メチシリン耐性ブドウ球菌感染症の検出方法
【構成】 本発明のＭＲＳＡ検出方法は、採集血液体に、直接、メチシリン耐性ブドウ球菌におけるｍｅｃＡ遺伝子の５′末端側から８００塩基までの領域に基づいて作製された２組のプライマーを使用し、２段階からなるポリメレ−スチェンリアクター法を実施することを特徴とする。
【効果】 本発明のＭＲＳＡ検出方法は、患者からのヘパリン採血から始めて検出結果を得るまで約４時間程度とでき、また、ファーストＰＣＲ反応において、Ｔｔｈポリメラーゼを用いることにより、ヘモグロビン存在下でも増殖が可能で、また２段階からなるＰＣＲ法によりＭＲＳＡの感度が飛躍的に向上したものであり、敗血症又は菌血症の早期診断に有効である。
【効果】 本発明のＭＲＳＡ検出方法は、患者からのヘパリン採血から始めて検出結果を得るまで約４時間程度とでき、また、ファーストＰＣＲ反応において、Ｔｔｈポリメラーゼを用いることにより、ヘモグロビン存在下でも増殖が可能で、また２段階からなるＰＣＲ法によりＭＲＳＡの感度が飛躍的に向上したものであり、敗血症又は菌血症の早期診断に有効である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症を血液検体から直接、高感度、かつ迅速に鑑別同定する方法に関し、敗血症又は菌血症の早期診断に有効な検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、広域スペクトラムを有するセフェム系薬剤の開発により、グラム陰性杆菌の制御がある程度可能になった反面、ブドウ球菌、とくにその薬剤耐性化したＭＲＳＡは院内感染原因菌として治療上のみならず、社会的にも大きな問題となっている。
【０００３】ＭＲＳＡは皮膚、鼻腔、咽頭などでは常在菌を構成していると考えられる菌種であり、これらの部位について高感度の測定法を確立することは臨床上あまり重要ではない。ＭＲＳＡが治療上一番問題となるのは、敗血症や菌血症をきたしやすく不適切な抗生剤を使用していると急速に病態が悪化し、多臓器不全から死に至ることが多いということである。ＭＲＳＡ敗血症を多臓器不全など重篤化する以前に診断することができれば、ＭＲＳＡに対して感受性のあるバンコマイシンなどを使用することにより、現在死亡に至る症例を充分救命し得る。しかしながら、現在までの方法ではＭＲＳＡ敗血症を診断するのに臨床症状が発現し、検査を始めてから数日を要し、その間に患者の状態が悪化している事が多い。そこで、この様な状況を打破するため血中より直接、ＭＲＳＡを迅速にかつ高感度に検出する方法の開発が望まれている。
【０００４】この観点から、現在、ＭＲＳＡの検出方法は標準的な方法としてはデイスク法がある。これは血液検体を２〜３日培養し、増殖細胞を同定する方法である。さらに近年、鼻、咽腔などに存在する常在菌を培養し、増殖させてからＤＮＡ抽出し、メチシリン耐性遺伝子ｍｅｃＡの特異部分を、二重標識したプライマーを用いたポリメレ−スチェンリアクター（ＰＣＲ）法で増幅させ、その産物の有無を調べることによってＭＲＳＡを同定するＥＤ−ＰＣＲ法が考えられている。
【０００５】しかし、デイスク法は検定まで２〜３日要し、その間患者の病態が悪化し原因菌が決定された時には、すでに手遅れといった場合がある。一方、ＥＤ−ＰＣＲ法では、皮膚、鼻、咽腔からＭＲＳＡの検出を行っているが、培養増殖後にＤＮＡを抽出しており時間がかかるという問題点と、その部位では菌厳構成菌とみなされる場合があり、常在菌がそのまま感染症の原因菌となるわけではないという問題点を含んでいる。さらにこの方法は血液検体からの検出ができない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、従来のＭＲＳＡ感染症の同定方法はそれぞれ短所があり、より有効な敗血症の迅速診断法の開発が望まれる。
【０００７】本発明は上記の問題点を解消し、血液検体について直接迅速でかつ高感度なＭＲＳＡ検出方法を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】そのための本発明のメチシリン耐性ブドウ球菌感染症の検出方法は、採集血液体に、直接、メチシリン耐性ブドウ球菌におけるｍｅｃＡ遺伝子の５′末端側から８００塩基までの領域に基づいて作製された２組のプライマーを使用し、２段階からなるポリメレ−スチェンリアクター法、即ちネステード（Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法を実施することを特徴とする。
【０００９】ＭＲＳＡのメチシリン耐性化は、菌が種々のβ−ラクタム系に触れる時、誘導的に生じる、ＰＢＰ−２’と呼ばれる細胞壁合成酵素の新たな産生が主因である。本発明者等は、ＰＢＰ−２’がｍｅｃＡと呼ばれる約２．２ｋｂの構造遺伝子に支配されていることに注目し、ＰＣＲ反応で使用する２組のプライマーをｍｅｃＡ遺伝子の特異的配列に基づいてデザインした。さらに、本発明においては、ＤＮＡを血液中の細菌から抽出するため、血液中のヘモグロビンによる酵素活性阻害を受けにくいＴｔｈポリメラーゼを用いることにより解決できる。
