説明

メチル化DNAを検出する方法、及びキット

【課題】メチル化DNAを検出するための生体外検出方法の提供。
【解決手段】以下のステップ:(a)メチル化DNAに結合することができるポリペプチドで、容器をコーティングし;(b)前記ポリペプチドを、メチル化DNA、及び/又は非メチル化DNAを含むサンプルと接触させ;そして(c)前記ポリペプチドのメチル化DNAへの結合を検出する、を含む、メチル化DNAを検出するための生体外検出方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、以下のステップ:(a)メチル化DNAに結合することができるポリペプチドで、容器をコーティングし;(b)前記ポリペプチドを、メチル化DNA、及び/又は非メチル化DNAを含むサンプルと接触させ;そして(c)前記ポリペプチドのメチル化DNAへの結合を検出する、を含む、メチル化DNAを検出するための生体外検出方法に関する。好ましい態様において、前記方法は、以下のステップ:(d)シークエンシングにより、当該検出されたメチル化DNAを分析する、をさらに含む。本発明の他の態様は、(a)メチル化DNAに結合することができるポリペプチド;(b)前記ポリペプチドでコートされ得る容器;(c)前記容器をコーティングする手段;そして(d)メチル化DNAを検出する手段を含む、本発明の方法によりメチル化DNAを検出するためのキットである。
【背景技術】
【0002】
全生体の細胞を形成するための情報は、それらのDNA中に含まれる。DNAは、G、A、T、及びCとして省略された4塩基からなり、はしごの「横木」の各々を形成するこれらの文字と対を有する非常に長い当該はしごのように形成される。当該文字Gは、Cと対になり、AはTと対になる。これらの対の文字列は、遺伝子と呼ばれる領域に分類された特定の細胞を形成するための情報と共に、コードされたメッセージのような情報を保存する。2倍体動物の全細胞は、全遺伝子の2つのコピーを含む。一方は、母親由来のものであり、もう一方は父親由来のものである(このルールの唯一の例外は、生物が「雄」か「雌」のいずれかとして発達することを決定する染色体上の遺伝子である。)。
【0003】
DNAのメチル化、及び遺伝子調節
私たちのゲノムを「つづる」4つの塩基−アデニン、グアニン、シトシン、及びチミンは別として、複製後のDNAの一時的変異により産生される5番目の塩基もある。DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)は、メチル供与体S−アデノシルメチオニンからシトシン環へのメチル基の移転を触媒し得る、そしてその結果、5−メチルシトシン塩基を形成する。特定のシトシン残基が哺乳類において修飾され、それは、DNA配列のグアノシン残基の前にある(CpGジヌクレオチド)(Singal,Blood93(1999),4059-4070);Robertson,Nat.Rev.Genet.1(2000),11−19;Ng,Curr.Opin.Genet.Dev.(2000),158−163;Razin,EMBO J.17(1998),4905−4908)。当該CpGジヌクレオチドのメチル化は、一般的に、安定した転写抑制と関連し、おそらく、非コードゲノムの大部分、及びトランスポゾン、繰り返し体、ウイルス性挿入部分の如き潜在的に有害な配列は転写されないといった事実を導く。CpGジヌクレオチドが、ゲノム中において、非常に遍在していることは興味深い(Singal(1999),loc.cit,Robertson(2000),loc.cit.,Ng(2000),loc.cit.,Razin(1998),loc.cit.)。
【0004】
ゲノムの大部分は、統計的に予期されるよりも非常に少ないCpGを含む。このことは、おそらく、5−メチルシトシンは比較的容易にアミノ基を取り去りチミジンとなり、進化の過程で、当該CpGジヌクレオチドの数の低減を導くという事実に起因する。しかしながら、ゲノム中に区分される何度も繰り返される多くのCpG、いわゆるCpGアイランドがある。これらの領域は、しばしば、転写開始点、及び遺伝子プロモーターを含み、そして一般的に、CpGアイランドに関連しないCpGとは対照的にメチル化されない。正常細胞において、当該CpGアイランドのメチル化は、雌性細胞中のX染色体、及び親の刷り込みゲノムの第2転写の不活性化の如き例外的ケースの場合のみ観察される(Singal(1999),loc.cit.,Robertson(2000),loc.cit.,Ng(2000),loc.cit,Razin(1998),loc.cit)。
【0005】
DNAメチル化の調節
DNAメチル化パターンが胚形成の過程中でどのように確立されるのか、及びCpGメチル化がどのようにゲノム中に維持され、調節されるのかは、一部しかわかっていない(Singal(1999),loc.cit,Ng(2000),loc.cit.,Razin(1998),loc.cit.)。哺乳類において、DNAメチル化過程を触媒する既知の3つのDNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT1、3a、及び3b)がある。各DNMTがCpGメチル化の維持、及び調節に寄与する対応分担は、明らかとされなければならないが、いまだ明らかではない。しかし、全3つの酵素は、明らかに胚形に必要不可欠であり、対応するノックアウトマウスは、生まれる前に、又は生後間もなく死に至る(Bestor,Hum.MoI.Genet.9(2000),2395−2402;El Osta,Bioessays 25(2003),1071−1084)。その間、DNAメチル化、クロマチン構造の一時的変異と、特定のヒストン一時的変異との関連は、数回見られる。DNAのメチル化は、ヒストン脱アセチル化、及びヒストンH3でのリジン9残基のメチル化と大部分関係がある(Sims,Trends Genet.19(2003),629−639,Fahrner,Cancer Res.62(2002),7213−7218)。従って、DNMTは、ヒストンアセチラーゼ(HDAC)又はコリプレッサー複合体と関連する。メチル基がどのようにCpG残基から除かれるのかもほとんどわかっていない。増殖細胞において、DNAメチル化は、おそらく複製の間にも受動的に生じ得るだろう。しかしながら、活性のある未知のデメチラーゼの存在により説明され得る有糸分裂細胞におけるDNA脱メチル化の例もある(Wolffe,Proc.Natl.Acad.Sd.96(1999),5894−5896)。
【0006】
CpGメチル化、及び遺伝子抑制
プロモーターのメチル化(しかし、非調節配列のものではない)は、安定、転写抑制と相互に関連する(Singal(1999),loc.cit.,Ng(2000),loc.cit.,Razin(1998),loc.cit.)。5−メチルシトシンの抑制特性は、2つの機構により影響され得る。第1に、DNAメチル化は、転写因子の結合を直接的に損なわせ得るというもの。第2に、抑制の最大部分に関与しそうな可能性は、メチル−CpG−結合タンパク質(MBP)の増大であるというものである(Ballestar,Eur.J.Biochem.268(2001),1−6)。MECP2又はMBD2(MeCP1複合体の構成要素)の如きMBPは、コリプレッサー複合体、及び抑制作用を有するHDACを伴い、そして転写因子に利用できない高密度クロマチン構造(ヘテロクロマチン)の形成に関与する(Ballestar(2001),loc.cit)。
【0007】
腫瘍形成における後成的変化
腫瘍の形成が、遺伝子病変(例えば、突然変異又は転座)だけでなく、後成的変化によっても支持されることが明らかとなっている。異常なクロマチン構造又はDNAメチル化は、腫瘍遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の転写状態に影響を与え得、及び腫瘍の成長を促進し得る。当該DNAメチル化における変化は、正常なメチル化配列におけるメチル化の損失(低メチル化)、あるいは正常な非メチル化配列におけるメチル化(高メチル化)のいずれかを含む(Roberston(2000),Ioc.cit.,Herman,N.Engl.J.Med.349(2003),2042−2054;Momparler,Oncogene22(2003),6479−6483;Esteller,Science297(2002),1807−1808;Plass,Hum.Mol.Genet11(2002),2479− 488)。
【0008】
低メチル化
広範囲のDNA低メチル化は、ほぼ全ての種類の腫瘍について記載される。腫瘍組織において、5−メチルシトシン含有量は、反復サテライト配列又は染色体のセントロメア領域に見られる脱メチル化事象の大部分を有する正常な組織と比較して、低減される。しかしながら、個々の場合、bcl-2又はc-mycの如き原がん遺伝子の脱メチル化、及び活性化もまた記載される(Costello,J.Med.Genet.38(2001),285−303)。
【0009】
CpGアイランドの高メチル化
CpGアイランドは、通常、遺伝子調節機能に影響を及ぼす。これは、メチル化状態における変化が、関連する遺伝子座の転写活性における変化と主に直接的に関与することによる(Robertson(1999);Herman(2003);Esteller(2002);Momparler(2003);Plass(2002),all Ioc.cit。)。大抵のCpGアイランドは、正常細胞における非メチル化形態中に存在する。しかしながら、ある態様において、CpGアイランドは、遺伝子調節事象においてもメチル化され得る。例えば雌性細胞の非活性化X染色体のCpGアイランドの大部分は、メチル化される(Goto,Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(1998),362−378)。CpGアイランドは、正常な老化作用の過程においてもメチル化され得る(Issa,Clin.Immunol.109(2003),103−108).
【0010】
特定の腫瘍において、通常メチル化されないCpGアイランドが高メチル化形態に存在し得る。多くの場合において、高メチル化により影響を受ける遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子の如き腫瘍の成長に対抗するタンパク質をコードする。以下の表は、高メチル化の後成的機構を通じて腫瘍中で非活性化され得ることが明らかである遺伝子の例を挙げるものである。
【0011】
【表1】

【0012】
腫瘍特異的高メチル化の理由は、ほとんどわかっていない。興味深いことに、ある種の腫瘍は、それら自身の高メチル化プロフィールを有しているようである。高メチル化が均一に分布されず、腫瘍に依存して生ずることが、より多くの比較研究において示され得た。白血病の場合、例えば結腸がん又は神経こう腫と比較して、ほとんど他の遺伝子が高メチル化される。それ故、高メチル化は、腫瘍を分類するために有用となり得た(Esteller,CancerRes.61(2001),3225−3229;Costello,Nat.Genet.24(2000),132−138)。
【0013】
多くの場合において、高メチル化は、HDACの増大活性も混合される。脱メチル化物質(例えば、5−アザシチジン)での処理の後、多くのメチル化遺伝子は、HDAC阻害剤(例えば、トリコスタチン(TSA))も使用した後にのみ、再活性化され得た(Suzuki,Nat.Genet.31(2002),141−149;Ghoshal,Mol.Cell.Biol.22(2002),8302−8319;Kalebic,Ann.N.Y.Acad.Sci983(2003),278−285)。
【0014】
大抵の分析は、DNAのメチル化は優位に抑制されること、及びTSAの如きHDAC阻害剤での処理により逆転され得ないことを示す(Suzuki(2002);Ghoshal(2002),loc.cit)。しかしながら、既に臨床に使用されるHDAC阻害剤、バルプロエートは、DNAの脱メチル化を導きうることもさらに最近示された(Detich,J.Biol.Chem.278(2003),27586−27592)。しかしながら、この観点において実施される系統的分析は、今のところない。
【0015】
後成的変化を逆転するための臨床的研究
がん(例えば突然変異)の遺伝的原因は不可逆的なものであるが、腫瘍形成に対する役割に寄与する後成的変化は可逆的となり得る。それ故、後成的変化の可能な処置は、新組織形成の治療のための新たな可能性を提示する(Herman(2003);Momparler(2003);Plass(2002),allloc.cit.;Leone,Clin.Immunol.109(2003),89−102;Claus,Oncogene 22 (2003), 6489−6496)。
【0016】
20年以上前、5−アザシチジンは、抗腫瘍薬として既に開発されており、及び知られた基質の分子効果なしに使用されていた。現在、さらに発達した形態(デオキシ−5−アザシチジン,デシタビン)において、骨髄異形成症候群、及び二次性白血病の治療のために、すでに首尾よく使用されている(Leone(2003),loc.cit.;Lyons,Curr.Opin.Investig.Drugs 4(2003),1442−1450;Issa,Curr.Opin.Oncol.15(2003),446−451).
