【課題】簡便なミゾリビン及び／又はリバビリンを測定する方法を提供する方法等を提供することを課題とした。
【解決手段】ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する反応を触媒し得る第一の酵素と該第一の反応とは別異の第二の反応を触媒し得る第二の酵素であり、その第二の反応は、ミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される反応である該第二の反応を触媒し得る第二の酵素を用いて簡便なミゾリビン及び／又はリバビリンを測定する方法が提供できる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はミゾリビン及び／又はリバビリンを測定する方法、及びそのリン酸化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
４−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−１−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ−５−ｏｌａｔｅ（5-Hydroxy-1-β-D-ribofuranosyl-1H-imidazole-4-carboxamideともいう、以下ミゾリビン（Ｍｉｚｏｒｉｂｉｎｅ）と記載する場合がある)は、腎移植における拒絶反応の抑制等に有用性が認められ、既に市販されている免疫抑制剤である（特許文献１、２）。
また、ミゾリビンについては種々のメカニズムの研究が行われている（非特許文献１）。なお、従来のミゾリビンの測定方法としては、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定方法が知られている（非特許文献２）。
【０００３】
１−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉ−ａｚｏｌｅ−３−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ（以下リバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）と記載する場合がある）は、インターフェロンαとの併用によりＣ型慢性肝炎等の治療効果を向上させる、既に市販されている抗ウィルス薬である。従来のリバビリンの測定方法としては、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定方法が知られている（非特許文献３、４）。
また、後述するが本件発明の第一の酵素の好ましい例として挙げられているBurkholderia thailandensis由来の蛋白質の情報としてその塩基配列やリボキナーゼかも知れない旨の開示がある（非特許文献５）。
【特許文献１】USP3888843
【特許文献２】USP5442051
【非特許文献１】Pediatr． Int., 44, 196-198, 2002年
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ．、２２２巻、１５６頁、１９８１年
【非特許文献３】Ｙｅｈ Ｌ． Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｓｃｉ．、４１巻、２５５頁、２００３年
【非特許文献４】Ｙｅｈ Ｌ． Ｔ．ら、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ．、４３巻、１０５７頁、２００７年
【非特許文献５】BMC Genomics 6, 174-187, 2005年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
簡便なミゾリビン及び／又はリバビリンを測定する方法を提供する事を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決する為に本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ミゾリビン及び／又はリバビリンを効率的にリン酸化する第一の反応を触媒し得る第一の酵素を新たに見出し、ミゾリビン及び／又はリバビリンのリン酸化方法を完成した。更に、該第一の酵素を用いるミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法を完成するに至った。すなわち、この第一の酵素に加えて、該第一の反応とは別異の第二の反応であって、ミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される反応である該第二の反応を触媒し得る第二の酵素を利用したミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法、及びその組成物を創出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下に関する。
［０］下記（１）の工程を含むミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
（１）ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る第一の酵素の存在下、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する第一の反応を含む工程。
［１］下記（１）、（２）及び（３）の各工程を含む［０］に記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
（１）ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る第一の酵素の存在下、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する第一の反応を含む工程、
（２）上記第一の反応とは別異の反応であって以下＜ａ＞〜＜ｃ＞のいずれかの第二の反応を触媒し得る第二の酵素の存在下、第二の反応を進行させるに際して、上記第一の反応の結果生じた該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンと第二の酵素を接触させて該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの存在量に応じて第二の反応が阻害される工程、
＜ａ＞ミゾリビンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビンで阻害される反応
＜ｂ＞リバビリンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化リバビリンで阻害される反応
＜ｃ＞ミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される反応
（３）第二の反応の阻害程度を検出する工程。
［１−１］下記（１）、（２）及び（３）の各工程を含む［０］または［１］に記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
（１）ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る第一の酵素の存在下、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する第一の反応を含む工程、
（２）上記第一の反応とは別異の反応であって、ミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される第二の反応を進行させるに際して、上記第一の反応の結果生じた該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンと第二の酵素を接触させて該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの存在量に応じて第二の反応が阻害される工程、
（３）第二の反応の阻害程度を検出する工程。
［１−１−１］上述の（２）工程が、以下である［１−１］に記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
（２）上記第一の反応とは別異の反応であって、以下＜ａ＞〜＜ｃ＞のいずれかの第二の反応を触媒し得る第二の酵素、
＜ａ＞ミゾリビンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビンで阻害される反応
＜ｂ＞リバビリンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化リバビリンで阻害される反応
＜ｃ＞ミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される反応。
［１−２］第一の酵素が、〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素、〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素、又は、〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、のいずれかの酵素である［０］、［１］〜［１−１］のいずれかに記載の測定方法。
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；または、
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応、又はリバビリンをリン酸化リバビリンとする反応の少なくともいずれかの反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［１−３］第一の酵素が、配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素である［０］、［１］〜［１−２］のいずれかに記載の測定方法。
［１−４］第一の酵素が、配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素、のいずれかの酵素である［０］、［１］〜［１−３］のいずれかに記載の測定方法。
［１−５］第一の酵素をコードする塩基配列が、配列表配列番号２で表される塩基配列である［０］、［１］〜［１−４］のいずれかに記載の測定方法。
［１−６］第一の酵素が、下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素である［０］、［１］〜［１−５］のいずれかに記載の測定方法。
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；または、
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応、又はリバビリンをリン酸化リバビリンとする反応の少なくともいずれかの反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［１−７］該リン酸供与体が、ＡＴＰである［１−６］に記載の測定方法。
［１−８］第一の酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属由来である［０］、［１］〜［１−７］のいずれかに記載の測定方法。
［１−９］第一の酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ由来である［０］、［１］〜［１−８］のいずれかに記載の測定方法。
［１−１０］第一の酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株由来である［０］、［１］〜［１−９］のいずれかに記載の測定方法。
［１−１１］第一の酵素の、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、約３４ｋＤａである［０］、［１］〜［１−１０］のいずれかに記載の測定方法。
［１−１２］第二の酵素が、リン酸化ミゾリビンで阻害される、リン酸化リバビリンで阻害される、又はリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される酵素である［０］、［１］〜［１−１１］のいずれかに記載の測定方法。
［１−１３］第二の酵素が、リン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される酵素である［０］、［１］〜［１−１２］のいずれかに記載の測定方法。
［１−１４］第二の酵素が、イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼである［０］、［１］〜［１−１３］のいずれかに記載の測定方法。
［１−１５］第二の酵素が、《１》配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列からなり、イノシン５’一リン酸を酸化し得る酵素、《２》配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号１１のアミノ酸配列及び配列表配列番号１２のアミノ酸配列を含む、イノシン５’一リン酸を酸化し得る酵素、又は、《３》下記の＜ｉ＞〜＜ｖ＞の理化学的性質を有する酵素、のいずれかの酵素である［０］、［１］〜［１−１４］のいずれかに記載の測定方法。
＜ｉ＞作用
ＮＡＤ（Ｐ）類とイノシン５’一リン酸に作用して、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とキサントシン５’一リン酸を生ずる反応を触媒する；
＜ｉｉ＞至適ｐＨ
ｐＨ８〜９；
＜ｉｉｉ＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１１の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜ｉｖ＞熱安定性
１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７の水溶液中、６０℃、３０分間の熱処理で８５％以上の活性を保持する；
＜ｖ＞阻害作用
少なくとも、リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンで作用が阻害される；
［１−１６］第二の酵素が、更に、下記の＜ｖｉ＞の理化学的性質を有する酵素である［０］、［１］〜［１−１５］のいずれかに記載の測定方法。
＜ｖｉ＞分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、５２〜５４ｋＤａ；
［１−１７］第二の酵素が、配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列からなり、イノシン５’一リン酸を酸化し得る酵素である［０］、［１］〜［１−１６］のいずれかに記載の測定方法。
［１−１８］第二の酵素が、配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号１１のアミノ酸配列及び配列表配列番号１２のアミノ酸配列を含む、イノシン５’一リン酸を酸化し得る酵素である［０］、［１］〜［１−１７］のいずれかに記載の測定方法。
［１−１９］第二の酵素をコードする塩基配列が、配列表配列番号８又は配列表配列番号１０で表される塩基配列である［０］、［１］〜［１−１８］のいずれかに記載の測定方法。
［１−２０］第二の酵素が、下記の＜ｉ＞〜＜ｖ＞の理化学的性質を有する酵素である［０］、［１］〜［１−１９］のいずれかに記載の測定方法。
＜ｉ＞作用
ＮＡＤ（Ｐ）類とイノシン５’一リン酸に作用して、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とキサントシン５’一リン酸を生ずる反応を触媒する；
＜ｉｉ＞至適ｐＨ
ｐＨ８〜９；
＜ｉｉｉ＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１１の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜ｉｖ＞熱安定性
１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７の水溶液中、６０℃、３０分間の熱処理で８５％以上の活性を保持する；
＜ｖ＞阻害作用
少なくとも、リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンで作用が阻害される；
［１−２１］第二の酵素が、更に、下記の＜ｖｉ＞の理化学的性質を有する酵素である［０］、［１］〜［１−２０］のいずれかに記載の測定方法。
＜ｖｉ＞分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、５２〜５４ｋＤａ；
［１−２２］第二の酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来である［０］、［１］〜［１−２１］のいずれかに記載の測定方法。
［１−２３］第二の酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ由来である［０］、［１］〜［１−２２］のいずれかに記載の測定方法。
［１−２４］第二の酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株由来である［０］、［１］〜［１−２３］のいずれかに記載の測定方法。
［１−２５］（１）の工程が、更に、リン酸供与体を含む工程である［０］、［１］〜［１−２４］のいずれかに記載の測定方法。
［１−２６］（１）の工程が、更に、金属イオンを含む工程である［０］、［１］〜［１−２５］のいずれかに記載の測定方法。
［１−２７］該リン酸供与体がＡＴＰである［１−２６］に記載の測定方法。
［１−２８］金属イオンがマグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン及びマンガンイオンのうち、いずれか１つ以上である[１−２７]に記載の測定方法。
［１−２９］（２）の工程が、更に、イノシン５’一リン酸を含む工程である［０］、［１］〜［１−２８］のいずれかに記載の測定方法。
［１−３０］（２）の工程が、更に、ＮＡＤ（Ｐ）類を含む工程である［０］、［１］〜［１−２９］のいずれかに記載の測定方法。
［１−３１］該リン酸化ミゾリビンとリン酸化リバビリンが、モノリン酸化ミゾリビンとモノリン酸化リバビリンである［０］、［１］〜［１−３０］のいずれかに記載の測定方法。
［１−３２］（３）の工程における阻害程度の検出が、第二の酵素の反応速度を測定する工程である［０］、［１］〜［１−３１］のいずれかに記載の測定方法。
［１−３３］（３）の工程における阻害程度の検出が、ＮＡＤ（Ｐ）類の変化量を測定する工程である［０］、［１］〜［１−３２］のいずれかに記載の測定方法。
［１−３４］（３）の工程における阻害程度の検出が、工程（１）及び（２）で処理した後の既知量のミゾリビン及び／又はリバビリンと、測定対象の変化量を検出して比較し、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンを定量する工程である［０］、［１］〜［１−３３］のいずれかに記載の測定方法。
［２］下記（１）、（２）及び（３）の各工程を含むミゾリビンの測定方法。
（１）ミゾリビンをリン酸化し得る酵素の存在下、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビンをリン酸化する第一の反応を含む工程、
（２）上記第一の反応とは別異の反応であって、ミゾリビンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビンで阻害される反応である該第二の反応を触媒し得る第二の酵素の存在下、第二の反応を進行させるに際して、上記第一の反応の結果生じた該リン酸化ミゾリビンと第二の酵素を接触させて該リン酸化ミゾリビンの存在量に応じて第二の反応が阻害される工程、
（３）第二の反応の阻害程度を検出する工程。
［２−１］上記［０］、［１］〜［１−３４］に記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［２］に記載のミゾリビンの測定方法。
［３］下記（１）、（２）及び（３）の各工程を含むリバビリンの測定方法。
（１）リバビリンをリン酸化し得る第一の酵素の存在下、試料中に含まれている可能性のあるリバビリンをリン酸化する第一の反応を含む工程、
（２）上記第一の反応とは別異の反応であって、リバビリンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化リバビリンで阻害される反応である該第二の反応を触媒し得る第二の酵素の存在下、第二の反応を進行させるに際して、上記第一の反応の結果生じた該リン酸化リバビリンと第二の酵素を接触させて該リン酸化リバビリンの存在量に応じて第二の反応が阻害せしめられる工程、
（３）第二の反応の阻害程度を検出する工程。
［３−１］上記［０］、［１］〜［１−３４］に記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［３］に記載のリバビリンの測定方法。
［４］下記（ａ）〜（ｃ）の各工程を含むミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
（ａ）下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素と、ＡＴＰの存在下、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとＡＤＰとする反応Ｉを含む工程、
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともＡＴＰ存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとＡＤＰとする反応を触媒する；または、
少なくともATP存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応、又はリバビリンをリン酸化リバビリンとする反応の少なくともいずれかの反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
（ｂ）上記反応Ｉとは別異の反応ＩＩ又は複数の反応ＩＩを触媒する酵素Ｂ又は複数の酵素Ｂの存在下、上記反応Ｉにより生ずるＡＤＰの量に応じて反応ＩＩにより生じる測定対象の変化を生じさせる工程、
（ｃ）該測定対象の変化量を検出し、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンの量を測定する工程、
［４−１］該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンが、モノリン酸化ミゾリビン及び／又はモノリン酸化リバビリンである［４］に記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［４−２］（ａ）工程における該酵素が、配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる酵素である［４］〜［４−１］のいずれかに記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［４−３］（ａ）工程における該酵素が、配列表配列番号１のアミノ酸配列における１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素である［４］〜［４−２］のいずれかに記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［４−４］（ａ）工程における該酵素が、配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素である［４］〜［４−３］のいずれかに記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［４−５］（ａ）工程における該酵素が、下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素である［４］〜［４−４］のいずれかに記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
＜１＞作用
少なくともＡＴＰ存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとＡＤＰとする反応を触媒する；または、
少なくともATP存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応、又はリバビリンをリン酸化リバビリンとする反応の少なくともいずれかの反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［４−６］（ａ）工程における該酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ由来である［４］〜［４−５］のいずれかに記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［４−７］（ａ）工程における該酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株由来である［４］〜［４−６］のいずれかに記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［４−８］（ａ）工程における該酵素が、少なくともマグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン又はマンガンイオンを利用する［４］〜［４−７］のいずれかに記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［４−９］（ｂ）工程において、（ｂ−１）ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの存在下、該反応ＩＩがグルコースとＡＤＰをグルコース−６−リン酸とＡＭＰとする反応と、（ｂ−２）グルコース−６−リン酸脱水素酵素の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）類及び前記反応により生ずるグルコース−６−リン酸を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とグルクノラクトン−６−リン酸とする反応を含み、上記反応Ｉにより生ずるＡＤＰの量に応じてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が増加しており、（ｃ）工程において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量を検出する工程、である［４］〜［４−８］のいずれかに記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［４−１０］（ｂ）工程において、（ｂ−１）ピルビン酸キナーゼの存在下、ＡＤＰとホスソエノールピルビン酸（本明細書ではＰＥＰと記載する場合がある）をＡＴＰとピルビン酸に変化させる反応と、（ｂ−２）乳酸脱水素酵素の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類及び前記の反応により生ずるピルビン酸を、ＮＡＤ（Ｐ）類と乳酸とする反応を含み、上記反応Ｉにより生ずるＡＤＰの量に応じてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が減少しており、（ｃ）工程において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の減少量を検出する工程、である［４］〜［４−９］のいずれかに記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［４−１１］（ｂ）工程において、（ｂ−１）ピルビン酸キナーゼの存在下、ＡＤＰとＰＥＰをピルビン酸とＡＴＰに変化させる反応と、（ｂ−２）ピルビン酸オキシダーゼの存在下、酸素、リン酸及び前記の反応により生ずるピルビン酸を、過酸化水素とアセチルリン酸とする反応を含み、上記反応Ｉにより生ずるＡＤＰの量に応じて過酸化水素が増加しており、（ｃ）工程において、過酸化水素の量を過酸化水素指示薬等で検出する工程、である［４］〜［４−１０］のいずれかに記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［４−１２］（ｃ）工程における変化量の検出が、工程（ａ）及び（ｂ）で処理した後の既知量の該ミゾリビン及び／又はリバビリンと、測定対象の変化量を検出して比較し、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンを定量する工程である［４］〜［４−１１］のいずれかのミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［４−１３］該酵素の、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、約３４ｋＤａである［４］〜［４−１２］のいずれかのミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
［５］下記（ａ）〜（ｃ）の各工程を含むミゾリビンの測定方法。
（ａ）下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素と、ＡＴＰの存在下、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとＡＤＰとする反応Ｉを含む工程、
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともＡＴＰ存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとＡＤＰとする反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
（ｂ）上記反応Ｉとは別異の反応ＩＩ又は複数の反応ＩＩを触媒する酵素Ｂ又は複数の酵素Ｂの存在下、上記反応Ｉにより生ずるＡＤＰの量に応じて反応ＩＩにより生じる測定対象の変化を生じさせる工程、
（ｃ）該測定対象の変化量を検出し、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビンの量を測定する工程、
［５−１］上記［４］〜［４−１３］に記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［５］に記載の測定方法。
［６］下記（ａ）〜（ｃ）の各工程を含むリバビリンの測定方法。
