マイクロ流動化された水中油型乳剤及びワクチン組成物
【課題】抗原の免疫原性を増強するためのワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油型乳剤の提供。
【解決手段】該抗原がウイルス抗原、細菌抗原またはその組み合わせであり、アジュバントがＱｕｉｌＡ、コレステロール、ＧＰＩ−０１００、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム等であるサブミクロン水中油型乳剤。また、該乳剤と内在的または外来的に組み合わされた抗原を含有するワクチン組成物、さらに該乳剤及びワクチンの調製方法。
【解決手段】該抗原がウイルス抗原、細菌抗原またはその組み合わせであり、アジュバントがＱｕｉｌＡ、コレステロール、ＧＰＩ−０１００、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム等であるサブミクロン水中油型乳剤。また、該乳剤と内在的または外来的に組み合わされた抗原を含有するワクチン組成物、さらに該乳剤及びワクチンの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の開示】
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、ワクチン分野に関し、そして具体的には、家畜動物において免疫応答を増強するためのアジュバント処方物に関する。具体的には、本発明は、抗原の免疫原性を増強するための、サブミクロン水中油型乳剤のワクチンアジュバントとしての使用に関する。サブミクロン水中油型乳剤処方物、このような乳剤に取り込まれた抗原を含有するワクチン組成物、ならびに当該の乳剤及びワクチン調製方法が、本発明により提供される。本発明はまた、ワクチンにおける使用に適したサポニン配糖体及びステロールにより形成される複合体を含有する組成物も、提供する。
【０００３】
発明の背景
細菌、ウイルス、寄生虫及びマイコプラズマ感染は、ウシ、ブタ及びペットなどの家畜動物において、幅広く広まっている。これらの感染性因子によって引き起こされる疾患は、多くの場合、抗微生物医薬療法に耐性であり、有効な治療の手段を残さない。結論として、ワクチン学的なアプローチが、家畜動物における感染性疾患を制御するために、ますます用いられている。感染性病原体全体を、化学的不活化または適切な遺伝子操作の後に、ワクチン処方物における使用に適するようにすることが可能である。あるいは、病原体のタンパク質サブユニットを、組換え発現系にて発現させ、そしてワクチン処方物における使用のために精製することが可能である。
【０００４】
アジュバントは、概して、抗原に対する液性及び／または細胞性免疫応答を増加させる任意の材料を指す。従来のワクチンは、死滅した病原性微生物の粗調製物から構成され、そして、病原性微生物の培養に伴う不純物が、免疫応答を増強するためのアジュバントとして作用し得る。しかしながら、病原性微生物の均一な調製物または精製タンパク質サブユニットをワクチン接種用抗原として用いる場合、このような抗原によって引き起こされる免疫は不十分であり、それ故に、アジュバントとしての特定の外因性材料の添加が、必要となってくる。さらに、合成ワクチン及びサブユニットワクチンは、生産コストが高い。したがって、アジュバントを用いると、免疫応答を刺激するために必要とされる投与量がより少量で、それによってワクチンの生産コストが抑えられる可能性がある。
【０００５】
アジュバントは、免疫応答を増強するための多くの異なる経路で作用することが知られている。多くのアジュバントは、免疫応答に関連するサイトカインネットワークを修飾する。これらの免疫調節アジュバントは、それらが抗原と一緒でない場合でさえも、その効果を発揮することが可能である。一般に、免疫調節アジュバントは、特定のサイトカインの一般的な亢進、及び同時に他のサイトカインの低下を引き起こし、細胞性Ｔｈ１及び／または液性Ｔｈ２応答へと導く。
【０００６】
あるアジュバントは、抗原の立体配座の完全性を保存する能を有し、そのために抗原が適切な免疫エフェクター細胞に効率的に提示されることが可能である。アジュバント処方物による抗原の立体配座のこの保存の結果として、ワクチンは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）に関して示されるように、有効期間が増すことになる。Ozel M.ら；Quarternary Structure of the
Immunestimmulating Complex (Iscom), J.of Ultrastruc. and Molec. Struc. Res.
102, 240-248（1989年）。
【０００７】
あるアジュバントは、注射部位にデポー（depot）として抗原を保持する特性を有する。このデポー効果の結果として、抗原は、肝クリアランスによって急速には消失しない。アルミニウム塩及び油中水型乳剤は、このデポー効果を介して、より短期間に作用する。例えば、油中水型乳剤であるフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）を用いることによって、長期のデポーを得ることが可能である。ＦＣＡは、典型的には、抗原提示細胞による抗原の除去が生分解により可能となるまで、注射部位に留まり続ける。
【０００８】
それらの物理的な性質に基づき、アジュバントを、二つの非常に大まかなカテゴリー、すなわち、粒子状アジュバントと非粒子状アジュバントとに分類することが可能である。粒子状アジュバントは、ミクロ粒子として存在する。免疫原は、ミクロ粒子を取り込むか、あるいはそれと会合することが可能である。アルミニウム塩、油中水型乳剤、水中油型乳剤、免疫刺激複合体、リポソーム、ならびにナノ及びミクロ粒子は、粒子状アジュバントの例である。非粒子状アジュバントは、一般には、免疫調節物質であり、そしてこれらは、一般には、粒子状アジュバントと併せて用いられる。ムラミルジペプチド（マイコバクテリアから抽出されるペプチドグリカンのアジュバント活性成分）、非イオン性ブロック共重合体、サポニン（シャボンノキ（Quillaja saponaria）の樹皮から抽出されるトリテルペノイドの複合混合物）、リピドＡ（２個のリン酸基及び５または６個の概してＣ１２〜Ｃ１６長の脂肪酸鎖を有する、グルコサミンの二糖類）、サイトカイン、炭水化物重合体、誘導体化多糖類、ならびに、コレラ毒素及び大腸菌（E. coli）不安定毒素（ＬＴ）などの細菌毒素が、非粒子状アジュバントの例である。
【０００９】
最も知られているアジュバントの一部は、非粒子状免疫調節物質と、デポー効果をアジュバント処方物に授け得る粒子状材料との組み合わせである。例えば、ＦＣＡは、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）成分の免疫調節特性を、油型乳剤の短期デポー効果とともに組み合わせている。
【００１０】
油型乳剤は、ワクチンアジュバントとして長い間使われている。Le Moignic及びPinoyは、1916年に、死滅ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）の鉱油懸濁液が免疫応答を増加させることを、見いだした。これに続き1925年には、Ramonが、スターチ油をジフテリアトキソイドへの抗毒素応答を増大させる物質の一つとして記載した。しかしながら、油型乳剤は、フロイントが現在フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）として公知のアジュバント処方物を公表した1937年まで、一般的にはならなかった。ＦＣＡは、死滅マイコバクテリア及びアラセルＡと混合された鉱（パラフィン）油から構成される、油中水型乳剤である。アラセルＡは、主にマンニドモノオレエートであり、そして乳化剤として用いられる。ＦＣＡは、抗体応答の誘導に優れているにもかかわらず、重度の疼痛、膿瘍形成、発熱及び肉芽腫性炎症を引き起こす。これらの望ましくない副作用を避けるために、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が開発された。ＩＦＡは、マイコバクテリア成分がないことを除けば、ＦＣＡとその組成が類似している。ＩＦＡは、注射部位におけるデポー形成、及び抗体産生細胞の刺激による抗原の徐放を介して、作用する。
【００１１】
ＦＣＡを改善するための別のアプローチは、鉱油を生体適合性の油により置き換えることが、注射部位におけるＦＣＡに関連する反応を除去するのに役立つであろうとの概念に基づいた。乳剤は油中水型乳剤よりもむしろ水中油型乳剤であるべきとも、前者が長期間持続するデポーを注射部位に作り出すことから、考えられていた。Hillemanらは、ピーナツ油８６％、乳化剤としてのアラセルＡ １０％、及び安定剤としてのモノステアリン酸アルミニウム４％からなる油性アジュバント「アジュバント６５」について記載した。Hilleman, 1966年、Prog. Med. Virol. 8：131-182；Hilleman及びBeale,
1983年、New Approaches to Vaccine Development（Bell, R.及びTorrigiani, G.編集）中、Schwabe, Basel。ヒトにおいて、アジュバント６５は安全かつ強力であったが、しかしＩＦＡよりも低いアジュバント活性を示した。それにもかかわらず、アジュバント６５の使用は、特定ロットのヒトに対するワクチンでの反応原性、及び精製もしくは合成乳化剤がアラセルＡの代わりに用いられる場合のアジュバント活性の低減により、中止された。米国特許第5,718,904及び第5,690,942は、安全性プロファイルを改善する目的で、水中油型乳剤中の鉱油を代謝可能な油に置き換えることが可能であることを、教示している。
【００１２】
アジュバント活性及び安全性の他に、乳剤の物理的外観もまた、市販のために考慮すべき重要なことである。物理的外観は、乳剤の安定性に依存する。クリーミング、沈降及び癒合は、乳剤の不安定さの指標である。クリーミングは、乳剤の油相と水相とが異なる比重である場合に生じる。クリーミングはまた、乳剤の初期の液滴サイズが大きく、かつ乳剤の液滴が全くブラウン運動をしていない場合にも、生じる。液滴サイズが大きい場合、界面が破裂する傾向があり、そして液滴が大きな粒子に癒合する。乳剤の安定性は、用いられる乳化剤の性質及び量、乳剤中での液滴サイズのサイズ、ならびに油相と水相との間の密度の差異などの多数の要因によって決まる。
【００１３】
乳化剤は、界面の自由エネルギーを低減し、そして液滴の癒合に対する物理的もしくは静電気的なバリアを作り出すことによって、分散している液滴の安定性を促進する。非イオン性及びイオン性界面活性剤は、乳化剤として使用されている。非イオン性乳化剤は、界面にて配向し、そして比較的分厚い構造を作り出すが、このことにより分散している液滴が立体的に回避される。陰イオンもしくは陽イオン乳化剤は、対イオンをひきつけることによって電気二重層の形成を誘導し；二重層の反発力は、液滴を、それらが接近するときに互いに反発させる。
【００１４】
乳化剤を用いる他に、乳剤の安定性は、機械的な手段によって乳剤の液滴サイズを低減することによっても、達成可能である。典型的には、プロペラミキサー、タービンローター、コロイドミル、ホモジナイザー及びソニケーターが、乳剤を製造するために用いられている。マイクロ流動化は、乳剤における液滴サイズの均一性を増加させる別の方法である。マイクロ流動化は、サブミクロン範囲の一定した粒子サイズの繊細で物理的に安定な乳剤を作り出すことが可能である。乳剤の安定性を増加させる他に、マイクロ流動化の過程は、最終産物の無菌性を確実にする好ましい方法である最終ろ過を可能とする。その上、サブミクロンの油粒子は、注射部位からリンパ管へ入り、次いでドレナージ連鎖のリンパ節、血液及び脾臓を通ることが可能である。このことは、局所的炎症及び有意な注射部位反応を作り出す可能性のある油のデポーを注射部位に確立する可能性を低減する。
【００１５】
マイクロ流動化装置は、現在、市販されている。乳剤の形成は、マイクロ流動化装置において、相互作用チャンバー内で二つの流動化された流れが高速で相互作用するときに生じる。マイクロ流動化装置は、空気または窒素を駆動し、そして過剰の２０，０００ｐｓｉの内部圧力にて動作することが可能である。米国特許第4,908,154は、いかなる乳化剤も本質的に含まない乳剤を得るためのマイクロ流動化装置の使用を、教示している。
【００１６】
多数のサブミクロン水中油型アジュバント処方物が、文献に記載されている。米国特許第5,376,369は、Syntaxアジュバント処方物（ＳＡＦ）として公知のサブミクロン水中油型乳剤アジュバント処方物を、教示している。ＳＡＦは、油成分としてのスクアレンまたはスクアラン、乳剤を形成する量のPluronic L121（ポリオキシ−プロピレン−ポリオキシエチレン）ブロック重合体、及び免疫を増強する量のムラミルジペプチドを、含有する。スクアレンは、多くの組織中（特に、サメ及び他の魚類の肝臓中）に見いだされる、コレステロールの直線状の炭化水素前駆体である。スクアランは、スクアレンの水素添加により調製され、かつ完全に飽和している。スクアレンとスクアランの双方は、代謝されることが可能であり、そして毒性学試験の成績は良好である。スクアレンもしくはスクアラン乳剤は、ヒト癌ワクチンにおいて使用され、軽度の副作用及び望ましい有効性を伴う。例えば、Anthony C. Allison, 1999年、Squalene and
Squalane emulsions as adjuvants, Methods 19:87-93を参照されたい。
【００１７】
米国特許第6,299,884及び国際特許公報WO 90/14837は、ポリオキシ−プロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体がサブミクロン水中油型乳剤の形成に必須ではないことを、教示している。その上、これらの参考文献は、非毒性の代謝可能な油の使用を教示し、そして鉱油及び毒性石油蒸留油のその乳剤処方物における使用を明確に除外している。
【００１８】
米国特許第5,961,970は、ワクチンアジュバントとして用いられるさらに別のサブミクロン水中油型乳剤を教示している。本特許に記載される乳剤において、疎水性成分は、中鎖トリグリセリド油、植物油及びその混合物からなる群より選択される。この乳剤に含まれる界面活性剤は、リン脂質（例えば、レシチン）などの天然の生物学的に適合性の界面活性剤、あるいはＴＷＥＥＮ−８０などの医薬的に許容可能な非天然の界面活性剤であることが可能である。この特許はまた、乳剤を形成するときに抗原を乳剤中へ取り込むことを教示しており、乳剤を独立的かつ外来的に形成した後に抗原を乳剤と混合するのとは対照的である。
【００１９】
米国特許第5,084,269は、鉱油と組み合わせてレシチンを含有するアジュバント処方物が、宿主動物内での刺激を減少させ、そして同時に全身性免疫の増加を誘導することを、教示している。米国特許第5,084,269から得られたアジュバント処方物は、商品名ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）で、動物用ワクチンにおいて商業的に用いられている。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物は、ミセル−レシチンに囲まれた油滴で構成される。これらのミセルは、従来の油に基づくアジュバントよりも多くの全細胞抗原の付着を可能にする。その上、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）に基づくワクチン処方物は、典型的には１０％〜２０％の油を含有する油アジュバントを含有する他のワクチン処方物と比較して、２．５〜５％の鉱油と、低い油量を含有する。この低い油量が、このアジュバントに基づくワクチン処方物の注射部位組織に対する刺激を低下させて、屠殺時により少ない病変及びより少ないトリムを生じる。加えて、油滴を囲んでいるレシチン被覆は、注射部位反応をさらに低減し、安全かつ有効なワクチンをもたらす。
【００２０】
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物は、多数の動物用ワクチンにおいてアジュバントとして用いられ、そしてワクチン製品の物理的外観は、短期及び長期の保管期間中ならびに再構成時に維持される必要がある。加えて、凍結乾燥させた抗原を、予め調製しておいたアジュバント処方物と、注射直前に混合する。この実行は、水中油型乳剤内での抗原の均一な分布を必ずしも確実にするわけではなく、そして乳剤の外観は望ましくない可能性がある。その上、均質化された乳剤は、静置すると相分離を示し得る。したがって、長期の有効期間に相分離を示さない安定なアジュバント処方物の必要性が存在する。相分離を防ぐ一つの方法は、液滴サイズを小さくし、そして乳剤の粒子均一性を増加させることである。代謝可能な油性乳剤処方物のマイクロ流動化の過程が文書化されているものの、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物などの水中油型乳剤のマイクロ流動化は、まだ実行されていない。
【００２１】
本発明では、マイクロ流動化を、レシチンに囲まれた鉱油の液滴サイズをサブミクロンサイズにするために用いている。予想外にも、本発明者は、レシチンと油との混合物からなる水中油型乳剤をアジュバントとして添加したワクチン処方物のマイクロ流動化が、処方物の物理的外観を改善するだけでなく、処方物の免疫化効果も増強することを、発見した。マイクロ流動化された処方物はまた、改善された安全性プロファイルによっても特徴付けられる。
【００２２】
発明の概要
本発明者は、代謝可能でない油に基づく水中油型乳剤のアジュバント活性及び安全性プロファイルが、マイクロ流動化を介して改善可能であることを、予想外にも発見した。マイクロ流動化された乳剤に取り込まれた抗原は、抗原をマイクロ流動化の前に乳剤中に内在的に取り込む場合でも、安定である。
【００２３】
したがって、一実施態様において、本発明は、ワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油型乳剤処方物を提供する。本発明のサブミクロン水中油型乳剤は、代謝可能でない油、少なくとも一つの界面活性剤、及び水溶性成分から構成され、ここで油は、サブミクロン範囲の平均の油滴サイズで水溶性成分中に分散している。好ましい代謝可能でない油は、軽質鉱油である。好ましい界面活性剤としては、レシチン、ＴＷＥＥＮ（商標登録）−８０及びＳＰＡＮ（商標登録）−８０が挙げられる。
【００２４】
本発明により提供される好ましい水中油型乳剤は、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物から構成される。
本発明の水中油型乳剤は、保存剤、浸透圧剤、生体接着分子及び免疫刺激分子などの適切かつ望ましい成分をさらに含むことが可能である。好ましい免疫刺激分子としては、例えば、Ｑｕｉｌ
Ａ、コレステロール、ＧＰＩ−０１００、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）が挙げられる。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、サブミクロン水中油型乳剤の調製方法を提供する。本発明によると、油、１またはそれより多くの界面活性剤、水溶性成分、及び乳剤における使用に適した任意の他の成分を始めとする乳剤の種々の成分を、混ぜ合わせる。該混合物を最初の乳化過程にかけて、水中油型乳剤を形成し、次いでこれをマイクロ流動化装置に通して、液滴が直径１ミクロン未満、好ましくは平均液滴サイズ０．５ミクロン未満の水中油型乳剤を得る。
【００２６】
さらに別の実施態様において、本発明は、抗原及び上述のサブミクロン水中油型乳剤を含有するワクチン組成物を提供する。抗原は、外来的あるいは内在的に、好ましくは内在的に、乳剤中に取り込まれている。
【００２７】
本発明のワクチン組成物に含まれることが可能な抗原は、細菌、真菌またはウイルスの抗原、あるいはその組み合わせであることが可能である。該抗原は、不活化した細胞またはウイルスの全体または一部の調製物の形態を取るか、あるいは慣用のタンパク質精製、遺伝子操作技術または化学合成によって得られる抗原分子の形態を取ることが可能である。
【００２８】
さらなる実施態様において、本発明は、抗原（単数または複数）をサブミクロン水中油型乳剤と組み合わせて含有するワクチン組成物の調製方法を、提供する。
本発明のワクチン組成物を調製する際に、抗原を、内在的（例えば、マイクロ流動化の前に）あるいは外来的（例えば、マイクロ流動化の後に）に水中油型乳剤の成分と組み合わせることが可能である。
【００２９】
さらに別の実施態様において、本発明は、マイクロカプセル化された抗原及び上述のサブミクロン水中油型乳剤を含有し、ここでマイクロカプセル化された抗原が乳剤と外来的に組み合わされているワクチン組成物を、提供する。
【００３０】
サポニンとステロールが、溶液中で組み合わされる場合に、互いに会合して、らせん状ミセルの形状の複合体を形成することもまた、驚くべきことに発見された。本発明によると、これらのらせん状ミセル複合体は、免疫刺激活性を有し、そしてワクチン組成物におけるアジュバントとして特に有用である。
【００３１】
したがって、本発明は、サポニン及びステロールを含有し、ここでサポニンとステロールがらせん状ミセルの形状の複合体を形成しているワクチン組成物を、提供する。本発明はまた、サポニン、ステロール及び抗原を含有し、ここでサポニンとステロールがらせん状ミセルの形状の複合体を形成し、そして該抗原がらせん状ミセルと混合されているが、しかしその内部には取り込まれていない組成物も、提供する。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明者は、レシチンと鉱油との混合物からなる水中油型乳剤をアジュバントとして添加したワクチン処方物のマイクロ流動化が、ワクチン処方物の物理的外観を改善するばかりでなく、ワクチン処方物の免疫化効果も増強することを、予想外にも発見した。マイクロ流動化されたワクチン処方物は、改善された安全性プロファイルによっても特徴付けられる。
【００３３】
これらの発見に基づき、本発明は、ワクチン組成物におけるアジュバントとして有用なサブミクロン水中油型乳剤を提供する。これらのサブミクロン水中油型乳剤をマイクロ流動化装置を用いることによって作る方法もまた、提供される。さらに、本発明は、抗原がサブミクロン水中油型乳剤と組み合わされているサブミクロンワクチン組成物を、提供する。このようなワクチン組成物を作るための方法もまた、提供される。本発明は、サブミクロン水中油型乳剤と組み合わせてマイクロカプセル化された抗原を含有するワクチン組成物、ならびにこのようなワクチンを作るための方法を、さらに提供する。
【００３４】
開示を明確にし、かつ限定しない目的で、発明の詳細な説明を、本発明の特定の特徴、実施態様または応用について記載または例示する以下のサブセクションに分割する。
サブミクロン水中油型乳剤
一実施態様において、本発明は、ワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油型乳剤処方物を提供する。本発明のサブミクロン水中油型乳剤は、ワクチン組成物における抗原の免疫原性を増強し、動物への投与に安全であり、かつ保管中は安定である。
【００３５】
本発明のサブミクロン水中油型乳剤は、代謝可能でない油、少なくとも一つの界面活性剤、及び水溶性成分から構成され、ここで油は、サブミクロン範囲の平均的な油滴サイズで水溶性成分中に分散している。
【００３６】
「サブミクロン」は、液滴が１μｍ（ミクロン）未満のサイズで、かつ平均の（average）または平均（mean）油滴サイズが１μｍ未満であることを意味する。好ましくは、乳剤の平均液滴サイズは、０．８μｍ未満；より好ましくは０．５μｍ未満；そしてよりいっそう好ましくは０．４μｍ未満、または約０．１〜０．３μｍ未満である。
【００３７】
「平均液滴サイズ」は、粒子サイズの体積分布内での体積平均径（ＶＭＤ）の粒子サイズとして定義される。ＶＭＤは、各粒子の直径をそのサイズの全粒子の体積とかけ合わせ、そして合計することにより、算出される。次いで、これを全粒子の総体積で割る。
【００３８】
「代謝可能でない油」の語は、本明細書では、乳剤が投与される動物個体の体により代謝されることが可能でない油を指す。
「動物」及び「動物個体」の語は、本明細書では、例えばウシ、ヒツジ及びブタを始めとする、すべてのヒトでない動物を指す。
【００３９】
本発明の乳剤における使用に適した代謝可能でない油としては、アルカン、アルケン、アルキン、ならびにそれに対応する酸及びアルコール、そのエーテル及びエステル、ならびにその混合物が挙げられる。好ましくは、油の個々の化合物は、軽質炭化水素化合物であって、すなわち、このような成分は６〜３０個の炭素原子を有する。油は、合成的に調製されるか、または石油生成物から精製されることが可能である。本発明の乳剤における使用に好ましい代謝可能でない油としては、例えば、鉱油、パラフィン油及びシクロパラフィンが挙げられる。
【００４０】
「鉱油」の語は、蒸留技術によってペトロラタムから得られる液体炭化水素の混合物を指す。該語は、「液化パラフィン」、「液体ペトロラタム」及び「白色鉱油」と同義である。該語はまた、「軽質鉱油」、すなわち、ペトロラタムの蒸留により同様に得られるが、ただし白色鉱油よりもわずかに低い比重である油を含むことも、意図する。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版（Easton、ペンシルバニア州：Mack Publishing Company,
1990年、788頁及び1323頁）を参照されたい。鉱油は、例えばJ.T. Baker（Phillipsburg、ペンシルバニア州）、USB Corporation（クリーブランド、オハイオ州）などの種々の市販元から得ることが可能である。好ましい鉱油は、ＤＲＡＫＥＯＬ（商標登録）の名前で市販されている軽質鉱油である。
【００４１】
典型的には、本発明のサブミクロン乳剤の油成分は、１％〜５０％容量の量；好ましくは、１０％〜４５の量；より好ましくは、２０％〜４０％の量で、存在する。
本発明の水中油型乳剤は、典型的には、少なくとも一つ（すなわち、１またはそれより多く）の界面活性剤を含む。界面活性剤及び乳化剤（本明細書ではこれらの語を同義的に用いる）は、油滴の表面を安定化し、そして所望のサイズ内に油滴を維持する剤である。
【００４２】
本発明の乳剤における使用に適した界面活性剤としては、天然の生物学的に適合性の界面活性剤、及び非天然の合成界面活性剤が挙げられる。生物学的に適合性の界面活性剤としては、リン脂質化合物またはリン脂質の混合物が挙げられる。好ましいリン脂質は、大豆もしくは卵レシチンなどのホスファチジルコリン（レシチン）である。レシチンは、粗植物油を水で洗浄し、そして得られた含水ゴムを分離及び乾燥することにより、ホスファチドとトリグリセリドの混合物として得られることが可能である。精製された生成物は、トリグリセリド及び植物油をアセトン洗浄により除去した後に残留する、アセトン不溶性リン脂質及び糖脂質の混合物を分画することにより、得られることが可能である。あるいは、レシチンを、種々の市販元から得ることが可能である。他の適切なリン脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。リン脂質は、天然源から単離されても、または慣用的に合成されてもよい。
【００４３】
本発明のサブミクロン乳剤における使用に適した非天然の合成界面活性剤としては、例えば脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤（ＳＰＡＮ（商標登録）またはＡＲＬＡＣＥＬ（商標登録）の名前で市販されている）などのソルビタンに基づく非イオン性界面活性剤、ポリエトキシ化ソルビトールの脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ（商標登録））、ヒマシ油などの源から得られる脂肪酸のポリエチレングリコールエステル（ＥＭＵＬＦＯＲ）；ポリエトキシ化脂肪酸（例えば、ＳＩＭＵＬＳＯＬ
Ｍ−５３の名前で入手可能なステアリン酸）、ポリエトキシ化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒド重合体（ＴＹＬＯＸＡＰＯＬ）、ポリオキシエチレン脂肪酸アルコールエーテル（ＢＲＩＪ（商標登録））；ポリオキシエチレンノンフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標登録）Ｎ）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標登録）Ｘ））が挙げられる。好ましい合成界面活性剤は、ＳＰＡＮ（商標登録）及びＴＷＥＥＮ（商標登録）の名前で入手可能な界面活性剤である。
【００４４】
本発明の水中油型乳剤における使用のための好ましい界面活性剤としては、レシチン、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＳＰＡＮ−８０が挙げられる。
一般的には、界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせ（２またはそれより多くの界面活性剤が用いられる場合）は、０．０１％〜１０％容量、好ましくは０．１％〜６．０％、より好ましくは０．２〜５．０％の量にて、乳剤中に存在する。
【００４５】
水溶性成分は、乳剤の連続相を構成し、そして水、緩衝生理食塩液または任意の他の適切な水溶液であることが可能である。
本発明の水中油型乳剤は、保存剤、浸透圧剤、生体接着分子及び免疫刺激分子を始めとする適切かつ望ましい成分を、さらに含むことが可能である。
【００４６】
生体接着分子は、標的粘膜表面での、またはこれを介した抗原の送達及び付着を増強し、粘膜免疫を授与することが可能であると考えられている。適切な生体接着分子の例としては、ポリアクリル酸及びポリメタクリル酸（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標登録）、ＣＡＲＢＯＭＥＲ）などの、天然に生じるものではない酸性重合体；カルボキシメチルセルロースなどの合成的に修飾された酸性の天然重合体；（ヒドロキシプロピル）メチルセルロースなどの合成的に修飾された中性の天然重合体；キトサンなどの塩基性アミン保有重合体；アルギニン酸、ヒアルロン酸、ペクチン、トラガカントゴム及びカラヤゴムなどの天然源から得ることが可能な酸性重合体；ならびに、ポリビニルアルコールなどの天然に生じるものではない中性重合体；あるいはその組み合わせが挙げられる。
【００４７】
「免疫刺激分子」の語句は、本明細書では、ワクチン組成物中の抗原性成分によって誘導される防御免疫応答を増強するこれらの分子を指す。適切な免疫刺激材料としては、細菌細胞壁成分（例えば、ムラブチド、トレオニル−ＭＤＰ及びムラミルトリペプチドなどのＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン誘導体）；サポニン配糖体及びその誘導体（例えば、Ｑｕｉｌ
Ａ、ＱＳ ２１及びＧＰＩ−０１００）；コレステロール；ならびに、第四級アンモニウム化合物（例えば、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）及びＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（「アブジリン」））が挙げられる。
【００４８】
サポニンは、多様な植物種において二次代謝産物として産生される配糖体化合物である。サポニンの化学構造は、強力かつ効果的な免疫学的活性を始めとする、幅広い薬理学的及び生物学的活性を授ける。
【００４９】
構造的には、サポニンは、１またはそれより多くの糖鎖に付着している任意のアグリコンからなる。サポニンは、そのアグリコン組成によって分類されることが可能である：トリテルペン配糖体、ステロイド配糖体及びステロイドアルカロイド配糖体。
【００５０】
サポニンは、シャボンノキ（Quillaja saponaria）の樹皮から単離されることが可能である。サポニンは、免疫刺激剤として長く知られてきた。Dalsgaard, K.、「Evaluation of its adjuvant
activity with a special reference to the application in the vaccination of
cattle against foot-and-mouth disease」、Acta. Vet.
