マンガンペルオキシダーゼ変異体及びそれを用いるリグノセルロース系バイオマスの前処理方法
【課題】耐熱性及び耐過酸化水素性に優れたＭｎＰ変異体及びそれを用いるリグノセルロース系バイオマスの前処理方法を提供する。
【解決手段】ＭｎＰ変異体は、特定の配列で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる。リグノセルロース系バイオマスの前処理方法は、リグノセルロース系バイオマスに、前記ＭｎＰ変異体と、リグニンペルオキシダーゼとを添加する。
【解決手段】ＭｎＰ変異体は、特定の配列で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる。リグノセルロース系バイオマスの前処理方法は、リグノセルロース系バイオマスに、前記ＭｎＰ変異体と、リグニンペルオキシダーゼとを添加する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンガンペルオキシダーゼ変異体及びそれを用いるリグノセルロース系バイオマスの前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、自動車用燃料として、ガソリン−エタノール混合燃料を用いることが検討されている。前記エタノールとしては、植物性物質の発酵、蒸留により得たバイオエタノールを用いると、土壌管理を厳密に行うことにより所謂カーボンニュートラル効果を得ることができ、二酸化炭素の排出量を低減して地球温暖化の防止に寄与できるものと考えられている。
【０００３】
しかし、前記植物性物質として、例えばサトウキビ、トウモロコシ等の農作物を用いると、該農作物がエタノールの原料として大量に消費されることにより、食料又は飼料としての供給量が減少するという問題がある。そこで、前記植物性物質として、食用または飼料用とならないリグノセルロース系バイオマスを用いてエタノールを製造する技術が検討されている。
【０００４】
前記リグノセルロース系バイオマスは、セルロースを含んでおり、該セルロースを酵素糖化によりグルコースに分解し、得られたグルコースを発酵させてバイオエタノールを得ることができる。ところが、前記リグノセルロースは、セルロースの他にヘミセルロース及びリグニンを主な構成成分としており、通常該セルロース及び該ヘミセルロースは、該リグニンと強固に結合することにより保護されている。従って、前記リグノセルロースはそのままでは前記酵素糖化反応が阻害されることとなり、予め前記リグニンを除去しておくことが望ましい。
【０００５】
前記リグニンを除去する方法として、微生物または微生物が産生する酵素を用いることが考えられる。前記リグニンを分解する微生物としては白色腐朽菌が知られており、白色腐朽菌はリグニン分解酵素であるマンガンペルオキシダーゼを産生することが知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００６】
前記マンガンペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下にＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化する。そして、Ｍｎ（III）と有機酸との反応により形成され錯体が、前記リグニンの分解に関与しているものと考えられている（例えば、特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１４２７７２号公報
【特許文献２】特開平９−９５８８５号公報
【特許文献３】特開２００６−３３３７５８号公報
【特許文献４】特開２００９−１６７５４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一般に、酵素を工業的に利用する場合には、室温以上の高温で作用させることが好ましい。しかしながら、前記マンガンペルオキシダーゼは、耐熱性が低く、例えば２０〜３０℃程度の温度で失活するという不都合がある。
【０００９】
また、前記マンガンペルオキシダーゼは、過酸化水素存在下でＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化することにより前記リグニンを分解する酵素であるにも拘わらず、過酸化水素に対する耐性が低いという不都合がある。
【００１０】
そこで、本発明は、かかる不都合を解消して、耐熱性及び耐過酸化水素性に優れたマンガンペルオキシダーゼ変異体を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明の目的は、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体を用いるリグノセルロース系バイオマスの前処理方法を提供することにもある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
かかる目的を達成するために、本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、野生型マンガンペルオキシダーゼのアミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸をより疎水性の大きなアミノ酸で置換したことを特徴とする。
【００１３】
本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、野生型マンガンペルオキシダーゼの立体構造において、その内方に位置しているアミノ酸であって、アミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸をより疎水性の大きなアミノ酸で置換している。この結果、本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、その立体構造の内方における疎水性相互作用が強化され、該立体構造が安定化するので、優れた耐熱性及び耐過酸化水素性を得ることができると考えられる。
【００１４】
本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、例えば、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１５】
前記第１のアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型のマンガンペルオキシダーゼにおいて、２３８番目のＭ（メチオニン）をＩ（イソロイシン）にアミノ酸置換したものである。この結果、前記第１のアミノ酸配列又は前記第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体は、優れた耐熱性及び耐過酸化水素性を得ることができる。
【００１６】
本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、前記第１のアミノ酸配列又は第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質である。
【００１７】
また、本発明は、前記組換えタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子にもある。本発明の遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子であることが好ましい。
【００１８】
本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、前記遺伝子を含有する組換えベクターを形質転換体に導入することにより発現させることができる。
【００１９】
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法は、リグノセルロース系バイオマスからリグニンを分解して除去するリグノセルロース系バイオマスの前処理方法であって、リグノセルロース系バイオマスに、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質と、リグニンペルオキシダーゼとを添加することを特徴とする。
【００２０】
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記リグノセルロース系バイオマスに、前記リグニンペルオキシダーゼを添加すると、該リグニンペルオキシダーゼが該リグノセルロース系バイオマスのリグニンを分解し、細胞壁を破壊する。
【００２１】
一方、前記リグノセルロース系バイオマスに、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体を添加すると、該マンガンペルオキシダーゼ変異体は、まず、過酸化水素の存在下にＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化する。生成したＭｎ（III）は、前記のように破壊された細胞壁から、前記リグノセルロース系バイオマスの内部に侵入し、該リグノセルロース系バイオマスの内部の不飽和脂肪酸と錯体を形成する。そして、前記錯体が前記リグノセルロース系バイオマスのリグニンをさらに分解する。
【００２２】
