メラニン合成促進物質の製造方法、メラニン合成促進物質、皮膚外用剤、チロシナーゼ活性物質の製造方法、チロシナーゼ活性物質、および医薬品
【課題】メラニンの合成を促進しうる新しい技術を提供する。
【解決手段】メラニン合成促進物質の製造方法。一例では、原料となるステビア植物の植物組織を乾燥・粉砕する乾燥粉砕工程Ｓ１００と、乾燥粉砕工程Ｓ１００で得られた乾燥ステビア粉末を発酵させる発酵工程Ｓ１０２と、発酵したステビア粉末（以下、単に発酵ステビアと称する）から、エタノール水溶液を用いて抽出を行い、抽出液を得る抽出工程Ｓ１０４と、発酵ステビアの抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る第１分画工程Ｓ１０６と、エタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る第２分画工程Ｓ１０８と、を有する。
【解決手段】メラニン合成促進物質の製造方法。一例では、原料となるステビア植物の植物組織を乾燥・粉砕する乾燥粉砕工程Ｓ１００と、乾燥粉砕工程Ｓ１００で得られた乾燥ステビア粉末を発酵させる発酵工程Ｓ１０２と、発酵したステビア粉末（以下、単に発酵ステビアと称する）から、エタノール水溶液を用いて抽出を行い、抽出液を得る抽出工程Ｓ１０４と、発酵ステビアの抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る第１分画工程Ｓ１０６と、エタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る第２分画工程Ｓ１０８と、を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニンの合成を促進しうる技術に関し、例えば、メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法、メラニン合成促進物質、皮膚外用剤、チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質の製造方法、チロシナーゼ活性物質、および医薬品に好適に適用されうる。
【発明の背景】
【０００２】
毛髪の色は、毛髪を産生する毛母細胞にあるメラノサイト（色素細胞）が合成するメラニンの色である。老化、ストレス、病気、遺伝等によって、メラノサイトのメラニン合成能力が低下すると、毛髪へのメラニンの供給が減少し、毛髪の白化、所謂白髪が生じることとなる。
【０００３】
従来、白髪を目立たなくするために様々な毛髪着色料（染毛剤）が開発されている。染毛剤として、例えば、酸化染毛剤が広く利用されている。酸化染毛剤は、毛髪の表皮（キューティクル）を開き、毛髪内部に色素を注入させることで、毛髪を着色するものである。酸化染毛剤では、キューティクルを開いて色素を注入させるため、酸化染毛剤を用いて染毛した毛髪は、傷みやすく、つやや潤いがなくなり、櫛通りが悪くなってしまう。
【０００４】
そこで、酸化染毛剤に、カチオン性高分子、両性高分子およびアニオン性高分子を含有させることにより、毛髪の柔軟性、しっとり感またはなめらかさを向上させる染毛剤が開示されている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１９３７７２号公報
【０００６】
しかし、特許文献１に記載の技術を利用したとしても、毛髪の表面のキューティクルを開いて色素を注入しなければ染毛できないことに変わりないので、毛髪へのダメージを完全に無くすことは困難である。また、白髪自体が無くなるわけではないので、毛髪が伸びてくると、先端の染めた部分と頭皮側の染めていない部分（白髪の部分）との色の差が目立つようになり、違和感を生じてしまう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、メラニンの合成を促進しうる新しい技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の具現化形態の一例として、メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法であって、発酵ステビアの抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る第１分画工程と、エタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る第２分画工程と、を含む製造方法を開示する。
【０００９】
本願発明者は、鋭意研究を重ねた結果、発酵ステビアの抽出液を分画して得られるエタノール可溶画分をさらに分画した脂溶性画分にメラニンの合成を促進させる作用があることを見いだした。したがって、例えば、毛髪を産生する毛母細胞のメラノサイトに上記脂溶性画分を適用することで、毛髪の表面からではなく、毛髪の内部にメラニンを含ませることができ、今後生えてくる毛髪の白化を抑制することが可能となる。
【００１０】
上記第１分画工程の前段に、乾燥したステビア植物組織に酵母および水を加えて発酵させる発酵工程と、発酵工程により得られた発酵ステビアからエタノール水溶液を用いて抽出を行い、抽出液を得る抽出工程と、を含んでもよい。
【００１１】
上記の発酵工程および抽出工程を経て得られた発酵ステビア抽出液は、上記製造方法にてメラニン合成促進物質を得るための発酵ステビア抽出液として好適である。
【００１２】
上記第１分画工程において得られるエタノール可溶画分は、３０〜１００％エタノール可溶画分であってもよい。
【００１３】
３０〜１００％エタノール可溶画分から分画した脂溶性画分は、メラニン合成促進物質として特に優れている。
【００１４】
本発明の具現化形態の別の例に従う、メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質は、発酵ステビアの抽出液を分画することにより得られるエタノール可溶画分をさらに分画して得た脂溶性画分を含む。
【００１５】
本発明の具現化形態の別の例に従う皮膚外用剤は、上記メラニン合成促進物質の製造方法により製造された、メラニン合成促進物質を含む。上記皮膚外用剤は、化粧料であっても、医薬部外品であっても、医薬品であっても、白髪予防用医薬品であってもよい。
【００１６】
本発明の具現化形態の別の例として、チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質の製造方法を開示する。この製造方法は、発酵ステビアの抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る第１分画工程と、エタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る第２分画工程と、を有する。
【００１７】
本願発明者は、鋭意研究を重ねた結果、発酵ステビアの抽出液を分画して得られるエタノール可溶画分をさらに分画した脂溶性画分にチロシナーゼを活性化させる機能があることを見いだした。チロシナーゼは、メラニンの合成過程に不可欠な酵素であるため、チロシナーゼを活性化する上記脂溶性画分を、メラノサイトに適用することでメラノサイトのメラニン合成能力を向上させることが可能となる。
【００１８】
またメラニンの合成過程であるチロシンからＬ―ＤＯＰＡ（3,4-dihydroxy-L-phenylalanine）への合成は、チロシナーゼによって行われる。Ｌ−ＤＯＰＡは、神経伝達物質であるドーパミンの前駆体であり、血液脳関門を通過することが可能であるため、パーキンソン病等に有用な薬剤として用いられている。したがって、チロシナーゼを活性化する上記脂溶性画分は、チロシンからＬ−ＤＯＰＡへの合成を促進させることができ、将来的にパーキンソン病等に好適な薬剤として適用することができる可能性がある。
【００１９】
上記第１分画工程の前段に、乾燥したステビア植物組織に酵母および水を加えて発酵させる発酵工程と、発酵工程により得られた発酵ステビアからエタノール水溶液を用いて抽出を行い、抽出液を得る抽出工程と、を含んでもよい。
【００２０】
上記第１分画工程において得られるエタノール可溶画分は、３０〜１００％エタノール可溶画分であってもよい。
【００２１】
本発明の具現化形態の一例に従う、チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質は、発酵ステビアの抽出液を分画することにより得られるエタノール可溶画分をさらに分画して得た脂溶性画分を含む。
【００２２】
本発明の具現化形態の一例に従う医薬品は、上記チロシナーゼ活性物質の製造方法により製造された、チロシナーゼ活性物質を含む。
【００２３】
上述したメラニン合成促進物質の製造方法の技術的思想に基づく構成要素やその説明は、当該メラニン合成促進物質、皮膚外用剤、チロシナーゼ活性物質の製造方法、チロシナーゼ活性物質、および医薬品にも適用可能である。
【００２４】
実施形態によっては、チロシナーゼを活性化させることでメラニンの合成を促進させることができ、今後生えてくる毛髪の内部にメラニンを含ませて、毛髪の白化を抑制することが可能となる。実施形態には、例えば、メラニン合成促進物質の製造方法、メラニン合成促進物質、皮膚外用剤、チロシナーゼ活性物質の製造方法、チロシナーゼ活性物質、および医薬品が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】一実施例に従うメラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法を説明するための説明図である。
