メラノーマ標的温熱免疫療法治療剤
【課題】本発明は、磁気微粒子が有する腫瘍細胞に対する温熱免疫効果と、システアミニルフェノール誘導体が有する殺腫瘍細胞効果を相乗的に発現させることにより、従来のメラノーマ治療法の概念とは全く異なる新しい、化学・温熱免疫ナノメディシン療法に使用することができるメラノーマ標的温熱免疫治療剤を提供することを課題とする。
【解決手段】次式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ8のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ8のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１〜５までの整数を表す。ただしｎが１のとき、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が同時に水素原子であることはない。）で表されるシステアミニルフェノール誘導体と、磁性微粒子（磁気ナノ粒子）、または磁性微粒子（磁気ナノ粒子）を内包するリポソームとの重合体を有効成分とすることを特徴とするメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【解決手段】次式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ8のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ8のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１〜５までの整数を表す。ただしｎが１のとき、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が同時に水素原子であることはない。）で表されるシステアミニルフェノール誘導体と、磁性微粒子（磁気ナノ粒子）、または磁性微粒子（磁気ナノ粒子）を内包するリポソームとの重合体を有効成分とすることを特徴とするメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノーマ（悪性黒色腫）を特異的に標的し、メラノーマ細胞に対する殺細胞効果と、磁気微粒子を用いる温熱免疫効果を相乗的に発揮する、特異的メラノーマ治療に使用するメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本においてメラノーマ（悪性黒色腫）患者は急速に増加する傾向にある。メラノーマは早期から転移を起しやすく、これら転移性癌を持った患者に対し現時点では全ての治療法が無効に等しい。
【０００３】
すなわち、メラノーマは、全身の皮膚、粘膜のみならず、目、脳、脊髄等の臓器に発生する癌であり、本症の発生は、近年加速度的に上昇している。予後は極めて悪く、病初期から皮膚、リンパ節、肺、肝、脳等への転移をとる。この治療に対しては、外科的療法以外に手段はなく、外科的手術後に抗癌剤を使用せざるを得ない。しかしながら、抗癌剤による激しい副作用のため、抗癌剤自体の使用が制限される場合も多い。
【０００４】
一方、癌の別の治療方法として温熱療法（ハイパーサーミア）が行われている。これは、腫瘍（癌）細胞が正常細胞に比較して熱に弱いという性質を利用した治療法である。多くの腫瘍細胞は体温から僅かに高い温度領域（４２．５℃〜４５℃）において正常細胞より温度感受性が高く、温度が高ければ高いほど腫瘍細胞は殺傷されるという性質を利用して、腫瘍細胞を加温殺傷させる治療法である。
【０００５】
現在広く用いられている温熱療法は、電極で身体を挟んでラジオ波を印加する誘電加温法である。しかしながら、この加温法では、腫瘍細胞を充分に殺傷する温度に加温する前に、正常細胞が火傷をしてしまい、患者の苦痛で加温を中止しなければならない欠点がある。
【０００６】
そこで最近、磁性微粒子、特にマグネタイトを発熱素子とした温熱療法が検討されてきている。マグネタイトは、Ｆｅ3Ｏ4酸化鉄（磁鉄鉱）のコロイドであり、高周波磁場内で発熱し、この発熱効果により熱ショック蛋白９０（温熱免疫蛋白；Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＨＳＰ９０）産生による腫瘍免疫効果を発現することが知られている。そこで、マグネタイトを選択的に腫瘍細胞へ集積させるため、リポソーム膜の表面に四級アミンなどの正電荷官能基を持たせたカチオニックリポソームを利用し、このリポソームにマグネタイトを封入したマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）を作成し、腫瘍局所投与による腫瘍へのターゲティングが検討され、腫瘍細胞のみを選択的に加温殺傷させる試みが行われている（非特許文献１）。
【０００７】
しかしながら、ＭＣＬは、中性付近でも正電荷をもっており、腫瘍細胞への選択性はなく、貪食能があるすべての細胞に取り込まれることから、腫瘍組織への局所注入による以外、すでに遠隔転移を含めた腫瘍細胞を標的とした全身的治療ができないという欠点を有している。そのため、抗体を用いた腫瘍組織への選択性をもたせるという試みがなされているが、臨床的応用には問題があり、また抗体結合磁性粒子内包リポソームの作成は複雑である等の欠点を有している。
【０００８】
ところで本発明者は、メラノーマ細胞の分化形質発現のキー酵素として知られているチロシナーゼの基質となるある種のシステアミニルフェノール誘導体が、メラノーマ細胞に選択的に取り込まれ、直接殺細胞効果を有することを見出してきている（特許文献１）。
【０００９】
すなわち、メラニン形成経路は全てのメラノーマ細胞にとり特異な分化形質であり、癌化と共に異常に亢進する。本発明者が提案しているシステアミニルフェノール誘導体は、メラニン形成酵素であるチロシナーゼの基質となり、このシステアミニルフェノール誘導体がメラノーマ細胞に選択的に接着して取り込まれ、その場で直接殺細胞効果を発揮するものである。
しかし、このような殺腫瘍細胞効果と、前記の温熱免疫効果との両者を備える治療剤は、これまで開発されていなかった。
【００１０】
【特許文献１】特許第３１７８８３４号公報
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｋａｉ Ｍ．ら：Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，８７：１１７９−１１８３（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって本発明は、従来のメラノーマ治療法の概念とは全く異なる新しい、化学・温熱免疫ナノメディシン療法に使用することができるメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた。その結果、前記したシステアミニルフェノール誘導体の有するメラノーマ細胞への選択性を利用し、温熱殺細胞効果を有する磁気微粒子、特にマグネタイトに前記誘導体を固定化する新しい選択的ナノ・ドラッグ・デリバリー・システムを開発するに至った。前記システムによれば、システアミニルフェノール誘導体が有するメラノーマ細胞への特異的な選択性に基づき、メラノーマ細胞に対する特異的な殺細胞効果と、マグネタイトの磁場照射に伴う温熱発生による殺細胞効果と免疫効果が相乗的に発揮され、従来の概念にない特異的なメラノーマ治療法を行い得るものといえる。
【００１３】
かかる考え方を基に、本発明者は、システアミニルフェノール誘導体を磁気微粒子、特にマグネタイト、あるいは磁気微粒子を包含するリポソームに固定化して、実際にメラノーマ細胞標的ナノ粒子を作成した。係る粒子が、メラノーマ細胞にｉｎ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏの両者で一定の細胞膜表面レセプターと思われる機構を介して選択的に取り込まれ、取り込まれたシステアミニルフェノール誘導体が単独で殺細胞効果を発揮することを確認し、さらに、かかる選択的ナノ・ドラッグ・デリバリー・システムによる温熱療法は、従来の誘電加温型と異なり、癌に指向性を持つ磁気微粒子だけが発熱する周波数を交番磁場発生装置によって照射することで、メラノーマに特異な加温が可能であることを確認し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
かかる課題を解決するための本発明は、その基本的態様として、次式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ8のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ8のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１〜５までの整数を表す。ただしｎが１のとき、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が同時に水素原子であることはない。）
で表されるシステアミニルフェノール誘導体と、磁性微粒子、または磁性微粒子を内包するリポソームとの重合体を有効成分とすることを特徴とするメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
より具体的には、本発明は、前記磁性微粒子がマグネタイトであることを特徴とする上記メラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