このとき、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体は優れた耐過酸化水素性を備えているので、過酸化水素の存在下においても失活することなく、Ｍｎ（II）をＭｎ（III）に酸化することができる。また、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体は優れた耐熱性を備えているので、室温よりも高い温度、例えば３７〜４２℃の範囲の温度で作用させることができ、前記リグニンの分解を促進させることができる。
【００２３】
また、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体によれば、それ自体が前記リグニンの分解を行うことはなく、該マンガンペルオキシダーゼ変異体により酸化されたＭｎ（III）が前記リグニンの分解に関与する。従って、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体自体から離間した部位で前記リグニンの分解を行うことができる。
【００２４】
尚、本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体に代えて、前記組換えタンパク質を用いても、該マンガンペルオキシダーゼ変異体と同一の作用効果を奏することができる。
【００２５】
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記リグノセルロース系バイオマスに、前記リグニンペルオキシダーゼを添加した後、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質を添加することが好ましい。このようにすることにより、まず、前記リグニンペルオキシダーゼによりリグニンを分解して前記リグノセルロース系バイオマスの細胞壁を破壊することができ、次いで、破壊された細胞壁からＭｎ（III）が前記リグノセルロース系バイオマスの内部に侵入することができる。
【００２６】
従って、前記リグニンペルオキシダーゼと、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質との連携を効率よく行うことができる。
【００２７】
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法において、前記リグニンペルオキシダーゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型のリグニンペルオキシダーゼにおいて、２４０番目のＨ（ヒスチジン）をＦ（フェニルアラニン）に、２４１番目のＴ（トレオニン）をＬ（ロイシン）に、２４２番目のＩ（イソロイシン）をＬ（ロイシン）に、それぞれアミノ酸置換したリグニンペルオキシダーゼ変異体であることが好ましい。前記野生型のリグニンペルオキシダーゼは、配列番号４で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００２８】
前記リグニンペルオキシダーゼ変異体は、優れた耐熱性及び耐過酸化水素性を備えているので、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質と同一条件下で作用することができ、該マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質との連携をさらに効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】野生型のマンガンペルオキシダーゼ及びこれと相同なアミノ酸配列からなるタンパク質４８個の系統樹を示す図。
【図２】本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体の３７℃における耐熱性を示すグラフ。
【図３】本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体の４２℃における耐熱性を示すグラフ。
【図４】本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体の耐過酸化水素性を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
【００３１】
本実施形態のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の野生型のマンガンペルオキシダーゼの変異体であり、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。前記野生型のマンガンペルオキシダーゼは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる。
【００３２】
本実施形態のマンガンペルオキシダーゼ変異体の前記配列番号１で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列において、２３８番目のＭ（メチオニン）をＩ（イソロイシン）にアミノ酸置換したものである。また、本実施形態のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼは、配列番号６で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００３３】
前記野生型のマンガンペルオキシダーゼは、耐熱性及び耐過酸化水素性を備えていない。しかし、ウーズ（Woese）らによって示された１６ｓｒＲＮＡによる系統樹を見ると、８０℃以上で至適に生育する生物が該系統樹の根元に多いことが示されている。この事実から、真正細菌、真核生物、古細菌の共通の祖先は超好熱菌と推定され、先祖型のアミノ酸配列を有するか又はそれに近い配列を有するタンパク質は耐熱性を備えているものと考えられる。このような知見は、特開２００２−２４７９９１号公報に記載されている。
【００３４】
そこで、本実施形態では、リグニンを分解する酵素を含み、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼと相同のアミノ酸配列を備えるタンパク質に関する系統樹を作成し、該系統樹における先祖型のアミノ酸配列について検討した。
【００３５】
前記系統樹の作成に当たって、まず、リグニンを分解する酵素を含み、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼと相同のアミノ酸配列を備えるタンパク質４８個をＤＤＢＪ内のアミノ酸配列データベースからソフトウェアＢＬＡＳＴＰを用いて抽出した。抽出したタンパク質は、リグニンを分解する酵素として、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼの他、担子菌由来のマンガンペルオキシダーゼ、子のう菌由来のリグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼとリグニンペルオキシダーゼとのハイブリッド型酵素であるヴァーサタイルペルオキシダーゼ、野生型のリグニンペルオキシダーゼを含んでいる。尚、本明細書では、マンガンペルオキシダーゼを「ＭｎＰ」、リグニンペルオキシダーゼを「ＬｉＰ」、ヴァ−サタイルペルオキシダーゼ「ＶＰ」と略記することがある。
【００３６】
次に、前記野生型ＭｎＰと、抽出した４８個のタンパク質との合わせて４９個のタンパク質について、進化の系統を示す系統樹を作成した。前記系統樹は、ソフトウェアＴｒｅｅｆｉｎｄｅｒとＰｈｙＭＬとを用いて候補系統樹群を作成し、該候補系統樹群の各候補系統樹について、ソフトウェアＰＭＡＬのＣＯＤＥＭＬを用いて尤度を計算した。そして、最尤度を備える候補系統樹を前記４９個のタンパク質の進化の系統を示す系統樹として選択した。選択した系統樹を図１に示す。
【００３７】
図１において、符号１は野生型ＭｎＰ、符号２は野生型ＬｉＰ、符号３は子のう菌由来ＬｉＰ、符号４はＶＰを示す。また、符号５はＭｎＰを示し、符号６はＬｉＰを示す。
【００３８】
尚、図１において、野生型ＭｎＰ１及び野生型ＬｉＰ２を除く４７個のタンパク質は、ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓにより示している。野生型ＭｎＰ１及び野生型ＬｉＰ２を除く４７個のタンパク質は、いずれも論文等に発表されており、前記”ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ”により特定することができる。
【００３９】
また、前記野生型ＬｉＰ２は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、配列番号４で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００４０】
図１において、分岐点Ａに対応するタンパク質は耐熱性を備えており、そのアミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸は、野生型ＭｎＰ１のアミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸よりも疎水性大きなアミノ酸であると考えられる。
【００４１】
そこで、前記野生型ＭｎＰ１のアミノ酸配列（配列番号５）中、２３８番目のＭ（メチオニン）を、Ｍより疎水性の大きなアミノ酸であるＩ（イソロイシン）にアミノ酸置換したものを本実施形態の先祖型ＭｎＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１）とした。
【００４２】