【００１０】
【作用及び発明の効果】本発明のＭＲＳＡ検出方法では、患者からのヘパリン採血から始めて検出結果を得るまで約４時間程度である。また、ファーストＰＣＲ反応において、Ｔｔｈポリメラーゼを用いることにより、ヘモグロビン存在下でもＤＮＡの増幅を可能とでき、２段階からなるＰＣＲ法によりＭＲＳＡの感度を飛躍的に向上させることができ、敗血症又は菌血症の早期診断に有効である。
【００１１】
【実施例】採集された血液２ｍｌをヘパリン処理し、蒸留水１０ｍｌを加え放置し、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除き、細胞溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．５％ＮＰ−４０）１００μｌ、リゾスタフィン１０μｇを加え３７℃で１時間反応させ、１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心を行い、その上清にＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ５μｌを加混和後１分間沸騰させ、さらに１分間氷冷し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心を行いＧＥＮＥＣＬＥＡＮ IIR キット（フナコシ社）でＤＮＡの精製を行った。
【００１２】次いで、この精製されたＤＮＡを用い、ネステードＰＣＲ反応を図１に示すように行った。すなわち、ＤＮＡ６μｌ、プライマー１：５′−ＡＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧ−３′（２５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、プライマー２：５′−ＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＧＧＴＡＴＣＡＴＣ−３′（２５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｔｔｈポリメラーゼ２．５単位をＰＣＲ混合液に加え、ファーストＰＣＲ反応を行った。
【００１３】反応条件はＤＮＡ変性：９４℃、１分、アニーリング：５５℃、１分、エックステンション：７２℃、２分で３０サイクルのＤＮＡ増幅を行った。
【００１４】得られたＰＣＲ産物１μｌに、ビオチンとデニトロフェニル（ＤＮＰ）で標識したプライマー３：５’−ＡＡＧＣＧＡＴＡＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＡＧ−３′（２５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、プライマー４：５′−ＧＧＡＡＣＧＡＴＧＣＣＴＡＡＴＣＴＣＡＴ−３′（２５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位をＰＣＲ混合液に加え、セカンドＰＣＲ反応を行った。
【００１５】反応条件はＤＮＡ変性：９４℃、１分、アニーリング：６０℃、１分、エックステンション：７２℃、２分で３０サイクルのＤＮＡ増幅を行った。
【００１６】尚、上記実施例において使用したＰＣＲ混合液は、１０ＸＰＣＲ緩衝液５μｌ、１０ＸｄＮＴＰ４μｌ、蒸留水３２．８μｌからなり、また、使用したプライマーは、ＤＮＡ合成装置（ミリポア社製）を使用して作製した。
【００１７】次に、目的ＤＮＡ増幅の有無の確認は、ストレプトアビシン固定化プレートに、増幅ＤＮＡと抗ＤＮＰ抗体を加え、室温で反応させた後、洗浄し、発色液ｐ−ニトロフェニルホスフェイト（ｐＮＰＰ）を加え、４０５ｎｍの光の吸収率を調べることによって行うか、或いはアガロースゲル電気泳動法によっても確認できる。
【００１８】図２は、アガロースゲル電気泳動法によって得られたチャートの模式図であり、図中（ａ）は、上記実施例に基づいて２血液検体について試験した結果を１．２．で示す。尚、図２において、横線により発色部位を示し、横線部が密であるほどＤＮＡの増幅量が大きいことを示す。また図２には、同時に比較例である（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）（ｆ）（ｇ）を同時に示す。
【００１９】比較例である（ｂ）は、上記実施例におけるファーストＰＣＲ反応において、Ｔｔｈポリメラーゼに代えてＴａｑポリメラーゼを同量使用した場合である。尚、プライマーは実施例と同一のものを使用した（以下同様）。
