マイコトキシンの体内への吸収を抑制する効果のある食品または飼料用添加剤
【課題】マイコトキシンの体内吸収を抑制する効果のある食品用もしくは飼料用添加剤、並びに当該添加剤を含む食品または飼料を提供する。また、食品もしくは飼料中に混在し得るマイコトキシンについて、その体内吸収を抑制する方法を提供する。
【解決手段】マイコトキシンの体内吸収を抑制するための食品用もしくは飼料用添加剤として、低メトキシルペクチンおよびカルシウム塩を含有する組成物を用いる。
【解決手段】マイコトキシンの体内吸収を抑制するための食品用もしくは飼料用添加剤として、低メトキシルペクチンおよびカルシウム塩を含有する組成物を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコトキシンの体内吸収を抑制する効果のある食品もしくは飼料用添加剤、並びに当該添加剤を含む食品または飼料に関する。また本発明は、食品もしくは飼料中に混在している可能性のあるマイコトキシンについて、その体内吸収を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコトキシンは、カビが産生する二次代謝産物で、人と動物に有害な化合物の総称であり、数多くの化合物やその類縁体が存在することが知られている。マイコトキシン中毒は、急性のものでは突発性の下痢と肝機能障害の主症状を呈する。慢性のものでは内臓に炎症をおこすことによって消化障害、呼吸器病の主症状を呈する。また、一部のマイコトキシンは変異原性の強いものや免疫能低下を引き起こすものもある。穀物などに特に頻繁に汚染しているマイコトキシンとして、デオキシニバレノールなどが挙げられる。
【０００３】
デオキシニバレノール(以下DONと略す)は、主にフザリウム属のカビ（赤カビ）が産生するトリコテセン系のマイコトキシンであり、別名ボミトキシン（Vomitoxin）や吐血毒素とも言われている。主な産生菌は、Fusarium 属のF.graminearum、F.culmorum 等があり、麦類を中心とした赤カビ病の原因となる植物病原菌の一つで、圃場での汚染により、最も広く穀類に被害を与え、特にとうもろこしや麦類のDON汚染は、世界的に問題となっている。
【０００４】
フモニシンはフザリウム属のカビであるF. verticillioides 、F ．moniliformeおよび F. proliferatum が産生するマイコトキシンであり、穀類を汚染するカビ毒として知られている。特に家畜飼料のフモニシン汚染例は多く、急性毒性はないが長期毒性としてほとんどの家畜に対して肝機能障害、心機能障害を引き起こし、さらには変異原性も疑われている。国内では飼料に対してのみ基準値が設定さており、食品に対する基準値はないが、最近では、とうもろこし加工品を主食とする国や地域での新生児の神経管に関する催奇形性から注目されており、今後注意が必要なカビ毒である。
【０００５】
パツリンは、Penicillium expansum等のカビによって産生され、種々の動物に致死的な毒性を有するカビ毒である。特に果汁に対する汚染が深刻であり、リンゴジュースへのパツリンの混入は様々な国で報告されており、深刻な被害をもたらしている。
【０００６】
食品や飼料中のマイコトキシンを除去もしくは減毒する方法としては、従来のように殺菌剤や抗菌剤を主成分とする農薬を用いてマイコトキシン産生菌自体を殺菌および低減する方法が一般的である。また、マイコトキシン生合成阻害剤を用いて汚染されているマイコトキシン量を減少させる方法もある（特許文献１）。しかしながら、これらの方法は、農薬による環境汚染等の問題がある。
【０００７】
一方、すでにマイコトキシンに汚染されている食品や飼料中の毒素の除去や無毒化については、マイコトキシン無毒化酵素を用いる方法（特許文献２）やEubacterium属等のマイコトキシン無毒化細菌を繁殖させるなどといった方法がある（特許文献３）。しかしながら、これらの方法には、特殊で高価な酵素や細菌を繁殖させる環境が必要であり、多くの食品や飼料に適用することは難しい。また、化石サンゴを主成分として含有するマイコトキシン吸着剤を用いて飼料からマイコトキシンを取り除く方法も確立されているがその効果は限定的である（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１６７１３８号公報
【特許文献２】特表２００１−５２１３６２号公報
【特許文献３】特表２００８−５２０１９４号公報
【特許文献４】特開２００７−１７４９２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、すでにマイコトキシンに汚染されている可能性のある食品または飼料を摂取した場合において、マイコトキシンが体内に吸収されることを抑制することによって、マイコトキシンが生体に及ぼす影響を低減するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を重ねていたところ、マイコトキシンで汚染された食品または飼料に低メトキシペクチンおよびカルシウム塩を含む組成物を共存させると、マイコトキシンが上記組成物から形成されるゲル内に取り込まれ、しかもその内部に安定に閉じこめられることで、マイコトキシンの体内への吸収および蓄積が抑制できることを見出した。
【００１１】
本発明は、かかる知見に基づいて開発されたものであり、下記の態様を含むものである：
（Ｉ）マイコトキシンの体内吸収を抑制するための食品もしくは飼料用添加剤
（I-1）低メトキシルペクチンおよびカルシウム塩を含有することを特徴とする、マイコトキシンの体内吸収を抑制するための食品用もしくは飼料用添加剤。
（I-2）低メトキシルペクチン１００質量部に対してカルシウム塩を０．２質量部以上の割合で含有する（I-1）に記載する食品用もしくは飼料用添加剤。
（I-3）低メトキシルペクチンがアミド化ペクチンである（I-1）または（I-2）に記載する食品用もしくは飼料用添加剤。
（I-4）上記マイコトキシンがデオキシニバレノール、フモニシン、およびパツリンからなる群から選択される少なくとも１種である、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載の食品用もしくは飼料用添加剤。
【００１２】
（II）飼料
マイコトキシンの体内吸収を抑制することを目的として（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する飼料用添加剤を含む飼料。
【００１３】
（III）体内でのマイコトキシンの吸収を抑制する方法
ヒト以外の動物に、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する飼料用添加剤または（II）に記載する飼料を経口投与することを特徴とする、体内でのマイコトキシンの吸収を抑制する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、マイコトキシンで汚染されている食品や飼料を摂取した際のマイコトキシンの体内への吸収および蓄積を有意に抑制することができる食品用または飼料用の添加剤、並びにそれを添加した食品もしくは飼料を提供することができる。
【００１５】
例えば、低メトキシペクチンおよびカルシウム塩を含む本発明の食品用添加剤は、乳児や咀嚼困難な高齢者などを対象とした、例えばゼリー状の食品（菓子を含む）に用いることができ、このため、マイコトキシンに対して抵抗性が低い高リスク者に対するマイコトキシン対策として有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の製剤（実施例２）を経口投与したマウス群の血清中のＤＯＮ濃度の経時的推移を示す（実験例３）。
【図２】比較例１の製剤を経口投与したマウス群の血清中のＤＯＮ濃度の経時的推移を示す（実験例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、低メトキシルペクチン（以下、「ＬＭペクチン」という）とカルシウム塩を主成分として含有する食品用もしくは飼料用の添加剤である。かかる添加剤は、水の存在下でゲルを形成することでマイコトキシンを取り込み、しかもゲル内部に安定に閉じ込める作用を有し、かかる作用に基づいて体内でのマイコトキシンの吸収や蓄積を抑制する効果を発揮する。このため、当該本発明の添加剤は、食品または飼料に混在している可能性のあるマイコトキシンについて、専ら食品または飼料とともに用いられて、マイコトキシンの体内吸収および蓄積を抑制する目的で使用される。