Scand. 69:1-40、1978年。サポニンを含有する植物の粗抽出物は、足口病ワクチンの効力を増強した。しかしながら、該粗抽出物は、ワクチンにおいて用いられた場合に副作用を伴った。これに続き、Dalsgaardは、サポニン由来のアジュバント活性成分を、透析、イオン交換及びゲルろ過クロマトグラフィによって部分精製した。Dalsgaard, K.ら、「Saponin adjuvants III.
Isolation of a substance from Quillaja saponaria Morina with adjuvant activity in
foot-and-mouth disease vaccines」、Arch. Gesamte.
Virusforsch. 44:243-254、1974年。この方法にて精製されたアジュバント活性成分は、「Ｑｕｉｌ
Ａ」として公知である。重量に基づくと、粗サポニンと比較した場合に、Ｑｕｉｌ Ａは効力の増加を示し、かつ局所反応を低減した。Ｑｕｉｌ Ａは、動物用ワクチンにおいて広く用いられている。
【００５１】
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によるＱｕｉｌ Ａのさらなる分析によって、密接に関連するサポニンの不均一な混合物が示され、そして毒性が低減したかまたは最小限の強力なアジュバントであるＱＳ２１の発見が導びかれた。Kensil C.R.ら、「Separation and
characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria
Molina cortex」、J. Immunol. 146:431-437、1991年。ほとんどの他の免疫刺激剤とは異なり、ＱＳ２１は、水溶性で、かつ乳剤型処方物の有無にかかわらずワクチンにおいて使用可能である。ＱＳ２１は、マウスにおいてＴｈ１型応答を誘発し、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ抗体の産生を刺激し、そしてサブユニット抗原に応答して抗原特異的ＣＤ８＋
ＣＴＬ（ＭＨＣクラスＩ）を誘導することが、示されている。ヒト臨床試験では、許容可能な毒性学的プロファイルを伴うそのアジュバント活性が、証明された。Kensil, C.R.ら、「Structural and imunological
charaterization of the vaccine adjuvant QS-21. In Vaccine Design: the subunit
and Adjvuant Approach」、Powell, M.F.及びNewman, M. J.編集、Plenum Publishing
Corporation、ニューヨーク州、1995年、525〜541頁。
【００５２】
米国特許第6,080,725は、サポニン−リポフィル（lilpophile）結合体の作製方法及び使用方法を教示している。このサポニン−リポフィル結合体では、脂質、脂肪酸、ポリエチレングリコールまたはテルペンなどのリポフィル部分が、アシル化されていないかまたはデスアシル化されたトリテルペンサポニンと、トリテルペンサポニンの３−Ｏ−グルクロン酸上に存在するカルボキシ基を介して共有結合している。リポフィル部分と、Quillajaデスアシルサポニンなどのサポニン、lucyoside P、またはGypsophila属、saponaria属及びAcanthophyllum属由来サポニンの３−Ｏ−グルクロン酸との結合は、液性免疫及び細胞を介した免疫へのそのアジュバント効果を増強する。加えて、リポフィル部分と非アシルもしくはデスアシルサポニンの３−Ｏ−グルクロン酸残基との結合は、元のサポニンよりも精製し易く、低毒性で、化学的に安定で、かつ同等または優れたアジュバント特性を有するサポニン類似体を、もたらす。
【００５３】
ＧＰＩ−０１００は、米国特許第6,080,725に記載されるサポニン−リポフィル結合体である。ＧＰＩ−０１００は、脂肪族アミンをグルクロン酸のカルボキシル基を介してデスアシルサポニンに付加することにより、生成される。
【００５４】
第四級アンモニウム化合物−多数の脂肪族窒素含有塩基が、アミン、第四級アンモニウム化合物、グアニジン、ベンズアミジン及びチオウロニウムを始めとする免疫学的アジュバントとしての使用を提唱されている。具体的なこのような化合物としては、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）及びＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（「アブジリン」）が挙げられる。
【００５５】
米国特許第5,951,988は、油成分と併せてＤＤＡなどの第四級アンモニウム塩を含有するアジュバント処方物を、教示する。この処方物は、免疫原性応答を増強するために公知の免疫学的物質（例えばワクチン組成物中のウイルスもしくは細菌抗原）と併せて、有用である。該組成物は、非特異的な免疫刺激処方物として、取り込まれた抗原がなくても有用である。
【００５６】
米国特許第4,310,550は、ワクチンアジュバントとして脂肪もしくは脂質乳剤とともに処方物化したＮ，Ｎ−高級アルキル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン及びＮ，Ｎ−高級アルキル−キシリレンジアミンの使用を、記載している。ヒトまたは動物においてアジュバント処方物の非経口投与を介して抗原の免疫原性応答を誘導または増強する方法は、米国特許第4,310,550に記載されている。
【００５７】
好ましい実施態様において、本発明は、液滴サイズが１μｍ未満であり、かつ平均液滴サイズが約０．２５μｍのＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物から構成される、ワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油型乳剤を提供する。
【００５８】
「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物」の語は、本明細書では、ＤＲＡＫＥＯＬ（商標登録）レシチン油溶液（Hydronics社、リンカーン、ネブラスカ州）と生理食塩溶液とをＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０の存在下で混合することによって形成される溶液を、指す。典型的なＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物は、軽質鉱油４０％容量（ｖ／ｖ）、レシチン約２５％ｗ／ｖ、ＴＷＥＥＮ
８０ 約０．１８％容量（ｖ／ｖ）及びＳｐａｎ ８０ 約０．０８％容量（ｖ／ｖ）を含有する。
【００５９】
サブミクロン水中油型乳剤の調製方法
別の実施態様において、本発明は、上述のサブミクロン水中油型乳剤の調製方法を提供する。
【００６０】
本発明によると、油、１またはそれより多くの界面活性剤、水溶性成分、及び乳剤における使用に適した任意の他の成分を始めとする乳剤の種々の成分を、組み合わせ、そして混ぜ合わせる。
【００６１】
形成された混合物を、典型的には１もしくはそれより多くのホモジナイザーまたは乳化装置に１回以上通すことによる乳化過程にかけて、均一な外観及び約０．５μｍの平均の液滴サイズの水中油型乳剤を形成する。例えばRoss乳化装置（Hauppauge、ニューヨーク州）、Gaulinホモジナイザー（Everett、マサチューセッツ州）などの市販されている任意のホモジナイザー及び乳化装置を、本目的のために用いることが可能である。
【００６２】
次いで、このように形成された乳剤を、マイクロ流動化にかけて、サブミクロン範囲の液滴サイズをもたらす。マイクロ流動化は、Microfluidics社（ニュートン、マサチューセッツ州）から入手可能なモデル番号１１０Ｙ；Gaulinモデル３０ＣＤ（Gaulin, Inc.、Everett、マサチューセッツ州）；及びRainnie Minilab ８．３０Ｈ型（Miro Atomizer Food and Dairy, Inc.、ハドソン、ウィスコンシン州）などの市販のマイクロ流動化装置の使用によって、行うことが可能である。これらのマイクロ流動化装置は、二つの液流が相互作用チャンバー内で高速で相互作用して液滴がサブミクロンサイズの乳剤を形成するように、小さな開口部を介して高圧下で液体を強引に通すことによって、動作する。
【００６３】
液滴サイズは、例えばレーザー回折、市販の定寸装置の使用によるなどの当該技術分野において公知の多様な方法によって、測定することが可能である。サイズは、用いる界面活性剤の種類、油に対する界面活性剤の割合、動作圧、温度等に応じて異なってもよい。当業者は、過度の実験を行うことなく所望の液滴サイズの乳剤を得るために、これらのパラメータの所望の組み合わせを決定することが可能である。本発明の乳剤の液滴サイズは、直径１μｍ未満、好ましくは平均液滴サイズ０．８μｍ未満、そしてより好ましくは平均液滴サイズ０．５μｍ未満、そしてよりいっそう好ましくは平均液滴サイズ０．３μｍ未満である。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様において、Hydronics社（リンカーン、ネブラスカ州）から市販され、そして軽質鉱油中に２５％のレシチンを含有するＤＲＡＫＥＯＬレシチン油溶液を、生理食塩液、ならびに界面活性剤であるＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０と組み合わせ、そして混合して、「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）溶液」または「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物」を形成する。次いで、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）溶液をRoss（商標登録）（Hauppauge、ニューヨーク州、11788）乳化装置でおよそ３４００ｒｐｍにて乳化して、水中油型乳剤を形成する。続いて、乳剤を、約４５００±５００ｐｓｉで動作しているマイクロ流動化装置に、一度通す。マイクロ流動化された水中油型乳剤は、１μｍ未満のサイズの液滴を有し、平均液滴サイズ約０．２５μｍである。
【００６５】
サブミクロン水中油型乳剤に取り込まれた抗原を含有する、ワクチン組成物
別の実施態様において、本発明は、抗原及び上述のサブミクロン水中油型乳剤を含有するワクチン組成物を、提供する。これらのワクチン組成物は、増強された免疫原性効果及び改善された物理的外観を有することによって、特徴付けられる（例えば、長期の保管後に相分離が認められない）。加えて、本発明のワクチン組成物は、動物への投与に関して安全である。
【００６６】
本発明によると、抗原を、外来的に、また好ましくは内在的に乳剤と組み合わせることが可能である。「内在的に」の語は、マイクロ流動化工程の前に抗原を乳剤成分と組み合わせる過程を指す。「外来的に」の語は、乳剤をマイクロ流動化した後に抗原を乳剤に添加する過程を指す。外来的に添加された抗原は、遊離抗原であることが可能であり、あるいは以下にさらに記載するように、ミクロ粒子中にカプセル化されることが可能である。
【００６７】
「抗原」の語は、本明細書では、動物において免疫原性であって、かつワクチン組成物が投与される動物において防御免疫応答を誘発するためにワクチン組成物中に含まれる、任意の分子、化合物または組成物を指す。
【００６８】
抗原に関連して用いられる「免疫原性」の語は、動物において抗原に対する免疫応答を誘発する抗原の能を指す。該免疫応答は、細胞性Ｔ細胞によって主に媒介される細胞性免疫応答、あるいは次にＢ細胞を活性化して抗体産生へと導く、ヘルパーＴ細胞によって主に媒介される液性免疫応答であることが可能である。
【００６９】
「防御免疫応答」は、抗原または抗原を含有する病原体により引き起こされる障害もしくは疾患の発生を防ぐかまたは検出可能に低下させるか、あるいはその重症度を除くかまたは検出可能に低減するか、あるいはその進行速度を検出可能に遅くする、動物において生じる、抗体または細胞のいずれかを介した免疫応答あるいはその双方である任意の免疫応答として、定義される。
【００７０】
本発明のワクチン組成物に含まれることが可能な抗原としては、不活化した細胞の全体または一部の調製物の形態、あるいは慣用のタンパク質精製、遺伝子操作技術または化学合成によって得られる抗原分子の形態の、Mycoplasma hyopneumoniae、Haemophilus somnus、Haemophilus parasuis、Bordetella
bronchiseptica、Actinobacillus pleuropneumonie、Pasteurella multocida、Manheimia hemolytica、Mycoplasma bovis、Mycoplasma galanacieum、Mycobacterium bovis、Mycobacterium
paratuberculosis、クロストリジウム属、Streptococcus uberis、Streptococcus suis、Staphylococcus aureus、Erysipelothrix rhusopathiae、カンピロバクター属、Fusobacterium
necrophorum、大腸菌、Salmonella enterica serovars、レプトスピラ属などの病原性細菌；カンジダなどの病原性真菌；Cryptosporidium parvum、Neospora canium、Toxoplasma gondii、エイメリア属などの原虫； Ostertagia、Cooperia、Haemonchus、Fasciolaなどの蠕虫から調製される抗原が、挙げられる。抗原としては、さらに、不活化した細胞の全体または一部の調製物の形態、あるいは慣用のタンパク質精製、遺伝子操作技術または化学合成によって得られる抗原分子の形態の、ウシヘルペスウイルス−１、３、６、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）１型及び２型、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシ白血病ウイルス、牛疫ウイルス、足口病ウイルス、狂犬病、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ブタパルボウイルス、ＰＲＲＳウイルス、ブタサーコウイルス、インフルエンザウイルス、ブタ水疱病ウイルス、Ｔｅｃｈｅｎ熱ウイルス、仮性狂犬病ウイルスなどの病原性ウイルスが、挙げられる。
【００７１】
抗原の量は、水中油型乳剤と組み合わせた抗原が、動物において防御免疫応答を誘導するのに有効なようであるべきである。有効となる正確な抗原の量は、抗原の性質、活性及び純度に依存し、そして当業者により決定されることが可能である。
【００７２】
ワクチン組成物中に存在する水中油型乳剤の量は、ワクチン組成物中の抗原の免疫原性を増強するのに十分であるべきである。望ましくかつ適切な場合には、界面活性剤の追加量または追加の界面活性剤を、水中油型乳剤により供される界面活性剤に加えて、ワクチン組成物中に加えることが可能である。一般的に言えば、油成分は、ワクチン組成物の最終容量において、１．０％〜２０％容量の量；好ましくは、１．０％〜１０％の量；より好ましくは、２．０％〜５．０％の量にて存在する。界面活性剤（単数）、あるいは２またはそれより多くの界面活性剤を用いる場合、界面活性剤の組み合わせは、ワクチン組成物の最終容量において、０．１％〜２０％容量、好ましくは０．１５％〜１０％、より好ましくは０．２％〜６．０％の量にて存在する。
【００７３】
抗原及び水中油型乳剤に加えて、ワクチン組成物は、水中油型乳剤に関連して上述のように、保存剤、浸透圧剤、生体接着分子及び免疫刺激分子（例えば、Ｑｕｉｌ
Ａ、コレステロール、ＧＰＩ−０１００、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ））などの適切かつ所望の他成分を含むことが可能である。
【００７４】
本発明のワクチン組成物は、獣医学的に許容可能（veterinarily-acceptable）なキャリアーもまた含むことが可能である。「獣医学的に許容可能なキャリアー」の語には、任意及びすべての溶媒、分散媒体、被覆、アジュバント、安定剤、希釈剤、保存剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤等が含まれる。希釈剤としては、水、生理食塩液、ブドウ糖、エタノール、グリセロール等が挙げられてよい。等張剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが挙げられてよい。安定剤としては、とりわけ、アルブミンが挙げられる。
【００７５】
好ましい実施態様において、本発明は、１μｍ未満のサイズの液滴、好ましくは０．８μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満の平均液滴サイズ、及びよりいっそう好ましくは約０．５μｍの平均液滴サイズの水中油型乳剤中に内在的に取り込まれている、ＢＶＤＶ Ｉ型またはＢＶＤＶ ＩＩ型抗原のうち少なくとも一つを含むワクチン組成物を、提供する。ＢＶＤＶ
Ｉ型及び／またはＩＩ型抗原は、好ましくは、不活化ウイルス調製物の形態である。サブミクロン水中油型乳剤は、好ましくは、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物（すなわち、軽質鉱油、レシチン、ＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０を含有する処方物）から構成される。
【００７６】
別の好ましい実施態様において、本発明は、レプトスピラ抗原、及びＢＶＤＶ Ｉ型またはＢＶＤＶ ＩＩ型抗原のうち少なくとも一つを水中油型乳剤中に含むワクチン組成物を、提供する。好ましくは不活化した細胞もしくはウイルス調製物の形態である抗原は、
１μｍ未満のサイズの液滴、好ましくは０．８μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満の平均液滴サイズ、及びよりいっそう好ましくは約０．５μｍの平均液滴サイズの水中油型乳剤中に内在的に取り込まれている。サブミクロン水中油型乳剤は、好ましくは、ＡＭＰＨＩＧＥＮ処方物（すなわち、軽質鉱油、レシチン、ＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０を含有する処方物）から構成される。該ワクチン組成物は、好ましくは、Ｑｕｉｌ−Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、ＧＰＩ−１００及び水酸化アルミニウム（ＡｌＯＨ）から選択される１またはそれより多くの免疫刺激分子もまた含む。
【００７７】
さらに別の好ましい実施態様において、本発明は、少なくとも一つの細菌抗原（例えば、組換えStreptococcus
uberis ＰａｕＡタンパク質または大腸菌の細胞調製物、あるいはその双方の組み合わせ）を水中油型乳剤中に含むワクチン組成物を提供する。抗原は、１μｍ未満のサイズの液滴、好ましくは０．８μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満の平均液滴サイズ、及びよりいっそう好ましくは約０．２５μｍの平均液滴サイズの水中油型乳剤と、内在的に組み合わされている。サブミクロン水中油型乳剤は、好ましくは、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物（すなわち、軽質鉱油、レシチン、ＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０を含有する処方物）から構成される。該ワクチン組成物は、好ましくは、Ｑｕｉｌ
Ａ、ＤＤＡ及びＧＰＩ−１００から選択される１またはそれより多くの免疫刺激分子もまた含む。
【００７８】
本発明のワクチン組成物を、経口、鼻腔内、粘膜、局所、経皮、及び非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）経路を始めとする公知の経路により動物に投与することが可能である。例えば、初回投与には非経口（parental）経路を用い、そしてそれに続く投与には粘膜経路を用いるなどの経路の組み合わせを用いて、投与を成し遂げることが可能である。
【００７９】
ワクチン組成物の調製方法
さらなる実施態様において、本発明は、抗原（単数または複数）及びサブミクロン水中油型乳剤を含有するワクチン組成物の調製方法を提供する。
【００８０】
本発明のワクチン組成物を調製する際に、抗原を、水中油型乳剤の成分と、内在的あるいは外来的に組み合わせることが可能である。「好ましくは」、抗原を、水中油型乳剤の成分と内在的に組み合わせる。
【００８１】
抗原を、油、１またはそれより多くの界面活性剤、水溶性成分及び任意の他の適切な成分を含む乳剤の種々の成分と組み合わせて、混合物を形成することが可能である。該混合物を、典型的には１もしくはそれより多くのホモジナイザーまたは乳化装置に１回以上通すことによる第一混和過程にかけて、抗原を含有する水中油型乳剤を形成する。例えばRoss乳化装置（Hauppauge、ニューヨーク州）、Gaulinホモジナイザー（Everett、マサチューセッツ州）またはMicrofluidics（ニュートン、マサチューセッツ州）などの任意の市販されているホモジナイザーまたは乳化装置を、本目的のために用いることが可能である。あるいは、油、１またはそれより多くの界面活性剤及び水溶性成分を含む乳剤アジュバントの種々の成分を、まず組み合わせて、ホモジナイザーまたは乳化装置を用いることによって水中油型乳剤を形成し；次いで、抗原をこの乳剤に添加する。第一混和後の水中油型乳剤の平均液滴サイズは、およそ１．０〜１．２ミクロンである。
【００８２】
次いで、抗原を含有する乳剤を、マイクロ流動化にかけて、サブミクロン範囲の液滴サイズを得る。マイクロ流動化は、Microfluidics社、ニュートン、マサチューセッツ州から入手可能なモデル番号１１０Ｙ；Gaulinモデル３０ＣＤ（Gaulin, Inc.、Everett、マサチューセッツ州）；及びRainnie Minilab ８．３０Ｈ型（Miro Atomizer Food and Dairy, Inc.、ハドソン、ウィスコンシン州）などの市販のマイクロ流動化装置の使用により、成し遂げることが可能である。
【００８３】
液滴サイズは、例えばレーザー回折、市販の定寸装置の使用によるなどの、当該技術分野において公知の多様な方法によって、測定することが可能である。サイズは、用いる界面活性剤の種類、油に対する界面活性剤の割合、動作圧、温度等に応じて異なってもよい。所望の液滴サイズの乳剤を得るために、これらのパラメータの所望の組み合わせを決定することが可能である。本発明の乳剤の液滴サイズは、直径１μｍ未満である。好ましくは、平均液滴サイズは０．８μｍ未満である。より好ましくは、平均液滴サイズは０．５μｍ未満である。よりいっそう好ましくは、平均液滴サイズは約０．１〜０．３μｍである。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様において、軽質鉱油中に２５％のレシチンを含有するＤＲＡＫＥＯＬ（商標登録）レシチン油溶液を、ＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０ならびに生理食塩液と組み合わせ、そして混合して、軽質鉱油４０％、レシチン、ＴＷＥＥＮ（商標登録）８０
０．１８％、及びＳＰＡＮ（商標登録）８０ ０．０８％を含有する混合物を形成する。次いで、該混合物を、Ross（商標登録）（Hauppauge、ニューヨーク州、11788）乳化装置でおよそ３４００ｒｐｍにて乳化して乳剤生成物を形成し、これは「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物」または「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）溶液」とも称される。続いて、所望の抗原を、乳化装置（たとえば、Rossホモジナイザー）を用いてＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）溶液及び任意の他の適切な成分（例えば、免疫刺激分子）と組み合わせて、抗原を含有する水中油型乳剤を形成する。このような乳剤を、約１００００±５００ｐｓｉで動作しているマイクロ流動化装置に一度通す。マイクロ流動化された水中油型乳剤は、平均液滴サイズ約０．２５μｍの、１μｍ未満のサイズの液滴を有する。
【００８５】
別の好ましい実施態様において、水中油型乳剤（例えば、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物）を所望の抗原と組み合わせる前に、抗原をサポニン配糖体（例えば、Ｑｕｉｌ
Ａ）と組み合わせて、混合物を形成する。この抗原−サポニン混合物を、ホモジナイゼーション容器中でホモジナイゼーションにかける。次いで、例えばコレステロールなどのステロールを、ホモジナイズされた抗原−サポニン混合物に加える。次いで、抗原、サポニン及びステロールを含有する該混合物を、さらにホモジナイゼーションにかける。次いで、ホモジナイズされた抗原−サポニン−ステロール混合物を、例えばホモジナイザーを用いて、水中油型乳剤（例えば、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物）と組み合わせる。次いで、抗原、サポニン及びステロールを含有するホモジナイズされた水中油型乳剤を、マイクロ流動化などの高圧ホモジナイゼーションにかける。