【図２】メラニンの生合成経路を説明するための説明図である。
【図３】Ｂ１６メラノーマを用いたメラニン合成量の比較実験の実験手順を説明するための説明図である。
【図４】脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマとコントロールのＢ１６メラノーマとの生存細胞数を説明するための説明図である。
【図５】脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマとコントロールのＢ１６メラノーマとのメラニン量を説明するための説明図である。
【図６】無細胞系におけるチロシナーゼ活性を測定するための実験手順を説明するための説明図である。
【図７】チロシナーゼ活性化率を評価するための式を示す図である。
【図８】脂溶性画分を添加したマッシュルームチロシナーゼとコントロールのマッシュルームチロシナーゼとのドーパキノンの合成量を説明するための説明図である。
【図９】細胞内におけるチロシナーゼ活性を測定するための実験手順を説明するための説明図である。
【図１０】チロシナーゼ活性化率を評価するための式を示す図である。
【図１１】脂溶性画分の上清とコントロールの上清とによるドーパキノンの合成量を説明するための説明図である。
【好適な実施形態の説明】
【００２６】
以下に添付図面を参照しながら、本発明の好適な実施例について詳細に説明する。かかる実施例に示す寸法、材料、その他具体的な数値などは、発明の理解を容易とするための例示にすぎず、特に断る場合を除き、本発明を限定するものではない。なお、本明細書および図面において、実質的に同一の機能、構成を有する要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略し、また本発明に直接関係のない要素は図示を省略する。
【００２７】
＜実施例：メラニン合成促進物質の製造方法＞
図１は、一実施例に従うメラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法を説明するための説明図である。図１に示すように、本実施例に従うメラニン合成促進物質の製造方法は、ステビア植物組織を乾燥させて粉砕する工程（乾燥粉砕工程：Ｓ１００）と、乾燥粉砕工程Ｓ１００により得られた乾燥したステビア植物組織に酵母および水を加えて発酵させる工程（発酵工程：Ｓ１０２）と、発酵工程Ｓ１０２により得られた発酵ステビアから、エタノール水溶液を用いて抽出を行い、抽出液を得る工程（抽出工程：Ｓ１０４）と、抽出工程（Ｓ１０４）により得られた抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る工程（第１分画工程：Ｓ１０６）と、第１分画工程（Ｓ１０８）により得られたエタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る工程（第２分画工程：Ｓ１０８）と、第２分画工程（Ｓ１０８）により得られた脂溶性画分を減圧し、濃縮乾固させる工程（濃縮乾固工程：Ｓ１１０）とを含む。以下に、各工程の構成を詳細に説明する。
【００２８】
（乾燥粉砕工程Ｓ１００）
乾燥粉砕工程Ｓ１００は、原料となるステビア植物の植物組織を乾燥・粉砕する工程である。本実施例の原料の一つであるステビア植物は、南米のパラグアイを原産とするキク科の多年生植物である。また、ステビア植物の学名はステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Stevia Rebaudiana Bertoni（学術名））である。ステビア植物を日本で栽培する場合、２月から５月にかけて、種、株苗あるいは挿し木苗を定植し、栽培を開始することが多い。収穫は、ステビア植物が十分に成熟する、１０月から１１月上旬頃にかけて行われることが多い。
【００２９】
本実施例における、メラニン合成促進物質は、このステビア植物の植物組織をよく乾燥させ、それを細かく粉砕して作った乾燥したステビア植物組織の粉末（以下、単に、乾燥ステビア粉末と称する）を原料として用いる。粉末といっても、各片の大きさが概ね１ｃｍ以下になるように粉砕してあれば十分である。また、ステビア植物の葉部および茎部を選別して使用することが好ましい。
【００３０】
ステビア植物の葉部及び茎部の乾燥には、できるだけ換気の行き届いた室内にて、常温にて行うことが望ましく、急激に熱をかけたりすることは、好ましくない。
【００３１】
（発酵工程Ｓ１０２）
発酵工程Ｓ１０２は、乾燥粉砕工程Ｓ１００で得られた乾燥ステビア粉末を発酵させる工程である。乾燥ステビア粉末の発酵は、乾燥ステビア粉末に水と酵母を加えて撹拌し、放置することにより行うことができる。発酵工程Ｓ１０２において加える水は、発酵に必要なだけの量があればよく、全体が湿る程度の量で十分である。酵母としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）類を用いることが好ましい。
【００３２】
乾燥ステビア粉末の発酵は、「完全に」行うことが好ましい。発酵していないステビア粉末を舐めてみると甘い味がするが、完全に発酵したステビア粉末には甘さが認められない。したがって、完全に甘さが感じられなくなるまで発酵を進めることが望ましい。完全に発酵させるには、常温の場合でおよそ１〜４週間の放置期間が必要である。
【００３３】
具体的に、発酵工程Ｓ１０２において、まず乾燥ステビア粉末に水分を含ませ、さらに、酵母（例えば、サッカロマイセス）を加え、常温にて１〜４週間、水分を補給しながら発酵を継続させる。そして、ステビア粉末を口に含み、その甘味を感じなくなったときを「完全」に発酵したとみなす。
【００３４】
（抽出工程Ｓ１０４）
発酵工程Ｓ１０２で得られた発酵したステビア粉末（以下、単に発酵ステビアと称する）から、エタノール水溶液を用いて抽出を行い、抽出液を得る工程である。発酵工程Ｓ１０２で得られた発酵ステビアから抽出した抽出液は、メラニンの合成を促進させる機能またはチロシナーゼを活性化させる機能を有する。本実施例において、発酵ステビアから抽出を行う際に用いる溶媒をエタノールとすることが重要である。これは、後の第１分画工程Ｓ１０８において、エタノール可溶画分を分画するためである。
【００３５】
抽出は、３０％程度のエタノール水溶液を準備し、これに発酵ステビアを加え、穏やかに撹拌しながら数時間〜数日、常温にて浸潤させて行う。発酵ステビアを３０％程度のエタノール水溶液に浸潤させたものを、１４０メッシュ程度の濾紙で濾過して得られた濾液を抽出液とする。そして、本実施例では、この抽出液をさらに６０℃程度で減圧濃縮することにより、抽出液を濃縮する。
【００３６】
（第１分画工程Ｓ１０６）
第１分画工程Ｓ１０６は、抽出工程Ｓ１０４で得られた濃縮した抽出液（以下、単に濃縮抽出液と称する）を分画して、エタノール可溶画分を得る工程である。第１分画工程Ｓ１０６において、エタノール可溶画分を分画するために、イオン交換樹脂（合成吸着剤）を用いる。本実施例における第１分画工程Ｓ１０６では、ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＨＰ２０を充填したカラムに濃縮抽出液を通すことで、濃縮抽出液からエタノール可溶画分を分画する。
【００３７】
第１分画工程Ｓ１０６で得るエタノール可溶画分は、好ましくは、３０〜１００％エタノール可溶画分であり、より好ましくは７０〜１００％エタノール可溶画分であり、さらに好ましくは８５％エタノール可溶画分である。
【００３８】
（第２分画工程Ｓ１０８）
第２分画工程Ｓ１０８は、第１分画工程Ｓ１０６で得られたエタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る工程である。第２分画工程Ｓ１０８において、脂溶性画分を分画するために、弱陰イオン交換樹脂を用いる。本実施例における第２分画工程Ｓ１０８では、ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ３０を充填したカラムにエタノール可溶画分を通すことで、エタノール可溶画分から脂溶性画分を分画する。
【００３９】
本実施例の第２分画工程Ｓ１０８では、まず、ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ３０を充填したカラムに、第１分画工程Ｓ１０６で得られたエタノール可溶画分を通し、ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ３０に吸着しなかったものを脂溶性画分とする。かかる脂溶性画分がメラニン合成促進物質として機能する。
【００４０】
（濃縮乾固工程Ｓ１１０）
濃縮乾固工程Ｓ１１０は、第２分画工程Ｓ１０８において得られた脂溶性画分を濃縮・乾固する工程である。濃縮乾固工程Ｓ１１０は、保存・運搬しやすいように、第２分画工程Ｓ１０８で分画された脂溶性画分を減圧濃縮乾固する。
【００４１】
以上説明した、乾燥粉砕工程Ｓ１００、発酵工程Ｓ１０２、抽出工程Ｓ１０４、第１分画工程Ｓ１０６、第２分画工程Ｓ１０８、濃縮乾固工程Ｓ１１０を経ることによりメラニン合成促進物質を製造することができる。
【００４２】
また、本実施例にかかる上記脂溶性画分は、メラニンの合成過程において必要不可欠な酵素であるチロシナーゼを活性化することでメラニンの合成を促進する。したがって、上記脂溶性画分はチロシナーゼ活性物質としても機能する。
【００４３】
＜評価＞