【００１８】
なお、ここで「食品または飼料とともに」とは、添加剤を食品または飼料に混合した状態で用いる場合のみならず、食品または飼料と組み合わせて同時に摂取する場合；添加剤を摂取した後、速やかに食品または飼料を摂取する場合；食品または飼料を摂取した後、速やかに添加剤を摂取する場合のいずれの態様をも包含する意味で用いられる。
【００１９】
本発明で用いられるＬＭペクチンは、植物の果皮などを酸性溶液で抽出して得られるα−１，４グリコシド結合したＤ−ガラクツロン酸もしくはＤ−カラクツロン酸のカルボキシル基がメチルエステル化されたＤ−カラクツロン酸メチルエステルからなる主鎖と、主にアラビノースやグルコース等の中性糖からなる側鎖によって構成される多糖類である。ペクチンの由来としてはレモンやライムが最も適しているが、オレンジ、グレープフルーツやリンゴなどでも良い。
【００２０】
ペクチンはＤ−ガラクツロン酸のフリーのカルボキシル基が２価のカチオン、特にカルシウムイオンと結合することによりゲルを形成ことが知られている。ペクチンは原料からの粗抽出段階ではエステル化度５０％以上の高メトキシル状態である。この状態ではフリーのカルボキシル基が少なすぎるためゲル化反応がすすみ難いため、メトキシル化度を低減させたＬＭペクチンが広く流通している。本発明においてはペクチンをカルシウムイオンでゲル化させることが必要であるため、低メトキシル化され、メトキシル化度が５０％以下になっていることが必要である。好ましくはメトキシル化度１０％以上、４０％以下のペクチンである。
【００２１】
メトキシル化度を低減させるためには一般的に酸、酵素処理やアンモニア処理を行うが、アンモニア処理の際にペクチンはアミド化される。本発明では、アミド化されていない非アミド化ペクチンおよびアミド化されたアミド化ペクチンのいずれをも使用することができる。後述する実験例で示すように、マイコトキシンの取り込み率が大きいことからアミド化ペクチンが好適に使用される。
【００２２】
これらのＬＭペクチンは食品添加物として広く流通しており、誰でも商業的に容易に入手することができる。商業的に入手可能な製品としては、例えば非アミド化ペクチンとしてはビストップ［商標］Ｄ−２２６２、アミド化ペクチンとしてはビストップ［商標］Ｄ−２２６４（いずれも、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）を挙げることができる。その形態は、顆粒状、粒状、または粉末状（スプレードライ粉末品を含む）の形態の別を問わず、いずれの形態も使用することができる。
【００２３】
本発明に用いられるカルシウム塩としては、カルシウムの塩化物、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、有機酸塩などを挙げることができる。ここで有機酸としては、乳酸、クエン酸、ピルビン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、マレイン酸等を挙げることができる。好ましくは炭酸塩や乳酸塩である。なお、ここで、中性条件下で水に溶解しやすいカルシウム塩としてはカルシウムの塩化物および水酸化物を、中性条件下で水に難溶であるものの酸性条件下で易溶性を示すカルシウム塩としてはカルシウムの炭酸塩、炭酸水素塩、または乳酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。好ましくは炭酸塩である。
【００２４】
これらのカルシウム塩は形態の別を問わず、いずれの形態も使用することができるが、水への溶解性を考慮すれば、粉末または顆粒状の形態を有することが好ましい。かかるカルシウム塩もまた商業的に容易に入手することができる。
【００２５】
本発明の添加剤は、ＬＭペクチンとカルシウム塩を混合することによって製造することができる。好ましくは、ＬＭペクチンとカルシウム塩とが互いに固体状態で共存するように混合することによって製造する。水への溶解性を考慮すれば、ＬＭペクチンとカルシウム塩とをそれぞれ顆粒または粉末の状態で混合することが好ましい。また、混合したＬＭペクチンとカルシウム塩を、流動層造粒機を用いて造粒することにより、顆粒形態の製剤を製造してもよい。さらには、低メトキシルペクチンとカルシウム塩をあらかじめｐＨが５以上の水性溶媒に溶かすことにより調製される液状の製剤としても使用することができる。
【００２６】
本発明の添加剤中に配合するＬＭペクチンの割合としては、通常２０〜９９質量％を挙げることができる。好ましくは３０〜９５質量％、より好ましくは５０〜９７質量％である。また、本発明の添加剤中のカルシウム塩の割合は、通常０．１〜５質量％を挙げることができ、好ましくは０．２〜３質量％、より好ましくは０．５〜３質量％である。なお、本発明の添加剤中のＬＭペクチン１００質量部に対するカルシウム塩の割合としては、ゲルを形成する範囲であれば特に制限されないが、通常０．２質量部以上、好ましくは０．５〜５質量部、より好ましくは１〜３質量部である。
【００２７】
なお、本発明の添加剤は、上記するようにＬＭペクチンとカルシウム塩からなるものであってもよいし、また本発明の効果を妨げない限り、他の成分を含有することもできる。かかる他の成分としては、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、ラクトースなどといった、単糖類や二糖類、オリゴ糖やデキストリンなどの比較的低分子の多糖類などを挙げることができる。
【００２８】
本発明の添加剤は、前述するように、マイコトキシンが混在しているおそれのある食品または飼料とともに用いられる。好ましくは本発明の添加剤が対象の食品または飼料と一緒に経口投与されるように、当該食品または飼料に配合した状態で使用される。
【００２９】
斯くして本発明の添加剤は、食品または飼料とともに経口摂取されることによって、胃内でＬＭペクチンとカルシウムイオンとが反応してゲル化し、当該ゲル内に食品または飼料中に混在するマイコトキシンを閉じ込める。その結果、マイコトキシンの体内への吸収や蓄積を抑制することができる。
【００３０】
この場合、食品または飼料に対して使用される本発明の添加剤の割合は、添加剤を添加した最終食品または飼料１００質量％中に、ＬＭペクチンが０．５質量％以上、好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上の割合で含まれるように設定することが好ましい。なお、上限は特に制限はされないが、通常１０質量％程度である。
【００３１】
このようにＬＭペクチンは、ｐＨ４以下の低ｐＨにおいて水存在下でカルシウムイオンと反応することによりゲル化する。このため、食品または飼料の形状に応じて、本発明の添加剤の調製に使用するカルシウム塩を選択することが好ましい。
【００３２】
食品または飼料が固体形状を有するものである場合は、中性条件での水易溶性および水難溶性の別を問わず、いずれのカルシウム塩をも使用することができる。この場合、本発明の添加剤を配合した食品または飼料（固体形状）は、経口摂取後、胃内の水存在下でＬＭペクチンとカルシウムイオンとが反応することによりゲル化し、その結果、当該ゲル内に食品または飼料中に混在するマイコトキシンが閉じ込められることになる。
【００３３】
食品または飼料がゲル形状を有するものである場合も、中性条件での水易溶性および水難溶性の別を問わず、いずれのカルシウム塩をも使用することができる。好ましくは食品または飼料のｐＨ条件下で水溶性を示すカルシウム塩である。この場合、本発明の添加剤を配合した食品または飼料（ゲル形状）は、すでにその状態でゲル内に食品または飼料中に混在するマイコトキシンが閉じ込められているため、経口摂取後、マイコトキシンの体内吸収や蓄積が抑制されることになる。
【００３４】
食品または飼料が中性またはアルカリ性で水溶液の形状を有するものである場合は、中性またはアルカリ性条件では水難溶性で、酸性条件で水易溶性を示すカルシウム塩を使用することが好ましい。この場合、本発明の添加剤を配合した食品または飼料（水溶液）は、経口摂取後、胃内の酸性の胃液存在下でＬＭペクチンとカルシウムイオンとが反応することによりゲル化し、その結果、当該ゲル内に食品または飼料中に混在するマイコトキシンが閉じ込められることになる。