【0017】
HDAC阻害剤がメチル化プロモーターの再活性化を支持し得、及び脱メチル化基質と相乗的に作用し得るといった生体外の観察に起因して、現在、基質双方の種類の使用を含む、試験的研究が世界中で実施される(Kalebic(2003);Claus(2003),loc.cit.;Gagnon,Anticancer Drugs 14(2003),193−202;Shaker,Leuk.Res.27(2003),437−444)。
【0018】
CpGメチル化の分析のための検出方法
ゲノムのCpGメチル化分析のための検出方法の開発は、CpGメチル化パターンにおける変化ががんの如き疾患に関連し得ることが見出される事実に起因する重要性を主に有している。現在のところ、主に、既知の遺伝子座のCpGメチル化の検出のために使用されることが知られている技術がある(Dahl,Biogerontology4(2003),233−250)。ゲノムを通じてCpGメチル化の分析を可能とする方法は、ほとんど確立されていない。以下に、適用の主要分野と共にCpGメチル化の分析のための最も一般的な方法を要約する。
【0019】
CpGメチル化の検出のためのメチル化感受性制限酵素の使用
特異的CpGジヌクレオチドのメチル化状態が、5−メチルシトシンに対する異なる感受性により特徴づけられる細菌の制限エンドヌクレアーゼのイソシゾマーを使用して、検出され得る。それらの例は、双方ともCCGG配列を切断する酵素HpaII、及びMspIであって、しかしながら、HpaIIは、内部シトシンがメチル化されない場合に限られる。いくつかのアッセイは、メチル化感受性制限酵素の使用に基づき、上記アッセイは、個々の遺伝子の分析、及び当該ゲノムを通じたCpGメチル化の分析の双方のために使用され得る。メチル化感受性制限消化の断片は、サザンブロット又は制限部位の側面に接する領域のゲノムPCRにより、主に検出される(Dahl(2003),loc.cit.)。現在までに刊行されている、ゲノムを通じたCpGメチル化の全分析法は、当該方法の構成成分として、メチル化感受性制限酵素を使用する。制限ランドマークゲノムスキャニング法(Restriction Landmark genomic Scanning、RLGS)(Costello,Methods27(2002),144−149)は、例えば、全次元が異なるメチル化感受性制限酵素で消化され2つのDNA母集団のCpGメチル化における相違を特定する、一種の2次元アガロースゲル電気泳動を使用する。メチル化CpGアイランド増幅法(Methylated CpG Island Amplification、MCA)は、メチル化SmaI制限部位を有する断片を充実させ、そして当該断片を増やすためにLM−PCRを使用する。かかる増幅産生物は、表示差異分析(Representational Difference Analyzis、RDA)(Smith,Genome Res.13(2003),558−569)又はCpGアイランドマイクロアレイ(Yan,Cancer Res.6(2001),8375−8380)を用いて、すでに成功裏に分析されている。
【0020】
ゲノムを介したCpGメチル化の分析に関して、メチル化感受性制限酵素に基づいた全アッセイは、不都合を有する。最善の方法で実施するために、とりわけ、全ての制限消化が完了することが保証される必要がある。最も著しい不都合は、当該分析が与える情報が、単に、使用されるメチル化感受性制限酵素により認識されるシトシン残基のメチル化状態に関する情報だけであることである。当該制限酵素の選択は、検出可能な配列の数を自動的に制限する。それ故、当該CpGメチル化の中立分析は、可能性のないものである。
【0021】
CpGメチル化の分析のための重硫酸塩処理
硫酸水素ナトリウムでの二本鎖ゲノムDNAの処理は、非メチル化シトシン残基の脱アミノ化を導きウラシル残基とし、及びもはや相補的ではない2つの一本鎖の形成を導く。この処理の間、5−メチルシトシンが維持される。このようにして形成された配列間の相違は、メチル化DNAと非メチル化DNAとの相違の根拠を作り出す(Frommer,Proc.Natl.Acad.Sci.889(1992),1827−1831)。亜硫酸水素塩で処理されたDNAは、ウラシル残基(以前は非メチル化シトシンであったもの)とチミジン残基がチミジンとして増幅され、5−メチルシトシン残基のみがシトシン残基として増幅されるPCRにおいて直接的に使用され得る。増幅に依存して、PDRに使用されるプライマーは、メチル化配列と非メチル化配列とを区別し、又はメチル化状態とは無関係に、断片を増幅する。例えば、非特徴的なプライマーを使用して増幅されるPCR断片は、直接的にシークエンスされ、メチル化、及び非メチル化CpGの占有率を決定し得る。
【0022】
さらなる方法は、メチル化の程度を決定するために、かかるPCR断片の物理的な相違(融解挙動、一本鎖構造、制限酵素のための制限部位など)を活用する(Dahl(2003),Ioc.cit.)。ハイスループットメチル化分析を可能とする他の系統的アプローチは、特徴的なプライマー又はプローブによるメチル化、及び非メチル化配列の特異的増幅(メチル化特異的PCR、MethylightPCR)のための配列内の相違を活用する(Dahl(2003),Ioc.cit.)。PCR産物の配列における亜硫酸水素塩−誘導の相違は、メチル化特異的オリゴヌクレオチド(MSO)マイクロアレイを用いても見出され得る(Shi,J.Cell.Biochem.88(2003),138−143;Adorjan,Nucleic Acid Res.30(2002),e21;Gitan,Genome Res.12(2002),158−164)。
【0023】
当該メチル化感受性制限酵素と対照的に、亜硫酸水素塩で処理されたDNAは、増幅されたゲノム断片におけるいくつかのCpG残基のメチル化状態に関する情報を提供し得る。しかしながら、特徴的なプライマー又はプローブを使用することによるCpGメチル化の検出は、単一の(又はわずかな)のシトシン残基のメチル化状態に限定される。それ故、単一の遺伝子座のハイスループットメチル化分析に好適な現在知られる本分野における全アッセイにより提供される情報は、着目の遺伝子内の1又はほんのわずかなCpG残基に限定される。
【0024】
CpGメチル化の検出のためのさらなる方法
変性された一本鎖DNA内のCpGメチル化を認識する5-メチルシトシンに対する抗体は、主に個々の固定細胞の染色体上のCpGメチル化の免疫組織化学的染色のために使用される。
【0025】
1994年に既に、A.Bird研究所は、親和性クロマトグラフィーを用いてメチル化DNA断片を濃縮するための方法を開発した(Gross,Nat.Genet.6(1994),236−244)。マトリクスに結合する組み換えMECP2が、メチル化DNAを結合するために使用された。それ以来、この技術は、使用され、改良され、そして他の作業グループによるさらなる技術と組み合わされた(Shiraishi,Proc.Natl.Acad.Sci.96(1999),2913−2918;Brock,Nucleic Acid.Res.29(2001),E123)。親和性マトリクスに対する強力な又はより劣る強力なメチル化ゲノム配列の結合は、濃密なメチル化を伴うCpGアイランドをより低いメチル化密度を伴う他の配列から分離することを可能とする塩濃度に、依存する。この親和性クロマトグラフィーの不都合な点は、大量のゲノムDNA(50〜100μg)を必要とすること、及び比較的時間のかかる手順である。
【0026】
以上の観点から、CpGジヌクレオチドのメチル化が、細胞の転写活性を制御するための重要な後成的機構であることが明らかである。一般的に、CpGジヌクレオチドのメチル化は、転写不活性と関連がある。しかし、正常な又は変性した分化過程の間、遺伝子座のメチル化パターンは変化し得る。従って、腫瘍形成の間、正常なメチル化パターンの逆転は、各々、腫瘍抑制遺伝子又は原がん遺伝子の如き、遺伝子の異常な抑制(又は活性化)を導き得、それ故、腫瘍形成を導く。それ故、CpGメチル化DNAの検出、及びそれ故、調節されない腫瘍抑制遺伝子、及び/又は原がん遺伝子の同定は、最も外部の臨床的興味である。上記のように、先行技術は、メチル化DNAの検出のために異なるアプローチを記載するが、欠陥に悩まされている。例えば、先行技術の方法は、ハイスループット適用に適しておらず、又はCpGメチル化DNAの検出において、特に検出対象として少量のDNAしかないとき、信頼性がない。それ故、先行技術の欠陥、及び欠点を克服し得るメチル化DNAを検出するさらなる手段、及び方法の必要性の余地がある。従って、本発明の根底にある技術的問題は、上記必要性に応じる。
【0027】
この技術的問題に対する解決法は、本願請求項において特徴付けられる態様を提供することにより達せられる。
【発明の概要】
【0028】
従って、第1態様において、本発明は、以下のステップ:
(a)メチル化DNAに結合することができるポリペプチドで、容器をコーティングし;
(b)前記ポリペプチドを、メチル化DNA、及び/又は非メチル化DNAを含むサンプルと接触させ;そして
(c)前記ポリペプチドのメチル化DNAへの結合を検出する、
を含む、メチル化DNAの生体外検出方法に関する。
【0029】
実施例において示される通り、驚くべきことに、単一チューブアッセイ/生体外方法は、メチル化核酸分子、特にCpGメチル化DNA分子/DNA断片の検出に使用する際、安全であり、及び信頼性があることを見出した。上記方法の有利な点は、好ましくはメチル化DNAの速くて、感受性があり、及び信頼できる検出、並びにそれらのメチル化の程度に従い標的DNA断片を分析する能力である。先行技術とは対照的に、本願の提供する方法は、亜硫酸水素塩処理又はメチル化感受性制限を必要とせず、及び、単一/わずかなCpG残基を検出することに限られない。提供された情報は、実際には、先行技術の他の方法のものよりもより意味がある、というのは、近位プロモーターのメチル化密度は、領域内の単一のCpG残基のメチル化状態よりも遺伝子の転写状態により関連し得るからである。従って、メチル化の程度が(ゲノムの)投入DNAのPDR反応に対して見積もられ得る、「単一チューブ」アッセイが本願明細書中に提供される。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1A】メチル−結合(MB)PCRの概略 (A)MB−PCRの主なステップを示す。MB−PCRは、ゲノムテンプレートから直接的に候補遺伝子座を増幅する対照PCR反応(P反応)、及び反応容器にメチル−CpG結合ポリペプチドにより事前に結合されたテンプレートDNAから候補遺伝子座を増幅するメチル−CpG結合PCR反応(M反応)の2つの別箇の反応を含む。第1ステップにおいて、両反応容器の内壁をメチル結合ポリペプチドでコートし、その後、ブロッキング試薬を使用して飽和させる(ステップ2)。次いで、当該テンプレートDNA(MseI又は類似の酵素で制限されたゲノムDNA)を、1つのチューブ(M反応)に加え、結合に供する(ステップ3)。最終ステップにおいて、PCR反応ミックスを両方のチューブに直接添加し、そしてM反応のために事前に使用されたテンプレートDNAの50%をP反応に添加する。遺伝子特異的PCR後、例えば、アガロースゲル電気泳動により産物を分析し得る。図1A及びBにおいて使用される用語「CpGメチル化 低」は、非メチル化DNAを含み、及び非メチル化DNAを特に言及する。
【図1B】メチル−結合(MB)PCRの概略 (B)本明細書中に記載される組み換えメチル結合ポリペプチドMBD−Fcを使用するMB−PCR法の略図。
【図2A】MB−PCRによる、3つのCpGアイランドプロモーターでの白血病細胞系におけるCpGメチル化の検出 (A)CpGジヌクレオチド、MseI制限部位、第1エキソンの位置、及びICSBP、ESR1、及びCDKN2B(P15INK4b)のプロモーター断片を検出するために使用されるプライマーの位置を示す。
【図2B】MB−PCRによる、3つのCpGアイランドプロモーターでの白血病細胞系におけるCpGメチル化の検出 (B)8つの異なる白血病細胞系のための指示プロモーターの典型的MB−PCR結果。P反応はゲノムDNAを直接増幅し、一方、M反応はCpGメチル化DNA断片のみ増幅する。
【図3】ICSBPプロモーターのメチル化は、白血病細胞系におけるICSBP発現と反比例の関係にある。 (A)ICSBPの転写レベルを、ハウスキーピング遺伝子ACTBと相対的に、LightCyclerリアルタイムPCRにより測定した。 (B)示された時間の間、Decitabine(DAC)で処理されたU937細胞をICSBP発現について分析した。結果をACTB発現に標準化した。データは、2つの独立したLightCycler分析の平均値±SDで表示する。
【図4】AML細胞における異常なCpGメチル化の検出 数人の健常なドナー及びAML患者のESR1、CDKN2B(p15INK4b)、及びICSBPプロモーターについての典型的なMB−PCR。
【図5】ICSBPプロモーターのMB−PCRは、bisulfiteシークエンシングにより得られた結果物と関連する。 選択された健常なドナー及びAML患者の細胞、並びに細胞系に由来するゲノムDNAを、亜硫酸水素塩で処理した。ICSBP遺伝子の指示領域を増幅し、そしてクローンした。いくつかの独立した挿入部分をシークエンスし、結果を図式化して示す。丸型はCpGジヌクレオチドの位置を示す(白丸:非メチル化、黒丸:メチル化)。
【図6A】MB−PCRの感受性 健常なドナーのDNA(非メチル化)由来のDNA、及びKG−1細胞系(全3つの遺伝子座においてメチル化される)由来のDNAの混合物からのESR1、CDKN2B(p15INK4b)、及びICSBPプロモーターについてのMB−PCR。
【図6B】MB−PCRの感度 3つの細胞系由来のDNAを、M反応とための指示量のDNA(又はP反応のための半分の指示量)を使用するMB−PCRに供した。DNA量を低減するにつれて、PCR中の増幅サイクルの回数(カッコ内の数字)を増大した。DNAを含まないサンプル(HO)も示した。
【図7−1】図7−1は、pMTBip/MBD2−Fcプラスミドのヌクレオチド配列、及びpMTBip/MBD2−FcプラスミドによりコードされるMBD2−Fc二機能性タンパク質のタンパク質配列(ボールド体)を示す。当該MBD2−Fc二機能性タンパク質のアミノ酸配列は、以下の特徴を有する。
【表2】

【図7−2】図7−2は、pMTBip/MBD2−Fcプラスミドのヌクレオチド配列、及びpMTBip/MBD2−FcプラスミドによりコードされるMBD2−Fc二機能性タンパク質のタンパク質配列(ボールド体)を示す。当該MBD2−Fc二機能性タンパク質のアミノ酸配列は、以下の特徴を有する。
【表3】

【図7−3】図7−3は、pMTBip/MBD2−Fcプラスミドのヌクレオチド配列、及びpMTBip/MBD2−FcプラスミドによりコードされるMBD2−Fc二機能性タンパク質のタンパク質配列(ボールド体)を示す。当該MBD2−Fc二機能性タンパク質のアミノ酸配列は、以下の特徴を有する。
【表4】

【図8】MB−PCRは、CpGアイランドプロモーターのメチル化を検出する。 (A)ESR1、CDKN2B(p15INK4b)、ICSBP、ETV3、及びDDX20の検出されたMseI断片(灰色のボックスとして示される。)の図式的表示。CpGジヌクレオチド、MseI制限部位、転写開始部位、第1エキソンの位置、及びプライマーの相対位置を示す。 (B)指示されたプライマーについての、正常な(非メチル化された)、及び生体外でメチル化されたゲノムDNAの典型的MB−PCRの結果を示す。P反応は、ゲノムDNAを直接的に増幅し、一方、M反応は、CpGメチル化DNA断片だけを増幅する。
【図9】MB−PCRによる白血病細胞系におけるCpGメチル化の検出。 (A)指示されたプロモーターについての8つの異なる白血病細胞系の典型的MB−PCR結果を示す。 (B)同じ細胞系由来のゲノムDNAを、bisulfiteシークエンシングにより分析した。ICSBP遺伝子の指示された領域を増幅し、そしてクローンした。いくつかの独立した挿入部分をシークエンスし、そして結果を図式的に示す。四角形は、CpGジヌクレオチドの位置を示す(白四角形:非メチル化、黒四角形:メチル化)。
【図10】原発性AML芽細胞における異常なCpGメチル化の検出 1人の典型的な健常なドナー(N)と9人のAML患者のICSBPプロモーターについての2つを、対応するシークエンシング結果と一緒に示す(bisulfiteシークエンシングの結果は、図9に記載のように示される)。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明に関する、好ましくは均一的にコートされる容器は、好ましくは、メチル化DNAを結合し得、及び本願明細書中に記載の方法に従って使用されるポリペプチドがメチル化DNAに対する最大結合能力を有することを促進する。当該容器の均一的コーティングは、本分野において知られた方法により、好ましくは本願明細書中に記載の本発明の方法、及び/又は実施例中の方法により達成される。さらに、均一的コーティングは、クマシー・ブルー染色の如き本分野において知られた方法により制御され得る。
【0032】
本明細書中に使用される用語「容器」は、通常使用される、並びに/あるいは、科学目的、及び/又は診断目的に適したいかなる容器をも包含する。好ましくは、前記容器は、以下の材料:ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンなどからなり、より好ましくは、ポリカーボネートからなる。ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン又はポリカーボネートは、サーモサイクラーと相性の良いことでも好ましく、すなわち、異なる時間間隔に対する異なる温度で好ましい熱安定性であり、及び耐久性がある。ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン又はポリカーボネートが、本発明に関連して使用される化学剤、及び/又は生物剤に対して、不活性であることがさらに好ましい。
【0033】
今までのところ、塗布可能なPCRチューブは、免疫ポリメラーゼ連鎖反応(免疫PCR)のためだけに使用されている(Sano,Science258(1992);Adler,Biochem Biophys Res Commun.308(2003),240−250)。免疫PCRは、抗原検出システムであり、特異的DNA分子がマーカーとして使用される。ビオチンと免疫グロブリンGの両方への強力、及び特異的な結合親和力を有するストレプトアビジン−プロテインAのキメラは、ビオチン化DNAを、マイクロプレート上でよく固定化された抗原モノクローナル抗体複合体に特異的に結合させるために使用される。次いで、当該結合されたDNAの断片は、PCRにより増幅される。免疫PCRは、慣習的なELISA技術に類似し、より感度の良い検出システムとのサンドイッチアプローチ(マーカーDNAのPCR検出)を使用する。それ故、DNAが検出の直接対象である本発明と対照的に、免疫PCRは、抗原を検出するための手段(マーカー)として使用する。
【0034】
本明細書中に使用される用語「コーティング」は、当該容器の表面が、好ましくは、メチル化DNAに結合することができるポリペプチドで完全に被膜され、それによって、当該ポリペプチドの本質的に等しい量が当該容器の表面の各領域、及び全領域に存在することを意味する。かかる結合ポリペプチドの例は以下に挙げられるものであり、そして、とりわけ、及び好ましくは、メチルDNA結合タンパク質(MBD)ファミリーに属するポリペプチドを含み、最も好ましくは、メチルCpG結合タンパク質(MBD)のファミリーに属するタンパク質、及び抗体のFc部分のDNA結合ドメインを含む二機能性ポリペプチドである。当該DNA結合ドメインは以下に記載される。場合により、当該二機能性ポリペプチドは、以下に記載されるポリペプチドリンカーを含む。従って、当該二機能性ポリペプチドは、好ましくは、配列番号1(図7)に示されるヌクレオチド配列によりコードされる配列番号2(図7)に示されるアミノ酸配列により特徴付けられる。