本実施形態のＭｎＰ変異体（先祖型ＭｎＰ変異体）は、前記のようにして決定した先祖型ＭｎＰ変異体のアミノ酸配列に基づいて、次のようにして作成することができる。
【００４３】
まず、野生型ＭｎＰ１の遺伝子がコードされたプラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）に、QuikChange（登録商標）Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE)を用いて、２３８番目のＭをＩにアミノ酸置換した祖先型変異を導入し、ベクターとする。目的の変異導入の成否はシークエンシングで確認することができる。
【００４４】
次に、前記祖先型変異が導入されたベクターを用いて大腸菌Escherichia coli BL21(DE3)株を形質転換し、ＴＢ培地を用い３７℃の温度で大量培養する。得られた菌体を超音波で破砕し、３００００ｒｐｍで２０分間遠心して、沈殿を分離する。
【００４５】
次に、分離された沈殿を、２０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−ＤＴＴ、１％−非イオン性界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名））で３回洗浄し、８Ｍ−尿素、５０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ−ＥＤＴＡ、１ｍＭ−ＤＴＴに再懸濁し、４℃の温度に一晩保持して封入体を可溶化する。
【００４６】
次に、前記封入体が可溶化された溶液を４倍に希釈することにより尿素の濃度を２Ｍとし、４℃の温度の暗所に一晩保持してリフォールディングして、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）を得る。このとき、５μＭ−ヘミン、０．７ｍＭ−酸化グルタチオン、１０ｍＭ−ＣａＣｌ２（濃度はそれぞれ終濃度である）を添加する。
【００４７】
次に、リフォールディングされた本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）を、陰イオン交換カラム（DEAE-Sepharose（商品名）、HiTrrapQ HP（商品名）、ResourceQ（商品名）)、で分離し、精製する。
【００４８】
次に、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）の耐熱性及び耐過酸化水素性を評価した（実施例）。
【００４９】
前記耐熱性の評価は、まず、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）４８ｎＭを、１０ｍＭ−酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び１ｍＭ−ＣａＣｌ２からなる溶液中、３７℃及び４２℃の温度でそれぞれインキュベートした。次に、インキュベート開始後、０分後、２分後、５分後、１０分後、１５分後に、インキュベートされた本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）８ｎＭを、５０ｍＭ−マロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）、１．２ｍＭ−ＭｎＳＯ４、０．１ｍＭ−Ｈ２Ｏ２を含む溶液に加えて、測定液を調製した。
【００５０】
前記測定液中で、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）はＭｎ(III)を生成し、Ｍｎ(III)がマロン酸と錯体を形成する。そこで、次に、２７０ｎｍの波長の光線を用いて、前記測定液の吸光度を測定した。測定中の失活を防ぐために、測定温度は２５℃とした。２７０ｎｍの波長によるモル吸光係数ε２７０は、ε２７０＝８５００である。
【００５１】
各試料から得られた初速により、それぞれのインキュベート時間における比活性（μモル／ｍｇ分）を算出した。インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００５２】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフについて、インキュベート温度３７℃の場合を図２（ａ）に、４２℃の場合を図３（ａ）にそれぞれ示す。
【００５３】
また、図２（ａ）及び図３（ａ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００５４】
また、前記耐過酸化水素性の評価は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）４８ｎＭを、ｐＨ６．０の０．１ｍＭ−Ｈ２Ｏ２溶液中、２５℃の温度でインキュベートした以外は、前記耐熱性の評価と全く同一にして、測定液の吸光度を測定することにより行った。
【００５５】
各試料から得られた初速により、それぞれのインキュベート時間における比活性（μモル／ｍｇ分）を算出した。インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性の値を表３に示す。
【００５６】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフを図４（ａ）に示す。また、図４（ａ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度を表３に示す。
【００５７】
次に、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）に代えて野生型のＭｎＰ１を用いた以外は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）の場合と全く同一にして野生型のＭｎＰ１の耐熱性及び耐過酸化水素性を評価した（比較例１）。
【００５８】
前記耐熱性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００５９】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフについて、インキュベート温度３７℃の場合を図２（ｂ）に、４２℃の場合を図３（ｂ）にそれぞれ示す。
【００６０】
また、図２（ｂ）及び図３（ｂ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００６１】
また、前記耐過酸化水素性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性の値を表３に示す。
【００６２】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフを図４（ｂ）に示す。また、図４（ｂ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度を表３に示す。
【００６３】
次に、前記野生型ＭｎＰ１のアミノ酸配列（配列番号４）中、２３８番目のＭ（メチオニン）を、Ｆ（フェニルアラニン）にアミノ酸置換したアミノ酸配列（配列番号７）を備えるＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）を作成した。前記ＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）は、配列番号８で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。前記ＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）は、野生型ＭｎＰ１の遺伝子がコードされたプラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）に、２３８番目のＭをＦにアミノ酸置換した変異を導入してベクターとする以外は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）と全く同一にして作成することができる。
【００６４】
次に、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）に代えて、ＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）を用いた以外は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）の場合と全く同一にしてＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）の耐熱性及び耐過酸化水素性を評価した（比較例２）。
【００６５】
前記耐熱性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００６６】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフについて、インキュベート温度３７℃の場合を図２（ｃ）に、４２℃の場合を図３（ｃ）にそれぞれ示す。
【００６７】
また、図２（ｃ）及び図３（ｃ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００６８】
前記過酸化水素性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性の値を表３に示す。