【００３５】
また、当該添加剤を用いて食品や飼料を製造すると、それらの食品や飼料を摂取した場合におけるマイコトキシンによる汚染を被るリスクを減じることができる。当該添加剤は、ゲル状食品または飼料の製造に適しており、食品を例にとると、具体的にはカスタードプリン、ミルクプリンなどのプリン類、ゼリー、ババロア、グミ食感キャンディー及びヨーグルトなどのデザート類などを例示できる。
【００３６】
また飼料用添加剤としては、例えば顆粒状や粉末状などの固形形態を有していることが好ましく、これらの添加剤は、通常、固形形態の飼料に配合されて、飼料と一緒に、または飼料として、ヒト以外の動物に摂取される。ここでヒト以外の動物としては、草食動物を挙げることができ、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギおよびブタ等の家畜；ゾウ、サイ、シカ、キリン、カバ、ラクダ、シカ、ウサギ等の飼育動物；ニワトリ、アヒル、ウズラなどの家禽を例示することができる。
【００３７】
当該飼料用添加剤は、飼料と一緒に、または飼料として、上記動物に経口摂取されると、動物の胃内でＬＭペクチンとカルシウムイオンとが反応してゲル化し、飼料中に混在するマイコトキシンを内部に取り込み、封じ込める。斯くして、マイコトキシンの動物体内への吸収及び蓄積が抑制され、マイコトキシン暴露による悪影響を低減することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の内容を以下の実施例及び比較例、並びに実験例を用いて具体的に説明する。但し、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００３９】
実施例１〜３および比較例１
アミド化ペクチンであるビストップ［商標］Ｄ−２２６４（メトキシル化度：３５％、三栄源エフ・エフ・アイ(株)製）と乳酸カルシウム（シグマ社製）を表１に示す配合量で粉体混合し、粉末状の製剤を調製した。また、ビストップ［商標］Ｄ−２２６４単体（乳化カルシウムなし）を比較例１の製剤とした。
【００４０】
【表１】
【００４１】
実施例４〜６および比較例２
非アミド化ペクチンであるビストップ［商標］Ｄ−２２６２（メトキシル化度：３５％、三栄源エフ・エフ・アイ(株)製）と炭酸カルシウム（シグマ社製）を表２に示す配合量で粉体混合し、粉末状の製剤を調製した。また、ビストップ［商標］Ｄ−２２６２単体（乳化カルシウムなし）を比較例２の製剤とした。
【００４２】
【表２】
【００４３】
実験例１ ＤＯＮの外液への溶出抑制効果
マイコトキシンとしてデオキシニバレノール（DON）を用いて、本発明の添加剤のマイコトキシン取り込み効果（外液への溶出抑制効果）を評価した。
【００４４】
（１）実験方法
実施例１〜６、並びに比較例１及び２で調製した各粉末製剤を、表３に示す濃度（重量％）になるように超純水に溶解し、その１００ｍｌを５μｇ／ｍｌのＤＯＮを含む超純水１５ｍｌと混合した（実験試料1-1〜1-8）。このとき、全ての液状試料は若干の粘性をもった溶液状であった。
【００４５】
また、ブランク試料として、超純水１００ｍｌに５μｇ／ｍｌのＤＯＮを含む超純水１５ｍｌを混合した試料を調製した。この溶液はほとんど粘りをもたない溶液となった。
【００４６】
これらにそれぞれ１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３）を３５ｍｌ加えて攪拌し、次いでこれに１５００ｍｌの水を加えて、ゆるやかに攪拌しながら３７℃で一昼夜放置した。実験試料１−１〜１−６は、クエン酸添加直後から徐々に固形化し、３７℃で一昼夜放置にはゆるやかなゲル状になった。一方、実験試料１−７、１−８およびブランク試料はゲル化しなかった。
【００４７】
次いで、水相に遊離しているＤＯＮを、下記に説明する免疫酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて定量し、得られたＤＯＮ量から下式に基づいて遊離ＤＯＮ分率（％）を算出した。
【００４８】
【数１】
【００４９】
＜免疫酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞
ＤＯＮ／ＮＩＶ（デオキシニバレノール／ニバレノール）抗体（National Center for Agricultural Utilization Research, USAのMaragos博士より譲り受けた）を０．２Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(和光純薬(株)製)を用いて２０００倍希釈し抗体を調整した。
【００５０】
この抗体を９６ウェルのプラスティックプレートの各ウェルに １００μｌずつ分注し、４℃で１８時間静置した。静置後のプレートを洗浄液（０．２Ｍ ＰＢＳ溶液１００ｍｌに対して超純水９００ｍｌとＴｗｅｅｎ２０ ０．５ｍｌ(和光純薬(株)製)を加えて１Ｌとしたもの）で４回洗浄した。これに１％ポリビニルアルコール溶液（東京化成社製）を２５０μｌずつ分注し、３０分静置した。これを洗浄液でさらに４回洗浄してＤＯＮ／ＮＩＶ抗体をプレートにコーティングした。
【００５１】
１％の牛胎児血清（ＢＳＡ）を含むＰＢＳを用いて１００００倍に希釈したＤＯＮホースラディッシュペルオキシダーゼ（以後ＤＯＮ−ＨＲＰとする）（和光純薬(株)製）７５μｌと各実験試料７５μｌを混合し、この混合溶液を１００μｌずつ上記で調製したＤＯＮ／ＮＩＶ抗体コーティングプレートに分注した。これにペルオキシダーゼ発色基質（ＴＭＢ基質）（ＢＤバイオサイエンス社）を１００μｌずつ分注し、暗所にて１５分間静置した後、２Ｎの硫酸を１００ｍｌずつ分注し、この溶液の４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５２】
実験試料中のＤＯＮの量は、標準検量線から算出した。当該標準検量線は、実験試料の代わりに、１ｐｐｍのＤＯＮ標準品（和光純薬(株)製）をＰＢＳを用いて２５０ｐｐｂ、６２．５ｐｐｂ、１５．６ｐｐｂ、および３．９ｐｐｂの４段階に希釈したものを、上記と同様の方法で発色させることによって作成した。
【００５３】
（２）実験結果
結果を表３に合わせて示す。
【００５４】
【表３】
【００５５】
低メトキシルペクチン粉末を単独で用いた実験試料１−７および１−８は、いずれも遊離ＤＯＮ分率が１００％であり、これから、添加したＤＯＮは当該試料（実験試料１−７および１−８）に取り込まれず、そのまま外部に遊離していることがわかる。これに対して、低メトキシルペクチンとカルシウムを含む実施例１〜６の製剤を用いて調製した実験試料１−１〜１−６では、添加したＤＯＮはこれらの試料から形成されたゲル内に取り込まれ、ＤＯＮが外液に流出することが抑制されていることが確認された。特に低メトキシルペクチンとしてアミド化された製剤（実施例１〜３）を用いた実験試料１−１〜１−３において顕著な効果が得られた。低メトキシルペクチンとして非アミド化ペクチンの製剤（実施例４〜６）を用いて調製した実験試料１−４〜１−６は、製剤含有量が多い実験試料１−６では、上記アミド化ペクチンを含む製剤と同様の抑制効果が得られたが、実験試料１−５や１−４のように製剤含有量が少なくなると抑制効果の低下が認められた。これらのことから、低メトキシルペクチンとして非アミド化物よりもアミド化された低メトキシルペクチンを用いるほうが、優れたＤＯＮの取り込み効果が得られることが判明した。
【００５６】
実験例２ フモニシンＢ１およびパツリンの外液への溶出抑制効果
マイコトキシンとしてフモニシンＢ１とパツリンを用いて、本発明の添加剤のマイコトキシン取り込み効果（外液への溶出抑制効果）を評価した。
【００５７】
（１）実験方法
実施例１〜３および比較例１の粉末製剤を表４に示す濃度（質量％）になるように超純水に溶解し、その１００ｍｌを５μｇ／ｍｌのフモニシンＢ１及びパツリンを含む超純水１５ｍｌと混合した（実験試料2-1〜2-4）。このとき、全ての液状試料は若干の粘性をもった溶液状であった。また、ブランク試料として、超純水１００ｍｌに５μｇ／ｍｌのフモニシンＢ１及びパツリンを含む超純水１５ｍｌと混合した試料を調製した。この溶液はほとんど粘りを持たない溶液となった。
【００５８】