図２は、メラニンの生合成経路を説明するための説明図である。図２に示すように、メラニンは、チロシンを出発物質として合成される。例えば、メラノサイトにおいて、血中から供給されたチロシンは、銅含有酵素であるチロシナーゼによって酸化されて、Ｌ−ＤＯＰＡに合成される。さらにＬ−ＤＯＰＡも、チロシナーゼによって酸化されてドーパキノンに合成される。そして、ドーパキノンは自動的に酸化されて、ドーパクロム、メラニンへと合成される。
【００４４】
そこで、上記製造方法で製造されたメラニン合成促進物質またはチロシナーゼ活性物質のメラニン合成の促進を評価すべく以下の実験を行った。
【００４５】
（Ｂ１６メラノーマ（マウス黒色腫細胞株）におけるメラニン合成量の測定）
図３は、Ｂ１６メラノーマを用いたメラニン合成量の比較実験の実験手順を説明するための説明図である。図３に示すように、まず、Ｂ１６メラノーマに上記製造方法により製造した脂溶性画分を添加した培地で、０．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間培養を行った。またコントロールとしてＢ１６メラノーマに脂溶性画分を添加しない培地で、上記培養条件と同様の条件で培養を行った。
【００４６】
そして、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマ、コントロールのＢ１６メラノーマそれぞれを、培養皿から回収し、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色法を用いて生存細胞数を計数した。
【００４７】
図４は、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマとコントロールのＢ１６メラノーマとの生存細胞数を説明するための説明図である。図４中、棒グラフに付加したエラーバーは標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）を示す。図４に示すようにコントロールのＢ１６メラノーマの生存細胞数（１．３７×１０６個／ｗｅｌｌ（標準偏差０．１２））と脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマの生存細胞数（１．１７×１０６個／ｗｅｌｌ（標準偏差０．１５））にはほとんど差が無いため、脂溶性画分を添加したことによりＢ１６メラノーマの死滅が促進することはないことが分かる。
【００４８】
また、培養皿から回収された培養後のＢ１６メラノーマに、１ＮのＮａＯＨを添加し、７５℃、９０分でインキュベートし、培養後のＢ１６メラノーマを溶解して、溶解液を得た。そして、波長４０５ｎｍで、かかる溶解液の吸光度を測定してメラニンの濃度を算出した。なお、４０５ｎｍはメラニンの吸収波長である。また、ここでは認証された合成メラニンを使用して検量線を作成した。
【００４９】
図５は、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマとコントロールのＢ１６メラノーマとのメラニン量を説明するための説明図であり、図５（ａ）は、１細胞あたりのメラニン合成量を、図５（ｂ）は、１ｗｅｌｌあたりのメラニン合成量を示す。図５中、棒グラフに付加したエラーバーは標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）を示す。図５（ａ）に示すように、コントロールのＢ１６メラノーマは、１細胞あたり、３０．３４ｐｇ（標準偏差４．８３）のメラニンを含有しており、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマは、１細胞あたり、５５．００ｐｇ（標準偏差６．９３）のメラニンを含有している。したがって、コントロールのＢ１６メラノーマと比較して脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマは、１細胞あたり、約１．６倍の量のメラニンを合成していることが分かる。また図５（ｂ）に示すように、コントロールのＢ１６メラノーマは、１ｗｅｌｌあたり、４１．２７μｇ（標準偏差３．４７）のメラニンを含有しており、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマは、１ｗｅｌｌあたり、６３．４８μｇ（標準偏差５．２８）のメラニンを含有している。したがって、コントロールのＢ１６メラノーマと比較して脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマは、１ｗｅｌｌあたり、約１．５倍の量のメラニンを合成していることが分かる。
【００５０】
これにより、上記製造方法で製造した脂溶性画分は、メラニンの合成を促進することが分かった。したがって、上記製造方法で製造した脂溶性画分（メラニン合成促進物質）を、メラノサイトに適用することでメラノサイトのメラニン合成能力を向上させることが可能となる。つまり、毛髪を産生する毛母細胞のメラノサイトに上記脂溶性画分を適用することで、毛髪の白化を抑制することができる。
【００５１】
（無細胞系におけるチロシナーゼ活性測定）
図６は、無細胞系におけるチロシナーゼ活性を測定するための実験手順を説明するための説明図である。図６に示すように、まず、１００ｐｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬとなるように、超音波を照射しながら脂溶性画分を、０．１ＭのＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）（ｐＨ６．８）で溶解した。そして、１００ｐｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの脂溶性画分の溶液それぞれに２００ ｕｎｉｔ／ｍＬのマッシュルームチロシナーゼを添加し、３７℃で１０分インキュベートした。またコントロールとして０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ６．８）に２００ ｕｎｉｔ／ｍＬのマッシュルームチロシナーゼを添加し、３７℃で１０分インキュベートした。
【００５２】
そして、マッシュルームチロシナーゼを添加した脂溶性画分、マッシュルームチロシナーゼを添加したコントロール、それぞれに２ｍＭ、Ｌ―ＤＯＰＡを添加し、３７℃に保ち、２０分経過後まで、１分ごとに波長４７５ｎｍで吸光度を測定した。なお、４７５ｎｍはドーパキノンの吸収波長である。
【００５３】
図７は、チロシナーゼ活性化率を評価するための式を示す図であり、図８は、脂溶性画分のチロシナーゼ活性率を説明するための説明図である。
【００５４】
図７に示す式に、０分時点における脂溶性画分を添加したマッシュルームチロシナーゼとＬ−ＤＯＰＡとの混合液（以下、単に脂溶性画分の混合液と称する）の吸光度、２０分時点における脂溶性画分の混合液の吸光度、０分時点におけるコントロールを添加したマッシュルームチロシナーゼとＬ−ＤＯＰＡとの混合液（以下、単にコントロールの混合液と称する）の吸光度、および２０分時点におけるコントロールの混合液の吸光度を代入することにより、脂溶性画分のチロシナーゼ活性化率（％）を算出することができる。
【００５５】
図８に示すように、コントロール（１００％（標準偏差９．９０））と比較して、脂溶性画分はチロシナーゼ活性率が高くなった。また、脂溶性画分を１００ｐｇ／ｍＬ添加した場合のチロシナーゼ活性率は１０５．９９％（標準偏差１０．４６）、１００ｎｇ／ｍＬ添加した場合のチロシナーゼ活性率は１１４．３０％（標準偏差１４．０８）、１００μｇ／ｍＬ添加した場合のチロシナーゼ活性率は１１８．０６％（標準偏差８．０２）となった。したがって、脂溶性画分は、濃度依存的にチロシナーゼを活性することが分かった。
【００５６】
これにより、無細胞系において、上記製造方法で製造した脂溶性画分は、チロシナーゼを活性化することが分かった。
【００５７】
（細胞内におけるチロシナーゼ活性測定）
図９は、細胞内におけるチロシナーゼ活性を測定するための実験手順を説明するための説明図である。図９に示すように、まず、Ｂ１６メラノーマに上記製造方法により製造した脂溶性画分を１００μｇ／ｍＬの濃度となるように添加した培地で、０．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間培養を行った。またコントロールとしてＢ１６メラノーマに脂溶性画分を添加しない培地で、上記培養条件と同様の条件で培養を行った。
【００５８】
そして、培地を除去し、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマ、コントロールのＢ１６メラノーマそれぞれを、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳで洗浄した、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマ、コントロールのＢ１６メラノーマそれぞれを、細胞溶解タンパク抽出試薬（例えば、東洋ビーネット株式会社製Ｃｅｌｌ−ＬｙＥＸ１）を用いて溶解した。
【００５９】
細胞溶解タンパク抽出試薬を用いて得られた細胞溶解液を回収し、１５０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離を行い、上清を得た。
【００６０】
得られた上清のタンパク質定量（Ｌｏｗｌｙ法）を行い、培地に含まれる血清が完全に除去されたことを確認した。
【００６１】