（ａ）下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素と、ＡＴＰの存在下、試料中に含まれている可能性のあるリバビリンをリン酸化リバビリンとＡＤＰとする反応Ｉを含む工程、
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、リバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、リバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともＡＴＰ存在下で、リバビリンをリン酸化リバビリンとＡＤＰとする反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
（ｂ）上記反応Ｉとは別異の反応ＩＩ又は複数の反応ＩＩを触媒する酵素Ｂ又は複数の酵素Ｂの存在下、上記反応Ｉにより生ずるＡＤＰの量に応じて反応ＩＩにより生じる測定対象の変化を生じさせる工程、
（ｃ）該測定対象の変化量を検出し、試料中に含まれている可能性のあるリバビリンの量を測定する工程、
［６−１］上記［４］〜［４−１３］に記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［６］に記載の測定方法。
［７］下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素を用いる、ミゾリビン及び／又はリバビリンのリン酸化方法。
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；または、
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応、又はリバビリンをリン酸化リバビリンとする反応の少なくともいずれかの反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［７−１］該リン酸供与体がＡＴＰである［７］に記載のリン酸化方法。
［７−２］該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンが、モノリン酸化ミゾリビン及び／又はモノリン酸化リバビリンである、［７］〜［７−１］のいずれかに記載のリン酸化方法。
［７−３］ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が約３４ｋＤａである、［７］〜［７−２］のいずれかに記載のリン酸化方法。
［７−４］配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる酵素を用いる、［７］〜［７−３］のいずれかに記載のリン酸化方法。
［７−５］配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素を用いる、［７］〜［７−４］のいずれかに記載のリン酸化方法。
［７−６］該酵素をコードする塩基配列が、配列表配列番号２で表される塩基配列である［７］〜［７−５］のいずれかに記載のリン酸化方法。
［７−７］下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素を用いる、[７]〜［７−６］のいずれかに記載のリン酸化方法。
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［７−８］該リン酸供与体が、ＡＴＰである［７−７］に記載のリン酸化方法。
［７−９］該蛋白質の、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、約３４ｋＤａである［７］〜［７−８］のいずれかに記載のリン酸化方法。
［７−１０］該酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属由来である［７］〜［７−９］のいずれかに記載のリン酸化方法。
［７−１１］該酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ由来である［７］〜［７−１０］のいずれかに記載のリン酸化方法。
［７−１２］該酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株由来である［７］〜［７−１１］のいずれかに記載のリン酸化方法。
［８］下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素を用いる、ミゾリビンのリン酸化方法。
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［８−１］上記［７］〜［７−１２］に記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［８］に記載のミゾリビンのリン酸化方法。
［９］下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素を用いる、リバビリンのリン酸化方法。
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、リバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、リバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、リバビリンをリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［９−１］上記［７］〜［７−１２］に記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［９］に記載のリバビリンのリン酸化方法。
［１０］下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素を用いる、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとするリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの製造方法。
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；または、
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応、又はリバビリンをリン酸化リバビリンとする反応の少なくともいずれかの反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［１０−１］上記［７］〜［７−１２］に記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［１０］に記載の製造方法。
［１１］下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素を用いる、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとするリン酸化ミゾリビンの製造方法。
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［１１−１］上記［７］〜［７−１２］に記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［１１］に記載の製造方法。
［１２］下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素を用いる、リバビリンをリン酸化リバビリンとするリン酸化リバビリンの製造方法。
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、リバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、リバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、リバビリンをリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［１２−１］上記［７］〜［７−１２］に記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［１２］に記載の製造方法。
［１３］下記の成分を含む組成物。
（Ａ１）ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する第一の反応を触媒し得る第一の酵素
（Ａ２）リン酸供与体
（Ａ３）金属イオン
（Ａ４−１）上記第一の反応とは別異の反応であって以下＜ａ＞〜＜ｃ＞のいずれかの第二の反応を触媒し得る第二の酵素、
＜ａ＞ミゾリビンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビンで阻害される反応
＜ｂ＞リバビリンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化リバビリンで阻害される反応
＜ｃ＞ミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される反応
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
［１３−０−１］ミゾリビン及び／又はリバビリン測定用である［１３］に記載の組成物。
［１３−０−２］下記の（Ａ）と（Ｂ）を含むミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物。
（Ａ）少なくとも以下の（Ａ１）〜（Ａ４）を含む第１の試薬。
（Ａ１）有効量のミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する第一の反応を触媒し得る第一の酵素
（Ａ２）リン酸供与体
（Ａ３）金属イオン
（Ａ４）第一の反応とは別異の第二の反応を触媒し有効量のリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンで阻害される第二の酵素、イノシン５’一リン酸及びＮＡＤ（Ｐ）類のうちいずれか１つ又は２つの成分
（Ｂ）少なくとも有効量のリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンで阻害される第二の酵素、イノシン５’一リン酸、及びＮＡＤ（Ｐ）類のうち、第１の試薬には含まれない成分を含む第２の試薬。
［１３−０−３］下記の成分を含むミゾリビン測定用の組成物である［１３］に記載の組成物。
（Ａ１）ミゾリビンをリン酸化する第一の反応を触媒し得る第一の酵素
（Ａ２）リン酸供与体
（Ａ３）金属イオン
（Ａ４−１）上記第一の反応とは別異の第二の反応を触媒し、ミゾリビンには阻害されず、リン酸化ミゾリビンで阻害される第二の酵素
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び、
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
［１３−０−４］下記の成分を含むリバビリン測定用の組成物である［１３］に記載の組成物。
（Ａ１）リバビリンをリン酸化する第一の反応を触媒し得る第一の酵素
（Ａ２）リン酸供与体
（Ａ３）金属イオン
（Ａ４−１）上記第一の反応とは別異の第二の反応を触媒し、リバビリンには阻害されず、リン酸化リバビリンで阻害される第二の酵素
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
［１３−０−５］下記の成分を含むリン酸化ミゾリビン測定用の組成物である［１３］に記載の組成物。
（Ａ４−１）上記第一の反応とは別異の第二の反応を触媒し、リン酸化ミゾリビンで阻害される第二の酵素
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び、
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
［１３−０−６］下記の成分を含むリン酸化リバビリン測定用の組成物である［１３］に記載の組成物。
（Ａ４−１）上記第一の反応とは別異の第二の反応を触媒し、リン酸化リバビリンで阻害される第二の酵素
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
［１３−０−７］該測定用の組成物において、下記の３成分のうち、いずれかひとつ以上が測定直前に合一される［１３］〜［１３−０−６］のいずれかに記載の組成物。
（Ａ４−１）第二の酵素、
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
［１３−１］該リン酸供与体がＡＴＰである［１３］に記載の組成物。
［１３−２］金属イオンがマグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン及びマンガンイオンのうちいずれか１つ以上である［１３］〜［１３−１］に記載の組成物。
［１３−３］下記の（Ａ）と（Ｂ）を含むミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物。
（Ａ）少なくとも以下の（Ａ１）〜（Ａ４）を含む第１の試薬。
（Ａ１）有効量のミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る第一の酵素
（Ａ２）リン酸供与体
（Ａ３）金属イオン
（Ａ４）有効量のリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンで阻害される第二の酵素、及びＮＡＤ（Ｐ）類を含む第１の試薬
（Ｂ）少なくとも有効量のイノシン５’一リン酸を含む第２の試薬。
［１３−４］該リン酸供与体がＡＴＰである［１３−３］に記載の組成物。
［１３−５］金属イオンがマグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン及びマンガンイオンのうちいずれか１つ以上である［１３−３］〜［１３−４］のいずれに記載の組成物。
［１３−６］更に下記（Ｃ）を含む［１３］〜［１３−５］のいずれかに記載の組成物。
（Ｃ）少なくとも既知量のミゾリビン及び／又はリバビリンを含むキャリブレーション試薬。
［１３−７］第一の酵素が、〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなる酵素、〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む酵素、又は、〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、のいずれかである［１３］〜［１３−６］のいずれかに記載の組成物。
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；または、
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応、又はリバビリンをリン酸化リバビリンとする反応の少なくともいずれかの反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［１３−８］第一の酵素が、配列表配列番号１のアミノ酸配列からなる酵素である［１３］〜［１３−７］のいずれかに記載の組成物。
［１３−９］第一の酵素が、配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む酵素である［１３］〜［１３−８］のいずれかに記載の組成物。
［１３−１０］第一の酵素をコードする塩基配列が、配列表配列番号２で表される塩基配列である［１３］〜［１３−９］のいずれかに記載の組成物。
［１３−１１］第一の酵素が下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素である、［１３］〜［１３−１０］のいずれかに記載の組成物。
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；または、
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応、又はリバビリンをリン酸化リバビリンとする反応の少なくともいずれかの反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［１３−１２］該リン酸供与体が、ＡＴＰである［１３−１１］に記載の組成物。
［１３−１３］該リン酸化ミゾリビンとリン酸化リバビリンが、モノリン酸化ミゾリビンとモノリン酸化リバビリンである［１３−１１］〜［１３−１２］のいずれかに記載の組成物。
［１３−１４］第一の酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属由来である［１３］〜［１３−１３］のいずれかに記載の組成物。
［１３−１５］第一の酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ由来である［１３］〜［１３−１４］のいずれかに記載の組成物。
［１３−１６］第一の酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株由来である［１３］〜［１３−１５］のいずれかに記載の組成物。
［１３−１７］第二の酵素が、リン酸化ミゾリビンで阻害される、リン酸化リバビリンで阻害される、又はリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される酵素である［１３］〜［１３−１６］のいずれかに記載の組成物。
［１３−１８］第二の酵素が、リン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される酵素である［１３］〜［１３−１７］のいずれかに記載の組成物。
［１３−１９］第二の酵素が、イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼである［１３］〜［１３−１８］のいずれかに記載の組成物。
［１３−２０］第二の酵素が、《１》配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列からなり、イノシン５’一リン酸を酸化し得る酵素、《２》配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号１１のアミノ酸配列及び配列表配列番号１２のアミノ酸配列を含む、イノシン５’一リン酸を酸化し得る酵素、又は、《３》下記の＜ｉ＞〜＜ｖ＞の理化学的性質を有する酵素、のいずれかの酵素である［１３］〜［１３−１９］のいずれかに記載の組成物。
＜ｉ＞作用
ＮＡＤ（Ｐ）類とイノシン５’一リン酸に作用して、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とキサントシン５’一リン酸を生ずる反応を触媒する；
＜ｉｉ＞至適ｐＨ
ｐＨ８〜９；
＜ｉｉｉ＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１１の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜ｉｖ＞熱安定性
１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７の水溶液中、６０℃、３０分間の熱処理で８５％以上の活性を保持する；
＜ｖ＞阻害作用
少なくとも、リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンで作用が阻害される；
［１３−２１］第二の酵素が、更に、下記の＜ｖｉ＞の理化学的性質を有する酵素である［１３］〜［１３−２０］のいずれかに記載の組成物。
＜ｖｉ＞分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、５２〜５４ｋＤａ；
［１３−２２］第二の酵素が、配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列からなり、イノシン５’一リン酸を酸化し得る酵素である［１３］〜［１３−２１］のいずれかに記載の組成物。
［１３−２３］第二の酵素が、配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号１１のアミノ酸配列及び配列表配列番号１２のアミノ酸配列を含む、イノシン５’一リン酸を酸化し得る酵素である［１３］〜［１３−２２］のいずれかに記載の組成物。
［１３−２４］第二の酵素をコードする塩基配列が、配列表配列番号８又は配列表配列番号１０で表される塩基配列である［１３］〜［１３−２３］のいずれかに記載の組成物。
［１３−２５］第二の酵素が、下記の＜ｉ＞〜＜ｖ＞の理化学的性質を有する酵素である［１３］〜［１３−２４］のいずれかに記載の組成物。
＜ｉ＞作用
ＮＡＤ（Ｐ）類とイノシン５’一リン酸に作用して、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とキサントシン５’一リン酸を生ずる反応を触媒する；
＜ｉｉ＞至適ｐＨ
ｐＨ８〜９；
＜ｉｉｉ＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１１の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜ｉｖ＞熱安定性
１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７の水溶液中、６０℃、３０分間の熱処理で８５％以上の活性を保持する；
＜ｖ＞阻害作用
少なくとも、リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンで作用が阻害される；
［１３−２６］第二の酵素が、更に、下記の＜ｖｉ＞の理化学的性質を有する酵素である［１３］〜［１３−２５］のいずれかに記載の組成物。
＜ｖｉ＞分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、５２〜５４ｋＤａ；
［１３−２７］第二の酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来である［１３］〜［１３−２６］のいずれかに記載の組成物。
［１３−２８］第二の酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ由来である［１３］〜［１３−２７］のいずれかに記載の組成物。
［１３−２９］第二の酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株由来である［１３］〜［１３−２８］のいずれかに記載の組成物。
［１４］以下の〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素の製造方法であって、
該酵素をコードする塩基配列に基づき該酵素を形成する工程と、該酵素を取得する工程を含む該酵素の製造方法。
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素。
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；または、
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応、又はリバビリンをリン酸化リバビリンとする反応の少なくともいずれかの反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［１４−１］該酵素を形成させる工程が、該酵素をコードする塩基配列を含む細胞を用いることを含む［１４］に記載の製造方法。
［１４−２］該酵素を形成させる工程が、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いることを含む［１４］〜［１４−１］のいずれかに記載の製造方法。
［１４−３］該酵素を形成させる工程が、該酵素をコードする塩基配列を有する微生物を用いることを含む［１４］〜［１４−２］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］該酵素を形成させる工程が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属に属し、且つ、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする反応を触媒し得る酵素を産生する微生物を用いることを含む［１４］〜［１４−３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５−１］該酵素を形成させる工程が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓを用いることを含む［１４］〜［１５］のいずれかに記載の製造方法。
［１５−２］該酵素を形成させる工程が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株を用いることを含む［１４］〜［１５−１］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］該酵素が、配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素である［１４］〜［１５−２］のいずれかに記載の製造方法。
［１６−１］該酵素が、配列表配列番号１のアミノ酸配列における１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素である［１４］〜［１６］のいずれかに記載の製造方法。
［１６−２］該酵素が、配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素である［１４］〜［１６−１］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］該酵素をコードする塩基配列に基づき、該酵素を形成する工程において形成された該酵素を取得するに際して、酵素を精製し取得する工程をさらに含む［１４］〜［１６−２］のいずれかに記載の製造方法。
［１７−１］該酵素を形成させる工程が、該酵素をコードする塩基配列を含む細胞を用いることを含む［１４］〜［１７］のいずれかに記載の製造方法。
［１７−２］該酵素を形成させる工程が、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いることを含む［１４］〜［１７−１］のいずれかに記載の製造方法。
［１８］該酵素をコードする塩基配列が、配列表配列番号２で表される塩基配列である［１４］〜［１７−２］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］該酵素が下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素である、［１４］〜［１８］のいずれかに記載の製造方法。
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；または、
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応、又はリバビリンをリン酸化リバビリンとする反応の少なくともいずれかの反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
［１９−１］該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンがモノリン酸化ミゾリビン及び／又はモノリン酸化リバビリンである［１９］に記載の製造方法。
［１９−２］該リン酸供与体が、ＡＴＰである［１９］〜［１９−１］のいずれかに記載の製造方法。
［１９−３］該酵素の、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、約３４ｋＤａである［１４］〜［１９−２］のいずれかに記載の製造方法。
［２０］以下の《１》〜《３》のいずれかの酵素の製造方法であって、該酵素をコードする塩基配列に基づき該酵素を形成する工程と、該酵素を取得する工程を含む該酵素の製造方法。
《１》配列表配列番号９のアミノ酸配列からなり、イノシン５’一リン酸を酸化し得る酵素、
《２》配列表配列番号９のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号１１のアミノ酸配列及び配列表配列番号１２のアミノ酸配列を含む、イノシン５’一リン酸を酸化し得る酵素、
《３》下記の＜ｉ＞〜＜ｖ＞の理化学的性質を有する酵素、
＜ｉ＞作用
ＮＡＤ（Ｐ）類とイノシン５’一リン酸に作用して、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とキサントシン５’一リン酸を生ずる反応を触媒する；
＜ｉｉ＞至適ｐＨ
ｐＨ８〜９；
＜ｉｉｉ＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１１の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜ｉｖ＞熱安定性
１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７の水溶液中、６０℃、３０分間の熱処理で８５％以上の活性を保持する；
＜ｖ＞阻害作用
少なくとも、リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンで作用が阻害される；
［２０−１］《３》に規定する酵素が、更に、下記の＜ｖｉ＞の理化学的性質を有する酵素である［２０］に記載の製造方法。
＜ｖｉ＞分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、５２〜５４ｋＤａ；
［２０−２］該酵素を形成させる工程が、該酵素をコードする塩基配列を含む細胞を用いることを含む［２０］〜［２０−１］のいずれかに記載の製造方法。
［２０−３］該酵素を形成させる工程が、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いることを含む［２０］〜［２０−２］のいずれかに記載の製造方法。
［２０−４］該酵素を形成させる工程が、該酵素をコードする塩基配列を有する微生物を用いることを含む［２０］〜［２０−３］のいずれかに記載の製造方法。
［２０−５］該酵素を形成させる工程が、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物を用いることを含む［２０］〜［２０−４］のいずれかに記載の製造方法。
［２０−６］該酵素を形成させる工程が、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ株を用いることを含む［２０］〜［２０−５］のいずれかに記載の製造方法。
［２０−７］該酵素を形成させる工程が、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株を用いることを含む［２０］〜［２０−６］のいずれかに記載の製造方法。