これらにそれぞれ１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３）３５ｍｌを加えて緩やかに混合した。これに１５００ｍｌの水を加えて、ゆるやかに攪拌しながら３７℃で２４時間放置した。実験試料２−１〜２−４は、クエン酸緩衝液添加直後から徐々に固定化し、３７℃で２４時間放置した後にはゆるやかなゲル状になった。一方、ブランク試料はゲル化しなかった。
【００５９】
次いで、水相に遊離するフモニシンＢ１とパツリンの量（マイコトシキン量）を、下記条件のＬＣ／ＭＳ／ＭＳで定量した。斯くして得られたマイコトキシン量から下式に基づいて算出した値を、遊離マイコトシキン分率（％）とした。
【００６０】
【数２】
【００６１】
＜ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法＞
フモニシンＢ１およびパツリンの定量は、１１００シリーズＨＰＬＣシステム（アジレント社製）およびＱｕａｔｔｒｏ Ｕｌｔｉｍａ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を用い、下記の条件で行った。
【００６２】
(1)フモニシンＢ１
カラム : Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｘｔｅｎｄ Ｃ１８
(５ｍｍ, １５０ × ２．１ｍｍ)（アジレント社製）
移動相：０．１％ギ酸 （ｉｎ 1．０ｍＭ 酢酸アンモニウム）＋アセトニトリル
ただし、アセトニトリルは５分間で２０％→９０％までグラジェント後５分間保持
カラム温度 : ４０℃
注入量:１０ｍｌ
流速:２００ｍｌ／ｍｉｎ
ＭＳ／ＭＳ条件 : ＥＳＩ ポジティブモード
722 > 352 (定量イオン)
722 > 334 (定性イオン)。
【００６３】
（2）パツリン
カラム : Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８
(３．５ｍｍ, １００×２．１ｍｍ ｉｄ)（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：２ｍＭ酢酸アンモニウム溶液＋アセトニトリル
ただし、アセトニトリルは１４分間で３％→９５％までグラジェント
カラム温度 : ４０℃
注入量:１０ｍｌ
流速:２００ｍｌ／ｍｉｎ
ＭＳ／ＭＳ条件 : ＥＳＩ ネガティブモード
153 > 109 (定量イオン)
153 > 81 (定性イオン)。
【００６４】
（２）実験結果
結果を表４に合わせて示す。
【００６５】
【表４】
【００６６】
実施例１〜３の製剤を用いた実験試料２−１〜２−３においても、ＤＯＮの場合と同様に３７℃で２４時間放置した後の遊離マイコトキシン分率が有意に抑えられており、フモニシンＢ１やパツリンのマイコトキシンが本発明の製剤から形成されたゲル内に取り込まれ、外部への流出が抑制されていることが確認された。
【００６７】
以上の実験例１および２から、低メトキシペクチンとカルシウム塩を含む本発明の製剤から形成されるゲルには、マイコトキシンを取り込み、外部への流出を抑制する作用があることが確認された。
【００６８】
実験例３ ＤＯＮの血中濃度の変化
実験例１と２の結果から、低メトキシペクチンとカルシウム塩を含む製剤から形成されるゲルは、マイコトキシンを取り込んで内部に閉じ込めることが判明した。そこで、ここでは当該ゲル内に封じ込められたマイコトキシンの体内挙動を調べた。
【００６９】
（１）実験方法
１．５ｍｌ容のマイクロチューブに１０００μｇ相当のデオキシニバレノール（DON）を分取し乾固した。実施例２および比較例１の粉末製剤０．０１ｇを１ｍｌの超純水に溶解し、これを上記のマイクロチューブに添加した。これをＢ６Ｃ３Ｆ１マウス（ミシガン州立大学のPestka博士から譲り受けた）（各試験区毎に４検体）に２５μｌずつ経口投与した。
【００７０】
投与後１５分から２４時間まで経時的に血液を採取し、血清中のＤＯＮの濃度を測定した。また、投与２４時間後にマウスから肝臓を取り出し、肝臓中のＤＯＮ濃度を測定した。
【００７１】
＜血清中のＤＯＮの定量方法＞
採取した血液をエッペンドルフチューブに分注し、１４０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに分注する。得られた血清６０μｌに０．２ＭのＰＢＳを２４０μｌ加え、これを実験例１で説明した免疫酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）に供して、血清中のＤＯＮ濃度を定量する。
【００７２】
＜肝臓中のＤＯＮの定量方法＞
取り出した肝臓をミキサーでホモジナイズした後、０．２ＭのＰＢＳで１０倍に希釈し、１００℃で５分間煮沸した後、遠心分離によって固形分を沈殿させ、上清を分取する。これを実験例１で説明した免疫酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）に供して、肝臓中のＤＯＮ濃度を定量する。
【００７３】
（２）実験結果
実施例２の製剤を経口投与したときの血清中のＤＯＮ濃度の経時変化を図１に、比較例１の製剤を経口投与したときの血清中のＤＯＮ濃度の経時変化を図２に示す。また、投与２４時間後の肝臓中のＤＯＮ濃度を表５に示す。
【００７４】
【表５】
【００７５】
ＤＯＮは、経口投与直後、胃から比較的短い時間で吸収されることが知られている。比較例１の製剤を経口投与したマウスの血清中のＤＯＮ濃度は、投与後１５分間で最大（約２２００ｐｐｂ）となり、その後時間をかけて徐々に低下していくことが確認された（図２）。一方、実施例２の製剤を経口投与したマウスの血清中のＤＯＮ濃度は、経口投与１５分後に約５００ｐｐｂまでしか上昇せず（比較例１の場合の1/4以下）、その後すぐに低下した（図１）。また経口投与２４時間後の肝臓中のＤＯＮ濃度は、実施例２の製剤を経口投与したマウスの肝臓内ＤＯＮ濃度は比較例１の製剤を経口投与したマウスのそれに比べて低く、低メトキシペクチンとカルシウム塩を含む本発明の製剤には、当該製剤から形成されたゲル内にマイコトキシンを取り込んで外部に放出することを抑制することで、マイコトキシンの体内への吸収及び蓄積を抑制する効果があることが確認された。この意味で、低メトキシペクチンとカルシウム塩を含む本発明の製剤には、マイコトキシンの毒性の発現を減少する作用があるといえる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコトキシンの体内吸収を抑制する効果のある食品もしくは飼料用添加剤、並びに当該添加剤を含む食品または飼料に関する。また本発明は、食品もしくは飼料中に混在している可能性のあるマイコトキシンについて、その体内吸収を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコトキシンは、カビが産生する二次代謝産物で、人と動物に有害な化合物の総称であり、数多くの化合物やその類縁体が存在することが知られている。マイコトキシン中毒は、急性のものでは突発性の下痢と肝機能障害の主症状を呈する。慢性のものでは内臓に炎症をおこすことによって消化障害、呼吸器病の主症状を呈する。また、一部のマイコトキシンは変異原性の強いものや免疫能低下を引き起こすものもある。穀物などに特に頻繁に汚染しているマイコトキシンとして、デオキシニバレノールなどが挙げられる。
【０００３】
デオキシニバレノール(以下DONと略す)は、主にフザリウム属のカビ（赤カビ）が産生するトリコテセン系のマイコトキシンであり、別名ボミトキシン（Vomitoxin）や吐血毒素とも言われている。主な産生菌は、Fusarium 属のF.graminearum、F.culmorum 等があり、麦類を中心とした赤カビ病の原因となる植物病原菌の一つで、圃場での汚染により、最も広く穀類に被害を与え、特にとうもろこしや麦類のDON汚染は、世界的に問題となっている。
【０００４】
フモニシンはフザリウム属のカビであるF. verticillioides 、F ．moniliformeおよび F. proliferatum が産生するマイコトキシンであり、穀類を汚染するカビ毒として知られている。特に家畜飼料のフモニシン汚染例は多く、急性毒性はないが長期毒性としてほとんどの家畜に対して肝機能障害、心機能障害を引き起こし、さらには変異原性も疑われている。国内では飼料に対してのみ基準値が設定さており、食品に対する基準値はないが、最近では、とうもろこし加工品を主食とする国や地域での新生児の神経管に関する催奇形性から注目されており、今後注意が必要なカビ毒である。
