説明

マトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤、並びにその産生抑制剤を配合した炎症後色素沈着の予防・改善剤、化粧料

【課題】炎症後色素沈着の優れた予防・改善作用を有する炎症後色素沈着の予防・改善剤、及びそのような予防・改善剤を配合した化粧料、医薬部外品、医薬品を提供することを課題とする。
【解決手段】アルギン酸オリゴ糖、アルギン酸オリゴ糖の塩、アルギン酸オリゴ糖と金属イオンとの錯体、又はアルギン酸オリゴ糖の塩と金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、又は柑橘類抽出物の少なくともいずれかを含有することを特徴とする。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤、並びにその産生抑制剤を配合した炎症後色素沈着の予防・改善剤、及び化粧料に関する。
【背景技術】
【0002】
アトピー性皮膚炎、傷、ニキビ等の炎症後において、患部及びその周囲に色素沈着を生ずることがあり、一般に、炎症後色素沈着と称されている。これらの色素沈着は、通常2〜3ヶ月で消退することが多いが、半年以上経過しても消失しないこともあり、特に女性にとっては美容上の悩みとなっている。従って、炎症後色素沈着を起こした皮膚を正常皮膚色に回復させることが要望されている。
【0003】
炎症後色素沈着の発生機構は未だ明確にされていないが、病理学的研究から、表皮中のメラニン量が増加していること、時にはメラニンが真皮へ滴落していることが確認されている。一方、炎症が起こっている皮膚では様々なサイトカイン、ケミカルメディエーター等の炎症性の生理活性因子が発生しており、それらが色素沈着発生の原因となっていると推察されている。
【0004】
たとえば、炎症が起きるとヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン等の炎症性メディエーターが各種の細胞から放出され、またIL−1α(Interleukin−1α)、IL−6(Interleukin−6)、TNF−α(Tumor Necrosis Factor−α)などの炎症性サイトカインが各種の細胞から放出されていることが知られている。表皮中のメラニン量の増加はメラノサイトの増殖あるいはメラニン合成能の亢進が原因であると考えられ、そのメカニズムとしては、次の二つが考えられる。
【0005】
一つは、炎症性因子がメラノサイトに直接的に作用し、メラノサイトを活性化させる機構であり、他の一つは、炎症性因子がまずケラチノサイトに作用し、そのケラチノサイトが産生するメラノサイト活性化因子がメラノサイトを活性化させる機構である。メラニンの真皮への滴落にはマトリックスメタロプロテアーゼ(以下、MMPともいう)が関与していると思われる。MMP−2やMMP−9等のMMPがケラチノサイトやメラノサイトでも産生されていることが知られており、炎症性因子によってそれらの産生が亢進されることが、メラニンの真皮への滴落の原因となっていることが考えられる。
【0006】
このような観点から、MMPの活性を阻害する阻害剤に関する下記特許文献1乃至4のような特許出願もなされている。特許文献1は、カテキン類、プロシアニジン類、マンゴスチン類等からなるMMP阻害剤を対象とするものであり、特許文献2は、マツ科マツ属植物の樹皮抽出物を有効成分とするMMP阻害剤を対象とするものである。しかし特許文献1は皮膚の老化の予防や改善を意図したものであり、また特許文献2は皮膚弾力性を維持する化粧料への適用を意図したものであり、いずれも炎症後色素沈着を予防・改善することまで意図したものではない。
【0007】
また特許文献3は、パルミチン酸、ステアリン酸等の脂肪酸を含有したMMP阻害剤を対象とするものであり、特許文献4は、クロレラの細胞壁破砕物を含有したMMP阻害剤を対象とするものである。しかし特許文献3や特許文献4は、ガンその他の疾患の適用について開示するものの、その効果は必ずしも試験によって裏付けられたものではなく、特に皮膚科領域の疾患については言及されておらず、炎症後色素沈着についてももちろん開示、示唆されていない。
【0008】
【特許文献1】特開2003−252745号公報
【特許文献2】特開2003−277223号公報
【特許文献3】特開2003−277259号公報
【特許文献4】特開2005−89304号公報
【0009】