［２０−８］該酵素をコードする塩基配列に基づき、該酵素を形成させる工程において形成された該酵素を取得するに際して、精製し取得する［２０］〜［２０−７］のいずれかに記載の製造方法。
［２０−９］該酵素を形成させる工程が、該酵素をコードする塩基配列を含む細胞を用いて、その細胞を用いることを含む［２０］〜［２０−８］のいずれかに記載の製造方法。
［２０−１０］該酵素を形成させる工程が、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いることを含む［２０］〜［２０−９］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］該酵素をコードする塩基配列が、配列表配列番号１０で表される塩基配列である［２０］〜［２０−１０］のいずれかに記載の製造方法。
［２２］下記『１』及び『２』の各工程を含むリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの測定方法。
『１』以下＜Ａ＞〜＜Ｃ＞のいずれかの第二の反応を触媒し得る第二の酵素の存在下、試料中に含まれている可能性のあるリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンと第二の酵素を接触させて該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの存在量に応じて第二の反応が阻害される工程、
＜Ａ＞試料中に含まれている可能性のあるリン酸化ミゾリビンで阻害される反応
＜Ｂ＞試料中に含まれている可能性のあるリン酸化リバビリンで阻害される反応
＜Ｃ＞試料中に含まれている可能性のあるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される反応
『２』第二の反応の阻害程度を検出する工程。
［２２−１］第二の酵素が、上記［１−１２］〜［１−２２］に記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［２２］に記載の測定方法。
［２２−２］『１』の工程が、上記［１−２９］〜［１−３０］のいずれかに記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［２２］〜［２２−１］に記載の測定方法。
［２２−３］該リン酸化ミゾリビンとリン酸化リバビリンが、モノリン酸化ミゾリビンとモノリン酸化リバビリンである上記［２２］〜［２２−２］に記載の測定方法。
［２２−４］『２』の工程における阻害程度の検出が、上記［１−３２］〜［１−３３］いずれかに記載の少なくともいずれか１つの特徴を有する上記［２２］〜［２２−３］に記載の測定方法。
［２２−５］『２』の工程における阻害程度の検出が、既知量のリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンと、測定対象の変化量を検出して比較し、試料中に含まれている可能性のあるリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンを定量する工程である［２２］〜［２２−４］のいずれかに記載の測定方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、少なくとも、簡便なミゾリビン及び／又はリバビリンを測定する方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は下記（１）の工程を含むミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法である。（１）ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る第一の酵素の存在下、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する第一の反応を含む工程。
本発明のミゾリビン又はリバビリンは、公知のミゾリビン又はリバビリン（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ５０９２４−４９−７又は３６７９１−０４−５）を含み、由来、剤型、結晶型、添加物、商品名等により限定されない。
本発明のリン酸化ミゾリビン又はリン酸化リバビリンは、ミゾリビン又はリバビリンにリン酸基が結合した物質である。リン酸基の数は１、２、又は３であっても良いが、１、すなわち、モノリン酸化ミゾリビン又はモノリン酸化リバビリンが好ましい。リン酸化され得る部位は特に限定されず、その糖部分、すなわちリボース部分の任意の水酸基であって良く、それには１’位、２’位、又は５’位が挙げられ、場合によってはリングを形成しても良いが、例えばモノリン酸化ミゾリビン又はモノリン酸化リバビリンの場合は、５’位が好ましい。すなわち、該モノリン酸化ミゾリビン又はモノリン酸化リバビリンは、ミゾリビン５’一リン酸又はリバビリン５’一リン酸が好ましい。
【０００９】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素は、上記理化学的性質のうち＜１＞作用の性質を有する酵素を含む。本明細書では、上記第一の反応を含む、該ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素を第一の酵素と記載する場合がある。本発明の測定方法の工程（１）には、該第一の酵素を存在させる事ができ、その理化学的性質はミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素であれば良く、酵素名、ＥＣ番号、又は製造方法等により限定されない。該第一の酵素としては、上記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質や本願明細書に記載された該第一の酵素の性質のいずれかを有する酵素であれば好ましい。すなわち、上記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質のうち、＜１＞作用と＜２＞基質特異性を有すれば好ましく、その他の性質の有無は特に限定されないが、上記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質や本願明細書に記載された該第一の酵素の性質のうち、任意の１つ又は２つ以上を備えていることも好ましい。本発明の第一の酵素においては、本願明細書に記載された該第一の酵素の性質のその他の理化学的性質や物性等を採用する事も出来る。
本発明の第一の酵素は、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素であれば特に限定されず、少なくとも測定する対象物をリン酸化する酵素を選択すればよい。例えば、ミゾリビン及びリバビリンをリン酸化し得る酵素、又は、ミゾリビン又はリバビリンのどちらか一方をリン酸化し得る酵素が挙げられる。すなわち本発明の第一の酵素には、ミゾリビン及びリバビリンを等しくリン酸化し得る酵素、ミゾリビン及びリバビリンをリン酸化し得るがミゾリビン又はリバビリンのどちらか一方をより効率的にリン酸化し得る酵素、ミゾリビン又はリバビリンのどちらか一方のみを選択的にリン酸化し得る酵素が含まれる。
【００１０】
本発明の第一の酵素は、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素であれば由来は限定されず、例えば天然の生物由来であっても良いが、培養等が容易で酵素の取得が容易となる点で、微生物由来である酵素が好ましい。好ましい微生物由来の本発明の第一の酵素としては、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属やその近縁のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属等、好ましくはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ、最も好ましくは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株由来の各酵素が例示される。該菌株は後述の菌株バンクで購入できるし、他の菌株バンクで購入できる該菌株との同等株や、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．、１１８巻１３７−１４８頁、１９９５年に記載の方法で分離した同等株を用いて、本発明の酵素の各性質を有する酵素を生産し得ることを確認して、本発明の測定方法に使用することもできる。
さらに、本発明の第一の酵素としては、アデノシンキナーゼやホスホフルクトキナーゼ−Ｂを含むヌクレオシドキナーゼ、またはホスファターゼ等も利用可能である。微生物由来の本発明の第一の酵素としては、大腸菌由来のグアノシンイノシンキナーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のホスホフルクトキナーゼ−Ｂ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のホスホフルクトキナーゼ−Ｂと予想されるタンパク質が挙げられる。その他の微生物由来の本発明の第一の酵素としては、パン酵母やマイコバクテリウム由来のミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得るアデノシンキナーゼが挙げられる。また、入手が困難であり必ずしも効率が高いとは言えないものの、哺乳類由来の酵素であっても良く、例えば、ヒト由来のアデノシンキナーゼやマウス、ラット、ウサギなどの、公知のアデノシンキナーゼが挙げられる。
【００１１】
本発明の第一の酵素は、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素であればアミノ酸配列は限定されず、例えば配列表配列番号１のアミノ酸配列の場合は、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であっても良い。該アミノ酸配列は、配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む配列が好ましく（但し、配列表配列番号５及び６中、Ｘａａは任意のアミノ酸を示す）、最も好ましくは配列表配列番号１のアミノ酸配列である。配列表配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換もしくは付加の例としては、第一の酵素のＮ末端側及び／又はＣ末端側にチオレドキシン酵素等機能性酵素やその他のアミノ酸配列からなる部分を付加する例が挙げられ、融合蛋白質とすることも好ましく、その付加する部分により精製や確認等をすることのできるタグと呼ばれる部分を融合させ、場合によっては、そのタグ部分を削除しても、場合によってはその全部又は一部が残る場合も例示される。例えば、第一の酵素を菌体外やペリプラズムへ輸送する為の約２０個のシグナルペプチドや、効率的な精製を行う為の５〜１０個のＨｉｓの付加でも良いし、それらを直列して付加しても良い。又、それらのアミノ酸配列の間等に数個のプロテアーゼ認識アミノ酸配列を配置して付加することもできる。上述の付加の例と同様に、欠失、又は置換を行うことができ、例えば、本発明の第一の酵素の本質的な機能とは無関係の数個のアミノ酸からなるドメインが存在する場合や、配列表配列番号１のアミノ酸配列中の複数個のアミノ酸からなるギャップが存在する場合、それらの欠失を組み合わせることもできる。又、欠失、置換もしくは付加を適宜組み合わせることも可能である。このようなアミノ酸配列としては、ＲＲＥＦＧＧＣＡ（Ｇ、Ａ、又はＴ）ＮＩ（Ａ、又はＧ）（Ｙ、又はＦ）（Ａ、Ｓ、Ｔ、又はＮ）Ｌ、及びＤＰＴＧ（Ｃ、Ａ、Ｖ、又はＩ）ＧＤＡ（Ｆ、Ｙ、Ｗ、又はＨ）Ｒ（Ｇ、Ａ、又はＳ）Ｇの配列を含む、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素であれば更に好ましい。更に、配列表配列番号１のアミノ酸配列において、その配列表配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端側、及びＣ末端側は、アミノ酸残基又はポリペプチド残基を含む、すなわち付加していても良く、その付加アミノ酸残基としてはシグナルペプチド、ＴＥＥ配列、Ｓタグ、又はＨｉｓタグ等が挙げられる。配列表配列番号１のアミノ酸を欠失する場合は、例えば、Ｎ末端側又はＣ末端側から順に削除する例が挙げられる。配列表配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端のＭｅｔの欠失や、Ｎ末端がアシル基やアルキル基等による修飾を受ける等の翻訳後修飾された酵素も本発明の第一の酵素である。又、第一の酵素を公知の方法で無水コハク酸やＰＥＧ等により化学修飾して、第一の酵素の至適ｐＨや安定性等の性質を利用しやすいように変化させることも可能である。上記の場合、第一の酵素の分子量は変化する場合があり、例えば、後述のｐＴｉｐ ＱＣ１やｐＴｉｐ ＱＣ２を利用してＮ末端にＨｉｓタグを付加すると分子量が約１，０００大きくなる。本発明の第一の酵素のアミノ酸配列の二次構造、三次構造、及び四次構造は、特に限定されない。
【００１２】
本発明の第一の酵素の塩基配列は、本発明の第一の酵素をコードする塩基配列であれば特に限定されないが、例えば配列表配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の場合、配列表配列番号１と実質的に均等なアミノ酸配列をコードする塩基配列であっても良く、例えば配列表配列番号１のアミノ酸配列のうち、上記第一の反応の触媒作用に関与しない一部のアミノ酸を変異させたもの、例えば１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列の均等物をコードする塩基配列であっても良い。好ましくは、配列表配列番号５及び配列表配列番号６のそれぞれのアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれるように行うことが特に好ましい。配列表配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列表配列番号２の塩基配列や配列表配列番号２の塩基配列を大腸菌や放線菌等宿主のコドン使用頻度に合わせて変更した塩基配列が例示される。
【００１３】
第一の酵素をコードする塩基配列の調製においては、通常用いられる公知の遺伝子操作手段を利用することができ、例えば、部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定塩基の断片を人工変異塩基で置換する等の種々の方法が例示される。
【００１４】
本明細書では、配列表配列番号１のアミノ酸配列からなる第一の酵素を特にＢｔｈＮＫと記載する場合がある。
【００１５】
本発明の測定方法の工程（１）において使用する第一の酵素の量は、ミゾリビン及び／又はリバビリンが測定できれば特に限定されず、試料に含まれるミゾリビン及び／又はリバビリンの存在量、目的とするミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する程度、使用する装置、第一の酵素の純度、及び／又は経済的な事情等に応じて好ましい結果が得られるように決定し得る。本発明の測定方法の工程（１）において、更に、リン酸供与体や金属イオンの使用する場合、その種類と量についても同様である。
【００１６】
本発明の測定方法の工程（１）において使用する第一の酵素の量は、例えば、原料や試料に含まれるミゾリビン及び／又はリバビリンの存在量が１ｍＭ以下で、その全てをリン酸化する条件の場合、下限が０．０１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．０５Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは０．１Ｕ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが、５Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは２Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは１Ｕ／ｍｌ以下である。
【００１７】
本発明の測定方法の工程（１）は、少なくともリン酸供与体の存在下であることが好ましく、該リン酸供与体はＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、又はポリリン酸等であっても良いが、ＡＴＰが特に好ましい。上記条件下で使用するリン酸供与体の量は、例えば、ＡＴＰの場合、下限が０．１ｍＭ以上、好ましくは１ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上、上限は特に設けないが好ましくは５００ｍＭ以下、更に好ましくは２００ｍＭ以下、特に好ましくは５０ｍＭ以下である。
【００１８】
本発明の測定方法の工程（１）は、少なくとも金属イオンの存在下であることが好ましく、マグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン又はマンガンイオンのうちいずれか一つ以上の金属イオンであっても良いがマグネシウムイオンが特に好ましい。上記条件下で使用する金属イオンの量は、例えば、マグネシウムイオンの場合、下限がリン酸供与体の濃度に対して０．１当量以上、好ましくは０．５当量以上、更に好ましくは１当量以上であり、上限が１０当量以下、好ましくは５当量以下、更に好ましくは３当量以下である。最も好ましい濃度はリン酸供与体の２当量である。
【００１９】
本件明細書実施例にも支持される通り、本件の測定方法は、種々の条件にて測定が正確に、精度よく実施できるものであり、本発明の試料は、特に限定されないが、全血、血漿、血清、血球、髄液、リンパ液、尿等を含む生体試料や研究用試料及びそれらの抽出物等を挙げることができ、それらの試料は、ミゾリビン及び／又はリバビリンを含有すると予想される試料であれば好ましいし、ミゾリビン又はリバビリンのどちらか一方を含有すると予想される試料であれば更に好ましい。試料が生体試料の場合、ミゾリビン及び／又はリバビリンの標的臓器、例えば、白血球、肝細胞、ウィルス感染細胞等を選別して試料とする事も好ましいし、試料が白血球の場合は、更に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、リンパ球等を選別して試料とする事も好ましい。ミゾリビン及び／又はリバビリンを含有すると予想される生体試料を取得する場合、取得方法は公知の方法で良いが、全血を取得する場合には、分離剤や抗プラスミン剤等の使用の有無には限定されず、ＥＤＴＡ、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム等の抗凝固剤や解糖阻止剤の使用の有無にも限定されない。その他の試料としては、例えば、海水、天然水、果汁、飲料、廃液等が挙げられる。
【００２０】
ミゾリビン及び／又はリバビリンが試料中に含まれている可能性の有無の判断には、本発明の測定方法を実施する前にミゾリビン及び／又はリバビリンが試料中に含まれている可能性の有無が判断できる場合を含み、例えば、薬歴や食歴等で可能性の有無を判断する事ができるし、ＨＰＬＣやＬＣ／ＭＳ／ＭＳ等上記の従来技術により可能性の有無を判断しても良い。又、本発明の測定方法の実施により試料中に含まれている可能性の有無を判断する事もできる。同様に、リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンが試料中に含まれている可能性の有無の判断も、従来技術や後述する方法により可能である。ミゾリビン及び／又はリバビリンが試料中に含まれている可能性の有無は、通常は薬歴で判断できる。
【００２１】
本発明においては、試料中にはミゾリビン、リバビリン、リン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンが混在していても良く、ミゾリビン、リバビリン、リン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンが混在している試料中のミゾリビン又はリバビリンの存在量を測定する場合は、本発明の測定方法と、従来技術や後述するリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの存在量を測定する方法、及び／又は、上記のＨＰＬＣやＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりミゾリビン又はリバビリンの存在量を測定する方法を、適宜組み合わせて実施してそれらの数値の差し引き等により算出すれば良い。通常は、ミゾリビン又リバビリンが単独で存在している試料について測定する場合であることが望ましい。
本発明は、さらに下記（２）の工程を含むミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法である。（２）上記第一の反応とは別異の反応であって次の＜ａ＞〜＜ｃ＞のいずれかの第二の反応を触媒し得る第二の酵素の存在下、第二の反応を進行させるに際して、上記第一の反応の結果生じた該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンと第二の酵素を接触させて該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの存在量に応じて第二の反応が阻害される工程。
＜ａ＞ミゾリビンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビンで阻害される反応
＜ｂ＞リバビリンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化リバビリンで阻害される反応
＜ｃ＞ミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、かつ、記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される反応
本明細書では、該第二の反応を触媒し得る酵素を第二の酵素と記載する場合がある。本発明の測定方法の工程（２）には、該第二の酵素を存在させる事ができ、その理化学的性質は上記第二の反応を触媒し得る酵素であれば良く、酵素名、ＥＣ番号、及び／又は製造方法等により限定されない。該第二の酵素は、ミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される反応を触媒し得る酵素でもよい。又、該第二の酵素は、ミゾリビンで阻害されず、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビンで阻害される反応を触媒し得る酵素でもよい。さらに、該第二の酵素は、リバビリンで阻害されず、上記第一の反応により生ずるリン酸化リバビリンで阻害される反応を触媒し得る酵素でもよい。該第二の酵素としては、上記の＜ｉ＞〜＜ｖｉ＞の理化学的性質や本願明細書に記載された該第二の酵素の性質のいずれかを有する酵素であれば好ましいが、上記の＜ｉ＞〜＜ｖｉ＞の理化学的性質のうち、＜ｖ＞阻害作用を有すれば好ましく、その他の性質の有無は特に限定されないが、上記の＜ｉ＞〜＜ｖｉ＞の理化学的性質や本願明細書に記載された該第二の酵素の性質のうち、任意の１つ又は２つ以上を備えていることも好ましい。更に好ましくは第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの存在量に応じて反応が阻害される反応を触媒し得る酵素で、最も好ましくは、イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼである。イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼはＥＣ １．１．１．２０５と表現されることもある。本発明の第二の酵素としてイノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼを採用する場合、由来は限定されず、例えば天然の生物由来であっても良いが、微生物由来の場合は、例えば、ヒト、大腸菌、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｔｒｉｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｆｏｅｔｕｓ、Ｂｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、ラット、ウサギ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｒｅｕｓ由来等公知のイノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼであっても良いし、それらのアイソザイムであっても良い（Ｓ．Ｆ．Ｃａｒｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８巻、２７２８６頁、１９９３年、Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１８３巻、４８１頁、１９７９年、Ｇ．Ａ．Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９巻、２３３１頁、１９９７年、Ｆ．Ｇ．Ｗｈｉｔｂｙら、３６巻、１０６６６頁、１９９７年、Ｘ．Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２巻、２１９７７頁、１９９７年等）。第二の酵素として使用され得るイノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼを形成する、天然の微生物の典型的な例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属やＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物を、更に好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓを、最も好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株を例示できる。又、他の菌株バンクで購入できる該株との同等株を用いたり、上記の方法で自然界から分離した同等株を用いたりして、本発明の酵素の各性質を有する酵素を生産し得ることを確認して、本発明の測定方法に使用することもできる。
【００２２】
本発明の第二の酵素は、上記第二の反応を触媒し得る酵素であればアミノ酸配列は限定されず、例えば配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列の場合は、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であっても良いが、該アミノ酸配列は配列表配列番号１１のアミノ酸配列及び配列表配列番号１２のアミノ酸配列を含む配列が好ましく、配列表配列番号２３を含む配列がより好ましく、配列表配列番号２４の配列を含む配列が更に好ましく、特に好ましくは配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列である。本発明の配列表配列番号７又は配列表配列番号９における複数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加、翻訳後修飾、化学修飾について、その結果の分子量の変化について、アミノ酸配列の構造については、上記の第一の酵素の場合と同様である。本発明の第二の酵素が例えば配列表配列番号７のアミノ酸配列の場合、１又は複数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列の例として、Ｖ４３２Ｉ（配列表配列番号７の４３２番目のＶがＩに置換したことを示す。以下同様。）、Ｋ４４９Ｉ、Ｋ３４５Ｎ、Ｄ２９Ｎ、Ｓ３３Ｙ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ２７０Ａ、Ｖ３８７Ｅ、及びＬ３６７Ｉとこれらの置換の任意の組み合わせが挙げられる。該任意の組み合わせは、例えば、［Ｖ４３２Ｉ、Ｋ４４９Ｉ］（配列表配列番号７の４３２番目のＶがＩ、及び４４９番目のＫがＩに同時に置換したことを示す。以下同様。）や［Ｄ２９Ｎ、Ｓ３３Ｙ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ２７０Ａ、Ｖ３８７Ｅ］が挙げられる。
【００２３】
本発明の第二の酵素の塩基配列は、本発明の第二の酵素をコードする塩基配列であれば特に限定されないが、配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列をコードする塩基配列や、上記の第一の酵素の場合と同様の変異や変更を含む塩基配列が例示される。
【００２４】
本発明の第二の酵素をコードする塩基配列の調製においては、上記の第一の酵素の場合と同様の遺伝子操作手段を利用することができる。
【００２５】
本明細書では、配列表配列番号７のアミノ酸配列からなる第二の酵素をＢｓｕＩＭＰＤＨと、配列表配列番号９のアミノ酸配列からなる第二の酵素をＯｂＩＭＰＤＨと記載する場合がある。
【００２６】
本発明の測定方法の工程（２）において使用する第二の酵素の量は、ミゾリビン及び／又はリバビリンが測定できれば特に限定されず、試料に含まれるミゾリビン及び／又はリバビリンの存在量、目的とするミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する程度、使用する装置、第二の酵素の純度、及び／又は経済的な事情等に応じて好ましい結果が得られるように決定し得る。本発明の測定方法の工程（２）において、使用する第二の酵素に応じた基質や補酵素を使用する場合や、イノシン５’一リン酸やＮＡＤ（Ｐ）類を使用する場合、その種類と量についても同様である。
【００２７】
本発明の測定方法の工程（２）において使用する第二の酵素の量は、例えば、原料や試料に含まれるミゾリビン及び／又はリバビリンの存在量が１ｍＭ以下で、その全てをリン酸化し、第二の酵素としてイノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼを使用する場合、下限が０．０１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．０５Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは０．１Ｕ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが、１Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは０．３Ｕ／ｍｌ以下である。
【００２８】