【０００５】
パツリンは、Penicillium expansum等のカビによって産生され、種々の動物に致死的な毒性を有するカビ毒である。特に果汁に対する汚染が深刻であり、リンゴジュースへのパツリンの混入は様々な国で報告されており、深刻な被害をもたらしている。
【０００６】
食品や飼料中のマイコトキシンを除去もしくは減毒する方法としては、従来のように殺菌剤や抗菌剤を主成分とする農薬を用いてマイコトキシン産生菌自体を殺菌および低減する方法が一般的である。また、マイコトキシン生合成阻害剤を用いて汚染されているマイコトキシン量を減少させる方法もある（特許文献１）。しかしながら、これらの方法は、農薬による環境汚染等の問題がある。
【０００７】
一方、すでにマイコトキシンに汚染されている食品や飼料中の毒素の除去や無毒化については、マイコトキシン無毒化酵素を用いる方法（特許文献２）やEubacterium属等のマイコトキシン無毒化細菌を繁殖させるなどといった方法がある（特許文献３）。しかしながら、これらの方法には、特殊で高価な酵素や細菌を繁殖させる環境が必要であり、多くの食品や飼料に適用することは難しい。また、化石サンゴを主成分として含有するマイコトキシン吸着剤を用いて飼料からマイコトキシンを取り除く方法も確立されているがその効果は限定的である（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１６７１３８号公報
【特許文献２】特表２００１−５２１３６２号公報
【特許文献３】特表２００８−５２０１９４号公報
【特許文献４】特開２００７−１７４９２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、すでにマイコトキシンに汚染されている可能性のある食品または飼料を摂取した場合において、マイコトキシンが体内に吸収されることを抑制することによって、マイコトキシンが生体に及ぼす影響を低減するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を重ねていたところ、マイコトキシンで汚染された食品または飼料に低メトキシペクチンおよびカルシウム塩を含む組成物を共存させると、マイコトキシンが上記組成物から形成されるゲル内に取り込まれ、しかもその内部に安定に閉じこめられることで、マイコトキシンの体内への吸収および蓄積が抑制できることを見出した。
【００１１】
本発明は、かかる知見に基づいて開発されたものであり、下記の態様を含むものである：
（Ｉ）マイコトキシンの体内吸収を抑制するための食品もしくは飼料用添加剤
（I-1）低メトキシルペクチンおよびカルシウム塩を含有することを特徴とする、マイコトキシンの体内吸収を抑制するための食品用もしくは飼料用添加剤。
（I-2）低メトキシルペクチン１００質量部に対してカルシウム塩を０．２質量部以上の割合で含有する（I-1）に記載する食品用もしくは飼料用添加剤。
（I-3）低メトキシルペクチンがアミド化ペクチンである（I-1）または（I-2）に記載する食品用もしくは飼料用添加剤。
（I-4）上記マイコトキシンがデオキシニバレノール、フモニシン、およびパツリンからなる群から選択される少なくとも１種である、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載の食品用もしくは飼料用添加剤。
【００１２】
（II）飼料
マイコトキシンの体内吸収を抑制することを目的として（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する飼料用添加剤を含む飼料。
【００１３】
（III）体内でのマイコトキシンの吸収を抑制する方法
ヒト以外の動物に、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する飼料用添加剤または（II）に記載する飼料を経口投与することを特徴とする、体内でのマイコトキシンの吸収を抑制する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、マイコトキシンで汚染されている食品や飼料を摂取した際のマイコトキシンの体内への吸収および蓄積を有意に抑制することができる食品用または飼料用の添加剤、並びにそれを添加した食品もしくは飼料を提供することができる。
【００１５】
例えば、低メトキシペクチンおよびカルシウム塩を含む本発明の食品用添加剤は、乳児や咀嚼困難な高齢者などを対象とした、例えばゼリー状の食品（菓子を含む）に用いることができ、このため、マイコトキシンに対して抵抗性が低い高リスク者に対するマイコトキシン対策として有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の製剤（実施例２）を経口投与したマウス群の血清中のＤＯＮ濃度の経時的推移を示す（実験例３）。
【図２】比較例１の製剤を経口投与したマウス群の血清中のＤＯＮ濃度の経時的推移を示す（実験例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、低メトキシルペクチン（以下、「ＬＭペクチン」という）とカルシウム塩を主成分として含有する食品用もしくは飼料用の添加剤である。かかる添加剤は、水の存在下でゲルを形成することでマイコトキシンを取り込み、しかもゲル内部に安定に閉じ込める作用を有し、かかる作用に基づいて体内でのマイコトキシンの吸収や蓄積を抑制する効果を発揮する。このため、当該本発明の添加剤は、食品または飼料に混在している可能性のあるマイコトキシンについて、専ら食品または飼料とともに用いられて、マイコトキシンの体内吸収および蓄積を抑制する目的で使用される。
【００１８】
なお、ここで「食品または飼料とともに」とは、添加剤を食品または飼料に混合した状態で用いる場合のみならず、食品または飼料と組み合わせて同時に摂取する場合；添加剤を摂取した後、速やかに食品または飼料を摂取する場合；食品または飼料を摂取した後、速やかに添加剤を摂取する場合のいずれの態様をも包含する意味で用いられる。
【００１９】
本発明で用いられるＬＭペクチンは、植物の果皮などを酸性溶液で抽出して得られるα−１，４グリコシド結合したＤ−ガラクツロン酸もしくはＤ−カラクツロン酸のカルボキシル基がメチルエステル化されたＤ−カラクツロン酸メチルエステルからなる主鎖と、主にアラビノースやグルコース等の中性糖からなる側鎖によって構成される多糖類である。ペクチンの由来としてはレモンやライムが最も適しているが、オレンジ、グレープフルーツやリンゴなどでも良い。
【００２０】
ペクチンはＤ−ガラクツロン酸のフリーのカルボキシル基が２価のカチオン、特にカルシウムイオンと結合することによりゲルを形成ことが知られている。ペクチンは原料からの粗抽出段階ではエステル化度５０％以上の高メトキシル状態である。この状態ではフリーのカルボキシル基が少なすぎるためゲル化反応がすすみ難いため、メトキシル化度を低減させたＬＭペクチンが広く流通している。本発明においてはペクチンをカルシウムイオンでゲル化させることが必要であるため、低メトキシル化され、メトキシル化度が５０％以下になっていることが必要である。好ましくはメトキシル化度１０％以上、４０％以下のペクチンである。
【００２１】
メトキシル化度を低減させるためには一般的に酸、酵素処理やアンモニア処理を行うが、アンモニア処理の際にペクチンはアミド化される。本発明では、アミド化されていない非アミド化ペクチンおよびアミド化されたアミド化ペクチンのいずれをも使用することができる。後述する実験例で示すように、マイコトキシンの取り込み率が大きいことからアミド化ペクチンが好適に使用される。
【００２２】
これらのＬＭペクチンは食品添加物として広く流通しており、誰でも商業的に容易に入手することができる。商業的に入手可能な製品としては、例えば非アミド化ペクチンとしてはビストップ［商標］Ｄ−２２６２、アミド化ペクチンとしてはビストップ［商標］Ｄ−２２６４（いずれも、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）を挙げることができる。その形態は、顆粒状、粒状、または粉末状（スプレードライ粉末品を含む）の形態の別を問わず、いずれの形態も使用することができる。