【００８６】
マイクロカプセル化された抗原をサブミクロン水中油型乳剤中に含有するワクチン組成物、及び調製方法
さらに別の実施態様において、本発明は、ミクロ粒子中にカプセル化された抗原（または、「マイクロカプセル化された抗原」）を含有し、ここでマイクロカプセル化された抗原が前述のサブミクロン水中油型乳剤中に外来的に取り込まれているワクチン組成物を、提供する。
【００８７】
抗原を粒子性キャリアー中に吸着または捕捉するための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications（Justin Hanes、Masatoshi Chiba及びRobert Langer、「Vaccine design」中、Polymer microspheres for vaccine delivery、The
subunit and adjuvant approach. Michael F. Powell及びMark
J. Newman編集、1995年、Plenum Press、ニューヨーク州及びロンドン）を参照されたい。粒子性キャリアーは、動物個体において選択された抗原の複数のコピーを免疫系に提示し、そして局所リンパ節における抗原の捕捉及び保持を促進することが可能である。粒子は、マクロファージによって貪食されることが可能であり、かつサイトカイン放出を介して抗原提示を増強することが可能である。粒子性キャリアーは、当該技術分野においても記載されており、そして例えば、ポリメチルメタクリレート重合体由来のもの、ならびに、ポリ（ラクチド）及びＰＬＧとして公知のポリ（ラクチド−共グリコリド）由来のものなどが挙げられる。ポリメチルメタクリレート重合体は非生分解性であるが、ＰＬＧ粒子は、正常な代謝経路で排出される乳酸及びグリコール酸とのエステル結合のランダムな非酵素性加水分解によって生分解されることが可能である。
【００８８】
生分解性ミクロスフェアもまた、 ワクチンの制御放出を成し遂げるのに用いられている。例えば、長期にわたり抗原の持続的な放出を成し遂げることが可能である。重合体の分子量、及び重合体におけるグリコール酸に対する乳酸の割合に応じて、ＰＬＧＡ重合体は、数日または数週間から数カ月または一年までの加水分解速度を有することが可能である。緩徐な制御放出により、複数回注射後に観察されるものと同様の高レベルの抗体の形成を生じる可能性がある。あるいは、ワクチン抗原のパルス放出を、異なる加水分解速度を伴う重合体を選択することによって成し遂げることが可能である。重合体の加水分解速度は、典型的には、重合体の分子量、及び重合体におけるグリコール酸に対する乳酸の割合に依存する。抗原放出速度の異なる２またはそれより多くの異なる重合体から作られたミクロ粒子は、抗原のパルス放出、及びワクチン接種の複数回投与レジメン（regime）の模倣を供する。
【００８９】
本発明によると、前述のもののいずれかを始めとする抗原を、当該技術分野において公知の任意の手順（実施例１７に例示されるものなど）を用いることにより粒子状重合体キャリアー（好ましくは、ＰＬＧ重合体）に吸着させて、マイクロカプセル化された抗原調製物を形成することが可能である。次いで、マイクロカプセル化された抗原調製物を、前述したサブミクロン水中油型乳剤と混合し、そしてその中に分散させて、ワクチン組成物を形成する。
【００９０】
好ましい実施態様において、本発明は、ＰＬＧ重合体中にカプセル化された抗原を含有し、ここでマイクロカプセル化された抗原が軽質鉱油、レシチン、ＴＷＥＥＮ８０、ＳＰＡＮ８０及び生理食塩液から構成されるマイクロ流動化された水中油型乳剤中に外来的に分散し、かつ１．０μｍ未満の平均液滴サイズを有するワクチン組成物を、提供する。
【００９１】
サポニン及びステロールにより形成される複合体
一実施態様において、本発明は、サポニン及びステロールを含有し、ここでサポニン及びステロールがらせん状ミセルの形状の複合体を形成している組成物を、提供する。本発明によると、これらの複合体は免疫刺激活性を有する。
【００９２】
「免疫刺激」とは、該複合体が抗原成分によって誘導される免疫応答を増強可能であること、あるいは該複合体が別の抗原成分とは独立に免疫応答を誘導可能であることを、意味する。
【００９３】
本発明によると、本発明の組成物における使用に好ましいサポニンは、Ｑｕｉｌ Ａである。
本発明のアジュバント組成物における使用に好ましいステロールとしては、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びコレステロールが挙げられる。これらのステロールは当該技術分野において周知であって、例えばコレステロールは、メルクインデックス第１１版、３４１頁に、動物脂肪中に見いだされる自然発生ステロールとして開示されている。最も好ましくは、ステロールはコレステロールである。
【００９４】
組成物中のサポニン：ステロールの割合は、典型的には、およそ１：１００〜５：１（重量対重量）である。好ましくは、割合は１：１である。
別の実施態様において、本発明は、サポニン、ステロール及び抗原を含有し、ここでサポニン及びステロールがらせん状ミセルの形状の複合体を形成しており、かつ抗原がらせん状ミセルと混合されているが、しかしその内部に取り込まれていないワクチン組成物を、提供する。
【００９５】
以下は、本発明を実行するための具体的な実施態様の実施例である。当該実施例は、例示的な目的のみのために提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００９６】
（実施例１）
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物の調製
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、二工程の過程にて調製した。第一工程では、８０リットルのＤｒａｋｅｏｌレシチン油溶液、１１６リットルの破傷風トキソイド生理食塩液、１．２リットルのＳＰＡＮ
８０、及び２．８リットルのＴｗｅｅｎ ８０を混ぜ合わせ、そしてRoss乳化装置を用いて乳化した。Ｄｒａｋｅｏｌレシチン油溶液は、大豆レシチン２５％及び鉱油７５％を含有した。乳化した生成物を、Ross乳化装置により最低５容量または最低１０分間再循環させた。乳化した生成物を、さらなる処理のために、２〜７℃にて最大２４時間保管した。Ross乳化装置のタンクから得られた乳剤を、Gaulinホモジナイザーに移し、そして４５００ｐｓｉの圧力下で２０分間ホモジナイズした。次いで、得られた４０％Ｄｒａｋｅｏｌレシチン油溶液（以下、「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物」または「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）溶液」）を、無菌のポリプロピレンカルボキシ容器に分注した。分注は、クラス１０，０００の制御環境にあるクラス１００の分注フードの中で行った。容器を、２〜７℃にて保管した。このＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、特に示さない限り、以下に記載の実験において用いた。
【００９７】
（実施例２）
ＢＶＤワクチンの急速混和ホモジナイゼーションによる第一の混和
このホモジナイゼーション過程に用いられる装置を、図１に示す。無菌技術または蒸気用三方弁を用いて、ＢＶＤ Ｉ型抗原（不活化したＢＶＤ
Ｉ型ウイルス調製物）を含有するボトルを、混和容器上の底部ポートに連結した。必要とされる容量のＢＶＤ Ｉ型抗原の移行が完了した後に、ＢＶＤ Ｉ型のボトルを、不活化ＢＶＤ
ＩＩ型ウイルス調製物（不活化ＢＶＤ ＩＩ型ウイルス調製物）を含有するボトルと取り替えた。必要量のＢＶＤ ＩＩ型抗原の移行が完了した後に、Rossホモジナイザーをポータブル容器に取り付け、そして再循環を最大のＲＰＭ（３３００ｒｐｍ）にて開始した。容器の撹拌を、中等度の速度にて維持した。
【００９８】
無菌技術または蒸気用三方弁を用いて、Ｑｕｉｌ−Ａを５０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するボトルを、混和容器上のホモジナイザーインラインポートに取り付けた。必要量のＱｕｉｌ−Ａ溶液を、ライン吸引により容器へと通した。Ｑｕｉｌ−Ａ溶液の移行が完了した後に、ボトルを取り外した。同じ方法で、必要量のコレステロール・エタノール溶液（１８ｍｇ／ｍｌ）を、混和容器に移した。続いて、必要量のＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物、１０％Thimerosol溶液、及び基本改変イーグル培地（「ＢＭＥ」）増量剤溶液を、混和容器に加えた。
【００９９】
すべての添加が完了した後に、混合をさらに１５分間続けた。得られた処方物を、２ｍｌ用量に分割し、そしてこれはマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくＢＶＤワクチンを表した。ワクチンの各用量は、Ｑｕｉｌ−Ａ
５００μｇ、コレステロール ５００μｇ、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物２．５％、及びThimerosol ０．００９％を含有した。二つの異なるＢＶＤ株の抗原濃度を、ｇｐ５３に対するＥＬＩＳＡ力価に関して測定した。
【０１００】
（実施例３）
マイクロ流動化による第二の混和
図２は、マイクロ流動化を介した第二の混和に用いられる過程を示す。マイクロ流動化装置を、蒸気滅菌した。まず、補助の処理モジュールチャンバーをユニット内に設置し、そして空のチャンバーを二番目のチャンバー位置に設置した。実施例２に記載のように調製された、十分にアジュバント添加されているＢＶＤワクチンを含有する容器を、供給容器のドレイン弁からマイクロ流動化装置の入口への移行ラインを取り付けることにより、マイクロ流動化装置に接続した。窒素ガスを、供給容器の空気フィルターの入口に接続し、そして容器の圧設定を２０±５ＰＳＩに調整した。収集容器のドレイン弁を、マイクロ流動化装置の出口からの移行ラインに接続した。すべての必要な接続を行った後に、弁を開き、そしてマイクロ流動化を動作圧１０，０００±５００ＰＳＩにて開始した。ワクチンの全量をマイクロ流動化装置に一度通し、そしてマイクロ流動化後チャンバー中に収集した。この調製物を、２ｍＬ用量に分割し、そしてこれはマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくＢＶＤワクチンを表した。
【０１０１】
（実施例４）
ベンチ混和によるワクチン組成物の調製
実施例１に記載のように調製されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、ＢＶＤ抗原及び増量剤を加えて２．５％に希釈した。得られた溶液を、ホモジナイザーを用いる代わりに撹拌子を用いて、ベンチにて混和した。最終調製物は、以下の組成物を含有した：ＢＶＤ
１型及び２型抗原、２．５％ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物（実施例１に記載のように、油、レシチン、ＳＰＡＮ（商標登録）及びＴＷＥＥＮ（商標登録）を含有する）、ならびに生理食塩液。ＴＷＥＥＮ
８０及びＳＰＡＮ ８０は、最終ワクチン調製物中にそれぞれ０．１８％及び０．０８％容量にて存在する。
【０１０２】
（実施例５）
マイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物とマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物との液滴サイズ分布の比較
実施例２に記載のように調製されたマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、実施例３に記載のように調製されたマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、及び実施例４に記載のようにベンチで混和により作られた調製物を用いて、ワクチン調製物の液滴サイズを比較した。２ミリリットルの各調製物の試料を、Malvern 2000レーザー回折計測器に添加し、そして液滴サイズ分布を測定した。図３に示すように、結果は、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物の最大粒子体積がおよそ０．１ミクロンであり、一方、マイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物の最大粒子分布体積がおよそ１ミクロンであったことを、示している。
【０１０３】
（実施例６）
ワクチンの相分離の低減
三つの異なるワクチン調製物：実施例２に記載のように調製されたマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、実施例３に記載のように調製されたマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、及び実施例４に記載のようにベンチ混和により調製されたワクチン調製物を、並列に比較して、長期保管時のそれらの相分離の特性を判定した。すべてのこれらの調製物を４℃にて約１ヶ月間静置させ、そして相分離を、ワクチン調製物最上部のクリーム状の層の出現に関してモニターした。図４に示すように、他の二つの調製物と比較した場合、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づく調製物では相分離はなかった。
【０１０４】
（実施例７）
マイクロ流動化された、及びマイクロ流動化されていないウシウイルス下痢ウイルスに対するウシ用ワクチンの調製
ウシウイルス下痢ウイルス抗原を、マイクロ流動化を介してＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物中に内在的に取り込んだ。「内在的に取り込んだ」の語は、マイクロ流動化の前に抗原をＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に添加することによる過程を指す。抗原をアジュバント処方物の成分とともに、マイクロ流動化過程の物理的な力にかけた。マイクロ流動化されていない対照群では、抗原調製物を、混和によりＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物中に分散させた。
【０１０５】
対照及びマイクロ流動化された調製物の双方の最終組成物は、以下のとおりであった：ｇｐ５３に対する不活化後のＥＬＩＳＡ力価２５３５ＲＵ／用量のＢＶＤ
Ｉ型、１．２５ｍｇ／用量の濃度のＱｕｉｌ−Ａ、１．２５ｍｇ／用量の濃度のコレステロール、２．５％の最終濃度のＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物、及び０．００９％の最終濃度のThimerosol。ワクチン用量は、５ｍｌであった。
【０１０６】
（実施例８）
マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物における、内在的に取り込まれたＢＶＤウイルス抗原の長期安定性
この実験は、内在的に取り込まれた抗原の長期保管中における安定性を判定するために行った。死滅ＢＶＤ ＩＩ型ウイルス抗原を、マイクロ流動化の過程中にＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物中に内在的に取り込んで、マイクロ流動化されたワクチン調製物（Ａ９０７５０５）を得た。同抗原をマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物（Ａ９０４３６９、Ａ９０４３７０及びＡ９０４３７１）中に含有する三つの他のワクチン調製物を、対照とした。マイクロ流動化されていない調製物では、抗原をＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物と混合し、そしてRossホモジナイザーを用いた混和により混合した。すべての四つのワクチン調製物を、４℃にて２年間保管した。保管中の異なる時点（０、６、１２または２４ヶ月）で、すべての四つの処方物を用いて、３ヶ月齢のウシにワクチン接種した。
【０１０７】
第０日及び第２１日に、３ヶ月齢のウシを、皮下経路を介して、２ｍｌのワクチン処方物でワクチン接種した。ワクチン接種された動物の血清を第３５日に採取し、そしてワクチンに対する血清学的応答を、ＢＶＤＶ−Ｅ２
ＥＬＩＳＡにより、抗体価に関して測定した。図５に示すように、マイクロ流動化されたワクチン調製物は、試験したすべての時点（０、６、１２及び２４ヶ月）で抗体価の上昇を示し、抗原調製物の安定性がマイクロ流動化の過程中における抗原の内在的な取り込みの間に失われないことが、示唆された。その上、マイクロ流動化されたワクチン調製物が、すべての時点で免疫応答の増強を誘導することもまた、驚くべきことに見いだされた。
【０１０８】
（実施例９）
マイクロ流動化後の、ワクチンにより誘導される直腸温増加の低減
実施例７に記載のように作られたマイクロ流動化されたワクチン調製物及びマイクロ流動化されていないワクチン調製物を用いて、第０日にウシにワクチン接種し、そして直腸温を、ワクチン接種１日前からワクチン接種後４日までの期間モニターした。ワクチン用量は、２ｍｌであった。当該群を、１倍用量または２倍用量のいずれかのワクチンでワクチン接種した。直腸温を、第−１日から第４日まで毎日測定及び記録した。第０日における直腸温は、被験物質の投与前に測定した。
【０１０９】
図６に示すように、結果は、１倍用量または２倍用量いずれかのマイクロ流動化されていないワクチン処方物でワクチン接種されたこれらの動物において、ワクチン接種後約２４時間に直腸温の急激な上昇があったことを、示している。しかしながら、マイクロ流動化された形状のワクチンでワクチン接種された動物においては、ワクチン接種後の直腸温の上昇は、ほんのわずかで、かつマイクロ流動化されていない処方物でワクチン接種された動物よりも有意に低かった（図６）。
【０１１０】
（実施例１０）
マイクロ流動化されたワクチン処方物でワクチン接種した場合、注射部位反応体積はより速く回復した
実施例７に記載のように作られた、マイクロ流動化されたワクチン調製物及びマイクロ流動化されていないワクチン調製物を用いて、第０日にウシにワクチン接種した。この試験に含まれる動物は、交雑食用牛であった。プラセボ治療群（Ｔ０１及びＴ０２）のそれぞれには、３例の動物がいた。Ｔ０３〜Ｔ０６群のそれぞれには、６例の動物がいた。ワクチン用量は２ｍｌであり、そして当該群を、第０日に１または２用量のいずれかのワクチンでワクチン接種した。第０日に、被験物質を、右首に投与した。２倍用量（４ｍｌ）の被験物質を投与される動物（Ｔ０２、Ｔ０４及びＴ０６）には、片側に１回の注射として、全２倍用量を投与した。注射部位における反応サイズの評価を始めとする注射部位の観察を、第０日から第４日までの全日、及び第６、９及び１４日に、首の右側で行った。第０日に、注射部位を、被験物質の投与前に観察した。１または２用量のプラセボでワクチン接種した群は、注射部位反応体積のいかなる有意な増加も示さず、そしてそれゆえにこれらのデータを図７に示していない。マイクロ流動化されていないワクチン処方物の場合、１用量と２用量のワクチン接種との間に注射部位反応体積の比例的な増加があった。他方で、マイクロ流動化されたワクチン処方物の場合、１倍用量がより大きな注射部位反応体積を誘導したが、二番目の用量での注射はいかなるさらなる増加も引き起こさなかった。その上、マイクロ流動化されたワクチン処方物で注射した動物の場合、注射部位反応部位体積は、マイクロ流動化されていないワクチン処方物で注射した動物と比較した場合に、より速い速度で回復した。これらの結果を、図７に示す。
【０１１１】
（実施例１１）
内在的に取り込まれたＢＶＤウイルス及びレプトスピラ抗原、ならびにＱｕｉｌ Ａ及びＤＤＡなどの免疫刺激分子を用いた、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物の調製
ホルマリンで不活化したLeptospira hardjo-bovis CLS株を、直接計数約１．４×１０９生物体／５ｍｌ用量にて、適切なアジュバント中に処方物化した。ホルマリンで不活化したLeptospira pomona T262株を、約２４００比濁単位／５ｍｌ用量にて処方物化した。比濁単位は、処理前の発酵液の比濁測定に基づき算出した。ＢＶＤウイルス１型を、約３０００相対単位／５ｍｌ用量のＥ２
Ｅｌｉｓａ力価にて処方物化した。ＢＶＤウイルス２型を、約３５００相対単位／５ｍｌ用量のＥ２ Ｅｌｉｓａ力価にて処方物化した。相対単位は、合わせる前の不活化後のバルク液のＥ２
ＥＬＩＳＡ力価に基づき算出した。Ｑｕｉｌ−Ａとコレステロールの双方を、０．５ｍｇ／用量の濃度にて用いた。Thimerosol及びＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、それぞれ０．００９％及び２．５％の最終濃度にて用いた。水酸化アルミニウム（Rehydragel LV）を、２．０％の最終濃度にて用いた。ＤＤＡを免疫調節物質として用いた場合、ＤＤＡはＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物内に含まれた。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物（すなわち、４０％Ｄｒａｋｅｏｌ−レシチンストック溶液）は１．６ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含有し、そして適切に希釈された場合、最終的なワクチン調製物は２．５％ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物及び０．１ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含有した。
【０１１２】
異なるワクチン処方物の調製において、ＢＶＤ画分、レプト、Ｑｕｉｌ−Ａ、コレステロール、Thimerosol、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物、及び増量剤としての生理食塩液を、Silversonホモジナイザーに添加し、そして１０，０００±５００ＲＰＭにて１５分間混合した。次いで、成分を、２００ミクロンのスクリーンを介して、１０，０００ｐｓｉにてマイクロ流動化した。
【０１１３】
ワクチン処方物が水酸化アルミニウムを含有した場合、マイクロ流動化を水酸化アルミニウムなしで行った。マイクロ流動化が完了した後に、水酸化アルミニウムを添加し、そして撹拌子を用いて４℃にて一晩混合した。
【０１１４】
（実施例１２）
曝露試験用ＢＶＤウイルスワクチンの調製
この実験に用いられるワクチン調製物は、ＢＶＤウイルス１型及びＢＶＤウイルス２型の双方由来の抗原を含有した。ＢＶＤ１−５９６０抗原を、ｇｐ５３に対する不活化後のＥＬＩＳＡ力価２５３５ＲＵ／用量にて用いた。ＢＶＤ２−８９０抗原を、ｇｐ５３に対する不活化後のＥＬＩＳＡ力価３２９０ＲＵ／用量にて用いた。Ｑｕｉｌ
Ａ及びコレステロールを、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度にて用いた。Thimersol及びＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、それぞれ０．００９％及び２．５％の最終濃度にて用いた。ＤＤＡを免疫調節物質として用いた場合、ＤＤＡはＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物内に含まれた。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）ストック溶液（４０％Ｄｒａｋｅｏｌ−レシチン溶液）は様々な量のＤＤＡを含有し、そして適切に希釈された場合、最終的なワクチン調製物は２．５％ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物及び０．５ｍｇ／用量〜２．０ｍｇ／用量のＤＤＡ濃度を含有した。アルミニウムゲル（Rehydragel-LV）を、２％の最終濃度にて用いた。ＧＰＩ−０１００を、２、３及び５ｍｇ／用量の範囲で用いた。
【０１１５】
すべての成分をSilversonホモジナイザーに添加し、そして１０，５００ｒｐｍにて１５分間混和し、次いで１０，０００ｐｓｉにて２００ミクロンのチャンバーに通すことによりマイクロ流動化した。ワクチン調製物が水酸化アルミニウムを含有した場合、マイクロ流動化を水酸化アルミニウムなしで行った。マイクロ流動化が完了した後に、水酸化アルミニウムを添加し、そして撹拌子を用いて４℃にて一晩混合した。
【０１１６】
（実施例１３）
レプトスピラ抗原を伴うマイクロ流動化されたＡｍｐｈｉｇｅｎワクチン処方物でワクチン接種後の、レプトスピラ曝露に対する防御
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
表１は、本試験において試験されたワクチン調製物におけるアジュバント処方物の組成を示す。ワクチン調製物を、実施例１１に記載のように調製した。各群には、６例の動物がいた。約７ヶ月齢の交雑種未経産牛を、本試験において用いた。ワクチン接種を、第０日及び第２１日に、皮下経路を介して５ｍｌのワクチン容量にて行った。曝露を、国立動物疾病センター（ＮＡＤＣ、National agricultural Disease Center）から得たL.