このように、従来ではMMP阻害剤についての出願はなされているものの、炎症後色素沈着を十分に予防・改善できる製品は未だに開発されていないのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、このような点に鑑みてなされたもので、炎症後色素沈着の優れた予防・改善作用を有する炎症後色素沈着の予防・改善剤、及びそのような予防・改善剤を配合した化粧料、医薬部外品、医薬品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、このような課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、炎症後色素沈着の発生には種々の炎症性因子の中でヒスタミンとTNF−αが重要な役割を担っていること、また、それらは、メラノサイトへ直接作用するのではなく、ケラチノサイトを介してメラノサイトの活性化因子であるエンドセリン−1(以下、ET−1ともいう)と基底膜分解酵素であるMMP−9を多量に分泌させてメラニン量を増加させ、或いはメラニンを真皮へ滴落させることを見出した。
【0012】
そして、アルギン酸オリゴ糖若しくはその塩、アルギン酸オリゴ糖若しくはその塩と金属塩との混合物、より詳しくは金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、柑橘類抽出物が、ケラチノサイトからのET−1及びMMP−9の産生を抑制することにより、炎症後色素沈着の予防・改善効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0013】
すなわち、マトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤に係る請求項1記載の発明は、アルギン酸オリゴ糖、アルギン酸オリゴ糖の塩、アルギン酸オリゴ糖と金属イオンとの錯体、又はアルギン酸オリゴ糖の塩と金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、又は柑橘類抽出物の少なくともいずれかを含有することを特徴とする。
【0014】
また請求項2記載の発明は、請求項1記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤において、アルギン酸オリゴ糖又はその塩の重合度が2〜20であることを特徴とする。さらに請求項3記載の発明は、請求項1記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤において、アルギン酸オリゴ糖又はその塩の重合度が7〜12であることを特徴とする。
【0015】
さらに請求項4記載の発明は、請求項1乃至3記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤において、アルギン酸オリゴ糖の塩が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、又はアルギン酸カルシウムであることを特徴とする。さらに請求項5記載の発明は、請求項1乃至4のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤において、アルギン酸オリゴ糖若しくはその塩と錯体を形成する金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、又はマンガンイオンであることを特徴とする。
【0016】
さらに炎症後色素沈着の予防・改善剤に係る請求項6記載の発明は、請求項1乃至5のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤を配合したことを特徴とする。さらに化粧料に係る請求項7記載の発明は、請求項1乃至5のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤を配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【0017】
本発明によって、優れた炎症後色素沈着の予防・改善効果を有する予防・改善剤や、そのような予防・改善剤を配合した化粧料、医薬部外品、医薬品を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【0018】
本発明のMMP−9及びET−1の産生抑制剤は、上述のようにアルギン酸オリゴ糖、アルギン酸オリゴ糖の塩、アルギン酸オリゴ糖と金属イオンとの錯体、アルギン酸オリゴ糖の塩と金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、又は柑橘類抽出物の少なくともいずれかを含有するものである。
【0019】
ここで「含有する」とは、本発明のMMP−9及びET−1の産生抑制剤が、アルギン酸オリゴ糖、アルギン酸オリゴ糖の塩、アルギン酸オリゴ糖と金属イオンとの錯体、アルギン酸オリゴ糖の塩と金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、又は柑橘類抽出物の少なくともいずれかのみからなる場合の他、これら以外の成分がMMP−9及びET−1の産生抑制剤に含有されていてもよいことを意味する。