【００２３】
本発明に用いられるカルシウム塩としては、カルシウムの塩化物、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、有機酸塩などを挙げることができる。ここで有機酸としては、乳酸、クエン酸、ピルビン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、マレイン酸等を挙げることができる。好ましくは炭酸塩や乳酸塩である。なお、ここで、中性条件下で水に溶解しやすいカルシウム塩としてはカルシウムの塩化物および水酸化物を、中性条件下で水に難溶であるものの酸性条件下で易溶性を示すカルシウム塩としてはカルシウムの炭酸塩、炭酸水素塩、または乳酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。好ましくは炭酸塩である。
【００２４】
これらのカルシウム塩は形態の別を問わず、いずれの形態も使用することができるが、水への溶解性を考慮すれば、粉末または顆粒状の形態を有することが好ましい。かかるカルシウム塩もまた商業的に容易に入手することができる。
【００２５】
本発明の添加剤は、ＬＭペクチンとカルシウム塩を混合することによって製造することができる。好ましくは、ＬＭペクチンとカルシウム塩とが互いに固体状態で共存するように混合することによって製造する。水への溶解性を考慮すれば、ＬＭペクチンとカルシウム塩とをそれぞれ顆粒または粉末の状態で混合することが好ましい。また、混合したＬＭペクチンとカルシウム塩を、流動層造粒機を用いて造粒することにより、顆粒形態の製剤を製造してもよい。さらには、低メトキシルペクチンとカルシウム塩をあらかじめｐＨが５以上の水性溶媒に溶かすことにより調製される液状の製剤としても使用することができる。
【００２６】
本発明の添加剤中に配合するＬＭペクチンの割合としては、通常２０〜９９質量％を挙げることができる。好ましくは３０〜９５質量％、より好ましくは５０〜９７質量％である。また、本発明の添加剤中のカルシウム塩の割合は、通常０．１〜５質量％を挙げることができ、好ましくは０．２〜３質量％、より好ましくは０．５〜３質量％である。なお、本発明の添加剤中のＬＭペクチン１００質量部に対するカルシウム塩の割合としては、ゲルを形成する範囲であれば特に制限されないが、通常０．２質量部以上、好ましくは０．５〜５質量部、より好ましくは１〜３質量部である。
【００２７】
なお、本発明の添加剤は、上記するようにＬＭペクチンとカルシウム塩からなるものであってもよいし、また本発明の効果を妨げない限り、他の成分を含有することもできる。かかる他の成分としては、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、ラクトースなどといった、単糖類や二糖類、オリゴ糖やデキストリンなどの比較的低分子の多糖類などを挙げることができる。
【００２８】
本発明の添加剤は、前述するように、マイコトキシンが混在しているおそれのある食品または飼料とともに用いられる。好ましくは本発明の添加剤が対象の食品または飼料と一緒に経口投与されるように、当該食品または飼料に配合した状態で使用される。
【００２９】
斯くして本発明の添加剤は、食品または飼料とともに経口摂取されることによって、胃内でＬＭペクチンとカルシウムイオンとが反応してゲル化し、当該ゲル内に食品または飼料中に混在するマイコトキシンを閉じ込める。その結果、マイコトキシンの体内への吸収や蓄積を抑制することができる。
【００３０】
この場合、食品または飼料に対して使用される本発明の添加剤の割合は、添加剤を添加した最終食品または飼料１００質量％中に、ＬＭペクチンが０．５質量％以上、好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上の割合で含まれるように設定することが好ましい。なお、上限は特に制限はされないが、通常１０質量％程度である。
【００３１】
このようにＬＭペクチンは、ｐＨ４以下の低ｐＨにおいて水存在下でカルシウムイオンと反応することによりゲル化する。このため、食品または飼料の形状に応じて、本発明の添加剤の調製に使用するカルシウム塩を選択することが好ましい。
【００３２】
食品または飼料が固体形状を有するものである場合は、中性条件での水易溶性および水難溶性の別を問わず、いずれのカルシウム塩をも使用することができる。この場合、本発明の添加剤を配合した食品または飼料（固体形状）は、経口摂取後、胃内の水存在下でＬＭペクチンとカルシウムイオンとが反応することによりゲル化し、その結果、当該ゲル内に食品または飼料中に混在するマイコトキシンが閉じ込められることになる。
【００３３】
食品または飼料がゲル形状を有するものである場合も、中性条件での水易溶性および水難溶性の別を問わず、いずれのカルシウム塩をも使用することができる。好ましくは食品または飼料のｐＨ条件下で水溶性を示すカルシウム塩である。この場合、本発明の添加剤を配合した食品または飼料（ゲル形状）は、すでにその状態でゲル内に食品または飼料中に混在するマイコトキシンが閉じ込められているため、経口摂取後、マイコトキシンの体内吸収や蓄積が抑制されることになる。
【００３４】
食品または飼料が中性またはアルカリ性で水溶液の形状を有するものである場合は、中性またはアルカリ性条件では水難溶性で、酸性条件で水易溶性を示すカルシウム塩を使用することが好ましい。この場合、本発明の添加剤を配合した食品または飼料（水溶液）は、経口摂取後、胃内の酸性の胃液存在下でＬＭペクチンとカルシウムイオンとが反応することによりゲル化し、その結果、当該ゲル内に食品または飼料中に混在するマイコトキシンが閉じ込められることになる。
【００３５】
また、当該添加剤を用いて食品や飼料を製造すると、それらの食品や飼料を摂取した場合におけるマイコトキシンによる汚染を被るリスクを減じることができる。当該添加剤は、ゲル状食品または飼料の製造に適しており、食品を例にとると、具体的にはカスタードプリン、ミルクプリンなどのプリン類、ゼリー、ババロア、グミ食感キャンディー及びヨーグルトなどのデザート類などを例示できる。
【００３６】
また飼料用添加剤としては、例えば顆粒状や粉末状などの固形形態を有していることが好ましく、これらの添加剤は、通常、固形形態の飼料に配合されて、飼料と一緒に、または飼料として、ヒト以外の動物に摂取される。ここでヒト以外の動物としては、草食動物を挙げることができ、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギおよびブタ等の家畜；ゾウ、サイ、シカ、キリン、カバ、ラクダ、シカ、ウサギ等の飼育動物；ニワトリ、アヒル、ウズラなどの家禽を例示することができる。
【００３７】
当該飼料用添加剤は、飼料と一緒に、または飼料として、上記動物に経口摂取されると、動物の胃内でＬＭペクチンとカルシウムイオンとが反応してゲル化し、飼料中に混在するマイコトキシンを内部に取り込み、封じ込める。斯くして、マイコトキシンの動物体内への吸収及び蓄積が抑制され、マイコトキシン暴露による悪影響を低減することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の内容を以下の実施例及び比較例、並びに実験例を用いて具体的に説明する。但し、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００３９】
実施例１〜３および比較例１
アミド化ペクチンであるビストップ［商標］Ｄ−２２６４（メトキシル化度：３５％、三栄源エフ・エフ・アイ(株)製）と乳酸カルシウム（シグマ社製）を表１に示す配合量で粉体混合し、粉末状の製剤を調製した。また、ビストップ［商標］Ｄ−２２６４単体（乳化カルシウムなし）を比較例１の製剤とした。
【００４０】
【表１】
【００４１】
実施例４〜６および比較例２
非アミド化ペクチンであるビストップ［商標］Ｄ−２２６２（メトキシル化度：３５％、三栄源エフ・エフ・アイ(株)製）と炭酸カルシウム（シグマ社製）を表２に示す配合量で粉体混合し、粉末状の製剤を調製した。また、ビストップ［商標］Ｄ−２２６２単体（乳化カルシウムなし）を比較例２の製剤とした。
【００４２】
【表２】
【００４３】
実験例１ ＤＯＮの外液への溶出抑制効果