さらに具体的には、本発明は、前記式（Ｉ）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ6のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ6のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１または２の整数である上記メラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
さらに具体的には、本発明は、前記式（Ｉ）中、Ｒ1が水素原子又はメチル基であり、Ｒ2が水素原子又はメチル基であり、Ｒ3がメチル基、アセチル基又はプロピオニル基である上記メラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
より具体的には、本発明は、前記重合体において、前記磁性微粒子又は前記リポソーム間の結合が活性化架橋結合基およびメルカプト基との結合を介しており、前記メルカプト基は前記式（Ｉ）の末端に付加されてなるものであるメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤であり、なかでも前記活性化架橋結合基が、マレイミド基であるメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明が提供する治療剤により、これまで外科的手術による治療しか手段の無かったメラノーマ治療に対して、化学薬剤としての殺腫瘍効果と、磁場照射による温熱殺腫瘍効果を相乗的に発揮させることが可能となり、患者に対して外科的手術の侵襲を回避しうる、極めて特異的なメラノーマ治療法を確立することができる利点を有している。
さらに、本発明の治療剤によれば、単にメラノーマ細胞を選択的に熱死滅させる効果を有するのみならず、熱ショック蛋白を介し、細胞障害性Ｔ細胞を活性化し、遠隔転移癌に対しても細胞破壊の腫瘍免疫を行うことが出来る利点を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、前記した式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール（ｃｙｓｔｅａｍｉｎｙｌ ｐｈｅｎｏｌ）誘導体と、磁性微粒子（磁気ナノ粒子）との直接重合体、または磁性微粒子（磁気ナノ粒子）を内包（包理）するリポソームとの重合体を有効成分とすることを特徴とするメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
【００１７】
式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体は、メラノーマ細胞指向性を有し、メラノーマに対して直接的な殺細胞効果を発揮する。すなわち、メラニン形成酵素であるチロシナーゼの基質であるチロシンにイオウを結合させたアミン誘導体である。
【００１８】
かかるシステアミニルフェノール誘導体の中でも、本発明にあっては、式（Ｉ）で表されるシステアミニルフェノール誘導体が用いられる。式（Ｉ）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ8のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ8のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１〜５までの整数を表す（ただしｎが１のとき、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が同時に水素原子であることはない。）。特に、式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ6のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ6のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１または２の整数を表す（ただしｎが１のとき、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が同時に水素原子であることはない。）構造からなるシステアミニルフェノール誘導体が好ましい。この場合において、式（Ｉ）中のアミノ基における置換基の一つであるアルカノイル基は、細胞膜親和性を高める性質の置換基である。なお、本発明の式（Ｉ）で表されるシステアミニルフェノール誘導体は、特許第３１７８８３４号公報に記載の方法によって製造することができる。
【００１９】
そのなかでも、Ｒ1が水素原子又はメチル基であり、Ｒ2が水素原子又はメチル基であり、Ｒ3がメチル基、アセチル基又はプロピオニル基であるシステアミニルフェノール誘導体等が好ましい。具体的には、Ｎ−アセチル−４−Ｓ−システアミニルフェノール、Ｎ−プロピオニル−４−Ｓ−システアミニルフェノール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−Ｓ−システアミニルフェノール、４−Ｓ−ホモシステアミニルフェノール、α−メチル−４−Ｓ−システアミニルフェノール等を挙げることができる。
【００２０】
本発明にあっては、そのようなシステアミニルフェノール誘導体の中でも、Ｒ1が水素原子であり、アミノ基における置換基であるアルカノイル基として、式中Ｒ2が水素原子であり、Ｒ3がアセチル基又はプロピオニル基であるシステアミニルフェノール誘導体が、メラノーマ細胞に対する特異的親和性を顕著に発揮する点で、好ましい。
このものは、具体的には、次式（Ｉ−ａ）で示されるＮ−アセチル−４−Ｓ−システアミニルフェノール（以下、「ＮＡｃＣＡＰ」と略記する場合もある）、及び（Ｉ−ｂ）で示されるＮ−プロピオニル−４−Ｓ−システアミニルフェノール（以下、「ＮＰｒＣＡＰ」と略記する場合もある）である。
【化２】
【化３】
そのなかでも、ＮＰｒＣＡＰが特にメラノーマ細胞に対する親和性と殺細胞効果に優れ、好ましく使用される。
【００２１】
一方、本発明にいう磁性微粒子（磁気ナノ粒子）は、高周波磁場でシステリシス損によって発熱する。このシステリシス損による発熱は、磁性微粒子の粒子径に依存することが知られている。本発明にあっては、腫瘍細胞に指向性を有する磁性微粒子だけが発熱する周波数を、交番磁場発生装置により照射することで、メラノーマ細胞に特異的な加温を与えることが可能となる。
【００２２】
交番磁場とは、変動磁場の一種であり、磁力が時間とともに変化するものである。すなわち交番磁場とは、電磁石に交流を流してつくった磁場をいい、磁力は強くなったり、弱くなったり、またＮ極とＳ極は一定のリズムで方向が逆向きになる特異性を有する磁場である。かかる交番磁場の照射により、本発明のメラノーマ細胞に集積された磁性微粒子のみが特異的に発熱する。
【００２３】
磁性微粒子の平均粒子径は５〜２５ｎｍであることが好ましく、より好ましくは１０ｎｍ程度であるのがよい。平均粒子径が５ｎｍ未満であると、磁性微粒子は超常磁性（ＳＰＩＯ）となりシステリシス損が生じず、したがって発熱が生じにくくなるおそれがある。また、粒子径が２５ｎｍを超える場合には、粒子自身の磁気により凝集が生じ磁性微粒子のコロイド、例えばマグネタイトコロイドの水分散性が損なわれ、リポソームへ包理することができなくなることがある。なお、磁性微粒子の平均粒子径は透過型電子顕微鏡観察によって測定される粒子径を平均することで求めることができる。
【００２４】
上記のシステアミニルフェノール誘導体を固定する磁性微粒子としては、鉄、コバルト、ニッケル等の化合物の他、マグネタイトが挙げられる。そのなかでもマグネタイト（以下、「Ｍ」と記す場合もある）が好ましく使用される。
【００２５】
本発明が提供する治療剤にあっては、上記磁性微粒子と、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体を直接重合させて得たもの、或いは磁性微粒子を内包（包理）するリポソームと重合させて得たものの両者を使用することが可能である。そのなかでも、上記磁性微粒子と直接重合して得たもの、特にマグネタイトと直接重合して得たものは、室温保存に安定な治療剤として得ることができ、好ましい。
【００２６】
一方、磁性微粒子を内包（包理）するリポソーム、すなわちマグネトリポソーム（以下、「ＭＬ」と記す場合もある）は、磁性微粒子をリン脂質で被覆したものである。リン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸等の脂質の単独あるいはこれらの混合物が挙げられる。これらのうち、特にホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールの単独又はこれらの混合物が好ましい。それらの中でも、ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンを、モル比でそれぞれ２：１となるように混合した混合物を使用するのがよい。
【００２７】
本発明が提供する治療剤にあって、その有効成分は、磁性微粒子、或いは磁性微粒子を内包するリポソームと、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体とが重合したものである。この重合にあっては、磁性微粒子或いは磁性微粒子を内包するリポソームの表面に結合させた活性化架橋結合基を介して、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体を重合することができる。
【００２８】
そのような活性化架橋結合基としては、例えば、メルカプト基（ＳＨ基）と結合し得るものを挙げることができる。中でも、マレイミド基を有する活性化架橋結合基が好ましい。マレイミド基を有する活性化架橋結合基としては、例えば次式（Ａ）〜（Ｃ）で示されるものを挙げることができる。
【化４】
（式中、ｍ、ｎ、及びｐは１〜６の整数を表す）
