方法の一実施形態を示した図である。
【図３】容器部１３の構成の実施形態を模式的に示した図である。
【図４】蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を用いた試料溶液中のウサギＩｇＧのマイクロチャンバアレイを用いた蛍光偏光解消法による濃度測定結果を示した図である。
【図５】蛍光標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を用いた試料溶液中のウサギＩｇＧの従来の蛍光偏光解消法による濃度測定結果を示した図である。
【図６】蛍光標識プロ−ブを用いた試料溶液中のＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡのマイクロチャンバアレイを用いた蛍光偏光解消法による濃度測定結果を示した図である。
【図７】蛍光標識プロ−ブを用いた試料溶液中のＭ１３ ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡの従来の蛍光偏光解消法による濃度測定結果を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液と、試料溶液中に存在が疑われる標的物質に結合可能な蛍光標識物質を混合する工程と、
得られた混合液を、マイクロチャンバアレイの各マイクロチャンバに分注する工程と、
蛍光偏光解消法により、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出することにより、生体試料中の標的物質の濃度を測定する工程と、を備えた標的物質測定方法。
【請求項２】
前記試料溶液が、生体試料である請求項１に記載の標的物質測定方法。
【請求項３】
前記標的物質が、タンパク質又はＤＮＡである、請求項１又は２に記載の標的物質測定方法。
【請求項４】
前記蛍光標識物質が、蛍光標識抗体、蛍光標識抗原又は蛍光標識プロ−ブである、請求項１〜３のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項５】
前記蛍光標識物質の蛍光発色団が有機系蛍光発色団からなる、請求項１〜４のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項６】
前記蛍光標識物質の蛍光発色団が６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンである請求項１〜５のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項７】
前記マイクロチャンバの開口の直径が、０．１〜４０μｍである、請求項１〜６のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項８】
前記マイクロチャンバの深さが、１００〜２０００ｎｍである、請求項１〜７のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項９】
前記マイクロチャンバの容積が０．００１〜２５０００ｆＬである、請求項１〜８のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項１０】
前記マイクロチャンバアレイが有するマイクロチャンバの数が、１ｃｍ２あたり１０〜１０１２個である請求項１〜９のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項１】
試料溶液と、試料溶液中に存在が疑われる標的物質に結合可能な蛍光標識物質を混合する工程と、
得られた混合液を、マイクロチャンバアレイの各マイクロチャンバに分注する工程と、
蛍光偏光解消法により、蛍光標識物質が結合した標的物質が分注されたマイクロチャンバを検出することにより、生体試料中の標的物質の濃度を測定する工程と、を備えた標的物質測定方法。
【請求項２】
前記試料溶液が、生体試料である請求項１に記載の標的物質測定方法。
【請求項３】
前記標的物質が、タンパク質又はＤＮＡである、請求項１又は２に記載の標的物質測定方法。
【請求項４】
前記蛍光標識物質が、蛍光標識抗体、蛍光標識抗原又は蛍光標識プロ−ブである、請求項１〜３のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項５】
前記蛍光標識物質の蛍光発色団が有機系蛍光発色団からなる、請求項１〜４のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項６】
前記蛍光標識物質の蛍光発色団が６Ａ−Ｏ−４−（１−ピレニル）ブタノイル−６Ｘ−Ｏ−４−（Ｏ−スクシンイミジル）スクシノイル−β−シクロデキストリンである請求項１〜５のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項７】
前記マイクロチャンバの開口の直径が、０．１〜４０μｍである、請求項１〜６のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項８】
前記マイクロチャンバの深さが、１００〜２０００ｎｍである、請求項１〜７のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項９】
前記マイクロチャンバの容積が０．００１〜２５０００ｆＬである、請求項１〜８のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【請求項１０】
前記マイクロチャンバアレイが有するマイクロチャンバの数が、１ｃｍ２あたり１０〜１０１２個である請求項１〜９のいずれか１に記載の標的物質測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−２３３０１０（Ｐ２００８−２３３０１０Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７６６７０（Ｐ２００７−７６６７０）
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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