マイコトキシンとしてデオキシニバレノール（DON）を用いて、本発明の添加剤のマイコトキシン取り込み効果（外液への溶出抑制効果）を評価した。
【００４４】
（１）実験方法
実施例１〜６、並びに比較例１及び２で調製した各粉末製剤を、表３に示す濃度（重量％）になるように超純水に溶解し、その１００ｍｌを５μｇ／ｍｌのＤＯＮを含む超純水１５ｍｌと混合した（実験試料1-1〜1-8）。このとき、全ての液状試料は若干の粘性をもった溶液状であった。
【００４５】
また、ブランク試料として、超純水１００ｍｌに５μｇ／ｍｌのＤＯＮを含む超純水１５ｍｌを混合した試料を調製した。この溶液はほとんど粘りをもたない溶液となった。
【００４６】
これらにそれぞれ１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３）を３５ｍｌ加えて攪拌し、次いでこれに１５００ｍｌの水を加えて、ゆるやかに攪拌しながら３７℃で一昼夜放置した。実験試料１−１〜１−６は、クエン酸添加直後から徐々に固形化し、３７℃で一昼夜放置にはゆるやかなゲル状になった。一方、実験試料１−７、１−８およびブランク試料はゲル化しなかった。
【００４７】
次いで、水相に遊離しているＤＯＮを、下記に説明する免疫酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて定量し、得られたＤＯＮ量から下式に基づいて遊離ＤＯＮ分率（％）を算出した。
【００４８】
【数１】
【００４９】
＜免疫酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞
ＤＯＮ／ＮＩＶ（デオキシニバレノール／ニバレノール）抗体（National Center for Agricultural Utilization Research, USAのMaragos博士より譲り受けた）を０．２Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(和光純薬(株)製)を用いて２０００倍希釈し抗体を調整した。
【００５０】
この抗体を９６ウェルのプラスティックプレートの各ウェルに １００μｌずつ分注し、４℃で１８時間静置した。静置後のプレートを洗浄液（０．２Ｍ ＰＢＳ溶液１００ｍｌに対して超純水９００ｍｌとＴｗｅｅｎ２０ ０．５ｍｌ(和光純薬(株)製)を加えて１Ｌとしたもの）で４回洗浄した。これに１％ポリビニルアルコール溶液（東京化成社製）を２５０μｌずつ分注し、３０分静置した。これを洗浄液でさらに４回洗浄してＤＯＮ／ＮＩＶ抗体をプレートにコーティングした。
【００５１】
１％の牛胎児血清（ＢＳＡ）を含むＰＢＳを用いて１００００倍に希釈したＤＯＮホースラディッシュペルオキシダーゼ（以後ＤＯＮ−ＨＲＰとする）（和光純薬(株)製）７５μｌと各実験試料７５μｌを混合し、この混合溶液を１００μｌずつ上記で調製したＤＯＮ／ＮＩＶ抗体コーティングプレートに分注した。これにペルオキシダーゼ発色基質（ＴＭＢ基質）（ＢＤバイオサイエンス社）を１００μｌずつ分注し、暗所にて１５分間静置した後、２Ｎの硫酸を１００ｍｌずつ分注し、この溶液の４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５２】
実験試料中のＤＯＮの量は、標準検量線から算出した。当該標準検量線は、実験試料の代わりに、１ｐｐｍのＤＯＮ標準品（和光純薬(株)製）をＰＢＳを用いて２５０ｐｐｂ、６２．５ｐｐｂ、１５．６ｐｐｂ、および３．９ｐｐｂの４段階に希釈したものを、上記と同様の方法で発色させることによって作成した。
【００５３】
（２）実験結果
結果を表３に合わせて示す。
【００５４】
【表３】
【００５５】
低メトキシルペクチン粉末を単独で用いた実験試料１−７および１−８は、いずれも遊離ＤＯＮ分率が１００％であり、これから、添加したＤＯＮは当該試料（実験試料１−７および１−８）に取り込まれず、そのまま外部に遊離していることがわかる。これに対して、低メトキシルペクチンとカルシウムを含む実施例１〜６の製剤を用いて調製した実験試料１−１〜１−６では、添加したＤＯＮはこれらの試料から形成されたゲル内に取り込まれ、ＤＯＮが外液に流出することが抑制されていることが確認された。特に低メトキシルペクチンとしてアミド化された製剤（実施例１〜３）を用いた実験試料１−１〜１−３において顕著な効果が得られた。低メトキシルペクチンとして非アミド化ペクチンの製剤（実施例４〜６）を用いて調製した実験試料１−４〜１−６は、製剤含有量が多い実験試料１−６では、上記アミド化ペクチンを含む製剤と同様の抑制効果が得られたが、実験試料１−５や１−４のように製剤含有量が少なくなると抑制効果の低下が認められた。これらのことから、低メトキシルペクチンとして非アミド化物よりもアミド化された低メトキシルペクチンを用いるほうが、優れたＤＯＮの取り込み効果が得られることが判明した。
【００５６】
実験例２ フモニシンＢ１およびパツリンの外液への溶出抑制効果
マイコトキシンとしてフモニシンＢ１とパツリンを用いて、本発明の添加剤のマイコトキシン取り込み効果（外液への溶出抑制効果）を評価した。
【００５７】
（１）実験方法
実施例１〜３および比較例１の粉末製剤を表４に示す濃度（質量％）になるように超純水に溶解し、その１００ｍｌを５μｇ／ｍｌのフモニシンＢ１及びパツリンを含む超純水１５ｍｌと混合した（実験試料2-1〜2-4）。このとき、全ての液状試料は若干の粘性をもった溶液状であった。また、ブランク試料として、超純水１００ｍｌに５μｇ／ｍｌのフモニシンＢ１及びパツリンを含む超純水１５ｍｌと混合した試料を調製した。この溶液はほとんど粘りを持たない溶液となった。
【００５８】
これらにそれぞれ１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３）３５ｍｌを加えて緩やかに混合した。これに１５００ｍｌの水を加えて、ゆるやかに攪拌しながら３７℃で２４時間放置した。実験試料２−１〜２−４は、クエン酸緩衝液添加直後から徐々に固定化し、３７℃で２４時間放置した後にはゆるやかなゲル状になった。一方、ブランク試料はゲル化しなかった。
【００５９】
次いで、水相に遊離するフモニシンＢ１とパツリンの量（マイコトシキン量）を、下記条件のＬＣ／ＭＳ／ＭＳで定量した。斯くして得られたマイコトキシン量から下式に基づいて算出した値を、遊離マイコトシキン分率（％）とした。
【００６０】
【数２】
【００６１】
＜ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法＞
フモニシンＢ１およびパツリンの定量は、１１００シリーズＨＰＬＣシステム（アジレント社製）およびＱｕａｔｔｒｏ Ｕｌｔｉｍａ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を用い、下記の条件で行った。
【００６２】
(1)フモニシンＢ１
カラム : Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｘｔｅｎｄ Ｃ１８
(５ｍｍ, １５０ × ２．１ｍｍ)（アジレント社製）
移動相：０．１％ギ酸 （ｉｎ 1．０ｍＭ 酢酸アンモニウム）＋アセトニトリル
ただし、アセトニトリルは５分間で２０％→９０％までグラジェント後５分間保持
カラム温度 : ４０℃
注入量:１０ｍｌ
流速:２００ｍｌ／ｍｉｎ
ＭＳ／ＭＳ条件 : ＥＳＩ ポジティブモード
722 > 352 (定量イオン)
722 > 334 (定性イオン)。
【００６３】
（2）パツリン
カラム : Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８
(３．５ｍｍ, １００×２．１ｍｍ ｉｄ)（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：２ｍＭ酢酸アンモニウム溶液＋アセトニトリル
ただし、アセトニトリルは１４分間で３％→９５％までグラジェント
カラム温度 : ４０℃
注入量:１０ｍｌ
流速:２００ｍｌ／ｍｉｎ
ＭＳ／ＭＳ条件 : ＥＳＩ ネガティブモード
153 > 109 (定量イオン)
153 > 81 (定性イオン)。
【００６４】
（２）実験結果
結果を表４に合わせて示す。
【００６５】
【表４】
【００６６】