そして、得られた脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマの細胞溶解液の上清（以下、単に脂溶性画分の上清と称する）、コントロールのＢ１６メラノーマの細胞溶解液の上清以下、単にコントロールの上清と称する）、それぞれに２ｍＭ、Ｌ―ＤＯＰＡを添加し、３７℃に保ち、６０分経過後まで、１０分ごとに波長４７５ｎｍで吸光度を測定した。
【００６２】
図１０は、チロシナーゼ活性化率を評価するための式を示す図であり、図１１は、脂溶性画分の上清のチロシナーゼ活性率を説明するための説明図である。図１０に示す式に、０分時点における脂溶性画分の上清とＬ−ＤＯＰＡとの混合液の吸光度、６０分時点における脂溶性画分の上清とＬ−ＤＯＰＡとの混合液の吸光度、０分時点におけるコントロールの上清とＬ−ＤＯＰＡとの混合液の吸光度、および６０分時点におけるコントロールの上清とＬ−ＤＯＰＡとの混合液の吸光度を代入することにより、脂溶性画分の上清のチロシナーゼ活性化率（％）を算出することができる。
【００６３】
図１１に示すように、コントロール（１００％（標準偏差２．６６））と比較して、脂溶性画分のチロシナーゼ活性率は、１３１．５５％（標準偏差１９．６７）となり、脂溶性画分の上清は、コントロールの上清と比較してチロシナーゼを１３１．５５％活性化することが分かった。
【００６４】
以上説明したように、細胞内においても、上記製造方法で製造した脂溶性画分は、チロシナーゼを活性化することが分かった。チロシナーゼは、メラニンの合成過程に不可欠な酵素であるため、チロシナーゼを活性化する上記脂溶性画分を、メラノサイトに適用することでメラノサイトのメラニン合成能力を向上させることが可能となる。したがって、毛髪を産生する毛母細胞のメラノサイトに上記脂溶性画分を適用することで、毛髪の表面からではなく、毛髪の内部にメラニンを含ませることができ、今後生えてくる毛髪の白化を抑制することが可能となる。
【００６５】
またメラニンの合成過程であるチロシンからＬ―ＤＯＰＡへの合成は、チロシナーゼによって行われる。Ｌ−ＤＯＰＡは、神経伝達物質であるドーパミンの前駆体であり、血液脳関門を通過することが可能であるため、パーキンソン病等に有用な薬剤として用いられている。したがって、チロシナーゼを活性化する上記脂溶性画分は、チロシンからＬ−ＤＯＰＡへの合成を促進させることができ、将来的にパーキンソン病等に好適な薬剤（医薬品）として適用することができる可能性がある。
【００６６】
以上、本実施例に従うメラニン合成促進物質の製造方法およびチロシナーゼ活性物質の製造方法の詳細と、その製造方法により製造されるメラニン合成促進物質およびチロシナーゼ活性物質の効果を証明する実験結果を示した。上述した実験結果から、得られたメラニン合成促進物質が驚くべきメラニン合成促進効果を有することが示され、また、得られたチロシナーゼ活性物質が驚くべきチロシナーゼ活性効果を有することが示された。したがって、上記のメラニン合成促進物質またはチロシナーゼ活性物質のいずれか一方または両方は、皮膚外用剤、例えば、化粧料や医薬部外品、医薬品、白髪予防用医薬品等の幅広い応用が可能なものであり、特に、白髪またはそれに近い症状を呈する者や、パーキンソン病等の神経疾患またはそれに近い症状を呈する者に好適な皮膚外用剤、化粧料、医薬部外品、医薬品、白髪予防用医薬品に応用が期待できる。
【００６７】
ここで、本明細書中に記載した白髪予防用医薬品という用語は造語であるが、髪などの体毛の地毛の色（元の毛の色）の発現を促進せしめうる剤という意味である。実施例によっては、その剤のチロシナーゼ活性作用またはメラニン合成促進作用により、体毛の白化を防止したり遅らせたり、さらには色を濃くしたりという効果が期待できる。通常、加齢と共に体毛の色は薄くなり、終には白色となることが多いが、実施例によっては、そのような加齢変化の進行を防止したり遅らせたり、または逆転させたりという効果が期待できるということである。このため、実施例によっては、本発明を利用する剤を、老化を防止する抗老化剤と言い表してもよい場合があるだろう。
【００６８】
本発明によるメラニン合成促進物質またはチロシナーゼ活性物質のいずれか一方または両方は、化粧料においては、毛の色を地毛の色に戻す白髪予防用医薬品（毛の老化を防止する抗老化毛剤）、頭髪用化粧品、整髪料、養毛料、頭皮料、毛髪着色料、洗髪料、ヘアリンス、皮膚用化粧品・化粧水、化粧液、クリーム、乳液、日焼け、日焼け止め、洗浄料、ひげそり、むだ毛そり、フェイシャルリンス、パック、化粧用油、ボディリンス、マッサージ料、仕上用化粧品・ファンデーション、化粧下地、おしろい、口紅、アイメークアップ、頬化粧料、ボディメークアップ、オーデコロン・香水、浴用化粧料、爪化粧料、ボディパウダー等、また医薬品においては、散剤・細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、桿剤、ペンシル剤、内容液剤、外用液剤、エキス剤、硬膏剤、坐剤、エアゾール、ガス剤、薬品吸着剤、眼科用剤、注射剤、絆創膏剤等幅広く使用可能である。
【００６９】
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施例について説明したが、本発明はこれらの実施例に限定されないことは言うまでもない。当業者であれば、特許請求の範囲を逸脱せずに、各種の変更または修正を行いうることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【００７０】
なお、本明細書のメラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法およびチロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質における各工程は、必ずしもフローチャートとして記載された順序に沿って時系列に処理する必要はなく、並列的に進めることも可能である。
【００７１】
本発明は、例えば、メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法、メラニン合成促進物質、皮膚外用剤、チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質の製造方法、チロシナーゼ活性物質、および医薬品に利用することができる。
【符号の説明】
【００７２】
Ｓ１００ …乾燥粉砕工程
Ｓ１０２ …発酵工程
Ｓ１０４ …抽出工程
Ｓ１０６ …第１分画工程
Ｓ１０８ …第２分画工程
Ｓ１１０ …濃縮乾固工程
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニンの合成を促進しうる技術に関し、例えば、メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法、メラニン合成促進物質、皮膚外用剤、チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質の製造方法、チロシナーゼ活性物質、および医薬品に好適に適用されうる。
【発明の背景】
【０００２】
毛髪の色は、毛髪を産生する毛母細胞にあるメラノサイト（色素細胞）が合成するメラニンの色である。老化、ストレス、病気、遺伝等によって、メラノサイトのメラニン合成能力が低下すると、毛髪へのメラニンの供給が減少し、毛髪の白化、所謂白髪が生じることとなる。
【０００３】
従来、白髪を目立たなくするために様々な毛髪着色料（染毛剤）が開発されている。染毛剤として、例えば、酸化染毛剤が広く利用されている。酸化染毛剤は、毛髪の表皮（キューティクル）を開き、毛髪内部に色素を注入させることで、毛髪を着色するものである。酸化染毛剤では、キューティクルを開いて色素を注入させるため、酸化染毛剤を用いて染毛した毛髪は、傷みやすく、つやや潤いがなくなり、櫛通りが悪くなってしまう。
【０００４】
そこで、酸化染毛剤に、カチオン性高分子、両性高分子およびアニオン性高分子を含有させることにより、毛髪の柔軟性、しっとり感またはなめらかさを向上させる染毛剤が開示されている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１９３７７２号公報
【０００６】
しかし、特許文献１に記載の技術を利用したとしても、毛髪の表面のキューティクルを開いて色素を注入しなければ染毛できないことに変わりないので、毛髪へのダメージを完全に無くすことは困難である。また、白髪自体が無くなるわけではないので、毛髪が伸びてくると、先端の染めた部分と頭皮側の染めていない部分（白髪の部分）との色の差が目立つようになり、違和感を生じてしまう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、メラニンの合成を促進しうる新しい技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の具現化形態の一例として、メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法であって、発酵ステビアの抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る第１分画工程と、エタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る第２分画工程と、を含む製造方法を開示する。
【０００９】