【００２０】（ｃ）は上記実施例において、血液検体から細菌をまず分離した後、ＤＮＡを抽出し、Ｔｔｈポリメラーゼに代えてＴａｑポリメラーゼを同量使用してファーストＰＣＲ反応を行い、次いで実施例と同様にしてネステードＰＣＲ法を行った場合である。
【００２１】また、（ｄ）は上記実施例において、セカンドＰＣＲ反応を省略した場合である。（ｅ）は上記（ｂ）において、セカンドＰＣＲ反応を省略した場合である。（ｆ）は上記（ｃ）において、セカンドＰＣＲ反応を省略した場合である。（ｇ）は標準試料の電気泳動パターンである。
【００２２】図２からわかるように、目的のバンドは図中、Ｘで示すものであり、本発明である（ａ）の場合には、２血液検体のいずれの場合にも検出ができたが、比較例である（ｂ）の場合、即ち、実施例におけるファーストＰＣＲ反応において、Ｔｔｈポリメラーゼに代えてＴａｑポリメラーゼを同量使用した場合では繰り返し実験の内、第１血液検体の場合には検出できなかった。
【００２３】このことから、本発明によると、ネステード（Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法を実施することにより、容易にＭＲＳＡ感染症を検出することが可能であり、特に、ファーストＰＣＲ法において、Ｔｔｈポリメラーゼを使用するとより確実に検出できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ネステード−ＰＣＲ法の概説図である。
【図２】図２は、アガロースゲル電気泳動法で得られたチャートの模式図であり、目的ＤＮＡ増幅の有無を示すものである。
【符号の説明】
Ｘは目的のバンド
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症を血液検体から直接、高感度、かつ迅速に鑑別同定する方法に関し、敗血症又は菌血症の早期診断に有効な検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、広域スペクトラムを有するセフェム系薬剤の開発により、グラム陰性杆菌の制御がある程度可能になった反面、ブドウ球菌、とくにその薬剤耐性化したＭＲＳＡは院内感染原因菌として治療上のみならず、社会的にも大きな問題となっている。
【０００３】ＭＲＳＡは皮膚、鼻腔、咽頭などでは常在菌を構成していると考えられる菌種であり、これらの部位について高感度の測定法を確立することは臨床上あまり重要ではない。ＭＲＳＡが治療上一番問題となるのは、敗血症や菌血症をきたしやすく不適切な抗生剤を使用していると急速に病態が悪化し、多臓器不全から死に至ることが多いということである。ＭＲＳＡ敗血症を多臓器不全など重篤化する以前に診断することができれば、ＭＲＳＡに対して感受性のあるバンコマイシンなどを使用することにより、現在死亡に至る症例を充分救命し得る。しかしながら、現在までの方法ではＭＲＳＡ敗血症を診断するのに臨床症状が発現し、検査を始めてから数日を要し、その間に患者の状態が悪化している事が多い。そこで、この様な状況を打破するため血中より直接、ＭＲＳＡを迅速にかつ高感度に検出する方法の開発が望まれている。
【０００４】この観点から、現在、ＭＲＳＡの検出方法は標準的な方法としてはデイスク法がある。これは血液検体を２〜３日培養し、増殖細胞を同定する方法である。さらに近年、鼻、咽腔などに存在する常在菌を培養し、増殖させてからＤＮＡ抽出し、メチシリン耐性遺伝子ｍｅｃＡの特異部分を、二重標識したプライマーを用いたポリメレ−スチェンリアクター（ＰＣＲ）法で増幅させ、その産物の有無を調べることによってＭＲＳＡを同定するＥＤ−ＰＣＲ法が考えられている。
【０００５】しかし、デイスク法は検定まで２〜３日要し、その間患者の病態が悪化し原因菌が決定された時には、すでに手遅れといった場合がある。一方、ＥＤ−ＰＣＲ法では、皮膚、鼻、咽腔からＭＲＳＡの検出を行っているが、培養増殖後にＤＮＡを抽出しており時間がかかるという問題点と、その部位では菌厳構成菌とみなされる場合があり、常在菌がそのまま感染症の原因菌となるわけではないという問題点を含んでいる。さらにこの方法は血液検体からの検出ができない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、従来のＭＲＳＡ感染症の同定方法はそれぞれ短所があり、より有効な敗血症の迅速診断法の開発が望まれる。
【０００７】本発明は上記の問題点を解消し、血液検体について直接迅速でかつ高感度なＭＲＳＡ検出方法を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】そのための本発明のメチシリン耐性ブドウ球菌感染症の検出方法は、採集血液体に、直接、メチシリン耐性ブドウ球菌におけるｍｅｃＡ遺伝子の５′末端側から８００塩基までの領域に基づいて作製された２組のプライマーを使用し、２段階からなるポリメレ−スチェンリアクター法、即ちネステード（Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法を実施することを特徴とする。