【0020】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩は、アルギン酸又はその塩にアルギン酸又はその塩の分解酵素、すなわちアルギン酸リアーゼを作用させて得ることができる。アルギン酸とはD−マンニュロン酸とL−グルクロン酸を構成糖とする多糖類である。
【0021】
また、アルギン酸オリゴ糖の塩としては、たとえばアルギン酸オリゴ糖の、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、アミン塩等又はその混合物が例示される。アルギン酸オリゴ糖又はその塩と混合する金属塩としては、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸マグネシウム等の水溶性の塩が例示できる。アルギン酸オリゴ糖又はその塩は、たとえば粉末状のものを水等に溶解し、上記のような金属塩の水溶液と混合される。混合後には、金属塩の金属イオンがアルギン酸オリゴ糖又はその塩と錯体を形成することとなる。
【0022】
さらにアルギン酸オリゴ糖の重合度は2〜20であることが好ましい。重合度が21以上になると分子量が増えるので、アルギン酸オリゴ糖が表皮の最外層を通過できないおそれがあり、従って皮膚浸透性が低下するおそれがあるからである。また多糖であるアルギン酸自体は活性を持たない。すなわちMMP−9及びET−1の産生抑制効果を有しない。
一方、アルギン酸はグルクロン酸とマンヌロン酸との2種類の単糖で構成されており、従ってアルギン酸オリゴ糖には、グルクロン酸とマンヌロン酸で構成されているもの、グルクロン酸のみからなるもの、マンヌロン酸のみからなるものの3種類が存在することとなる。しかしながら、単糖であるグルクロン酸やマンヌロン酸自体、或いはグルクロン酸の塩やマンヌロン酸の塩自体には本発明のMMP−9及びET−1の産生抑制効果は認められない。従ってオリゴ糖であること、すなわち重合度が2以上であることは必要となる。
尚、活性を高める観点、すなわちMMP−9及びET−1の産生抑制効果を高める観点からは、アルギン酸オリゴ糖の重合度は、7〜12であることがより好ましい。
【0023】
本発明のアルギン酸オリゴ糖又はその塩は、多糖であるアルギン酸又はその塩を原料として、アルギン酸リアーゼを反応させることによって得ることができる。アルギン酸リアーゼを生産するものとしては、種々のウィルス、細菌、藻類、及び海洋動物が知られており、これらから通常の精製手法によって分離精製されたアルギン酸リアーゼや、あるいは市販されているアルギン酸リアーゼをアルギン酸オリゴ糖又はその塩の調製に用いることができる。尚、このように調製する場合、アルギン酸又はその塩とアルギン酸リアーゼとの反応温度は45〜55℃、反応時のpHが6.5〜7.5の条件が好ましく、48〜52℃、pH6.8〜7.2の条件で行うのが特に好ましい。
また、上記のようにアルギン酸又はその塩にアルギン酸リアーゼを反応させることによって調製されたものに限らず、アルギン酸オリゴ糖又はその塩として市販されているものを用いることも可能である。
【0024】
さらに、このようにして得られたアルギン酸オリゴ糖又はその塩を金属塩と混合することにより、アルギン酸オリゴ糖又はその塩と金属塩の混合物とする。用いられる金属塩は、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン等の水溶性の塩が例示できる。アルギン酸オリゴ糖又はその塩と金属塩の比は、不溶性錯体を形成することのない値とする。すなわち、金属塩の濃度はアルギン酸オリゴ糖又はその塩の含有濃度の25重量%以下であることが好ましい。尚、この場合においても、アルギン酸オリゴ糖又はその塩と金属塩との混合物として市販されているものを用いることも可能である。
【0025】
以上のようにして得られるアルギン酸オリゴ糖、若しくはその塩、又はアルギン酸オリゴ糖若しくはその塩と金属塩の混合物の活性成分は、そのまま本発明の炎症後色素沈着予防・改善剤の有効成分として用いることができ、さらに通常用いられる方法による除蛋白及び脱塩後、凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥等の方法で乾燥して使用することもできる。本発明で用いられる混合物は、上記のようにして得られたアルギン酸オリゴ糖又はその塩と金属塩の水溶液、その濃縮液、あるいはその乾燥末等のものである。
【0026】