【００２９】
一方、上記のような活性化架橋結合基を介する重合の場合、更に式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体側には、活性化架橋結合基と重合結合する官能基が付加されることが好ましい。このような官能基としては、活性化架橋結合基がマレイミド基を有する活性化架橋結合基の場合、マレイミド基の二重結合と重合結合する官能基が挙げられる。具体的には、メルカプト基が好ましい。
【００３０】
式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体が前記した次式（Ｉ−ａ）で示されるＮ−アセチル−４−Ｓ−システアミニルフェノール（ＮＡｃＣＡＰ）、及び（Ｉ−ｂ）で示されるＮ−プロピオニル−４−Ｓ−システアミニルフェノール（ＮＰｒＣＡＰ）のそれぞれである場合を例にとり説明すると、以下の通りである。まず、それぞれの化合物の、例えばアセチル基或いはプロピオニル基の末端に、メルカプト基を付加導入し、次式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）：
【化５】
で示される化合物へ誘導する。その後、上記した活性化架橋結合基、すなわちマレイミド基の二重結合とメルカプト基との重合結合により、マグネタイト（Ｍ）或いはマグネタイトを内包するリポソーム（ＭＬ）と重合されることとなる。
【００３１】
磁性微粒子がマグネタイト（Ｍ）の場合、マグネタイトに式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体を直接重合させたものは、より具体的には、以下の方法により調製することができる。
例えば、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体がＮＰｒＣＡＰであり、磁性微粒子がマグネタイトである場合を具体例として記載すると以下の通りである。まず、マグネタイトの表面に上記の活性化反応性架橋基（Ｂ）を有する直接結合型マグネタイトを得る。この直接結合型マグネタイトを水中に懸濁させ、そこに末端にメルカプト基を有する上記（ＩＩＩ）のシステアミニルフェノール誘導体を加え室温下に攪拌する。その後、冷所に一夜放置し、遠心後ミリＱ水による洗浄を繰り返し、最後にミリＱ水中に懸濁させる。こうして、ＮＰｒＣＡＰがマグネタイトに直接重合した重合体、すなわちＮＰｒＣＡＰ／Ｍを調製することができる。
【００３２】
なお、マグネタイトの表面に上記の活性化反応性架橋基（Ｂ）を有する直接結合型マグネタイト、すなわちマレイミド基が導入されたマグネタイトは、例えば以下のようにして得ることができる。まず、マグネタイトを水に分散させ懸濁させ、水分散マグネタイトの懸濁液を得るこの懸濁液に、アミノシランカップリング剤、例えば３−アミノプロピルトリエトキシシランを攪拌下に滴下し、室温で反応させる。その後、遠心分離して上清液を除き、更にミリＱ水にて数回の洗浄を行った後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）に置き換える。続いて、この溶液にＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）のＰＢＳ溶液を加え、激しく攪拌し反応させ、遠心分離して上清液を除く。更にミリＱ水にて数回の洗浄を行い、直接結合型マグネタイトを調製することができる。
【００３３】
また、磁性微粒子を内包するリポソームと式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体を重合させて得たもの、例えば、ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬは具体的には、以下のようにして調製することができる。
リポソームは、形態学的に小さな１枚膜リポソーム（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＳＵＶ）と大きな１枚膜（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＬＵＶ）と多重層リポソーム（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ:ＭＬＶ）に分類されるが、ＳＵＶが一般に最も頻用される。本発明においても、ＳＵＶを使用するのが好ましい。
先ず、脂質（リポソーム；ＳＵＶ）を溶媒、例えば、クロロホルムに溶解し、上記式（ＩＩＩ）で示されるプロピオニル基の末端にメルカプト基を有するＮＰｒＣＡＰを加え反応を行う。続いて、溶媒を減圧除去した後、脂質のフィルムにマグネタイト水溶液を入れてボルテックスし、超音波処理を、例えば３０分間程度行うことによりＮＰｒＣＡＰ／ＭＬを調製することができる。
【００３４】
また、別法として、マグネタイトを内包するリポソームの表面に活性化反応性架橋基、例えば、式（Ａ）を有する直接結合型マグネタイト内包リポソーム、すなわちマレイミド基が導入されたマグネタイト内包リポソームを先に調製してから、それと上記式（ＩＩＩ）で示されるプロピオニル基の末端にメルカプト基を有するＮＰｒＣＡＰを加え反応を行い、ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬを調製することもできる。
具体的には、まず、リン脂質としてホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、並びに活性型リン脂質（活性型反応性架橋基を有するリン脂質）、例えばジパルミトイル型ホスファチジルエタノールアミン−プロピルマレイミド（ＤＰＰＥ−プロピルマレイミド：日本油脂社製）を、溶媒、例えばクロロホルムに混合、溶解させる。溶媒を留去した後、半日以上冷所にて乾燥保存する。その後、これに水分散マグネタイトを加え、激しくボルテックス等で撹拌し、その後超音波処理を行う。こうして、マグネタイトを内包するリポソームの表面に活性化反応性架橋基を有する直接結合型マグネタイトリポソームを調製することができる。
次いで、この溶液に、上記式（ＩＩＩ）で示される、プロピオニル基の末端にメルカプト基を有するＮＰｒＣＡＰを加え、室温にて１０分間程度攪拌反応させる。続いて、冷所（４℃程度）に一夜放置した後、３０００ｒｐｍ／分で遠心分離し、ミリＱ水で洗浄し、ミリＱ水中に懸濁させる。こうして、ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬを調製することができる。
【００３５】
なお、本発明の式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体として、４−Ｓ−システアミニルフェノール（４−Ｓ−ＣＡＰ）を、直接マグネタイトを内包するリポソームと重合することも可能である。
例えば、ＴＭＡＧ（相互薬工社製）、ＤＬＰＣ（日本油脂社製）、ＤＯＰＥ（日本油脂社製）及び４−Ｓ−ＣＡＰの所定量を溶媒、例えばメタノール中に混合、溶解させ溶媒を留去下後、冷所（４℃程度）にて乾燥保存を行う。次いで、これに予め洗浄して濃度を調整した水分散マグネタイトの水懸濁液を加え、激しくボルテックスし、さらに超音波処理を行うことにより調製することもできる。
【００３６】
以上のようにして得られた本発明が提供する治療剤は、具体的には、以下の特色を有する。
すなわち、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体の特徴としては、
低分子アミノ酸のイオウ誘導体であり、細胞内への取り込みに問題がない；
また、チロシンよりＶｍａｘ、Ｋｍにおいてはるかに高いメラニン形成の基質であり、メラニン形成細胞に選択的に、かつ非可逆的に細胞膜リセプターと考えられる機構を介し細胞膜に接着し、その後細胞内に取り込まれる；
チロシナーゼ・メラニン形成は臨床的に無色素産生メラノーマでも常に存在し、癌化と共に異常に亢進する。すなわちメラノーマ細胞に正常細胞（メラノサイト）と比較しより高く取り込まれる；
イオウは細胞膜親和性を高める；
従来標的として用いられた抗体と異なり、人体にとり異種蛋白ではなく、頻回使用しても無害である；
等の特色が挙げられる。これらの特色は、本発明の治療剤の特色でもあり、磁気微粒子が有する腫瘍細胞に対する温熱免疫効果とともに相乗的に発現される効果である。
【００３７】
また、本発明が提供する治療剤として、磁性微粒子を内包するリポソームを用いる場合には、標的化可能な因子との組み合わせで癌細胞への特異的ターゲティングが可能である。リポソームであるので、例えば、本発明の式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体であるＮＰｒＣＡＰを介し、細胞内へ容易に取り込まれ得る。
一度細胞内に取り込まれ、人体に無浸襲で加温された場合には、ｉｎ ｓｉｔｕで最も効率的に、熱ショックたんぱく質（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＨＳＰ）等を介し細胞破壊を行い得るものであり、結果として直接の細胞殺効果のみならず、ＨＳＰの結果、間接的に細胞傷害性Ｔ細胞・サイトカイン等を刺激し遠隔転移巣に対し免疫療法も誘導し得るものである。
【００３８】
本発明の治療剤を使用するメラノーマの治療は、以下のようにして実施される。例えば本発明の式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体としてＮＰｒＣＡＰを用いた場合には、生理的食塩水に可溶化された４％のＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ、又はＮＰｒＣＡＰ／Ｍを皮下の癌組織内に注射する（一回注射総量２ｍＬ程度が好ましい）。または、親水軟膏基材に溶かした１０〜２０％のＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ、又はＮＰｒＣＡＰ／Ｍ軟膏を、癌組織直上部の皮膚に密封療法（ＯＤＴ）で２４時間塗布する。