実施例１〜３の製剤を用いた実験試料２−１〜２−３においても、ＤＯＮの場合と同様に３７℃で２４時間放置した後の遊離マイコトキシン分率が有意に抑えられており、フモニシンＢ１やパツリンのマイコトキシンが本発明の製剤から形成されたゲル内に取り込まれ、外部への流出が抑制されていることが確認された。
【００６７】
以上の実験例１および２から、低メトキシペクチンとカルシウム塩を含む本発明の製剤から形成されるゲルには、マイコトキシンを取り込み、外部への流出を抑制する作用があることが確認された。
【００６８】
実験例３ ＤＯＮの血中濃度の変化
実験例１と２の結果から、低メトキシペクチンとカルシウム塩を含む製剤から形成されるゲルは、マイコトキシンを取り込んで内部に閉じ込めることが判明した。そこで、ここでは当該ゲル内に封じ込められたマイコトキシンの体内挙動を調べた。
【００６９】
（１）実験方法
１．５ｍｌ容のマイクロチューブに１０００μｇ相当のデオキシニバレノール（DON）を分取し乾固した。実施例２および比較例１の粉末製剤０．０１ｇを１ｍｌの超純水に溶解し、これを上記のマイクロチューブに添加した。これをＢ６Ｃ３Ｆ１マウス（ミシガン州立大学のPestka博士から譲り受けた）（各試験区毎に４検体）に２５μｌずつ経口投与した。
【００７０】
投与後１５分から２４時間まで経時的に血液を採取し、血清中のＤＯＮの濃度を測定した。また、投与２４時間後にマウスから肝臓を取り出し、肝臓中のＤＯＮ濃度を測定した。
【００７１】
＜血清中のＤＯＮの定量方法＞
採取した血液をエッペンドルフチューブに分注し、１４０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに分注する。得られた血清６０μｌに０．２ＭのＰＢＳを２４０μｌ加え、これを実験例１で説明した免疫酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）に供して、血清中のＤＯＮ濃度を定量する。
【００７２】
＜肝臓中のＤＯＮの定量方法＞
取り出した肝臓をミキサーでホモジナイズした後、０．２ＭのＰＢＳで１０倍に希釈し、１００℃で５分間煮沸した後、遠心分離によって固形分を沈殿させ、上清を分取する。これを実験例１で説明した免疫酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）に供して、肝臓中のＤＯＮ濃度を定量する。
【００７３】
（２）実験結果
実施例２の製剤を経口投与したときの血清中のＤＯＮ濃度の経時変化を図１に、比較例１の製剤を経口投与したときの血清中のＤＯＮ濃度の経時変化を図２に示す。また、投与２４時間後の肝臓中のＤＯＮ濃度を表５に示す。
【００７４】
【表５】
【００７５】
ＤＯＮは、経口投与直後、胃から比較的短い時間で吸収されることが知られている。比較例１の製剤を経口投与したマウスの血清中のＤＯＮ濃度は、投与後１５分間で最大（約２２００ｐｐｂ）となり、その後時間をかけて徐々に低下していくことが確認された（図２）。一方、実施例２の製剤を経口投与したマウスの血清中のＤＯＮ濃度は、経口投与１５分後に約５００ｐｐｂまでしか上昇せず（比較例１の場合の1/4以下）、その後すぐに低下した（図１）。また経口投与２４時間後の肝臓中のＤＯＮ濃度は、実施例２の製剤を経口投与したマウスの肝臓内ＤＯＮ濃度は比較例１の製剤を経口投与したマウスのそれに比べて低く、低メトキシペクチンとカルシウム塩を含む本発明の製剤には、当該製剤から形成されたゲル内にマイコトキシンを取り込んで外部に放出することを抑制することで、マイコトキシンの体内への吸収及び蓄積を抑制する効果があることが確認された。この意味で、低メトキシペクチンとカルシウム塩を含む本発明の製剤には、マイコトキシンの毒性の発現を減少する作用があるといえる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低メトキシルペクチンおよびカルシウム塩を含有することを特徴とする、マイコトキシンの体内吸収を抑制するための食品用もしくは飼料用添加剤。
【請求項２】
低メトキシルペクチン１００質量部に対してカルシウム塩を０．２質量部以上の割合で含有する請求項１に記載する食品用もしくは飼料用添加剤。
【請求項３】
低メトキシルペクチンがアミド化ペクチンである請求項１または２に記載する食品用もしくは飼料用添加剤。
【請求項４】
上記マイコトキシンがデオキシニバレノール、フモニシン、およびパツリンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１乃至３のいずれかに記載の食品用もしくは飼料用添加剤。
【請求項５】
マイコトキシンの体内吸収を抑制することを目的として請求項１乃至４のいずれかに記載する飼料用添加剤を含む飼料。
【請求項６】
ヒト以外の動物に、請求項１乃至４のいずれかに記載する飼料用添加剤または請求項５に記載する飼料を経口投与することを特徴とする、体内でのマイコトキシンの吸収を抑制する方法。
【請求項１】
低メトキシルペクチンおよびカルシウム塩を含有することを特徴とする、マイコトキシンの体内吸収を抑制するための食品用もしくは飼料用添加剤。
【請求項２】
低メトキシルペクチン１００質量部に対してカルシウム塩を０．２質量部以上の割合で含有する請求項１に記載する食品用もしくは飼料用添加剤。
【請求項３】
低メトキシルペクチンがアミド化ペクチンである請求項１または２に記載する食品用もしくは飼料用添加剤。
【請求項４】
上記マイコトキシンがデオキシニバレノール、フモニシン、およびパツリンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１乃至３のいずれかに記載の食品用もしくは飼料用添加剤。
【請求項５】
マイコトキシンの体内吸収を抑制することを目的として請求項１乃至４のいずれかに記載する飼料用添加剤を含む飼料。
【請求項６】
ヒト以外の動物に、請求項１乃至４のいずれかに記載する飼料用添加剤または請求項５に記載する飼料を経口投与することを特徴とする、体内でのマイコトキシンの吸収を抑制する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−５５７４７（Ｐ２０１１−５５７４７Ａ）
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０７４８８（Ｐ２００９−２０７４８８）
【出願日】平成２１年９月８日（２００９．９．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ▲１▼掲載年月日 平成２１年８月３日（Ｔｉｔｌｅ ｏｆ Ｐｏｓｔｅｒ ０７１） 平成２１年９月３日（Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｆ Ｐｏｓｔｅｒ ０７１） 掲載アドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｓｍ２００９．ａｔ／ＩＳＭ２００９＿ｐｏｓｔｅｒｓ．ｐｄｆ
【出願人】（５９７１２８００４）国立医薬品食品衛生研究所長 (22)
【出願人】（０００１７５２８３）三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 (429)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月８日（２００９．９．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ▲１▼掲載年月日 平成２１年８月３日（Ｔｉｔｌｅ ｏｆ Ｐｏｓｔｅｒ ０７１） 平成２１年９月３日（Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｆ Ｐｏｓｔｅｒ ０７１） 掲載アドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｓｍ２００９．ａｔ／ＩＳＭ２００９＿ｐｏｓｔｅｒｓ．ｐｄｆ
【出願人】（５９７１２８００４）国立医薬品食品衛生研究所長 (22)
【出願人】（０００１７５２８３）三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 (429)
【Ｆターム（参考）】
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