本発明で用いられるローズマリー(Rosmarinus officinalis L.)はシソ科に属し、地中海諸国に自生する植物である。ダイズ(Glycine max)は豆科に属し、世界各地で農作物として広く栽培されている一年生の植物である。緑藻類は緑色植物門(Chlorophyta)緑藻綱(Chlorophyceae)に属する藻類であるが、中でもヘマトコッカス属に属する緑藻類を用いるのが好ましい。具体的にはヘマトコッカス・プルビアリス(Haematococcus pluvialis)、ヘマトコッカス・ラキュストリス(Haematococcus lacustris)、ヘマトコッカス・カペンシス (Haematococcus capensis) 、ヘマトコッカス・ドロエバケンシス (Haematococcus droebakensis) 、ヘマトコッカス・ジンバビエンシス (Haematococcus zimbabwiensis)などが挙げられる。柑橘類とはミカン科に属する植物の総称である。ダイダイ、ウンシュウミカン、グレープフルーツ、レモン等が柑橘類に該当し、ダイダイ(Sitrus Aurantium)は別名トウヒ、ビターオレンジ、オレンジビターなどとも称されることがある。ウンシュウミカン(Citrus unshiu Markovich 又は Citrus reticulata Blanco)の果皮はチンピと称される。
【0027】
本発明で用いられる植物の使用部位は葉、茎、根、果実、果皮など特に限定されるものではないが、ローズマリーにおいては葉が、ダイズにおいては種子が、柑橘類においては果皮が、特に好ましい。また、緑藻類の使用部位はその形態の特性上、全体とすることができる。
【0028】
本発明で用いられる抽出物(以下、各抽出物ということがある)は、ローズマリー、ダイズ、緑藻類、柑橘類の粉砕物を、常温または加温下に溶剤により抽出するか、またはソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる各種溶媒抽出液、その濃縮液、あるいはその乾燥末等のものである。抽出に用いる溶媒としては、通常の植物の抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができる。たとえば水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、エチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶媒類等であり、それらは単独あるいは組み合わせて用いることができる。
【0029】
本発明で用いられるダイズ発酵物は、大豆蛋白原料又は大豆蛋白原料抽出物又は大豆蛋白原料副産物にプロテアーゼ活性及びβ-グルコシダーゼ活性を有する酵素剤を作用させた後、水洗し、水不溶部を回収することにより得られる、イソフラボンアグリコン含有組成物である。大豆蛋白原料としては丸大豆、脱皮大豆、脱脂大豆等が、大豆蛋白原料抽出物としては分離大豆蛋白質、濃縮大豆蛋白質、豆乳、大豆イソフラボン配糖体含有抽出物等が、そして大豆蛋白原料副産物としては大豆モラセス、おから等が利用できる。
【0030】
本発明の色素沈着予防・改善剤中のアルギン酸オリゴ糖又はその塩、アルギン酸オリゴ糖又はその塩と金属塩の混合物、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、又は柑橘類抽出物の配合量は、通常乾燥固形分として、0.0001〜50重量%とすることが好ましい。0.0001重量%未満では本発明の効果が充分に得られない可能性があり、一方、50重量%を越えても、その増量に見合った効果の向上は認められないからである。この観点から、0.001〜10重量%が特に好ましい。
【0031】
炎症後色素沈着予防・改善剤の形態の例としては、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、ゲル、化粧水、分散剤、パック、メーキャップ化粧料、頭皮・毛髪用品等の化粧品及び医薬部外品や、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等の医薬品などとすることができ、外用組成物の基剤としては、これら外用剤の形態に応じた基剤、例えば、精製水、低級アルコール、多価アルコール、油脂、界面活性剤、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、防腐剤、香料、薬効成分等を用いることができる。
【0032】