【００６９】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフを図４（ｃ）に示す。また、図４（ｃ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度を表３に示す。
【００７０】
【表１】
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
表１〜２及び図２〜３に示すように、本実施例のＭｎＰ変異体は、野生型ＭｎＰ（比較例１）又は２３８番目のＭをＦにアミノ酸置換したＭｎＰ変異体（比較例２）よりも優れた耐熱性を備えていることが明らかである。
【００７４】
また、表３及び図４に示すように、本実施例のＭｎＰ変異体は、野生型ＭｎＰ（比較例１）又は２３８番目のＭをＦにアミノ酸置換したＭｎＰ変異体（比較例２）よりも優れた耐過酸化水素性を備えていることが明らかである。
【００７５】
次に、本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法について説明する。
【００７６】
本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法は、リグノセルロース系バイオマスを基質として、該基質を糖化酵素により糖化し、得られた糖化溶液を発酵させてバイオエタノールを製造する際に、前処理として該基質のリグニンを除去する方法である。前記リグノセルロース系バイオマスとしては、木材、稲藁、麦藁、バガス、竹、パルプ及びこれらから生じる廃棄物例えば古紙等を挙げることができ、例えば、稲藁を用いることができる。
【００７７】
本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記リグノセルロース系バイオマスとして稲藁を用いる場合には、まず、カッターミル等により約３ｍｍの長さに粉砕された稲藁に水を添加して、例えば５質量％の濃度の混合液を調製する。
【００７８】
次に、前記混合液に、その全量に対し０．１〜０．５μＭの範囲のリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）を添加する。前記ＬｉＰは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型ＬｉＰにおいて、２４０番目のＨ（ヒスチジン）をＦ（フェニルアラニン）に、２４１番目のＴ（トレオニン）をＬ（ロイシン）に、２４２番目のＩ（イソロイシン）をＬ（ロイシン）に、それぞれアミノ酸置換したＬｉＰ変異体であることが好ましい。前記野生型ＬｉＰは、配列番号４で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００７９】
前記ＬｉＰ変異体は、耐熱性及び耐過酸化水素性を備えている。そこで、前記ＬｉＰ変異体が添加された混合液を、０．１〜０．５ｍＭの過酸化水素の存在下、２５〜３０℃の範囲の温度に、１〜１２０時間の範囲の時間保持することにより、前記稲藁のリグニンを分解し、細胞壁を破壊することができる。
【００８０】
次に、前記混合液に、その全量に対し０．１〜０．５μＭの範囲の本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ、先祖型ＭｎＰ変異体）を添加する。本実施形態のＭｎＰ変異体は、前述のように耐熱性及び耐過酸化水素性を備えている。
【００８１】
そこで、本実施形態のＭｎＰ変異体が添加された混合液を、０．１〜０．５ｍＭの過酸化水素の存在下、３７〜４２℃の範囲の温度に、１〜１２０時間の範囲の時間保持することにより、前記稲藁に含まれるＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化することができる。生成したＭｎ（III）は、前記ＬｉＰ変異体により破壊された細胞壁から、前記稲藁の内部に侵入し、該稲藁に含まれる不飽和脂肪酸と錯体を形成する。そして、前記錯体が前記稲藁のリグニンをさらに分解する。
【００８２】
また、本実施形態のＭｎＰ変異体によれば、それ自体が前記リグニンの分解を行うことはなく、該ＭｎＰ変異体により酸化されたＭｎ（III）が前記リグニンの分解に関与する。従って、前記ＭｎＰ変異体自体から離間した部位で前記リグニンの分解を行うことができる。
【００８３】
本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法により処理された前記混合液は、前記リグニンの分解後、さらに糖化酵素を添加することにより、前記稲藁に含まれるセルロース及びヘムセルロースを糖化して、糖化溶液とすることができる。また、前記糖化溶液は、バイオエタノールの原料として用いることができる。
【００８４】
尚、本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記ＭｎＰ変異体に代えて、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質を用いてもよく、前記ＭｎＰ変異体と同一の作用効果を奏することができる。
【００８５】
また、本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記ＬｉＰ変異体に代えて、野生型ＬｉＰ等の他のリグニンペルオキシダーゼを用いてもよい。ただし、この場合には、前記ＬｉＰ変異体よりも耐熱性又は耐過酸化水素性が低く、本実施形態のＭｎＰ変異体と同一条件で用いることが難しくなることがある。
【００８６】
また、本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記混合液に前記ＬｉＰ変異体を添加した後、本実施形態のＭｎＰ変異体を添加するようにしているが、前記ＬｉＰ変異体と本実施形態のＭｎＰ変異体とを同時に添加するようにしてもよい。
【符号の説明】
【００８７】
１…野生型ＭｎＰ、 ２…野生型ＬｉＰ、 ３…子のう菌由来ＬｉＰ、 ４…ＶＰ、 ５…ＭｎＰ、 ６…ＬｉＰ、 Ａ…分岐点。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンガンペルオキシダーゼ変異体及びそれを用いるリグノセルロース系バイオマスの前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、自動車用燃料として、ガソリン−エタノール混合燃料を用いることが検討されている。前記エタノールとしては、植物性物質の発酵、蒸留により得たバイオエタノールを用いると、土壌管理を厳密に行うことにより所謂カーボンニュートラル効果を得ることができ、二酸化炭素の排出量を低減して地球温暖化の防止に寄与できるものと考えられている。
【０００３】
しかし、前記植物性物質として、例えばサトウキビ、トウモロコシ等の農作物を用いると、該農作物がエタノールの原料として大量に消費されることにより、食料又は飼料としての供給量が減少するという問題がある。そこで、前記植物性物質として、食用または飼料用とならないリグノセルロース系バイオマスを用いてエタノールを製造する技術が検討されている。
【０００４】
前記リグノセルロース系バイオマスは、セルロースを含んでおり、該セルロースを酵素糖化によりグルコースに分解し、得られたグルコースを発酵させてバイオエタノールを得ることができる。ところが、前記リグノセルロースは、セルロースの他にヘミセルロース及びリグニンを主な構成成分としており、通常該セルロース及び該ヘミセルロースは、該リグニンと強固に結合することにより保護されている。従って、前記リグノセルロースはそのままでは前記酵素糖化反応が阻害されることとなり、予め前記リグニンを除去しておくことが望ましい。
【０００５】
前記リグニンを除去する方法として、微生物または微生物が産生する酵素を用いることが考えられる。前記リグニンを分解する微生物としては白色腐朽菌が知られており、白色腐朽菌はリグニン分解酵素であるマンガンペルオキシダーゼを産生することが知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００６】
前記マンガンペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下にＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化する。そして、Ｍｎ（III）と有機酸との反応により形成され錯体が、前記リグニンの分解に関与しているものと考えられている（例えば、特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１４２７７２号公報
【特許文献２】特開平９−９５８８５号公報
【特許文献３】特開２００６−３３３７５８号公報
【特許文献４】特開２００９−１６７５４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一般に、酵素を工業的に利用する場合には、室温以上の高温で作用させることが好ましい。しかしながら、前記マンガンペルオキシダーゼは、耐熱性が低く、例えば２０〜３０℃程度の温度で失活するという不都合がある。
【０００９】
また、前記マンガンペルオキシダーゼは、過酸化水素存在下でＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化することにより前記リグニンを分解する酵素であるにも拘わらず、過酸化水素に対する耐性が低いという不都合がある。