本発明の測定方法の工程（２）は、少なくともイノシン５’一リン酸の存在下であることが好ましく、該イノシン５’一リン酸は塩の種類や結晶水の有無には限定されない。上記条件下で使用するイノシン５’一リン酸の量は、下限が１ｍＭ以上、好ましくは３ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００ｍＭ以下、更に好ましくは５０ｍＭ以下、特に好ましくは３０ｍＭ以下である。
【００２９】
本発明の測定方法の工程（２）は、少なくともＮＡＤ（Ｐ）類の存在下であることが好ましく、ＮＡＤ（Ｐ）類には、ＮＡＤ（Ｐ）、デアミドＮＡＤ（Ｐ）（ＮＡＡＤ（Ｐ））、チオＮＡＤ（Ｐ）、ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド（リン酸）、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（リン酸）等が挙げられ、そのうちいずれか一つ以上であっても良いがＮＡＤが特に好ましい。上記条件下で使用するＮＡＤ（Ｐ）類の量は、例えばＮＡＤの場合、下限が０．１ｍＭ以上、好ましくは０．５ｍＭ以上、更に好ましくは１ｍＭ以上、上限は特に設けないが好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは１０ｍＭ以下、特に好ましくは７ｍＭ以下である。
【００３０】
本発明の測定方法は、下記（３）の工程を含むミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法である。（３）第二の反応の阻害程度を検出する工程。
【００３１】
本発明の検出方法の工程（３）は、定性反応により阻害程度を検出する工程でも良く、好ましくは、阻害程度の検出が、第二の反応を触媒し得る第二の酵素の反応速度を検出する工程であり、更に好ましくは、阻害程度の検出が、ＮＡＤ（Ｐ）類の変化量を検出する工程であり、最も好ましくは、阻害程度の検出が、ＮＡＤ（Ｐ）類の変化量を検出し定量する工程である。
【００３２】
定量する測定方法とは次の通りである。ミゾリビン及び／又はリバビリンが含まれている可能性のある試料と、ミゾリビン及び／又はリバビリンを既知の濃度で含む試料を、それぞれ単独に工程（１）〜（３）で処理し、工程（３）でそれぞれの変化量を検出する。ミゾリビン及び／又はリバビリンが含まれている可能性のある試料中のミゾリビン及び／又はリバビリンの濃度は、ミゾリビン及び／又はリバビリンが含まれている可能性のある試料について工程（３）で検出した変化量と、ミゾリビン及び／又はリバビリンを既知の濃度で含む試料について工程（３）で検出した変化量とを比較することにより定量する。
【００３３】
ＮＡＤ（Ｐ）類の変化量を検出する方法は、該測定対象の変化量を公知の方法で検出する。一般的には該測定対象の変化に伴うそれら該測定対象の吸収スペクトルや吸光強度の変化を、装置を用いて光学的方法で検出する方法が例示され、ＮＡＤ（Ｐ）類の酸化還元に伴う吸収スペクトルや特定波長における吸光強度の変化を検出する方法でも良い。又、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の蛍光の変化を検出することも可能である。感度向上や目視での検出等を目的としてＤＩ（Ｐ）（Ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）やホルマザン色素を存在させても良い。又、更に感度向上等を目的としてＮＡＤ（Ｐ）類サイクリング反応を用いることもできる。ＮＡＤ（Ｐ）類の酸化還元に伴う電位差を測定する場合は電極を使用する。使用する酵素をカーボンペースト等に固定して電極にし、ミゾリビン及び／又はリバビリンの測定に使用する事もできる。
【００３４】
本発明の測定方法は、液相、気相、又は固相等やそれぞれの臨界面で実施すれば良いが、液相で実施する事が好ましい。液相には水相、有機溶媒相等が考えられ、本発明の測定方法を水相で実施する場合、水相には例えば水、水溶液や適宜の有機溶媒を含有した水性媒体が例示されるが、適宜のｐＨ緩衝剤を用いることが好ましい。ｐＨ緩衝剤を使用する場合、その種類は目的のｐＨを保つことができ、試料中のミゾリビン及びリバビリンが測定できれば特に限定されないが、グッドのｐＨ緩衝液、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、酢酸／ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸／ＮａＯＨ緩衝液が例示できる。本発明の測定方法を実施する際のｐＨは、試料中のミゾリビン及び／又はリバビリンが測定できれば特に限定されないが、工程（１）は、下限としてｐＨ４以上、好ましくはｐＨ４．８以上、更に好ましくはｐＨ５．２以上が例示され、上限としてはｐＨ８．５以下、好ましくはｐＨ８以下が、更に好ましくはｐＨ７．５以下が例示される。工程（２）及び（３）は、下限としてｐＨ５．５以上、好ましくはｐＨ６以上、更に好ましくはｐＨ７以上が例示され、上限としてはｐＨ１０．５以下、好ましくはｐＨ９．５以下が、更に好ましくはｐＨ８．５以下が例示される。ｐＨ緩衝剤の濃度は目的のｐＨを保つことができ、ミゾリビン及びリバビリンが測定できれば特に限定されないが、下限として３ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは１０ｍＭ以上が例示され、上限としては５００ｍＭ以下、好ましくは２００ｍＭ以下が、更に好ましくは１００ｍＭ以下が例示される。
【００３５】
本発明の測定方法のその他の好ましい液相として、例えばゾル・ゲルが挙げられる。ゾル・ゲルとするためには、例えば、寒天等の多糖類を利用すれば良い。ゾル・ゲルと乳濁液を区別する場合は、乳濁液として実施しても良い。乳濁液とするためには、例えば、有機溶媒等を利用すれば良いし、両親媒性物質を利用すればミセルとしても実施できる。いずれの場合も、ｐＨ緩衝剤を用いる場合は上記と同様である。
【００３６】
本発明の測定方法における、（１）〜（３）の各工程はそれぞれ別異の反応槽（相）で実施できるが、同一反応槽（相）で実施する事が好ましい。又、（１）〜（３）の各工程は、不連続に実施できるが、連続して実施する事が好ましい。又、（１）〜（３）の各工程は、（１）、（２）、（３）の順に行っても良く、（１）と（２）を同時に行って次いで（３）を行ったり、まず（１）を行い、次いで（２）と（３）を同時に行ったり、（１）、（２）、（３）を同時に行ったりする等、目的、試料、使用する装置等に応じて好ましい結果が得られるように決定し得る。又、本発明の測定方法の工程（１）を実施せずに工程（２）と工程（３）の方法を実施すれば、リン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの存在量を測定できる。
【００３７】
本発明の工程（１）〜（３）の反応時間は、試料中のミゾリビン及び／又はリバビリンが測定できれば特に限定されないが、それぞれ、下限が１５秒以上、好ましくは１分以上、更に好ましくは３分以上である。上限は特に設けないが、好ましくは３０分以下、更に好ましくは１５分以下、特に好ましくは１０分以下である。（１）〜（３）の各工程の反応時間は不均等であっても良い。
【００３８】
本発明の測定方法を実施する温度は、試料中のミゾリビン及び／又はリバビリンが測定できる温度であれば特に限定されないが、使用する酵素の作用温度の範囲内が好ましく、下限は１５℃以上、好ましくは２０℃以上、更に好ましくは２５℃以上が、上限は７０℃以下、好ましくは５０℃以下、更に好ましくは４０℃以下である。（１）〜（３）の各工程の温度は不均等であっても良い。
【００３９】
本発明の上記（１）〜（３）の工程を含むミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法と別異な測定方法としては、下記（ａ）〜（ｃ）の各工程を含む測定方法であってもよい。（ａ）上記の第一の酵素とＡＴＰの存在下、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとＡＤＰとする反応Ｉを含む工程、（ｂ）上記反応Ｉとは別異の反応ＩＩ又は複数の反応ＩＩを触媒する酵素Ｂ又は複数の酵素Ｂの存在下、上記反応Ｉにより生ずるＡＤＰの量に応じて反応ＩＩにより生じる測定対象の変化を生じさせる工程、（ｃ）該測定対象の変化量を検出し、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンの量を測定する工程。
【００４０】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法におけるミゾリビン及び／又はリバビリンの由来は限定されないが、上記の試料であれば好ましい。本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法を実施する相、液相で実施する場合はｐＨ緩衝剤の条件、時間や温度の条件、反応槽（相）の条件、工程を実施する順番等は上記と同様である。
【００４１】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法の工程（ａ）において使用する第一の酵素の量、リン酸供与体や金属イオンの使用する場合、その種類と量等の条件等は、上記の工程（１）と同様である。すなわち、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法の工程（ａ）は、本発明の測定方法における工程（１）と同様の条件で実施する事もできる。
【００４２】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法の工程（ｂ）は、上記反応Ｉとは別異の反応ＩＩ又は複数の反応ＩＩを触媒する酵素Ｂ又は複数の酵素Ｂの存在下、上記反応Ｉにより生ずるＡＤＰの量に応じて反応ＩＩにより生じる測定対象の変化を生じさせる工程である。
【００４３】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法の工程（ｂ）の例として、（ｂ−１）ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの存在下、該反応ＩＩがグルコースとＡＤＰをグルコース−６−リン酸とＡＭＰとする反応と、（ｂ−２）グルコース−６−リン酸脱水素酵素の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）類及び前記反応により生ずるグルコース−６−リン酸を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とグルクノラクトン−６−リン酸とする反応を含み、上記の反応Ｉにより生ずるＡＤＰの量に応じてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が増加しており（本明細書では工程（ｂ（α））と記載する場合がある）、（ｃ）工程において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量を検出する工程が挙げられる。
【００４４】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法の工程（ｂ（α））におけるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素の由来や起源は、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法が実施できれば特に限定されない。工程（ｂ（α））におけるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素の濃度は、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法が実施できれば特に限定されないが、下限として０．１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは１Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは２Ｕ／ｍｌ以上であり、上限は特に設けないが、好ましくは２０Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは１０Ｕ／ｍｌ以下が例示される。工程（ｂ（α））にはＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼが反応に要求する基質、金属イオンが存在しても良い。基質や金属イオンの種類や濃度は、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法が実施できれば特に限定されないが、使用するＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの由来や起源により異なる。一例として、基質としてグルコースを０．０１ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは１ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５００ｍＭ以下、更に好ましくは１００ｍＭ以下が例示される。金属イオンとして塩化マグネシウムを０．１ｍＭ以上、好ましくは１ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは１００ｍＭ以下、更に好ましくは１０ｍＭ以下が例示される。工程（ｂ（α））にはグルコース−６−リン酸脱水素酵素の補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）類が存在しても良い。ＮＡＤ（Ｐ）類の種類や濃度は、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法が実施できれば特に限定されないが、使用するグルコース−６−リン酸脱水素酵素の由来や起源により異なる。一例として、補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）を０．１ｍＭ以上、好ましくは１ｍM以上、更に好ましくは３ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは１０ｍＭ以下が例示される。ＮＡＤ（Ｐ）類の種類は上記と同様である。
【００４５】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法の工程（ｂ）の別異な例として、（ｂ−１）ピルビン酸キナーゼの存在下、ＡＤＰとＰＥＰをピルビン酸とＡＴＰに変化させる反応と、（ｂ−２）乳酸脱水素酵素の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類及び前記の反応により生ずるピルビン酸を、ＮＡＤ（Ｐ）類と乳酸とする反応を含み、上記第一の反応により生ずるＡＤＰの量に応じてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が減少しており（本明細書では工程（ｂ（β））と記載する場合がある）、（ｃ）工程において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の減少量を検出する工程が挙げられる。
【００４６】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法の工程（ｂ（β））におけるピルビン酸キナーゼ及び乳酸脱水素酵素の由来や起源は、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法が実施できれば特に限定されない。工程（ｂ（β））におけるピルビン酸キナーゼ及び乳酸脱水素酵素の濃度は、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法が実施できれば特に限定されないが、下限として１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは５Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは１０Ｕ／ｍｌ以上であり、上限は特に設けないが、好ましくは１００Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは５０Ｕ／ｍｌ以下が例示される工程（ｂ（β））にはピルビン酸キナーゼが反応に要求する基質、金属イオンが存在しても良い。基質や金属イオンの種類や濃度は、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法が実施できれば特に限定されないが、使用するピルビン酸キナーゼの由来や起源により異なる。一例として、基質として、ＰＥＰを０．１ｍＭ以上、好ましくは０．５ｍM以上、更に好ましくは１ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは１０ｍＭ以下が例示される。金属イオンとしては、塩化マグネシウムを０．１ｍＭ以上、好ましくは０．５ｍM以上、更に好ましくは１ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは１０ｍＭ以下が例示される。工程（ｂ（β））には乳酸脱水素酵素の補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が存在しても良い。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の種類や濃度は、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法が実施できれば特に限定されないが、使用する乳酸脱水素酵素の由来や起源により異なり、使用するキュベットの光路長や比色計の性能によっても異なる。一例として、光路長１ｃｍのキュベットの場合、０．０１ｍＭ以上、好ましくは０．０３ｍＭ以上、更に好ましくは０．０７ｍＭ以上、上限は０．２ｍＭ以下、好ましくは０．１７ｍＭ以下、更に好ましくは０．１５ｍＭ以下が例示される。
【００４７】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法の工程（ｂ）の更に別異な例として、（ｂ−１）ピルビン酸キナーゼの存在下、ＡＤＰとＰＥＰをピルビン酸とＡＴＰに変化させる反応と、（ｂ−２）ピルビン酸オキシダーゼの存在下、酸素、リン酸及び前記の反応により生ずるピルビン酸を、過酸化水素とアセチルリン酸とする反応を含み、上記第一の反応により生ずるＡＤＰの量に応じて過酸化水素が増加しており（本明細書では工程（ｂ（γ））と記載する場合がある）、（ｃ）工程において、過酸化水素の量を過酸化水素指示薬等で検出する工程が挙げられる。
【００４８】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法の工程（ｂ（γ））におけるピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼの由来や起源は、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法が実施できれば特に限定されない。工程（ｂ（γ））におけるピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼの濃度は、上記のピルビン酸キナーゼ及び乳酸脱水素酵素の場合と同様である。工程（ｂ（γ））におけるピルビン酸キナーゼが反応に要求する基質、金属イオンの種類や濃度は、上記と同様である。工程（ｂ（γ））における過酸化水素指示薬は、ペルオキシダーゼとともに、４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラシゾン等のカップラーとクロロフェノール等のフェノール類又はＴＯＯＳやＮ，Ｎ−ジメチルアニリン等のアニリン類及びそれらの誘導体等の色原体との縮合反応やロイコ型の色原体を使用する等当業者なら容易に想達し得る。
【００４９】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法の工程（ｃ）における該測定対象の変化量を検出する方法において、ＮＡＤ（Ｐ）類の変化量を検出する方法は上記と同様である。過酸化水素指示薬を使用する場合は該過酸化水素指示薬の変化に伴う吸収スペクトルや特定波長における吸光強度の変化を検出しても良い。又、消費する酸素を検出する場合は酸素電極を利用する。
【００５０】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法の工程（ｃ）における検出する方法は、上記本発明の測定方法の工程（３）と同様であっても良い。
【００５１】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンのリン酸化方法は、本発明の第一の酵素を用いてミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする方法である。
【００５２】
又、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンのリン酸化方法は、例えば、本発明の第一の酵素を用い、少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする方法であれば好ましく、好ましくは、少なくともマグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン又はマンガンイオンのうちいずれか一つ以上の金属イオン、ミゾリビン及び／又はリバビリン、リン酸供与体、及び本発明の第一の酵素を接触させることが例示される。接触させる順番は特に限定されない。
【００５３】
本発明のリン酸化方法におけるミゾリビン及び／又はリバビリンの由来は上記と同様である。本発明のリン酸化方法を実施する相、液相で実施する場合はｐＨ緩衝剤の条件等、時間や温度の条件等は上記と同様である。又、該方法において使用する第一の酵素の量、リン酸供与体や金属イオンの使用する場合、その種類と量等の条件等は上記と同様である。すなわち、本発明のリン酸化方法は、本発明の測定方法における工程（１）と同様の条件で実施する事もできる。
【００５４】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリバビリンとするリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの製造方法においては、上記本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンのリン酸化方法により、ミゾリビン及び／又はリバビリンからリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンが製造される。製造されたリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンは、原料や他の製造物等が混在したままであっても良いが、目的や用途等場合によっては実質的に不純物を包含しないようにすることも好ましく、通常は、例えば５０％以上、７０％以上、９５％以上の各種の純度にすることが例示される。リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンは、公知の精製方法を行うことができるが、例えば、溶剤等を用いた抽出、シリカゲル、アルミナ、及び／又はセライト等を用いたクロマトグラフィー、及び／又は再結晶等による精製方法が例示できる。
【００５５】
本発明の第一の酵素及び／又は第二の酵素は、ミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物となり得る。本発明のミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物は、上記の本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法及び本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの別異な測定方法に用いることができる。又、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする方法やミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとするリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの製造する方法に用いることができる。
【００５６】
本発明の組成物は下記の（Ａ１）〜（Ａ４−３）の成分を含む組成物が例示される。該組成物はミゾリビン測定用の組成物、リバビリン測定用の組成物、ミゾリビン及びリバビリン測定用の組成物、のいずれであっても良い。
（Ａ１）ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する第一の反応を触媒し得る第一の酵素
（Ａ２）リン酸供与体
（Ａ３）金属イオン
（Ａ４−１）上記第一の反応とは別異の反応であって以下＜ａ＞〜＜ｃ＞のいずれかの第二の反応を触媒し得る第二の酵素、
＜ａ＞ミゾリビンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビンで阻害される反応
＜ｂ＞リバビリンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化リバビリンで阻害される反応
＜ｃ＞ミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される反応
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
本発明の組成物には、前記（Ａ１）〜（Ａ３）及び下記の（Ａ４−１）〜（Ａ４−３）の成分を含む組成物が含まれる。該組成物はリン酸化ミゾリビン測定用の組成物、リン酸化リバビリン測定用の組成物、リン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリン測定用リバビリン測定用の組成物であっても良い。
（Ａ４−１）上記第一の反応とは別異の反応を触媒し、リン酸化リバビリンで阻害される第二の酵素
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
さらに本発明の組成物は、下記の３成分のうち、いずれかひとつ以上の成分が測定直前に合一されて本発明の組成物となることが好ましい。すなわち、測定時には必要な全ての成分を有する本発明の組成物とするに当たり、その測定以前においては、少なくとも、下記の３成分、またはそのいずれかひとつまたは２つがその組成物から分離されていることが好ましい。下記の３成分のうち、いずれかひとつ、２つまたは３つを測定直前に組成物に合一する場合、合一する順序は任意であり、ひとつずつ合一しても良く、２つまたは3つを同時に合一しても良い。
（Ａ４−１）第二の酵素、
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物は下記の（Ａ）と（Ｂ）を含む組成物である。
（Ａ）少なくとも以下の（Ａ１）〜（Ａ４）を含む第１の試薬。
（Ａ１）有効量の本発明の第一の酵素
（Ａ２）リン酸供与体
（Ａ３）金属イオン
（Ａ４）有効量の本発明の第二の酵素、イノシン５’一リン酸、及び、ＮＡＤ（Ｐ）類のいずれか１つ以上の成分
（Ｂ）少なくとも有効量のリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンで阻害される第二の酵素、イノシン５’一リン酸、及び、ＮＡＤ（Ｐ）類のうち第１の試薬には含まれない成分を含む第２の試薬。
【００５７】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物は、好ましくは下記の（Ａ）と（Ｂ）を含む。
（Ａ）少なくとも以下の（Ａ１）〜（Ａ４）を含む第１の試薬。
（Ａ１）有効量の本発明の第一の酵素
（Ａ２）リン酸供与体
（Ａ３）金属イオン
（Ａ４）本発明の第二の酵素及びＮＡＤ（Ｐ）類
（Ｂ）少なくとも有効量のイノシン５’一リン酸を含む第２の試薬
【００５８】
上記本発明のミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物（Ａ）と（Ｂ）は適宜ｐＨ緩衝剤を含む事も好ましい。
【００５９】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物は、更に下記の（Ｃ）を含んでも良い。（Ｃ）少なくとも既知量のミゾリビン及び／又はリバビリンを含んでなるキャリブレーション試薬。
【００６０】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物に含まれる、本発明の第一の酵素、本発明の第二の酵素、リン酸供与体、金属イオン、イノシン５’一リン酸、及び、ＮＡＤ（Ｐ）類の種類と有効量、すなわち、該組成物がミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物となり得る為に有効な添加量及びｐＨ緩衝剤の条件等は、上記の本発明の測定方法と同様である。
【００６１】
本発明のキャリブレーション試薬は、少なくとも既知量のミゾリビン及び／又はリバビリンを含む試薬が良いが、好ましくはｐＨ緩衝剤、アジ化ナトリウムや抗性物等の防腐剤、糖等の安定化剤を含む試薬である。ｐＨ緩衝剤を含む場合、種類や濃度等の条件等は本発明の測定方法の工程（１）の場合と同様である。アジ化ナトリウムや抗性物等を含む場合、種類や濃度は防腐効果があれば限定されないが、例えばアジ化ナトリウムの場合、下限は０．００５％以上、好ましくは０．０１％以上、更に好ましくは０．０３％以上、上限は１％以下、好ましくは０．５％以下、更に好ましくは０．１％以下である。例えば抗生物質の場合、下限は５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上、更に好ましくは３０μｇ／ｍｌ以上、上限は１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは７５μｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは６０μｇ／ｍｌ以下である。安定化剤を含む場合、種類や濃度等の条件等は上記の第一の酵素の安定化剤と同様である。キャリブレーション方法は、一点検量の他、多点検量（折れ線やスプライン）や多点検量の直線回帰などが選択できる。
【００６２】
該既知量は特に限定されず、試料中のミゾリビン及び／又はリバビリンを正確に測定するために選択すれば良い。又、複数のキャリブレーション試薬を使用する場合のキャリブレーション試薬の既知量も同様である。例えばミゾリビンの場合、下限は０．００μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．００５μｇ／ｍｌ以上、更に好ましくは０．０１μｇ／ｍｌ以上、上限は２０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは８μｇ／ｍｌ以下である。
【００６３】