本発明の色素沈着予防・改善剤には、上記各成分に加えて本発明の効果を損なわない範囲内で、通常の医薬品等の皮膚外用剤、医薬部外品や化粧品に用いられる他の成分、たとえば陰イオン界面活性剤(高級脂肪酸アルカリ金属塩、高級脂肪酸アミン塩、アミノ酸系界面活性剤)や非イオン界面活性剤、リン脂質ステロールエステル等の界面活性剤、炭化水素(流動パラフィン、スクワラン、ワセリン等)、油脂(動植物油、トリグリセリド、ワックスエステル、高級アルコール、高級脂肪酸、シリコーン、エステル油、ロウ類等)、潤滑剤(多価アルコール、糖類、アミノ酸、ペプチド類等)、アルコール(エチルアルコール)、皮膜形成剤(ポリビニルアルコール、ペクチン)や水溶性若しくは油溶性高分子、樹脂、紫外線吸収剤、殺菌防腐剤、抗酸化剤、金属封鎖剤、着色剤(天然色素、合成色素)、各種香料の他、各種の植物及び動物抽出物、油溶性若しくは水溶性ビタミン、美白剤としてアスコルビン酸誘導体、アルブチン、エラグ酸、胎盤抽出液、肌荒れ防止剤としてアラントイン、抗炎症剤としてグルチルレチン酸、グリチルリチン酸、アズレン、抗ヒスタミン剤等、抗老化剤としてビタミンAパルミテート等、収歛剤としてパラフェノールスルフォン酸亜鉛や、クエン酸及びその塩等を含めた有機酸類とその塩等、そして紫外線散乱剤として有機或いは無機系粉体等を、必要に応じて適宜配合若しくは併用することができる。
【実施例】
【0033】
以下、本発明の実施例について説明する。
【0034】
(実施例1)
本実施例では、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液を調製した。アルギン酸ナトリウム (10.0kg)を90Lの精製水に溶解後、アルギン酸リアーゼ溶液(50000U)を加え、40℃で6時間撹拌しながら反応させた。反応液を、除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸ナトリウムオリゴ糖末を4.0kg得た。得られたアルギン酸ナトリウムオリゴ糖末を精製水に溶解した後、硫酸亜鉛水溶液を添加することにより、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液を得た。この水溶液は、混合直後は、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖水溶液と硫酸亜鉛水溶液との混合溶液であるが、その後に硫酸イオンがアルギン酸ナトリウムオリゴ糖と錯体を形成する。従って厳密には混合溶液ではないので、以下には単に「アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液」として説明する。
【0035】
(実施例2)
本実施例では、アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液を調製した。アルギン酸(10.0kg)を90Lの精製水に溶解後、アルギン酸リアーゼ溶液(50000U)を加え、40℃で6時間撹拌しながら反応させた。反応液を、除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸オリゴ糖末を2.0kg得た。得られたアルギン酸オリゴ糖末を精製水に溶解した後、硫酸亜鉛水溶液を添加することにより、アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液を得た。この水溶液も、上記実施例1と同様に硫酸イオンがアルギン酸オリゴ糖と錯体を形成し、厳密には混合溶液ではないので、以下には単に「アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液」として説明する。
【0036】
(実施例3)
本実施例では、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液を調製した。アルギン酸ナトリウム (10.0kg)を90Lの精製水に溶解後、アルギン酸リアーゼ溶液(50000U)を加え、40℃で6時間撹拌しながら反応させた。反応液を、除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸ナトリウムオリゴ糖末を4.0kg得た。得られたアルギン酸ナトリウムオリゴ糖末を精製水に溶解してアルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液を得た。
【0037】
(実施例4)
本実施例では、アルギン酸オリゴ糖の水溶液を調製した。アルギン酸 (10.0kg)を90Lの精製水に溶解後、アルギン酸リアーゼ溶液(50000U)を加え、40℃で6時間撹拌しながら反応させた。反応液を、除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸オリゴ糖末を2.0kg得た。得られたアルギン酸オリゴ糖末を精製水に溶解してアルギン酸オリゴ糖の水溶液を得た。
【0038】
(実施例5)