hardjo-bovis 203株を用いて行った。曝露は、第５７〜５９日に、１ｍｌの接種により行った。曝露を、眼及び腟に同時投与した。曝露材料は、５．０Ｘ１０６レプトスピラ／ｍｌを含有した。尿を、レプト培養、ＦＡ及びＰＣＲのために一週間毎に採取した。腎臓の採取を、第１１２日及び第１１３日の間に行った。
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
表２は、レプトスピラ曝露試験から得られたデータを示す。曝露された動物におけるレプトスピラ感染率を決定する際に、以下の基準を用いた。腎臓培養が一試料のみで陽性であったならば、動物はレプトスピラに陽性であると考えられる。動物がＦＡまたはＰＣＲのいずれかに関して一試料のみで陽性であるならば、動物は陰性であると考えられる。試料がＦＡ及びＰＣＲの双方に関して一試料のみで陽性であるならば、レプトスピラに陽性であると考えられた。
【０１２１】
表２に示す結果は、すべての三つのアッセイに基づくすべてのワクチン群において、尿への排出期間が有意に短かったことを示している。尿及び腎臓のコロニー形成に関する限り、ＱＡＣ及びＤＤＡを含有するＡｌＯＨを含まない処方物の有効性は、同程度であった。ＡｌＯＨは、本曝露試験においては、ＱＡＣまたはＤＤＡを含有するワクチンの有効性を改善せず、そしてむしろ低減した。
【０１２２】
【表３】
【０１２３】
ワクチン処方物中の双方のレプトスピラ抗原に対する血清学的応答を、ワクチン接種された動物において検出し、そしてピーク応答は第３５日にみられた。血清学的応答と曝露に対する防御との間に、相関はなかった。血清学的応答がワクチン中のアルミニウムゲルの存在により増強されたにもかかわらず、ワクチン処方物中のアルミニウムゲルの存在は、防御レベルを低減させた。
【０１２４】
（実施例１４）
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物及びＤＤＡを含有するマイクロ流動化されたワクチン調製物で免疫後の、ＢＶＤウイルス抗原に対する免疫応答の誘発、及びＢＶＤ
２型ウイルス曝露に対する防御
４〜７ヶ月齢の血清陰性の子ウシを、本実験において用いた。異なる６群があり、そして各群は１０例の動物を有した（表４）。第０日及び第２１日に、各動物は、２ｍｌのワクチンまたはプラセボの皮下用量を、肩甲骨と頭蓋骨との中ほどにある側頸に１回受けた。
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
５ｍｌ用量の曝露用ウイルス調製物（１鼻孔につき、およそ２．５ｍｌ）を、試験第４４日に鼻腔内投与した。細胞変性していないＢＶＤ
２型ウイルスである単離番号２４５１５（Ellis株）、ロット番号４６３２５−７０を、本試験において曝露用株として用いた。保持しておいた曝露用材料の試料を、曝露開始時及びその完了直後に力価測定した（１力価測定につき二つ組で）。５ｍｌ用量あたりの平均生存ウイルスは、曝露前は５．３ｌｏｇ１０ＦＡＩＤ５０／５ｍｌ、そして曝露後は５．４ｌｏｇ１０ＦＡＩＤ５０／５ｍｌであった（ＦＡＩＤは、ＴＣＩＤ５０に相当する）。
【０１２７】
動物を、第−３日から第５８日まで、毎日モニターした。ＢＶＤ ２感染に起因する臨床徴候に基づいた０、１、２または３の臨床疾患スコアを、第４２日から第５８日まで、各動物について行った。第４４日におけるスコアは、曝露の前に記録した。ＢＶＤ
１型及びＢＶＤ ２型ウイルス中和抗体の血清力価を測定するために、血液試料（二つの１３ｍｌ血清分離用チューブ、ＳＳＴ）を、第０、２１、３５、４４及び５８日に各動物から採取した。
【０１２８】
血液試料を、第４２日から第５８日までの全日、各動物から採取し、そしてバフィーコート細胞におけるＢＶＤウイルスの存在を判定した。第４４日に、試料を曝露の前に得た。
【０１２９】
白血球細胞数を測定するために、血液試料（４ｍｌ ＥＤＴＡチューブ１本）を、第４２日から第５８日までの全日、各動物から採取した。第４４日に、試料を曝露の前に得た。
【０１３０】
白血球減少症を、４０％またはそれを超えるベースライン（曝露２日前及び曝露当日の、曝露前の平均のＷＢＣ数）からのＷＢＣ数の減少として、定義した。
臨床疾患スコアを、以下のように疾患状態を定義するために用いた：スコアが≦１ならば、疾患＝なし；スコアが＞２ならば、疾患＝あり。
【０１３１】
表５及び表６に示すように、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物、Ｑｕｉｌ ＡまたはＤＤＡとともにＢＶＤウイルス抗原を含有し、かつマイクロ流動化されたワクチンでワクチン接種された群は、ＢＶＤ
１型とＢＶＤ ２型ウイルスの双方に対する有意な血清ウイルス中和力価によって血清転換した。これらの群では、曝露後にウイルス血症を示す動物の率の有意な低減もあったが、対照群では、１００％の動物がウイルス血症であった（表７）。加えて、これらのワクチン接種された群において、疾患の頻度もまた有意に低減した（表８）。同様に、白血球減少症を示す動物の率もワクチン群において低減し、そして白血球減少症の低減は、Ｑｕｉｌ
Ａを含有する群よりもＤＤＡを含有する群においてより有意であった（表９）。対照群では、ワクチン接種群と比較した場合に、体重増加の有意な降下があった（表１０）。
【０１３２】
血清学
第０日におけるワクチン接種の前に、試験におけるすべての動物は、ＢＶＤウイルス １型及び２型に対する抗体に血清陰性（ＳＶＮ
＜１：２）であった（データは示さず）。二回目のワクチン接種（第３５日）後１４日に、プラセボを投与されたすべての動物（Ｔ０１）は、ＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体に血清陰性のままであり；そして、ＩＴＡ（研究用被験抗原）でワクチン接種されたすべての動物（Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６）は、ＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体に血清陽性（ＳＶＮ
≧１：８）であった。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物をアジュバントとして添加したＤＤＡ ２ｍｇ／用量のワクチンを投与された１例の動物は、第３５日に、ＢＶＤウイルス２型に対する抗体に対してＳＶＮ力価３であった（表１１及び表１２）。
【０１３３】
第４４日における曝露の前に、１例を除くすべての対照（Ｔ０１）は、ＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体に血清陰性（ＳＶＮ
＜１：２）であった（データは示さず）。１例の対照（＃２４９７）は、ＢＶＤウイルス１型に対する抗体に血清陽性（ＳＶＮ＝１０）、そしてＢＶＤウイルス２型に対する抗体に血清陰性であった。曝露後１４日に、試験におけるすべての動物は、ＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体に血清陽性であった。
【０１３４】
【表５】
【０１３５】
【表６】
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
【表８】
【０１３８】
【表９】
【０１３９】
【表１０】
【０１４０】
ウイルスの単離
表１３に示すデータのように、曝露期間（第４４日〜第５８日）中に、対照（Ｔ０１）におけるすべての１０例の動物は、ウイルス血症であった（ＢＶＤウイルスが、１日以上で単離された）。ＩＴＡ投与群では、ウイルス血症の動物の頻度は、１０例の各群（それぞれ、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６）において１、０、３、２及び２例であった。対照とＩＴＡ投与群との間の差は、統計学的に有意であった（Ｐ≦０．０５）。ウイルス血症の最小二乗平均日数もまた、ＩＴＡ投与群（０．０〜０．５日）と比較して、対照で有意に大きかった（１０．４日）。
【０１４１】
臨床疾患
臨床徴候スコア２または３の動物は、ＢＶＤ疾患の徴候を示していると考えられた。表１４に示すように、ＢＶＤウイルス疾患の臨床徴候を伴う動物の頻度は、対照（Ｔ０１）において１０例中９例、そしてＩＴＡ投与各群（それぞれ、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６）において、１０例中１、２、０、０及び０例であった。対照とＩＴＡ投与群との間の差は、統計学的に有意であった（Ｐ≦０．０５）。
【０１４２】
白血球減少症
表１５に示すように、曝露期間（第４４日〜第５８日）中に、対照（Ｔ０１）におけるすべての１０例の動物は、白血球減少症であった（第４２〜４４日の曝露前ベースラインから、白血球数が４０％低減）。白血球減少症を伴う動物の頻度は、ＩＴＡ投与各群（それぞれ、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６）において、１０例中６、２、４、３及び２例であった。対照と、０．５ｍｇ／用量のＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物及び水酸化アルミニウムをアジュバントとして添加したワクチン投与群（Ｔ０３）との間の差は、統計学的に有意であった（Ｐ≦０．０５）。白血球減少症の最小二乗平均日数は、ＩＴＡ投与群（０．２〜１．２日）と比較して、対照で有意に大きかった（７．８日）。
【０１４３】
（実施例１５）
ＧＰＩ−０１００を含有するマイクロ流動化されたワクチン調製物で免疫後の、ＢＶＤウイルス抗原に対する免疫応答の誘発、及びＢＶＤ２型ウイルス曝露に対する防御
実施例１４に記載の一連の実験条件にしたがい、そしてＱｕｉｌ ＡとＧＰＩ−０１００との直接比較を行った。表１１及び表１２に示すように、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づいた、Ｑｕｉｌ
ＡまたはＧＰＩ−０１００のいずれかを含有する調製物に含まれるＢＶＤ抗原でワクチン接種された動物は、ＢＶＤ１型とＢＶＤ２型ウイルスの双方に対する有意な抗体価を有した。ＢＶＤ１型ウイルスに対する抗体価は、ＢＶＤ２型ウイルスに対するものよりもかなり高かった。しかしながら、それに続くＢＶＤ２型ウイルスによる曝露は、強力な防御を示し、そして疾患発生率は、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくＧＰＩ−０１００含有ワクチン調製物でワクチン接種された子ウシにおいて、低減した。
【０１４４】
【表１１】
【０１４５】
【表１２】
【０１４６】
【表１３】
【０１４７】
【表１４】
【０１４８】
【表１５】
【０１４９】
結論として、各ワクチンの安全性は、ワクチン接種された動物において副作用または死亡がないことにより示された。各ワクチンの効力は、１００％のワクチン接種された動物における血清転換（ＢＶＤ−１及びＢＶＤ−２に対するＳＶＮ抗体価
＞１：８）によって、示された。曝露に対する十分な耐性は、ＧＰＩ−０１００ ２ｍｇのみをアジュバントとして添加したワクチンにより示された。
【０１５０】
（実施例１６）
マイクロ流動化された水中油型乳剤中にマイクロカプセル化された抗原を含有するワクチン調製物
３ｇのトレハロース（Fluka社）を水に加えて、３３３ｍｇ／ｍｌのトレハロース溶液を得た。０．８％ＳＤＳ溶液中に可溶化した組換えＰａｕＡ抗原（ＳＤＳ／ｒＰａｕＡ）をトレハロース溶液に加えて、４９４μｇ ｒＰａｕＡ／ｍｌの最終濃度を得た。次の工程で、１０ｇのポリ乳酸グリコール酸（PLG-Resomer
RE 503H、ベーリンガー・インゲルハイム社）を、２００ｍｌの塩化メチレン（ＭｅＣｌ２）に溶解した。得られたＰＬＧ／ＭｅＣｌ２溶液を、最初の工程で調製されたＳＤＳ−ｒＰａｕＡ／トレハロース溶液と組み合わせた。組み合わせた溶液を、（MicrofluidicsモデルＭ１１０ＥＨのマイクロ流動化装置）を用いてマイクロ流動化にかけ、そしてマイクロ流動化された調製物を、（テプコ噴霧乾燥機モデルＳＤ−０５）を用いて噴霧乾燥した。噴霧乾燥した材料を、５００ミクロンのスクリーンを用いて収集した。
【０１５１】
この噴霧乾燥した材料中のｒＰａｕＡ濃度を、ウエスタンブロット解析を用いて定量した。１．０４ｍｇの噴霧乾燥した材料を、５０μｌのアセトン中に溶解し、そして室温にて１０分間、１３，２００ｒｐｍで遠心分離した。上清を、除去した。上清画分及びペレット画分を、生物学的安全フード内で２．５時間乾燥させた。ペレットを、４７．４３μＬの試料溶液（２５μｌの試料緩衝液＋１０μｌの還元剤＋６５μｌの水）中に再懸濁した。乾燥させた上清画分を、２０μｌの試料溶液で再懸濁した。ウエスタン解析において、精製ＰａｕＡを、噴霧乾燥した材料のｒＰａｕＡ含量を定量するための標準品として用いた。
【０１５２】
２０％マンニトールストック溶液を、１００ｍｇのマンニトール（シグマ社）を５００ｍｌの注射用水（ＷＦＩ）に溶解することにより、調製した。溶液をホットプレート／撹拌機で４０℃に加熱し、そして３０℃に冷ました。溶液を、０．２２ミクロンの無菌フィルター（ミリポア社）を介して無菌ろ過した。２．５％カルボキシメチルセルロース溶液を、１２．５ｇのカルボキシメチルセルロース（シグマ社）を５００ｍｌのＷＦＩに溶解することによって調製し、そして４℃にて一晩混合した。溶液を、１２１℃にて高圧滅菌した。
【０１５３】
噴霧乾燥により得られた粉末を、５％マンニトール、０．３％カルボキシメチルセルロース及び１：５０００のThimerosolを含有する溶液中で再構成した。最終溶液を３ｍｌバイアルに分割し、そして凍結乾燥機（USIFROID）を用いて凍結乾燥した。凍結乾燥粉末は、マイクロカプセル化されたｒＰａｕＡを表した。マイクロカプセル化されたサブユニットタンパク質抗原を、２ｍｌのＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を含有するマイクロ流動化された水中油型乳剤（実施例２０に記載されるマイクロ流動化された乳剤など）中に再懸濁する。
【０１５４】
（実施例１７）
水中油型乳剤中に細菌全細胞抗原と組換えタンパク質抗原の双方を含有するマイクロ流動化されたワクチン処方物の調製
実施例２及び３に記載のように水中油型乳剤に内在的に添加された、組換えStreptococcus
uberis ＰａｕＡタンパク質と大腸菌細菌細胞の双方を含有する二つのワクチン調製物を、作った。組換えＰａｕＡ抗原は１００μｇ／用量の濃度であり、そして大腸菌細胞は４Ｘ１０９／用量の最終数であった。二つのワクチン処方物の乳剤アジュバント組成物を、表１６に示す。
【０１５５】
【表１６】
【０１５６】
（実施例１８）
水中油型乳剤中にｒＰａｕＡ及び全細胞細菌因子を含有するマイクロ流動化されたワクチンに対する免疫応答
成熟乳牛を、本実験において用いた。動物は、登録時に初回または二回目の授乳が終了したところであった。２ｍｌの各ワクチン処方物を、乾乳時（Ｄ−０）に一度、２８日後（Ｄ＝２８）、及び分娩後４〜１０日（Ｃ＋４〜Ｃ＋１０）に再び、３回皮下投与した。最初及び三回目の用量を首の左側に投与し、そして二回目の用量を首の右側に投与した。血液を、各ワクチン接種の前、ならびに三回目のワクチン接種後およそ１４日及び３２日に採取した。大腸菌及びｒＰａｕＡに対する抗体価を、ＥＬＩＳＡにより測定した。図８に示すように、結果は、ｒＰａｕＡに対する抗体価が、ＧＰＩ−０１００を免疫刺激剤として含有するワクチン処方物でワクチン接種された群においてより高く、そして最初のワクチン接種後第７０日にピークとなったことを示している。大腸菌抗原に対する抗体価を、図９に示す。免疫刺激剤としてのＧＰＩ−０１００の存在が、免疫刺激剤としてＤＤＡを伴う処方物と比較した場合に相対的により高い抗体価を誘導したにもかかわらず、大腸菌抗原に対する抗体価は、双方のワクチン処方物で同程度であった。
【０１５７】
（実施例１９）
マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物の殺ウイルス活性の分析
マイクロ流動化がウイルスを不活化するかどうかを判定するために、三つのマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくウイルス調製物の殺ウイルス活性を測定した。この三つの調製物は、三つの異なるウシ感染性ウイルス、すなわちウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）及びウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）を含有した。
【０１５８】
三つのワクチン調製物における殺ウイルス活性の検出を、USDA 9CFR.113.35要件にしたがって行った。
表１６に示した結果は、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物のマイクロ流動化がワクチン調製物のいかなる有意な不活化も引き起こさないことを、示している。
【０１５９】
【表１７】
【０１６０】
（実施例２０）
マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物の調製
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、ＤＲＡＫＥＯＬレシチン油溶液（２５％レシチンを伴う軽質鉱油）とＴＷＥＥＮ ８０（０．１８％の最終濃度で）とＳｐａｎ
８０（０．０８％の最終濃度で）とを組み合わせて、３６±１℃にて８〜２２時間混合することにより、調製した。次いで、Ross（Hauppauge、ニューヨーク州、11788）乳化装置をおよそ３４００ｒｐｍで用いて、油混合物を生理食塩液に加えた。続いて、該混合物を、２００μｍの相互作用チャンバーを伴うマイクロ流動化装置に、４５００±５００ｐｓｉにて一度通した。図１０Ａ及び図１０Ｂは、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物の安定性を示す。レーザー回折により測定された、最初の開始時点における粒子サイズ分布（図１０Ａ）は、２２ヶ月間の４℃保管後の粒子サイズ分布（図１０Ｂ）とほとんど同一であった。
【０１６１】
（実施例２１）
ＱｕｉｌＡ−コレステロール免疫原性複合体の電子顕微鏡による分析
Ｑｕｉｌ Ａ及びコレステロールにより形成された免疫原性複合体の性質を判定するため、これらの二成分の混合物を、抗原の存在下及び非存在下のいずれかで作った。
【０１６２】
５０ｍｌのＫＲ−Ｈａｌｓ緩衝液を含有するビーカーに、溶液を磁気撹拌子で攪拌しながら、ＢＶＤ Ｉ型抗原を加えた。その後、Ｑｕｉｌ
Ａの濃縮ストック溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）を、溶液を攪拌しながら１滴ずつ加えて、５０μｇ／ｍｌの最終濃度に到達させた。Ｑｕｉｌ
Ａの添加後に、コレステロール・エタノール溶液（１８ｍｇ／ｍｌ）を５０μｇ／ｍｌの最終濃度となるように加えた。
【０１６３】
二番目のビーカーには、Ｑｕｉｌ Ａ及びコレステロールを、ＢＶＤ Ｉ型抗原を全く含まない５０ｍｌの緩衝液に同じ方法で加えた。
透過型電子顕微鏡用に、１０μｌの各試料を、formvar／炭素担体プラットホームを伴う４００メッシュ銅グリッド（Electron
Microscopy Sciences, Inc.、フォートワシントン、ペンシルバニア州）上に吸着させた。該試料を、ろ過したｐＨ５．２の２％リンタングステン酸１０μｌを造影剤として用いて、ネガティブ染色した。該試料を、８０ｋＶの加速電圧にてJEOL
1230透過型電子顕微鏡（JEOL Inc.、東京、日本）を用いて、検討した。デジタルイメージングを、Gatan BioScan 792カメラで行った。顕微鏡撮影を、４４８９ ＥＭフィルムで行い、そしてコダブロムＩＩ ＲＣ Ｆ３紙（Eastman Kodak Company、ロチェスター、ニューヨーク州）に印刷した。
【０１６４】
ＢＶＤ Ｉ型抗原を全く含まない、コレステロール及びＱｕｉｌ Ａのみを含有する溶液では、らせん状ミセルが、Ｑｕｉｌ Ａミセル及びコレステロール結晶とともに検出された（図１１）。らせん状ミセルは、絡み合い、そしてメッシュのようにみえた。ＢＶＤ
Ｉ型抗原を含有する試料では、らせん状ミセルは、ランダムに特定の高密度領域を取り囲むことがみられた（図１２）。該高密度領域はＢＶＤ１型抗原を表し、そしてＱｕｉｌ
Ａとコレステロールの会合により生じるらせん状免疫原性複合体は、ＢＶＤ Ｉ型抗原の表面に吸着することが見いだされている。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、マイクロ流動化されていないワクチン組成物のバッチ調製のための過程を示す。この過程では、種々のワクチン成分を、左の添加容器に添加し、そして最終的には、成分を単純な機械的手段により混ぜ合わせる混合容器へと投入する。
【図２】図２は、内在的に取り込まれた抗原を含有するマイクロ流動化されたワクチン組成物を調製するための過程を示す。種々のワクチン成分を、添加容器に添加し、そして単純な機械的手段により混合するためのプレ乳剤混和ユニットに移す。
【図３】図３は、マイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、及びベンチ混和ワクチン調製物の液滴サイズの分布を、示す。
【図４】図４は、マイクロ流動化されたワクチン調製物では相分離しないことを示す。
【図５】図５は、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物（Ａ９０７５０５）、及び対照である三つのマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物（Ａ９０４３６９、Ａ９０４３７０及びＡ９０４３７１）中に内在的に取り込まれた抗原の安定性の比較を、示す。すべての四つのワクチン調製物を、４℃にて２年間保管した。保管中の異なる時点（０、６、１２または２４ヶ月）で、すべての四つの処方物を用いて、３ヶ月齢のウシをワクチン接種した。ワクチン接種を、２ｍｌのワクチン用量で第０日及び第２１日に行い、そして二回目のワクチン接種後２週間に、血清を採取した。ＢＶＤＩＩ型ウイルスに対する中和抗体価を、血清試料のそれぞれにおいて測定した。データを、５例の動物の幾何平均として示した。
【図６】図６は、マイクロ流動化されたワクチン及びマイクロ流動化されていないワクチンの投与前及び投与後のウシの直腸温の最小二乗平均を示す。Ｔ０１：プラセボ群−１倍用量；Ｔ０２：プラセボ群−２倍用量；Ｔ０３：マイクロ流動化されていない処方物−１倍用量；Ｔ０４：マイクロ流動化されていない処方物−２倍用量；Ｔ０５：マイクロ流動化された処方物−１倍用量；Ｔ０６：マイクロ流動化された処方物−２倍用量。
【図７】図７は、マイクロ流動化されていないワクチン処方物及びマイクロ流動化されたワクチン処方物の投与後にウシにおいて観察される注射部位反応体積の最小二乗平均を示す。Ｔ０３：マイクロ流動化されていない処方物−１倍用量；Ｔ０４：マイクロ流動化されていない処方物−２倍用量；Ｔ０５：マイクロ流動化された処方物−１倍用量；Ｔ０６：マイクロ流動化された処方物−２倍用量。
【図８】図８は、組換えＰａｕＡ抗原と大腸菌全細胞抗原の双方を含有する種々のワクチン処方物でワクチン接種後の、Streptococcus uberis由来組換えＰａｕＡ抗原のＩｇＧ力価の幾何平均を示す。
【図９】図９は、組換えＰａｕＡ抗原と大腸菌全細胞抗原の双方を含有する種々のワクチン処方物でワクチン接種後の、Streptococcus uberis由来大腸菌全細胞抗原のＩｇＧ力価の幾何平均を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ及び図１０Ｂは、最初の生成時（図１０Ａ）及び生成後２２ヶ月（図１０Ｂ）におけるマイクロ流動化されたＡｍｐｈｉｇｅｎ処方物の粒子サイズ分布を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ及び図１０Ｂは、最初の生成時（図１０Ａ）及び生成後２２ヶ月（図１０Ｂ）におけるマイクロ流動化されたＡｍｐｈｉｇｅｎ処方物の粒子サイズ分布を示す。
【図１１】図１１は、Ｑｕｉｌ Ａミセル及びコレステロール結晶とともに形成されたらせん状ミセルを示す電子顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、ＢＶＤ Ｉ型抗原の表面にＱｕｉｌ Ａ及びコレステロールにより形成されたらせん状免疫原性複合体を示す電子顕微鏡写真である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の開示】
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、ワクチン分野に関し、そして具体的には、家畜動物において免疫応答を増強するためのアジュバント処方物に関する。具体的には、本発明は、抗原の免疫原性を増強するための、サブミクロン水中油型乳剤のワクチンアジュバントとしての使用に関する。サブミクロン水中油型乳剤処方物、このような乳剤に取り込まれた抗原を含有するワクチン組成物、ならびに当該の乳剤及びワクチン調製方法が、本発明により提供される。本発明はまた、ワクチンにおける使用に適したサポニン配糖体及びステロールにより形成される複合体を含有する組成物も、提供する。
【０００３】
発明の背景
細菌、ウイルス、寄生虫及びマイコプラズマ感染は、ウシ、ブタ及びペットなどの家畜動物において、幅広く広まっている。これらの感染性因子によって引き起こされる疾患は、多くの場合、抗微生物医薬療法に耐性であり、有効な治療の手段を残さない。結論として、ワクチン学的なアプローチが、家畜動物における感染性疾患を制御するために、ますます用いられている。感染性病原体全体を、化学的不活化または適切な遺伝子操作の後に、ワクチン処方物における使用に適するようにすることが可能である。あるいは、病原体のタンパク質サブユニットを、組換え発現系にて発現させ、そしてワクチン処方物における使用のために精製することが可能である。
【０００４】
アジュバントは、概して、抗原に対する液性及び／または細胞性免疫応答を増加させる任意の材料を指す。従来のワクチンは、死滅した病原性微生物の粗調製物から構成され、そして、病原性微生物の培養に伴う不純物が、免疫応答を増強するためのアジュバントとして作用し得る。しかしながら、病原性微生物の均一な調製物または精製タンパク質サブユニットをワクチン接種用抗原として用いる場合、このような抗原によって引き起こされる免疫は不十分であり、それ故に、アジュバントとしての特定の外因性材料の添加が、必要となってくる。さらに、合成ワクチン及びサブユニットワクチンは、生産コストが高い。したがって、アジュバントを用いると、免疫応答を刺激するために必要とされる投与量がより少量で、それによってワクチンの生産コストが抑えられる可能性がある。
【０００５】
アジュバントは、免疫応答を増強するための多くの異なる経路で作用することが知られている。多くのアジュバントは、免疫応答に関連するサイトカインネットワークを修飾する。これらの免疫調節アジュバントは、それらが抗原と一緒でない場合でさえも、その効果を発揮することが可能である。一般に、免疫調節アジュバントは、特定のサイトカインの一般的な亢進、及び同時に他のサイトカインの低下を引き起こし、細胞性Ｔｈ１及び／または液性Ｔｈ２応答へと導く。
【０００６】
あるアジュバントは、抗原の立体配座の完全性を保存する能を有し、そのために抗原が適切な免疫エフェクター細胞に効率的に提示されることが可能である。アジュバント処方物による抗原の立体配座のこの保存の結果として、ワクチンは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）に関して示されるように、有効期間が増すことになる。Ozel M.ら；Quarternary Structure of the
Immunestimmulating Complex (Iscom), J.of Ultrastruc. and Molec. Struc. Res.