本願発明者は、鋭意研究を重ねた結果、発酵ステビアの抽出液を分画して得られるエタノール可溶画分をさらに分画した脂溶性画分にメラニンの合成を促進させる作用があることを見いだした。したがって、例えば、毛髪を産生する毛母細胞のメラノサイトに上記脂溶性画分を適用することで、毛髪の表面からではなく、毛髪の内部にメラニンを含ませることができ、今後生えてくる毛髪の白化を抑制することが可能となる。
【００１０】
上記第１分画工程の前段に、乾燥したステビア植物組織に酵母および水を加えて発酵させる発酵工程と、発酵工程により得られた発酵ステビアからエタノール水溶液を用いて抽出を行い、抽出液を得る抽出工程と、を含んでもよい。
【００１１】
上記の発酵工程および抽出工程を経て得られた発酵ステビア抽出液は、上記製造方法にてメラニン合成促進物質を得るための発酵ステビア抽出液として好適である。
【００１２】
上記第１分画工程において得られるエタノール可溶画分は、３０〜１００％エタノール可溶画分であってもよい。
【００１３】
３０〜１００％エタノール可溶画分から分画した脂溶性画分は、メラニン合成促進物質として特に優れている。
【００１４】
本発明の具現化形態の別の例に従う、メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質は、発酵ステビアの抽出液を分画することにより得られるエタノール可溶画分をさらに分画して得た脂溶性画分を含む。
【００１５】
本発明の具現化形態の別の例に従う皮膚外用剤は、上記メラニン合成促進物質の製造方法により製造された、メラニン合成促進物質を含む。上記皮膚外用剤は、化粧料であっても、医薬部外品であっても、医薬品であっても、白髪予防用医薬品であってもよい。
【００１６】
本発明の具現化形態の別の例として、チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質の製造方法を開示する。この製造方法は、発酵ステビアの抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る第１分画工程と、エタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る第２分画工程と、を有する。
【００１７】
本願発明者は、鋭意研究を重ねた結果、発酵ステビアの抽出液を分画して得られるエタノール可溶画分をさらに分画した脂溶性画分にチロシナーゼを活性化させる機能があることを見いだした。チロシナーゼは、メラニンの合成過程に不可欠な酵素であるため、チロシナーゼを活性化する上記脂溶性画分を、メラノサイトに適用することでメラノサイトのメラニン合成能力を向上させることが可能となる。
【００１８】
またメラニンの合成過程であるチロシンからＬ―ＤＯＰＡ（3,4-dihydroxy-L-phenylalanine）への合成は、チロシナーゼによって行われる。Ｌ−ＤＯＰＡは、神経伝達物質であるドーパミンの前駆体であり、血液脳関門を通過することが可能であるため、パーキンソン病等に有用な薬剤として用いられている。したがって、チロシナーゼを活性化する上記脂溶性画分は、チロシンからＬ−ＤＯＰＡへの合成を促進させることができ、将来的にパーキンソン病等に好適な薬剤として適用することができる可能性がある。
【００１９】
上記第１分画工程の前段に、乾燥したステビア植物組織に酵母および水を加えて発酵させる発酵工程と、発酵工程により得られた発酵ステビアからエタノール水溶液を用いて抽出を行い、抽出液を得る抽出工程と、を含んでもよい。
【００２０】
上記第１分画工程において得られるエタノール可溶画分は、３０〜１００％エタノール可溶画分であってもよい。
【００２１】
本発明の具現化形態の一例に従う、チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質は、発酵ステビアの抽出液を分画することにより得られるエタノール可溶画分をさらに分画して得た脂溶性画分を含む。
【００２２】
本発明の具現化形態の一例に従う医薬品は、上記チロシナーゼ活性物質の製造方法により製造された、チロシナーゼ活性物質を含む。
【００２３】
上述したメラニン合成促進物質の製造方法の技術的思想に基づく構成要素やその説明は、当該メラニン合成促進物質、皮膚外用剤、チロシナーゼ活性物質の製造方法、チロシナーゼ活性物質、および医薬品にも適用可能である。
【００２４】
実施形態によっては、チロシナーゼを活性化させることでメラニンの合成を促進させることができ、今後生えてくる毛髪の内部にメラニンを含ませて、毛髪の白化を抑制することが可能となる。実施形態には、例えば、メラニン合成促進物質の製造方法、メラニン合成促進物質、皮膚外用剤、チロシナーゼ活性物質の製造方法、チロシナーゼ活性物質、および医薬品が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】一実施例に従うメラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法を説明するための説明図である。
【図２】メラニンの生合成経路を説明するための説明図である。
【図３】Ｂ１６メラノーマを用いたメラニン合成量の比較実験の実験手順を説明するための説明図である。
【図４】脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマとコントロールのＢ１６メラノーマとの生存細胞数を説明するための説明図である。
【図５】脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマとコントロールのＢ１６メラノーマとのメラニン量を説明するための説明図である。
【図６】無細胞系におけるチロシナーゼ活性を測定するための実験手順を説明するための説明図である。
【図７】チロシナーゼ活性化率を評価するための式を示す図である。
【図８】脂溶性画分を添加したマッシュルームチロシナーゼとコントロールのマッシュルームチロシナーゼとのドーパキノンの合成量を説明するための説明図である。
【図９】細胞内におけるチロシナーゼ活性を測定するための実験手順を説明するための説明図である。
【図１０】チロシナーゼ活性化率を評価するための式を示す図である。
【図１１】脂溶性画分の上清とコントロールの上清とによるドーパキノンの合成量を説明するための説明図である。
【好適な実施形態の説明】
【００２６】
以下に添付図面を参照しながら、本発明の好適な実施例について詳細に説明する。かかる実施例に示す寸法、材料、その他具体的な数値などは、発明の理解を容易とするための例示にすぎず、特に断る場合を除き、本発明を限定するものではない。なお、本明細書および図面において、実質的に同一の機能、構成を有する要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略し、また本発明に直接関係のない要素は図示を省略する。
【００２７】
＜実施例：メラニン合成促進物質の製造方法＞
図１は、一実施例に従うメラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法を説明するための説明図である。図１に示すように、本実施例に従うメラニン合成促進物質の製造方法は、ステビア植物組織を乾燥させて粉砕する工程（乾燥粉砕工程：Ｓ１００）と、乾燥粉砕工程Ｓ１００により得られた乾燥したステビア植物組織に酵母および水を加えて発酵させる工程（発酵工程：Ｓ１０２）と、発酵工程Ｓ１０２により得られた発酵ステビアから、エタノール水溶液を用いて抽出を行い、抽出液を得る工程（抽出工程：Ｓ１０４）と、抽出工程（Ｓ１０４）により得られた抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る工程（第１分画工程：Ｓ１０６）と、第１分画工程（Ｓ１０８）により得られたエタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る工程（第２分画工程：Ｓ１０８）と、第２分画工程（Ｓ１０８）により得られた脂溶性画分を減圧し、濃縮乾固させる工程（濃縮乾固工程：Ｓ１１０）とを含む。以下に、各工程の構成を詳細に説明する。
【００２８】
（乾燥粉砕工程Ｓ１００）
乾燥粉砕工程Ｓ１００は、原料となるステビア植物の植物組織を乾燥・粉砕する工程である。本実施例の原料の一つであるステビア植物は、南米のパラグアイを原産とするキク科の多年生植物である。また、ステビア植物の学名はステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Stevia Rebaudiana Bertoni（学術名））である。ステビア植物を日本で栽培する場合、２月から５月にかけて、種、株苗あるいは挿し木苗を定植し、栽培を開始することが多い。収穫は、ステビア植物が十分に成熟する、１０月から１１月上旬頃にかけて行われることが多い。
【００２９】
本実施例における、メラニン合成促進物質は、このステビア植物の植物組織をよく乾燥させ、それを細かく粉砕して作った乾燥したステビア植物組織の粉末（以下、単に、乾燥ステビア粉末と称する）を原料として用いる。粉末といっても、各片の大きさが概ね１ｃｍ以下になるように粉砕してあれば十分である。また、ステビア植物の葉部および茎部を選別して使用することが好ましい。
【００３０】
ステビア植物の葉部及び茎部の乾燥には、できるだけ換気の行き届いた室内にて、常温にて行うことが望ましく、急激に熱をかけたりすることは、好ましくない。
【００３１】
（発酵工程Ｓ１０２）