【0035】
本明細書中に使用される用語「メチル化DNAに結合することができるポリペプチド」は、本明細書中に記載のメチル化DNAに結合することができるいかなるポリペプチドも包含する。メチル化DNAに結合する能力は、本分野において知られる方法により試験される。本明細書中に使用される用語「ポリペプチド」は、相互交換可能に使用され及び与えられた長さのアミノ酸鎖を含む、ペプチド、タンパク質、ポリペプチドを意味し、ここで当該アミノ酸残基は、共有ペプチド結合により連結される。しかしながら、アミノ酸、及び/又はペプチド結合が機能的類似物により置換される、かかるタンパク質/ポリペプチドのペプチド模倣薬も本発明に含まれ、並びにセレノシテインの如き20の遺伝子がコードするアミノ酸以外本発明に含まれる。ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質は、ポリペプチドと称し得る。言及のように、当該用語、ポリペプチド、及びタンパク質は、本明細書中において、しばしば同じ意味で使用される。用語ポリペプチドは、当該ポリペプチドの一時的変異もいい、除外しない。一時的変異は、グリコシル化、アセチル化、アシル化、リン酸化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、剤形、ガンマカルボキシル化、グリコシル化,GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化の如き、タンパク質に対するアミノ酸の転移RNA媒介付加、及びユビキチン化を含む。例えば、PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,第2版.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993);POST−TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York(1983),pgs.1−12;Seifter,Meth.Enzymol.182(1990);626−646,Rattan,Ann.NY Acad.Sci.663(1992); 48−62を参照のこと。好ましくは、用語「ポリペプチド」は、メチル化DNAに結合することができるポリペプチドを包含する。当該用語は、メチル化DNAに結合することができる二機能性ポリペプチドも含み、抗メチル化DNA抗体を含む。かかるポリペプチドは、本明細書中に記載され、そして、メチル化DNAを検出するための本発明の方法において使用される。
【0036】
本明細書中に使用される用語「二機能性ポリペプチド」は、ポリペプチドが、当該二機能性ポリペプチドの一部である抗体のFc部分により、メチル化DNA、好ましくはCpGメチル化DNAと結合することに加えてさらなる機能を有することを意味する。例えば、当該Fc部分は、好ましくは、化合物又は部分を当該Fc部分と、結合、連結又は共有結合する可能性を提示する。本明細書中に使用されるように、用語「共有結合した」は、特定の化合物又は部分が、互いに直接的に共有的に連結する、あるいは、橋、スペーサー又は連結部分の如き、介在する部分を通じて互いに間接的に共有的に連結することを意味する。さらに、前記Fc部分は、本明細書中に記載のように、容器に当該二機能性ポリペプチドを結合させるために使用され得る。好ましい二機能性ポリペプチドは、配列番号2(図7)に示されるアミノ酸配列により特徴付けられる。さらに好ましい二機能性ポリペプチドは、以下に記載される。
【0037】
理論に束縛されることなく、メチル−DNA−結合ドメインと抗体のFc部分を含む新生二機能性ポリペプチドは、抗体の定常領域とある意味類似、好ましくは一致するそれらのFc部分で、好ましくは2つのポリペプチドが連結され、結果として本明細書中に記載されるような二機能性ポリペプチドとなるために宿主細胞内に折りたたまれている。
【0038】
驚くべきことに、好ましくは抗体様タンパク質として振舞う当該二機能性ポリペプチドは、好ましくは抗体様方法においてCpGメチル化DNAを結合できることを見出した。そのことは、当該二機能性ポリペプチドが、好ましくはCpGジヌクレオチドでメチル化された好ましくはメチル化DNAであるその「抗原」に対する高親和性、及び結合活性を有することを意味する。さらに、理論に束縛されることなく、その「抗原」としてのメチル化DNAを検出するための本発明の方法において使用される二機能性ポリペプチドの高親和性、及び結合活性は、当該二機能性ポリペプチドの唯一の構造により引き起こされる。なぜなら、当該定常領域は、当該二機能性ポリペプチドの2つのポリペプチド分子の互いの定常領域の免疫グロブリン重鎖の間に、ジスルフィド結合を形成することが予測されるからである。従って、好ましくは、抗体様構造は、抗体の構造に非常に類似して形成される。
【0039】
さらに、理論に縛られることなく、この抗体様構造は、例えば、メチル化DNAを検出するために本発明の方法において使用される二機能性ポリペプチドに関する安定に役立つと予測される。なぜならば、抗体の定常領域と融合するタンパク質は、当該タンパク質の高い安定性、及び半減期を与えることが本分野において記載されているからである。さらに、当該定常領域の分子内相互作用により生じさせられた抗体様構造は、本発明の方法において使用される本発明の1つのポリペプチドのメチル−DNA−結合ドメインに近接近するメチル化DNAを検出するために本発明の方法に関して使用される、二機能性ポリペプチドのもう1つのポリペプチドのメチル−DNA−結合ドメインをもたらすことが信じられる。
【0040】
このことは、当該メチル−DNA−結合タンパク質と、メチル化DNAとの二価の相互作用を可能とする。従って、本明細書中に記載される二機能性ポリペプチドは、当該二機能性ポリペプチドの一部である2つのメチルDNA−結合ドメインを介して、その抗原に好ましくは結合することが可能である。当該二機能性ポリペプチドの高親和性結合は、とりわけ、他のタンパク質と相互作用するためのドメインを含む全長メチル−DNA−結合タンパク質の代わりに、好ましくはタンパク質のメチル−DNA−結合ドメインを使用することによっても達成される、ここで、当該他のタンパク質は、非メチル化DNAよりはむしろメチル化DNA、好ましくはCpGメチル化DNAと特異的に結合することが知られる本明細書中に記載されるような唯一の適用性を、しかしながら、阻害又は干渉され得る。さらに、当該メチル−DNA−結合ドメインの好ましい使用は、検出が直接的であり間接的ではないので、確かに、メチル化DNAが結合されることを保証すると信じられる。大抵の先行技術の方法は、PCRによりメチル化DNAを間接的に検出できるだけである。
【0041】
これらの特性は、メチル化DNAを検出するための本発明の方法において使用され得る信頼でき、容易に適用できる診断用手段である二機能性ポリペプチドを与える。さらに、それは、たとえ、DNAが、本明細書中に記載されるように約10ng超、10ng未満、7.5ng未満、5ng未満、2.5ng未満、1000pg未満、500pg未満、250pg未満又は約150pgの如き少量で存在するときでも、とりわけ、メチル化DNAを単離する、精製する、促進する方法にも使用され得る。従って、その抗体様構造により、本明細書中に記載される二機能性ポリペプチドは、例えば、本明細書中に記載されるような、及び実施例中にあるような単一のチューブ内の多段階手法を含む様々な用途に適用可能であることを示す確固とした分子である。
【0042】
本明細書中に使用される用語「接触させる」とは、本明細書中に記載されるようなメチル化DNAに結合することができるポリペプチドを、メチル化及び/又は非メチル化DNAを含むサンプルの接触に至らせる全技術を含む。好ましくは、当該メチル化及び/又は非メチル化DNAを含むサンプルは、好ましくはピペット操作ステップにより、メチル化DNAに結合することができる本明細書中に記載されるポリペプチドでコートされる容器の中に移動させられる。
【0043】
メチル化DNAを検出するための本発明の方法のさらなる利点は、当該容器、好ましくはPCRチューブがコートされた後、メチル化DNAが、好ましくは40〜50分以内で、メチル化DNAに結合することができるポリペプチドにより、結合させられ得ることである。好ましくは適用される続く洗浄ステップは、本明細書中に記載されるメチル化DNAを検出するための方法を場合により自動化され得るハイスループット形式において走らされ得る時間のかからない頑健な方法の状態にする、好ましくは約5分間だけ必要とする。
【0044】
本明細書中に使用される用語「検出する」とは、メチル化DNAを検出するために適するいかなる技術をも包含する。
【0045】
好ましい態様において、メチル化DNAに結合することができるポリペプチドにより結合されるメチル化DNAは、制限酵素の消化、bisulfiteシークエンシング、ピロシークエンシング又はサザンブロットにより検出される。しかしながら、当該メチル化DNAの検出は、上述の方法に限定されず、RDA、マイクロアレイなどの如き、メチル化DNAを検出するために本分野において知られる他の全ての好適な方法を含む。
【0046】
本明細書中に使用される用語「メチル化DNA」は、好ましくはメチル化DNA、より好ましくはヘミメチル化DNA、あるいは両鎖又は一本鎖メチル化DNAでメチル化されたDNA含むCpGメチル化DNAを包含する。最も重要な例は、大抵はジヌクレオチドCpGという状況で、さらにCpNpG−及びCpNpN−配列という状況でも生ずるメチル化シトシンである。しかしながら、原則として、他の天然に生ずるヌクレオチドもまたメチル化され得る。
【0047】
あるいは、好ましい態様において、メチル化DNAに結合することができるポリペプチドにより結合される当該メチル化DNAは、増幅技術であって、好ましくは遺伝子特異的プライマーを使用する、シングル又はマルチプレックスのいずれかの慣習的又はリアルタイムPCRを含む、慣習的又はリアルタイムPCRの如き、PCRにより検出される。
【0048】
本明細書中に使用される用語「増幅技術」とは、多くの同一の又は本質的に同一(すなわち、少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%、及び最も好ましくは99.9%同一の如き少なくとも99.5%)の核酸分子又はそれらの一部の産生を可能とするいかなる方法をもいう。かかる方法は、本分野において確立される;Sambrook et al."Molecular Cloning,A Laboratory Manual”,第2版1989,CSH Press,Cold Spring Harborを参照のこと。リアルタイムPCRを含む様々なPCR技術は、例えばDing,J.Biochem.Mol.Biol.37(2004),1−10により概説される。
【0049】
上述のように、本分野において種々の増幅方法が知られ、それらの全てが、本発明の方法において、メチル化DNAに結合することができる本明細書中に記載のポリペプチドにより結合されるメチル化DNAを検出するために有用であることが予期される。ステップ(c)における検出は、PCRにより達成されることが好ましい。PCRは、短時間で、鋳型の繰り返される複製により、DNAを何百万倍にも増幅するために使用される強力な技術である。当該方法は、最初のDNA合成に対して特異的に生体外で増幅されるオリゴヌクレオチドのセットを利用する。プライマーの設計は、分析が望まれるDNAの配列に依存する。プライマーの長さが異なるパラメータをもたらすことが知られる(Gillam(1979),Gene8,81−97;lnnis(1990),PCR Protocols:A guide to methods and applications,Academic Press,San Diego,USA)。
【0050】
好ましくは、プライマーは、標的ヌクレオチド配列の特異的領域のみにハイブリダイズ又は結合すべきである。標的ヌクレオチド配列の1つの領域にのみ統計的にハイブリダイズするプライマーの長さは、以下の式:(1/4)(ここで、xは、当該プライマーの長さである。)により計算され得る。例えば、ヘプタ又はオクタヌクレオチドは、37kbの配列に統計的に1回だけ結合するのに十分だろう。しかしながら、相補的テンプレート鎖に正確に適合するプライマーは、少なくとも9塩基対の長さでなければならず、さもなければ、安定した二本鎖が形成され得ないことが知られている(Goulian(1973),Biochemistry 12,2893−2901)。本発明の核酸分子を増幅することが可能なプライマーを設計するために、コンピューターに基づくアルゴリズムが使用され得ることも企図される。好ましくは、本発明のプライマーは、少なくとも10ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも12ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは少なくとも15ヌクレオチドの長さ、特に好ましくは少なくとも18ヌクレオチドの長さ、さらにより特に好ましくは少なくとも20ヌクレオチドの長さ、及び最も好ましくは少なくとも25ヌクレオチドの長さである。しかしながら、本発明は、より短い又はより長いプライマーでも実施され得る。
【0051】
PCR技術は、高温でテンプレートを融解させる、プライマーを当該テンプレート中の相補的配列にアニールさせる、次いでDNAポリメラーゼで当該テンプレートを複製させる多くのサイクル(通常20〜50)を通じて実施される。当該過程は、海や温泉の熱の孔で育った細菌から単離された熱安定性DNAポリメラーゼの使用で自動化されている。複製の第1ラウンドの間、DNAの単一のコピーは2つのコピーに転換され、当該プライマーにより標的とされる配列の多くのコピーにおいて急激な増加をもたらす。ちょうど20サイクル後、DNAの単一コピーは、2,000,000倍超に増幅される。
【0052】
好ましい態様において、上記方法は、ステップ(d)メチル化DNAに結合することができるポリペプチドにより結合されるDNAを分析する、をさらに含む。当該分析は、好ましくは、シークエンシングにより実施される。当該シークエンシングは、サンガー(Sanger)法により蛍光ジデオキシヌクレオチドを使用する自動化ジデオキシシークエンシングの如き、本分野において知られる方法により実施される(Proc.Natl.Acad.Sd.74(1977),5463−5467)。自動化シークエンシングのために、シークエンスされるDNAは、本分野において知られる方法により、及び好ましくはシークエンスのためのDNAを作成するために使用されるキットの指示に従って作成される。
【0053】
本発明が詳細に記載される前、当然のことながら、本発明は、様々に本明細書中に記載される、特定の方法論、プロトコル、細菌、ベクター、及び試薬などに限定されないと理解される。本明細書中に使用される専門用語は、特定の態様のみを記載するためのものであり、添付の請求項によってのみ限定されるだろう本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解される。特段の特定がなければ、本明細書中に使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。
【0054】
好ましくは、本明細書中に使用される用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)」,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.And Kolbl,H.eds.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH−4010 Basel,Switzerland)中に記載されるように定義される。本明細書、及び請求項を通して、特段の要求がなければ、単語「含む」、及び「含む(複数形)」や「含んでいる」の如き変化は、他の整数又はステップ又は整数の群の排除ではなく、言及される整数又はステップ又は整数の群の含有を暗示すると理解されるだろう。
【0055】
本明細書中、及び請求項における単数形「a」、「an」、及び「the」は、特段の指示がなければ、複数形の言及をも含むことに留意しなければならない。それ故、例えば、「試薬(単数形)」の言及は、1又は複数のかかる異なる複数の試薬をも含み、「当該方法」の言及は、本明細書中に記載される方法について改変又は置換可能な、当業者に知られる同等のステップ、及び方法をも含む。
【0056】
CpGアイランドは、遺伝子プロモーター、及び転写開始部位を高い頻度で含み、そして、正常細胞において、通常、非メチル化される。CpGアイランドのメチル化は、転写抑制に関連する。がんにおいて、CpGアイランドプロモーターのメチル化は、腫瘍抑制遺伝子の異常なサイレンシングを導き、当該疾患の発症の一因となる。上述のように、先行技術は、メチル化候補遺伝子の検出のために異なるアプローチを記載するが、ある欠点に直面する。例えば、先行技術のハイスループット方法は、単一の/わずかなCpG残基の検出に限定され得、又は、特に、非常にわずかな量のDNAが分析対象とされる場合、CpGメチル化DNAを信頼して検出し得ない。候補遺伝子のCpGメチル化の程度の、速く感度の良い検出を可能とするために、本発明は、例えば、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ又は亜硫酸水素塩処理を適用しない、CpGメチル化の検出を可能とする手段、及び方法を提供する。
【0057】
メチル化DNAを検出するための本発明の方法に関して、上述の驚くべき発見に加えて、さらに驚くべきことには、容器、好ましくはPCRチューブの比較的小さな表面に対するメチル化DNA、及び/又はそれらの断片の結合は、メチル化及び/又はメチル化DNA、及び/又はそれらの断片の複合混合物内の好ましくは単一の遺伝子座を検出するのに十分であった。従って、好ましくは、メチル−結合(MB)PCRと名付けられたメチル化DNAを検出するための1つのチューブアッセイは、DNAがほんの少量、例えば、10ng超、10ng未満、7.5ng未満、5ng未満、2.5ng未満、1000pg未満、500pg未満、250pg未満又は本明細書中に記載されるような約150pgしか存在しないときでさえも、とりわけ、メチル化DNAを単離する、精製する、促進するための、及び/又は好ましくはメチル化DNAを検出するための信頼でき、容易に提供可能な診断手段であることを見出した。本明細書中に記載される方法、及びキットを使用するとき、多くのサンプルにおいて、例えばヒトがんにおける単一の又は多様な遺伝座のメチル化プロフィールを発生させることもあり得る。簡単に言えば、メチル化DNAを検出するための本発明の方法の好ましい態様は、以下のように実施され得るMB−PCRである。
【0058】
好ましくは、メチル化DNA、特にCpGメチル化DNAのための高親和性を有するタンパク質は、好ましくはPCRサイクラー適合反応容器、好ましくはチューブの壁上にコートされ、メチル化DNA、及び/又はゲノムDNA混合物からのDNA断片を選択的に捕捉するために使用される。特異的DNA、及び/又はDNA断片(例えば、特異的遺伝子のCpGアイランドプロモーター)は、PCR(標準PCR、リアルタイムPCR、シングル、マルチプレックスPCRのいずれか)を使用して同じ容器内に検出され得る。メチル化の程度は、ゲノムの投入DNAのPCR反応と比較して見積もられ得る。それ故、本発明は、特に限られたサンプルから腫瘍性組織又は腫瘍細胞におけるメチル化DNAの検出を可能とする、速くて、単純で、信頼性があり、エラーに強く、及び非常に感度の良い技術を提供する。
【0059】