【００３９】
注射２４時間後、または密封療法終了直後、磁場照射を行う。これ等の投与と磁場照射は隔日に３回行うのがよい。その後腫瘍組織は外科的処置にて全切除を行う。外科的手術時には、同時に加療後の免疫反応を検索するために領域リンパのセンチネルリンパ節生検を行う。
【００４０】
この治療方法は、具体的には以下に記載するマウスを用いた動物実験の結果に基づくものである。
対象動物としてマウス（Ｃ５７ＢＬマウス、４週目、メス）を各群７匹使用し、それぞれにメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１）を移植した。移植後９日目から４％のＮＰｒＣＡＰ／Ｍを１日３回連続３日間投与した群（その後の磁場照射を行わない群）を群ＩＩとした。また、同様に４％のＮＰｒＣＡＰ／Ｍを１日３回連続３日間投与し、更に磁場照射（周波数１１８ｋヘルツ；保磁力３０．８ｋＡ/ｍｅｔｅｒ）投与日から５日間連続して行った群を群ＩＩＩとした。更に何も処理をしないコントロール群を群Ｉとした。群Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを比較すると、群ＩＩでは、コントロール群（群Ｉ）と比較して注射直後に、統計的に優位に癌組織の増殖抑制が認められたが（ＮＰｒＣＡＰ／Ｍ自体には抗癌作用を有する）、更に磁場照射を行うと（群ＩＩＩ）、群ＩＩ及びコントロール群（群Ｉ）よりはるかに有効な癌組織の増殖抑制効果を示し、多くの実験マウス（７匹中６匹）において、癌組織の完全な消失が認められた。
【００４１】
さらに興味を引くことは、上記実験後（群ＩＩＩについては磁場照射後）の各実験マウス群において、メラノーマ細胞を移植しなかった反対側の正常皮膚にメラノーマ癌組織を移植したところ、コントロール群（群Ｉ）ではメラノーマの増殖が認められたのに、群ＩＩＩの磁場照射群の実験マウスでは、メラノーマの増殖拒絶が認められ、メラノーマが発生しなかった。
このことは、磁場照射後に生ずる温熱ショック蛋白を介した腫瘍拒否免疫機構が実験マウス群に生じたことを示すものである。
【００４２】
上記の動物実験に基き、実際のヒトに対して用いる場合には、以下の方法で行うことが可能となる。
すなわち、皮膚メラノーマ原発、転移巣に対し、ＮＰｒＣＡＰ／ＭまたはＮＰｒＣＡＰ／ＭＬを軟膏に混ぜ（好ましくは、１０％軟膏碁剤をテープストリッピングに表皮角層を剥離後塗布）、封鎖密封療法（ＯＤＴ療法）にて１２時間塗布する。
或いは、直接マイクロインジェクターで腫瘍内に注射（好ましくは４％濃度・生食液）し、投与後２４時間後に磁場照射（具体的条件としては、例えば、ｆｉｅｌｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ＝１１８ｋＨｚ；ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ＝３０．６ｋＡ／ｍ；３８４ Ｏｅ）を隔日に、３回行い、２４時間後に全切除する。
【００４３】
本発明の治療剤の治療効果に関しては、前記実験の群ＩＩＩのマウスにおける予備動物実験にて、３回の薬剤投与と磁場照射により腫瘍はほぼ消失することが判明している。また磁場照射を５回行うと腫瘍は完全に消失している。
しかしながら、患者の温熱免疫効果を発現させるためには、腫瘍を少し残すところまで本発明の治療剤および磁場照射を用いた治療を施した後、腫瘍免疫を高め、その後に腫瘍を外科的切除により完全に除去するのがよい。
【００４４】
本発明が提供する治療剤の剤形としては、外用剤として皮膚外用には親水軟膏基剤を用いるのが好ましく、製剤学的に汎用されている親水基剤を用いて、常法にしたがって軟膏剤を調製することができる。
また、局所投与に際しては注射による溶液投与が好ましく、通常の生理的食塩水を用い、投与するのがよい。
なお、外用軟膏剤を皮膚表面に塗布する前、ストリッピングで表皮のバリアーを省き、密封療法（１２時間）を用い行うのが好ましい。局所投与は微量注入ポンプを用い、４％ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬの場合、２ｍＬを３０分程度かけて、また、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍの場合には、５分程度をかけて投与するのがよい。
【００４５】
本発明が提供する治療剤は、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体自体の抗癌作用と、磁性微粒子、或いは磁性微粒子内包リポソームを用いた温熱による細胞殺効果に加えて、温熱照射に基づく熱ショック蛋白（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）を介した温熱免疫効果が期待できるものである。
【００４６】
事実、マグネタイト内包リポソームを用い、磁場照射を行ったマウス・グリオーマはＨＳＰ７０を介し、抗腫瘍免疫を起し、治療グリオーマの反対側の無治療グリオーマを消失させるものであった。
【００４７】
本発明が提供する治療剤による癌免疫の誘導は、次のようにして行われるものと推測される。まず、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体、例えば、ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ、或いはＮＰｒＣＡＰ／Ｍをメラノーマ細胞にとりこませ、磁場をあてることにより、細胞内でマグネタイトが発熱し、細胞が壊死に陥る。この際、壊死細胞から、ＨＳＰ−癌抗原ペプチド複合体が放出され、ＨＳＰレセプターにより樹状細胞にとりこまれ、ＭＨＣ分子にペプチドが提示され、メラノーマ特異的なｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌを誘導し、獲得免疫を誘導するものと考えられる。またｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒを介して、サイトカインの産生を増加させ、免疫細胞を活性化することにより、自然免疫が活性化される。本発明においては、このような獲得免疫の誘導および自然免疫の活性化の２点により、癌免疫が誘導されるものといえる。
【００４８】
本発明が提供する治療剤による腫瘍免疫機構としては、以下の２経路が考えられる。その主たるものはメラノーマ細胞質に存在するＨＳＰはＴＹＲＰ−Ｉなどのメラノーマ特異癌抗原からプロテアソームにより生成された抗原ペプチドと結合し、癌抗原ペプチドを小胞体へ運ぶシャペロンの役割を果たす経路が挙げられる。
ＨＳＰによって小胞体へ運ばれた癌抗原ペプチドは、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子に受け渡され、このＭＨＣ ｃｌａｓｓ ｉ−癌抗原ペプチド複合体はゴルジ体をへて、細胞表面上に発現し、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌに認識される。
一方、メラノーマ細胞に熱などのストレス負荷、あるいは細胞死が起こった場合、ＨＳＰ−ペプチド複合体（ＨＳＰ結合ペプチド）は細胞外に放出され、樹状細胞に結合もしくはとりこまれて、樹状細胞を活性化する。同時に、ＨＳＰ結合ペプチドは、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ｉ分子によって提示され、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌを誘導すると考えられる。
【００４９】
これまでにＨＳＰにはいくつかの種類があることが知られており、これらのうちＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６の３つが癌免疫に関与していることが報告されている。本発明者等は、予備実験にてＢ１６Ｆ１のメラノーマ細胞にＣＡＰ／ＭＬ、ＭＬを取り込ませ、磁場をかけて、上清をＥＬＩＳＡ法にかけＨＳＰを特定した。例えば、ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ ２００μｇに温熱を加え培養すると、４６時間後にはＨＳＰ７０の放出を認めた。同様にＨＳＰ９０の放出も認められた。
【００５０】
さらに、本発明者等は、実際の人での治療法に順じ、予備動物実験で前記動物実験で準備したものと同様のＢ１６Ｆ１メラノーマ担癌マウスに、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体であるＮＰｒＣＡＰ／Ｍを前記実験群ＩＩＩと同様に投与し、磁場照射（周波数１１８ｋヘルツ；保磁力３０．８ｋＡ/ｍｅｔｅｒ）をＮＰｒＣＡＰ／Ｍの投与日から３日間連続して行い、その後腫瘍を完全に切除し、その後再度同一マウスにＢ１６Ｆ１メラノーマを接種したところ、コントロールは腫瘍の発育をみたが、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍ投与加療群、及びＮＰｒＣＡＰ／Ｍ投与／磁場照射加療群のいずれにおいても、再チャレンジしたＢ１６Ｆ１メラノーマの発育阻止が認められた。
【００５１】