【０００９】ＭＲＳＡのメチシリン耐性化は、菌が種々のβ−ラクタム系に触れる時、誘導的に生じる、ＰＢＰ−２’と呼ばれる細胞壁合成酵素の新たな産生が主因である。本発明者等は、ＰＢＰ−２’がｍｅｃＡと呼ばれる約２．２ｋｂの構造遺伝子に支配されていることに注目し、ＰＣＲ反応で使用する２組のプライマーをｍｅｃＡ遺伝子の特異的配列に基づいてデザインした。さらに、本発明においては、ＤＮＡを血液中の細菌から抽出するため、血液中のヘモグロビンによる酵素活性阻害を受けにくいＴｔｈポリメラーゼを用いることにより解決できる。
【００１０】
【作用及び発明の効果】本発明のＭＲＳＡ検出方法では、患者からのヘパリン採血から始めて検出結果を得るまで約４時間程度である。また、ファーストＰＣＲ反応において、Ｔｔｈポリメラーゼを用いることにより、ヘモグロビン存在下でもＤＮＡの増幅を可能とでき、２段階からなるＰＣＲ法によりＭＲＳＡの感度を飛躍的に向上させることができ、敗血症又は菌血症の早期診断に有効である。
【００１１】
【実施例】採集された血液２ｍｌをヘパリン処理し、蒸留水１０ｍｌを加え放置し、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除き、細胞溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．５％ＮＰ−４０）１００μｌ、リゾスタフィン１０μｇを加え３７℃で１時間反応させ、１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心を行い、その上清にＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ５μｌを加混和後１分間沸騰させ、さらに１分間氷冷し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心を行いＧＥＮＥＣＬＥＡＮ IIR キット（フナコシ社）でＤＮＡの精製を行った。
【００１２】次いで、この精製されたＤＮＡを用い、ネステードＰＣＲ反応を図１に示すように行った。すなわち、ＤＮＡ６μｌ、プライマー１：５′−ＡＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧ−３′（２５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、プライマー２：５′−ＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＧＧＴＡＴＣＡＴＣ−３′（２５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｔｔｈポリメラーゼ２．５単位をＰＣＲ混合液に加え、ファーストＰＣＲ反応を行った。
【００１３】反応条件はＤＮＡ変性：９４℃、１分、アニーリング：５５℃、１分、エックステンション：７２℃、２分で３０サイクルのＤＮＡ増幅を行った。
【００１４】得られたＰＣＲ産物１μｌに、ビオチンとデニトロフェニル（ＤＮＰ）で標識したプライマー３：５’−ＡＡＧＣＧＡＴＡＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＡＧ−３′（２５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、プライマー４：５′−ＧＧＡＡＣＧＡＴＧＣＣＴＡＡＴＣＴＣＡＴ−３′（２５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位をＰＣＲ混合液に加え、セカンドＰＣＲ反応を行った。
【００１５】反応条件はＤＮＡ変性：９４℃、１分、アニーリング：６０℃、１分、エックステンション：７２℃、２分で３０サイクルのＤＮＡ増幅を行った。
【００１６】尚、上記実施例において使用したＰＣＲ混合液は、１０ＸＰＣＲ緩衝液５μｌ、１０ＸｄＮＴＰ４μｌ、蒸留水３２．８μｌからなり、また、使用したプライマーは、ＤＮＡ合成装置（ミリポア社製）を使用して作製した。
【００１７】次に、目的ＤＮＡ増幅の有無の確認は、ストレプトアビシン固定化プレートに、増幅ＤＮＡと抗ＤＮＰ抗体を加え、室温で反応させた後、洗浄し、発色液ｐ−ニトロフェニルホスフェイト（ｐＮＰＰ）を加え、４０５ｎｍの光の吸収率を調べることによって行うか、或いはアガロースゲル電気泳動法によっても確認できる。