メチル化DNAに結合することができるポリペプチドを使用する好ましい診断的適用を、図1Aに示す。図1Bは、本明細書中に記載されるようなCpGメチル化DNAに結合することができる二機能性ポリペプチドを使用することによる診断的適用を示す。簡単に言えば、第1ステップにおいて、好ましくはメチルCpG結合ポリペプチドを、塗布可能なPCR容器、例えばNuncからのTopYield中に好ましくは添加する。そのようにする際、当該ポリペプチドを、本分野において知られる、及び本明細書中に記載される技術により、当該容器の内表面上に好ましくはコートする。
【0060】
次のステップにおいて、約5%ミルク粉末の如きブロッキング試薬を、当該コートされたPCR容器内に添加する。さらなるステップにおいて、好ましくは目的のDNA断片{例えば、メチル化、及び/又は非メチル化DNA断片(図1A、及びBに使用される用語「CpGメチル化 低」は、非メチル化DNAを含み、及び特には非メチル化DNAを言及する。)}を、当該被膜されブロッキングされたPCR容器中に添加した。信じられることには、当該メチルCpG結合ポリペプチドは、もし存在すれば、メチル化DNAに特異的に結合する。
【0061】
続くステップにおいて、好ましくはDNA断片を含むコートされブロッキングされたPCR容器を、インキュベートし、次いで、洗浄し、非結合DNA断片を除去する。その後、好ましくは遺伝子特異的プライマー、また好ましくはメチル化又は非メチル化されると思われる目的の遺伝子又は遺伝子座のための、例えばマルチプレックスPCRのための少なくとも2、3、4、5、6、7対などのプライマー対を含むPCRミックスを添加し、そして,好ましくはリアルタイムPCR又は慣習的PCRを走らせ、その後、ゲル電気泳動により増幅産物を分離する。場合により、対照反応を、以下に記載される「P反応」として図1A又は1Bにおいて示される様に実施し得る。
【0062】
MB−PCRの好ましい詳細なプロトコルを以下に示す。
【0063】
好ましくは、PCRチューブは、熱安定性TopYield(登録商標)ストリップ(Nuncカタログ番号248909)を使用することが好まれる。好ましくは、本明細書中に記載されるポリペプチド、好ましくはメチルCpG結合ポリペプチドの50μl(10mMのTris/HCl pH7.5で希釈されたもの)を、各ウェルに添加し、そして4℃で一晩インキュベートする。好ましくは、ウェルを200μlのTBS(170mMのNaClを含み、pH7.4の20mMのTris)で3回洗浄し、そして好ましくは室温で3〜4時間、100μlのブロッキング液(170mMのNaClを含み、pH7.5の10mMのTris、5%のスキムミルク粉末、5mMのEDTA、及び1μg/mlの各ポリd(I/C)、ポリd(A/T)、及びポリd(CG))でブロッキングする。好ましくは、チューブを、次いで200μlのTBST(0.05%Tween−20を含むTBS)で3回洗浄する。
【0064】
好ましくは、50μlの結合緩衝液(400mMのNaCl、2mMのMgCl、0.5mMのEDTA、及び0.05%のTween−20を含む、pH7.5の20mMのTris)を、各ウェルに添加し、好ましくは2μlの消化されたDNA、好ましくは5ng/μlの量のMselで消化されたゲノムのDNAを各第2ウェル(M反応)に添加する。
【0065】
ゲノムDNAは、本分野において知られるキットを使用することにより、例えばBlood and Cell Culture Midi Kit(Qiagen)を使用することにより、好ましくは産生される。当該ゲノムDNA産生物の質は、好ましくはアガロースゲル電気泳動により調整され、DNA濃度を、好ましくは、UV光度分析法により測定した。DNAの定量を、好ましくは、PicoGreen dsDNA定量試薬(Molecular Probes)の使用により実施する。
【0066】
本明細書中に記載されるポリペプチド、及びDNA、好ましくはDNA断片(酵素消化又は機械的断片化により産生されたもの)を含むウェルを、好ましくは室温で、好ましくは40〜50分間、振動器上にインキュベートする。好ましくは、チューブを200μlの結合緩衝液で2回洗浄し、そしてpH8.0の10mMのTris/HClで1回洗浄した。
【0067】
次に、PCRを、好ましくはTopYield(登録商標)ストリップ内において直接実施する。PCRミックス(50μ/ウェル)、好ましくはPCR Masterミックス(Promega)は、好ましくは10pmolの各遺伝子特異的プライマー(Metabionにより合成されたもの)を含む。プライマー配列、及び着目の特異的遺伝子のためのサイクルパラメータを、実施例中に与える。もちろん、他の好適な遺伝子特異的又は遺伝子座特異的プライマーは、当業者により設計され得る。さらに、当業者は、着目のプライマー、及び遺伝子、遺伝子座についての最も好適なPCRパラメータを容易に測定し、及び/又は試験し得る。当該PCRミックスを添加した後、好ましくは1μlのMsel消化DNA(好ましくは5ng/μlの量において)を、DNA断片でその前にインキュベートしていない(P反応)の他の各第2ウェルに添加する。好ましくは、PCR産物を、アガロースゲル電気泳動で分析し、そしてエチジウムブロマイド染色された当該ゲルを、例えばTyphoon9200Imager(Amersham/Pharmacia)を使用して走査する。
【0068】
場合により、対照反応を下記のような「P反応」として図1A又は1Bに示される様に実施し得る。
【0069】
従って、本発明の方法は、単細胞を含む下記のようなサンプルにおけるメチル化DNA、好ましくはCpGメチル化DNAの検出のために有用であると企図される。全細胞に有用であるとも企図される。「全細胞」とは、全単細胞のゲノムのコンテキストを意味する。
【0070】
以下において、メチル化DNAに結合することができる好ましいポリペプチドを記載する。従って、メチル化DNAを検出するための本発明の方法において使用されるポリペプチドは、好ましくは、以下の:
(a)メチル−DNA結合タンパク質(MBD)ファミリーに属するポリペプチド;
(b)メチル化DNAに結合することができる、前記(a)のポリペプチドの断片;
(c)前記(a)のポリペプチド又は前記(b)の断片と比較して1又は複数のアミノ酸残基が置換され、かつ、メチル化DNAに結合することができる前記(a)のポリペプチド又は前記(b)の断片の変異体;
(d)抗メチル化DNA抗体又はそれらの断片であるポリペプチド;及び
(e)(a)〜(c)のいずれか1つのポリペプチドと少なくとも70%一致し、かつ、メチル化DNAに結合することができるポリペプチド、
からなる群より選択される。
【0071】
もちろん、メチル化DNAに結合することができる本明細書中に記載されるポリペプチドは、核酸分子によりコードされることが企図される。本明細書中に使用される用語「核酸分子」は、前記核酸分子により含まれるプリン、及びピリミジン塩基を含む塩基のヌクレオチド配列を有するいかなる核酸分子をも包含する、ここで当該塩基は、核酸分子の一次構造を表す。核酸配列は、DNA、cDNA、ゲノムDNA、RNA、PNA及び混合ポリマーの如き合成型、センス鎖及び非センス鎖の両方を含み、当業者により容易に評価されるように、非天然又は誘導ヌクレオチド塩基を含み得る。
【0072】
メチル化DNAに結合することができる、かつ本発明の方法に使用されるポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、非修飾RNA又はDNA、あるいは修飾RNA又はDNAとなり得るいかなるポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドからなる。例えば、当該ポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖DNA、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖及び二本鎖RNA、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖又はより典型的には二本鎖、あるいは一本鎖及び二本鎖領域の混合物を含むハイブリッド分子からなり得る。
【0073】
さらに、当該ポリヌクレオチドは、RNA又はDNA、あるいはRNA及びDNAの両方を含む三本鎖領域からなり得る。当該ポリヌクレオチドは、安定性のため、あるいは他の理由のために修飾された、1又は複数の修飾された塩基又はDNA又はRNA骨格も含み得る。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基、及びイノシンの如き異常塩基を含む。様々な修飾(一時的変異)は、DNA、及びRNAに対して作られ、それ故、用語「核酸分子」は、化学的、酵素的、又は代謝的修飾型を含む。
【0074】
あるいは、他の好ましい態様において、本発明の方法において使用されるメチル化DNAに結合することができる二機能性ポリペプチド(すなわち、本発明において提供される方法、及びキットにおいて使用されるMBDタンパク質)は、以下の:
(a)配列番号1(図7)に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列;
(b)配列番号2(図7)に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸配列;
(c)配列番号2(図7)に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片をコードするヌクレオチド配列を有する核酸配列であって、ここで当該断片が前記ポリペプチドの少なくとも130〜361のアミノ酸を含み、かつメチル化DNAに結合することができる、前記核酸配列;
(d)前記(a)〜(c)のいずれか1つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸配列であって、前記変異体の1又は複数のアミノ酸残基が前記ポリペプチドと比較して置換され、かつ前記変異体がメチル化DNAに結合することができる、前記核酸配列;
(e)前記(a)〜(d)のいずれか1つの核酸とハイブリダイズし、かつ(a)の核酸分子のヌクレオチド配列と少なくとも65%一致し、メチル化DNAに結合することができるポリペプチドをコードする、前記核酸配列;
(f)前記(b)の核酸分子によりコードされるポリペプチドと少なくとも65%一致し、かつメチル化DNAに結合することができる、ポリペプチドをコードする核酸分子;及び
(g)前記(a)〜(f)のいずれか1つのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に変性されるヌクレオチド配列を有する核酸配列、
あるいは、かかるポリヌクレオチドの相補鎖からなる群より選択される、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸配列によりコードされる。
【0075】
従って、上記態様は、例えば、本明細書中に提供されるキット、及び方法における「MBD−Fc」分子の使用に関する。
【0076】
上記のように、配列番号2(図7)に示されるアミノ酸配列を有するメチル化DNAを検出するために本発明の方法において使用される二機能性ポリペプチドの断片は、配列番号2(図7)に示されるアミノ酸配列の少なくとも130アミノ酸〜361アミノ酸を含む。このことは、当該断片が、Fc部分を示すアミノ酸130〜361に加えて、当該断片が非メチル化DNAよりもむしろメチル化DNA、好ましくはCpGメチル化DNAを結合可能となるように1又は複数のアミノ酸を含むことを意味する。従って、当該断片が、より好ましくは、配列番号2(図7)に示されるアミノ酸配列の少なくとも116〜361アミノ酸を含むことが企図される。さらにより好ましくは、配列番号2(図7)に示されるアミノ酸配列の少なくとも29〜115アミノ酸、及び130〜361アミノ酸を含み得る。最も好ましい態様において、当該断片は、少なくとも29〜361アミノ酸を含み得る。一般的に好ましいことには、本明細書中に記載のポリペプチドの断片が、非メチル化DNAよりもむしろ、メチル化DNA、好ましくはCpGDNAに結合できることである。この可能性は、本分野において知られる方法により、又は好ましくは実施例において記載される方法により、試験される。
【0077】
本発明は、好ましくは、メチル化DNAに結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を使用する方法にも関する。当該ハイブリダイズする核酸配列は、メチル化DNAに結合することができるポリペプチドをコードする。さらに、本発明の方法において、本明細書中(図7)に記載されるような配列番号1に示される配列、あるいはそれらの断片又は変異体とハイブリダイズし、かつ好ましくは、非メチル化よりもむしろ、メチル化DNA、好ましくはCpGメチル化DNAと結合可能である二機能性ポリペプチドをコードする核酸配列を使用する、ここで当該ポリペプチドは、メチル化DNAを検出するための本発明の方法において使用される。
【0078】
さらに、本発明は、好ましくは、メチル化DNAに結合することができる本明細書中に記載されるポリペプチドと少なくとも65%、より好ましくは70%、75%、80%、85%、90%、さらにより好ましくは99%一致するポリペプチドをコードする核酸配列を使用する方法に関する。好ましくは、本発明の方法において、配列番号2に示されるポリペプチドと少なくとも65%、より好ましくは70%、75%、80%、85%、90%、さらにより好ましくは99%一致するポリペプチドが使用されることも企図される。
【0079】
本発明において使用される用語「ハイブリダイズする」とは、好ましくは、ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションに関する。用語「ハイブリダイズする配列」は、好ましくは、非メチル化DNAよりもむしろ、メチル化DNA、好ましくはCpGメチル化DNAに結合することができるポリペプチド、あるいは非メチル化DNAよりもむしろ、メチル化DNA、好ましくはCpGメチル化DNAに結合することができる二機能性ポリペプチドをコードする上記のような核酸配列と少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、特に好ましくは少なくとも80%、より特に少なくとも90%、さらにより特に好ましくは少なくとも95%、及び最も好ましくは少なくとも97%、98%、又は99%の一致率である配列を示す配列を言及する、ここで前記メチル化DNAに結合することができる前記ポリペプチド、又は前記二機能性ポリペプチドは、メチル化DNAを検出するために、本発明の方法において使用される。
【0080】
上記ハイブリダイゼーション条件は、Sambrook,Russell”Molecular Cloning,A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(2001);Ausubel,”Current Protocols in Molecular Biology”,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989),又はHiggins and Hames(Eds.)”Nucleic acid hybridization,a practical approach”IRL Press Oxford,Washington DC,(1985)の如き慣習的なプロトコルに従って確立され得る。条件の設定は、当業者によりよく知られたものであり、本分野において記載されるプロトコルに従って決定され得る。それ故、特異的にハイブリダイズする配列のみの検出は、通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション、及び65℃で0.1×SSC、0.1%SDSの如き洗浄条件を必要とする。相同の又は非正確な相補配列の検出のための非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、65℃で、6×SSC、1%SDSで設定され得る。よく知られるように、測定されるプローブの長さ及び核酸の組成は、当該ハイブリダイゼーション条件のパラメータをさらに構成する。上記条件における変化は、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑制するために使用される代替ブロッキング試薬の包含、及び/又は置換を通じて達成され得ることに留意する。
【0081】
典型的なブロッキング試薬は、デンハルト試薬、BLOTTO、ヘパリン、変性したサケの精子DNA、及び商業的に入手可能な特許製品を含む。特異的なブロッキング試薬の包含は、適合性の問題による上記ハイブリダイゼーション条件の変更を必要とし得る。ハイブリダイズする核酸分子は、上記分子の断片も含む。かかる断片は、本明細書に記載される核酸配列を示し得る。さらに、上述の核酸分子のいくつかとハイブリダイズする核酸分子は、相補的断片、誘導体、及びこれらの分子の対立遺伝子多型をも含む。
【0082】
さらに、ハイブリダイゼーション複合体は、相補的なGとC塩基、及び相補的なAとT塩基間の水素結合に基づいて、2つの核酸間の複合体をいう、ここでこれらの水素結合は、スタッキング作用によりさらに安定化され得る。当該2つの相補的核酸配列は、逆平行配置において水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中(例えばCot又はRot分析)又は溶液中に存在する核酸配列と固形支持体(例えば膜、フィルター、小片、ピン又は例えば細胞が固定されたスライドガラス)上に固定された他の核酸配列との間において形成され得る。
【0083】
用語「相補的」又は「相補」は、許容される塩及び温度条件下、塩基対合による、ポリヌクレオチドの天然結合をいう。例えば、配列「A−G−T」は、相補的配列「T−C−A」と結合する。2つの一本鎖分子間の相補は、当該核酸のいくつかだけが結合する場合に「部分的」となり、一本鎖分子間に全ての相補性が存在するときに完全となり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率、及び長さに関して重要な効果を有する。このことは増幅反応において特に重要であり、増幅反応は核酸鎖間の結合に依存する。
【0084】
さらに、本発明は、上記核酸分子の配列と比較して縮重する配列の核酸分子を使用する方法にも関し、ここで、かかる縮重核酸分子は、メチル化DNAに結合することができ又は本明細書中に記載される二機能性ポリペプチドをコードし、及びメチル化DNAを検出するための本発明の方法において使用されるポリペプチドをコードする。本発明において使用されるとき、用語「遺伝子コードの結果として縮重する」とは、遺伝子コードの過剰により、異なる核酸配列が同じアミノ酸をコードすることを意味する。
【0085】
もちろん、本発明は、もし一本鎖形態であるならば、上記、及び下記の核酸分子に対する相補鎖も企図する。
【0086】
おそらく、メチル化DNAに結合することができるポリペプチド、又はメチル化DNAに結合することができる二機能性ポリペプチドをコードし、本発明の方法において使用されるポリペプチドは、DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA又はPNA(ペプチド核酸)の如き核酸のいかなる型ともなり得る。
【0087】