102, 240-248（1989年）。
【０００７】
あるアジュバントは、注射部位にデポー（depot）として抗原を保持する特性を有する。このデポー効果の結果として、抗原は、肝クリアランスによって急速には消失しない。アルミニウム塩及び油中水型乳剤は、このデポー効果を介して、より短期間に作用する。例えば、油中水型乳剤であるフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）を用いることによって、長期のデポーを得ることが可能である。ＦＣＡは、典型的には、抗原提示細胞による抗原の除去が生分解により可能となるまで、注射部位に留まり続ける。
【０００８】
それらの物理的な性質に基づき、アジュバントを、二つの非常に大まかなカテゴリー、すなわち、粒子状アジュバントと非粒子状アジュバントとに分類することが可能である。粒子状アジュバントは、ミクロ粒子として存在する。免疫原は、ミクロ粒子を取り込むか、あるいはそれと会合することが可能である。アルミニウム塩、油中水型乳剤、水中油型乳剤、免疫刺激複合体、リポソーム、ならびにナノ及びミクロ粒子は、粒子状アジュバントの例である。非粒子状アジュバントは、一般には、免疫調節物質であり、そしてこれらは、一般には、粒子状アジュバントと併せて用いられる。ムラミルジペプチド（マイコバクテリアから抽出されるペプチドグリカンのアジュバント活性成分）、非イオン性ブロック共重合体、サポニン（シャボンノキ（Quillaja saponaria）の樹皮から抽出されるトリテルペノイドの複合混合物）、リピドＡ（２個のリン酸基及び５または６個の概してＣ１２〜Ｃ１６長の脂肪酸鎖を有する、グルコサミンの二糖類）、サイトカイン、炭水化物重合体、誘導体化多糖類、ならびに、コレラ毒素及び大腸菌（E. coli）不安定毒素（ＬＴ）などの細菌毒素が、非粒子状アジュバントの例である。
【０００９】
最も知られているアジュバントの一部は、非粒子状免疫調節物質と、デポー効果をアジュバント処方物に授け得る粒子状材料との組み合わせである。例えば、ＦＣＡは、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）成分の免疫調節特性を、油型乳剤の短期デポー効果とともに組み合わせている。
【００１０】
油型乳剤は、ワクチンアジュバントとして長い間使われている。Le Moignic及びPinoyは、1916年に、死滅ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）の鉱油懸濁液が免疫応答を増加させることを、見いだした。これに続き1925年には、Ramonが、スターチ油をジフテリアトキソイドへの抗毒素応答を増大させる物質の一つとして記載した。しかしながら、油型乳剤は、フロイントが現在フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）として公知のアジュバント処方物を公表した1937年まで、一般的にはならなかった。ＦＣＡは、死滅マイコバクテリア及びアラセルＡと混合された鉱（パラフィン）油から構成される、油中水型乳剤である。アラセルＡは、主にマンニドモノオレエートであり、そして乳化剤として用いられる。ＦＣＡは、抗体応答の誘導に優れているにもかかわらず、重度の疼痛、膿瘍形成、発熱及び肉芽腫性炎症を引き起こす。これらの望ましくない副作用を避けるために、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が開発された。ＩＦＡは、マイコバクテリア成分がないことを除けば、ＦＣＡとその組成が類似している。ＩＦＡは、注射部位におけるデポー形成、及び抗体産生細胞の刺激による抗原の徐放を介して、作用する。
【００１１】
ＦＣＡを改善するための別のアプローチは、鉱油を生体適合性の油により置き換えることが、注射部位におけるＦＣＡに関連する反応を除去するのに役立つであろうとの概念に基づいた。乳剤は油中水型乳剤よりもむしろ水中油型乳剤であるべきとも、前者が長期間持続するデポーを注射部位に作り出すことから、考えられていた。Hillemanらは、ピーナツ油８６％、乳化剤としてのアラセルＡ １０％、及び安定剤としてのモノステアリン酸アルミニウム４％からなる油性アジュバント「アジュバント６５」について記載した。Hilleman, 1966年、Prog. Med. Virol. 8：131-182；Hilleman及びBeale,
1983年、New Approaches to Vaccine Development（Bell, R.及びTorrigiani, G.編集）中、Schwabe, Basel。ヒトにおいて、アジュバント６５は安全かつ強力であったが、しかしＩＦＡよりも低いアジュバント活性を示した。それにもかかわらず、アジュバント６５の使用は、特定ロットのヒトに対するワクチンでの反応原性、及び精製もしくは合成乳化剤がアラセルＡの代わりに用いられる場合のアジュバント活性の低減により、中止された。米国特許第5,718,904及び第5,690,942は、安全性プロファイルを改善する目的で、水中油型乳剤中の鉱油を代謝可能な油に置き換えることが可能であることを、教示している。
【００１２】
アジュバント活性及び安全性の他に、乳剤の物理的外観もまた、市販のために考慮すべき重要なことである。物理的外観は、乳剤の安定性に依存する。クリーミング、沈降及び癒合は、乳剤の不安定さの指標である。クリーミングは、乳剤の油相と水相とが異なる比重である場合に生じる。クリーミングはまた、乳剤の初期の液滴サイズが大きく、かつ乳剤の液滴が全くブラウン運動をしていない場合にも、生じる。液滴サイズが大きい場合、界面が破裂する傾向があり、そして液滴が大きな粒子に癒合する。乳剤の安定性は、用いられる乳化剤の性質及び量、乳剤中での液滴サイズのサイズ、ならびに油相と水相との間の密度の差異などの多数の要因によって決まる。
【００１３】
乳化剤は、界面の自由エネルギーを低減し、そして液滴の癒合に対する物理的もしくは静電気的なバリアを作り出すことによって、分散している液滴の安定性を促進する。非イオン性及びイオン性界面活性剤は、乳化剤として使用されている。非イオン性乳化剤は、界面にて配向し、そして比較的分厚い構造を作り出すが、このことにより分散している液滴が立体的に回避される。陰イオンもしくは陽イオン乳化剤は、対イオンをひきつけることによって電気二重層の形成を誘導し；二重層の反発力は、液滴を、それらが接近するときに互いに反発させる。
【００１４】
乳化剤を用いる他に、乳剤の安定性は、機械的な手段によって乳剤の液滴サイズを低減することによっても、達成可能である。典型的には、プロペラミキサー、タービンローター、コロイドミル、ホモジナイザー及びソニケーターが、乳剤を製造するために用いられている。マイクロ流動化は、乳剤における液滴サイズの均一性を増加させる別の方法である。マイクロ流動化は、サブミクロン範囲の一定した粒子サイズの繊細で物理的に安定な乳剤を作り出すことが可能である。乳剤の安定性を増加させる他に、マイクロ流動化の過程は、最終産物の無菌性を確実にする好ましい方法である最終ろ過を可能とする。その上、サブミクロンの油粒子は、注射部位からリンパ管へ入り、次いでドレナージ連鎖のリンパ節、血液及び脾臓を通ることが可能である。このことは、局所的炎症及び有意な注射部位反応を作り出す可能性のある油のデポーを注射部位に確立する可能性を低減する。
【００１５】
マイクロ流動化装置は、現在、市販されている。乳剤の形成は、マイクロ流動化装置において、相互作用チャンバー内で二つの流動化された流れが高速で相互作用するときに生じる。マイクロ流動化装置は、空気または窒素を駆動し、そして過剰の２０，０００ｐｓｉの内部圧力にて動作することが可能である。米国特許第4,908,154は、いかなる乳化剤も本質的に含まない乳剤を得るためのマイクロ流動化装置の使用を、教示している。
【００１６】
多数のサブミクロン水中油型アジュバント処方物が、文献に記載されている。米国特許第5,376,369は、Syntaxアジュバント処方物（ＳＡＦ）として公知のサブミクロン水中油型乳剤アジュバント処方物を、教示している。ＳＡＦは、油成分としてのスクアレンまたはスクアラン、乳剤を形成する量のPluronic L121（ポリオキシ−プロピレン−ポリオキシエチレン）ブロック重合体、及び免疫を増強する量のムラミルジペプチドを、含有する。スクアレンは、多くの組織中（特に、サメ及び他の魚類の肝臓中）に見いだされる、コレステロールの直線状の炭化水素前駆体である。スクアランは、スクアレンの水素添加により調製され、かつ完全に飽和している。スクアレンとスクアランの双方は、代謝されることが可能であり、そして毒性学試験の成績は良好である。スクアレンもしくはスクアラン乳剤は、ヒト癌ワクチンにおいて使用され、軽度の副作用及び望ましい有効性を伴う。例えば、Anthony C. Allison, 1999年、Squalene and
Squalane emulsions as adjuvants, Methods 19:87-93を参照されたい。
【００１７】
米国特許第6,299,884及び国際特許公報WO 90/14837は、ポリオキシ−プロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体がサブミクロン水中油型乳剤の形成に必須ではないことを、教示している。その上、これらの参考文献は、非毒性の代謝可能な油の使用を教示し、そして鉱油及び毒性石油蒸留油のその乳剤処方物における使用を明確に除外している。
【００１８】
米国特許第5,961,970は、ワクチンアジュバントとして用いられるさらに別のサブミクロン水中油型乳剤を教示している。本特許に記載される乳剤において、疎水性成分は、中鎖トリグリセリド油、植物油及びその混合物からなる群より選択される。この乳剤に含まれる界面活性剤は、リン脂質（例えば、レシチン）などの天然の生物学的に適合性の界面活性剤、あるいはＴＷＥＥＮ−８０などの医薬的に許容可能な非天然の界面活性剤であることが可能である。この特許はまた、乳剤を形成するときに抗原を乳剤中へ取り込むことを教示しており、乳剤を独立的かつ外来的に形成した後に抗原を乳剤と混合するのとは対照的である。
【００１９】
米国特許第5,084,269は、鉱油と組み合わせてレシチンを含有するアジュバント処方物が、宿主動物内での刺激を減少させ、そして同時に全身性免疫の増加を誘導することを、教示している。米国特許第5,084,269から得られたアジュバント処方物は、商品名ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）で、動物用ワクチンにおいて商業的に用いられている。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物は、ミセル−レシチンに囲まれた油滴で構成される。これらのミセルは、従来の油に基づくアジュバントよりも多くの全細胞抗原の付着を可能にする。その上、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）に基づくワクチン処方物は、典型的には１０％〜２０％の油を含有する油アジュバントを含有する他のワクチン処方物と比較して、２．５〜５％の鉱油と、低い油量を含有する。この低い油量が、このアジュバントに基づくワクチン処方物の注射部位組織に対する刺激を低下させて、屠殺時により少ない病変及びより少ないトリムを生じる。加えて、油滴を囲んでいるレシチン被覆は、注射部位反応をさらに低減し、安全かつ有効なワクチンをもたらす。
【００２０】
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物は、多数の動物用ワクチンにおいてアジュバントとして用いられ、そしてワクチン製品の物理的外観は、短期及び長期の保管期間中ならびに再構成時に維持される必要がある。加えて、凍結乾燥させた抗原を、予め調製しておいたアジュバント処方物と、注射直前に混合する。この実行は、水中油型乳剤内での抗原の均一な分布を必ずしも確実にするわけではなく、そして乳剤の外観は望ましくない可能性がある。その上、均質化された乳剤は、静置すると相分離を示し得る。したがって、長期の有効期間に相分離を示さない安定なアジュバント処方物の必要性が存在する。相分離を防ぐ一つの方法は、液滴サイズを小さくし、そして乳剤の粒子均一性を増加させることである。代謝可能な油性乳剤処方物のマイクロ流動化の過程が文書化されているものの、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物などの水中油型乳剤のマイクロ流動化は、まだ実行されていない。
【００２１】
本発明では、マイクロ流動化を、レシチンに囲まれた鉱油の液滴サイズをサブミクロンサイズにするために用いている。予想外にも、本発明者は、レシチンと油との混合物からなる水中油型乳剤をアジュバントとして添加したワクチン処方物のマイクロ流動化が、処方物の物理的外観を改善するだけでなく、処方物の免疫化効果も増強することを、発見した。マイクロ流動化された処方物はまた、改善された安全性プロファイルによっても特徴付けられる。
【００２２】
発明の概要
本発明者は、代謝可能でない油に基づく水中油型乳剤のアジュバント活性及び安全性プロファイルが、マイクロ流動化を介して改善可能であることを、予想外にも発見した。マイクロ流動化された乳剤に取り込まれた抗原は、抗原をマイクロ流動化の前に乳剤中に内在的に取り込む場合でも、安定である。
【００２３】
したがって、一実施態様において、本発明は、ワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油型乳剤処方物を提供する。本発明のサブミクロン水中油型乳剤は、代謝可能でない油、少なくとも一つの界面活性剤、及び水溶性成分から構成され、ここで油は、サブミクロン範囲の平均の油滴サイズで水溶性成分中に分散している。好ましい代謝可能でない油は、軽質鉱油である。好ましい界面活性剤としては、レシチン、ＴＷＥＥＮ（商標登録）−８０及びＳＰＡＮ（商標登録）−８０が挙げられる。
【００２４】
本発明により提供される好ましい水中油型乳剤は、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物から構成される。
本発明の水中油型乳剤は、保存剤、浸透圧剤、生体接着分子及び免疫刺激分子などの適切かつ望ましい成分をさらに含むことが可能である。好ましい免疫刺激分子としては、例えば、Ｑｕｉｌ
Ａ、コレステロール、ＧＰＩ−０１００、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）が挙げられる。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、サブミクロン水中油型乳剤の調製方法を提供する。本発明によると、油、１またはそれより多くの界面活性剤、水溶性成分、及び乳剤における使用に適した任意の他の成分を始めとする乳剤の種々の成分を、混ぜ合わせる。該混合物を最初の乳化過程にかけて、水中油型乳剤を形成し、次いでこれをマイクロ流動化装置に通して、液滴が直径１ミクロン未満、好ましくは平均液滴サイズ０．５ミクロン未満の水中油型乳剤を得る。
【００２６】
さらに別の実施態様において、本発明は、抗原及び上述のサブミクロン水中油型乳剤を含有するワクチン組成物を提供する。抗原は、外来的あるいは内在的に、好ましくは内在的に、乳剤中に取り込まれている。
【００２７】
本発明のワクチン組成物に含まれることが可能な抗原は、細菌、真菌またはウイルスの抗原、あるいはその組み合わせであることが可能である。該抗原は、不活化した細胞またはウイルスの全体または一部の調製物の形態を取るか、あるいは慣用のタンパク質精製、遺伝子操作技術または化学合成によって得られる抗原分子の形態を取ることが可能である。
【００２８】
さらなる実施態様において、本発明は、抗原（単数または複数）をサブミクロン水中油型乳剤と組み合わせて含有するワクチン組成物の調製方法を、提供する。
本発明のワクチン組成物を調製する際に、抗原を、内在的（例えば、マイクロ流動化の前に）あるいは外来的（例えば、マイクロ流動化の後に）に水中油型乳剤の成分と組み合わせることが可能である。
【００２９】
さらに別の実施態様において、本発明は、マイクロカプセル化された抗原及び上述のサブミクロン水中油型乳剤を含有し、ここでマイクロカプセル化された抗原が乳剤と外来的に組み合わされているワクチン組成物を、提供する。
【００３０】
サポニンとステロールが、溶液中で組み合わされる場合に、互いに会合して、らせん状ミセルの形状の複合体を形成することもまた、驚くべきことに発見された。本発明によると、これらのらせん状ミセル複合体は、免疫刺激活性を有し、そしてワクチン組成物におけるアジュバントとして特に有用である。
【００３１】
したがって、本発明は、サポニン及びステロールを含有し、ここでサポニンとステロールがらせん状ミセルの形状の複合体を形成しているワクチン組成物を、提供する。本発明はまた、サポニン、ステロール及び抗原を含有し、ここでサポニンとステロールがらせん状ミセルの形状の複合体を形成し、そして該抗原がらせん状ミセルと混合されているが、しかしその内部には取り込まれていない組成物も、提供する。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明者は、レシチンと鉱油との混合物からなる水中油型乳剤をアジュバントとして添加したワクチン処方物のマイクロ流動化が、ワクチン処方物の物理的外観を改善するばかりでなく、ワクチン処方物の免疫化効果も増強することを、予想外にも発見した。マイクロ流動化されたワクチン処方物は、改善された安全性プロファイルによっても特徴付けられる。
【００３３】
これらの発見に基づき、本発明は、ワクチン組成物におけるアジュバントとして有用なサブミクロン水中油型乳剤を提供する。これらのサブミクロン水中油型乳剤をマイクロ流動化装置を用いることによって作る方法もまた、提供される。さらに、本発明は、抗原がサブミクロン水中油型乳剤と組み合わされているサブミクロンワクチン組成物を、提供する。このようなワクチン組成物を作るための方法もまた、提供される。本発明は、サブミクロン水中油型乳剤と組み合わせてマイクロカプセル化された抗原を含有するワクチン組成物、ならびにこのようなワクチンを作るための方法を、さらに提供する。
【００３４】
開示を明確にし、かつ限定しない目的で、発明の詳細な説明を、本発明の特定の特徴、実施態様または応用について記載または例示する以下のサブセクションに分割する。
サブミクロン水中油型乳剤
一実施態様において、本発明は、ワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油型乳剤処方物を提供する。本発明のサブミクロン水中油型乳剤は、ワクチン組成物における抗原の免疫原性を増強し、動物への投与に安全であり、かつ保管中は安定である。
【００３５】
本発明のサブミクロン水中油型乳剤は、代謝可能でない油、少なくとも一つの界面活性剤、及び水溶性成分から構成され、ここで油は、サブミクロン範囲の平均的な油滴サイズで水溶性成分中に分散している。
【００３６】
「サブミクロン」は、液滴が１μｍ（ミクロン）未満のサイズで、かつ平均の（average）または平均（mean）油滴サイズが１μｍ未満であることを意味する。好ましくは、乳剤の平均液滴サイズは、０．８μｍ未満；より好ましくは０．５μｍ未満；そしてよりいっそう好ましくは０．４μｍ未満、または約０．１〜０．３μｍ未満である。
【００３７】
「平均液滴サイズ」は、粒子サイズの体積分布内での体積平均径（ＶＭＤ）の粒子サイズとして定義される。ＶＭＤは、各粒子の直径をそのサイズの全粒子の体積とかけ合わせ、そして合計することにより、算出される。次いで、これを全粒子の総体積で割る。
【００３８】
「代謝可能でない油」の語は、本明細書では、乳剤が投与される動物個体の体により代謝されることが可能でない油を指す。
「動物」及び「動物個体」の語は、本明細書では、例えばウシ、ヒツジ及びブタを始めとする、すべてのヒトでない動物を指す。
【００３９】
本発明の乳剤における使用に適した代謝可能でない油としては、アルカン、アルケン、アルキン、ならびにそれに対応する酸及びアルコール、そのエーテル及びエステル、ならびにその混合物が挙げられる。好ましくは、油の個々の化合物は、軽質炭化水素化合物であって、すなわち、このような成分は６〜３０個の炭素原子を有する。油は、合成的に調製されるか、または石油生成物から精製されることが可能である。本発明の乳剤における使用に好ましい代謝可能でない油としては、例えば、鉱油、パラフィン油及びシクロパラフィンが挙げられる。
【００４０】
「鉱油」の語は、蒸留技術によってペトロラタムから得られる液体炭化水素の混合物を指す。該語は、「液化パラフィン」、「液体ペトロラタム」及び「白色鉱油」と同義である。該語はまた、「軽質鉱油」、すなわち、ペトロラタムの蒸留により同様に得られるが、ただし白色鉱油よりもわずかに低い比重である油を含むことも、意図する。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版（Easton、ペンシルバニア州：Mack Publishing Company,
1990年、788頁及び1323頁）を参照されたい。鉱油は、例えばJ.T. Baker（Phillipsburg、ペンシルバニア州）、USB Corporation（クリーブランド、オハイオ州）などの種々の市販元から得ることが可能である。好ましい鉱油は、ＤＲＡＫＥＯＬ（商標登録）の名前で市販されている軽質鉱油である。
【００４１】
典型的には、本発明のサブミクロン乳剤の油成分は、１％〜５０％容量の量；好ましくは、１０％〜４５の量；より好ましくは、２０％〜４０％の量で、存在する。
本発明の水中油型乳剤は、典型的には、少なくとも一つ（すなわち、１またはそれより多く）の界面活性剤を含む。界面活性剤及び乳化剤（本明細書ではこれらの語を同義的に用いる）は、油滴の表面を安定化し、そして所望のサイズ内に油滴を維持する剤である。
【００４２】
本発明の乳剤における使用に適した界面活性剤としては、天然の生物学的に適合性の界面活性剤、及び非天然の合成界面活性剤が挙げられる。生物学的に適合性の界面活性剤としては、リン脂質化合物またはリン脂質の混合物が挙げられる。好ましいリン脂質は、大豆もしくは卵レシチンなどのホスファチジルコリン（レシチン）である。レシチンは、粗植物油を水で洗浄し、そして得られた含水ゴムを分離及び乾燥することにより、ホスファチドとトリグリセリドの混合物として得られることが可能である。精製された生成物は、トリグリセリド及び植物油をアセトン洗浄により除去した後に残留する、アセトン不溶性リン脂質及び糖脂質の混合物を分画することにより、得られることが可能である。あるいは、レシチンを、種々の市販元から得ることが可能である。他の適切なリン脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。リン脂質は、天然源から単離されても、または慣用的に合成されてもよい。
【００４３】
本発明のサブミクロン乳剤における使用に適した非天然の合成界面活性剤としては、例えば脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤（ＳＰＡＮ（商標登録）またはＡＲＬＡＣＥＬ（商標登録）の名前で市販されている）などのソルビタンに基づく非イオン性界面活性剤、ポリエトキシ化ソルビトールの脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ（商標登録））、ヒマシ油などの源から得られる脂肪酸のポリエチレングリコールエステル（ＥＭＵＬＦＯＲ）；ポリエトキシ化脂肪酸（例えば、ＳＩＭＵＬＳＯＬ
Ｍ−５３の名前で入手可能なステアリン酸）、ポリエトキシ化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒド重合体（ＴＹＬＯＸＡＰＯＬ）、ポリオキシエチレン脂肪酸アルコールエーテル（ＢＲＩＪ（商標登録））；ポリオキシエチレンノンフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標登録）Ｎ）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標登録）Ｘ））が挙げられる。好ましい合成界面活性剤は、ＳＰＡＮ（商標登録）及びＴＷＥＥＮ（商標登録）の名前で入手可能な界面活性剤である。
【００４４】
本発明の水中油型乳剤における使用のための好ましい界面活性剤としては、レシチン、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＳＰＡＮ−８０が挙げられる。
一般的には、界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせ（２またはそれより多くの界面活性剤が用いられる場合）は、０．０１％〜１０％容量、好ましくは０．１％〜６．０％、より好ましくは０．２〜５．０％の量にて、乳剤中に存在する。
【００４５】
水溶性成分は、乳剤の連続相を構成し、そして水、緩衝生理食塩液または任意の他の適切な水溶液であることが可能である。
本発明の水中油型乳剤は、保存剤、浸透圧剤、生体接着分子及び免疫刺激分子を始めとする適切かつ望ましい成分を、さらに含むことが可能である。
【００４６】
生体接着分子は、標的粘膜表面での、またはこれを介した抗原の送達及び付着を増強し、粘膜免疫を授与することが可能であると考えられている。適切な生体接着分子の例としては、ポリアクリル酸及びポリメタクリル酸（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標登録）、ＣＡＲＢＯＭＥＲ）などの、天然に生じるものではない酸性重合体；カルボキシメチルセルロースなどの合成的に修飾された酸性の天然重合体；（ヒドロキシプロピル）メチルセルロースなどの合成的に修飾された中性の天然重合体；キトサンなどの塩基性アミン保有重合体；アルギニン酸、ヒアルロン酸、ペクチン、トラガカントゴム及びカラヤゴムなどの天然源から得ることが可能な酸性重合体；ならびに、ポリビニルアルコールなどの天然に生じるものではない中性重合体；あるいはその組み合わせが挙げられる。
【００４７】
「免疫刺激分子」の語句は、本明細書では、ワクチン組成物中の抗原性成分によって誘導される防御免疫応答を増強するこれらの分子を指す。適切な免疫刺激材料としては、細菌細胞壁成分（例えば、ムラブチド、トレオニル−ＭＤＰ及びムラミルトリペプチドなどのＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン誘導体）；サポニン配糖体及びその誘導体（例えば、Ｑｕｉｌ
Ａ、ＱＳ ２１及びＧＰＩ−０１００）；コレステロール；ならびに、第四級アンモニウム化合物（例えば、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）及びＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（「アブジリン」））が挙げられる。
【００４８】
サポニンは、多様な植物種において二次代謝産物として産生される配糖体化合物である。サポニンの化学構造は、強力かつ効果的な免疫学的活性を始めとする、幅広い薬理学的及び生物学的活性を授ける。
【００４９】
構造的には、サポニンは、１またはそれより多くの糖鎖に付着している任意のアグリコンからなる。サポニンは、そのアグリコン組成によって分類されることが可能である：トリテルペン配糖体、ステロイド配糖体及びステロイドアルカロイド配糖体。
【００５０】
サポニンは、シャボンノキ（Quillaja saponaria）の樹皮から単離されることが可能である。サポニンは、免疫刺激剤として長く知られてきた。Dalsgaard, K.、「Evaluation of its adjuvant
activity with a special reference to the application in the vaccination of
cattle against foot-and-mouth disease」、Acta. Vet.