発酵工程Ｓ１０２は、乾燥粉砕工程Ｓ１００で得られた乾燥ステビア粉末を発酵させる工程である。乾燥ステビア粉末の発酵は、乾燥ステビア粉末に水と酵母を加えて撹拌し、放置することにより行うことができる。発酵工程Ｓ１０２において加える水は、発酵に必要なだけの量があればよく、全体が湿る程度の量で十分である。酵母としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）類を用いることが好ましい。
【００３２】
乾燥ステビア粉末の発酵は、「完全に」行うことが好ましい。発酵していないステビア粉末を舐めてみると甘い味がするが、完全に発酵したステビア粉末には甘さが認められない。したがって、完全に甘さが感じられなくなるまで発酵を進めることが望ましい。完全に発酵させるには、常温の場合でおよそ１〜４週間の放置期間が必要である。
【００３３】
具体的に、発酵工程Ｓ１０２において、まず乾燥ステビア粉末に水分を含ませ、さらに、酵母（例えば、サッカロマイセス）を加え、常温にて１〜４週間、水分を補給しながら発酵を継続させる。そして、ステビア粉末を口に含み、その甘味を感じなくなったときを「完全」に発酵したとみなす。
【００３４】
（抽出工程Ｓ１０４）
発酵工程Ｓ１０２で得られた発酵したステビア粉末（以下、単に発酵ステビアと称する）から、エタノール水溶液を用いて抽出を行い、抽出液を得る工程である。発酵工程Ｓ１０２で得られた発酵ステビアから抽出した抽出液は、メラニンの合成を促進させる機能またはチロシナーゼを活性化させる機能を有する。本実施例において、発酵ステビアから抽出を行う際に用いる溶媒をエタノールとすることが重要である。これは、後の第１分画工程Ｓ１０８において、エタノール可溶画分を分画するためである。
【００３５】
抽出は、３０％程度のエタノール水溶液を準備し、これに発酵ステビアを加え、穏やかに撹拌しながら数時間〜数日、常温にて浸潤させて行う。発酵ステビアを３０％程度のエタノール水溶液に浸潤させたものを、１４０メッシュ程度の濾紙で濾過して得られた濾液を抽出液とする。そして、本実施例では、この抽出液をさらに６０℃程度で減圧濃縮することにより、抽出液を濃縮する。
【００３６】
（第１分画工程Ｓ１０６）
第１分画工程Ｓ１０６は、抽出工程Ｓ１０４で得られた濃縮した抽出液（以下、単に濃縮抽出液と称する）を分画して、エタノール可溶画分を得る工程である。第１分画工程Ｓ１０６において、エタノール可溶画分を分画するために、イオン交換樹脂（合成吸着剤）を用いる。本実施例における第１分画工程Ｓ１０６では、ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＨＰ２０を充填したカラムに濃縮抽出液を通すことで、濃縮抽出液からエタノール可溶画分を分画する。
【００３７】
第１分画工程Ｓ１０６で得るエタノール可溶画分は、好ましくは、３０〜１００％エタノール可溶画分であり、より好ましくは７０〜１００％エタノール可溶画分であり、さらに好ましくは８５％エタノール可溶画分である。
【００３８】
（第２分画工程Ｓ１０８）
第２分画工程Ｓ１０８は、第１分画工程Ｓ１０６で得られたエタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る工程である。第２分画工程Ｓ１０８において、脂溶性画分を分画するために、弱陰イオン交換樹脂を用いる。本実施例における第２分画工程Ｓ１０８では、ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ３０を充填したカラムにエタノール可溶画分を通すことで、エタノール可溶画分から脂溶性画分を分画する。
【００３９】
本実施例の第２分画工程Ｓ１０８では、まず、ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ３０を充填したカラムに、第１分画工程Ｓ１０６で得られたエタノール可溶画分を通し、ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ３０に吸着しなかったものを脂溶性画分とする。かかる脂溶性画分がメラニン合成促進物質として機能する。
【００４０】
（濃縮乾固工程Ｓ１１０）
濃縮乾固工程Ｓ１１０は、第２分画工程Ｓ１０８において得られた脂溶性画分を濃縮・乾固する工程である。濃縮乾固工程Ｓ１１０は、保存・運搬しやすいように、第２分画工程Ｓ１０８で分画された脂溶性画分を減圧濃縮乾固する。
【００４１】
以上説明した、乾燥粉砕工程Ｓ１００、発酵工程Ｓ１０２、抽出工程Ｓ１０４、第１分画工程Ｓ１０６、第２分画工程Ｓ１０８、濃縮乾固工程Ｓ１１０を経ることによりメラニン合成促進物質を製造することができる。
【００４２】
また、本実施例にかかる上記脂溶性画分は、メラニンの合成過程において必要不可欠な酵素であるチロシナーゼを活性化することでメラニンの合成を促進する。したがって、上記脂溶性画分はチロシナーゼ活性物質としても機能する。
【００４３】
＜評価＞
図２は、メラニンの生合成経路を説明するための説明図である。図２に示すように、メラニンは、チロシンを出発物質として合成される。例えば、メラノサイトにおいて、血中から供給されたチロシンは、銅含有酵素であるチロシナーゼによって酸化されて、Ｌ−ＤＯＰＡに合成される。さらにＬ−ＤＯＰＡも、チロシナーゼによって酸化されてドーパキノンに合成される。そして、ドーパキノンは自動的に酸化されて、ドーパクロム、メラニンへと合成される。
【００４４】
そこで、上記製造方法で製造されたメラニン合成促進物質またはチロシナーゼ活性物質のメラニン合成の促進を評価すべく以下の実験を行った。
【００４５】
（Ｂ１６メラノーマ（マウス黒色腫細胞株）におけるメラニン合成量の測定）
図３は、Ｂ１６メラノーマを用いたメラニン合成量の比較実験の実験手順を説明するための説明図である。図３に示すように、まず、Ｂ１６メラノーマに上記製造方法により製造した脂溶性画分を添加した培地で、０．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間培養を行った。またコントロールとしてＢ１６メラノーマに脂溶性画分を添加しない培地で、上記培養条件と同様の条件で培養を行った。
【００４６】
そして、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマ、コントロールのＢ１６メラノーマそれぞれを、培養皿から回収し、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色法を用いて生存細胞数を計数した。
【００４７】
図４は、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマとコントロールのＢ１６メラノーマとの生存細胞数を説明するための説明図である。図４中、棒グラフに付加したエラーバーは標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）を示す。図４に示すようにコントロールのＢ１６メラノーマの生存細胞数（１．３７×１０６個／ｗｅｌｌ（標準偏差０．１２））と脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマの生存細胞数（１．１７×１０６個／ｗｅｌｌ（標準偏差０．１５））にはほとんど差が無いため、脂溶性画分を添加したことによりＢ１６メラノーマの死滅が促進することはないことが分かる。
【００４８】
また、培養皿から回収された培養後のＢ１６メラノーマに、１ＮのＮａＯＨを添加し、７５℃、９０分でインキュベートし、培養後のＢ１６メラノーマを溶解して、溶解液を得た。そして、波長４０５ｎｍで、かかる溶解液の吸光度を測定してメラニンの濃度を算出した。なお、４０５ｎｍはメラニンの吸収波長である。また、ここでは認証された合成メラニンを使用して検量線を作成した。
【００４９】
図５は、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマとコントロールのＢ１６メラノーマとのメラニン量を説明するための説明図であり、図５（ａ）は、１細胞あたりのメラニン合成量を、図５（ｂ）は、１ｗｅｌｌあたりのメラニン合成量を示す。図５中、棒グラフに付加したエラーバーは標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）を示す。図５（ａ）に示すように、コントロールのＢ１６メラノーマは、１細胞あたり、３０．３４ｐｇ（標準偏差４．８３）のメラニンを含有しており、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマは、１細胞あたり、５５．００ｐｇ（標準偏差６．９３）のメラニンを含有している。したがって、コントロールのＢ１６メラノーマと比較して脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマは、１細胞あたり、約１．６倍の量のメラニンを合成していることが分かる。また図５（ｂ）に示すように、コントロールのＢ１６メラノーマは、１ｗｅｌｌあたり、４１．２７μｇ（標準偏差３．４７）のメラニンを含有しており、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマは、１ｗｅｌｌあたり、６３．４８μｇ（標準偏差５．２８）のメラニンを含有している。したがって、コントロールのＢ１６メラノーマと比較して脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマは、１ｗｅｌｌあたり、約１．５倍の量のメラニンを合成していることが分かる。
【００５０】