【００１０】
そこで、本発明は、かかる不都合を解消して、耐熱性及び耐過酸化水素性に優れたマンガンペルオキシダーゼ変異体を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明の目的は、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体を用いるリグノセルロース系バイオマスの前処理方法を提供することにもある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
かかる目的を達成するために、本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、野生型マンガンペルオキシダーゼのアミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸をより疎水性の大きなアミノ酸で置換したことを特徴とする。
【００１３】
本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、野生型マンガンペルオキシダーゼの立体構造において、その内方に位置しているアミノ酸であって、アミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸をより疎水性の大きなアミノ酸で置換している。この結果、本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、その立体構造の内方における疎水性相互作用が強化され、該立体構造が安定化するので、優れた耐熱性及び耐過酸化水素性を得ることができると考えられる。
【００１４】
本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、例えば、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１５】
前記第１のアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型のマンガンペルオキシダーゼにおいて、２３８番目のＭ（メチオニン）をＩ（イソロイシン）にアミノ酸置換したものである。この結果、前記第１のアミノ酸配列又は前記第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体は、優れた耐熱性及び耐過酸化水素性を得ることができる。
【００１６】
本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、前記第１のアミノ酸配列又は第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質である。
【００１７】
また、本発明は、前記組換えタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子にもある。本発明の遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子であることが好ましい。
【００１８】
本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、前記遺伝子を含有する組換えベクターを形質転換体に導入することにより発現させることができる。
【００１９】
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法は、リグノセルロース系バイオマスからリグニンを分解して除去するリグノセルロース系バイオマスの前処理方法であって、リグノセルロース系バイオマスに、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質と、リグニンペルオキシダーゼとを添加することを特徴とする。
【００２０】
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記リグノセルロース系バイオマスに、前記リグニンペルオキシダーゼを添加すると、該リグニンペルオキシダーゼが該リグノセルロース系バイオマスのリグニンを分解し、細胞壁を破壊する。
【００２１】
一方、前記リグノセルロース系バイオマスに、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体を添加すると、該マンガンペルオキシダーゼ変異体は、まず、過酸化水素の存在下にＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化する。生成したＭｎ（III）は、前記のように破壊された細胞壁から、前記リグノセルロース系バイオマスの内部に侵入し、該リグノセルロース系バイオマスの内部の不飽和脂肪酸と錯体を形成する。そして、前記錯体が前記リグノセルロース系バイオマスのリグニンをさらに分解する。
【００２２】
このとき、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体は優れた耐過酸化水素性を備えているので、過酸化水素の存在下においても失活することなく、Ｍｎ（II）をＭｎ（III）に酸化することができる。また、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体は優れた耐熱性を備えているので、室温よりも高い温度、例えば３７〜４２℃の範囲の温度で作用させることができ、前記リグニンの分解を促進させることができる。
【００２３】
また、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体によれば、それ自体が前記リグニンの分解を行うことはなく、該マンガンペルオキシダーゼ変異体により酸化されたＭｎ（III）が前記リグニンの分解に関与する。従って、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体自体から離間した部位で前記リグニンの分解を行うことができる。
【００２４】
尚、本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体に代えて、前記組換えタンパク質を用いても、該マンガンペルオキシダーゼ変異体と同一の作用効果を奏することができる。
【００２５】
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記リグノセルロース系バイオマスに、前記リグニンペルオキシダーゼを添加した後、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質を添加することが好ましい。このようにすることにより、まず、前記リグニンペルオキシダーゼによりリグニンを分解して前記リグノセルロース系バイオマスの細胞壁を破壊することができ、次いで、破壊された細胞壁からＭｎ（III）が前記リグノセルロース系バイオマスの内部に侵入することができる。
【００２６】
従って、前記リグニンペルオキシダーゼと、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質との連携を効率よく行うことができる。
【００２７】
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法において、前記リグニンペルオキシダーゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型のリグニンペルオキシダーゼにおいて、２４０番目のＨ（ヒスチジン）をＦ（フェニルアラニン）に、２４１番目のＴ（トレオニン）をＬ（ロイシン）に、２４２番目のＩ（イソロイシン）をＬ（ロイシン）に、それぞれアミノ酸置換したリグニンペルオキシダーゼ変異体であることが好ましい。前記野生型のリグニンペルオキシダーゼは、配列番号４で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００２８】
前記リグニンペルオキシダーゼ変異体は、優れた耐熱性及び耐過酸化水素性を備えているので、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質と同一条件下で作用することができ、該マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質との連携をさらに効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】野生型のマンガンペルオキシダーゼ及びこれと相同なアミノ酸配列からなるタンパク質４８個の系統樹を示す図。
【図２】本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体の３７℃における耐熱性を示すグラフ。
【図３】本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体の４２℃における耐熱性を示すグラフ。
【図４】本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体の耐過酸化水素性を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
【００３１】