【００１８】図２は、アガロースゲル電気泳動法によって得られたチャートの模式図であり、図中（ａ）は、上記実施例に基づいて２血液検体について試験した結果を１．２．で示す。尚、図２において、横線により発色部位を示し、横線部が密であるほどＤＮＡの増幅量が大きいことを示す。また図２には、同時に比較例である（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）（ｆ）（ｇ）を同時に示す。
【００１９】比較例である（ｂ）は、上記実施例におけるファーストＰＣＲ反応において、Ｔｔｈポリメラーゼに代えてＴａｑポリメラーゼを同量使用した場合である。尚、プライマーは実施例と同一のものを使用した（以下同様）。
【００２０】（ｃ）は上記実施例において、血液検体から細菌をまず分離した後、ＤＮＡを抽出し、Ｔｔｈポリメラーゼに代えてＴａｑポリメラーゼを同量使用してファーストＰＣＲ反応を行い、次いで実施例と同様にしてネステードＰＣＲ法を行った場合である。
【００２１】また、（ｄ）は上記実施例において、セカンドＰＣＲ反応を省略した場合である。（ｅ）は上記（ｂ）において、セカンドＰＣＲ反応を省略した場合である。（ｆ）は上記（ｃ）において、セカンドＰＣＲ反応を省略した場合である。（ｇ）は標準試料の電気泳動パターンである。
【００２２】図２からわかるように、目的のバンドは図中、Ｘで示すものであり、本発明である（ａ）の場合には、２血液検体のいずれの場合にも検出ができたが、比較例である（ｂ）の場合、即ち、実施例におけるファーストＰＣＲ反応において、Ｔｔｈポリメラーゼに代えてＴａｑポリメラーゼを同量使用した場合では繰り返し実験の内、第１血液検体の場合には検出できなかった。
【００２３】このことから、本発明によると、ネステード（Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法を実施することにより、容易にＭＲＳＡ感染症を検出することが可能であり、特に、ファーストＰＣＲ法において、Ｔｔｈポリメラーゼを使用するとより確実に検出できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ネステード−ＰＣＲ法の概説図である。
【図２】図２は、アガロースゲル電気泳動法で得られたチャートの模式図であり、目的ＤＮＡ増幅の有無を示すものである。
【符号の説明】
Ｘは目的のバンド
【特許請求の範囲】
【請求項１】 採集血液体に、直接、メチシリン耐性ブドウ球菌におけるｍｅｃＡ遺伝子の５′末端側から８００塩基までの領域に基づいて作製された２組のプライマーを使用し、２段階からなるポリメレ−スチェンリアクター法を実施することを特徴とするメチシリン耐性ブドウ球菌感染症の検出方法。
【請求項２】 ファーストポリメレ−スチェンリアクター反応において、Ｔｔｈポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項１記載のメチシリン耐性ブドウ球菌感染症の検出方法。
【請求項１】 採集血液体に、直接、メチシリン耐性ブドウ球菌におけるｍｅｃＡ遺伝子の５′末端側から８００塩基までの領域に基づいて作製された２組のプライマーを使用し、２段階からなるポリメレ−スチェンリアクター法を実施することを特徴とするメチシリン耐性ブドウ球菌感染症の検出方法。
【請求項２】 ファーストポリメレ−スチェンリアクター反応において、Ｔｔｈポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項１記載のメチシリン耐性ブドウ球菌感染症の検出方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開平６−７０７７１
【公開日】平成６年（１９９４）３月１５日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平４−２２３７４０
【出願日】平成４年（１９９２）８月２４日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １９９２年２月２５日 社団法人日本外科学会発行の「日本外科学会誌（第９２回日本外科学会総会号）臨時増刊」に発表
【出願人】（５９２１８１７８３）エヌビイテイ株式会社 (7)
【出願人】（５９１１４３２５０）
【公開日】平成６年（１９９４）３月１５日
【国際特許分類】
【出願日】平成４年（１９９２）８月２４日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １９９２年２月２５日 社団法人日本外科学会発行の「日本外科学会誌（第９２回日本外科学会総会号）臨時増刊」に発表
【出願人】（５９２１８１７８３）エヌビイテイ株式会社 (7)
【出願人】（５９１１４３２５０）
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