本発明の目的として、ペプチド核酸(PNA)は、DNA類似体のポリアミド型であり、そして、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンとしてのモノマー単位は、商業的に入手可能である(Perceptive Biosystems)。リン、酸化リン、又はデオキシリボース誘導体の如きDNAのある構成要素は、PNA中には存在しない。Nielsen et al.,Science 254:1497(1991)、及びEgholm et al.,Nature 365:666(1993)により記載されるように、PNAは、相補的DNAに特異的、かつ、しっかりと結合し、及びヌクレアーゼにより分解されない。事実、PNAは、DNA自身が結合するよりも強く結合する。これは、おそらく2つの鎖の間に静電反発力がないせいであり、ポリアミド骨格がより柔軟であるせいでもある。それ故、PNA/DNA2本鎖は、DNA/DNA2本鎖よりも広範なストリンジェント条件下、結合し、多重ハイブリダイゼーションをより容易に生じさせる。当該強い結合により、DNAに対するよりも、小さいプローブが使用され得る。さらに、PNA/DNAハイブリダイゼーションでPNA一塩基ミスマッチがより測定されがちであり、その理由は、PNA/DNA15−mer中の単一のミスマッチは、DNA/DNA15−merについての4°〜16°に対して、当該融点(T.sub.m)を8°〜20°まで下げるからである。PNAにおける荷電基の不存在は、ハイブリダイゼーションが低イオン強度で行われ得、及び分析の間に塩による可能な干渉を低減することを意味する。
【0088】
DNAは、例えば、ゲノムDNA又はcDNAとなり得る。RNAは、例えば、mRNAとなり得る。核酸分子は、天然、合成又は半合成のものとなり得、あるいは、ペプチド核酸(Nielsen,Science 254(1991),1497−1500)又はホスホロチオエートの如き誘導体となり得る。さらに、当該核酸分子は、上述の核酸分子のいずれかを単独又は組み合わせのいずれかで含む、組み換え技術により作成されたキメラ核酸分子となり得る。
【0089】
メチル化DNAを検出するための本発明の方法において使用される本明細書中に記載のポリペプチドをコードする核酸分子は、とりわけ、本発明の方法において使用される本発明のポリペプチドを作成するために、宿主細胞(原核細胞又は真核細胞)の中に形質転換され得るベクター(例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ)に含まれると予想される。本発明の方法において使用される本発明のポリペプチドは、微生物的方法又はトランスジェニック哺乳類により作成される。本発明のポリペプチドは、トランスジェニック植物から回収されるとも予想される。あるいは、本発明のポリペプチドは、合成又は半合成で作成され得る。
【0090】
例えば、Houghton Proc.Natl.Acad.Sci.USA(82)(1985),5131−5135により記載される固相方法の如き化学合成が使用され得る。他の方法は、mRNAの生体外翻訳である。好ましい方法は、上記のような宿主細胞におけるタンパク質の組み換え作成を含む。例えば、本発明のヌクレオチド配列のいずれか1つの全部又は一部を含むヌクレオチド酸配列は、PCRにより合成され得、発現ベクター内に挿入され得、そして宿主細胞は、当該発現ベクターで形質転換され得る。その後、当該宿主細胞は、培養され、所望のポリペプチドを作成し、そして単離され精製される。
【0091】
タンパク質の単離、及び精製は、以下のいくつかの知られた方法:例えば、非制限的に、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、及び親和性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相HPLC、分取ディスクゲル電気泳動により、達成され得る。さらに、無細胞形質転換系が、本発明のポリペプチドを作成するために使用され得る。本発明に関する使用のために好適な無細胞発現系は、ラビット網状赤血球溶血液、麦芽抽出物、すい臓ミクロソーム膜、E.coli S30抽出物、及びTNTシステム(Promega)の如き、転写/翻訳結合系を含む。
【0092】
これらの系は、クローニングベクター、DNA断片又はコーディング領域及び適切なプロモーター要素を含むRNA配列に追加される組み換えポリペプチド又はペプチドの発現を可能とする。上述のように、タンパク質の単離/精製技術は、慣習的方法を使用する本発明のタンパク質の修飾を必要とし得る。例えば、ヒスチジンタグは、当該タンパク質に追加され、ニッケルカラムにおいて精製を可能とし得る。他の修飾は、より高い又は低い活性を生じ得、より高い値のタンパク質作成を可能とし得、又は当該タンパク質の精製を単純化し得る。本発明の方法において使用されるポリペプチドの作成後、ペグ化、誘導体化などにより修飾され得る。
【0093】
用語「メチル−DNA結合タンパク質(MBD)に属するポリペプチド」は、MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3、及びMBD4タンパク質を含むMBDファミリーのタンパク質のメチル−DNA結合ドメイン(MBD)の構造的、及び/又は機能的特徴を好ましくは有するポリペプチドを包含する。当該用語は、とりわけ、メチル化DNAに対する抗体を含むメチル化DNAに結合することができるポリペプチドを包含する。好ましくは、当該抗体は、抗−5−メチルシステイン抗体又はそれらの断片である。好ましくは、当該断片は、Fab、F(ab’)2、Fv又はscFvの断片である。
【0094】
当該メチル−DNA結合活性は、本分野において知られた方法により試験され得る。本明細書中に記載されたポリペプチドは、モノマー又はダイマー又は本明細書中に記載されるような多価分子のいずれかとしてのメチル化DNAに結合することが好ましい。高メチル化DNA又は低メチル化DNAに結合できることが好ましい。好ましくは、単一メチル化CpG対に結合することができる。MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3、及びMBD4は、メチル−CpG結合ドメインを有する組織だったタンパク質ファミリーの構成要素となる。当該MBDタンパク質ファミリーは、既知のMBDの配列に基づく2つのサブグループを含む。
【0095】
MBD4のメチル−DNA結合ドメインは、一次配列において、MeCP2のものと最も似ており、一方、MBD1、MBD2、及びMBD3のメチル−DNA結合ドメインは、MBD4又はMeCP2のいずれかのものよりも、互いに、より似ている。しかしながら、各タンパク質内の当該メチル−DNA結合ドメインは、MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3、及びMBD4の全5遺伝子内の保存位置に位置するイントロンの存在に基づいて、進化的に関連するようである。しかし、当該MBDファミリーのメンバー間の配列の類似は、それらのメチル−DNA結合ドメインに主に限定される、しかしながら、MBD2とMBD3は似ており、それらの長さのほとんどに渡り約70%の一致を有する。最も著しい相違は、C末端で生じ、そこで、MBD3は、12連続グルタミン酸残基を有する。
【0096】
本発明の方法において有用な、MBDファミリー又はそれらの断片、好ましくはメチル−DNA結合ドメインに属するタンパク質は、例えば、本分野において知られた手段、及び方法、好ましくは本明細書中に記載されるものを使用することによる配列比較、及び/又は整列を使用することにより、並びに、既知のMBDとMBDであると思われる配列とを比較すること、及び/又は整列することにより同定され得る。
【0097】
例えば、比較された2つの配列の双方における位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットにより占められるとき(例えば、もし2つのDNA分子の各々における位置が、アデニンにより占められるならば、又は、2つのポリペプチドの各々における位置がリジンにより占められるならば)、そのとき、各分子は、その位置で一致する。2つの配列間の一致パーセンテージは、当該2つの配列により照合される又は共有される一致位置の数を、比較された位置の数により割り、100をかける関数である。例えば、もし、2つの配列の10個の位置において6個の位置が、一致又は同一であれば、当該2つの配列は60%の一致率となる。例示として、CTGACTとCAGGTTのDNA配列は、50%の相同性を有する(6個の総位置数の内3個が一致する。)。
【0098】
一般的に、比較は、2つの配列が最大の相同性、及び/又は一致を得るように整列させられ実施される。かかる整列は、例えば、Needleman,J.MoI Biol.48(1970):443−453,implemented conveniently by computer programs such as the Align program(DNAstar,Inc.)の方法を使用して提供され得る。相同配列は、一致した又は似たアミノ酸残基を有し、ここで、似た残基は、整列させられた対照配列における対応するアミノ酸残基の同類置換又は「許容される点変異」である。これに関して、対照配列における残基の「同類置換」は、対応する対照残基と物理的又は機能的に類似である、例えば、類似の大きさ、形状、電荷、共有又は水素結合を形成する能力を含む化学的特性を有する置換である。特に好ましい同類置換は、Dayhoff et al.,5:Atlas of Protein Sequence and Structure,5:Suppl.3,chapter 22:354−352,Nat.Biomed.Res.Foundation,Washington,D.C.(1978)において「許容される点変異」として定義された基準を実行するものである。
【0099】
好ましくは、本発明の方法において使用されるポリペプチドのメチル−DNA結合ドメイン又はそれらの断片である、本明細書中に記載され、かつメチル化DNAに結合することができる本発明の方法において使用されるポリペプチドの断片は、好ましくは本明細書中に記載されるようなMBDファミリーに属するタンパク質の構造的、及び/又は機能的特徴を有する。好ましくは、本明細書中に記載されるメチル−DNA結合タンパク質の断片は、メチル化DNA、好ましくは、CpGメチル化DNAを結合することができる。
【0100】
本発明の方法において使用される本発明のポリペプチドのメチル−DNA結合ドメイン又はそれらの断片は、好ましくは、昆虫起源、線虫起源、魚類起源、両生類起源であり、より好ましくは、脊椎動物起源であり、さらにより好ましくは、哺乳類起源であり、最も好ましくは、マウス起源であり、そして特に好ましくは、ヒト起源である。
【0101】
好ましくは、本発明の方法において使用される本発明のポリペプチドのメチル−DNA結合ドメイン又はそれらの断片は、Ballester and Wolffe,Eur.J.Biochem.268(2001),1−6の図1に示されるような特徴的ループを有する、固有のアルファへリックス/β鎖サンドイッチ構造を有し、かつメチル化DNAを結合することができる。
【0102】
より好ましくは、本発明の方法において使用される本発明のポリペプチドのMBDファミリーに属するタンパク質又はそれらの断片は、Ballester and Wolffe(2001),loc.cit.の図1に示されるMBDの少なくとも50、より好ましくは少なくとも60、さらにより好ましくは少なくとも70又は80アミノ酸残基を含み、かつメチル化DNAに結合することができる。
【0103】
さらにより好ましくは、本発明の方法において使用される本発明のポリペプチドのメチル−DNA結合ドメイン又はそれらの断片又は変異体は、Ballester and Wolffe(2001),loc.cit.の図1に示されるMBDとアミノ酸レベルで、好ましくは、50%、60%、70%、80%又は90%、より好ましくは95%又は97%、さらにより好ましくは98%、及び最も好ましくは99%の一致率を有し、かつメチル化DNAを結合することができる。アミノ酸配列の如き配列の一致率を決定するための手段、及び方法は、本明細書中に記載される。
【0104】
本発明に従い、複数の核酸又はアミノ酸配列との関係における用語「一致」又は「パーセント一致」は、比較間に渡り、又は本分野において知られる配列比較アルゴリズムを使用して測定されるように指定された領域に渡り、又は手作業の整列及び視覚による検査に渡り、最大の一致となるように比較、及び整列されたとき、同一の、又は同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドの特異的パーセンテージ(例えば、少なくとも65%一致、好ましくは少なくとも70〜95%一致、より好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%一致)を有する複数の配列又はサブ配列をいう。例えば、65%〜95%又はそれ超の一致を有する配列は、実質的に一致と考えられる。かかる定義は、試験配列の相補体にも適用する。好ましくは、当該記載された一致は、少なくとも約232アミノ酸又は696ヌクレオチドの長さである領域に渡り存在する。当業者は、例えば、本分野において知られる、CLUSTALWコンピュータープログラム{Thompson Nucl.Acids Res.2(1994),4673−4680}又はFASTDB{Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990),237−245}に基づくアルゴリズムの如きアルゴリズムを使用する配列間の一致パーセントの測定法を知っているだろう。
【0105】
当該FASTDBアルゴリズムは、通常、その計算において、配列中の内部非一致欠失部分又は追加部分、すなわちギャップを考慮しないけれども、これは、一致%の過大評価を避けるために手作業で正され得る。しかしながら、CLUSTALWは、その一致計算において配列ギャップを考慮し得る。本分野において有用なものには、BLAST、及びBLAST2.0アルゴリズム{Altschul Nucl.Acids Res.25(1977),3389−3402}もある。核酸配列のための当該BLASTNプログラムは、デフォルトとして、ワード長(W)11、期待値(E)10、M=5、N=4、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のために、当該BLASTPプログラムは、デフォルトとして、ワード長(W)3、及び期待値(E)10を使用する。BLOSUM62採点マトリクス(Henikoff Proc.Natl.Acad.Sci,USA,89,(1989),10915)は、整列値(B)50、期待値(E)、M=5、N=4、及び両方の鎖の比較を使用する。
【0106】
例えば、基本的局所配列検査ツール(Altschul,Nucl.Acids Res.25(1997),3389−3402;Altschul,J.MoI.Evol.36(1993),290−300;Altschul,J.Mol.Biol.215(1990),403−410)として示されるBLAST2.0は、局所配列の検索のために使用され得る。BLASTは、配列相同性を決定するためにヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方の整列を形成する。当該配列の局所的性質を理由として、BLASTは、正確な一致を決定する際又は相同配列を特定する際に、非常に有用である。BLASTアルゴリズム出力の基本単位は、高スコア断片対(HSP)である。HSPは、任意の、しかし等しい長さの2つの配列断片であって、その整列が局所的に最大となり、その配列スコアが使用者により設定された閾値又はカットスコアに対応する又はそれを超す当該配列断片からなる。当該BLASTアプローチは、問い合わせ配列とデータベース配列との間のHSPを検索し、見つかったいくつかの一致の統計的有意性を評価し、そして使用者の選択した閾値又は有意性を満足する一致のみを報告する。パラメータEは、データベース配列の一致を報告するための統計的有意な閾値を確立する。Eは、全データベース検索の範囲内のHSP(又はHSPのセット)の偶発的事象の期待度数の上限として解釈される。その一致がEを満足させるいくつかのデータベース配列が、当該プログラム出力において報告される。
【0107】
BLASTを使用する類似のコンピューター技術(Altschul(1997),loc.cit.;Altschul(1993),loc.cit.;Altschul(1990),loc.cit.)は、GenBank又はEMBLの如きヌクレオチドデータベースにおいて一致又は関連分子を検索するために使用される。この分析は、多重膜に基づくハイブリダイゼーションより著しく早い。さらに、当該コンピューター検索の感度は、特定の一致が正確として分類されるか類似として分類されるかのいずれかを決定するために修正され得る。
【0108】
当該検索の基本は、以下のように定義される製品スコアであり、2つの配列間の相同性の程度、及び配列一致の長さを考慮する。
【化1】

【0109】
例えば、製品スコア40で、一致は1〜2%エラー内の正確性であり、70で一致は正確なものとなるだろう。より低いスコアが関連分子を同一視するかもしれないけれども、類似分子は、通常15〜40の製品スコアを示すものを選択することにより特定される。
【0110】
最も好ましくは、本発明の方法において使用される本発明のポリペプチドのメチル−DNA結合ドメイン、あるいはそれらの断片又は変異体は、Ballester and Wolffe(2001),loc.citの図1に示されるMBDタンパク質のメチル−DNA結合ドメイン、又はHendrich and Tweedy,Trends Genet.19(2003),269−77に記載されるMBDタンパク質のメチル−DNA結合ドメインを含み、かつメチル化DNAに結合することができる。
【0111】
本発明の特に好ましい態様において、本発明の方法において使用されるポリペプチドのメチル−DNA結合ドメインは、ヒトMBD2のものである。よりさらに好ましい態様において、当該メチル−DNA結合ドメインは、GenBank受け入れ番号NM003927のアミノ酸配列の144アミノ酸〜230アミノ酸を含む、ヒトMBD2のものである。最も好ましい態様において、本発明の方法において使用されるポリペプチドのメチル−DNA結合ドメインは、配列番号2(図3)において示されるアミノ酸配列の29位〜115位由来のアミノ酸配列を含む。
【0112】
メチル化DNAに結合することができ、及び本発明の方法において使用される本発明のポリペプチドの「変異体」は、1又は複数のアミノ酸残基が置換された、好ましくは当該ポリペプチドと比較して保存的に置換されたポリペプチドを含み、かつ、好ましくはCpGメチル化DNAであるメチル化DNAと好ましくは結合し得る。かかる変異体は、本発明のポリペプチドの活性に影響しないように、本分野において知られる一般的ルールに従って選択される欠失体、挿入体、反転体、反復体、及び置換体を含む。例えば、表現型に影響を与えないアミノ酸置換の作り方に関連する指針は、Bowie,Science 247:(1990)1306−1310において提供され、ここで、著者らは、変化させるアミノ酸配列の許容範囲を研究するための2つの主要な戦略を示している。
【0113】
第1戦略は、進化の過程の間、自然選択によるアミノ酸置換の許容範囲を有効に活かす。異なる種のアミノ酸配列を比較することにより、保存されたアミン酸が同定され得る。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質機能として重要となりがちである。対照的に、置換が自然選択により許容されているアミノ酸の位置は、これらの位置がタンパク質の機能にとって重要ではないことを示す。それ故、アミノ酸置換が許容される位置は、タンパク質の生物学的活性をいまだに維持しながら修飾され得る。
【0114】
第2戦略は、遺伝子工学を使用して、タンパク質機能にとって重要な領域を同定するためのクローン遺伝子の特定の位置でアミノ酸の変化を導く。例えば、部位特異的突然変異誘発法又はアラニンスキャニング突然変異生成(分子内の全残基で単一アラニン突然変異の誘導)が使用される(Cunningham and Wells,Science 244:(1989)1081−1085)。得られた突然変異分子は、次いで、生物学的活性について試験され得る。