Scand. 69:1-40、1978年。サポニンを含有する植物の粗抽出物は、足口病ワクチンの効力を増強した。しかしながら、該粗抽出物は、ワクチンにおいて用いられた場合に副作用を伴った。これに続き、Dalsgaardは、サポニン由来のアジュバント活性成分を、透析、イオン交換及びゲルろ過クロマトグラフィによって部分精製した。Dalsgaard, K.ら、「Saponin adjuvants III.
Isolation of a substance from Quillaja saponaria Morina with adjuvant activity in
foot-and-mouth disease vaccines」、Arch. Gesamte.
Virusforsch. 44:243-254、1974年。この方法にて精製されたアジュバント活性成分は、「Ｑｕｉｌ
Ａ」として公知である。重量に基づくと、粗サポニンと比較した場合に、Ｑｕｉｌ Ａは効力の増加を示し、かつ局所反応を低減した。Ｑｕｉｌ Ａは、動物用ワクチンにおいて広く用いられている。
【００５１】
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によるＱｕｉｌ Ａのさらなる分析によって、密接に関連するサポニンの不均一な混合物が示され、そして毒性が低減したかまたは最小限の強力なアジュバントであるＱＳ２１の発見が導びかれた。Kensil C.R.ら、「Separation and
characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria
Molina cortex」、J. Immunol. 146:431-437、1991年。ほとんどの他の免疫刺激剤とは異なり、ＱＳ２１は、水溶性で、かつ乳剤型処方物の有無にかかわらずワクチンにおいて使用可能である。ＱＳ２１は、マウスにおいてＴｈ１型応答を誘発し、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ抗体の産生を刺激し、そしてサブユニット抗原に応答して抗原特異的ＣＤ８＋
ＣＴＬ（ＭＨＣクラスＩ）を誘導することが、示されている。ヒト臨床試験では、許容可能な毒性学的プロファイルを伴うそのアジュバント活性が、証明された。Kensil, C.R.ら、「Structural and imunological
charaterization of the vaccine adjuvant QS-21. In Vaccine Design: the subunit
and Adjvuant Approach」、Powell, M.F.及びNewman, M. J.編集、Plenum Publishing
Corporation、ニューヨーク州、1995年、525〜541頁。
【００５２】
米国特許第6,080,725は、サポニン−リポフィル（lilpophile）結合体の作製方法及び使用方法を教示している。このサポニン−リポフィル結合体では、脂質、脂肪酸、ポリエチレングリコールまたはテルペンなどのリポフィル部分が、アシル化されていないかまたはデスアシル化されたトリテルペンサポニンと、トリテルペンサポニンの３−Ｏ−グルクロン酸上に存在するカルボキシ基を介して共有結合している。リポフィル部分と、Quillajaデスアシルサポニンなどのサポニン、lucyoside P、またはGypsophila属、saponaria属及びAcanthophyllum属由来サポニンの３−Ｏ−グルクロン酸との結合は、液性免疫及び細胞を介した免疫へのそのアジュバント効果を増強する。加えて、リポフィル部分と非アシルもしくはデスアシルサポニンの３−Ｏ−グルクロン酸残基との結合は、元のサポニンよりも精製し易く、低毒性で、化学的に安定で、かつ同等または優れたアジュバント特性を有するサポニン類似体を、もたらす。
【００５３】
ＧＰＩ−０１００は、米国特許第6,080,725に記載されるサポニン−リポフィル結合体である。ＧＰＩ−０１００は、脂肪族アミンをグルクロン酸のカルボキシル基を介してデスアシルサポニンに付加することにより、生成される。
【００５４】
第四級アンモニウム化合物−多数の脂肪族窒素含有塩基が、アミン、第四級アンモニウム化合物、グアニジン、ベンズアミジン及びチオウロニウムを始めとする免疫学的アジュバントとしての使用を提唱されている。具体的なこのような化合物としては、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）及びＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（「アブジリン」）が挙げられる。
【００５５】
米国特許第5,951,988は、油成分と併せてＤＤＡなどの第四級アンモニウム塩を含有するアジュバント処方物を、教示する。この処方物は、免疫原性応答を増強するために公知の免疫学的物質（例えばワクチン組成物中のウイルスもしくは細菌抗原）と併せて、有用である。該組成物は、非特異的な免疫刺激処方物として、取り込まれた抗原がなくても有用である。
【００５６】
米国特許第4,310,550は、ワクチンアジュバントとして脂肪もしくは脂質乳剤とともに処方物化したＮ，Ｎ−高級アルキル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン及びＮ，Ｎ−高級アルキル−キシリレンジアミンの使用を、記載している。ヒトまたは動物においてアジュバント処方物の非経口投与を介して抗原の免疫原性応答を誘導または増強する方法は、米国特許第4,310,550に記載されている。
【００５７】
好ましい実施態様において、本発明は、液滴サイズが１μｍ未満であり、かつ平均液滴サイズが約０．２５μｍのＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物から構成される、ワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油型乳剤を提供する。
【００５８】
「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物」の語は、本明細書では、ＤＲＡＫＥＯＬ（商標登録）レシチン油溶液（Hydronics社、リンカーン、ネブラスカ州）と生理食塩溶液とをＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０の存在下で混合することによって形成される溶液を、指す。典型的なＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物は、軽質鉱油４０％容量（ｖ／ｖ）、レシチン約２５％ｗ／ｖ、ＴＷＥＥＮ
８０ 約０．１８％容量（ｖ／ｖ）及びＳｐａｎ ８０ 約０．０８％容量（ｖ／ｖ）を含有する。
【００５９】
サブミクロン水中油型乳剤の調製方法
別の実施態様において、本発明は、上述のサブミクロン水中油型乳剤の調製方法を提供する。
【００６０】
本発明によると、油、１またはそれより多くの界面活性剤、水溶性成分、及び乳剤における使用に適した任意の他の成分を始めとする乳剤の種々の成分を、組み合わせ、そして混ぜ合わせる。
【００６１】
形成された混合物を、典型的には１もしくはそれより多くのホモジナイザーまたは乳化装置に１回以上通すことによる乳化過程にかけて、均一な外観及び約０．５μｍの平均の液滴サイズの水中油型乳剤を形成する。例えばRoss乳化装置（Hauppauge、ニューヨーク州）、Gaulinホモジナイザー（Everett、マサチューセッツ州）などの市販されている任意のホモジナイザー及び乳化装置を、本目的のために用いることが可能である。
【００６２】
次いで、このように形成された乳剤を、マイクロ流動化にかけて、サブミクロン範囲の液滴サイズをもたらす。マイクロ流動化は、Microfluidics社（ニュートン、マサチューセッツ州）から入手可能なモデル番号１１０Ｙ；Gaulinモデル３０ＣＤ（Gaulin, Inc.、Everett、マサチューセッツ州）；及びRainnie Minilab ８．３０Ｈ型（Miro Atomizer Food and Dairy, Inc.、ハドソン、ウィスコンシン州）などの市販のマイクロ流動化装置の使用によって、行うことが可能である。これらのマイクロ流動化装置は、二つの液流が相互作用チャンバー内で高速で相互作用して液滴がサブミクロンサイズの乳剤を形成するように、小さな開口部を介して高圧下で液体を強引に通すことによって、動作する。
【００６３】
液滴サイズは、例えばレーザー回折、市販の定寸装置の使用によるなどの当該技術分野において公知の多様な方法によって、測定することが可能である。サイズは、用いる界面活性剤の種類、油に対する界面活性剤の割合、動作圧、温度等に応じて異なってもよい。当業者は、過度の実験を行うことなく所望の液滴サイズの乳剤を得るために、これらのパラメータの所望の組み合わせを決定することが可能である。本発明の乳剤の液滴サイズは、直径１μｍ未満、好ましくは平均液滴サイズ０．８μｍ未満、そしてより好ましくは平均液滴サイズ０．５μｍ未満、そしてよりいっそう好ましくは平均液滴サイズ０．３μｍ未満である。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様において、Hydronics社（リンカーン、ネブラスカ州）から市販され、そして軽質鉱油中に２５％のレシチンを含有するＤＲＡＫＥＯＬレシチン油溶液を、生理食塩液、ならびに界面活性剤であるＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０と組み合わせ、そして混合して、「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）溶液」または「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物」を形成する。次いで、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）溶液をRoss（商標登録）（Hauppauge、ニューヨーク州、11788）乳化装置でおよそ３４００ｒｐｍにて乳化して、水中油型乳剤を形成する。続いて、乳剤を、約４５００±５００ｐｓｉで動作しているマイクロ流動化装置に、一度通す。マイクロ流動化された水中油型乳剤は、１μｍ未満のサイズの液滴を有し、平均液滴サイズ約０．２５μｍである。
【００６５】
サブミクロン水中油型乳剤に取り込まれた抗原を含有する、ワクチン組成物
別の実施態様において、本発明は、抗原及び上述のサブミクロン水中油型乳剤を含有するワクチン組成物を、提供する。これらのワクチン組成物は、増強された免疫原性効果及び改善された物理的外観を有することによって、特徴付けられる（例えば、長期の保管後に相分離が認められない）。加えて、本発明のワクチン組成物は、動物への投与に関して安全である。
【００６６】
本発明によると、抗原を、外来的に、また好ましくは内在的に乳剤と組み合わせることが可能である。「内在的に」の語は、マイクロ流動化工程の前に抗原を乳剤成分と組み合わせる過程を指す。「外来的に」の語は、乳剤をマイクロ流動化した後に抗原を乳剤に添加する過程を指す。外来的に添加された抗原は、遊離抗原であることが可能であり、あるいは以下にさらに記載するように、ミクロ粒子中にカプセル化されることが可能である。
【００６７】
「抗原」の語は、本明細書では、動物において免疫原性であって、かつワクチン組成物が投与される動物において防御免疫応答を誘発するためにワクチン組成物中に含まれる、任意の分子、化合物または組成物を指す。
【００６８】
抗原に関連して用いられる「免疫原性」の語は、動物において抗原に対する免疫応答を誘発する抗原の能を指す。該免疫応答は、細胞性Ｔ細胞によって主に媒介される細胞性免疫応答、あるいは次にＢ細胞を活性化して抗体産生へと導く、ヘルパーＴ細胞によって主に媒介される液性免疫応答であることが可能である。
【００６９】
「防御免疫応答」は、抗原または抗原を含有する病原体により引き起こされる障害もしくは疾患の発生を防ぐかまたは検出可能に低下させるか、あるいはその重症度を除くかまたは検出可能に低減するか、あるいはその進行速度を検出可能に遅くする、動物において生じる、抗体または細胞のいずれかを介した免疫応答あるいはその双方である任意の免疫応答として、定義される。
【００７０】
本発明のワクチン組成物に含まれることが可能な抗原としては、不活化した細胞の全体または一部の調製物の形態、あるいは慣用のタンパク質精製、遺伝子操作技術または化学合成によって得られる抗原分子の形態の、Mycoplasma hyopneumoniae、Haemophilus somnus、Haemophilus parasuis、Bordetella
bronchiseptica、Actinobacillus pleuropneumonie、Pasteurella multocida、Manheimia hemolytica、Mycoplasma bovis、Mycoplasma galanacieum、Mycobacterium bovis、Mycobacterium
paratuberculosis、クロストリジウム属、Streptococcus uberis、Streptococcus suis、Staphylococcus aureus、Erysipelothrix rhusopathiae、カンピロバクター属、Fusobacterium
necrophorum、大腸菌、Salmonella enterica serovars、レプトスピラ属などの病原性細菌；カンジダなどの病原性真菌；Cryptosporidium parvum、Neospora canium、Toxoplasma gondii、エイメリア属などの原虫； Ostertagia、Cooperia、Haemonchus、Fasciolaなどの蠕虫から調製される抗原が、挙げられる。抗原としては、さらに、不活化した細胞の全体または一部の調製物の形態、あるいは慣用のタンパク質精製、遺伝子操作技術または化学合成によって得られる抗原分子の形態の、ウシヘルペスウイルス−１、３、６、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）１型及び２型、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシ白血病ウイルス、牛疫ウイルス、足口病ウイルス、狂犬病、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ブタパルボウイルス、ＰＲＲＳウイルス、ブタサーコウイルス、インフルエンザウイルス、ブタ水疱病ウイルス、Ｔｅｃｈｅｎ熱ウイルス、仮性狂犬病ウイルスなどの病原性ウイルスが、挙げられる。
【００７１】
抗原の量は、水中油型乳剤と組み合わせた抗原が、動物において防御免疫応答を誘導するのに有効なようであるべきである。有効となる正確な抗原の量は、抗原の性質、活性及び純度に依存し、そして当業者により決定されることが可能である。
【００７２】
ワクチン組成物中に存在する水中油型乳剤の量は、ワクチン組成物中の抗原の免疫原性を増強するのに十分であるべきである。望ましくかつ適切な場合には、界面活性剤の追加量または追加の界面活性剤を、水中油型乳剤により供される界面活性剤に加えて、ワクチン組成物中に加えることが可能である。一般的に言えば、油成分は、ワクチン組成物の最終容量において、１．０％〜２０％容量の量；好ましくは、１．０％〜１０％の量；より好ましくは、２．０％〜５．０％の量にて存在する。界面活性剤（単数）、あるいは２またはそれより多くの界面活性剤を用いる場合、界面活性剤の組み合わせは、ワクチン組成物の最終容量において、０．１％〜２０％容量、好ましくは０．１５％〜１０％、より好ましくは０．２％〜６．０％の量にて存在する。
【００７３】
抗原及び水中油型乳剤に加えて、ワクチン組成物は、水中油型乳剤に関連して上述のように、保存剤、浸透圧剤、生体接着分子及び免疫刺激分子（例えば、Ｑｕｉｌ
Ａ、コレステロール、ＧＰＩ−０１００、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ））などの適切かつ所望の他成分を含むことが可能である。
【００７４】
本発明のワクチン組成物は、獣医学的に許容可能（veterinarily-acceptable）なキャリアーもまた含むことが可能である。「獣医学的に許容可能なキャリアー」の語には、任意及びすべての溶媒、分散媒体、被覆、アジュバント、安定剤、希釈剤、保存剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤等が含まれる。希釈剤としては、水、生理食塩液、ブドウ糖、エタノール、グリセロール等が挙げられてよい。等張剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが挙げられてよい。安定剤としては、とりわけ、アルブミンが挙げられる。
【００７５】
好ましい実施態様において、本発明は、１μｍ未満のサイズの液滴、好ましくは０．８μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満の平均液滴サイズ、及びよりいっそう好ましくは約０．５μｍの平均液滴サイズの水中油型乳剤中に内在的に取り込まれている、ＢＶＤＶ Ｉ型またはＢＶＤＶ ＩＩ型抗原のうち少なくとも一つを含むワクチン組成物を、提供する。ＢＶＤＶ
Ｉ型及び／またはＩＩ型抗原は、好ましくは、不活化ウイルス調製物の形態である。サブミクロン水中油型乳剤は、好ましくは、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物（すなわち、軽質鉱油、レシチン、ＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０を含有する処方物）から構成される。
【００７６】
別の好ましい実施態様において、本発明は、レプトスピラ抗原、及びＢＶＤＶ Ｉ型またはＢＶＤＶ ＩＩ型抗原のうち少なくとも一つを水中油型乳剤中に含むワクチン組成物を、提供する。好ましくは不活化した細胞もしくはウイルス調製物の形態である抗原は、
１μｍ未満のサイズの液滴、好ましくは０．８μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満の平均液滴サイズ、及びよりいっそう好ましくは約０．５μｍの平均液滴サイズの水中油型乳剤中に内在的に取り込まれている。サブミクロン水中油型乳剤は、好ましくは、ＡＭＰＨＩＧＥＮ処方物（すなわち、軽質鉱油、レシチン、ＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０を含有する処方物）から構成される。該ワクチン組成物は、好ましくは、Ｑｕｉｌ−Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、ＧＰＩ−１００及び水酸化アルミニウム（ＡｌＯＨ）から選択される１またはそれより多くの免疫刺激分子もまた含む。
【００７７】
さらに別の好ましい実施態様において、本発明は、少なくとも一つの細菌抗原（例えば、組換えStreptococcus
uberis ＰａｕＡタンパク質または大腸菌の細胞調製物、あるいはその双方の組み合わせ）を水中油型乳剤中に含むワクチン組成物を提供する。抗原は、１μｍ未満のサイズの液滴、好ましくは０．８μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満の平均液滴サイズ、及びよりいっそう好ましくは約０．２５μｍの平均液滴サイズの水中油型乳剤と、内在的に組み合わされている。サブミクロン水中油型乳剤は、好ましくは、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物（すなわち、軽質鉱油、レシチン、ＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０を含有する処方物）から構成される。該ワクチン組成物は、好ましくは、Ｑｕｉｌ
Ａ、ＤＤＡ及びＧＰＩ−１００から選択される１またはそれより多くの免疫刺激分子もまた含む。
【００７８】
本発明のワクチン組成物を、経口、鼻腔内、粘膜、局所、経皮、及び非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）経路を始めとする公知の経路により動物に投与することが可能である。例えば、初回投与には非経口（parental）経路を用い、そしてそれに続く投与には粘膜経路を用いるなどの経路の組み合わせを用いて、投与を成し遂げることが可能である。
【００７９】
ワクチン組成物の調製方法
さらなる実施態様において、本発明は、抗原（単数または複数）及びサブミクロン水中油型乳剤を含有するワクチン組成物の調製方法を提供する。
【００８０】
本発明のワクチン組成物を調製する際に、抗原を、水中油型乳剤の成分と、内在的あるいは外来的に組み合わせることが可能である。「好ましくは」、抗原を、水中油型乳剤の成分と内在的に組み合わせる。
【００８１】
抗原を、油、１またはそれより多くの界面活性剤、水溶性成分及び任意の他の適切な成分を含む乳剤の種々の成分と組み合わせて、混合物を形成することが可能である。該混合物を、典型的には１もしくはそれより多くのホモジナイザーまたは乳化装置に１回以上通すことによる第一混和過程にかけて、抗原を含有する水中油型乳剤を形成する。例えばRoss乳化装置（Hauppauge、ニューヨーク州）、Gaulinホモジナイザー（Everett、マサチューセッツ州）またはMicrofluidics（ニュートン、マサチューセッツ州）などの任意の市販されているホモジナイザーまたは乳化装置を、本目的のために用いることが可能である。あるいは、油、１またはそれより多くの界面活性剤及び水溶性成分を含む乳剤アジュバントの種々の成分を、まず組み合わせて、ホモジナイザーまたは乳化装置を用いることによって水中油型乳剤を形成し；次いで、抗原をこの乳剤に添加する。第一混和後の水中油型乳剤の平均液滴サイズは、およそ１．０〜１．２ミクロンである。
【００８２】
次いで、抗原を含有する乳剤を、マイクロ流動化にかけて、サブミクロン範囲の液滴サイズを得る。マイクロ流動化は、Microfluidics社、ニュートン、マサチューセッツ州から入手可能なモデル番号１１０Ｙ；Gaulinモデル３０ＣＤ（Gaulin, Inc.、Everett、マサチューセッツ州）；及びRainnie Minilab ８．３０Ｈ型（Miro Atomizer Food and Dairy, Inc.、ハドソン、ウィスコンシン州）などの市販のマイクロ流動化装置の使用により、成し遂げることが可能である。
【００８３】
液滴サイズは、例えばレーザー回折、市販の定寸装置の使用によるなどの、当該技術分野において公知の多様な方法によって、測定することが可能である。サイズは、用いる界面活性剤の種類、油に対する界面活性剤の割合、動作圧、温度等に応じて異なってもよい。所望の液滴サイズの乳剤を得るために、これらのパラメータの所望の組み合わせを決定することが可能である。本発明の乳剤の液滴サイズは、直径１μｍ未満である。好ましくは、平均液滴サイズは０．８μｍ未満である。より好ましくは、平均液滴サイズは０．５μｍ未満である。よりいっそう好ましくは、平均液滴サイズは約０．１〜０．３μｍである。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様において、軽質鉱油中に２５％のレシチンを含有するＤＲＡＫＥＯＬ（商標登録）レシチン油溶液を、ＴＷＥＥＮ（商標登録）８０及びＳＰＡＮ（商標登録）８０ならびに生理食塩液と組み合わせ、そして混合して、軽質鉱油４０％、レシチン、ＴＷＥＥＮ（商標登録）８０
０．１８％、及びＳＰＡＮ（商標登録）８０ ０．０８％を含有する混合物を形成する。次いで、該混合物を、Ross（商標登録）（Hauppauge、ニューヨーク州、11788）乳化装置でおよそ３４００ｒｐｍにて乳化して乳剤生成物を形成し、これは「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物」または「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）溶液」とも称される。続いて、所望の抗原を、乳化装置（たとえば、Rossホモジナイザー）を用いてＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）溶液及び任意の他の適切な成分（例えば、免疫刺激分子）と組み合わせて、抗原を含有する水中油型乳剤を形成する。このような乳剤を、約１００００±５００ｐｓｉで動作しているマイクロ流動化装置に一度通す。マイクロ流動化された水中油型乳剤は、平均液滴サイズ約０．２５μｍの、１μｍ未満のサイズの液滴を有する。
【００８５】
別の好ましい実施態様において、水中油型乳剤（例えば、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物）を所望の抗原と組み合わせる前に、抗原をサポニン配糖体（例えば、Ｑｕｉｌ
Ａ）と組み合わせて、混合物を形成する。この抗原−サポニン混合物を、ホモジナイゼーション容器中でホモジナイゼーションにかける。次いで、例えばコレステロールなどのステロールを、ホモジナイズされた抗原−サポニン混合物に加える。次いで、抗原、サポニン及びステロールを含有する該混合物を、さらにホモジナイゼーションにかける。次いで、ホモジナイズされた抗原−サポニン−ステロール混合物を、例えばホモジナイザーを用いて、水中油型乳剤（例えば、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物）と組み合わせる。次いで、抗原、サポニン及びステロールを含有するホモジナイズされた水中油型乳剤を、マイクロ流動化などの高圧ホモジナイゼーションにかける。