本発明のミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物及びキャリブレーション試薬は、液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品、又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥等による）として提供できる。液状品の凍結物が好ましく、液状品の凍結乾燥品が更に好ましく、液状品が最も好ましい。別の態様として、液状品の凍結物が好ましい場合もある。更に別の態様としては、液状品の凍結乾燥が好ましい場合もある。本発明のミゾリビン及び／又はリバビリン測定用の組成物は、一試薬の組成物としても良いが、通常は上記のように二試薬以上に分離するのが好ましい。又、試薬の品質向上等を目的としてＮａＣｌやＫＣｌ等の塩、ＴＸ−１００やＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤、及び／又はアジ化ナトリウムや抗性物等防腐剤を混合しても良い。又、例えば、ＰＯＣのキャピラリーへの使用、又は酵素センサーとしての使用の場合、各成分の濃度は通常よりも濃い濃度が好ましく、例えば、固定化したり、紙や膜に染み込ませたり、ゲル・ゾル状組成物としたりして使用することが好ましい。塩を混合する場合、種類や濃度は限定されないが、通常は５〜２００ｍＭの範囲であり、界面活性剤を混合する場合、種類や濃度は限定されないが、通常は０．００１％〜２％であり、防腐剤を混合する場合は上記キャリブレーション試薬の場合と同様である。
【００６４】
本発明の第一の酵素の製造方法について説明する。
本発明の第一の酵素は、公知の方法により、自然界から該第一の酵素を形成する天然の生物を探索（スクリーニング）し、該生物の細胞から取得すれば良い。該生物は第一の反応を触媒し得る酵素を形成する生物であれば限定されず、例えば真正細菌、真核生物、又は古細菌を含む微生物が挙げられる。微生物を探索の対象とする場合には、微生物は公知の方法に従って自然界から分離すれば良く、高温、低温、高圧、酸、アルカリ環境等の極限環境を含む土壌や水中、落下菌や氷核等を含む空中、又は、生物の体内等から得ることができる。特に高温環境から分離した微生物からは安定性の高い第一の酵素を得ることが期待できる。又、微生物はＡＴＣＣやＤＳＭ等の菌株バンクから購入しても良い。分離した微生物は、限界希釈法やモノコロニーの形成等公知の方法に従って純粋分離し、最少培地、ＬＢ培地、ブイヨン培地等で純粋培養し、その培養物においてミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素活性の有無を確認する事により、第一の酵素を形成する生物を選別できる。又、ミゾリビン及び／又はリバビリンを用いた集積培養による微生物の取得、ミゾリビン及び／又はリバビリンを培地に添加することによる第一の酵素の誘導等、探索の効率を上げる工夫も可能である。第一の酵素の有無は、非特許文献１に示される方法等により当業者なら容易に確認できる。
【００６５】
分離した菌株の同定は、実験書（鈴木健一朗ら、微生物の分類・同定実験法―分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に、シュプリンガー・フェアラーク東京）等に従うことにより同定することができ、又、市販の各種菌株同定キット（日本ビオメリュー社等）を使用することによっても可能であり、さらには、財団法人日本食品分析センター（東京都渋谷区元代々木町５２番１号）等に依頼して同定することも良い。
【００６６】
かくして得られた第一の酵素を形成する天然の微生物は、さらにＮＴＧ等の薬剤、紫外線、及び／又は放射線で処理した変異株とすることもできる。該変異株によって、第一の酵素の生産性を向上することや、第一の酵素の変異体を形成させることが可能であり、安定性、生産性、反応性等が優れた性質を有する変異体を形成することも可能である。
【００６７】
又、得られた該第一の酵素をコードする塩基配列やその情報は、上記の第一の酵素や該第一の酵素を形成する天然の微生物を用いた、プロテインシーケンス、ＤＮＡシーケンスや公知遺伝子工学手法で取得できる。
【００６８】
本発明の第一の酵素は、公知のバイオインフォマティクス手法によっても取得可能である。配列表配列番号１及び配列表配列番号２は、本発明の測定方法の工程（１）において好ましい例である第一の酵素のアミノ酸配列及び塩基配列なので、これらの配列をクエリーとしてＮＣＢＩ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ等のデータベースでＢＬＡＳＴサーチ等にてホモロジー検索を行い、配列表配列番号１や配列表配列番号２に一致する、あるいは類似するアミノ酸配列又は塩基配列をもった蛋白質又は遺伝子、すなわち、第一の酵素を生産する可能性のある生物の情報や遺伝子情報を得ることが可能である。
【００６９】
上記の方法で得られた第一の酵素を形成する天然の微生物や、第一の酵素の塩基配列、又は塩基配列の情報に基づいて形成された該酵素を取得する工程を含む該酵素の製造方法にて、該第一の酵素を取得できる。該第一の酵素を形成する工程としては、該酵素をコードする塩基配列を含む無細胞酵素合成系が例示され、好ましくは該酵素をコードする塩基配列を含む細胞を用いる工程、天然の該酵素を形成する微生物等該酵素をコードする塩基配列を有する微生物を用いる工程、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いる工程等が例示される。
【００７０】
第一の酵素をコードする塩基配列を含む無細胞酵素合成系を採用する場合には、上記の第一の酵素をコードする塩基配列を、コムギ胚芽由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、又は昆虫細胞由来等の公知の無細胞酵素合成系に使用すれば良い。
【００７１】
又、該酵素をコードする塩基配列を含む細胞を用いる工程を採用する場合には、上記の第一の酵素をコードする塩基配列をベクターに挿入して宿主微生物に導入させて形質転換体を作成し、その形質転換体を用いて該酵素を形成する例が示される。
【００７２】
第一の酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体は、該塩基配列が挿入されたベクターである組換体ファージ又は組換体プラスミドを宿主に導入した細胞、又は微生物を含む。第一の酵素をコードする塩基配列は、一部又は全てを合成して使用することができ、好ましくは第一の酵素をコードする塩基配列を、遺伝子供与体から公知の方法で取得して使用する。遺伝子供与体としては、第一の酵素を形成する細胞であれば限定されないが、好ましくは上記の探索して選別した天然の微生物や、バイオインフォマティクス手法で情報を得た生物を含む第一の酵素を形成する生物が挙げられる。
【００７３】
第一の酵素をコードする塩基配列を挿入するベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドのうち遺伝子組換用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、大腸菌に属する微生物を宿主とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ等が使用できる。又、プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴベクター、又はｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮＩ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３等が使用できる。本発明においては大腸菌を宿主とするプラスミドベクターが好ましい。プロモーターは宿主中で発現できるものであれば特に限定されない。
【００７４】
このようなベクターを、第一の酵素をコードする塩基配列の切断に使用した制限酵素により生成する塩基配列の末端と、同じ末端を生成する制限酵素により切断してベクター断片を作成し、第一の酵素をコードする塩基配列の断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼにより常法に従って結合させて第一の酵素をコードする塩基配列を目的のベクターに挿入して、組換体ファージ又は組換体プラスミドとする。
【００７５】
組換体プラスミドを導入する宿主としては、組換体プラスミドが安定かつ自律的に増殖可能な細胞、又は微生物であれば良く、例えば宿主微生物が大腸菌に属する微生物の場合、大腸菌ＢＬ２１、大腸菌ＤＨ１、大腸菌 ＪＭ１０９、大腸菌ＪＭ１０１、大腸菌 Ｗ３１１０、大腸菌Ｃ６００等を含む、大腸菌Ｂ株、Ｋ株、Ｃ株やそれらの溶原菌が利用できる。又、宿主微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物の場合、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ等、放線菌に属する微生物の場合、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓＴＫ２４等、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに属する微生物の場合、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＩＮＶＳＣ１等が使用できる。本発明においては大腸菌を宿主微生物とする事が好ましい。
【００７６】
第一の酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いて該酵素を形成させる事ができる好適なその他の例としては、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌における組換酵素を形成する方法が挙げられる（特許第３９４４５７７号公報、特許第３７９３８１２号公報）。具体的には、低温での組換酵素の形成に適したｐＴｉｐ ＱＣ１やｐＴｉｐ ＱＣ２等のプラスミドベクターに、第一の酵素をコードする塩基配列を挿入し、その組換体プラスミドをリゾチーム感受性微生物に導入した形質転換体を用いる方法が示される。リゾチーム感受性微生物としてはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物が好ましい（特許第３８７６３１０号公報）。
【００７７】
第一の酵素を形成する天然の微生物や、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体等の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。培養温度は宿主となる微生物が発育し、第一の酵素が形成される範囲で適宜変更し得るが、大腸菌の場合、下限が１０℃以上、好ましくは２０℃以上、更に好ましくは２５℃以上、上限が４５℃以下、好ましくは４２℃以下、更に好ましくは３８℃以下である。放線菌の場合、下限が４℃以上、好ましくは１０℃以上、更に好ましくは２０℃以上、上限が５０℃以下、好ましくは４２℃以下、更に好ましくは３７℃以下である。培養条件は、条件によって多少異なるが、第一の酵素が最高形成量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すれば良く、大腸菌の場合、通常は下限が１０時間以上、好ましくは１２時間以上、更に好ましくは１７時間以上、上限が６０時間以下、好ましくは４８時間以下、更に好ましくは３０時間以下である。放線菌の場合、通常は下限が１７時間以上、好ましくは２０時間以上、更に好ましくは２４時間以上、上限が８０時間以下、好ましくは７２時間以下、更に好ましくは４８時間以下である。培地のｐＨは菌が発育し、第一の酵素を形成する範囲で適宜変更し得るが、大腸菌や放線菌の場合、好ましくは下限としてｐH５．８以上、好ましくはｐH６．２以上で、上限としてｐH８．５以下、好ましくはｐH７．５以下である。
【００７８】
第一の酵素は、上記のように形成された第一の酵素を取得する工程を含む方法によって製造できるが、簡便には殺菌、非殺菌を問わず菌体を含む細胞等のままであっても良いが、培養不純物や細胞破砕物等を軽く除いた不純物がある酵素とすることも好ましい。さらに第一の酵素の粗酵素は、目的や用途等場合によっては実質的に不純物を包含しないようにすることも好ましいが、通常は、例えば５０％以上、７０％以上、９５％以上の各種の純度にすることが例示される。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥやＨＰＬＣ等の公知の方法で確認すれば良い。
【００７９】
第一の酵素を、上記の探索し選別した天然の微生物や、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体の微生物等を培養し取得することによって製造する場合、まず、該微生物等を栄養培地で培養して菌体内又は培養液中に該酵素を形成させ、菌体内に形成される場合には培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠心分離等の手段により菌体を採集する。次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチーム等の酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ、及び／又は適当な界面活性剤等を添加して該酵素を濃縮するか濃縮する事なく、アセトン、メタノール、エタノール等の有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩等による塩析法等を適用して第一の酵素を沈殿させ回収する。この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーや疎水的クロマトグラフィーにより処理して、第一の酵素を得ることができる。又、これらの方法を適宜組み合わせて行うことができる。又、本発明の酵素が培養液中に形成される場合には、培養物を濾過又は遠心分離等の手段により菌体を除去し、培養液について、前記菌体内に形成される場合と同様の処理を行えばよい。
【００８０】
かくして得られる第一の酵素は安定化剤又は賦型剤として、各種の塩類、糖類、酵素、脂質、界面活性化剤等を加え、あるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥等の方法により、液状又は固形の第一の酵素を得ることができ、又、適宜凍結乾燥を行う場合、安定化剤又は賦型剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミン等を０．５〜１０％程度添加しても良い。
【００８１】
本発明の第一の酵素を形成する天然の微生物の典型的な例は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株である。本発明の測定方法の工程（１）における第一の酵素のアミノ酸配列の典型的な例としては、配列表配列番号１のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列をコードする塩基配列の一例は配列表配列番号２の塩基配列である。該塩基配列はＨ．Ｓ．Ｓｔａｎｌｅｙら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６巻、１７４頁、２００５年によりＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株の全ゲノム解析で明らかにされていたが、該塩基配列がコードする酵素の性質はこれまでに解明されておらず、単にリボキナーゼらしいとして予想されていた。すなわち、配列表配列番号２の塩基がコードする配列表配列番号１のアミノ酸配列が、ミゾリビン及び／又はリバビリンに対する反応を触媒することは従来全く知られていなかった。
【００８２】
本発明の第二の酵素の製造方法について説明する。
本発明の第二の酵素は、上記の第一の酵素の場合と同様に、公知の方法により、自然界から該第二の酵素を形成する天然の生物を探索し、該生物の細胞から取得すれば良い。ミゾリビン及び／又はリバビリンによる該第二の酵素の阻害は、例えば、ミゾリビン及び／又はリバビリンの存在下と非存在下における該第二の酵素の反応速度の差を比較して確認できる。リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンによる第二の酵素の阻害は、第二の酵素の反応速度を、例えば、リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの存在下と非存在下における該第二の酵素の反応速度の差を比較して確認できる。阻害定数を算出して比較する場合は、蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版、堀尾武一、１９９４年南光堂参照）に記載の方法等で算出して確認すれば良い。リン酸化ミゾリビン又はリン酸化リバビリンは、後述のミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとするリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの製造方法で製造すれば良いし、Ｓｈｕｔｏ Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１巻、３６０３頁、２０００年に記載の方法で合成しても良い。
【００８３】
第二の酵素の塩基配列取得方法、バイオインフォマティクス手法による塩基配列と該酵素を生産する生物の情報の取得方法、形成方法、及び取得する工程を含む方法による製造方法等については上記の第一の酵素の場合と同様である。
【００８４】
本発明の第二の酵素の典型的な例は、イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼである。本発明の第二の酵素を形成する天然の微生物の典型的な例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株である。本発明の測定方法の工程（２）における第二の酵素のアミノ酸配列の典型的な例としては、配列表配列番号７又は配列表配列番号９のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列をコードする塩基配列の一例は配列表配列番号８又は配列表配列番号１０の塩基配列である。配列表配列番号８の塩基配列は、Ｗｕ Ｔ．Ｗ．ら、Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５１巻、１３９１頁、１９７３年によりイノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼをコードする事は明らかにされていたが、該イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼがミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、リン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害されることは従来全く知られていなかった。又、配列表配列番号１０の塩基配列は、Ｔａｋａｍａｍｉ Ｈ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．、３０巻、３９２７頁、２００２年によりＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株の全ゲノム解析で明らかにされていたが、該塩基配列がコードする酵素の性質はこれまでに解明されておらず、配列表配列番号１０の塩基がコードする配列表配列番号９のアミノ酸配列が、イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼであることは従来知られていなかった。更に、該酵素がミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの両方で阻害されることは従来全く知られていなかった。
【実施例】
【００８５】
以下、本発明を実施例等に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定して解釈されない。尚、常法に従い、と記述した技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２年、１９８９年）や上記の蛋白質・酵素の基礎実験法、市販の各種酵素、又は、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。又、以下に示した測定値等は測定の条件や使用機器の精度等によりその値は変化し得る。
【００８６】
尚、本発明で使用する試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業株式会社製、シグマアルドリッチ社製、タカラバイオ株式会社製等であり、市販で容易に入手できるものを使用することができる。ＤＳＭ菌株はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨで購入できる。ＡＴＣＣ菌株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎで購入できる。試薬のメーカーや純度等は特に限定されない。又、本発明で使用した血清などの生体材料は、市販品、又は、インフォームド・コンセント（使用目的の情報を正しく伝えた上での合意）を得たものである。
【００８７】
本発明の第一の酵素の活性量は下記の活性測定法１又は活性測定法３で、本発明の第二の酵素の活性量は下記の活性測定法２で測定した。本発明の第一の酵素の活性測定法３は、反応工程が少ないので簡便に正確な活性値が測定できる。本発明の第一の酵素の活性測定法１は任意の物質を基質として測定が可能である。尚、本明細書において、本発明の第一の酵素の活性量を特定する必要がある際には、測定法を特に断らない限り、全て活性測定法１における活性量として換算して表記する。換算に際しては、同じ検体を各測定方法で測定し、その値の変化量の比率から換算できる。変化量の比率は、測定の条件や使用機器の精度等によりその値は変化し得るが、測定法１：測定法３＝０．７：３．０が例示される。
【００８８】
［活性測定法１］
［反応試薬混合液］
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
２０ｍＭ グルコース
１ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
１ｍＭ 塩化マグネシウム
１ｍＭ ＮＡＤＰ
５０ｍＭ ＫＣｌ
５Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ依存性ＨＫ（旭化成ファーマ株式会社製）
１ｍＭ ミゾリビン
石英製の１．０ｃｍキュベットに反応試薬混合液を１．３ｍｌ量りとり、３７℃で２分間予備加温する。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５で適当な濃度に希釈した第一の酵素溶液を０．０３ｍｌ加えて混和し３７℃で反応を開始する。反応開始後３４０ｎｍにおける吸光度を測定して直線的に反応している１分間当たりの吸光変化を求める。求められた吸光変化をＡｓ／ｍｉｎ、第一の酵素溶液の代わりに精製水を用いた盲検をＡｂ／ｍｉｎとして、酵素活性（Ｕ／ｍｌ）は（式２）で算出する。
（式２）
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（Ａｓ／ｍｉｎ−Ａｂ／ｍｉｎ）／６．２２｝×１．３３／０．０３×希釈倍数
【００８９】
［活性測定法２］
［反応試薬混合液］
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０
２ｍＭ イノシン５’一リン酸
２ｍＭ ＮＡＤ、５０ｍＭ ＫＣｌ
石英製の１．０ｃｍキュベットに反応試薬混合液を２ｍｌ量りとり、３７℃で２分間予備加温する。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で適当な濃度に希釈した第二の酵素溶液を０．０３ｍｌ加えて混和し３７℃で反応を開始する。反応開始後３４０ｎｍにおける吸光度を測定して直線的に反応している１分間当たりの吸光変化を求める。求められた吸光変化をＡｓ／ｍｉｎ、第二の酵素溶液の代わりに精製水を用いた盲検をＡｂ／ｍｉｎとして、酵素活性（Ｕ／ｍｌ）は（式３）で算出する。
（式３）
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（Ａｓ／ｍｉｎ−Ａｂ／ｍｉｎ）／６．２２｝×２．０３／０．０３×希釈倍数
【００９０】
［活性測定法３］
［反応試薬混合液１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
５ｍＭ イノシン
５０ｍＭ 塩化カリウム
［反応試薬混合液２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ９．０
１３Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
２０ｍＭ ＮＡＤ
５０ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
２００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ９）
石英製の１．０ｃｍキュベットに反応試薬混合液を１．０ｍｌ量りとり、３７℃で２分間予備加温する。３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で適当な濃度に希釈した本発明の酵素溶液を０．０１ｍｌ加えて混和し、３７℃で反応を開始する。反応開始５分後に０．１Ｎの塩酸を２ｍｌ混和して反応を止め、５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光変化を求める。求められた吸光変化をＡｓ／ｍｉｎ、第一の酵素溶液の代わりに精製水を用いた盲検をＡｂ／ｍｉｎとして、酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を下記（式４）で算出する。
（式４）
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（Ａｓ／ｍｉｎ−Ａｂ／ｍｉｎ）／１９｝×３．０１／０．０１×希釈倍数
【００９１】
［蛋白質濃度測定］
本発明の第一の酵素及び第二の酵素等の蛋白質濃度はバイオラッド社のプロテインアッセイキットを用いて常法にて測定し、ＢＳＡをスタンダードとして算出した。
【００９２】
［実施例１］
＜ミゾリビンをリン酸化し得る酵素の探索１＞
堆肥中から常法にて分離した微生物を０．５％のイノシンを含む１００ｍｌのＬＢ培地で３７℃１７時間培養して遠心分離して菌体を得た。菌体を１０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５で懸濁して超音波破砕し、遠心分離して粗酵素液を得た。下記の反応液５００μｌに粗酵素液１０μｌを添加し３７℃で３０分間反応した。反応後の反応液を精製水で１０倍希釈して、２５μｌをＨＰＬＣで分離した。ＨＰＬＣは昭和電工社製のＡｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−３２０を使用し、移動相は２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで室温でにおいて実施し、２６０ｎｍの吸光をモニターしたところ、ミゾリビンをリン酸化し得る活性、すなわち、本発明の第一の酵素の活性が検出されたので、該微生物を第一の酵素を形成する微生物として選別した。上記の粗酵素液１０ｍｌを１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で充分に洗浄した後、０及び０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度１５％になるように硫酸アンモニウムを添加し、１５％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着して１５及び０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で脱塩した後、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で充分に洗浄した後、０及び０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２５で脱塩して、第一の酵素を得た。該酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離しメイン蛋白をＰＶＤＦ膜にブロッティングしプロテインシーケンスした所、本実施例で得た本発明の第一の酵素は、大腸菌のグアノシンイノシンキナーゼであることが判明した。本実施例で得た第一の酵素の比活性は、０．０１Ｕ／ｍｇ以下であった。そこで、Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４巻、９７２頁、２０００年に記載の方法に従って、大腸菌ＪＭ１０９のグアノシンイノシンキナーゼを大量発現する形質転換体を調整し、該グアノシンイノシンキナーゼを取得し、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素活性を検出した所、上記と同様な結果が得られた。
［反応液］１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５、３０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＡＴＰ ｐＨ７、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭミゾリビン。
【００９３】
［実施例２］
＜ミゾリビンをリン酸化し得る酵素の探索２＞
Ｔｈｏｍａｓ Ｈａｎｓｅｎら、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ、１１巻、１０５−１１４頁、２００７年に記載の方法に従ってＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のホスホフルクトキナーゼ−Ｂ（Ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ−Ｂ）を調整した。具体的には、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＤＳＭ２６６１株をテンプレートに配列表配列番号１３と配列表配列番号１４のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した遺伝子をｐＥＴ１７ｂにライゲーションし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換体をＬＢ培地で培養しＩＰＴＧで該遺伝子がコードするホスホフルクトキナーゼ−Ｂを誘導発現し、該酵素を上記実施例１と同様の方法で精製した。精製酵素は上記実施例１と同様のＨＰＬＣにより、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素活性、すなわち、本発明の第一の酵素の活性があることを確認した。本実施例で得た第一の酵素の比活性は、約０．０２Ｕ／ｍｇであった。