これにより、上記製造方法で製造した脂溶性画分は、メラニンの合成を促進することが分かった。したがって、上記製造方法で製造した脂溶性画分（メラニン合成促進物質）を、メラノサイトに適用することでメラノサイトのメラニン合成能力を向上させることが可能となる。つまり、毛髪を産生する毛母細胞のメラノサイトに上記脂溶性画分を適用することで、毛髪の白化を抑制することができる。
【００５１】
（無細胞系におけるチロシナーゼ活性測定）
図６は、無細胞系におけるチロシナーゼ活性を測定するための実験手順を説明するための説明図である。図６に示すように、まず、１００ｐｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬとなるように、超音波を照射しながら脂溶性画分を、０．１ＭのＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）（ｐＨ６．８）で溶解した。そして、１００ｐｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの脂溶性画分の溶液それぞれに２００ ｕｎｉｔ／ｍＬのマッシュルームチロシナーゼを添加し、３７℃で１０分インキュベートした。またコントロールとして０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ６．８）に２００ ｕｎｉｔ／ｍＬのマッシュルームチロシナーゼを添加し、３７℃で１０分インキュベートした。
【００５２】
そして、マッシュルームチロシナーゼを添加した脂溶性画分、マッシュルームチロシナーゼを添加したコントロール、それぞれに２ｍＭ、Ｌ―ＤＯＰＡを添加し、３７℃に保ち、２０分経過後まで、１分ごとに波長４７５ｎｍで吸光度を測定した。なお、４７５ｎｍはドーパキノンの吸収波長である。
【００５３】
図７は、チロシナーゼ活性化率を評価するための式を示す図であり、図８は、脂溶性画分のチロシナーゼ活性率を説明するための説明図である。
【００５４】
図７に示す式に、０分時点における脂溶性画分を添加したマッシュルームチロシナーゼとＬ−ＤＯＰＡとの混合液（以下、単に脂溶性画分の混合液と称する）の吸光度、２０分時点における脂溶性画分の混合液の吸光度、０分時点におけるコントロールを添加したマッシュルームチロシナーゼとＬ−ＤＯＰＡとの混合液（以下、単にコントロールの混合液と称する）の吸光度、および２０分時点におけるコントロールの混合液の吸光度を代入することにより、脂溶性画分のチロシナーゼ活性化率（％）を算出することができる。
【００５５】
図８に示すように、コントロール（１００％（標準偏差９．９０））と比較して、脂溶性画分はチロシナーゼ活性率が高くなった。また、脂溶性画分を１００ｐｇ／ｍＬ添加した場合のチロシナーゼ活性率は１０５．９９％（標準偏差１０．４６）、１００ｎｇ／ｍＬ添加した場合のチロシナーゼ活性率は１１４．３０％（標準偏差１４．０８）、１００μｇ／ｍＬ添加した場合のチロシナーゼ活性率は１１８．０６％（標準偏差８．０２）となった。したがって、脂溶性画分は、濃度依存的にチロシナーゼを活性することが分かった。
【００５６】
これにより、無細胞系において、上記製造方法で製造した脂溶性画分は、チロシナーゼを活性化することが分かった。
【００５７】
（細胞内におけるチロシナーゼ活性測定）
図９は、細胞内におけるチロシナーゼ活性を測定するための実験手順を説明するための説明図である。図９に示すように、まず、Ｂ１６メラノーマに上記製造方法により製造した脂溶性画分を１００μｇ／ｍＬの濃度となるように添加した培地で、０．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間培養を行った。またコントロールとしてＢ１６メラノーマに脂溶性画分を添加しない培地で、上記培養条件と同様の条件で培養を行った。
【００５８】
そして、培地を除去し、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマ、コントロールのＢ１６メラノーマそれぞれを、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳで洗浄した、脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマ、コントロールのＢ１６メラノーマそれぞれを、細胞溶解タンパク抽出試薬（例えば、東洋ビーネット株式会社製Ｃｅｌｌ−ＬｙＥＸ１）を用いて溶解した。
【００５９】
細胞溶解タンパク抽出試薬を用いて得られた細胞溶解液を回収し、１５０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離を行い、上清を得た。
【００６０】
得られた上清のタンパク質定量（Ｌｏｗｌｙ法）を行い、培地に含まれる血清が完全に除去されたことを確認した。
【００６１】
そして、得られた脂溶性画分を添加したＢ１６メラノーマの細胞溶解液の上清（以下、単に脂溶性画分の上清と称する）、コントロールのＢ１６メラノーマの細胞溶解液の上清以下、単にコントロールの上清と称する）、それぞれに２ｍＭ、Ｌ―ＤＯＰＡを添加し、３７℃に保ち、６０分経過後まで、１０分ごとに波長４７５ｎｍで吸光度を測定した。
【００６２】
図１０は、チロシナーゼ活性化率を評価するための式を示す図であり、図１１は、脂溶性画分の上清のチロシナーゼ活性率を説明するための説明図である。図１０に示す式に、０分時点における脂溶性画分の上清とＬ−ＤＯＰＡとの混合液の吸光度、６０分時点における脂溶性画分の上清とＬ−ＤＯＰＡとの混合液の吸光度、０分時点におけるコントロールの上清とＬ−ＤＯＰＡとの混合液の吸光度、および６０分時点におけるコントロールの上清とＬ−ＤＯＰＡとの混合液の吸光度を代入することにより、脂溶性画分の上清のチロシナーゼ活性化率（％）を算出することができる。
【００６３】
図１１に示すように、コントロール（１００％（標準偏差２．６６））と比較して、脂溶性画分のチロシナーゼ活性率は、１３１．５５％（標準偏差１９．６７）となり、脂溶性画分の上清は、コントロールの上清と比較してチロシナーゼを１３１．５５％活性化することが分かった。
【００６４】
以上説明したように、細胞内においても、上記製造方法で製造した脂溶性画分は、チロシナーゼを活性化することが分かった。チロシナーゼは、メラニンの合成過程に不可欠な酵素であるため、チロシナーゼを活性化する上記脂溶性画分を、メラノサイトに適用することでメラノサイトのメラニン合成能力を向上させることが可能となる。したがって、毛髪を産生する毛母細胞のメラノサイトに上記脂溶性画分を適用することで、毛髪の表面からではなく、毛髪の内部にメラニンを含ませることができ、今後生えてくる毛髪の白化を抑制することが可能となる。
【００６５】
またメラニンの合成過程であるチロシンからＬ―ＤＯＰＡへの合成は、チロシナーゼによって行われる。Ｌ−ＤＯＰＡは、神経伝達物質であるドーパミンの前駆体であり、血液脳関門を通過することが可能であるため、パーキンソン病等に有用な薬剤として用いられている。したがって、チロシナーゼを活性化する上記脂溶性画分は、チロシンからＬ−ＤＯＰＡへの合成を促進させることができ、将来的にパーキンソン病等に好適な薬剤（医薬品）として適用することができる可能性がある。
【００６６】
以上、本実施例に従うメラニン合成促進物質の製造方法およびチロシナーゼ活性物質の製造方法の詳細と、その製造方法により製造されるメラニン合成促進物質およびチロシナーゼ活性物質の効果を証明する実験結果を示した。上述した実験結果から、得られたメラニン合成促進物質が驚くべきメラニン合成促進効果を有することが示され、また、得られたチロシナーゼ活性物質が驚くべきチロシナーゼ活性効果を有することが示された。したがって、上記のメラニン合成促進物質またはチロシナーゼ活性物質のいずれか一方または両方は、皮膚外用剤、例えば、化粧料や医薬部外品、医薬品、白髪予防用医薬品等の幅広い応用が可能なものであり、特に、白髪またはそれに近い症状を呈する者や、パーキンソン病等の神経疾患またはそれに近い症状を呈する者に好適な皮膚外用剤、化粧料、医薬部外品、医薬品、白髪予防用医薬品に応用が期待できる。
【００６７】
ここで、本明細書中に記載した白髪予防用医薬品という用語は造語であるが、髪などの体毛の地毛の色（元の毛の色）の発現を促進せしめうる剤という意味である。実施例によっては、その剤のチロシナーゼ活性作用またはメラニン合成促進作用により、体毛の白化を防止したり遅らせたり、さらには色を濃くしたりという効果が期待できる。通常、加齢と共に体毛の色は薄くなり、終には白色となることが多いが、実施例によっては、そのような加齢変化の進行を防止したり遅らせたり、または逆転させたりという効果が期待できるということである。このため、実施例によっては、本発明を利用する剤を、老化を防止する抗老化剤と言い表してもよい場合があるだろう。
【００６８】
本発明によるメラニン合成促進物質またはチロシナーゼ活性物質のいずれか一方または両方は、化粧料においては、毛の色を地毛の色に戻す白髪予防用医薬品（毛の老化を防止する抗老化毛剤）、頭髪用化粧品、整髪料、養毛料、頭皮料、毛髪着色料、洗髪料、ヘアリンス、皮膚用化粧品・化粧水、化粧液、クリーム、乳液、日焼け、日焼け止め、洗浄料、ひげそり、むだ毛そり、フェイシャルリンス、パック、化粧用油、ボディリンス、マッサージ料、仕上用化粧品・ファンデーション、化粧下地、おしろい、口紅、アイメークアップ、頬化粧料、ボディメークアップ、オーデコロン・香水、浴用化粧料、爪化粧料、ボディパウダー等、また医薬品においては、散剤・細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、桿剤、ペンシル剤、内容液剤、外用液剤、エキス剤、硬膏剤、坐剤、エアゾール、ガス剤、薬品吸着剤、眼科用剤、注射剤、絆創膏剤等幅広く使用可能である。