【0115】
著者らが述べるには、これらの2つの戦略は、タンパク質がアミノ酸置換に驚くべき耐性を有していることを明らかとしている。著者らは、どのアミノ酸変化がタンパク質内の特定のアミノ酸位置で許容される傾向にあるのかをさらに示す。例えば、(タンパク質の3次構造内において)最も埋もれたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、一方、表面側鎖の機能は一般的に保存されない。
【0116】
本発明は、一致の程度は低いが、本発明の方法において使用される本明細書中に記載のポリペプチドにより機能する1又は複数の機能を働かせるために十分な類似点を有するポリペプチドを含む。類似とは、保存されたアミノ酸置換により決定される。かかる置換は、ポリペプチド中の与えられたアミノ酸を似た特徴(例えば、化学的特性)の別のアミノ酸で置換するといった置換である。上記Cunninghamらによると、かかる保存的置換は、表現型に影響を与えない傾向にある。どのアミノ酸変化が表現型に影響を与えない傾向にあるのかに関するさらなる指針は、Bowie,Science 247:(1990)1306−1310に記載される。
【0117】
本発明の許容される保存アミノ酸置換は、脂肪族又は疎水性アミノ酸、Ala、Val、Leu及びIleの置換;ヒドロキシル残基、Ser及びThrの置換;酸性残基、Asp及びGluの置換;アミド残基、Asn及びGlnの置換、塩基性残基、Lys、Arg、及びHisの置換;芳香族残基、Phe、Tyr及びTrpの置換、並びに小さいサイズのアミノ酸、Ala、Ser、Thr、Met及びGlyの置換を含む。
【0118】
さらに、本発明は、以下の表に提供される保存的置換を含む。
【0119】
【表5】

【0120】
上記の使用とは別に、かかるアミノ酸置換は、タンパク質又はペプチドの安定性をも増大する。本発明は、タンパク質又はペプチド配列中に、例えば、(当該ペプチド結合を置換する)1又は複数の非ペプチド結合を含むアミノ酸置換を包含する。D−アミノ酸の如き天然に生ずるL−アミノ酸以外のアミノ酸、あるいはβ又はγアミノ酸の如き非天然に生ずる又は合成アミノ酸を含む置換体をも含む。
【0121】
一致、及び類似の双方は、以下の刊行物を参照することにより容易に計算され得る。Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Infoliuaties and Genome Projects,Smith,DM.,ed.,Academic Press,New York,1993;lnformafies Computer Analyzis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analyzis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academie Press,1987;及びSequence Analyzis Primer,Gribskov,M.and Devereux,eds.,M Stockton Press,New York,1991。
【0122】
上記のように、メチル化DNAに結合するために使用されるポリペプチドは、好ましくは抗5−メチルシトシン抗体、あるいはそれらのFab、F(ab’)、Fv又はscFv断片である抗メチル化DNA抗体をも好ましくは包含する。好ましくは、当該抗5−メチルシトシン抗体は、メチル化DNA、好ましくはCpGメチル化DNAに特異的に結合する。本明細書中の用語「特異的」は、上記抗体がCpGメチル化DNAと反応するが、非メチル化DNA、及び/又はシトシン以外のヌクレオチドでメチル化されたDNA、及び/又はシトシンのC5原子以外の位置でメチル化されたDNAとは反応しないことを意味する。
【0123】
当該抗体が上記のように反応するかどうかは、とりわけ、当該抗体とCpGメチル化DNAとの結合反応と、非メチル化DNA、及び/又はシトシンのC5原子以外の位置でメチル化されたDNAとの結合反応を比較することにより、容易に試験され得る。
【0124】
本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル又はモノクローナルとなり得る。用語「抗体」とは、誘導体、あるいは、Fab、F(ab’)、Fv又はscFv断片の如き、結合特異性を保持するそれら断片をも含む。抗体作成のための技術は、本分野においてよく知られ、例えばHarlow and Lane ”Antibodies,A Laboratory Manual”,CSH Press,Cold Spring Harbor,1988に記載される。本発明は、キメラの、一本鎖及びヒト化抗体、並びに上記のような抗体断片をもさらに含む。例えば、Harlow and Lane,loc.citをも参照のこと。
【0125】
さまざまな処方が本分野において知られ、かかる抗体及び/又は断片の作成のために使用され得る。それ故、当該誘導体(抗体)は、ペプチド模倣薬により作成され得る。さらに、一本鎖抗体の作成のために記載される技術(とりわけ,米国特許第4,946,778号を参照のこと。)は、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を作成するために適合され得る。
【0126】
さらに、形質転換動物は、本発明のポリペプチドに対するヒト化抗体を発現させるために使用される。最も好ましくは、本発明の抗メチル化DNA抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の作成のために、連続継代細胞系培養により作成された抗体を提供するいくつかの技術が、使用され得る。かかる技術の例は、ハイブリドーマ技術(Kohler and Milstein Nature 256(1975),495−497)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor,Immunology Today 4(1983),72)、及びヒトモノクローナル抗体を作成するためのEBVハイブリドーマ技術(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77−96)である。
【0127】
一本鎖抗体の作成を記載する技術(例えば、米国特許第4,946,778号)は、上記のような抗原性ポリペプチドに対する一本鎖工程を作成するために適合され得る。従って、本発明において、用語「抗体分子」は、全長免疫グロブリン分子、並びにかかる免疫グロブリン分子の一部に関連する。さらに、当該用語は、上記のように、キメラ及びヒト化抗体のような、修飾及び/又は変化された抗体分子にも関する。当該用語は、モノクローナル又はポリクローナル抗体、並びに組み換え的又は合成的に生成/合成された抗体にも関する。当該用語は、正常な抗体、並びに、分離された軽鎖、及び重鎖、Fab、Fab/c、Fv、Fab’、F(ab’)のようなそれらの断片にも関する。用語「抗体分子」は、二機能性抗体、及び一本鎖Fvs(scFv)又は抗体融合タンパク質のような抗体コンストラクトも含む。本発明の記載中においては、当該用語「抗体」が、とりわけウイルス又はベクター経由で形質転換、及び/又は形質導入され得る抗体コンストラクトの如き、細胞内で発現される抗体コンストラクトを含むことも企図される。当然、本発明の抗体は、検出可能な物質と結合、連結又は接合され得る。
【0128】
検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、蛍光体、生物発光物質、放射活性物質、様々な陽電子放出断層撮影法を用いる陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンを含む。当該検出可能物質は、抗体(又はそれらの断片)のFc部分に対して直接的に、あるいは、本分野において知られた技術を使用して中間体(例えば本分野において知られるリンカー)を介して、非直接的のいずれかで結合又は接合され得る。本発明の診断器具としての使用のための抗体のFc部分と接合し得る金属イオンについて、米国特許第4,741,900号を参照のこと。
【0129】
好適な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含み、好適な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチン、及びアビジン/ビオチンを含み、好適な蛍光物質は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン フルオレセイン、ダンシルクロライド又はフィコエリトンを含み、蛍光体の例は、ルミノールを含み、生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み、並びに好適な放射活性物質の例は、125I、131I又は99Tcを含む。
【0130】
Fc部分に化合物を接合、結合、連結させるための技術は、よく知られ、例えば、以下のArnon et al.,”Monoclonal Antibodies For lmmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243−56(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstrom et al.,”Antibodies For Drug Delivery”,in Controlled Drug Delivery(第2版),Robinson et al.(eds.),pp.623−53(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,”Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy:A Review”,in Monoclonal Antibodies’84:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475−506(1985);”Analyzis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.),pp.303−16(Academic Press 1985),及びThorpe,Immunol.Rev.,119−158を参照のこと。
【0131】
本発明の好ましい態様において、本発明の方法において使用される、本明細書中に記載のポリペプチドは、メチル化DNAを検出するための異種ポリペプチドに、そのN末端、及び/又はC末端で融合される、ここで当該異種ポリペプチドは、好ましくは、HAタグ、myc6タグ、FLAGタグ、STREPタグ、STREP IIタグ、TAPタグ、HATタグ、キチン質結合ドメイン(CBD)、マルトース結合タンパク質、His6タグ、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)タグ、インテインタグ、ストレプトアビジン結合タンパク質(SBP)タグ、及び抗体のFc部分からなる群より選択される。「タグ」は、融合されるアミノ酸配列に対して相同または非相同であるアミノ酸配列である。
【0132】
上記タグは、とりわけ、タンパク質の精製を容易に又は融合されるタンパク質の検出を容易にする。当該融合は同一線形連結をいい、翻訳融合をもたらす。さらに好ましい態様において、メチル化DNAに結合することができる本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチドと融合され、そして場合により、当該ポリペプチドのN末端及び/又はC末端と当該異種ポリペプチドとの間の更なるリンカーを含む。当該リンカーは、好ましくは、フレキシブルリンカーである。好ましくは、それは、複数の、親水性の、ペプチド結合されたアミノ酸を含む。場合により、当該リンカーは、もし所望するならば、本発明のポリペプチドと融合される異種ポリペプチドを切断することが可能なプロテアーゼ開裂部位を含む。プロテアーゼ開裂部位は、例えば、トロンビン開裂部位である。
【0133】
好ましくは、当該リンカーは、複数のグリシン、アラニン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、プロリン、イソロイシン、及び/又はアルギニン残基を含む。当該ポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列の複数の連続コピーを含むことがさらに好まれる。通常、当該ポリペプチドリンカーは、20超のアミノ酸のポリペプチドリンカーが働く方がいいけれども、1〜20、好ましくは1〜19、1〜18、1〜17、1〜16、1〜15のアミノ酸を含む。
【0134】
好ましくは、抗体の上記Fcタンパク質は、好ましくは少なくとも一部の免疫グロブリン重鎖分子の定常領域を含む。当該Fc領域は、好ましくは、当該定常ドメインヒンジ領域、並びにC2及びC3ドメインに限定される。メチル化DNAを結合することができる、かつ本発明の方法において使用される本発明のポリペプチドにおけるFc領域は、ヒンジ領域の一部、分子間ジスルフィド架橋を形成することができる部分、及びC2及びC3ドメイン、又はそれらの機能的に同等物をも含み得る。
【0135】
あるいは、Fc部分は、少なくとも、メチル化DNAに結合することができる本発明のポリペプチドが上記ポリペプチドの特性、特に実施例において使用されたポリペプチドの特性をさらに有するために必要とされる多くのC領域を含むことも好まれる。
【0136】
他の態様において、当該定常領域が、本分野において知られる定常領域と比較して1又は複数のアミノ酸置換を含み得ることも好まれる。好ましくは、1〜100、1〜90、1〜80、1〜70、1〜60、1〜50、1〜40、1〜30又は1〜20の置換、より好ましくは1〜10の置換、さらにより好ましくは1〜9、1〜8、1〜7、1〜6の置換、及び最も好ましくは1〜5、1〜4、1〜3又は2又は1の置換を含む。当該比較は、本分野において知られるように、より好ましくは本明細書に記載されるように実施される。
【0137】
あるいは、当該定常領域は、好ましくは、少なくともC1領域、より好ましくはC1及びC2領域、及び最も好ましくはC1、C2、及びC3領域を含む。本分野において知られるように、当該抗体の定常領域は、約110アミノ酸からなる3つの特徴的免疫グロブリンドメインを有する、2つの免疫グロブリン重鎖を含む、ここで当該2つの免疫グロブリン重鎖は、ジスルフィド結合を介して共有的に結合される。
【0138】
当該定常領域が好ましくはニワトリ又はアヒル起源のものであることも企図される。さらに、好ましくは、当該定常領域は、IgM、IgA、IgD又はIgEイソ型のものであり、より好ましくは、IgGイソ型、最も好ましくはIgG1イソ型のものである。好ましくは、上述のイソ型が、脊椎動物起源のものであり、より好ましくは哺乳類起源のものであり、さらにより好ましくは、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ロバ、ラクダ又はチンパンジー起源のものであり、そして最も好ましくはヒト起源のものである。好ましくは、当該IgGイソ型は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4クラスのものであり、及び当該IgAイソ型は、IgA1、IgA2クラスのものである。
【0139】
本発明のさらに好ましい態様において、本発明の方法おいて使用されるポリペプチドは、MBD2タンパク質のメチル−DNA結合ドメインと本明細書に記載されるような抗体のFc部分との融合タンパク質である。場合により、好ましい当該融合タンパク質は、本明細書中に記載されるようなリンカーポリペプチドを含み、ここで当該リンカーポリペプチドは、MBD2のメチル−DNA結合ドメインと抗体のFc部分との間に好ましくは局在される。
【0140】
本発明の方法において使用されるポリペプチドと融合される本明細書中に記載される異種ポリペプチドは、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリカーボネート、ポリスチレン、塩化ポリビニル又はポリプロピレンなどを非制限的に含む容器又は固形支持体への本発明の方法において使用されるポリペプチドの結合、及び/又は接合を容易にする。好ましくは、当該容器は、ポリカーボネートからなるPCRチューブであり、そしてより好ましくは、Nunc カタログ番号248909由来の熱安定性TopYield(登録商標)ストリップである。当該PCRチューブ又はストリップは、96穴、384穴又は1024穴プレートの形式となり得る。従って、本発明の方法は、自動化され得るハイスループット適用に好適となる。なぜなら、本発明の方法は、いわゆる「1チューブ1アッセイ」として実施され得るからである。
【0141】
好ましい態様において、当該容器又は固形支持体、好ましくはPCRチューブ又はストリップは、本発明の方法において使用されるポリペプチドで直接的又は間接的にコートされる。例えば、コーティングは、本発明のビオチニル化されたポリペプチド、及びストレプトアビジンでコートされた容器、好ましくはPCRチューブを使用することにより直接的に達成されるだろう。しかしながら、ポリペプチドで容器をコーティングするための本分野において知られた他の技術も、本発明により企図される。
【0142】
間接的コーティングは、好ましくは、当該容器の表面上にコートされる抗体により達成され得、そしてそれは、メチル化DNAに結合することができる本発明のポリペプチドを特異的に結合すること、あるいはメチル化DNAに結合することができるポリペプチドと好ましくは融合される異種ポリペプチドを特異的に結合すること又は本発明の抗メチル化DNA抗体を特異的に結合することのいずれかが可能である。事実、当該容器はメチル化DNAに結合することができる本発明のポリペプチドで間接的にコートされる。
【0143】
本明細書中に記載される容器のコーティングは、例えば、メチル化DNAに結合することができる本発明のポリペプチドと融合される異種ポリペプチドと相互作用するために好適な剤で当該容器をコーティングすることにより達成され得る。例えば、当該容器は、グルタチオンでコートされ得、従って、本発明のGSTタグ付けポリペプチドは、本発明の方法において使用されるポリペプチドでの当該容器のコーティングにおいて生ずるグルタチオンにより結合される。好ましくは、当該容器のコーティングは、本明細書中に記載される好ましい容器が作られるプラスチックの特性に起因して生ずる。従って、本発明のポリペプチドが本発明の容器と接触するようにされると、当該ポリペプチドは当該容器をコートする。
【0144】
本明細書中に記載のように、本発明の方法は、好ましくは、とりわけ、15μg超、15μg未満、10μg未満、10ng未満、7.5ng未満、5ng未満、2.5ng未満、1ng未満、0.5ng未満、0.25ng未満又は約150pgからメチル化DNAを検出するための好適な診断器具を示す、単一遺伝子座のメチル化DNAの検出を可能とする。条件により、生体サンプルは、患者又は個体、細胞系、組織培養物、あるいはポリヌクレオチド又はポリペプチド又はそれらの部分を含む他の源から得られる。示された通り、生体サンプルは、体液(例えば、血液、血清、結晶、尿、滑液、及び脊髄液)、及び本発明のポリヌクレオチドを発現することが見出される組織起源を含む。哺乳類から、組織生検及び体液を得る方法は、本分野においてよく知られている。ゲノムDNA、mRNA又はタンパク質を含む生体サンプルが、源として好まれる。
【0145】