本実施形態のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の野生型のマンガンペルオキシダーゼの変異体であり、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。前記野生型のマンガンペルオキシダーゼは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる。
【００３２】
本実施形態のマンガンペルオキシダーゼ変異体の前記配列番号１で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列において、２３８番目のＭ（メチオニン）をＩ（イソロイシン）にアミノ酸置換したものである。また、本実施形態のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼは、配列番号６で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００３３】
前記野生型のマンガンペルオキシダーゼは、耐熱性及び耐過酸化水素性を備えていない。しかし、ウーズ（Woese）らによって示された１６ｓｒＲＮＡによる系統樹を見ると、８０℃以上で至適に生育する生物が該系統樹の根元に多いことが示されている。この事実から、真正細菌、真核生物、古細菌の共通の祖先は超好熱菌と推定され、先祖型のアミノ酸配列を有するか又はそれに近い配列を有するタンパク質は耐熱性を備えているものと考えられる。このような知見は、特開２００２−２４７９９１号公報に記載されている。
【００３４】
そこで、本実施形態では、リグニンを分解する酵素を含み、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼと相同のアミノ酸配列を備えるタンパク質に関する系統樹を作成し、該系統樹における先祖型のアミノ酸配列について検討した。
【００３５】
前記系統樹の作成に当たって、まず、リグニンを分解する酵素を含み、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼと相同のアミノ酸配列を備えるタンパク質４８個をＤＤＢＪ内のアミノ酸配列データベースからソフトウェアＢＬＡＳＴＰを用いて抽出した。抽出したタンパク質は、リグニンを分解する酵素として、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼの他、担子菌由来のマンガンペルオキシダーゼ、子のう菌由来のリグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼとリグニンペルオキシダーゼとのハイブリッド型酵素であるヴァーサタイルペルオキシダーゼ、野生型のリグニンペルオキシダーゼを含んでいる。尚、本明細書では、マンガンペルオキシダーゼを「ＭｎＰ」、リグニンペルオキシダーゼを「ＬｉＰ」、ヴァ−サタイルペルオキシダーゼ「ＶＰ」と略記することがある。
【００３６】
次に、前記野生型ＭｎＰと、抽出した４８個のタンパク質との合わせて４９個のタンパク質について、進化の系統を示す系統樹を作成した。前記系統樹は、ソフトウェアＴｒｅｅｆｉｎｄｅｒとＰｈｙＭＬとを用いて候補系統樹群を作成し、該候補系統樹群の各候補系統樹について、ソフトウェアＰＭＡＬのＣＯＤＥＭＬを用いて尤度を計算した。そして、最尤度を備える候補系統樹を前記４９個のタンパク質の進化の系統を示す系統樹として選択した。選択した系統樹を図１に示す。
【００３７】
図１において、符号１は野生型ＭｎＰ、符号２は野生型ＬｉＰ、符号３は子のう菌由来ＬｉＰ、符号４はＶＰを示す。また、符号５はＭｎＰを示し、符号６はＬｉＰを示す。
【００３８】
尚、図１において、野生型ＭｎＰ１及び野生型ＬｉＰ２を除く４７個のタンパク質は、ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓにより示している。野生型ＭｎＰ１及び野生型ＬｉＰ２を除く４７個のタンパク質は、いずれも論文等に発表されており、前記”ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ”により特定することができる。
【００３９】
また、前記野生型ＬｉＰ２は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、配列番号４で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００４０】
図１において、分岐点Ａに対応するタンパク質は耐熱性を備えており、そのアミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸は、野生型ＭｎＰ１のアミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸よりも疎水性大きなアミノ酸であると考えられる。
【００４１】
そこで、前記野生型ＭｎＰ１のアミノ酸配列（配列番号５）中、２３８番目のＭ（メチオニン）を、Ｍより疎水性の大きなアミノ酸であるＩ（イソロイシン）にアミノ酸置換したものを本実施形態の先祖型ＭｎＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１）とした。
【００４２】
本実施形態のＭｎＰ変異体（先祖型ＭｎＰ変異体）は、前記のようにして決定した先祖型ＭｎＰ変異体のアミノ酸配列に基づいて、次のようにして作成することができる。
【００４３】
まず、野生型ＭｎＰ１の遺伝子がコードされたプラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）に、QuikChange（登録商標）Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE)を用いて、２３８番目のＭをＩにアミノ酸置換した祖先型変異を導入し、ベクターとする。目的の変異導入の成否はシークエンシングで確認することができる。
【００４４】
次に、前記祖先型変異が導入されたベクターを用いて大腸菌Escherichia coli BL21(DE3)株を形質転換し、ＴＢ培地を用い３７℃の温度で大量培養する。得られた菌体を超音波で破砕し、３００００ｒｐｍで２０分間遠心して、沈殿を分離する。
【００４５】
次に、分離された沈殿を、２０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−ＤＴＴ、１％−非イオン性界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名））で３回洗浄し、８Ｍ−尿素、５０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ−ＥＤＴＡ、１ｍＭ−ＤＴＴに再懸濁し、４℃の温度に一晩保持して封入体を可溶化する。
【００４６】
次に、前記封入体が可溶化された溶液を４倍に希釈することにより尿素の濃度を２Ｍとし、４℃の温度の暗所に一晩保持してリフォールディングして、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）を得る。このとき、５μＭ−ヘミン、０．７ｍＭ−酸化グルタチオン、１０ｍＭ−ＣａＣｌ２（濃度はそれぞれ終濃度である）を添加する。
【００４７】
次に、リフォールディングされた本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）を、陰イオン交換カラム（DEAE-Sepharose（商品名）、HiTrrapQ HP（商品名）、ResourceQ（商品名）)、で分離し、精製する。
【００４８】
次に、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）の耐熱性及び耐過酸化水素性を評価した（実施例）。
【００４９】
前記耐熱性の評価は、まず、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）４８ｎＭを、１０ｍＭ−酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び１ｍＭ−ＣａＣｌ２からなる溶液中、３７℃及び４２℃の温度でそれぞれインキュベートした。次に、インキュベート開始後、０分後、２分後、５分後、１０分後、１５分後に、インキュベートされた本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）８ｎＭを、５０ｍＭ−マロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）、１．２ｍＭ−ＭｎＳＯ４、０．１ｍＭ−Ｈ２Ｏ２を含む溶液に加えて、測定液を調製した。
【００５０】
前記測定液中で、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）はＭｎ(III)を生成し、Ｍｎ(III)がマロン酸と錯体を形成する。そこで、次に、２７０ｎｍの波長の光線を用いて、前記測定液の吸光度を測定した。測定中の失活を防ぐために、測定温度は２５℃とした。２７０ｎｍの波長によるモル吸光係数ε２７０は、ε２７０＝８５００である。
【００５１】
各試料から得られた初速により、それぞれのインキュベート時間における比活性（μモル／ｍｇ分）を算出した。インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００５２】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフについて、インキュベート温度３７℃の場合を図２（ａ）に、４２℃の場合を図３（ａ）にそれぞれ示す。