【００６９】
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施例について説明したが、本発明はこれらの実施例に限定されないことは言うまでもない。当業者であれば、特許請求の範囲を逸脱せずに、各種の変更または修正を行いうることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【００７０】
なお、本明細書のメラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法およびチロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質における各工程は、必ずしもフローチャートとして記載された順序に沿って時系列に処理する必要はなく、並列的に進めることも可能である。
【００７１】
本発明は、例えば、メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法、メラニン合成促進物質、皮膚外用剤、チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質の製造方法、チロシナーゼ活性物質、および医薬品に利用することができる。
【符号の説明】
【００７２】
Ｓ１００ …乾燥粉砕工程
Ｓ１０２ …発酵工程
Ｓ１０４ …抽出工程
Ｓ１０６ …第１分画工程
Ｓ１０８ …第２分画工程
Ｓ１１０ …濃縮乾固工程
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法であって、
発酵ステビアの抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る第１分画工程と、
前記エタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る第２分画工程と、
を含むメラニン合成促進物質の製造方法。
【請求項２】
前記第１分画工程の前段に、
乾燥したステビア植物組織に酵母および水を加えて発酵させる発酵工程と、
前記発酵工程により得られた発酵ステビアからエタノール水溶液を用いて抽出を行い、前記抽出液を得る抽出工程と、
を含む請求項１に記載のメラニン合成促進物質の製造方法。
【請求項３】
前記第１分画工程において得られるエタノール可溶画分は、３０〜１００％エタノール可溶画分である請求項１または２に記載のメラニン合成促進物質の製造方法。
【請求項４】
発酵ステビアの抽出液を分画することにより得られるエタノール可溶画分をさらに分画して得た脂溶性画分を含む、メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法により製造された、メラニン合成促進物質を含む、皮膚外用剤。
【請求項６】
化粧料である、請求項４に記載の皮膚外用剤。
【請求項７】
医薬部外品である、請求項４に記載の皮膚外用剤。
【請求項８】
医薬品である、請求項４に記載の皮膚外用剤。
【請求項９】
白髪予防用医薬品である、請求項４に記載の皮膚外用剤。
【請求項１０】
チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質の製造方法であって、
発酵ステビアの抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る第１分画工程と、
前記エタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る第２分画工程と、
を含むチロシナーゼ活性物質の製造方法。
【請求項１１】
前記第１分画工程の前段に、
乾燥したステビア植物組織に酵母および水を加えて発酵させる発酵工程と、
前記発酵工程により得られた発酵ステビアからエタノール水溶液を用いて抽出を行い、前記抽出液を得る抽出工程と、
を含む請求項１０に記載のチロシナーゼ活性物質の製造方法。
【請求項１２】
前記第１分画工程において得られるエタノール可溶画分は、３０〜１００％エタノール可溶画分である請求項１０または１１に記載のチロシナーゼ活性物質の製造方法。
【請求項１３】
発酵ステビアの抽出液を分画することにより得られるエタノール可溶画分をさらに分画して得た脂溶性画分を含む、チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質。
【請求項１４】
請求項１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法により製造された、チロシナーゼ活性物質を含む、医薬品。
【請求項１】
メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質の製造方法であって、
発酵ステビアの抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る第１分画工程と、
前記エタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る第２分画工程と、
を含むメラニン合成促進物質の製造方法。
【請求項２】
前記第１分画工程の前段に、
乾燥したステビア植物組織に酵母および水を加えて発酵させる発酵工程と、
前記発酵工程により得られた発酵ステビアからエタノール水溶液を用いて抽出を行い、前記抽出液を得る抽出工程と、
を含む請求項１に記載のメラニン合成促進物質の製造方法。
【請求項３】
前記第１分画工程において得られるエタノール可溶画分は、３０〜１００％エタノール可溶画分である請求項１または２に記載のメラニン合成促進物質の製造方法。
【請求項４】
発酵ステビアの抽出液を分画することにより得られるエタノール可溶画分をさらに分画して得た脂溶性画分を含む、メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進物質。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法により製造された、メラニン合成促進物質を含む、皮膚外用剤。
【請求項６】
化粧料である、請求項４に記載の皮膚外用剤。
【請求項７】
医薬部外品である、請求項４に記載の皮膚外用剤。
【請求項８】
医薬品である、請求項４に記載の皮膚外用剤。
【請求項９】
白髪予防用医薬品である、請求項４に記載の皮膚外用剤。
【請求項１０】
チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質の製造方法であって、
発酵ステビアの抽出液を分画してエタノール可溶画分を得る第１分画工程と、
前記エタノール可溶画分をさらに分画して脂溶性画分を得る第２分画工程と、
を含むチロシナーゼ活性物質の製造方法。
【請求項１１】
前記第１分画工程の前段に、
乾燥したステビア植物組織に酵母および水を加えて発酵させる発酵工程と、
前記発酵工程により得られた発酵ステビアからエタノール水溶液を用いて抽出を行い、前記抽出液を得る抽出工程と、
を含む請求項１０に記載のチロシナーゼ活性物質の製造方法。
【請求項１２】
前記第１分画工程において得られるエタノール可溶画分は、３０〜１００％エタノール可溶画分である請求項１０または１１に記載のチロシナーゼ活性物質の製造方法。
【請求項１３】
発酵ステビアの抽出液を分画することにより得られるエタノール可溶画分をさらに分画して得た脂溶性画分を含む、チロシナーゼを活性化させるチロシナーゼ活性物質。
【請求項１４】
請求項１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法により製造された、チロシナーゼ活性物質を含む、医薬品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−１３６９７６（Ｐ２０１１−１３６９７６Ａ）
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７５１０（Ｐ２０１０−１７５１０）
【出願日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 日本研究皮膚科学会 第３４回年次学術大会．総会 会頭 橋本 隆 刊行物名 日本研究皮膚科学会 第３４回年次学術大会．総会 プログラム・抄録集 Ｔｈｅ ３４ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ＰＲＯＧＲＡＭ 発行年月日 平成２１年１１月１０日
【出願人】（５９９０４７１２５）株式会社シャローム (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 日本研究皮膚科学会 第３４回年次学術大会．総会 会頭 橋本 隆 刊行物名 日本研究皮膚科学会 第３４回年次学術大会．総会 プログラム・抄録集 Ｔｈｅ ３４ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ＰＲＯＧＲＡＭ 発行年月日 平成２１年１１月１０日
【出願人】（５９９０４７１２５）株式会社シャローム (5)
【Ｆターム（参考）】
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