理論に束縛されることなく、CpGジヌクレオチドのメチル化は、安定した転写抑制に関連し、非コードゲノムの大部分、及び潜在的に有害な配列は転写されないといった事実をおそらく導く。広範なDNA低メチル化は、ほとんど全ての種類の腫瘍について記載されている。腫瘍組織において、5−メチルシトシンの含量は、正常な組織と比較して低減され、反復サテライト配列又は染色体のセントロメア領域において脱メチル化事象の大部分が見られる。しかしながら、唯一の場合、bcl−2又はc−mycの如き原がん遺伝子の脱メチル化、及び活性化も記載される(Costello,J.Med.Genet.38(2001),285−303)。
【0146】
CpGアイランドは、一般的に遺伝子調節機能を示す。このことは、メチル化の状態における変化が関与する遺伝子座の転写活性における変化に主に直接的に関連する理由となる(Robertson(1999);Herman(2003);Esteller(2002);Momparler(2003);Plass(2002),all loc.cit.)。ほとんどのCpGアイランドは、正常細胞内の非メチル化形態において存在する。
【0147】
ある状況において、しかしながら、遺伝子調節事象においてメチル化もされ得る。雌性細胞の非活性化されたX染色体のCpGアイランドの大半は、例えば、メチル化される(Goto,Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(1998),362−378)。CpGアイランドは、正常な老化作用の過程においてもメチル化され得る(Issa,Clin.Immunol.109(2003),103−108)。
【0148】
特に腫瘍において、通常メチル化されないCpGアイランドは、高メチル化状態で存在する。多くの場合、当該高メチル化により影響を受ける遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子の如き腫瘍の成長を妨げるタンパク質をコードする。高メチル化の後成的機構を介して腫瘍において非活性化され得ることが示され得る遺伝子の例が、本明細書中に記載される。腫瘍特異的高メチル化の理由は、ほとんど知られていない。興味深いことに、ある種の腫瘍は、それら自身の高メチル化プロフィールを有するようである。高メチル化が均一に分配されるわけではなく、腫瘍依存的に生ずるといった多くの比較研究が示され得る。白血病の場合、大抵の他の遺伝子は、例えば結腸がん又は神経こう腫と比較して高メチル化される。それ故、高メチル化は腫瘍を分類するために有用となり得る(Esteller,Cancer Res.61(2001),3225−3229;Costello,Nat.Genet.24(2000),132−138)。
【0149】
それ故、低メチル化、及び/又は高メチル化の如き後成的効果は、がん、腫瘍、及び/又は転移に関連する。
【0150】
メチル化DNAを検出するためにサンプルを得た本発明の患者は、低及び/又は高メチル化遺伝子座を有すると思われている。当該低及び/又は高メチル化遺伝子座は、がん、腫瘍又は転移を示す。当該腫瘍又はがんは、腫瘍又はがんの可能性のある型となり得る。例示は、皮膚がん、脳腫瘍、子宮頸がん、精巣がん、頭頸部がん、肺癌、縦隔がん、消化管がん、泌尿生殖器系がん、婦人科系がん、乳がん、内分泌系がん、皮膚がん、小児がん、原発部位不明又は転移性がん、軟組織及び骨の肉腫、中皮腫、黒色腫、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、腫瘍随伴症候群、腹膜がん症、免疫抑制関連悪性腫瘍及び/又は転移性がんなどである。
【0151】
当該腫瘍細胞は、例えば、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下咽頭、唾液腺及び傍神経こう腫の腫瘍を含む頭頸部がん;非小細胞肺がん、小細胞肺がんを含む肺のがん;縦隔のがん;食道、胃、すい臓、肝臓、胆道系、小腸、結腸、直腸及び肛門部のがんを含む胃腸管のがん;腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、ペニス及び睾丸を含む泌尿生殖器系のがん;頸部、膣、外陰、子宮体、妊娠性絨毛疾患、卵巣、卵管、腹膜のがんを含む婦人科のがん;乳がん;甲状腺、副甲状腺、副腎皮質,すい内分泌腫瘍、カルチノイド腫瘍及びカルチノイド症候群の腫瘍を含む内分泌系のがん;多発性内分泌腺腫;軟組織及び骨の肉腫;中皮腫;皮膚のがん;皮膚黒色腫及び眼内黒色腫を含む黒色腫;中枢神経系の新形成;網膜芽腫、ウィルムス腫瘍、神経線維腫瘍、神経芽腫、腫瘍のユーイング肉腫ファミリー、横紋筋肉腫を含む小児のがん;非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、及びホジキン病を含むリンパ腫;急性白血病、慢性骨髄性及びリンパ性白血病を含む白血病;形質細胞腫及び骨髄異形成症候群;腫瘍随伴症候群;原発部位不明のがん;腹膜がん腫瘍;カポジ肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連中枢神経系原発リンパ腫、エイズ関連ホジキン病及びエイズ関連肛門性器のがんを含むエイズ関連悪性腫瘍、及び移植関連悪性腫瘍を含む免疫抑制関連悪性腫瘍; 肝臓への転移性がん;骨への転移性がん;がん性胸水及び心のう液貯留、並びに悪性腹水である。
【0152】
最も好まれるものは、上記がん又は腫瘍性疾患が、頭頸部、肺、縦隔、胃腸管、泌尿生殖器系、婦人科系、乳、内分泌系、皮膚、小児、原発部位不明のがん又は転移性 がん;軟組織及び骨の肉腫;中皮腫;黒色腫;中枢神経系の新形成;リンパ腫;白血病;腫瘍随伴症候群;腹膜がん腫瘍;免疫抑制関連悪性腫瘍;及び/又は転移性のがんであることである。好ましい腫瘍は、AML、形質細胞腫又はCLLである。
【0153】
本明細書中に記載されるように、本発明は、単一のチューブアッセイにおける、メチル化DNA、好ましくはCpGメチル化DNA断片を検出するための方法であって、以下のステップ:容器、好ましくはPCRチューブのない表面上にコートされた、メチル化DNAに結合することができるポリペプチド、好ましくはメチル−CpG結合タンパク質へゲノムDNAを結合させるステップ;非結合(非メチル化)DNA断片を洗浄して落とすステップ;そして好ましくは豊富なメチル化DNAを検出するために遺伝子特異的なPCRに適合するステップ含む上記方法を提供する。
【0154】
本発明の方法は、確固として早く、かつ、「全ステップについて1つの容器で実施される」のに起因して、メチル化DNAを検出するための容易に適用可能で信頼性の高い診断器具であるので、本発明の方法は、自動化の目的となり得るハイスループット形式に適用され得る。本発明の方法は、それ故、好ましくは単一遺伝子座のCpGメチル化の容易で高感受性の検出を可能とする。腫瘍、及び/又はがんのメチル化パターンは、有益な診断パラメータに発展するように思われるので、本発明の方法を実施するための全手段を含むキットを提供することが好まれる。
【0155】
従って、本発明は、以下の:
(a)本明細書中に記載されるようなメチル化DNAに結合することができるポリペプチド;
(b)前記ポリペプチドでコートされ得る容器;並びに
(c)前記容器をコートする手段;及び
(d)メチル化DNAを検出する手段、
を含む、本発明の方法によりメチル化DNAを検出するキットに関する。
【0156】
本発明の方法に関連して開示された態様は、必要な変更を加えて、本発明のキットについて適用する。
【0157】
有利なことに、本発明のキットは、場合により、本明細書中に記載されるような科学的又は診断的アッセイの実施のために要求される反応緩衝液、保存溶液、洗浄溶液、及び/又は残存試薬又は原料をさらに含む。さらに、本発明のキットの一部は、バイアル又はボトル、あるいは容器又はマルチ容器ユニットの組み合わせにおいて、それぞれ包装される。
【0158】
本発明のキットは、有利なことに、とりわけ、本明細書中に記載されるようなメチル化DNAを検出するための方法を実施するために使用され得、そして例えば、診断キットとして、研究器具として、又は治療器具として、本明細書中に記載される様々な適用に使用され得る。あるいは、本発明のキットは、科学的、医療及び/又は診断目的に好適な検出のための手段を含み得る。当該キットの製造は、好ましくは、本分野において知られる標準的手段に従う。本発明のキットは、好ましくは、本明細書中に提供されるような「単一チューブ」アッセイにおいて有用である。
【0159】
本発明の容器の「コーティング手段」は、例えば、架橋結合剤又はアビジン又はグルタチオンなどといった、本発明のポリペプチドで当該容器をコーティングするために適した全ての剤である。それ故、基本的に、メチル化DNAに結合することができる本発明のポリペプチドと融合する異種ポリペプチドと相互作用するのに好適な全剤である。好ましくは、本発明のキットは、プレコート容器、好ましくはPCRチューブを含む。
【0160】
用語「メチル化DNAを検出するための手段」は、上記メチル化DNAの検出方法を実施するのに必要な全ての剤を含む。より好ましい態様において、当該キットは、本発明の方法によるメチル化DNAの検出の実施の仕方についての取扱説明書を含む。
【0161】
本発明、及びその多くの有利点のよりよい理解は、以下の実施例に見られるだろう。当該実施例は、例示的な目的のみを提示し、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例】
【0162】
実施例1:メチル−結合ポリメラーゼ連鎖反応(MB−PCR)を使用するCpGメチル化DNA断片の検出のための単一チューブアッセイ
この方法は、ELISAに似たアプローチを使用する。CpGメチル化DNAに対する高親和性を有するタンパク質を、PCRサイクラー互換性反応容器の壁上にコートし、ゲノムDNA混合物からの強力にメチル化されたDNA断片を選択的に捕捉するために使用する。特定のDNA断片(例えば、CpGアイランドプロモーター又は特定の遺伝子)の保持を、PCR(標準的PCRかリアルタイムPCRのいずれか、シングルかマルチプレックスのいずれか)を使用して、同一のチューブ内において検出し得る。メチル化の程度は、ゲノム入力DNAのPCR反応に関連して見積もられ得る。図1は、MB−PCRの略図を示す。
【0163】
1.細胞、患者のサンプル、DNAの製造、及び断片化
細胞
末梢血単核球(MNC)を、健常なドナーの白血球搬出法により分離し、その後Ficoll/Hypaqueにかかる濃度勾配遠心により分離した。Krause,J.Leukoc.Biol.60(1996),540−545に記載されるようにJ6ME遠心分離器(Beckman,Munchen,Germany)における逆流遠心洗浄により、単球をMNCから単離した。ショウジョウバエS2細胞をATTCから入手し、そして、10%ウシ胎仔血清(FCS;PAA)を含むInsect−Xpress培地(BioWhittaker)において、インキュベーター内、21℃で培養した。ヒト骨髄性白血病細胞系THP−1、NB−4、KG−1、K562、HL−60、及びU937を、10%で補充されたRPMI1640培地内で培養した。ヒト骨髄性白血病細胞系MonoMac6を、10%FCS、及び1%OPI培地補助栄養物(Sigma)を補充したRPMI1640培地内で培養した。ヒト骨髄性白血病細胞系MUTZ−3を、20%FCS、及び10ng/mlの幹細胞因子を追加したαMEM内で維持した。DNA脱メチル反応のために、U937細胞を、指示された量のデシタビン(2−デオキシ−5’−アザシチジン、Sigma)で、数日間処理した。
【0164】
患者サンプル
新たに診断される及び非処理のデノボ又は二次的AMLを有する35人の患者からの新鮮な末梢血サンプル、及び骨髄を、試験のために使用した。全患者を、German AML Cooperative GroupのAMLCG−2000プロトコルに従い処理した。当該試験は、Institutional Ethics Committeeにより承認され、当該試験に入る前に、各患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
【0165】
DNAの調整及び断片化
本明細書中に記載される細胞系(例えば、KG1、U937、及びTHP−1)、正常なヒト単球(健常なドナー)、及びAMLを有する患者からの凍結芽細胞を含む、様々な細胞起源からのゲノムDNAを、血液及び細胞培養Midiキット(Qiagen)を使用して調整した。ゲノムDNA調整の質を、アガロースゲル電気泳動により制御し、DNA濃度をUV光度分析法により測定した。ゲノムDNAをMseI(NEB)で消化し、そしてPicoGreen dsDNA定量試薬(Molecular Probes)を使用して最終的に定量した。示されたDNAを、SssIメチラーゼ(NEB)を使用して生体外でメチル化した。
【0166】
2.組み換えメチル−CpG結合ポリペプチドの産生
ヒトMBD2のメチル−CpG結合ドメイン(MBD)に対応するcDNA(Genbank acc.no.NM 003927;AA 144−230)を、MBD2−Nhe S(5’−AGATGCTAGCACGGAGAGCGGGAAGAGG−3’)(SEQ ID NO:4)と、MBD2−Not AS(5’−ATCACGCGGCCGCCAGAGGATCGTTTCGCAGTCTC−3’)(SEQ ID NO:5)のプライマー、及びHerculase DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用して、逆転写されたヒト初代マクロファージ総RNAからPCR増幅した。サイクルパラメータを、以下の:95℃、3分間の変性;95℃で20秒間、65℃で20秒間、72℃で80秒間の増幅を34サイクル;72℃、5分間の最終伸長、とした。当該PCR産物を沈殿させ、NotI/NheIで消化し、Signal plgプラスベクター(Ingenius,R&D Systems)のNotI/NheI部位にクローンし、得られたplg/MBD2-Fc(真核性発現ベクター)を配列検証した。ショウジョウバエS2細胞内の組み換え発現のためにpMTBip/MBD2-Fcをクローンするため、ヒトIgG1のFcテイルと融合されたヒトMBD2のMBDを含むplg/MBD2-FcのApaI/NheI断片を、pMTBiP/V5−HisB(Invitrogen)のApaI/SpeI部位にサブクローンした。
【0167】
ショウジョウバエS2細胞を、ATTCから入手し、そして10%FCS(PAA)を含むInsect−Xpress培地(BioWhittaker)中において、インキュベーター内、21℃で培養した。ショウジョウバエS2細胞4×10個/60mmの細胞培養皿を、調整プロトコルに従い、Effecteneトランスフェクション試薬(Quiagen)を使用し、1.5μgのpMTBip/MBD2−Fcと0.3μgのpCoHygro(Invitrogen)との混合物と一緒にトランスフェクトした。
【0168】
3日目に、トランスフェクトされた細胞を収穫し、洗浄し、そして10%FCS及び300μg/mlのハイグロマイシン(BD Biosciences)を含む選択培地(Insect−Xpress)中に継代した。選択培地を5週間の間、4〜5日間毎に交換した。安定的にトランスフェクトされたショウジョウバエS2細胞のプールを拡張した。メチル−CpG結合ポリペプチド、MBD−Fcのラージスケール製造のために、1〜5×10個の細胞を、0.5mMCuSOの添加前の2日間、2000mlローラーボトル内のFcsなし(場合により300μg/mlのハイグロマイシン)の100〜200mlのInsect−Xpress中で培養した。
【0169】
4〜7日間毎に培地を収穫し、細胞を、更なるタンパク質製造のためにCuSOを加えた培地と交換した。細胞培養上清を混合し、TBS(pH7.4)に対して透析し、そしてプロテインAカラムを使用して精製した。当該画分を含むMBD−Fcを混合し、TBS(pH7.4)に対して透析した。当該安定的にトランスフェクトされたショウジョウバエS2細胞は、1リットルの細胞培養上清あたり、3〜5mgの組み換えMBD2−Fcタンパク質を製造した。当該MBD−Fcタンパク質の配列、及び特徴を図7に示す。
【0170】
3.MB−PCRチューブの製造
ヒト メチル−CpG結合ドメイン2(MBD2)のメチル−CpG結合ドメイン(MBD)を含む組み換えMBD2−Fcタンパク質の50μl、フレキシブルリンカーポリペプチド、及びヒトIgG1のFc部分(10mMのTris/Hcl pH7.5で希釈されたもの)を、熱安定性TopYield(登録商標)ストリップ(Nunc Cat.No.248909)の各ウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。ウェルを、200μlのTBS(170mMのNaClを含む20mMのTris、pH7.4)で3回洗浄し、そして100μlのブロッキング溶液{170mMのNaClを含む10mMのTris pH7.5、5%スキムミルク粉末、5mMのEDTA、及び1μg/mlの各ポリd(l/C)、ポリd(A/T)、及びポリd(CG)、全てAmershamからのもの}で、3〜4時間、室温で、ブロッキングした。チューブを200μlのTBST(0.05%のTween−20を含むTBS)で3回洗浄した。
【0171】
4.メチル化DNA断片の結合
50μlの結合緩衝液(400nmのNaClを含むpH7.5、20mMのTris、2mMのMgCl2、0.5mMのEDTA、及び0.05%のTween−20)を、各ウェルに添加し、そして2μlのMseIで消化されたDNA(5ng/μl)を各第2ウェル(M反応)に添加した。ウェルを、室温で40〜50分間、振とう器上にインキュベートした。チューブを200μlの結合緩衝液で2回洗浄し、そして10mMのpH8.0、Tris/Hclで1回洗浄した。
【0172】
5.メチル化DNA断片の検出
PCRを、処理され洗浄されたTopYield(登録商標)ストリップ内で直接的に実施した。PCRミックス{PCR Master Mix(Promega):50μl反応/ウェル}は、10pmolの各遺伝子特異的プライマー(Metabionにより合成されたもの)を含んだ。プライマー配列は、P15S(5'−GGCTCAGCTTCATTACCCTCC−3’)(配列番号6)、P15AS(5'−AAAGCCCGGAGCTAACGAC−3’)(配列番号7)、ESR1S(5'−GACTGCACTTGCTCCCGTC−3’)(配列番号8)、ESR1AS(5’−AAGAGCACAGCCCGAGGTTAG−3’)(配列番号9)、ICSBP S(5’−CGGAATTCCTGGGAAAGCC−3’)(配列番号10)、ICSBP AS(5’−TTCCGAGAAATCACTTTCCCG−3’)(配列番号11)、MET S(5’−AATTGCGTCTGAAGTCTGCGG−3’)(配列番号12)、MET AS(5’−TCCCACACAACAGAGAGGCG−3’)(配列番号13)、DP103 S(5’−GCTGTTAGTCCAGTTCCAGGTTCC−3’)(配列番号14)、DP103 AS(5’−GTGCAACCACATTTATCTCCGG−3’)(配列番号15)だった。
【0173】
当該PCRミックスを加えた後、1μlのMseIで消化されたDNA(5んg/μl)を、前もってDNA断片とともにインキュベートしなかった(P反応)各第2の他のウェルに添加した。PCRを、MJReserchエンジンに関して実施した、ここでサイクル条件は、以下の:95℃で3分間(変性);94℃で20秒間、60℃で20秒間、及び72℃で70秒間(36サイクル);及び72℃で5分間(最終伸長)だった。PCR産物を3%のアガロースゲル電気泳動を使用して分析し、そしてエチジウムブロマイド染色ゲルを、Typhoon9200Imager(Amersham/Pharmacia)を使用して走査した。
【0174】
6.亜硫酸水素ナトリウムシークエンシング