【００８６】
マイクロカプセル化された抗原をサブミクロン水中油型乳剤中に含有するワクチン組成物、及び調製方法
さらに別の実施態様において、本発明は、ミクロ粒子中にカプセル化された抗原（または、「マイクロカプセル化された抗原」）を含有し、ここでマイクロカプセル化された抗原が前述のサブミクロン水中油型乳剤中に外来的に取り込まれているワクチン組成物を、提供する。
【００８７】
抗原を粒子性キャリアー中に吸着または捕捉するための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications（Justin Hanes、Masatoshi Chiba及びRobert Langer、「Vaccine design」中、Polymer microspheres for vaccine delivery、The
subunit and adjuvant approach. Michael F. Powell及びMark
J. Newman編集、1995年、Plenum Press、ニューヨーク州及びロンドン）を参照されたい。粒子性キャリアーは、動物個体において選択された抗原の複数のコピーを免疫系に提示し、そして局所リンパ節における抗原の捕捉及び保持を促進することが可能である。粒子は、マクロファージによって貪食されることが可能であり、かつサイトカイン放出を介して抗原提示を増強することが可能である。粒子性キャリアーは、当該技術分野においても記載されており、そして例えば、ポリメチルメタクリレート重合体由来のもの、ならびに、ポリ（ラクチド）及びＰＬＧとして公知のポリ（ラクチド−共グリコリド）由来のものなどが挙げられる。ポリメチルメタクリレート重合体は非生分解性であるが、ＰＬＧ粒子は、正常な代謝経路で排出される乳酸及びグリコール酸とのエステル結合のランダムな非酵素性加水分解によって生分解されることが可能である。
【００８８】
生分解性ミクロスフェアもまた、 ワクチンの制御放出を成し遂げるのに用いられている。例えば、長期にわたり抗原の持続的な放出を成し遂げることが可能である。重合体の分子量、及び重合体におけるグリコール酸に対する乳酸の割合に応じて、ＰＬＧＡ重合体は、数日または数週間から数カ月または一年までの加水分解速度を有することが可能である。緩徐な制御放出により、複数回注射後に観察されるものと同様の高レベルの抗体の形成を生じる可能性がある。あるいは、ワクチン抗原のパルス放出を、異なる加水分解速度を伴う重合体を選択することによって成し遂げることが可能である。重合体の加水分解速度は、典型的には、重合体の分子量、及び重合体におけるグリコール酸に対する乳酸の割合に依存する。抗原放出速度の異なる２またはそれより多くの異なる重合体から作られたミクロ粒子は、抗原のパルス放出、及びワクチン接種の複数回投与レジメン（regime）の模倣を供する。
【００８９】
本発明によると、前述のもののいずれかを始めとする抗原を、当該技術分野において公知の任意の手順（実施例１７に例示されるものなど）を用いることにより粒子状重合体キャリアー（好ましくは、ＰＬＧ重合体）に吸着させて、マイクロカプセル化された抗原調製物を形成することが可能である。次いで、マイクロカプセル化された抗原調製物を、前述したサブミクロン水中油型乳剤と混合し、そしてその中に分散させて、ワクチン組成物を形成する。
【００９０】
好ましい実施態様において、本発明は、ＰＬＧ重合体中にカプセル化された抗原を含有し、ここでマイクロカプセル化された抗原が軽質鉱油、レシチン、ＴＷＥＥＮ８０、ＳＰＡＮ８０及び生理食塩液から構成されるマイクロ流動化された水中油型乳剤中に外来的に分散し、かつ１．０μｍ未満の平均液滴サイズを有するワクチン組成物を、提供する。
【００９１】
サポニン及びステロールにより形成される複合体
一実施態様において、本発明は、サポニン及びステロールを含有し、ここでサポニン及びステロールがらせん状ミセルの形状の複合体を形成している組成物を、提供する。本発明によると、これらの複合体は免疫刺激活性を有する。
【００９２】
「免疫刺激」とは、該複合体が抗原成分によって誘導される免疫応答を増強可能であること、あるいは該複合体が別の抗原成分とは独立に免疫応答を誘導可能であることを、意味する。
【００９３】
本発明によると、本発明の組成物における使用に好ましいサポニンは、Ｑｕｉｌ Ａである。
本発明のアジュバント組成物における使用に好ましいステロールとしては、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びコレステロールが挙げられる。これらのステロールは当該技術分野において周知であって、例えばコレステロールは、メルクインデックス第１１版、３４１頁に、動物脂肪中に見いだされる自然発生ステロールとして開示されている。最も好ましくは、ステロールはコレステロールである。
【００９４】
組成物中のサポニン：ステロールの割合は、典型的には、およそ１：１００〜５：１（重量対重量）である。好ましくは、割合は１：１である。
別の実施態様において、本発明は、サポニン、ステロール及び抗原を含有し、ここでサポニン及びステロールがらせん状ミセルの形状の複合体を形成しており、かつ抗原がらせん状ミセルと混合されているが、しかしその内部に取り込まれていないワクチン組成物を、提供する。
【００９５】
以下は、本発明を実行するための具体的な実施態様の実施例である。当該実施例は、例示的な目的のみのために提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００９６】
（実施例１）
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物の調製
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、二工程の過程にて調製した。第一工程では、８０リットルのＤｒａｋｅｏｌレシチン油溶液、１１６リットルの破傷風トキソイド生理食塩液、１．２リットルのＳＰＡＮ
８０、及び２．８リットルのＴｗｅｅｎ ８０を混ぜ合わせ、そしてRoss乳化装置を用いて乳化した。Ｄｒａｋｅｏｌレシチン油溶液は、大豆レシチン２５％及び鉱油７５％を含有した。乳化した生成物を、Ross乳化装置により最低５容量または最低１０分間再循環させた。乳化した生成物を、さらなる処理のために、２〜７℃にて最大２４時間保管した。Ross乳化装置のタンクから得られた乳剤を、Gaulinホモジナイザーに移し、そして４５００ｐｓｉの圧力下で２０分間ホモジナイズした。次いで、得られた４０％Ｄｒａｋｅｏｌレシチン油溶液（以下、「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物」または「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）溶液」）を、無菌のポリプロピレンカルボキシ容器に分注した。分注は、クラス１０，０００の制御環境にあるクラス１００の分注フードの中で行った。容器を、２〜７℃にて保管した。このＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、特に示さない限り、以下に記載の実験において用いた。
【００９７】
（実施例２）
ＢＶＤワクチンの急速混和ホモジナイゼーションによる第一の混和
このホモジナイゼーション過程に用いられる装置を、図１に示す。無菌技術または蒸気用三方弁を用いて、ＢＶＤ Ｉ型抗原（不活化したＢＶＤ
Ｉ型ウイルス調製物）を含有するボトルを、混和容器上の底部ポートに連結した。必要とされる容量のＢＶＤ Ｉ型抗原の移行が完了した後に、ＢＶＤ Ｉ型のボトルを、不活化ＢＶＤ
ＩＩ型ウイルス調製物（不活化ＢＶＤ ＩＩ型ウイルス調製物）を含有するボトルと取り替えた。必要量のＢＶＤ ＩＩ型抗原の移行が完了した後に、Rossホモジナイザーをポータブル容器に取り付け、そして再循環を最大のＲＰＭ（３３００ｒｐｍ）にて開始した。容器の撹拌を、中等度の速度にて維持した。
【００９８】
無菌技術または蒸気用三方弁を用いて、Ｑｕｉｌ−Ａを５０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するボトルを、混和容器上のホモジナイザーインラインポートに取り付けた。必要量のＱｕｉｌ−Ａ溶液を、ライン吸引により容器へと通した。Ｑｕｉｌ−Ａ溶液の移行が完了した後に、ボトルを取り外した。同じ方法で、必要量のコレステロール・エタノール溶液（１８ｍｇ／ｍｌ）を、混和容器に移した。続いて、必要量のＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物、１０％Thimerosol溶液、及び基本改変イーグル培地（「ＢＭＥ」）増量剤溶液を、混和容器に加えた。
【００９９】
すべての添加が完了した後に、混合をさらに１５分間続けた。得られた処方物を、２ｍｌ用量に分割し、そしてこれはマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくＢＶＤワクチンを表した。ワクチンの各用量は、Ｑｕｉｌ−Ａ
５００μｇ、コレステロール ５００μｇ、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物２．５％、及びThimerosol ０．００９％を含有した。二つの異なるＢＶＤ株の抗原濃度を、ｇｐ５３に対するＥＬＩＳＡ力価に関して測定した。
【０１００】
（実施例３）
マイクロ流動化による第二の混和
図２は、マイクロ流動化を介した第二の混和に用いられる過程を示す。マイクロ流動化装置を、蒸気滅菌した。まず、補助の処理モジュールチャンバーをユニット内に設置し、そして空のチャンバーを二番目のチャンバー位置に設置した。実施例２に記載のように調製された、十分にアジュバント添加されているＢＶＤワクチンを含有する容器を、供給容器のドレイン弁からマイクロ流動化装置の入口への移行ラインを取り付けることにより、マイクロ流動化装置に接続した。窒素ガスを、供給容器の空気フィルターの入口に接続し、そして容器の圧設定を２０±５ＰＳＩに調整した。収集容器のドレイン弁を、マイクロ流動化装置の出口からの移行ラインに接続した。すべての必要な接続を行った後に、弁を開き、そしてマイクロ流動化を動作圧１０，０００±５００ＰＳＩにて開始した。ワクチンの全量をマイクロ流動化装置に一度通し、そしてマイクロ流動化後チャンバー中に収集した。この調製物を、２ｍＬ用量に分割し、そしてこれはマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくＢＶＤワクチンを表した。
【０１０１】
（実施例４）
ベンチ混和によるワクチン組成物の調製
実施例１に記載のように調製されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、ＢＶＤ抗原及び増量剤を加えて２．５％に希釈した。得られた溶液を、ホモジナイザーを用いる代わりに撹拌子を用いて、ベンチにて混和した。最終調製物は、以下の組成物を含有した：ＢＶＤ
１型及び２型抗原、２．５％ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物（実施例１に記載のように、油、レシチン、ＳＰＡＮ（商標登録）及びＴＷＥＥＮ（商標登録）を含有する）、ならびに生理食塩液。ＴＷＥＥＮ
８０及びＳＰＡＮ ８０は、最終ワクチン調製物中にそれぞれ０．１８％及び０．０８％容量にて存在する。
【０１０２】
（実施例５）
マイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物とマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物との液滴サイズ分布の比較
実施例２に記載のように調製されたマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、実施例３に記載のように調製されたマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、及び実施例４に記載のようにベンチで混和により作られた調製物を用いて、ワクチン調製物の液滴サイズを比較した。２ミリリットルの各調製物の試料を、Malvern 2000レーザー回折計測器に添加し、そして液滴サイズ分布を測定した。図３に示すように、結果は、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物の最大粒子体積がおよそ０．１ミクロンであり、一方、マイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物の最大粒子分布体積がおよそ１ミクロンであったことを、示している。
【０１０３】
（実施例６）
ワクチンの相分離の低減
三つの異なるワクチン調製物：実施例２に記載のように調製されたマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、実施例３に記載のように調製されたマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、及び実施例４に記載のようにベンチ混和により調製されたワクチン調製物を、並列に比較して、長期保管時のそれらの相分離の特性を判定した。すべてのこれらの調製物を４℃にて約１ヶ月間静置させ、そして相分離を、ワクチン調製物最上部のクリーム状の層の出現に関してモニターした。図４に示すように、他の二つの調製物と比較した場合、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づく調製物では相分離はなかった。
【０１０４】
（実施例７）
マイクロ流動化された、及びマイクロ流動化されていないウシウイルス下痢ウイルスに対するウシ用ワクチンの調製
ウシウイルス下痢ウイルス抗原を、マイクロ流動化を介してＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物中に内在的に取り込んだ。「内在的に取り込んだ」の語は、マイクロ流動化の前に抗原をＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に添加することによる過程を指す。抗原をアジュバント処方物の成分とともに、マイクロ流動化過程の物理的な力にかけた。マイクロ流動化されていない対照群では、抗原調製物を、混和によりＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物中に分散させた。
【０１０５】
対照及びマイクロ流動化された調製物の双方の最終組成物は、以下のとおりであった：ｇｐ５３に対する不活化後のＥＬＩＳＡ力価２５３５ＲＵ／用量のＢＶＤ
Ｉ型、１．２５ｍｇ／用量の濃度のＱｕｉｌ−Ａ、１．２５ｍｇ／用量の濃度のコレステロール、２．５％の最終濃度のＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物、及び０．００９％の最終濃度のThimerosol。ワクチン用量は、５ｍｌであった。
【０１０６】
（実施例８）
マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物における、内在的に取り込まれたＢＶＤウイルス抗原の長期安定性
この実験は、内在的に取り込まれた抗原の長期保管中における安定性を判定するために行った。死滅ＢＶＤ ＩＩ型ウイルス抗原を、マイクロ流動化の過程中にＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物中に内在的に取り込んで、マイクロ流動化されたワクチン調製物（Ａ９０７５０５）を得た。同抗原をマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物（Ａ９０４３６９、Ａ９０４３７０及びＡ９０４３７１）中に含有する三つの他のワクチン調製物を、対照とした。マイクロ流動化されていない調製物では、抗原をＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物と混合し、そしてRossホモジナイザーを用いた混和により混合した。すべての四つのワクチン調製物を、４℃にて２年間保管した。保管中の異なる時点（０、６、１２または２４ヶ月）で、すべての四つの処方物を用いて、３ヶ月齢のウシにワクチン接種した。
【０１０７】
第０日及び第２１日に、３ヶ月齢のウシを、皮下経路を介して、２ｍｌのワクチン処方物でワクチン接種した。ワクチン接種された動物の血清を第３５日に採取し、そしてワクチンに対する血清学的応答を、ＢＶＤＶ−Ｅ２
ＥＬＩＳＡにより、抗体価に関して測定した。図５に示すように、マイクロ流動化されたワクチン調製物は、試験したすべての時点（０、６、１２及び２４ヶ月）で抗体価の上昇を示し、抗原調製物の安定性がマイクロ流動化の過程中における抗原の内在的な取り込みの間に失われないことが、示唆された。その上、マイクロ流動化されたワクチン調製物が、すべての時点で免疫応答の増強を誘導することもまた、驚くべきことに見いだされた。
【０１０８】
（実施例９）
マイクロ流動化後の、ワクチンにより誘導される直腸温増加の低減
実施例７に記載のように作られたマイクロ流動化されたワクチン調製物及びマイクロ流動化されていないワクチン調製物を用いて、第０日にウシにワクチン接種し、そして直腸温を、ワクチン接種１日前からワクチン接種後４日までの期間モニターした。ワクチン用量は、２ｍｌであった。当該群を、１倍用量または２倍用量のいずれかのワクチンでワクチン接種した。直腸温を、第−１日から第４日まで毎日測定及び記録した。第０日における直腸温は、被験物質の投与前に測定した。
【０１０９】
図６に示すように、結果は、１倍用量または２倍用量いずれかのマイクロ流動化されていないワクチン処方物でワクチン接種されたこれらの動物において、ワクチン接種後約２４時間に直腸温の急激な上昇があったことを、示している。しかしながら、マイクロ流動化された形状のワクチンでワクチン接種された動物においては、ワクチン接種後の直腸温の上昇は、ほんのわずかで、かつマイクロ流動化されていない処方物でワクチン接種された動物よりも有意に低かった（図６）。
【０１１０】
（実施例１０）
マイクロ流動化されたワクチン処方物でワクチン接種した場合、注射部位反応体積はより速く回復した
実施例７に記載のように作られた、マイクロ流動化されたワクチン調製物及びマイクロ流動化されていないワクチン調製物を用いて、第０日にウシにワクチン接種した。この試験に含まれる動物は、交雑食用牛であった。プラセボ治療群（Ｔ０１及びＴ０２）のそれぞれには、３例の動物がいた。Ｔ０３〜Ｔ０６群のそれぞれには、６例の動物がいた。ワクチン用量は２ｍｌであり、そして当該群を、第０日に１または２用量のいずれかのワクチンでワクチン接種した。第０日に、被験物質を、右首に投与した。２倍用量（４ｍｌ）の被験物質を投与される動物（Ｔ０２、Ｔ０４及びＴ０６）には、片側に１回の注射として、全２倍用量を投与した。注射部位における反応サイズの評価を始めとする注射部位の観察を、第０日から第４日までの全日、及び第６、９及び１４日に、首の右側で行った。第０日に、注射部位を、被験物質の投与前に観察した。１または２用量のプラセボでワクチン接種した群は、注射部位反応体積のいかなる有意な増加も示さず、そしてそれゆえにこれらのデータを図７に示していない。マイクロ流動化されていないワクチン処方物の場合、１用量と２用量のワクチン接種との間に注射部位反応体積の比例的な増加があった。他方で、マイクロ流動化されたワクチン処方物の場合、１倍用量がより大きな注射部位反応体積を誘導したが、二番目の用量での注射はいかなるさらなる増加も引き起こさなかった。その上、マイクロ流動化されたワクチン処方物で注射した動物の場合、注射部位反応部位体積は、マイクロ流動化されていないワクチン処方物で注射した動物と比較した場合に、より速い速度で回復した。これらの結果を、図７に示す。
【０１１１】
（実施例１１）
内在的に取り込まれたＢＶＤウイルス及びレプトスピラ抗原、ならびにＱｕｉｌ Ａ及びＤＤＡなどの免疫刺激分子を用いた、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物の調製
ホルマリンで不活化したLeptospira hardjo-bovis CLS株を、直接計数約１．４×１０９生物体／５ｍｌ用量にて、適切なアジュバント中に処方物化した。ホルマリンで不活化したLeptospira pomona T262株を、約２４００比濁単位／５ｍｌ用量にて処方物化した。比濁単位は、処理前の発酵液の比濁測定に基づき算出した。ＢＶＤウイルス１型を、約３０００相対単位／５ｍｌ用量のＥ２
Ｅｌｉｓａ力価にて処方物化した。ＢＶＤウイルス２型を、約３５００相対単位／５ｍｌ用量のＥ２ Ｅｌｉｓａ力価にて処方物化した。相対単位は、合わせる前の不活化後のバルク液のＥ２
ＥＬＩＳＡ力価に基づき算出した。Ｑｕｉｌ−Ａとコレステロールの双方を、０．５ｍｇ／用量の濃度にて用いた。Thimerosol及びＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、それぞれ０．００９％及び２．５％の最終濃度にて用いた。水酸化アルミニウム（Rehydragel LV）を、２．０％の最終濃度にて用いた。ＤＤＡを免疫調節物質として用いた場合、ＤＤＡはＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物内に含まれた。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物（すなわち、４０％Ｄｒａｋｅｏｌ−レシチンストック溶液）は１．６ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含有し、そして適切に希釈された場合、最終的なワクチン調製物は２．５％ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物及び０．１ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含有した。
【０１１２】
異なるワクチン処方物の調製において、ＢＶＤ画分、レプト、Ｑｕｉｌ−Ａ、コレステロール、Thimerosol、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物、及び増量剤としての生理食塩液を、Silversonホモジナイザーに添加し、そして１０，０００±５００ＲＰＭにて１５分間混合した。次いで、成分を、２００ミクロンのスクリーンを介して、１０，０００ｐｓｉにてマイクロ流動化した。
【０１１３】
ワクチン処方物が水酸化アルミニウムを含有した場合、マイクロ流動化を水酸化アルミニウムなしで行った。マイクロ流動化が完了した後に、水酸化アルミニウムを添加し、そして撹拌子を用いて４℃にて一晩混合した。
【０１１４】
（実施例１２）
曝露試験用ＢＶＤウイルスワクチンの調製
この実験に用いられるワクチン調製物は、ＢＶＤウイルス１型及びＢＶＤウイルス２型の双方由来の抗原を含有した。ＢＶＤ１−５９６０抗原を、ｇｐ５３に対する不活化後のＥＬＩＳＡ力価２５３５ＲＵ／用量にて用いた。ＢＶＤ２−８９０抗原を、ｇｐ５３に対する不活化後のＥＬＩＳＡ力価３２９０ＲＵ／用量にて用いた。Ｑｕｉｌ
Ａ及びコレステロールを、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度にて用いた。Thimersol及びＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、それぞれ０．００９％及び２．５％の最終濃度にて用いた。ＤＤＡを免疫調節物質として用いた場合、ＤＤＡはＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物内に含まれた。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）ストック溶液（４０％Ｄｒａｋｅｏｌ−レシチン溶液）は様々な量のＤＤＡを含有し、そして適切に希釈された場合、最終的なワクチン調製物は２．５％ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物及び０．５ｍｇ／用量〜２．０ｍｇ／用量のＤＤＡ濃度を含有した。アルミニウムゲル（Rehydragel-LV）を、２％の最終濃度にて用いた。ＧＰＩ−０１００を、２、３及び５ｍｇ／用量の範囲で用いた。
【０１１５】
すべての成分をSilversonホモジナイザーに添加し、そして１０，５００ｒｐｍにて１５分間混和し、次いで１０，０００ｐｓｉにて２００ミクロンのチャンバーに通すことによりマイクロ流動化した。ワクチン調製物が水酸化アルミニウムを含有した場合、マイクロ流動化を水酸化アルミニウムなしで行った。マイクロ流動化が完了した後に、水酸化アルミニウムを添加し、そして撹拌子を用いて４℃にて一晩混合した。
【０１１６】
（実施例１３）
レプトスピラ抗原を伴うマイクロ流動化されたＡｍｐｈｉｇｅｎワクチン処方物でワクチン接種後の、レプトスピラ曝露に対する防御
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
表１は、本試験において試験されたワクチン調製物におけるアジュバント処方物の組成を示す。ワクチン調製物を、実施例１１に記載のように調製した。各群には、６例の動物がいた。約７ヶ月齢の交雑種未経産牛を、本試験において用いた。ワクチン接種を、第０日及び第２１日に、皮下経路を介して５ｍｌのワクチン容量にて行った。曝露を、国立動物疾病センター（ＮＡＤＣ、National agricultural Disease Center）から得たL.