【００９４】
［実施例３］
＜ミゾリビンをリン酸化し得る酵素の探索３＞
Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＤＳＭ４３０４株をテンプレートに配列表配列番号１５と配列表配列番号１６のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した遺伝子をｐＥＴ２１ａ（＋）にライゲーションし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換体をＬＢ培地で培養しＩＰＴＧで該遺伝子がコードする酵素を誘導発現し、該酵素を上記実施例１と同様の方法で精製した。精製酵素は実施例１と同様のＨＰＬＣにより、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素活性、すなわち、本発明の第一の酵素の活性があることを確認した。本実施例で得た第一の酵素の比活性は、０．０１Ｕ／ｍｇ以下であった。
【００９５】
［実施例４］
＜ミゾリビンをリン酸化し得る酵素の探索４＞
Ｂ．Ｓａｈｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２７１巻、３５４７頁、２００４年に記載の方法を参考にマウス由来アデノシンキナーゼを調整した。具体的には、マウスｂｒａｉｎのｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をテンプレートに配列表配列番号１７と配列表配列番号１８のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した遺伝子をｐＥＴ２１ａ（＋）にライゲーションし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換体をＬＢ培地で培養しＩＰＴＧで該遺伝子がコードする酵素を誘導発現し、該酵素を上記実施例１と同様の方法で精製した。精製酵素は実施例１と同様のＨＰＬＣにより、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素活性、すなわち、本発明の第一の酵素の活性があることを確認した。本実施例で得た第一の酵素の比活性は、０．０１Ｕ／ｍｇ以下であり、実施例２で得た第一の酵素の反応速度と比較して、約二分の一であった。ところで、マウス由来のアデノシンキナーゼとヒト由来のアデノシンキナーゼは、アミノ酸配列における相同性が約９０％と近似しており、活性中心のアミノ酸も保存されていることから、マウス由来のアデノシンキナーゼとヒト由来のアデノシンキナーゼは同様の性質であると予想できる（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９９８年、６巻、１８３−１９３頁等）。すなわち、ヒト由来のアデノシンキナーゼもマウス由来のアデノシンキナーゼと同様に本発明の第一の酵素となり得て、比活性は０．０１Ｕ／ｍｇ以下と推定されるが、実施例２で得た第一の酵素の方が、反応速度として、約二倍良好であると予想できる。
【００９６】
［実施例５］
＜ミゾリビンをリン酸化し得る酵素の探索５＞
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株を０．５％のイノシンを含む１００ｍｌのＬＢ培地で３０℃２日間培養して遠心分離して菌体を得た。菌体を１０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５で懸濁して超音波破砕し、遠心分離して粗酵素液を得た。粗酵素液は実施例１と同様のＨＰＬＣにより、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素活性、すなわち、本発明の第一の酵素の活性があることを確認した。
【００９７】
［実施例６］
＜ＤＮＡの抽出＞
ＬＢ培地を使用して３０℃２日間培養して集菌したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株の菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるよう添加して菌体を溶解した。更に等量のフェノール／クロロホルムの１：１混合液を加え、３０分攪拌した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分間）して水層を回収した。回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液（以下ＴＥと記載する場合もある）に溶解し、適量のＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルムの１：１混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。この染色体をＴＥに溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１：１混合液を加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層に３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）とエタノールを加え、撹拌後、−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株のＤＮＡ標品を得た。
【００９８】
［実施例７］
＜ＰＣＲ法による配列表配列番号２に示す遺伝子の増幅＞
ｐＴｉｐ ＱＣ１又はｐＴｉｐ ＱＣ２（特許第３９４４５７７号公報、及び特許第３７９３８１２号公報）のマルチクローニングサイトＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ部位に配列表配列番号２の遺伝子を挿入するように、配列表配列番号３と配列表配列番号４のプライマーを設計した。ＰＣＲは、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いた。ＰＣＲ条件は、使用説明書記載の方法に従った。得られた約１．０ｋｂｐのＰＣＲ産物は、常法に従って精製した。
【００９９】
［実施例８］
＜発現ベクターとのライゲーション＞
実施例７で精製したＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより常法に従って制限酵素処理しインサートとした。常法に従って精製したインサートはＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより制限酵素処理し精製したｐＴｉｐ ＱＣ１又はｐＴｉｐ ＱＣ２と常法に従ってライゲーションし、ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ及びｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫを作成した。ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ及びｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫを大腸菌ＤＨ５αに常法に従って導入して形質転換し、コロニーダイレクトＰＣＲ法によるポジティブクローンから精製した組換体プラスミドは、ＤＮＡシーケンスによりインサート配列が正しい事を確認した。
【０１００】
［実施例９］
＜ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ、及びｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓへの形質転換＞
ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ、及びｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓへの形質転換は特開２００４−０７３１１６号公報等に記載の方法に従いエレクトロポレーション法（電気穿孔法）で実施した。エレクトロポレーション条件は次のようにした。コンピテントセルを融解し、ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ、又はｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫと混合して、２ｍｍの専用チャンバーに入れ、７．５ｍＳ、２５００Ｖ、２５μＦ、４００Ωでパルスをかけた。
【０１０１】
［実施例１０］
＜発現チェック＞
実施例９で得た形質転換体を３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で２日間培養してシードとした。３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと１μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＬＢ培地に上記のシードを１／１０量植菌し、３０℃で１日間培養した。培養液を遠心分離して集菌し、培養液の１／５倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。粗酵素液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図１に示すが、酵素の大量発現が確認された。尚、図１（Ａ）中矢印がｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ、図１（Ｂ）中矢印がｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫの形質転換体で発現した第一の酵素（ＢｔｈＮＫ）（ミゾリビンをリン酸化し得る酵素）である。
【０１０２】
［実施例１１］
＜ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ形質転換体からミゾリビンをリン酸化し得る酵素の精製＞
実施例１０でｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ形質転換体を培養して得られた粗酵素液を０．１Ｍの塩化ニッケル、及び０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＣｈｅｒａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ８．０で充分に洗浄した後、１０％グリセロール及び０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０で充分に洗浄した。０．４Ｍイミダゾール、１０％グリセロール及び０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０にて溶出した。活性画分は０．０３Ｍの塩化ナトリウム、０．０５ＭのＫＣｌ及び１ｍＭのＤＴＴを含む３０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で透析して第一の酵素（ＢｔｈＮＫ）（ミゾリビンをリン酸化し得る酵素）を得た。本実施例で得たＢｔｈＮＫの比活性は、約０．０４Ｕ／ｍｇであった。１Ｌの培養で約８０ｍｇのＢｔｈＮＫを得た。
【０１０３】
［実施例１２］
＜ｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫ形質転換体からミゾリビンをリン酸化し得る酵素の精製＞
実施例１０でｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫ形質転換体を培養して得られた粗酵素液を１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＢＢ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で充分に洗浄した後、０及び０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度１５％になるように硫酸アンモニウムを添加し、１５％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦに吸着して１５及び０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＤＥＡＥ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で充分に洗浄した後、０及び０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２５で脱塩して第一の酵素（ＢｔｈＮＫ）（ミゾリビンをリン酸化し得る酵素）を得た。本実施例で得たＢｔｈＮＫの比活性は、約０．０４Ｕ／ｍｇであった。１Ｌの培養で約５０ｍｇのＢｔｈＮＫを得た。
【０１０４】
［実施例１３］
＜ｐＥＴシステムを使用したミゾリビンをリン酸化し得る酵素の発現＞
実施例７で得られたインサートは、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより制限酵素処理し精製したｐＥＴ２１ａ（＋）と常法に従ってライゲーションし、ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＢｔｈＮＫを作成した。ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＢｔｈＮＫを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に常法に従って導入して形質転換し、コロニーダイレクトＰＣＲ法によるポジティブクローンから精製した組換体プラスミドは、ＤＮＡシーケンスしてインサート配列が正しい事を確認した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌した。３０℃で１日間培養してシードとした。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に上記のシードを１／１００量植菌し、３０℃で一日培養した。培養液中の濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、更に３０℃で３時間培養した。培養液を遠心分離して集菌し、培養液の１／５倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．５に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。粗酵素液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図２に示すが、酵素の大量発現が確認された。尚、図中矢印が本発明の第一の酵素（ミゾリビンをリン酸化し得る酵素）である。粗酵素液は実施例１２と同様の方法で精製した。本実施例で得た第一の酵素（ＢｔｈＮＫ）（ミゾリビンをリン酸化し得る酵素）の比活性は、約０．０４Ｕ／ｍｇであった。１Ｌの培養で約５０ｍｇのＢｔｈＮＫを得た。
【０１０５】
［実施例１４］
＜ミゾリビンのリン酸化方法とリン酸化ミゾリビンの製造＞
実施例１に記載の反応液５００μｌに、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５で希釈した実施例１２で調製したＢｔｈＮＫを１０μｌ添加し３７℃で３０分間反応した。反応後の反応液を実施例１と同様にＨＰＬＣで分離した。反応後のクロマト図を図３の（Ｃ）、反応前のクロマト図を図３の（Ｂ）に示す。図３の（Ａ）は同じＨＰＬＣ条件で、標品のリン酸化ミゾリビンをＨＰＬＣで分離したクロマト図である。実施例１２で調整したＢｔｈＮＫがミゾリビンをリン酸化し得る酵素活性があることが確認された。同様に実施例１３で調製したＢｔｈＮＫがミゾリビンをリン酸化し得る酵素活性があることも確認した。
【０１０６】
［実施例１５］
＜基質特異性＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫを用いた。上記の活性測定法１でミゾリビンの代わりに表１中の各基質を使用して、ＢｔｈＮＫの相対活性を測定した。表１に、相対活性を比較した基質特異性を示す。
【０１０７】
【表１】

【０１０８】
本実施例の結果から明らかなように、ＢｔｈＮＫ、すなわち、本発明の第一の酵素（ミゾリビンをリン酸化し得る酵素）は、少なくともリン酸供与体存在下で、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとする反応を触媒する。特に、アデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用し、シチジン及びキサントシンに実質的に、すなわち本実施例の条件下、作用せず、リボースにも実質的に作用しない。
又、本実施例の結果から明らかなように、ＢｔｈＮＫ、すなわち、本発明の第一の酵素（ミゾリビンをリン酸化し得る酵素）は、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンとする反応を触媒する。
【０１０９】
［実施１６］
＜至適ｐＨ＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫを用いた。活性測定法３における緩衝液をｐＨ４．５〜６．０の範囲はクエン酸／ＮａＯＨ（図４中○印）、ｐＨ６．０〜７．５の範囲はリン酸カリウム緩衝液（図４中●印）、ｐＨ７．０〜９．０の範囲はＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（図４中△印）、ｐＨ９．５はグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（図４中□印）に変更して活性測定を行い、至適ｐＨを測定した。図４に、最大活性を１００％とした相対活性（%）を示した。ＢｔｈＮＫが最大の活性を示す至適ｐＨは、ｐＨ５．５〜７．５の範囲に存在した。
【０１１０】
［実施例１７］
＜ｐＨ安定性＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫを用いてｐＨ安定性を測定した。ＢｔｈＮＫを０．４７５ｍｇ／ｍｌになるように１００ｍＭのｐＨ４．５〜６．０の範囲はクエン酸／ＮａＯＨ（図５中○印）、ｐＨ６．０〜７．５の範囲はリン酸カリウム緩衝液（図５中●印）、ｐＨ７．０〜９．０の範囲はＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（図５中△印）、ｐＨ９．５〜１１．０はグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（図５中□印）に希釈して３７℃で３時間加温処理した後、ＢｔｈＮＫの残存活性を活性測定法３で測定した。図５に示す通り、ＢｔｈＮＫは３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持した。
【０１１１】
［実施例１８］
＜熱安定性＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫを用いて熱安定性を測定した。ＢｔｈＮＫを０．４７５ｍｇ／ｍｌになるように１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０中に希釈し、各温度で２０分間熱処理した後、ＢｔｈＮＫの残存活性を活性測定法３で測定した。図６に示す通り、ＢｔｈＮＫは１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持した。
【０１１２】
［実施例１９］
＜ＢｔｈＮＫの分子量＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量は、図７に示すように約３４ｋＤａであった。配列表配列番号１のアミノ酸配列からの計算値は、３３，９９４であった。
【０１１３】
［実施例２０］
＜ＢｔｈＮＫの作用温度範囲＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫを活性測定法３で、反応温度を１５〜７０℃まで変化して、ＢｔｈＮＫのイノシンをリン酸化する反応速度を測定した（図８）。その結果をアレニウスプロットして図９に示した。図８で示した通り、作用温度の範囲は少なくとも１５〜７０℃であった。又、図９より、２０〜４５℃の間における活性化エネルギーは約６４ｋＪ／ｍｏｌであった。尚、図９中Ｔは絶対温度を示す。又、図８で５０℃以上では相対活性が上がっていないように見えるが、反応液中におけるＢｔｈＮＫの安定性やＡＴＰの分解の結果と考えられる。
【０１１４】
［実施例２１］
＜金属の利用性＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫを使用した下記の［混合物］において、表２に示した金属化合物を使用した場合の、ＢｔｈＮＫによるＡＭＰが生成する速度を測定し、結果を相対比として表２に示す。
［混合物］１ｍｌに、最終濃度１ｍＭとなるようにアデノシンを添加して３７℃で３０分間アデノシンをリン酸化した。リン酸化後の［混合物］を精製水で１０倍に希釈して、２５μｌをＨＰＬＣで分離した。ＨＰＬＣは昭和電工社製のＡｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−３２０を使用し、移動相は２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで、室温で実施し、ＡＭＰの生成量を２６０ｎｍの吸光で測定した。
［混合物］
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ ７．５
２．５ｍＭ ＡＴＰ
５ｍＭ 表２に示す金属化合物
０．５ｍＵ／ｍｌ 実施例１２により調製したＢｔｈＮＫ
【０１１５】
【表２】

【０１１６】
ＢｔｈＮＫは、少なくともマグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン又はマンガンイオンのうち、いずれか一つ以上利用することがわかった。
【０１１７】
［実施例２２］
＜ＶｍａｘとＫｍ＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫを活性測定法１で、Ｋｍ値の１／１０倍〜１０倍の間で５つ以上の異なる濃度になるように基質濃度を調製して、ラインウェーバー・バーク逆数プロットにより各見かけのＶｍａｘとＫｍ値を算出した。その結果を表３に示す。
【０１１８】
【表３】

【０１１９】
更に、実施例１２により調製したＢｔｈＮＫのイノシンに対するＶｍａｘとＫｍを別法で測定した。
［反応試薬混合液１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
５ｍＭ イノシン
５０ｍＭ ＫＣｌ
［反応試薬混合液２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０
１３Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調整したＢｓｕＩＭＰＤＨ
２０ｍＭ ＮＡＤ
５０ｍＭ ＫＣｌ
１ｍＭ ＤＴＴ
２００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ９）
石英製の１．０ｃｍキュベットに反応試薬混合液１を１．０ｍｌ量り、３７℃で２分間予備加温する。３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で適当な濃度に希釈したＢｔｈＮＫを０．０５ｍｌ加えて混和し３７℃で反応を開始する。５分後に反応試薬混合液２を１．０ｍｌ混和して、３４０ｎｍにおける吸光度を測定して吸光変化を求める。イノシン濃度及びＮＡＤ濃度はＫｍ値の１／１０倍〜１０倍の間で５つ以上の異なる濃度になるようにを調製し、ラインウェーバー・バーク逆数プロットによりイノシンに対するＫｍとＶｍａｘを算出した。その結果、Ｖｍａｘ＝１．５９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、Ｋｍ＝０．１８μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。
【０１２０】
［実施例２３］
＜ヌクレオシドのリン酸化方法とリン酸化ヌクレオシド製造＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫを使用し、ヌクレオシドのリン酸化剤として下記の［組成物］を調製し、アデノシンのリン酸化方法を実施して、アデノシンからリン酸化アデノシン（ＡＭＰ）を製造した。［組成物］１ｍｌに、最終濃度１ｍＭとなるようにアデノシンを添加して３７℃で３０分間アデノシンのリン酸化方法を実施した。アデノシンのリン酸化方法を実施後の［組成物］を精製水で１０倍に希釈して、２５μｌをＨＰＬＣで分離した。ＨＰＬＣは実施例１に記載の方法と同様に実施した。アデノシンのリン酸化方法を実施後のクロマト図を図１０の（Ｃ）、実施前のクロマト図を図１０の（Ｂ）に示す。図１０の（Ａ）は同じＨＰＬＣ条件で、標品のＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、及びアデノシン組成物をＨＰＬＣで分離したクロマト図である。本発明のミゾリビンをリン酸化し得る酵素酵素を使用したヌクレオシドのリン酸化剤で、アデノシンのリン酸化方法を実施して、アデノシンからリン酸化アデノシン（ＡＭＰ）を製造することができた。盲検は実施例１２により調製したＢｔｈＮＫの代わりに精製水を使用して実施し、実施前後のクロマト図が図１０の（Ｂ）と変化無いことを確認した。
［組成物］
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
２．５ｍＭ ＡＴＰ
５ｍＭ 塩化マグネシウム
０．５ｍＵ／ｍｌ 実施例１２により調製したＢｔｈＮＫ
【０１２１】
［実施例２４］
＜ヌクレオシド混合物の測定＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫを使用し、下記の［組成物］を作成し、アデノシン、イノシン、及びグアノシンの混合物の測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル５μｌ、Ｒ１として［組成物１］を１００μｌ、Ｒ２として［組成物２］を１００μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、１ポイントエンド、１０分反応、０−３１とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料としてアデノシン、イノシン、及びグアノシンの１：１：１混合物を合計濃度で図１１の横軸の範囲となるように調整して、測定した結果を図１１に示した。ＢｔｈＮＫを使用した組成物で、アデノシン、イノシン、及びグアノシン混合物の測定が実施できた。
［組成物１］
２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０２５Ｕ／ｍｌ ＢｔｈＮＫ
５０ｍＭ ＫＣｌ
［組成物２］
２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
２０ｍＭ グルコース
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
５０ｍＭ ＫＣｌ
５ｍＭ ＮＡＤＰ
５Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ依存性ＨＫ
【０１２２】
［実施例２５］
＜ヌクレオシドの測定＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫを使用し、下記の［組成物］を作成し、アデノシン、イノシン、及びグアノシンの測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル３μｌ、Ｒ１として［組成物］を１３０μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、５分反応、７−９とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料としてアデノシン、イノシン、及びグアノシンを用い、それぞれ図１２〜図１４の横軸の濃度範囲となるように調整して測定した結果を図１２〜図１４に示した。ＢｔｈＮＫを使用した組成物で、アデノシン、イノシン、及びグアノシンの測定が実施できた。尚、レートＡ（ＲＡＴＥ−Ａ）とは測定機器（日立７０８０形自動分析機）の測定方法の１つであり、日立７０８０形自動分析機の取扱説明書を参照すれば当業者なら理解出来る。
［組成物］
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
１ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
０．５ｍＭ 塩化マグネシウム
０．５ｍＭ ＰＥＰ
０．１ｍＭ ＮＡＤＨ
５０Ｕ／ｍｌ ピルビン酸キナーゼ
１５Ｕ／ｍｌ 乳酸脱水素酵素
２ｍＭ ＤＴＴ
２．５ｍＵ／ｍｌ ＢｔｈＮＫ
【０１２３】
［実施例２６］
＜ヌクレオシドの測定＞
実施例１２により調製したＢｔｈＮＫを使用し、下記の［組成物］を作成し、アデノシン、イノシン、及びグアノシンの測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル３μｌ、Ｒ１として［組成物］を１３０μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、５分反応、７−９とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料としてアデノシン、イノシン、及びグアノシンを用い、それぞれ図１５〜図１７の横軸の濃度範囲となるように調整して測定した結果を図１５〜図１７に示した。ＢｔｈＮＫを使用した組成物で、アデノシン、イノシン、及びグアノシンの測定が実施できた。［組成物］：２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、２０ｍＭ グルコース、１ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）、１ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ＮＡＤＰ、５０ｍＭ ＫＣｌ、５Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ依存性ＨＫ、０．６ｍＵ／ｍｌ ＢｔｈＮＫ。