興味を引くことは、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍのみ投与で磁場照射を行わない加療群においても、弱いながら抗メラノーマ発育抑制効果が認められたが、何よりもＨＳＰを介した抗腫瘍免疫が認められ、再チャレンジしたメラノーマの拒絶反応が認められた。このことは、本発明の式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体、例えば、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍ自体にもＨＳＰを介した癌拒絶免疫機構が存在することを示しているものであり、本発明の特異性がよく理解される。
【実施例】
【００５２】
以下に本発明を、具体的実施例を示すことにより、より詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１：１−メルカプトプロピオニル−４−Ｓ−ＣＡＰ（ＮＰｒＣＡＰ）の合成
【化６】
【００５４】
［第一工程］
Ｐａｄｇｅｔｔｅらの文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２７：１３５４−１３５７，１９８４）に従い、４−メルカプトフェノールと２−メチル−２−オキサゾリンを２時間還流させ、Ｎ−アセチル−４−Ｓ−システアミニルフェノールを、再結晶後７０％の収率で結晶として得た。
【００５５】
次いで、このものを６Ｍ−塩酸水溶液で３時間還流させ、目的物の４−Ｓ−システアミニルフェノール（４−Ｓ−ＣＡＰ）を、再結晶後８０％の収率で得た。
【００５６】
［第二工程］
上記で得た４−Ｓ−システアミニルフェノール（４−Ｓ−ＣＡＰ）を、Ｎ−スクシンイミジル−３−（（２−ピリジル）ジチオ）プロピオネートとピリジン中室温下に２時間反応させた後、薄層クロマトグラフィーで精製した。得られた生成物をメタノール中ジチオトレイトールと室温下で２時間反応させ、目的物質である、１−メルカプトプロピオニル−４−Ｓ−ＣＡＰ（ＮＰｒＣＡＰ）を薄層クロマトグラフィーで精製後、４０％の収率（２段階）で得た。
【００５７】
実施例２：活性化反応性架橋基を有する直接結合型マグネタイト内包リポソーム（ＭＬ）の合成
リン脂質であるホスファチジルコリン１０ｍｇ（ＳＩＧＭＡ社製）、ホスファチジルエタノールアミン４．５ｍｇ（東京化成社製）と、活性型リン脂質であるＤＰＰＥ−プロピルマレイミド２ｍｇ（日本油脂社製）を５００μＬのクロロホルムに混合、溶解させ、溶媒を留去した後、半日以上４℃のデシケーターにて乾燥保存し、これに平均粒子径１０ｎｍのマグネタイト（戸田工業株式会社製）で４０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した水分散マグネタイトを２ｍＬ加え、激しくボルテックスし、その後超音波処理（２８Ｗ）２０分間を行い、下式で示される、マグネタイトを内包する１重膜のリポソーム（ＭＬ）の表面に活性化反応性架橋基（Ａ）を有する直接結合型マグネタイト内包リポソームを得た。
【化７】
【００５８】
実施例３：活性化反応性架橋基を有する直接結合型マグネタイト（Ｍ）の合成
実施例２で用いたものと同様の４０ｍｇ／ｍＬの濃度の水分散マグネタイトの懸濁液１０ｍＬをスターラーで攪拌しながら、アミノシランカップリング剤として３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＴＣＩ）を１００μＬ滴下し、６０分間室温で反応させた後、２，５００ｒｐｍで２分間遠心分離して上清液を除き、更にミリＱ水にて３回の洗浄を行った後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）に置き換え、この溶液にＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）のＰＢＳ溶液を加え、激しく攪拌し反応させ、遠心分離して上清液を除き、更にミリＱ水にて３回の洗浄を行い、１０ｍＬのミリＱ水を加えることで、下式で示される、活性化反応性架橋基（Ｂ）を有する直接結合型マグネタイト（Ｍ）を得た。
【００５９】
【化８】
【００６０】
実施例４：Ｎ−（１−メルカプトプロピオニル−４−Ｓ−ＣＡＰ結合型マグネタイト内包リポソーム（ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ）の合成
リポソームの表面に活性化反応性架橋基（Ａ）を有するマグネタイト内包リポソーム（ＭＬ）の４０ｍｇ／ｍＬに、実施例１で得たＮＰｒＣＡＰを１ｍｇ加えて、室温で１０分間攪拌後、４℃の冷蔵庫で一晩放置した。その後、３，０００ｒｐｍ／分で遠心し、沈殿物をミリＱ水による洗浄を３回繰り返した後、ミリＱ水１０ｍＬで懸濁させ、目的とするマレイミド基にＮＰｒＣＡＰが結合したＮＰｒＣＡＰ／ＭＬを得た。
【化９】
【００６１】
実施例５：ｎ−（１−メルカプトプロピオニル−４−Ｓ−ＣＡＰ直接結合型マグネタイト（ＮＰｒＣＡＰ／Ｍ）の合成
マグネタイトの表面に活性化反応性架橋基（Ｂ）を有する直接結合型マグネタイト（Ｍ）の４０ｍｇ／ｍＬに、実施例１で得たＮＰｒＣＡＰを１ｍｇ加えて、室温で１０分間攪拌後、４℃の冷蔵庫で一晩放置した。その後、３，０００ｒｐｍ／分で遠心し、沈殿物をミリＱ水による洗浄を３回繰り返した後、ミリＱ水１０ｍＬで懸濁させ、目的とするマレイミド基にＮＰｒＣＡＰが結合したＮＰｒＣＡＰ／Ｍを得た。
【化１０】
【００６２】
実施例６：ＮＰｒＣＡＰのマグネタイトへの取り込み量の測定
ＮＰｒＣＡＰのマグネタイトへの取り込み量は、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍを６Ｍ−塩酸（５％チオグリコール酸を含む）で１１０℃、１．５時間反応させ、生成する４−Ｓ−ＣＡＰ量をＨＰＬＣで定量することにより測定した。
【００６３】
その結果、マグネタイト１ｍｇあたり６１０ｎｍｏｌのＮＰｒＣＡＰが結合していることがわかった。
【００６４】
ＨＰＬＣの分析条件
カラム：Ｃａｐｃｅｌ ｐａｋ（Ｃ18)、
移動相：メタノール：水：１Ｍ−ＨＣｌＯ4（用量比で１０：９０：１．５）、
流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ、
検出器：ＵＶ（２５０ｎｍ）、
カラム温度：５０℃
【００６５】
実施例７：ＮＰｒＣＡＰのチロシナーゼ酸化
ＮＰｒＣＡＰ／Ｍは４−Ｓ−ＣＡＰ部分を含むので、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍのチロシナーゼ酸化を行う前に、４−Ｓ−ＣＡＰのチロシナーゼ酸化を検討した。
【００６６】
０．１ｍＭの４−Ｓ−ＣＡＰを０．２ｍＭシステインの共存下に、チロシナーゼ（４０μｇ／ｍＬ）酸化した。酸化反応は、１０分で終了した。
【００６７】
生成した４−Ｓ−システアミニル−６−Ｓ−システイニル カテコールは７．５分の保持時間であった。なお、初期濃度が半分になる時間は、４．２分であった。
【００６８】
実施例８：ＮＰｒＣＡＰ／Ｍのチロシナーゼ酸化
ＮＰｒＣＡＰ／Ｍの０．１ｍＭを０．２ｍＭのシステインの共存下、チロシナーゼ（４０μｇ／ｍＬ）酸化し、３０分、１時間、３時間反応させた。反応生成物を６Ｍ−塩酸（５％チオグルコール酸を含む）で１１０℃、１．５時間反応させＨＰＬＣで分析後、残存する４−Ｓ−ＣＡＰ量と生成する４−Ｓ−システアミニル−６−Ｓ−システイニル カテコール量を測定した。ＮＰｒＣＡＰ／Ｍの初期濃度が半分になる時間は、６９分であった。
【００６９】
この結果から、４−Ｓ−ＣＡＰ／（ＮＰｒＣＡＰ／Ｍ）の反応速度の比は、１６．４になった。
【００７０】
一方、生成した４−Ｓ−システアミニル−６−Ｓ−システイニル カテコール量は時間とともに増加し、３時間後、８０μＭとなった。
【００７１】
以上の事から、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍがチロシナーゼの基質になることが判明した。
【００７２】
実施例９：製剤例（１）軟膏剤
実施例４又は５で得たＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ又はＮＰｒＣＡＰ／Ｍを、日本薬局方記載のマクロゴール軟膏に、１０％含有量で混合し、軟膏剤を得た。
【００７３】
（２）注射剤
実施例４又は５で得たＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ又はＮＰｒＣＡＰ／Ｍを、用時生理食塩水と４％濃度で懸濁させ、注射剤とした。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上記載のように、本発明は、磁気微粒子が有する腫瘍細胞に対する温熱免疫効果と、システアミニルフェノール誘導体が有する殺腫瘍細胞効果を相乗的に発現させることにより、従来のメラノーマ治療法の概念とは全く異なる新しい、化学・温熱免疫ナノメディシン療法に使用することができるメラノーマ標的温熱免疫治療剤を提供するものであり、その医療上の価値は多大なものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノーマ（悪性黒色腫）を特異的に標的し、メラノーマ細胞に対する殺細胞効果と、磁気微粒子を用いる温熱免疫効果を相乗的に発揮する、特異的メラノーマ治療に使用するメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本においてメラノーマ（悪性黒色腫）患者は急速に増加する傾向にある。メラノーマは早期から転移を起しやすく、これら転移性癌を持った患者に対し現時点では全ての治療法が無効に等しい。
【０００３】
すなわち、メラノーマは、全身の皮膚、粘膜のみならず、目、脳、脊髄等の臓器に発生する癌であり、本症の発生は、近年加速度的に上昇している。予後は極めて悪く、病初期から皮膚、リンパ節、肺、肝、脳等への転移をとる。この治療に対しては、外科的療法以外に手段はなく、外科的手術後に抗癌剤を使用せざるを得ない。しかしながら、抗癌剤による激しい副作用のため、抗癌剤自体の使用が制限される場合も多い。