本実施例では、ローズマリー抽出物を調製した。ローズマリー(Rosmarinus officinalis L.)の葉200gを粉砕後、2Lの50%エタノールに浸漬し、60℃〜80℃で3日間抽出し、抽出液から溶媒を除去し、7.5gの抽出物を得た。
【0039】
(実施例6)
本実施例では、ダイズ発酵物を調製した。市販の分離大豆蛋白質200gに6Lの精製水を加えて沸騰水中10分間加熱処理を行い、冷却後45℃に加温しながら、200gのプロテア-ゼ活性及びβ-グルコシダ-ゼ活性を有する酵素剤と500mlのエタノールを添加し、pH5で一晩(16時間)撹拌しながら反応した。この液をpH4に調製し、遠心処理をして不溶物を回収した。もう一度、水洗後、凍結乾燥機にて乾燥し、処理物60gを得た。
【0040】
(実施例7)
本実施例では、緑藻類抽出物を調製した。ヘマトコッカス藻体破砕物200gを2Lの精製水に浸漬し、常温で10日間抽出後、抽出液から溶媒を除去し、3.0gの抽出物を得た。
【0041】
(実施例8)
本実施例では、トウヒ抽出物を調製した。ダイダイ(Citrus aurantium)の皮200gを粉砕後、2Lの50%エタノールに浸漬し、60℃〜80℃で3日間抽出し、抽出液から溶媒を除去し、10gの抽出物を得た。
【0042】
(実施例9)
本実施例では、チンピ抽出物を調製した。ウンシュウミカン(Citrus unshiu Markovich)の皮200gを粉砕後、2Lの50%エタノールに浸漬し、60℃〜80℃で3日間抽出し、抽出液から溶媒を除去し、11gの抽出物を得た。
【0043】
(試験例1)
上記実施例1乃至9のMMP−9及びET−1の産生抑制剤について、ET−1の産生抑制効果について試験した。
正常ヒト表皮角化細胞 (Cryo NHEK-Neo、クラボウ製)を5.0×104cell/wellになるように、24wellマイクロプレートに移し、HuMedia−KG2培地(クラボウ製)で48時間培養した。さらに培養した細胞を1%非必須アミノ酸、1%ペニシリン/ストレプトマイシン混液、5μMヒスタミン、10ng/mlのTNF−αを含むDMEM培地(以下、刺激培地とする)に適量のアルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液(実施例1)を加えて24時間培養した。培養終了後、培養上清を回収した。
【0044】
上記で得られた培養上清中のET−1を、酵素免疫測定法を用いたサンドイッチ法(Human Endothelin-1 Parameter ELISA Kit、R&D社製)により定量した。マイクロプレート、抗体、試薬等は全てキット付属のものを用いた。すなわち、まずヒトET−1に対するラットET−1抗体を固着した96wellマイクロプレートに、抗ET−1ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体液を添加し、さらに試料(上記培養上清)又はヒトET−1標準液を添加した後、室温で1時間反応させた。リン酸緩衝溶液でプレートを洗浄後、基質(テトラメチルベンチジン溶液)を添加した。室温で30分間反応させた後、反応停止液(塩酸水溶液)を添加して反応を停止させた。次いでプレートリーダー(POWERSCAN HT、大日本製薬製)を用いて、450及び620nmにおける吸光度を測定した。450nmにおける吸光度から620nmにおける吸光度を差し引いたものを測定値とした。
【0045】
アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液(実施例2)、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液(実施例3)、アルギン酸オリゴ糖の水溶液(実施例4)、ローズマリー抽出物(実施例5)、ダイズ発酵物(実施例6)、緑藻類抽出物(実施例7)、トウヒ抽出物(実施例8)、及びチンピ抽出物(実施例9)についても、同様に上記刺激培地に加えて24時間培養した後、培養上清を回収し、Human Endothelin-1 Parameter ELISA Kit (R&D社製)を用いてET−1量を測定した。また、これら実施例1乃至9のMMP−9及びET−1の産生抑制剤(以下、単に産生抑制剤ともいう)を含まない刺激培地で培養したケラチノサイト(ヒト表皮角化細胞)から産生されたET−1量も同様に測定した。さらに5μMヒスタミン、10ng/mlのTNF−αを含まない無刺激の培地で培養したケラチノサイトから産生されたET−1量も同様に測定した。
【0046】
実施例1乃至9の産生抑制剤のET−1産生抑制効果は、これらの産生抑制剤を含まない刺激培地で培養した場合のET−1量を100とした場合の値(比率)で示した。その結果を表1〜9に示す。表1〜9においてET−1量/cell(重量%)とは、単位細胞当たりのET−1量を意味する。
【0047】
【表1】