【０１２４】
［実施例２７］
実施例１１により調製したＢｔｈＮＫ、実施例１２により調製したＢｔｈＮＫ及び実施例１３により調製したＢｔｈＮＫについて、同時に上述の理化学的性質＜１＞〜＜４＞の測定を行い、比較した。その結果、該３種類のＢｔｈＮＫは、上述の理化学的性質＜１＞〜＜４＞を備える酵素であることが確認できた。
【０１２５】
［実施例２８］
＜ＤＮＡの抽出＞
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ２．３％、ポテト抽出液 ０．２％を含む培地を使用してＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株を２６℃１日間培養して菌体を得た。ペプトン ５ｇ／Ｌ、酵母エキス １ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２０ｇ／Ｌ、クエン酸鉄 ０．１ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム ５．９ｇ／Ｌ、硫酸ナトリウム ３．２４ｇ／Ｌを工業用水で溶解しｐＨ７．６に調整した培地を使用してＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株を２５℃１日間培養して菌体を得た。これらの菌体から実施例５と同様の操作でＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株のＤＮＡ標品を得た。
【０１２６】
［実施例２９］
＜ＰＣＲ法による配列表配列番号８に示す遺伝子の増幅＞
実施例２８で得たＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株のＤＮＡをテンプレートに配列表配列番号１９と配列表配列番号２０のプライマーを用いてＰＣＲで遺伝子増幅した。ＰＣＲはＫＯＤＤＮＡポリメラーゼを用いて常法に従って行った。得られた約１．５ｋｂｐのＰＣＲ産物は常法に従って精製した。
【０１２７】
［実施例３０］
＜ＰＣＲ法による配列表配列番号１０に示す遺伝子の増幅＞
実施例２８で得たＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株のＤＮＡをテンプレートに配列表配列番号２１と配列表配列番号２２のプライマーを用いてＰＣＲで遺伝子増幅した。ＰＣＲはＫＯＤＤＮＡポリメラーゼを用いて常法に従って行った。得られた約１．５ｋｂｐのＰＣＲ産物は常法に従って精製した。
【０１２８】
［実施例３１］
＜発現ベクターとのライゲーション＞
実施例２９で精製したＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＳａｃＩにより常法に従って制限酵素処理しインサートとした。常法に従って精製したインサートはＸｂａＩ及びＳａｃＩにより制限酵素処理し精製したｐＨＳＧ３９９と常法に従ってライゲーションし、ｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨを作成した。ｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨを大腸菌Ｗ３１１０に常法に従って導入して形質転換し、コロニーダイレクトＰＣＲ法によるポジティブクローンから精製した組換体プラスミドは、ＤＮＡシーケンスによりインサート配列が正しい事を確認した。
【０１２９】
［実施例３２］
＜発現ベクターとのライゲーション＞
実施例２９で精製したＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＳａｃＩにより常法に従って制限酵素処理しインサートとした。常法に従って精製したインサートはＸｂａＩ及びＳａｃＩにより制限酵素処理し精製したｐＨＳＧ３９９と常法に従ってライゲーションし、ｐＨＳＧ３９９／ＯｂＩＭＰＤＨを作成した。ｐＨＳＧ３９９／ＯｂＩＭＰＤＨを大腸菌Ｗ３１１０に常法に従って導入して形質転換し、コロニーダイレクトＰＣＲ法によるポジティブクローンから精製した組換体プラスミドは、ＤＮＡシーケンスによりインサート配列が正しい事を確認した。
【０１３０】
［実施例３３］
＜ＢｓｕＩＭＰＤＨの取得＞
実施例３１で得た形質転換体を３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日間培養した。培養液を遠心分離して集菌し、培養液の１／５倍量の１ｍＭ ＤＴＴを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５に懸濁し、超音波破砕して遠心分離し、粗酵素液を得た。該粗酵素液を１ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＢＢに吸着させた。１ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で充分に洗浄した後、１ｍＭ ＤＴＴ及び０又は０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度１５％になるように硫酸アンモニウムを添加し、１ｍＭ ＤＴＴ及び１５％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦに吸着して１ｍＭ ＤＴＴ及び１５又は０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５で脱塩して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＢｓｕＩＭＰＤＨ）を得た。１Ｌの培養で約１０ｍｇのＢｓｕＩＭＰＤＨを得た。
【０１３１】
［実施例３４］
＜ＯｂＩＭＰＤＨの取得＞
実施例３２で得た形質転換体を用いて実施例３３と同様にしてＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ由来イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＯｂＩＭＰＤＨ）を得た。１Ｌの培養で約１０ｍｇのＯｂＩＭＰＤＨを得た。
【０１３２】
［実施例３５］
＜ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨの至適ｐＨ＞
実施例３３及び実施例３４で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨの至適ｐＨを測定した。上記の活性測定法２における緩衝液をｐＨ４．５〜６．０の範囲はクエン酸／ＮａＯＨ（図１８中○印）、ｐＨ６．０〜７．５の範囲はリン酸カリウム緩衝液（図１８中●印）、ｐＨ７．０〜９．０の範囲はＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（図１８中△印）、ｐＨ９．５〜１０．５はグリシン／ＮａＯＨ（図１８中□印）に変更して活性測定を行い、至適ｐＨを測定した。図１８に、最大活性を１００％とした相対活性（%）を示した。図１８で（Ａ）がＢｓｕＩＭＰＤＨで、（Ｂ）がＯｂＩＭＰＤＨである。ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨが最大の活性を示す至適ｐＨは、ｐＨ８〜９の範囲に存在した。
【０１３３】
［実施例３６］
＜ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨのｐＨ安定性＞
実施例３３及び実施例３４で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨのｐＨ安定性を測定した。ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨが１ｍｇ／ｍｌになるように１００ｍＭのｐＨ４．５〜６．０の範囲はクエン酸／ＮａＯＨ（図１９中○印）、ｐＨ６．０〜７．５の範囲はリン酸カリウム緩衝液（図１９中●印）、ｐＨ７．０〜９．０の範囲はＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（図１９中△印）、ｐＨ９．５〜１１．０はグリシン／ＮａＯＨ（図１９中□印）、ｐＨ１０．５〜１２．５はリン酸ナトリウム緩衝液（図１９中■印）に希釈して３７℃で３時間加温処理した後、残存活性を活性測定法２で測定した。図１９で（Ａ）がＢｓｕＩＭＰＤＨで（Ｂ）がＯｂＩＭＰＤＨである。ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨは３７℃、３時間でｐＨ６〜１１の範囲で７０％以上の活性を保持した。
【０１３４】
［実施例３７］
＜ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨの熱安定性＞
実施例３３及び実施例３４で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨの熱安定性を測定した。ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨが１ｍｇ／ｍｌになるように１ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０中に希釈し、各温度で３０分間熱処理した後、残存活性を活性測定法２で測定した。図２０で（Ａ）がＢｓｕＩＭＰＤＨで（Ｂ）がＯｂＩＭＰＤＨである。図２０に示す通り、ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨは１ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、６０℃、３０分間の熱処理で８５％以上の活性を保持する。
【０１３５】
［実施例３８］
＜ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨの分子量＞
実施例３３及び実施例３４で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は、図２１に示すように５２〜５４ｋＤａであった。図２１で（Ａ）がＯｂＩＭＰＤＨで（Ｂ）がＢｓｕＩＭＰＤＨである。配列表配列番号７及び配列表配列番号９のアミノ酸配列からの計算値では、ＢｓｕＩＭＰＤＨが５２，９９０、ＯｂＩＭＰＤＨが５２，４８７であった。
【０１３６】
［実施例３９］
＜ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨの活性に塩が与える影響＞
実施例３３及び実施例３４で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨの活性を、上記の活性測定法２におけるＫＣｌの濃度を変化して測定した結果を図２２の（○）で、ＫＣｌを塩化アンモニウムに換えて濃度を変化して測定しした結果を図２２の（●）で示した。図２２で（Ａ）がＯｂＩＭＰＤＨで（Ｂ）がＢｓｕＩＭＰＤＨである。ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨは５０〜１００ｍＭのＫＣｌや塩化アンモニウムで最大活性になった。
【０１３７】
［実施例４０］
＜ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨのカイネティックスパラメーター＞
実施例３３及び実施例３４で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨを使用した。上記の活性測定法２におけるＮＡＤとイノシン５’一リン酸（表中ではＩＭＰと表記した）の濃度をＫｍの１／１０倍〜１０倍の間で５つ以上の異なる濃度になるように調製して、ラインウェーバー・バーク逆数プロットでＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨのＶｍａｘとＫｍを測定して表４に示した。
上記の活性測定法２の反応試薬混合液中にミコフェノール酸（表中ではＭＰＡと表記した）をＫｉ’の１／１０倍〜１０倍の間で５つ以上の異なる濃度になるように調製して、ラインウェーバー・バークプロットの２次プロットでＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨのＫｉ’を測定して表４に示した。
上記の活性測定法２の反応試薬混合液中にリン酸化ミゾリビン、キサントシン５’一リン酸（表中ではＭＺＲ−Ｐ、ＸＭＰと表記した）、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰをＫｉの１／１０倍〜１０倍の間で５つ以上の異なる濃度になるように調製して、ディクソンプロットでＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨのＫｉを測定して表４に示した。
ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨはミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害され無かった。
阻害形式のＵＣは不拮抗阻害、ＣＯは拮抗阻害、ＮＣは非拮抗阻害、ＣＯ＋ＮＣは拮抗阻害と非拮抗阻害の混合型であることを示す。
本実施例の結果より、ＢｓｕＩＭＰＤＨ及びＯｂＩＭＰＤＨは第二の反応を触媒し得る酵素、すなわち、第二の酵素であることが確認された。
【０１３８】
【表４】

【０１３９】
［実施例４１］
＜ミゾリビンの測定１＞
実施例２により調製した第一の酵素を使用し、下記の［組成物］を作成し、ミゾリビンの測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル５μｌ、Ｒ１として［組成物１］を１００μｌ、Ｒ２として［組成物２］を５０μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、１０分反応、２３−２５とした。試料としてミゾリビンをＰＢＳでそれぞれ０〜１０μＭの範囲で調整して測定した結果を図２３に示した。実施例２により調製した第一の酵素を使用した組成物で、ミゾリビンの測定が実施できた。
［組成物１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
７５ｍＭ ＫＣｌ
５ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
１０ｍＭ 塩化マグネシウム
１ｍＭ ＤＴＴ
２ｍＭ イノシン５’一リン酸
［組成物２］
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．５
７５ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＮＡＤ
１ｍＭ ＤＴＴ
０．２Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
【０１４０】
［実施例４２］
＜リバビリンの測定＞
実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用し、下記の［組成物］を作成し、リバビリンの測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル１０μｌ、Ｒ１として［組成物１］を２００μｌ、Ｒ２として［組成物２］を１００μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、１０分反応、２０−２２とした。試料としてリバビリンをＰＢＳでそれぞれ０〜１０ｍＭの範囲で調整して測定した結果を図２４に示した。実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、リバビリンの測定が実施できた。
［組成物１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
５ｍＭ ＮＡＤ
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ ＴＸ−１００
４Ｕ／ｍｌ 実施例１２で調整したＢｔｈＮＫ
０．２Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
１ｍＭ ＤＴＴ
３０ｍＭ ＮａＣｌ
０．０５％ アジ化ナトリウム
［組成物２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ イノシン５’一リン酸
０．０５％ アジ化ナトリウム
【０１４１】
［実施例４３］
＜ミゾリビンの測定２＞
実施例１１で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用し、下記の［組成物］を作成し、ミゾリビンの測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２μｌ、Ｒ１として［組成物１］を２３０μｌ、Ｒ２として［組成物２］を１１５μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、１０分反応、２０−２２とした。試料としてミゾリビンをＰＢＳでそれぞれ０〜４０μＭの範囲で調整して測定した結果を図２５に示した。実施例１１で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、ミゾリビンの測定が実施できた。
［組成物１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
５ｍＭ ＮＡＤ
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ ＴＸ−１００
０．３Ｕ／ｍｌ 実施例１１で調整したＢｔｈＮＫ
０．２９Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
１ｍＭ ＤＴＴ
［組成物２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ イノシン５’一リン酸
【０１４２】
［実施例４４］
＜ミゾリビンの測定３＞
実施例１１で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用し、下記の［組成物］を作成し、ミゾリビンの測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２μｌ、Ｒ１として［組成物１］を２３０μｌ、Ｒ２として［組成物２］を１１５μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、１０分反応、２０−２２とした。０〜２μＭの範囲のミゾリビンを蒸留水で希釈した試料の測定結果を図２６中○で、血清（Ｓｅｒｏｎｏｒｍ Ｈｕｍａｎ（Ｓｅｒｏ社））で希釈した試料の測定結果を図２６中●で示した。実施例１１で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、蒸留水中のミゾリビンと血清中のミゾリビンの測定が実施できた。
［組成物１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
５ｍＭ ＮＡＤ
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ ＴＸ−１００
０．３Ｕ／ｍｌ 実施例１１で調整したＢｔｈＮＫ
０．０６Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
１ｍＭ ＤＴＴ
［組成物２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ イノシン５’一リン酸
【０１４３】
［実施例４５］
＜ミゾリビンの測定４＞
実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ又は実施例３４で調製したＯｂＩＭＰＤＨを使用し、下記の［組成物］を作成し、ミゾリビンの測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２μｌ、Ｒ１として［組成物１］を２３０μｌ、Ｒ２として［組成物２］を１１５μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、１０分反応、２０−２２とした。試料としてミゾリビンをＰＢＳでそれぞれ０〜４０μＭの範囲で調整して、実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物１を使用した場合を図２７中○、実施例３４で調製したＯｂＩＭＰＤＨを使用した組成物１を使用した場合を図２７中●で示した。実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ又は実施例３４で調製したＯｂＩＭＰＤＨを使用した組成物で、ミゾリビンの測定が実施できた。
［組成物１］：
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
５ｍＭ ＮＡＤ
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ ＴＸ−１００
０．３Ｕ／ｍｌ 実施例１２で調整したＢｔｈＮＫ
０．１２Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ又は実施例３４で調製したＯｂＩＭＰＤＨ
１ｍＭ ＤＴＴ
３０ｍＭ ＮａＣｌ
［組成物２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ イノシン５’一リン酸
【０１４４】
［実施例４６］
＜ミゾリビンの測定５＞
実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用して下記の［組成物］を作成し、干渉物質が測定値に与える影響を調べた。干渉物質には国際試薬社製の干渉チェックＡを使用した。図２８（Ａ）〜（Ｄ）の横軸の濃度のビリルビンＣ、ビリルビンＦ、乳ビ、ヘモグロビンを混在した血清に、ミゾリビンを２μｇ／ｍｌとなるように溶かして下記の［組成物］で測定した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２．２μｌ、Ｒ１として［組成物１］を２００μｌ、Ｒ２として［組成物２］を１００μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、１０分反応、２０−２２とした。実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、干渉物質の影響なくミゾリビンの測定が実施できた。
［組成物１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
５ｍＭ ＮＡＤ
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ ＴＸ−１００
０．４Ｕ／ｍｌ 実施例１２で調整したＢｔｈＮＫ
０．１６Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
１ｍＭ ＤＴＴ
３０ｍＭ ＮａＣｌ
［組成物２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ イノシン５’一リン酸
【０１４５】
［実施例４７］
＜ミゾリビンの測定６＞
実施例１２で調整したＢｔｈＮＫ又は実施例１３で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用し、下記の［組成物］を作成し、ミゾリビンの測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２．２μｌ、Ｒ１として［組成物１］を２００μｌ、Ｒ２として［組成物２］を１００μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、１０分反応、２０−２２とした。試料としてミゾリビンをＰＢＳでそれぞれ０〜５μｇ／ｍｌの範囲で調整して、実施例１２で調整したＢｔｈＮＫを使用した組成物１を使用した場合を図２９中○、実施例１３で調整したＢｔｈＮＫを使用した組成物１を使用した場合を図２９中●で示した。実施例１２で調整したＢｔｈＮＫ又は実施例１３で調整したＢｔｈＮＫを使用した組成物で、ミゾリビンの測定が実施できた。
［組成物１］：
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
５ｍＭ ＮＡＤ
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．４Ｕ／ｍｌ 実施例１２で調整したＢｔｈＮＫ又は実施例１３で調整したＢｔｈＮＫ０．１６Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
２ｍＭ ＤＴＴ
３０ｍＭ ＮａＣｌ
０．０５％ ＴＸ−１００
０．０５％ アジ化ナトリウム
［組成物２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５％ ＴＸ−１００
２ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ イノシン５’一リン酸
０．０５％ アジ化ナトリウム
【０１４６】
［実施例４８］
＜ミゾリビンの測定７＞
実施例１３で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用し、下記の［組成物］を作成し、ミゾリビンの測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、１０分反応、２０−２２とした。パラメーターをサンプル２μｌ、Ｒ１として［組成物１］を２００μｌ、Ｒ２として［組成物２］を１００μｌとした場合は、０〜７．５μｇ／ｍｌの範囲をＰＢＳで調整した試料を測定した（図３０（Ａ））。パラメーターをサンプル５μｌ、Ｒ１として［組成物１］を１００μｌ、Ｒ２として［組成物２］を５０μｌとした場合は、０〜０．５μｇ／ｍｌの範囲をＰＢＳで調整した試料を測定した（図３０（Ｂ））。実施例１３で調整したＢｔｈＮＫを使用した組成物で、０〜７．５μｇ／ｍｌの範囲と０〜０．５μｇ／ｍｌの範囲のミゾリビンが測定できた。
［組成物１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
５ｍＭ ＮＡＤ
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ ＴＸ−１００
０．４Ｕ／ｍｌ 実施例１３で調整したＢｔｈＮＫ
０．１２Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
１ｍＭ ＤＴＴ
３０ｍＭ ＮａＣｌ
［組成物２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ イノシン５’一リン酸
【０１４７】
［実施例４９］
＜ミゾリビンの測定８＞
実施例１１で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用し、下記の［組成物］を作成し、ミゾリビンの測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、１０分反応、２０−２２とした。パラメーターはサンプル５μｌ、Ｒ１として［組成物１］を１００μｌ、Ｒ２として［組成物２］を５０μｌとした。試料としてミゾリビン（０〜２μＭ）を血清で希釈調整した場合を図３１の●、血球を蒸留水で５倍希釈した血球破壊液で希釈調整した場合を図３１の○で示した。実施例１１で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、血清希釈の血球破壊液希釈のミゾリビンが０〜２μＭの範囲のミゾリビンが測定できた。
［組成物１］
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
５ｍＭ イノシン５’一リン酸
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ ＴＸ−１００
０．１Ｕ／ｍｌ 実施例１１で調整したＢｔｈＮＫ
［組成物２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＮＡＤ
０．０５％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
０．０６Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
【０１４８】
［実施例５０］
＜ミゾリビンの測定９＞
ヒト血清４０検体に０．５〜６．９μｇ／ｍｌの範囲でミゾリビンを添加し試料とした。該試料を実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用し、下記の［組成物］を使用して血清中ミゾリビンを測定した結果（本発明のミゾリビン測定方法）と、実施例１に記載のＨＰＬＣを使用する方法（ＨＰＬＣによるミゾリビン測定）で血清中ミゾリビンを測定した結果を比較した。図３２で示すように、本発明のミゾリビン測定方法（Ｘ軸）とＨＰＬＣによるミゾリビン測定（Ｙ軸）は、相関式が約Ｙ＝１．１Ｘ＋０．０９だった。本発明のミゾリビン測定方法は、ＨＰＬＣによるミゾリビン測定方法と同等の正確性であることが確認された。
［組成物１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
５ｍＭ ＮＡＤ
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ ＴＸ−１００
０．１９Ｕ／ｍｌ 実施例１２で調整したＢｔｈＮＫ
０．１６Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
１ｍＭ ＤＴＴ
３０ｍＭ ＮａＣｌ
［組成物２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ イノシン５’一リン酸
【０１４９】
［実施例５１］
＜リン酸化ミゾリビンの測定＞
実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用し、下記の［組成物］を作成し、リン酸化ミゾリビンの測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２μｌ、Ｒ１として［組成物１］を２３０μｌ、Ｒ２として［組成物２］を１１５μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、１０分反応、２０−２２とした。０〜３５μＭの範囲のリン酸化ミゾリビンを蒸留水で希釈した試料の測定結果を図３３に示した。実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、蒸留水中のリン酸化ミゾリビンの測定が実施できた。
［組成物１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