【０００４】
一方、癌の別の治療方法として温熱療法（ハイパーサーミア）が行われている。これは、腫瘍（癌）細胞が正常細胞に比較して熱に弱いという性質を利用した治療法である。多くの腫瘍細胞は体温から僅かに高い温度領域（４２．５℃〜４５℃）において正常細胞より温度感受性が高く、温度が高ければ高いほど腫瘍細胞は殺傷されるという性質を利用して、腫瘍細胞を加温殺傷させる治療法である。
【０００５】
現在広く用いられている温熱療法は、電極で身体を挟んでラジオ波を印加する誘電加温法である。しかしながら、この加温法では、腫瘍細胞を充分に殺傷する温度に加温する前に、正常細胞が火傷をしてしまい、患者の苦痛で加温を中止しなければならない欠点がある。
【０００６】
そこで最近、磁性微粒子、特にマグネタイトを発熱素子とした温熱療法が検討されてきている。マグネタイトは、Ｆｅ3Ｏ4酸化鉄（磁鉄鉱）のコロイドであり、高周波磁場内で発熱し、この発熱効果により熱ショック蛋白９０（温熱免疫蛋白；Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＨＳＰ９０）産生による腫瘍免疫効果を発現することが知られている。そこで、マグネタイトを選択的に腫瘍細胞へ集積させるため、リポソーム膜の表面に四級アミンなどの正電荷官能基を持たせたカチオニックリポソームを利用し、このリポソームにマグネタイトを封入したマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）を作成し、腫瘍局所投与による腫瘍へのターゲティングが検討され、腫瘍細胞のみを選択的に加温殺傷させる試みが行われている（非特許文献１）。
【０００７】
しかしながら、ＭＣＬは、中性付近でも正電荷をもっており、腫瘍細胞への選択性はなく、貪食能があるすべての細胞に取り込まれることから、腫瘍組織への局所注入による以外、すでに遠隔転移を含めた腫瘍細胞を標的とした全身的治療ができないという欠点を有している。そのため、抗体を用いた腫瘍組織への選択性をもたせるという試みがなされているが、臨床的応用には問題があり、また抗体結合磁性粒子内包リポソームの作成は複雑である等の欠点を有している。
【０００８】
ところで本発明者は、メラノーマ細胞の分化形質発現のキー酵素として知られているチロシナーゼの基質となるある種のシステアミニルフェノール誘導体が、メラノーマ細胞に選択的に取り込まれ、直接殺細胞効果を有することを見出してきている（特許文献１）。
【０００９】
すなわち、メラニン形成経路は全てのメラノーマ細胞にとり特異な分化形質であり、癌化と共に異常に亢進する。本発明者が提案しているシステアミニルフェノール誘導体は、メラニン形成酵素であるチロシナーゼの基質となり、このシステアミニルフェノール誘導体がメラノーマ細胞に選択的に接着して取り込まれ、その場で直接殺細胞効果を発揮するものである。
しかし、このような殺腫瘍細胞効果と、前記の温熱免疫効果との両者を備える治療剤は、これまで開発されていなかった。
【００１０】
【特許文献１】特許第３１７８８３４号公報
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｋａｉ Ｍ．ら：Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，８７：１１７９−１１８３（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって本発明は、従来のメラノーマ治療法の概念とは全く異なる新しい、化学・温熱免疫ナノメディシン療法に使用することができるメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた。その結果、前記したシステアミニルフェノール誘導体の有するメラノーマ細胞への選択性を利用し、温熱殺細胞効果を有する磁気微粒子、特にマグネタイトに前記誘導体を固定化する新しい選択的ナノ・ドラッグ・デリバリー・システムを開発するに至った。前記システムによれば、システアミニルフェノール誘導体が有するメラノーマ細胞への特異的な選択性に基づき、メラノーマ細胞に対する特異的な殺細胞効果と、マグネタイトの磁場照射に伴う温熱発生による殺細胞効果と免疫効果が相乗的に発揮され、従来の概念にない特異的なメラノーマ治療法を行い得るものといえる。
【００１３】
かかる考え方を基に、本発明者は、システアミニルフェノール誘導体を磁気微粒子、特にマグネタイト、あるいは磁気微粒子を包含するリポソームに固定化して、実際にメラノーマ細胞標的ナノ粒子を作成した。係る粒子が、メラノーマ細胞にｉｎ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏの両者で一定の細胞膜表面レセプターと思われる機構を介して選択的に取り込まれ、取り込まれたシステアミニルフェノール誘導体が単独で殺細胞効果を発揮することを確認し、さらに、かかる選択的ナノ・ドラッグ・デリバリー・システムによる温熱療法は、従来の誘電加温型と異なり、癌に指向性を持つ磁気微粒子だけが発熱する周波数を交番磁場発生装置によって照射することで、メラノーマに特異な加温が可能であることを確認し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
かかる課題を解決するための本発明は、その基本的態様として、次式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ8のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ8のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１〜５までの整数を表す。ただしｎが１のとき、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が同時に水素原子であることはない。）
で表されるシステアミニルフェノール誘導体と、磁性微粒子、または磁性微粒子を内包するリポソームとの重合体を有効成分とすることを特徴とするメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
より具体的には、本発明は、前記磁性微粒子がマグネタイトであることを特徴とする上記メラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
さらに具体的には、本発明は、前記式（Ｉ）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ6のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ6のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１または２の整数である上記メラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
さらに具体的には、本発明は、前記式（Ｉ）中、Ｒ1が水素原子又はメチル基であり、Ｒ2が水素原子又はメチル基であり、Ｒ3がメチル基、アセチル基又はプロピオニル基である上記メラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
より具体的には、本発明は、前記重合体において、前記磁性微粒子又は前記リポソーム間の結合が活性化架橋結合基およびメルカプト基との結合を介しており、前記メルカプト基は前記式（Ｉ）の末端に付加されてなるものであるメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤であり、なかでも前記活性化架橋結合基が、マレイミド基であるメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明が提供する治療剤により、これまで外科的手術による治療しか手段の無かったメラノーマ治療に対して、化学薬剤としての殺腫瘍効果と、磁場照射による温熱殺腫瘍効果を相乗的に発揮させることが可能となり、患者に対して外科的手術の侵襲を回避しうる、極めて特異的なメラノーマ治療法を確立することができる利点を有している。
さらに、本発明の治療剤によれば、単にメラノーマ細胞を選択的に熱死滅させる効果を有するのみならず、熱ショック蛋白を介し、細胞障害性Ｔ細胞を活性化し、遠隔転移癌に対しても細胞破壊の腫瘍免疫を行うことが出来る利点を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、前記した式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール（ｃｙｓｔｅａｍｉｎｙｌ ｐｈｅｎｏｌ）誘導体と、磁性微粒子（磁気ナノ粒子）との直接重合体、または磁性微粒子（磁気ナノ粒子）を内包（包理）するリポソームとの重合体を有効成分とすることを特徴とするメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤である。
【００１７】
式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体は、メラノーマ細胞指向性を有し、メラノーマに対して直接的な殺細胞効果を発揮する。すなわち、メラニン形成酵素であるチロシナーゼの基質であるチロシンにイオウを結合させたアミン誘導体である。
【００１８】