【００５３】
また、図２（ａ）及び図３（ａ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００５４】
また、前記耐過酸化水素性の評価は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）４８ｎＭを、ｐＨ６．０の０．１ｍＭ−Ｈ２Ｏ２溶液中、２５℃の温度でインキュベートした以外は、前記耐熱性の評価と全く同一にして、測定液の吸光度を測定することにより行った。
【００５５】
各試料から得られた初速により、それぞれのインキュベート時間における比活性（μモル／ｍｇ分）を算出した。インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性の値を表３に示す。
【００５６】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフを図４（ａ）に示す。また、図４（ａ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度を表３に示す。
【００５７】
次に、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）に代えて野生型のＭｎＰ１を用いた以外は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）の場合と全く同一にして野生型のＭｎＰ１の耐熱性及び耐過酸化水素性を評価した（比較例１）。
【００５８】
前記耐熱性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００５９】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフについて、インキュベート温度３７℃の場合を図２（ｂ）に、４２℃の場合を図３（ｂ）にそれぞれ示す。
【００６０】
また、図２（ｂ）及び図３（ｂ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００６１】
また、前記耐過酸化水素性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性の値を表３に示す。
【００６２】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフを図４（ｂ）に示す。また、図４（ｂ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度を表３に示す。
【００６３】
次に、前記野生型ＭｎＰ１のアミノ酸配列（配列番号４）中、２３８番目のＭ（メチオニン）を、Ｆ（フェニルアラニン）にアミノ酸置換したアミノ酸配列（配列番号７）を備えるＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）を作成した。前記ＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）は、配列番号８で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。前記ＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）は、野生型ＭｎＰ１の遺伝子がコードされたプラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）に、２３８番目のＭをＦにアミノ酸置換した変異を導入してベクターとする以外は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）と全く同一にして作成することができる。
【００６４】
次に、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）に代えて、ＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）を用いた以外は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）の場合と全く同一にしてＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）の耐熱性及び耐過酸化水素性を評価した（比較例２）。
【００６５】
前記耐熱性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００６６】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフについて、インキュベート温度３７℃の場合を図２（ｃ）に、４２℃の場合を図３（ｃ）にそれぞれ示す。
【００６７】
また、図２（ｃ）及び図３（ｃ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。
【００６８】
前記過酸化水素性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性の値を表３に示す。
【００６９】
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフを図４（ｃ）に示す。また、図４（ｃ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度を表３に示す。
【００７０】
【表１】
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
表１〜２及び図２〜３に示すように、本実施例のＭｎＰ変異体は、野生型ＭｎＰ（比較例１）又は２３８番目のＭをＦにアミノ酸置換したＭｎＰ変異体（比較例２）よりも優れた耐熱性を備えていることが明らかである。
【００７４】
また、表３及び図４に示すように、本実施例のＭｎＰ変異体は、野生型ＭｎＰ（比較例１）又は２３８番目のＭをＦにアミノ酸置換したＭｎＰ変異体（比較例２）よりも優れた耐過酸化水素性を備えていることが明らかである。
【００７５】
次に、本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法について説明する。
【００７６】
本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法は、リグノセルロース系バイオマスを基質として、該基質を糖化酵素により糖化し、得られた糖化溶液を発酵させてバイオエタノールを製造する際に、前処理として該基質のリグニンを除去する方法である。前記リグノセルロース系バイオマスとしては、木材、稲藁、麦藁、バガス、竹、パルプ及びこれらから生じる廃棄物例えば古紙等を挙げることができ、例えば、稲藁を用いることができる。
【００７７】
本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記リグノセルロース系バイオマスとして稲藁を用いる場合には、まず、カッターミル等により約３ｍｍの長さに粉砕された稲藁に水を添加して、例えば５質量％の濃度の混合液を調製する。
【００７８】
次に、前記混合液に、その全量に対し０．１〜０．５μＭの範囲のリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）を添加する。前記ＬｉＰは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型ＬｉＰにおいて、２４０番目のＨ（ヒスチジン）をＦ（フェニルアラニン）に、２４１番目のＴ（トレオニン）をＬ（ロイシン）に、２４２番目のＩ（イソロイシン）をＬ（ロイシン）に、それぞれアミノ酸置換したＬｉＰ変異体であることが好ましい。前記野生型ＬｉＰは、配列番号４で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００７９】
前記ＬｉＰ変異体は、耐熱性及び耐過酸化水素性を備えている。そこで、前記ＬｉＰ変異体が添加された混合液を、０．１〜０．５ｍＭの過酸化水素の存在下、２５〜３０℃の範囲の温度に、１〜１２０時間の範囲の時間保持することにより、前記稲藁のリグニンを分解し、細胞壁を破壊することができる。
【００８０】
次に、前記混合液に、その全量に対し０．１〜０．５μＭの範囲の本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ、先祖型ＭｎＰ変異体）を添加する。本実施形態のＭｎＰ変異体は、前述のように耐熱性及び耐過酸化水素性を備えている。
【００８１】
そこで、本実施形態のＭｎＰ変異体が添加された混合液を、０．１〜０．５ｍＭの過酸化水素の存在下、３７〜４２℃の範囲の温度に、１〜１２０時間の範囲の時間保持することにより、前記稲藁に含まれるＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化することができる。生成したＭｎ（III）は、前記ＬｉＰ変異体により破壊された細胞壁から、前記稲藁の内部に侵入し、該稲藁に含まれる不飽和脂肪酸と錯体を形成する。そして、前記錯体が前記稲藁のリグニンをさらに分解する。
【００８２】
また、本実施形態のＭｎＰ変異体によれば、それ自体が前記リグニンの分解を行うことはなく、該ＭｎＰ変異体により酸化されたＭｎ（III）が前記リグニンの分解に関与する。従って、前記ＭｎＰ変異体自体から離間した部位で前記リグニンの分解を行うことができる。