５ｍＭ ＮＡＤ
０．０５％ ＴＸ−１００
０．１６Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
１ｍＭ ＤＴＴ
［組成物２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ イノシン５’一リン酸
【０１５０】
［実施例５２］
＜ミゾリビンの測定１０＞
ミゾリビンを投与されている患者から採血した血清４７検体を試料とした。実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用し、下記の［組成物］を使用して血清中ミゾリビンを測定した結果（本発明のミゾリビン測定方法）と、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４３２巻、１９８８年、３４０−３４５頁に記載のＨＰＬＣを使用する方法（ＨＰＬＣによるミゾリビン測定）で血清中ミゾリビンを測定した結果を比較した。図３４で示すように、本発明のミゾリビン測定方法（Ｙ軸）とＨＰＬＣによるミゾリビン測定（Ｘ軸）は、相関式が約Ｙ＝１．１Ｘ＋０．０６だった。本発明のミゾリビン測定方法は、ＨＰＬＣによるミゾリビン測定方法と同等の正確性であることが確認された。
［組成物１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
５ｍＭ ＮＡＤ
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ ＴＸ−１００
０．１９Ｕ／ｍｌ 実施例１２で調整したＢｔｈＮＫ
０．１６Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
１ｍＭ ＤＴＴ
３０ｍＭ ＮａＣｌ
［組成物２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ イノシン５’一リン酸
【０１５１】
［実施例５３］
＜第一の酵素の比較＞
実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ、実施例２で調製したＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の第一の酵素、又は、実施例３で調製したＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来の第一の酵素、又は、実施例１２で調整したＢｔｈＮＫを使用し、下記の［組成物］を作成し、１μｇ／ｍｌのミゾリビンを測定した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル５μｌ、Ｒ１として［組成物１］を１００μｌ、Ｒ２として［組成物２］を５０μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、１０分反応、２０−２２とした。
その結果、実施例２で調製したＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の第一の酵素を使用した場合、約８０ｍＡｂｓ／分（９．３ｍＡｂｓ／分／ｍｇ）、実施例３で調製したＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来の第一の酵素を使用した場合、約８０ｍＡｂｓ／分（１６．７ｍＡｂｓ／分／ｍｇ）、実施例１２で調整したＢｔｈＮＫを使用した場合、約２００ｍＡｂｓ／分（１００ｍＡｂｓ／分／ｍｇ）の感度が得られた。この結果から、実施例１２で調整したＢｔｈＮＫは、少なくとも、実施例２で調製した第一の酵素に対して１０．７倍以上、実施例３で調製した第一の酵素に対して６倍以上の効率でミゾリビンをリン酸化している事が分かった。又この結果と、実施例４の結果を考え合わせると、実施例１２で調整したＢｔｈＮＫはマウス由来のアデノシンキナーゼ、又は、ヒト由来のアデノシンキナーゼの、２１倍以上の効率でミゾリビンをリン酸化している事が予想される。このように、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来の第一の酵素、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の第一の酵素、マウス由来のアデノシンキナーゼ、ヒト由来のアデノシンキナーゼも、本発明のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法における第一の酵素として使用することが可能であるが、通常はその酵素の使用量を増やす必要があることから、ＢｔｈＮＫが本発明の第一の酵素としては最適であることが分かった。
［組成物１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
７５ｍＭ ＫＣｌ
５ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
５ｍＭ 塩化マグネシウム
１ｍＭ イノシン５’一リン酸
１ｍＭ ＤＴＴ
８．６ｍｇ／ｍｌ 実施例２で調製した第一の酵素、又は、
４．８ｍｇ／ｍｌ 実施例３で調製した第一の酵素、又は、
２．０ｍｇ／ｍｌ 実施例１２で調整したＢｔｈＮＫ
［組成物２］
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．５
７５ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ ＮＡＤ
１ｍＭ ＤＴＴ
０．３Ｕ／ｍｌ 実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ
【０１５２】
［実施例５４］
＜第二の酵素の変異体作成＞
実施例２８、実施例２９、及び実施例３１と同様の方法でｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨを作成した。該ｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨをテンプレートとして、配列表配列番号２５、配列表配列番号２６、配列表配列番号２７、及び配列表配列番号２８のプライマーを用いて、ＰＣＲを用いた常法や実施例２８、実施例２９、及び実施例３１と同様の方法にてＢｓｕＩＭＰＤＨの２アミノ酸変異体をコードする塩基配列を含むプラスミドであるｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨ［Ｖ４３２Ｉ、Ｋ４４９Ｉ］を調整した。同様に、配列表配列番号２９、配列表配列番号３０、配列表配列番号３１、配列表配列番号３２、配列表配列番号３３、配列表配列番号３４、配列表配列番号３５、配列表配列番号３６、配列表配列番号３７、及び配列表配列番号３８のプライマーを用いて、ＢｓｕＩＭＰＤＨの５アミノ酸変異体をコードする塩基配列を含むプラスミドであるｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨ［Ｄ２９Ｎ、Ｓ３３Ｙ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ２７０Ａ、Ｖ３８７Ｅ］を調整した。同様に、ＢｓｕＩＭＰＤＨの１アミノ酸変異体をコードする塩基配列を含むプラスミドであるｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨ Ｋ３４５Ｎ及びｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨ Ｌ３６７Ｉを調整した。実施例３１と同様の方法で得たそれぞれの形質転換体を３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日間培養した。その結果ｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨ、ｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨ［Ｖ４３２Ｉ、Ｋ４４９Ｉ］、ｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨ Ｋ３４５Ｎ、ｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨ［Ｄ２９Ｎ、Ｓ３３Ｙ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ２７０Ａ、Ｖ３８７Ｅ］、及びｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨ Ｌ３６７Ｉの形質転換体の培養力価はそれぞれ０．６４Ｕ／ｍｌ、１．５７Ｕ／ｍｌ，２．６９Ｕ／ｍｌ、２．８２Ｕ／ｍｌ、及び３．０９Ｕ／ｍｌであった。これらの置換により、本発明の第二の酵素の製造方法において、本発明の第二の酵素の生産量が向上した。
【０１５３】
［実施例５５］
＜赤血球中のミゾリビンの測定＞
ヘパリン採血した全血５ｍｌにミゾリビンを１０μｇ／ｍｌになるように添加し、３７度でインキュベートした。インキュベート開始後、表５に示した時間に、インキュベートしている全血を０．５ｍｌずつサンプリングして血漿と血球を遠心分離した。血球は生理的食塩水で３回洗浄した後、０．５ｍｌの蒸留水に懸濁して超音波破砕し、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ Ｂｉｏｍａｘ−１０でろ過した。得られた血漿とろ過液のミゾリビンの濃度を実施例５２と同様の方法で測定した。結果を表５に示すように、赤血球中のミゾリビンの測定が出来た。
【０１５４】
【表５】

【０１５５】
［実施例５６］
＜白血球中のミゾリビンの測定＞
マウスリンパ腫Ｌ５１７８Ｙ細胞をＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）５００ｍｌ、ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、ペニシリン１００Ｕ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌからなる培地で培養し、細胞浮遊液濃度３×１０^６個／ｍｌとした。これにミゾリビンを５又は１０μｇ／ｍｌになるように添加し、さらに３７度で３又は１８時間培養した。培養液２０ｍｌを遠心上清と細胞に遠心分離した。細胞は１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した後、０．５ｍｌの蒸留水に懸濁して超音波破砕し、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ Ｂｉｏｍａｘ−１０でろ過した。得られた遠心上清とろ過液のミゾリビンの濃度を実施例５２と同様の方法で測定した。結果を表６に示すように、白血球中のミゾリビンの測定が出来た。
【０１５６】
【表６】

【０１５７】
［実施例５７］
＜白血球中のリン酸化ミゾリビンの測定＞
実施例５６と同様のマウスリンパ腫Ｌ５１７８Ｙ細胞浮遊液濃度３×１０^６個／ｍｌにミゾリビンを表８に示した濃度になるように添加して、さらに３７度で４時間培養した。実施例５６と同様の方法で細胞破砕ろ過液を得た。得られたろ過液のミゾリビンの濃度を実施例５２と同様の方法で、リン酸化ミゾリビンの濃度を実施例５１と同様の方法で測定した。ミゾリビンの濃度測定結果を表７に示し、リン酸化ミゾリビンの濃度測定結果を表８に示した。白血球中のミゾリビンとリン酸化ミゾリビンの測定が出来た。
【０１５８】
【表７】

【０１５９】
【表８】

【０１６０】
［実施例５８］
＜本発明の測定方法の同時再現性＞
実施例５２で使用したミゾリビンを投与されている患者から採血した血清４７検体の中から任意の１０検体を選び、本発明の測定方法の同時再現性（ｎ＝５）を測定した。ミゾリビンの測定方法は実施例５２と同様の方法で行った。〔表９〕に平均、２Ｓ．Ｄ．（標準偏差）、ＣＶ（％）（変動係数）を示した。ＣＶ（％）が大きくても１％で、本発明のミゾリビン測定方法は、同時再現性の良い方法であることがわかった。
【０１６１】
【表９】

【０１６２】
［実施例５９］
＜キャリブレーション試薬の作成＞
３．７５％シュークロース、０．５％マンニトール、及び４．５％ＮａＣｌからなる水溶液に約２５、１５、又は５μｇ／ｍｌの濃度になるようにミゾリビンを溶解して、キャリブレーション試薬の凍結乾燥用母液を作成した。これらを０．６ｍｌずつ凍結乾燥用バイアルに分注して、常法にて凍結乾燥視してキャリブレーション試薬を完成した。本キャリブレーション試薬は３ｍｌの蒸留水で溶解して使用する。キャリブレーション試薬中のミゾリビン濃度をＨＰＬＣ法にて測定したところ、２５μｇ／ｍｌの凍結乾燥用母液濃度で作成したキャリブレータは４．９０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌの凍結乾燥用母液濃度で作成したキャリブレータは３．４０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌの凍結乾燥用母液濃度で作成したキャリブレータは１．０１μｇ／ｍｌであった。
【０１６３】
［実施例６０］
＜本発明の測定方法の日内差と日間差＞
実施例５９で作成したキャリブレーション試薬を実施例５２と同様の方法で測定して、本発明の測定方法の日内差と日間差を測定した。日内差は同日内５回測定、日間差は同日内１回測定を５日間連続して行い計算した。その結果、〔表１０〕に示すように、日内差のＣＶ（％）の平均は０．６４％、日間差のＣＶ（％）の平均は１．６７％だった。Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ．、４３２巻、３４０頁、１９８８年に記載のＨＰＬＣ法の日内差と日間差が２．５０３％と３．８９８％と報告されているので、本発明のミゾリビン測定方法は、ＨＰＬＣ法と同等以上に精度良く測定できる方法であった。
【０１６４】
【表１０】

【産業上の利用可能性】
【０１６５】
簡便なミゾリビン及び／又はリバビリンを測定する方法を提供できた。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】（Ａ）ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ形質転換Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを培養して得られた粗酵素液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。（Ｂ）ｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫ形質転換Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを培養して得られた粗酵素液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２】ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＢｔｈＮＫ形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を培養した、粗酵素液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図３】（Ａ）標品のリン酸化ミゾリビンをＨＰＬＣで分離したクロマト図である。（Ｂ）実施例１４の反応前の反応液をＨＰＬＣで分離したクロマト図である。（Ｃ）実施例１４の反応後の反応液をＨＰＬＣで分離したクロマト図である。
【図４】ＢｔｈＮＫの至適ｐＨを示す図である。
【図５】ＢｔｈＮＫのｐＨ安定性を示す図である。
【図６】ＢｔｈＮＫの熱安定性を示す図である。
【図７】ＢｔｈＮＫのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図８】ＢｔｈＮＫの作用温度範囲を示す図である。
【図９】ＢｔｈＮＫの作用温度範囲をアレニウスプロットした図である。
【図１０】（Ａ）標品のＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、及びアデノシン混合物をＨＰＬＣで分離したクロマト図である。（Ｂ）実施例２３に記載のアデノシンのリン酸化方法を実施前のクロマト図である。（Ｃ）実施例２３に記載のアデノシンのリン酸化方法を実施後のクロマト図である。
【図１１】ＢｔｈＮＫを使用した組成物で、アデノシン、イノシン、及びグアノシン混合物を測定した検量線を示す図である。
【図１２】ＢｔｈＮＫを使用した組成物で、アデノシンを測定した検量線を示す図である。
【図１３】ＢｔｈＮＫを使用した組成物で、イノシンを測定した検量線を示す図である。
【図１４】ＢｔｈＮＫを使用した組成物で、グアノシンを測定した検量線を示す図である。
【図１５】ＢｔｈＮＫを使用した組成物で、アデノシンを測定した検量線を示す図である。
【図１６】ＢｔｈＮＫを使用した組成物で、イノシンを測定した検量線を示す図である。
【図１７】ＢｔｈＮＫを使用した組成物で、グアノシンを測定した検量線を示す図である。
【図１８】ＢｓｕＩＭＰＤＨ（Ａ）とＯｂＩＭＰＤＨ（Ｂ）の至適ｐＨを示す図である。
【図１９】ＢｓｕＩＭＰＤＨ（Ａ）とＯｂＩＭＰＤＨ（Ｂ）のｐＨ安定性を示す図である。
【図２０】ＢｓｕＩＭＰＤＨ（Ａ）とＯｂＩＭＰＤＨ（Ｂ）の熱安定性を示す図である。
【図２１】ＢｓｕＩＭＰＤＨ（Ｂ）とＯｂＩＭＰＤＨ（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２２】ＢｓｕＩＭＰＤＨ（Ｂ）及びＯｂＩＭＰＤＨ（Ａ）の活性にＫＣｌ（○）と塩化アンモニウム（●）が与える影響を示す図である。
【図２３】実施例２により調製した第一の酵素と実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、ミゾリビンを測定した検量線を示す図である。
【図２４】実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、リバビリンを測定した検量線を示す図である。
【図２５】実施例１１で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、ミゾリビンを測定した検量線を示す図である。
【図２６】実施例１１で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、蒸留水で希釈したミゾリビンを測定した検量線と（○）、血清で希釈したミゾリビンを測定した検量線（●）を示す図である。
【図２７】実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨ（○）又は実施例３４で調製したＯｂＩＭＰＤＨ（●）を使用した組成物で、ミゾリビンを測定した検量線を示す図である。
【図２８】実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、２μｇ／ｍｌのミゾリビンを測定する際に干渉物質が与える影響を図である。干渉物質として、（Ａ）ビリルビンＣ、（Ｂ）ビリルビンＦ、（Ｃ）乳ビ、（Ｄ）ヘモグロビンである。
【図２９】実施例１２で調整したＢｔｈＮＫ（●）又は実施例１３で調整したＢｔｈＮＫ（○）と実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、ミゾリビンを測定した検量線を示す図である。
【図３０】実施例１３で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、ミゾリビンを測定した検量線を示す図である。測定範囲が（Ａ）は０〜７．５μｇ／ｍｌ、（Ｂ）は０〜０．５μｇ／ｍｌの範囲である。
【図３１】実施例１１で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、血清で希釈したミゾリビンを測定した検量線と（●）、血球破壊液で希釈したミゾリビンを測定した検量線（○）を示す図である。
【図３２】実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物による本発明のミゾリビン測定方法（Ｘ軸）と実施例１に記載のＨＰＬＣによるミゾリビン測定（Ｙ軸）の相関図である。
【図３３】実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物で、リン酸化ミゾリビンを測定した検量線を示す図である。
【図３４】実施例１２で調整したＢｔｈＮＫと実施例３３で調製したＢｓｕＩＭＰＤＨを使用した組成物による本発明のミゾリビン測定方法（Ｙ軸）とＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４３２巻、１９８８年、３４０−３４５頁に記載のＨＰＬＣを使用する方法によるミゾリビン測定（Ｘ軸）の相関図である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）の工程を含むミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
（１）ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る第一の酵素の存在下、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する第一の反応を含む工程。
【請求項２】
下記（１）、（２）及び（３）の各工程を含む請求項１に記載のミゾリビン及び／又はリバビリンの測定方法。
（１）ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る第一の酵素の存在下、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する第一の反応を含む工程、
（２）上記第一の反応とは別異の反応であって以下＜ａ＞〜＜ｃ＞のいずれかの第二の反応を触媒し得る第二の酵素の存在下、第二の反応を進行させるに際して、上記第一の反応の結果生じた該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンと第二の酵素を接触させて該リン酸化ミゾリビン及び／又はリン酸化リバビリンの存在量に応じて第二の反応が阻害される工程、
＜ａ＞ミゾリビンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビンで阻害される反応
＜ｂ＞リバビリンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化リバビリンで阻害される反応
＜ｃ＞ミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される反応
（３）第二の反応の阻害程度を検出する工程。
【請求項３】
下記（１）、（２）及び（３）の各工程を含む請求項１又は２に記載のミゾリビンの測定方法。
（１）ミゾリビンをリン酸化し得る第一の酵素の存在下、試料中に含まれている可能性のあるミゾリビンをリン酸化する第一の反応を含む工程、
（２）上記第一の反応とは別異の反応であって、ミゾリビンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビンで阻害される反応である該第二の反応を触媒し得る第二の酵素の存在下、第二の反応を進行させるに際して、上記第一の反応の結果生じた該リン酸化ミゾリビンと第二の酵素を接触させて該リン酸化ミゾリビンの存在量に応じて第二の反応が阻害される工程、
（３）第二の反応の阻害程度を検出する工程。
【請求項４】
下記（１）、（２）及び（３）の各工程を含む請求項１又は２に記載のリバビリンの測定方法。
（１）リバビリンをリン酸化し得る第一の酵素の存在下、試料中に含まれている可能性のあるリバビリンをリン酸化する第一の反応を含む工程、
（２）上記第一の反応とは別異の反応であって、リバビリンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化リバビリンで阻害される反応である該第二の反応を触媒し得る第二の酵素の存在下、第二の反応を進行させるに際して、上記第一の反応の結果生じた該リン酸化リバビリンと第二の酵素を接触させて該リン酸化リバビリンの存在量に応じて第二の反応が阻害される工程、
（３）第二の反応の阻害程度を検出する工程。
【請求項５】
第一の酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ由来である請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
第二の酵素が、イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼである請求項２〜５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
第二の酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ由来である請求項２〜６のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素を用いる、ミゾリビン及び／又はリバビリンのリン酸化方法。
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応、又はリバビリンをリン酸化リバビリンとする反応の少なくともいずれかの反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
【請求項９】
下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素を用いる、請求項８に記載のミゾリビンのリン酸化方法。
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、ミゾリビンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ミゾリビンをリン酸化ミゾリビンとする反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
【請求項１０】
下記〔１〕〜〔３〕のいずれかの酵素を用いる、請求項８に記載のリバビリンのリン酸化方法。
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、リバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号５のアミノ酸配列及び配列表配列番号６のアミノ酸配列を含む、リバビリンをリン酸化し得る酵素、
〔３〕下記の＜１＞〜＜４＞の理化学的性質を有する酵素、
＜１＞作用
少なくともリン酸供与体存在下で、リバビリンをリン酸化リバビリンとする反応を触媒する；
＜２＞至適ｐＨ
ｐＨ５．５〜６．５；
＜３＞ｐＨ安定性
３７℃、３時間でｐＨ６〜１０の範囲で７０％以上の活性を保持する；
＜４＞熱安定性
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０の水溶液中、５０℃、２０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持する；
【請求項１１】
下記の成分を含む組成物。
（Ａ１）ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する第一の反応を触媒し得る第一の酵素
（Ａ２）リン酸供与体
（Ａ３）金属イオン
（Ａ４−１）上記第一の反応とは別異の反応であって以下＜ａ＞〜＜ｃ＞のいずれかの第二の反応を触媒し得る第二の酵素、
＜ａ＞ミゾリビンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビンで阻害される反応
＜ｂ＞リバビリンで阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化リバビリンで阻害される反応
＜ｃ＞ミゾリビン及びリバビリンの両方で阻害されず、かつ、上記第一の反応により生ずるリン酸化ミゾリビン及びリン酸化リバビリンの両方で阻害される反応
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
【請求項１２】
下記の成分を含むミゾリビン測定用の組成物である請求項１１に記載の組成物。
（Ａ１）ミゾリビンをリン酸化する第一の反応を触媒し得る第一の酵素
（Ａ２）リン酸供与体
（Ａ３）金属イオン
（Ａ４−１）上記第一の反応とは別異の反応を触媒し、ミゾリビンには阻害されず、リン酸化ミゾリビンで阻害される第二の酵素
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び、
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
【請求項１３】
下記の成分を含むリバビリン測定用の組成物である請求項１１に記載の組成物。
（Ａ１）リバビリンをリン酸化する第一の反応を触媒し得る第一の酵素
（Ａ２）リン酸供与体
（Ａ３）金属イオン
（Ａ４−１）上記第一の反応とは別異の反応を触媒し、リバビリンには阻害されず、リン酸化リバビリンで阻害される第二の酵素
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
【請求項１４】
該測定用の組成物において、下記の３成分のうち、いずれかひとつ以上が測定直前に合一される請求項１１〜１３のいずれかに記載の組成物。
（Ａ４−１）第二の酵素、
（Ａ４−２）イノシン５’一リン酸、及び
（Ａ４−３）ＮＡＤ（Ｐ）類。
【請求項１５】
ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する第一の反応を触媒し得る第一の酵素が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ由来である請求項１１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
第二の反応を触媒し得る第二の酵素が、イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼである請求項１１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
第二の反応を触媒し得る第二の酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ由来である請求項１１〜１６のいずれかに記載の組成物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【公開番号】特開２００９−１４２２６２（Ｐ２００９−１４２２６２Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１７０００（Ｐ２００８−２１７０００）
【出願日】平成２０年８月２６日（２００８．８．２６）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】