かかるシステアミニルフェノール誘導体の中でも、本発明にあっては、式（Ｉ）で表されるシステアミニルフェノール誘導体が用いられる。式（Ｉ）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ8のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ8のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１〜５までの整数を表す（ただしｎが１のとき、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が同時に水素原子であることはない。）。特に、式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ6のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ6のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１または２の整数を表す（ただしｎが１のとき、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が同時に水素原子であることはない。）構造からなるシステアミニルフェノール誘導体が好ましい。この場合において、式（Ｉ）中のアミノ基における置換基の一つであるアルカノイル基は、細胞膜親和性を高める性質の置換基である。なお、本発明の式（Ｉ）で表されるシステアミニルフェノール誘導体は、特許第３１７８８３４号公報に記載の方法によって製造することができる。
【００１９】
そのなかでも、Ｒ1が水素原子又はメチル基であり、Ｒ2が水素原子又はメチル基であり、Ｒ3がメチル基、アセチル基又はプロピオニル基であるシステアミニルフェノール誘導体等が好ましい。具体的には、Ｎ−アセチル−４−Ｓ−システアミニルフェノール、Ｎ−プロピオニル−４−Ｓ−システアミニルフェノール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−Ｓ−システアミニルフェノール、４−Ｓ−ホモシステアミニルフェノール、α−メチル−４−Ｓ−システアミニルフェノール等を挙げることができる。
【００２０】
本発明にあっては、そのようなシステアミニルフェノール誘導体の中でも、Ｒ1が水素原子であり、アミノ基における置換基であるアルカノイル基として、式中Ｒ2が水素原子であり、Ｒ3がアセチル基又はプロピオニル基であるシステアミニルフェノール誘導体が、メラノーマ細胞に対する特異的親和性を顕著に発揮する点で、好ましい。
このものは、具体的には、次式（Ｉ−ａ）で示されるＮ−アセチル−４−Ｓ−システアミニルフェノール（以下、「ＮＡｃＣＡＰ」と略記する場合もある）、及び（Ｉ−ｂ）で示されるＮ−プロピオニル−４−Ｓ−システアミニルフェノール（以下、「ＮＰｒＣＡＰ」と略記する場合もある）である。
【化２】
【化３】
そのなかでも、ＮＰｒＣＡＰが特にメラノーマ細胞に対する親和性と殺細胞効果に優れ、好ましく使用される。
【００２１】
一方、本発明にいう磁性微粒子（磁気ナノ粒子）は、高周波磁場でシステリシス損によって発熱する。このシステリシス損による発熱は、磁性微粒子の粒子径に依存することが知られている。本発明にあっては、腫瘍細胞に指向性を有する磁性微粒子だけが発熱する周波数を、交番磁場発生装置により照射することで、メラノーマ細胞に特異的な加温を与えることが可能となる。
【００２２】
交番磁場とは、変動磁場の一種であり、磁力が時間とともに変化するものである。すなわち交番磁場とは、電磁石に交流を流してつくった磁場をいい、磁力は強くなったり、弱くなったり、またＮ極とＳ極は一定のリズムで方向が逆向きになる特異性を有する磁場である。かかる交番磁場の照射により、本発明のメラノーマ細胞に集積された磁性微粒子のみが特異的に発熱する。
【００２３】
磁性微粒子の平均粒子径は５〜２５ｎｍであることが好ましく、より好ましくは１０ｎｍ程度であるのがよい。平均粒子径が５ｎｍ未満であると、磁性微粒子は超常磁性（ＳＰＩＯ）となりシステリシス損が生じず、したがって発熱が生じにくくなるおそれがある。また、粒子径が２５ｎｍを超える場合には、粒子自身の磁気により凝集が生じ磁性微粒子のコロイド、例えばマグネタイトコロイドの水分散性が損なわれ、リポソームへ包理することができなくなることがある。なお、磁性微粒子の平均粒子径は透過型電子顕微鏡観察によって測定される粒子径を平均することで求めることができる。
【００２４】
上記のシステアミニルフェノール誘導体を固定する磁性微粒子としては、鉄、コバルト、ニッケル等の化合物の他、マグネタイトが挙げられる。そのなかでもマグネタイト（以下、「Ｍ」と記す場合もある）が好ましく使用される。
【００２５】
本発明が提供する治療剤にあっては、上記磁性微粒子と、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体を直接重合させて得たもの、或いは磁性微粒子を内包（包理）するリポソームと重合させて得たものの両者を使用することが可能である。そのなかでも、上記磁性微粒子と直接重合して得たもの、特にマグネタイトと直接重合して得たものは、室温保存に安定な治療剤として得ることができ、好ましい。
【００２６】
一方、磁性微粒子を内包（包理）するリポソーム、すなわちマグネトリポソーム（以下、「ＭＬ」と記す場合もある）は、磁性微粒子をリン脂質で被覆したものである。リン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸等の脂質の単独あるいはこれらの混合物が挙げられる。これらのうち、特にホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールの単独又はこれらの混合物が好ましい。それらの中でも、ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンを、モル比でそれぞれ２：１となるように混合した混合物を使用するのがよい。
【００２７】
本発明が提供する治療剤にあって、その有効成分は、磁性微粒子、或いは磁性微粒子を内包するリポソームと、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体とが重合したものである。この重合にあっては、磁性微粒子或いは磁性微粒子を内包するリポソームの表面に結合させた活性化架橋結合基を介して、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体を重合することができる。
【００２８】
そのような活性化架橋結合基としては、例えば、メルカプト基（ＳＨ基）と結合し得るものを挙げることができる。中でも、マレイミド基を有する活性化架橋結合基が好ましい。マレイミド基を有する活性化架橋結合基としては、例えば次式（Ａ）〜（Ｃ）で示されるものを挙げることができる。
【化４】
（式中、ｍ、ｎ、及びｐは１〜６の整数を表す）
【００２９】
一方、上記のような活性化架橋結合基を介する重合の場合、更に式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体側には、活性化架橋結合基と重合結合する官能基が付加されることが好ましい。このような官能基としては、活性化架橋結合基がマレイミド基を有する活性化架橋結合基の場合、マレイミド基の二重結合と重合結合する官能基が挙げられる。具体的には、メルカプト基が好ましい。
【００３０】
式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体が前記した次式（Ｉ−ａ）で示されるＮ−アセチル−４−Ｓ−システアミニルフェノール（ＮＡｃＣＡＰ）、及び（Ｉ−ｂ）で示されるＮ−プロピオニル−４−Ｓ−システアミニルフェノール（ＮＰｒＣＡＰ）のそれぞれである場合を例にとり説明すると、以下の通りである。まず、それぞれの化合物の、例えばアセチル基或いはプロピオニル基の末端に、メルカプト基を付加導入し、次式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）：
【化５】
で示される化合物へ誘導する。その後、上記した活性化架橋結合基、すなわちマレイミド基の二重結合とメルカプト基との重合結合により、マグネタイト（Ｍ）或いはマグネタイトを内包するリポソーム（ＭＬ）と重合されることとなる。
【００３１】
磁性微粒子がマグネタイト（Ｍ）の場合、マグネタイトに式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体を直接重合させたものは、より具体的には、以下の方法により調製することができる。
例えば、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体がＮＰｒＣＡＰであり、磁性微粒子がマグネタイトである場合を具体例として記載すると以下の通りである。まず、マグネタイトの表面に上記の活性化反応性架橋基（Ｂ）を有する直接結合型マグネタイトを得る。この直接結合型マグネタイトを水中に懸濁させ、そこに末端にメルカプト基を有する上記（ＩＩＩ）のシステアミニルフェノール誘導体を加え室温下に攪拌する。その後、冷所に一夜放置し、遠心後ミリＱ水による洗浄を繰り返し、最後にミリＱ水中に懸濁させる。こうして、ＮＰｒＣＡＰがマグネタイトに直接重合した重合体、すなわちＮＰｒＣＡＰ／Ｍを調製することができる。
【００３２】
なお、マグネタイトの表面に上記の活性化反応性架橋基（Ｂ）を有する直接結合型マグネタイト、すなわちマレイミド基が導入されたマグネタイトは、例えば以下のようにして得ることができる。まず、マグネタイトを水に分散させ懸濁させ、水分散マグネタイトの懸濁液を得るこの懸濁液に、アミノシランカップリング剤、例えば３−アミノプロピルトリエトキシシランを攪拌下に滴下し、室温で反応させる。その後、遠心分離して上清液を除き、更にミリＱ水にて数回の洗浄を行った後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）に置き換える。続いて、この溶液にＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）のＰＢＳ溶液を加え、激しく攪拌し反応させ、遠心分離して上清液を除く。更にミリＱ水にて数回の洗浄を行い、直接結合型マグネタイトを調製することができる。