【００８３】
本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法により処理された前記混合液は、前記リグニンの分解後、さらに糖化酵素を添加することにより、前記稲藁に含まれるセルロース及びヘムセルロースを糖化して、糖化溶液とすることができる。また、前記糖化溶液は、バイオエタノールの原料として用いることができる。
【００８４】
尚、本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記ＭｎＰ変異体に代えて、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質を用いてもよく、前記ＭｎＰ変異体と同一の作用効果を奏することができる。
【００８５】
また、本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記ＬｉＰ変異体に代えて、野生型ＬｉＰ等の他のリグニンペルオキシダーゼを用いてもよい。ただし、この場合には、前記ＬｉＰ変異体よりも耐熱性又は耐過酸化水素性が低く、本実施形態のＭｎＰ変異体と同一条件で用いることが難しくなることがある。
【００８６】
また、本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記混合液に前記ＬｉＰ変異体を添加した後、本実施形態のＭｎＰ変異体を添加するようにしているが、前記ＬｉＰ変異体と本実施形態のＭｎＰ変異体とを同時に添加するようにしてもよい。
【符号の説明】
【００８７】
１…野生型ＭｎＰ、 ２…野生型ＬｉＰ、 ３…子のう菌由来ＬｉＰ、 ４…ＶＰ、 ５…ＭｎＰ、 ６…ＬｉＰ、 Ａ…分岐点。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型マンガンペルオキシダーゼのアミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸をより疎水性の大きなアミノ酸で置換したことを特徴とするマンガンペルオキシダーゼ変異体。
【請求項２】
請求項１記載のマンガンペルオキシダーゼ変異体であって、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることを特徴とするマンガンペルオキシダーゼ変異体。
【請求項３】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項４】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項５】
請求項４記載の遺伝子において、配列番号２で表される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
【請求項６】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターにおいて、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項８】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体において、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子を含有する組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項１０】
リグノセルロース系バイオマスからリグニンを分解して除去するリグノセルロース系バイオマスの前処理方法であって、
リグノセルロース系バイオマスに、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質と、リグニンペルオキシダーゼとを添加することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの前処理方法。
【請求項１１】
請求項１０記載のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法において、
前記リグノセルロース系バイオマスに、前記リグニンペルオキシダーゼを添加した後、前記配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質を添加することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの前処理方法。
【請求項１２】
請求項１０又は請求項１１記載のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法において、
前記リグニンペルオキシダーゼは、配列番号３で表される第３のアミノ酸配列、又は第３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第４のアミノ酸配列からなるリグニンペルオキシダーゼ変異体であることを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの前処理方法。
【請求項１】
野生型マンガンペルオキシダーゼのアミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸をより疎水性の大きなアミノ酸で置換したことを特徴とするマンガンペルオキシダーゼ変異体。
【請求項２】
請求項１記載のマンガンペルオキシダーゼ変異体であって、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることを特徴とするマンガンペルオキシダーゼ変異体。
【請求項３】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項４】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項５】
請求項４記載の遺伝子において、配列番号２で表される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
【請求項６】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターにおいて、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項８】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体において、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子を含有する組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項１０】
リグノセルロース系バイオマスからリグニンを分解して除去するリグノセルロース系バイオマスの前処理方法であって、
リグノセルロース系バイオマスに、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質と、リグニンペルオキシダーゼとを添加することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの前処理方法。
【請求項１１】
請求項１０記載のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法において、
前記リグノセルロース系バイオマスに、前記リグニンペルオキシダーゼを添加した後、前記配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質を添加することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの前処理方法。
【請求項１２】
請求項１０又は請求項１１記載のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法において、
前記リグニンペルオキシダーゼは、配列番号３で表される第３のアミノ酸配列、又は第３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第４のアミノ酸配列からなるリグニンペルオキシダーゼ変異体であることを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの前処理方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１７５９１１（Ｐ２０１２−１７５９１１Ａ）
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３９９９０（Ｐ２０１１−３９９９０）
【出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【出願人】（５９２０６８２００）学校法人東京薬科大学 (32)
【出願人】（０００００５３２６）本田技研工業株式会社 (23,863)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【出願人】（５９２０６８２００）学校法人東京薬科大学 (32)
【出願人】（０００００５３２６）本田技研工業株式会社 (23,863)
【Ｆターム（参考）】
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