【0048】
【表2】

【0049】
【表3】

【0050】
【表4】

【0051】
【表5】

【0052】
【表6】

【0053】
【表7】

【0054】
【表8】

【0055】
【表9】

【0056】
表1〜9からも明らかなように、実施例1乃至9の産生抑制剤を含む刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたET−1量は、これらの産生抑制剤を含まない刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたET−1量よりも減少していた。このことからアルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液、アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液、アルギン酸オリゴ糖の水溶液、ローズマリー抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、柑橘類抽出物はケラチノサイトによるET−1産生を抑制するものと認められた。
【0057】
また、実施例1〜7、9の産生抑制剤の濃度が高くなる程、産生されるET−1量が減少し、これら実施例1〜7、9の産生抑制剤の濃度を高くすることで、ET−1の産生抑制効果が高まることが分かった。特に、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液の場合には0.125容量%以上とすることで、無刺激の場合と同等若しくはそれ以上にET−1量を減少させることができ、ローズマリー抽出液の場合には0.50容量%、緑藻類抽出物の場合には0.125容量%以上とすることで、無刺激の場合と同等若しくはそれ以上にET−1量を減少させることができた。
一方、実施例8の産生抑制剤(トウヒ抽出物)の場合には、逆に産生抑制剤の濃度を高くすることで低下したが、その理由は定かではない。しかしながら、実施例8の産生抑制剤を含まない刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたET−1量よりも明らかに減少していた。従ってトウヒ抽出物にも、ケラチノサイトによるET−1産生を抑制する効果があることは明らかである。
【0058】
(試験例2)
上記実施例1乃至9の産生抑制剤について、MMP−9の産生抑制効果について試験した。
正常ヒト表皮角化細胞 (Cryo NHEK-Neo、クラボウ製)を5.0×104cell/wellになるように、24wellマイクロプレートに移し、HuMedia−KG2培地(クラボウ製)で48時間培養した。さらに培養した細胞を上記刺激培地に適量のアルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液(実施例1)を加えて24時間培養した。培養終了後、培養上清を回収した。
【0059】
上記で得られた培養上清中のMMP−9量をゼラチンザイモグラフィー法により測定した。すなわち、0.1重量%ゼラチンを含むSDS−ポリアクリルアミドゲル(7.5%T)を作製し、全レーンにヒト細胞由来のMMP−9標準溶液又は試料(上記培養上清を、Laemmli Sample Buffer(バイオ・ラッド社製)で2倍希釈したもの)を一定量アプライし、電気泳動を行った。泳動後のゲルを2.5重量%「TritonX−100」で洗浄し、十分にSDSを除いた。そのゲルを、インキュベーション用緩衝液(0.01mMCaCl2を含むpH7.6の50mMトリス)に浸して、37℃で一晩インキュベートした。
【0060】
インキュベーション後のゲルを、前固定液(20%メタノール、7.5%酢酸の水溶液)で処理した後、クーマシー・ブリリアント・ブルー染色し、脱色後に現れるバンドの太さをレーン・スポットアナライザー(アトー社製)で定量化した。
【0061】
アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液(実施例2)、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液(実施例3)、アルギン酸オリゴ糖の水溶液(実施例4)、ローズマリー抽出物(実施例5)、ダイズ発酵物(実施例6)、緑藻類抽出物(実施例7)、トウヒ抽出物(実施例8)、及びチンピ抽出物(実施例9)についても、同様に上記刺激培地に加えて24時間培養した後、培養上清を回収し、ゼラチンザイモグラフィー法を用いてMMP−9量を測定した。また、これら実施例1乃至9のMMP−9及びET−1の産生抑制剤を含まない刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたMMP−9量も同様に測定した。さらに5μMヒスタミン、10ng/mlのTNF−αを含まない無刺激の培地で培養したケラチノサイトから産生されたMMP−9量も同様に測定した。
【0062】
実施例1乃至9の産生抑制剤のMMP−9産生抑制効果は、これらの産生抑制剤を含まない刺激培地で培養した場合のMMP−9量を100とした場合の値(比率)で示した。この結果を表10〜18に示す。表10〜18においてMMP−9量/cell(重量%)とは、単位細胞数当たりのMMP−9量を意味する。
【0063】
【表10】