亜硫酸水素ナトリウムでのDNAの修飾を、前述のように実施した。亜硫酸水素塩で処理されたDNAをnestedPCR反応において増幅した。使用したプライマーは、第1に、icsbp−out S(5’−GGGGTAGTTAGTTTTTGGTTG−’)(配列番号16)及びicsbp−out AS(5’−ATAAATAATTCCACCCCCAC−3’)(配列番号17)、そして増幅の第2ラウンドのために、icsbp−in S(5’−TTGTGGATTTTGATTAATGGG−3’)(配列番号18)及びicsbp−in AS(5’−CCRCCCACTATACCTACCTACC−3’)(配列番号19)。PCR産物を、TOPO−TAクローニングキット(Invitrogen)を使用してクローンし、そしていくつかの独立したクローンをシークエンスした。
【0175】
7.RNA製造、リアルタイムPCR
総RNAを、グアニジン チオシアネート/酸 フェノール法により異なる細胞系から単離した{Chomczynski,Anal.Biochem.162(1987),156−159}。RNA(2μg)を、Superscript II MMLV−RT(Invitrogen)を使用して逆転写した。リアルタイムPCRをLightcycler(Roche)上で、Quantitectキット(Quiagen)を使用して説明書に従い実施した。使用したプライマーは、以下の:ヒトICSBP:センス5’−CGTGGTGTGCAAAGGCAG−3’(配列番号20)、アンチセンス5’−CTGTTATAGAACTGCTGCAGCTCTC−3’(配列番号21);ヒトACTB(β−アクチン):センス5’−TGACGGGGTTCACCCACACTGTGCCCATCTA−3’(配列番号22)、アンチセンス5’−CTAGAAGCATTTGTGGTGGACGATGGAGGG−3’(配列番号23)だった。
【0176】
サイクルパラメータは、以下の:変性95℃で15分間;増幅95℃で15秒間、57℃で20秒間、72℃で25秒間を50サイクルだった。製品の大きさを、アガロースゲル電気泳動で最初に調整し、融解曲線を分析し、当該PCR反応の特異性について制御した。ICSBPデータを、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチン(ACTB)の発現について標準化した。相対ユニットを、測定された蛍光強度が固定値に達するところのPCRサイクル数に対する対数希釈物の3つの異なる濃度(CP)をプロットした標準曲線から計算した。増幅効率Eを、以下の式:E=10−1/傾きにより、当該標準曲線から計算した。EICSBPは、1.87〜1.98の範囲であった。EACTBは、1.76〜1.84の範囲であった。各サンプルについて、3つの独立した分析データを平均した。
【0177】
8.MB−PCRによるESR1、CDKN2B(p15INK4b)、及びICSBPのプロモーターのCpGアイランドメチル化の分析
いくつかの白血病細胞系を、ESR1、CDKN2B(p15INK4b)、及びICSBPのプロモーターのCpGアイランドメチル化状態について、MB−PCRにより分析した。ゲノムDNAをMseIで消化した。この酵素を選択した理由は、メチル化感受性であり、及びDNAを小断片に切断するが、CpGアイランドを比較的そのまま放置するからである。各遺伝子の第1イントロンに対する当該遺伝子特異的MseI断片の位置、並びにPCRに使用された遺伝子特異的プライマーの位置を、図2Aに示す。全断片を、推測上の近位プロモーター領域を含むよう選択した。制限されたDNAの総量10ngを、M反応のために使用し、同様に制限されたDNAの5ngをP反応に使用した。8つの異なる白血病細胞系からの典型的なMB−PCR実験の結果を、図2Bに示す。当該ESR1プロモーターは、全8つのサンプルのM反応において様々な程度まで増幅され、そしてそのことは、ヒト造血系腫瘍の86%における異常なメチル化を示す先行文献と一致する。CDKN2B(p15INK4b)プロモーターについてのP反応は、双方の対立遺伝子における突然変異又は欠失を提示する3つの細胞系(THP−1、NB−4、K562)について完全に失敗し、そのことは以前にも示されていた。2つの細胞系(KG−1及びMUTZ3)は、CDKN2B(p15INK4b)プロモーターについてのM反応においてポシティブを示し、一方3つの細胞系(U937、MonoMac6、HL−60)は、ネガティブだった。観察された結果は、これらの細胞系のいくつかにおけるESR1及びCDKN2B(p15INK4b)プロモーターの以前に刊行されたメチル化分析に従っていた。一部の例では、P反応が他の細胞系と比較して弱く、1つの対立遺伝子(例えば、U937細胞中のESR1)の欠失又は突然変異を示した。ICSBPプロモーターは、6つの細胞系のM反応においても増幅させた。
【0178】
ICSBPプロモーターのメチル化の程度及び効果をMB−PCRの実験的潜在性の正当性をさらに立証するために分析した。ICSBPの反応レベルを、LightCyclerリアルタイムPCRを用いて、8つの白血病細胞系において分析した。図3Aに示されるように、mRNA発現値は、MB−PCRにより示されたようにメチル化の程度と逆相関した。脱メチル化剤デシタビン(5−アザー2’デオキシシチジン)での、高度のICSBPプロモーターメチル化を示すU937細胞の処理は、際立った、ICSBP mRNA発現の用量及び時間に依存する導入を導き(図3Bを参照のこと)、ICSBP転写のメチル化誘導抑制がこれらの細胞において、可逆的であることを示す。
【0179】
MB−PCRが原発腫瘍細胞におけるCpGアイランドプロモーターのメチル化をも検出できるのかどうかを試験するため、DNAを、健常者(n=4)の血中単球、及びAMLの患者(n=11)の芽細胞から準備し、MseIで消化し、そしてMB−PCRに供した。図4に示されるように、健常者のDNAにおいては有意水準のメチル化を全く検出せず、一方、ほとんどの患者は、分析された3つのプロモーターの少なくとも1つにおいて有意メチル化を示した。
【0180】
MB−PCR産物が当該ICSBPプロモーターでのCpGメチル化の正確なパターンと、どの程度関連するのかを測定するために、ICSBPプロモーターのメチル化を、正常及び腫瘍細胞である選択された細胞系においてbisulfiteシークエンシングにより分析した。図5に示される結果は、プロモーターメチル化の程度が、MB−PCRにより予測され得ることを示す、つまり強い増殖シグナルは明らかに高度のメチル化を示し、一方より弱いシグナルはメチル化のより低度を示す。
【0181】
患者サンプルには、正常な潜在的に非メチル化細胞が混ざっているので、腫瘍細胞系のDNAサンプルにおける正常DNAの増加量の効果を測定した。制限されたDNAを混合し、そしてMB−PCRに供した。結果を図6Aに示す。M反応におけるシグナルは、サンプル中の正常な非メチル化DNAの量の増大量にしたがって直線的に低減した。当該方法の検出感度を試験するため、低減したDNAの量を使用するMB−PCR実験を実施した。図6Bに示されるように、3つの異なる細胞系におけるICSBP遺伝子座のメチル化状態を分析する際に試験された全濃度(10ng〜160pg)を使用して、比較可能な結果を得た。これらの結果が示すことには、MB−PCRは、正常細胞と腫瘍細胞の混合物中においてメチル化DNA断片を検出でき、標準的ゲノムPCRの正常な感受性の範囲内(160pgのDNA量に減るまで)で働く。
【0182】
9.MB−PCRによる、ESR1、CDKN2B(p15INK4b)、ICSBP、ETV3、及びDDX20プロモーターのCpGアイランドメチル化状態の分析
他の態様において、白血病細胞において頻繁にメチル化されることが以前から示されている単一のCpGアイランドプロモーター、すなわち、ヒトCDKN2B遺伝子(p15INK4bとしても知られる。)、及びヒト エストロゲン受容体(ESR1)遺伝子のCpGメチル化の程度を分析することにより、当該MB−PCR方法を調査した。既に確立された腫瘍マーカーに加えて、腫瘍抑制遺伝子として潜在的に働くことが可能なCpGアイランドプロモーターを伴う3つの付加遺伝子を選択した。それらは、ヒト インターフェロン コンセンサス結合タンパク質(ICSBP)遺伝子、ヒトEts変異体3遺伝子(ETV3)、及びヒトDEADボックスポリペプチド20遺伝子(DDX20)である。ICSBP、インターフェロン(IFN)調整因子ファミリー(IRF)の転写因子は、ヒト骨髄性白血病において頻繁に下方制御され(Schmidt,Blood 91(1991),22−29)、及びICSBP欠損マウスは、ヒトにおける慢性骨髄性白血病(CML)と似た血液学的変化を示し(Holtschke,Cell 87(1996),307−317)、造血細胞におけるICSBPについての腫瘍抑制機能を示唆する。
【0183】
マウスにおいて、EtsリプレッサーETV3(METS又はPE1としても知られる)及びそのコリプレッサーDDX20(DP103としても知られる)は、最終単球分化が細胞周期停止に関連するように示され(Klappacher,Cell 109(2002),169−180)、それは、可能性のある腫瘍抑制ルールも示し得る。我々のアプローチの検証として、正常細胞由来のゲノムDNAを、未処理のまま又は生体外でSssIを使用してメチル化のいずれかとし、MseIで消化し、MB−PCRに供した。ゲノムDNAをMseIで消化した、なぜならばこの酵素はメチル化非感受性であり、CpGアイランドが相対的に無傷の間に、DNAを小断片に切断するからである(CROSS,Nat.GENET.6(1994),236−244)。
【0184】
各遺伝子の第1イントロンと相対的な遺伝子特異的MseI断片の位置、並びにMB−PCRのために使用される遺伝子特異的プライマーの位置を、図8Aに示す。全断片は、推定状の近位プロモーター領域を含む。図8Bに示されるように、全5つの遺伝子座のM反応は、正常なDNAを使用したときネガティブであり、それはこれらのゲノム領域が、予想通り、正常な血液細胞においてメチル化されないことを示す。しかしながら、各遺伝子座は、同様の遺伝子をMB−PCRに供する前にSssI−メチラーゼを使用してメチル化したとき、対応するM反応において増幅された。それ故、MB−PCRは、これらの遺伝子座でのメチル化及び非メチル化状態を識別できる。
【0185】
10.MB−PCRにより分析された腫瘍細胞系における特異的CpGアイランドプロモーターのメチル化状態
他の実験において、MB−PCRが生体サンプルにおける上記遺伝子座のメチル化状態を検出可能かどうか試験し、いくつかの白血病細胞系を分析した。規定通りに、総量10ngの制限されたDNAをM反応のために使用し、そして、同様に制限されたゲノムDNAの5ngをP反応のために使用した。8つの異なる白血病細胞系からの典型的MB−PCR実験の結果を、図9Aに示す。ESR1プロモーターを、全8サンプルのM反応において様々な程度に増幅したところ、それは、ヒト造血系腫瘍の80%超において異常なメチル化を示すという従前の報告と一致した。両対立遺伝子において突然変異又は欠失を提示する3つの細胞系(THP−1、NB−4、K562)において、CDKN2BプロモーターについてのP反応は完全に失敗し、そしてその事は、NB−4(Chim,Ann.Hematol.82(2003),738−742)、及びK562(Paz,Cancer Res.63(2003),1114−1121)の場合において、従前に示されていた。2つの細胞系、KG−1及びMUTZ3は、CDKN2BについてのポジティブM反応を示した、一方3つの細胞系(U937、MonoMac6、HL−60)はネガティブだった。
【0186】
当該観察結果、ESR1(27)及びCDKN2Bプロモーターの従前に刊行されたメチル化分析と非常によく一致した(Cameroon,Blood 94(1999),2445−2451;Chim(2003),loc.cit;Paz(2003),loc.cit.)。ある場合において、P反応は他の細胞系と比較してより弱く、このことは1つの対立遺伝子の欠失又は突然変異を提示する(例えば、U937細胞におけるESR1)。
【0187】
興味深いことに、ICSBPプロモーターは、6細胞系のM反応においても増幅され、一方、ETV3及びDDX20遺伝子のプロモーターでは大幅なメチル化は検出されなかった。
【0188】
MB−PCRが、各細胞系において、ICSBPプロモーターでのCpGメチル化の正確なパターンどの程度の一致をもたらすのかを測定するため、ICSBPプロモーターメチル化を、bisulfiteシークエンシングにより分析した。図9Bにおいて示される結果は、プロモーターメチル化の程度がMB−PCRにより得られた結果と一致することを示す。KG−1、U937、MUTZ−3、HL−60、及びK562細胞系に見られるような(対応するP反応と比較して)強力な増幅シグナルは、高程度を示すと思われ、一方、(NB−4細胞に観察されるような)より弱いシグナルは、メチル化度が低いことを示す。DNAメチル化がない場合(THP−1及びMonoMac6細胞)、MB−PCRはネガティブである。
【0189】
11.原発腫瘍細胞におけるCpGアイランドプロモーターのメチル化の検出
DNAを、数人の健常者(n=4)の血中単球、及びこれまでに非処置のAMLを有する患者(n=35)の白血病性芽球から準備し、MseIで消化し、そしてMB−PCRに供した。図10は、典型的ICSBP MB−PCRを示し、対応するbisulfiteシークエンシングは、9人のAML患者及び1人の健常人の結果である。通常、M反応において観察されるバンドの強度は(対応するP反応と比較して)、サンプルにおけるメチル化の平均密度と非常によく一致する。試験した35人のAML患者のうち、7人の患者(20%)はICSBPについてのポジティブなMB−PCR結果を示し、ESR1については21人の患者(60%)、及びCDKN2Bについては25人の患者(71%)がポジティブなMB−PCR結果示した(データは示していない)。観察されたESR1及びCDKN2Bのメチル化の頻度は、以前の研究において記載されたものと同意である。ICSBPメチル化は、明らかに、患者の部分群に影響を与えるだけである。12人の患者を、ETV3及びDDX20遺伝子のメチル化について試験したところ、白血病細胞系において観察されたように、当該サンプルのいかなるサンプルにおいても著しいメチル化を検出しなかった。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のステップ:
(a)メチル化DNAに結合することができるポリペプチドで、容器をコーティングし;
(b)前記ポリペプチドを、メチル化DNA、及び/又は非メチル化DNAを含むサンプルと接触させ;そして
(c)前記ポリペプチドのメチル化DNAへの結合を検出する、
を含む、メチル化DNAの生体外検出方法。
【請求項2】
前記ステップ(c)が、制限酵素による消化、bisulfiteシークエンシング、ピロシークエンシング、サザンブロット又はPCRを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記ステップ(c)が、PCRを含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】
以下のステップ:
(d)前記メチル化DNAを分析する、
をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項5】
前記分析メチル化DNAを分析するステップが、シークエンシングを含む、請求項4の方法。
【請求項6】
前記ポリペプチドが、以下の:
(a)メチル−DNA結合タンパク質(MBD)ファミリーに属するポリペプチド;
(b)メチル化DNAに結合することができる、前記(a)のポリペプチドの断片;
(c)前記(a)のポリペプチド又は前記(b)の断片と比較して1又は複数のアミノ酸残基が置換され、かつ、メチル化DNAに結合することができる、前記(a)のポリペプチド又は前記(b)の断片の変異体;
(d)抗メチル化DNA抗体又はそれらの断片である、ポリペプチド;及び
(e)前記(a)から(c)のいずれか1つのポリペプチドと少なくとも70%一致し、かつメチル化DNAに結合することができる、ポリペプチド、
からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
前記ポリペプチドが、異種ポリペプチドと融合する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】
前記異種ポリペプチドが、HA−タグ、myc6−タグ、FLAG−タグ、STREP−タグ、STREP II−タグ、TAP−タグ、HAT−タグ、キチン質結合ドメイン(CBD)、マルトース結合タンパク質、His6−タグ、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)タグ、インテイン−タグ、ストレプトアビジン結合タンパク質(SBP)タグ、及び抗体のFc部分からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
前記抗メチル化DNA抗体が、抗5−メチルシトシン抗体、あるいはそれらのFab、F(ab’)、Fv又はscFv断片である、請求項6に記載の方法。
【請求項10】
前記容器が、前記ポリペプチドで、直接的又は間接的にコートされる、請求項1に記載の方法。
【請求項11】
前記サンプルが、患者からのものである、請求項1に記載の方法。
【請求項12】
前記患者が、低、及び/又は高メチル化遺伝子座を有する疑いがある、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
前記低、及び/又は高メチル化遺伝子座が、がん、腫瘍又は転移を示す、請求項12に記載の方法。
【請求項14】
以下の
(a)メチル化DNAに結合することができるポリペプチド;
(b)前記ポリペプチドでコートされ得る容器;並びに
(c)前記容器をコートする手段;及び
(d)メチル化DNAを検出する手段、
を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法によりメチル化DNAを検出するキット。

【図1A】
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【図1B】
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【図2A】
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【図2B】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6A】
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【図6B】
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【図7−1】
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【図7−2】
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【図7−3】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【公開番号】特開2012−249636(P2012−249636A)
【公開日】平成24年12月20日(2012.12.20)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2012−185139(P2012−185139)
【出願日】平成24年8月24日(2012.8.24)
【分割の表示】特願2007−541868(P2007−541868)の分割
【原出願日】平成17年11月28日(2005.11.28)
【出願人】(505198950)セクエノム,インコーポレイティド (6)
【Fターム(参考)】