hardjo-bovis 203株を用いて行った。曝露は、第５７〜５９日に、１ｍｌの接種により行った。曝露を、眼及び腟に同時投与した。曝露材料は、５．０Ｘ１０６レプトスピラ／ｍｌを含有した。尿を、レプト培養、ＦＡ及びＰＣＲのために一週間毎に採取した。腎臓の採取を、第１１２日及び第１１３日の間に行った。
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
表２は、レプトスピラ曝露試験から得られたデータを示す。曝露された動物におけるレプトスピラ感染率を決定する際に、以下の基準を用いた。腎臓培養が一試料のみで陽性であったならば、動物はレプトスピラに陽性であると考えられる。動物がＦＡまたはＰＣＲのいずれかに関して一試料のみで陽性であるならば、動物は陰性であると考えられる。試料がＦＡ及びＰＣＲの双方に関して一試料のみで陽性であるならば、レプトスピラに陽性であると考えられた。
【０１２１】
表２に示す結果は、すべての三つのアッセイに基づくすべてのワクチン群において、尿への排出期間が有意に短かったことを示している。尿及び腎臓のコロニー形成に関する限り、ＱＡＣ及びＤＤＡを含有するＡｌＯＨを含まない処方物の有効性は、同程度であった。ＡｌＯＨは、本曝露試験においては、ＱＡＣまたはＤＤＡを含有するワクチンの有効性を改善せず、そしてむしろ低減した。
【０１２２】
【表３】
【０１２３】
ワクチン処方物中の双方のレプトスピラ抗原に対する血清学的応答を、ワクチン接種された動物において検出し、そしてピーク応答は第３５日にみられた。血清学的応答と曝露に対する防御との間に、相関はなかった。血清学的応答がワクチン中のアルミニウムゲルの存在により増強されたにもかかわらず、ワクチン処方物中のアルミニウムゲルの存在は、防御レベルを低減させた。
【０１２４】
（実施例１４）
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物及びＤＤＡを含有するマイクロ流動化されたワクチン調製物で免疫後の、ＢＶＤウイルス抗原に対する免疫応答の誘発、及びＢＶＤ
２型ウイルス曝露に対する防御
４〜７ヶ月齢の血清陰性の子ウシを、本実験において用いた。異なる６群があり、そして各群は１０例の動物を有した（表４）。第０日及び第２１日に、各動物は、２ｍｌのワクチンまたはプラセボの皮下用量を、肩甲骨と頭蓋骨との中ほどにある側頸に１回受けた。
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
５ｍｌ用量の曝露用ウイルス調製物（１鼻孔につき、およそ２．５ｍｌ）を、試験第４４日に鼻腔内投与した。細胞変性していないＢＶＤ
２型ウイルスである単離番号２４５１５（Ellis株）、ロット番号４６３２５−７０を、本試験において曝露用株として用いた。保持しておいた曝露用材料の試料を、曝露開始時及びその完了直後に力価測定した（１力価測定につき二つ組で）。５ｍｌ用量あたりの平均生存ウイルスは、曝露前は５．３ｌｏｇ１０ＦＡＩＤ５０／５ｍｌ、そして曝露後は５．４ｌｏｇ１０ＦＡＩＤ５０／５ｍｌであった（ＦＡＩＤは、ＴＣＩＤ５０に相当する）。
【０１２７】
動物を、第−３日から第５８日まで、毎日モニターした。ＢＶＤ ２感染に起因する臨床徴候に基づいた０、１、２または３の臨床疾患スコアを、第４２日から第５８日まで、各動物について行った。第４４日におけるスコアは、曝露の前に記録した。ＢＶＤ
１型及びＢＶＤ ２型ウイルス中和抗体の血清力価を測定するために、血液試料（二つの１３ｍｌ血清分離用チューブ、ＳＳＴ）を、第０、２１、３５、４４及び５８日に各動物から採取した。
【０１２８】
血液試料を、第４２日から第５８日までの全日、各動物から採取し、そしてバフィーコート細胞におけるＢＶＤウイルスの存在を判定した。第４４日に、試料を曝露の前に得た。
【０１２９】
白血球細胞数を測定するために、血液試料（４ｍｌ ＥＤＴＡチューブ１本）を、第４２日から第５８日までの全日、各動物から採取した。第４４日に、試料を曝露の前に得た。
【０１３０】
白血球減少症を、４０％またはそれを超えるベースライン（曝露２日前及び曝露当日の、曝露前の平均のＷＢＣ数）からのＷＢＣ数の減少として、定義した。
臨床疾患スコアを、以下のように疾患状態を定義するために用いた：スコアが≦１ならば、疾患＝なし；スコアが＞２ならば、疾患＝あり。
【０１３１】
表５及び表６に示すように、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物、Ｑｕｉｌ ＡまたはＤＤＡとともにＢＶＤウイルス抗原を含有し、かつマイクロ流動化されたワクチンでワクチン接種された群は、ＢＶＤ
１型とＢＶＤ ２型ウイルスの双方に対する有意な血清ウイルス中和力価によって血清転換した。これらの群では、曝露後にウイルス血症を示す動物の率の有意な低減もあったが、対照群では、１００％の動物がウイルス血症であった（表７）。加えて、これらのワクチン接種された群において、疾患の頻度もまた有意に低減した（表８）。同様に、白血球減少症を示す動物の率もワクチン群において低減し、そして白血球減少症の低減は、Ｑｕｉｌ
Ａを含有する群よりもＤＤＡを含有する群においてより有意であった（表９）。対照群では、ワクチン接種群と比較した場合に、体重増加の有意な降下があった（表１０）。
【０１３２】
血清学
第０日におけるワクチン接種の前に、試験におけるすべての動物は、ＢＶＤウイルス １型及び２型に対する抗体に血清陰性（ＳＶＮ
＜１：２）であった（データは示さず）。二回目のワクチン接種（第３５日）後１４日に、プラセボを投与されたすべての動物（Ｔ０１）は、ＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体に血清陰性のままであり；そして、ＩＴＡ（研究用被験抗原）でワクチン接種されたすべての動物（Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６）は、ＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体に血清陽性（ＳＶＮ
≧１：８）であった。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物をアジュバントとして添加したＤＤＡ ２ｍｇ／用量のワクチンを投与された１例の動物は、第３５日に、ＢＶＤウイルス２型に対する抗体に対してＳＶＮ力価３であった（表１１及び表１２）。
【０１３３】
第４４日における曝露の前に、１例を除くすべての対照（Ｔ０１）は、ＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体に血清陰性（ＳＶＮ
＜１：２）であった（データは示さず）。１例の対照（＃２４９７）は、ＢＶＤウイルス１型に対する抗体に血清陽性（ＳＶＮ＝１０）、そしてＢＶＤウイルス２型に対する抗体に血清陰性であった。曝露後１４日に、試験におけるすべての動物は、ＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体に血清陽性であった。
【０１３４】
【表５】
【０１３５】
【表６】
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
【表８】
【０１３８】
【表９】
【０１３９】
【表１０】
【０１４０】
ウイルスの単離
表１３に示すデータのように、曝露期間（第４４日〜第５８日）中に、対照（Ｔ０１）におけるすべての１０例の動物は、ウイルス血症であった（ＢＶＤウイルスが、１日以上で単離された）。ＩＴＡ投与群では、ウイルス血症の動物の頻度は、１０例の各群（それぞれ、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６）において１、０、３、２及び２例であった。対照とＩＴＡ投与群との間の差は、統計学的に有意であった（Ｐ≦０．０５）。ウイルス血症の最小二乗平均日数もまた、ＩＴＡ投与群（０．０〜０．５日）と比較して、対照で有意に大きかった（１０．４日）。
【０１４１】
臨床疾患
臨床徴候スコア２または３の動物は、ＢＶＤ疾患の徴候を示していると考えられた。表１４に示すように、ＢＶＤウイルス疾患の臨床徴候を伴う動物の頻度は、対照（Ｔ０１）において１０例中９例、そしてＩＴＡ投与各群（それぞれ、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６）において、１０例中１、２、０、０及び０例であった。対照とＩＴＡ投与群との間の差は、統計学的に有意であった（Ｐ≦０．０５）。
【０１４２】
白血球減少症
表１５に示すように、曝露期間（第４４日〜第５８日）中に、対照（Ｔ０１）におけるすべての１０例の動物は、白血球減少症であった（第４２〜４４日の曝露前ベースラインから、白血球数が４０％低減）。白血球減少症を伴う動物の頻度は、ＩＴＡ投与各群（それぞれ、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６）において、１０例中６、２、４、３及び２例であった。対照と、０．５ｍｇ／用量のＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物及び水酸化アルミニウムをアジュバントとして添加したワクチン投与群（Ｔ０３）との間の差は、統計学的に有意であった（Ｐ≦０．０５）。白血球減少症の最小二乗平均日数は、ＩＴＡ投与群（０．２〜１．２日）と比較して、対照で有意に大きかった（７．８日）。
【０１４３】
（実施例１５）
ＧＰＩ−０１００を含有するマイクロ流動化されたワクチン調製物で免疫後の、ＢＶＤウイルス抗原に対する免疫応答の誘発、及びＢＶＤ２型ウイルス曝露に対する防御
実施例１４に記載の一連の実験条件にしたがい、そしてＱｕｉｌ ＡとＧＰＩ−０１００との直接比較を行った。表１１及び表１２に示すように、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づいた、Ｑｕｉｌ
ＡまたはＧＰＩ−０１００のいずれかを含有する調製物に含まれるＢＶＤ抗原でワクチン接種された動物は、ＢＶＤ１型とＢＶＤ２型ウイルスの双方に対する有意な抗体価を有した。ＢＶＤ１型ウイルスに対する抗体価は、ＢＶＤ２型ウイルスに対するものよりもかなり高かった。しかしながら、それに続くＢＶＤ２型ウイルスによる曝露は、強力な防御を示し、そして疾患発生率は、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくＧＰＩ−０１００含有ワクチン調製物でワクチン接種された子ウシにおいて、低減した。
【０１４４】
【表１１】
【０１４５】
【表１２】
【０１４６】
【表１３】
【０１４７】
【表１４】
【０１４８】
【表１５】
【０１４９】
結論として、各ワクチンの安全性は、ワクチン接種された動物において副作用または死亡がないことにより示された。各ワクチンの効力は、１００％のワクチン接種された動物における血清転換（ＢＶＤ−１及びＢＶＤ−２に対するＳＶＮ抗体価
＞１：８）によって、示された。曝露に対する十分な耐性は、ＧＰＩ−０１００ ２ｍｇのみをアジュバントとして添加したワクチンにより示された。
【０１５０】
（実施例１６）
マイクロ流動化された水中油型乳剤中にマイクロカプセル化された抗原を含有するワクチン調製物
３ｇのトレハロース（Fluka社）を水に加えて、３３３ｍｇ／ｍｌのトレハロース溶液を得た。０．８％ＳＤＳ溶液中に可溶化した組換えＰａｕＡ抗原（ＳＤＳ／ｒＰａｕＡ）をトレハロース溶液に加えて、４９４μｇ ｒＰａｕＡ／ｍｌの最終濃度を得た。次の工程で、１０ｇのポリ乳酸グリコール酸（PLG-Resomer
RE 503H、ベーリンガー・インゲルハイム社）を、２００ｍｌの塩化メチレン（ＭｅＣｌ２）に溶解した。得られたＰＬＧ／ＭｅＣｌ２溶液を、最初の工程で調製されたＳＤＳ−ｒＰａｕＡ／トレハロース溶液と組み合わせた。組み合わせた溶液を、（MicrofluidicsモデルＭ１１０ＥＨのマイクロ流動化装置）を用いてマイクロ流動化にかけ、そしてマイクロ流動化された調製物を、（テプコ噴霧乾燥機モデルＳＤ−０５）を用いて噴霧乾燥した。噴霧乾燥した材料を、５００ミクロンのスクリーンを用いて収集した。
【０１５１】
この噴霧乾燥した材料中のｒＰａｕＡ濃度を、ウエスタンブロット解析を用いて定量した。１．０４ｍｇの噴霧乾燥した材料を、５０μｌのアセトン中に溶解し、そして室温にて１０分間、１３，２００ｒｐｍで遠心分離した。上清を、除去した。上清画分及びペレット画分を、生物学的安全フード内で２．５時間乾燥させた。ペレットを、４７．４３μＬの試料溶液（２５μｌの試料緩衝液＋１０μｌの還元剤＋６５μｌの水）中に再懸濁した。乾燥させた上清画分を、２０μｌの試料溶液で再懸濁した。ウエスタン解析において、精製ＰａｕＡを、噴霧乾燥した材料のｒＰａｕＡ含量を定量するための標準品として用いた。
【０１５２】
２０％マンニトールストック溶液を、１００ｍｇのマンニトール（シグマ社）を５００ｍｌの注射用水（ＷＦＩ）に溶解することにより、調製した。溶液をホットプレート／撹拌機で４０℃に加熱し、そして３０℃に冷ました。溶液を、０．２２ミクロンの無菌フィルター（ミリポア社）を介して無菌ろ過した。２．５％カルボキシメチルセルロース溶液を、１２．５ｇのカルボキシメチルセルロース（シグマ社）を５００ｍｌのＷＦＩに溶解することによって調製し、そして４℃にて一晩混合した。溶液を、１２１℃にて高圧滅菌した。
【０１５３】
噴霧乾燥により得られた粉末を、５％マンニトール、０．３％カルボキシメチルセルロース及び１：５０００のThimerosolを含有する溶液中で再構成した。最終溶液を３ｍｌバイアルに分割し、そして凍結乾燥機（USIFROID）を用いて凍結乾燥した。凍結乾燥粉末は、マイクロカプセル化されたｒＰａｕＡを表した。マイクロカプセル化されたサブユニットタンパク質抗原を、２ｍｌのＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を含有するマイクロ流動化された水中油型乳剤（実施例２０に記載されるマイクロ流動化された乳剤など）中に再懸濁する。
【０１５４】
（実施例１７）
水中油型乳剤中に細菌全細胞抗原と組換えタンパク質抗原の双方を含有するマイクロ流動化されたワクチン処方物の調製
実施例２及び３に記載のように水中油型乳剤に内在的に添加された、組換えStreptococcus
uberis ＰａｕＡタンパク質と大腸菌細菌細胞の双方を含有する二つのワクチン調製物を、作った。組換えＰａｕＡ抗原は１００μｇ／用量の濃度であり、そして大腸菌細胞は４Ｘ１０９／用量の最終数であった。二つのワクチン処方物の乳剤アジュバント組成物を、表１６に示す。
【０１５５】
【表１６】
【０１５６】
（実施例１８）
水中油型乳剤中にｒＰａｕＡ及び全細胞細菌因子を含有するマイクロ流動化されたワクチンに対する免疫応答
成熟乳牛を、本実験において用いた。動物は、登録時に初回または二回目の授乳が終了したところであった。２ｍｌの各ワクチン処方物を、乾乳時（Ｄ−０）に一度、２８日後（Ｄ＝２８）、及び分娩後４〜１０日（Ｃ＋４〜Ｃ＋１０）に再び、３回皮下投与した。最初及び三回目の用量を首の左側に投与し、そして二回目の用量を首の右側に投与した。血液を、各ワクチン接種の前、ならびに三回目のワクチン接種後およそ１４日及び３２日に採取した。大腸菌及びｒＰａｕＡに対する抗体価を、ＥＬＩＳＡにより測定した。図８に示すように、結果は、ｒＰａｕＡに対する抗体価が、ＧＰＩ−０１００を免疫刺激剤として含有するワクチン処方物でワクチン接種された群においてより高く、そして最初のワクチン接種後第７０日にピークとなったことを示している。大腸菌抗原に対する抗体価を、図９に示す。免疫刺激剤としてのＧＰＩ−０１００の存在が、免疫刺激剤としてＤＤＡを伴う処方物と比較した場合に相対的により高い抗体価を誘導したにもかかわらず、大腸菌抗原に対する抗体価は、双方のワクチン処方物で同程度であった。
【０１５７】
（実施例１９）
マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物の殺ウイルス活性の分析
マイクロ流動化がウイルスを不活化するかどうかを判定するために、三つのマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくウイルス調製物の殺ウイルス活性を測定した。この三つの調製物は、三つの異なるウシ感染性ウイルス、すなわちウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）及びウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）を含有した。
【０１５８】
三つのワクチン調製物における殺ウイルス活性の検出を、USDA 9CFR.113.35要件にしたがって行った。
表１６に示した結果は、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物のマイクロ流動化がワクチン調製物のいかなる有意な不活化も引き起こさないことを、示している。
【０１５９】
【表１７】
【０１６０】
（実施例２０）
マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物の調製
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物を、ＤＲＡＫＥＯＬレシチン油溶液（２５％レシチンを伴う軽質鉱油）とＴＷＥＥＮ ８０（０．１８％の最終濃度で）とＳｐａｎ
８０（０．０８％の最終濃度で）とを組み合わせて、３６±１℃にて８〜２２時間混合することにより、調製した。次いで、Ross（Hauppauge、ニューヨーク州、11788）乳化装置をおよそ３４００ｒｐｍで用いて、油混合物を生理食塩液に加えた。続いて、該混合物を、２００μｍの相互作用チャンバーを伴うマイクロ流動化装置に、４５００±５００ｐｓｉにて一度通した。図１０Ａ及び図１０Ｂは、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物の安定性を示す。レーザー回折により測定された、最初の開始時点における粒子サイズ分布（図１０Ａ）は、２２ヶ月間の４℃保管後の粒子サイズ分布（図１０Ｂ）とほとんど同一であった。
【０１６１】
（実施例２１）
ＱｕｉｌＡ−コレステロール免疫原性複合体の電子顕微鏡による分析
Ｑｕｉｌ Ａ及びコレステロールにより形成された免疫原性複合体の性質を判定するため、これらの二成分の混合物を、抗原の存在下及び非存在下のいずれかで作った。
【０１６２】
５０ｍｌのＫＲ−Ｈａｌｓ緩衝液を含有するビーカーに、溶液を磁気撹拌子で攪拌しながら、ＢＶＤ Ｉ型抗原を加えた。その後、Ｑｕｉｌ
Ａの濃縮ストック溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）を、溶液を攪拌しながら１滴ずつ加えて、５０μｇ／ｍｌの最終濃度に到達させた。Ｑｕｉｌ
Ａの添加後に、コレステロール・エタノール溶液（１８ｍｇ／ｍｌ）を５０μｇ／ｍｌの最終濃度となるように加えた。
【０１６３】
二番目のビーカーには、Ｑｕｉｌ Ａ及びコレステロールを、ＢＶＤ Ｉ型抗原を全く含まない５０ｍｌの緩衝液に同じ方法で加えた。
透過型電子顕微鏡用に、１０μｌの各試料を、formvar／炭素担体プラットホームを伴う４００メッシュ銅グリッド（Electron
Microscopy Sciences, Inc.、フォートワシントン、ペンシルバニア州）上に吸着させた。該試料を、ろ過したｐＨ５．２の２％リンタングステン酸１０μｌを造影剤として用いて、ネガティブ染色した。該試料を、８０ｋＶの加速電圧にてJEOL
1230透過型電子顕微鏡（JEOL Inc.、東京、日本）を用いて、検討した。デジタルイメージングを、Gatan BioScan 792カメラで行った。顕微鏡撮影を、４４８９ ＥＭフィルムで行い、そしてコダブロムＩＩ ＲＣ Ｆ３紙（Eastman Kodak Company、ロチェスター、ニューヨーク州）に印刷した。
【０１６４】
ＢＶＤ Ｉ型抗原を全く含まない、コレステロール及びＱｕｉｌ Ａのみを含有する溶液では、らせん状ミセルが、Ｑｕｉｌ Ａミセル及びコレステロール結晶とともに検出された（図１１）。らせん状ミセルは、絡み合い、そしてメッシュのようにみえた。ＢＶＤ
Ｉ型抗原を含有する試料では、らせん状ミセルは、ランダムに特定の高密度領域を取り囲むことがみられた（図１２）。該高密度領域はＢＶＤ１型抗原を表し、そしてＱｕｉｌ
Ａとコレステロールの会合により生じるらせん状免疫原性複合体は、ＢＶＤ Ｉ型抗原の表面に吸着することが見いだされている。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、マイクロ流動化されていないワクチン組成物のバッチ調製のための過程を示す。この過程では、種々のワクチン成分を、左の添加容器に添加し、そして最終的には、成分を単純な機械的手段により混ぜ合わせる混合容器へと投入する。
【図２】図２は、内在的に取り込まれた抗原を含有するマイクロ流動化されたワクチン組成物を調製するための過程を示す。種々のワクチン成分を、添加容器に添加し、そして単純な機械的手段により混合するためのプレ乳剤混和ユニットに移す。
【図３】図３は、マイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン、及びベンチ混和ワクチン調製物の液滴サイズの分布を、示す。
【図４】図４は、マイクロ流動化されたワクチン調製物では相分離しないことを示す。
【図５】図５は、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物（Ａ９０７５０５）、及び対照である三つのマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標登録）処方物に基づくワクチン調製物（Ａ９０４３６９、Ａ９０４３７０及びＡ９０４３７１）中に内在的に取り込まれた抗原の安定性の比較を、示す。すべての四つのワクチン調製物を、４℃にて２年間保管した。保管中の異なる時点（０、６、１２または２４ヶ月）で、すべての四つの処方物を用いて、３ヶ月齢のウシをワクチン接種した。ワクチン接種を、２ｍｌのワクチン用量で第０日及び第２１日に行い、そして二回目のワクチン接種後２週間に、血清を採取した。ＢＶＤＩＩ型ウイルスに対する中和抗体価を、血清試料のそれぞれにおいて測定した。データを、５例の動物の幾何平均として示した。
【図６】図６は、マイクロ流動化されたワクチン及びマイクロ流動化されていないワクチンの投与前及び投与後のウシの直腸温の最小二乗平均を示す。Ｔ０１：プラセボ群−１倍用量；Ｔ０２：プラセボ群−２倍用量；Ｔ０３：マイクロ流動化されていない処方物−１倍用量；Ｔ０４：マイクロ流動化されていない処方物−２倍用量；Ｔ０５：マイクロ流動化された処方物−１倍用量；Ｔ０６：マイクロ流動化された処方物−２倍用量。
【図７】図７は、マイクロ流動化されていないワクチン処方物及びマイクロ流動化されたワクチン処方物の投与後にウシにおいて観察される注射部位反応体積の最小二乗平均を示す。Ｔ０３：マイクロ流動化されていない処方物−１倍用量；Ｔ０４：マイクロ流動化されていない処方物−２倍用量；Ｔ０５：マイクロ流動化された処方物−１倍用量；Ｔ０６：マイクロ流動化された処方物−２倍用量。
【図８】図８は、組換えＰａｕＡ抗原と大腸菌全細胞抗原の双方を含有する種々のワクチン処方物でワクチン接種後の、Streptococcus uberis由来組換えＰａｕＡ抗原のＩｇＧ力価の幾何平均を示す。
【図９】図９は、組換えＰａｕＡ抗原と大腸菌全細胞抗原の双方を含有する種々のワクチン処方物でワクチン接種後の、Streptococcus uberis由来大腸菌全細胞抗原のＩｇＧ力価の幾何平均を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ及び図１０Ｂは、最初の生成時（図１０Ａ）及び生成後２２ヶ月（図１０Ｂ）におけるマイクロ流動化されたＡｍｐｈｉｇｅｎ処方物の粒子サイズ分布を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ及び図１０Ｂは、最初の生成時（図１０Ａ）及び生成後２２ヶ月（図１０Ｂ）におけるマイクロ流動化されたＡｍｐｈｉｇｅｎ処方物の粒子サイズ分布を示す。
【図１１】図１１は、Ｑｕｉｌ Ａミセル及びコレステロール結晶とともに形成されたらせん状ミセルを示す電子顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、ＢＶＤ Ｉ型抗原の表面にＱｕｉｌ Ａ及びコレステロールにより形成されたらせん状免疫原性複合体を示す電子顕微鏡写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サポニン配糖体、ステロール及び抗原を含んでなるワクチンであって、前記サポニン配糖体及び前記ステロールが互いに会合してらせん状ミセルの形状の複合体を形成し、かつ前記抗原が前記らせん状ミセルと混合されているが、しかしその内部には組み込まれていない、上記ワクチン。
【請求項２】
獣医学的に許容可能なキャリアーをさらに含んでなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記の獣医学的に許容可能なキャリアーが水中油型乳剤である、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記サポニン配糖体がトリテルペノイドである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記トリテルペノイドがＱｕｉｌ Ａである、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記ステロールがコレステロールである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記抗原がウイルス抗原、細菌抗原またはその組み合わせを含んでなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記抗原がウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）１型またはＢＶＤＶ２型抗原を含んでなる、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のワクチンの製造方法であって、
ａ）緩衝液中に抗原組成物を調製し；
ｂ）サポニンをステップａの組成物に加え；そして
ｃ）アルコール中のステロールをステップｂの組成物に加える、
ステップを含む製造方法。
【請求項１】
サポニン配糖体、ステロール及び抗原を含んでなるワクチンであって、前記サポニン配糖体及び前記ステロールが互いに会合してらせん状ミセルの形状の複合体を形成し、かつ前記抗原が前記らせん状ミセルと混合されているが、しかしその内部には組み込まれていない、上記ワクチン。
【請求項２】
獣医学的に許容可能なキャリアーをさらに含んでなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記の獣医学的に許容可能なキャリアーが水中油型乳剤である、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記サポニン配糖体がトリテルペノイドである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記トリテルペノイドがＱｕｉｌ Ａである、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記ステロールがコレステロールである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記抗原がウイルス抗原、細菌抗原またはその組み合わせを含んでなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記抗原がウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）１型またはＢＶＤＶ２型抗原を含んでなる、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のワクチンの製造方法であって、
ａ）緩衝液中に抗原組成物を調製し；
ｂ）サポニンをステップａの組成物に加え；そして
ｃ）アルコール中のステロールをステップｂの組成物に加える、
ステップを含む製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−１６８６０５（Ｐ２０１１−１６８６０５Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８９０１８（Ｐ２０１１−８９０１８）
【出願日】平成２３年４月１３日（２０１１．４．１３）
【分割の表示】特願２００７−５０６８５０（Ｐ２００７−５０６８５０）の分割
【原出願日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１３日（２０１１．４．１３）
【分割の表示】特願２００７−５０６８５０（Ｐ２００７−５０６８５０）の分割
【原出願日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
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