【0064】
【表11】

【0065】
【表12】

【0066】
【表13】

【0067】
【表14】

【0068】
【表15】

【0069】
【表16】

【0070】
【表17】

【0071】
【表18】

【0072】
表10〜18からも明らかなように、実施例1乃至9の産生抑制剤を含む刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたMMP−9量は、これらの産生抑制剤を含まない刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたMMP−9量よりも減少していた。このことからアルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液、アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液、アルギン酸オリゴ糖の水溶液、ローズマリー抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、柑橘類抽出物はケラチノサイトによるMMP−9産生をも抑制するものと認められた。
【0073】
また、実施例1〜9の産生抑制剤の濃度が高くなる程、産生されるMMP−9量が減少し、これら実施例1〜9の産生抑制剤の濃度を高くすることで、MMP−9の産生抑制効果が高まることが分かった。特に、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液の場合には0.125容量%以上、ローズマリー抽出液の場合には0.50容量%、ダイズ発酵物の場合には100μg/ml、緑藻類抽出物の場合には0.125容量%、チンピ抽出物の場合には0.50容量%以上とすることで、無刺激の場合と同等若しくはそれ以上にMMP−9量を減少させることができた。
【0074】
(処方例1)
本処方例は、クリームの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【0075】
配合成分 配合量(重量%)
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液 3.0
マイクロクリスタリンワックス 0.5
流動パラフィン 2.0
ミリスチン酸オクチルドデシル 2.0
オリーブ油 5.0
親油型モノステアリン酸グリセリン 3.5
モノステアリン酸ポリオキシエチレン 0.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.5
メチルポリシロキサン 0.4
セタノール 2.5
1,3−ブチレングリコール 5.0
グリセリン 8.0
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
【0076】
(処方例2)
本処方例は、ジェルの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【0077】
配合成分 配合量(重量%)
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液 3.0
酢酸トコフェロール 0.1
1,3−ブチレングリコール 6.0
グリセリン 2.0
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 0.2
クエン酸 0.01
クエン酸ナトリウム 0.03
水酸化ナトリウム 0.08
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
【0078】
(処方例3)
本処方例は、ジェルの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【0079】
配合成分 配合量(重量%)
アルギン酸オリゴ糖の水溶液 3.0
酢酸トコフェロール 0.1
1,3−ブチレングリコール 6.0
グリセリン 2.0
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 0.2
クエン酸 0.01
クエン酸ナトリウム 0.03
水酸化ナトリウム 0.08
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
【0080】
(処方例4)
本処方例は、エッセンスの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【0081】
配合成分 配合量(重量%)
アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液 3.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
グリセリン 4.0
ヒアルロン酸ナトリウム 0.1
エタノール 3.0
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.1
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
【0082】
(処方例5)
本処方例は、乳液の処方例であり、その組成は次のとおりである。
【0083】
配合成分 配合量(重量%)
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液 3.0
サフラワー油 3.0
オリーブ油 3.0
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン 1.0
モノステアリン酸ソルビタン 0.5
ステアリルアルコール 0.4
セタノール 0.6
1,3−ブチレングリコール 3.0
グリセリン 5.0
ヒアルロン酸ナトリウム 0.5
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.5
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
【0084】
(処方例6)
本処方例は、エッセンスの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【0085】
配合成分 配合量(重量%)
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液 2.5
1,3−ブチレングリコール 5.0
グリセリン 4.0
ヒアルロン酸ナトリウム 0.1
エタノール 3.0
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.1
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
【0086】
(処方例7)
本処方例は、クリームの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【0087】
配合成分 配合量(重量%)
ダイズ発酵物 2.0
マイクロクリスタリンワックス 0.5
流動パラフィン 2.0
ミリスチン酸オクチルドデシル 2.0
オリーブ油 5.0
親油型モノステアリン酸グリセリン 3.5
モノステアリン酸ポリオキシエチレン 0.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.5
メチルポリシロキサン 0.4
セタノール 2.5
1,3−ブチレングリコール 5.0
グリセリン 8.0
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
【0088】
(処方例8)
本処方例は、乳液の処方例であり、その組成は次のとおりである。
【0089】
配合成分 配合量(重量%)
ローズマリー抽出物 3.0
サフラワー油 3.0
オリーブ油 3.0
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン 1.0
モノステアリン酸ソルビタン 0.5
ステアリルアルコール 0.4
セタノール 0.6
1,3−ブチレングリコール 3.0
グリセリン 5.0
ヒアルロン酸ナトリウム 0.5
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.5
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
【0090】
(処方例9)
本処方例は、エッセンスの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【0091】
配合成分 配合量(重量%)
緑藻抽出物 3.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
グリセリン 4.0
ヒアルロン酸ナトリウム 0.1
エタノール 3.0
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.1
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
【0092】
(処方例10)
本処方例は、クリームの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【0093】
トウヒ抽出物 1.5
チンピ抽出物 1.5
マイクロクリスタリンワックス 0.5
流動パラフィン 2.0
ミリスチン酸オクチルドデシル 2.0
オリーブ油 5.0
親油型モノステアリン酸グリセリン 3.5
モノステアリン酸ポリオキシエチレン 0.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.5
メチルポリシロキサン 0.4
セタノール 2.5
1,3−ブチレングリコール 5.0
グリセリン 8.0
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量

【特許請求の範囲】
【請求項1】
アルギン酸オリゴ糖、アルギン酸オリゴ糖の塩、アルギン酸オリゴ糖と金属イオンとの錯体、アルギン酸オリゴ糖の塩と金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、柑橘類抽出物の少なくともいずれかを含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤。
【請求項2】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩の重合度が2〜20である請求項1記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤。
【請求項3】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩の重合度が7〜12である請求項1記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤。
【請求項4】
アルギン酸オリゴ糖の塩が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、又はアルギン酸カルシウムである請求項1乃至3記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤。
【請求項5】
アルギン酸オリゴ糖若しくはその塩と錯体を形成する金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、又はマンガンイオンである請求項1乃至4のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤。
【請求項6】
請求項1乃至5のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤を配合したことを特徴とする炎症後色素沈着の予防・改善剤。
【請求項7】
請求項1乃至5のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−9及びエンドセリン−1の産生抑制剤を配合したことを特徴とする化粧料。

【公開番号】特開2007−204449(P2007−204449A)
【公開日】平成19年8月16日(2007.8.16)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−27255(P2006−27255)
【出願日】平成18年2月3日(2006.2.3)
【出願人】(000112266)ピアス株式会社 (49)
【Fターム(参考)】