【００３３】
また、磁性微粒子を内包するリポソームと式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体を重合させて得たもの、例えば、ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬは具体的には、以下のようにして調製することができる。
リポソームは、形態学的に小さな１枚膜リポソーム（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＳＵＶ）と大きな１枚膜（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＬＵＶ）と多重層リポソーム（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ:ＭＬＶ）に分類されるが、ＳＵＶが一般に最も頻用される。本発明においても、ＳＵＶを使用するのが好ましい。
先ず、脂質（リポソーム；ＳＵＶ）を溶媒、例えば、クロロホルムに溶解し、上記式（ＩＩＩ）で示されるプロピオニル基の末端にメルカプト基を有するＮＰｒＣＡＰを加え反応を行う。続いて、溶媒を減圧除去した後、脂質のフィルムにマグネタイト水溶液を入れてボルテックスし、超音波処理を、例えば３０分間程度行うことによりＮＰｒＣＡＰ／ＭＬを調製することができる。
【００３４】
また、別法として、マグネタイトを内包するリポソームの表面に活性化反応性架橋基、例えば、式（Ａ）を有する直接結合型マグネタイト内包リポソーム、すなわちマレイミド基が導入されたマグネタイト内包リポソームを先に調製してから、それと上記式（ＩＩＩ）で示されるプロピオニル基の末端にメルカプト基を有するＮＰｒＣＡＰを加え反応を行い、ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬを調製することもできる。
具体的には、まず、リン脂質としてホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、並びに活性型リン脂質（活性型反応性架橋基を有するリン脂質）、例えばジパルミトイル型ホスファチジルエタノールアミン−プロピルマレイミド（ＤＰＰＥ−プロピルマレイミド：日本油脂社製）を、溶媒、例えばクロロホルムに混合、溶解させる。溶媒を留去した後、半日以上冷所にて乾燥保存する。その後、これに水分散マグネタイトを加え、激しくボルテックス等で撹拌し、その後超音波処理を行う。こうして、マグネタイトを内包するリポソームの表面に活性化反応性架橋基を有する直接結合型マグネタイトリポソームを調製することができる。
次いで、この溶液に、上記式（ＩＩＩ）で示される、プロピオニル基の末端にメルカプト基を有するＮＰｒＣＡＰを加え、室温にて１０分間程度攪拌反応させる。続いて、冷所（４℃程度）に一夜放置した後、３０００ｒｐｍ／分で遠心分離し、ミリＱ水で洗浄し、ミリＱ水中に懸濁させる。こうして、ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬを調製することができる。
【００３５】
なお、本発明の式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体として、４−Ｓ−システアミニルフェノール（４−Ｓ−ＣＡＰ）を、直接マグネタイトを内包するリポソームと重合することも可能である。
例えば、ＴＭＡＧ（相互薬工社製）、ＤＬＰＣ（日本油脂社製）、ＤＯＰＥ（日本油脂社製）及び４−Ｓ−ＣＡＰの所定量を溶媒、例えばメタノール中に混合、溶解させ溶媒を留去下後、冷所（４℃程度）にて乾燥保存を行う。次いで、これに予め洗浄して濃度を調整した水分散マグネタイトの水懸濁液を加え、激しくボルテックスし、さらに超音波処理を行うことにより調製することもできる。
【００３６】
以上のようにして得られた本発明が提供する治療剤は、具体的には、以下の特色を有する。
すなわち、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体の特徴としては、
低分子アミノ酸のイオウ誘導体であり、細胞内への取り込みに問題がない；
また、チロシンよりＶｍａｘ、Ｋｍにおいてはるかに高いメラニン形成の基質であり、メラニン形成細胞に選択的に、かつ非可逆的に細胞膜リセプターと考えられる機構を介し細胞膜に接着し、その後細胞内に取り込まれる；
チロシナーゼ・メラニン形成は臨床的に無色素産生メラノーマでも常に存在し、癌化と共に異常に亢進する。すなわちメラノーマ細胞に正常細胞（メラノサイト）と比較しより高く取り込まれる；
イオウは細胞膜親和性を高める；
従来標的として用いられた抗体と異なり、人体にとり異種蛋白ではなく、頻回使用しても無害である；
等の特色が挙げられる。これらの特色は、本発明の治療剤の特色でもあり、磁気微粒子が有する腫瘍細胞に対する温熱免疫効果とともに相乗的に発現される効果である。
【００３７】
また、本発明が提供する治療剤として、磁性微粒子を内包するリポソームを用いる場合には、標的化可能な因子との組み合わせで癌細胞への特異的ターゲティングが可能である。リポソームであるので、例えば、本発明の式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体であるＮＰｒＣＡＰを介し、細胞内へ容易に取り込まれ得る。
一度細胞内に取り込まれ、人体に無浸襲で加温された場合には、ｉｎ ｓｉｔｕで最も効率的に、熱ショックたんぱく質（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＨＳＰ）等を介し細胞破壊を行い得るものであり、結果として直接の細胞殺効果のみならず、ＨＳＰの結果、間接的に細胞傷害性Ｔ細胞・サイトカイン等を刺激し遠隔転移巣に対し免疫療法も誘導し得るものである。
【００３８】
本発明の治療剤を使用するメラノーマの治療は、以下のようにして実施される。例えば本発明の式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体としてＮＰｒＣＡＰを用いた場合には、生理的食塩水に可溶化された４％のＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ、又はＮＰｒＣＡＰ／Ｍを皮下の癌組織内に注射する（一回注射総量２ｍＬ程度が好ましい）。または、親水軟膏基材に溶かした１０〜２０％のＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ、又はＮＰｒＣＡＰ／Ｍ軟膏を、癌組織直上部の皮膚に密封療法（ＯＤＴ）で２４時間塗布する。
【００３９】
注射２４時間後、または密封療法終了直後、磁場照射を行う。これ等の投与と磁場照射は隔日に３回行うのがよい。その後腫瘍組織は外科的処置にて全切除を行う。外科的手術時には、同時に加療後の免疫反応を検索するために領域リンパのセンチネルリンパ節生検を行う。
【００４０】
この治療方法は、具体的には以下に記載するマウスを用いた動物実験の結果に基づくものである。
対象動物としてマウス（Ｃ５７ＢＬマウス、４週目、メス）を各群７匹使用し、それぞれにメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１）を移植した。移植後９日目から４％のＮＰｒＣＡＰ／Ｍを１日３回連続３日間投与した群（その後の磁場照射を行わない群）を群ＩＩとした。また、同様に４％のＮＰｒＣＡＰ／Ｍを１日３回連続３日間投与し、更に磁場照射（周波数１１８ｋヘルツ；保磁力３０．８ｋＡ/ｍｅｔｅｒ）投与日から５日間連続して行った群を群ＩＩＩとした。更に何も処理をしないコントロール群を群Ｉとした。群Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを比較すると、群ＩＩでは、コントロール群（群Ｉ）と比較して注射直後に、統計的に優位に癌組織の増殖抑制が認められたが（ＮＰｒＣＡＰ／Ｍ自体には抗癌作用を有する）、更に磁場照射を行うと（群ＩＩＩ）、群ＩＩ及びコントロール群（群Ｉ）よりはるかに有効な癌組織の増殖抑制効果を示し、多くの実験マウス（７匹中６匹）において、癌組織の完全な消失が認められた。
【００４１】
さらに興味を引くことは、上記実験後（群ＩＩＩについては磁場照射後）の各実験マウス群において、メラノーマ細胞を移植しなかった反対側の正常皮膚にメラノーマ癌組織を移植したところ、コントロール群（群Ｉ）ではメラノーマの増殖が認められたのに、群ＩＩＩの磁場照射群の実験マウスでは、メラノーマの増殖拒絶が認められ、メラノーマが発生しなかった。
このことは、磁場照射後に生ずる温熱ショック蛋白を介した腫瘍拒否免疫機構が実験マウス群に生じたことを示すものである。
【００４２】
上記の動物実験に基き、実際のヒトに対して用いる場合には、以下の方法で行うことが可能となる。
すなわち、皮膚メラノーマ原発、転移巣に対し、ＮＰｒＣＡＰ／ＭまたはＮＰｒＣＡＰ／ＭＬを軟膏に混ぜ（好ましくは、１０％軟膏碁剤をテープストリッピングに表皮角層を剥離後塗布）、封鎖密封療法（ＯＤＴ療法）にて１２時間塗布する。
或いは、直接マイクロインジェクターで腫瘍内に注射（好ましくは４％濃度・生食液）し、投与後２４時間後に磁場照射（具体的条件としては、例えば、ｆｉｅｌｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ＝１１８ｋＨｚ；ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ＝３０．６ｋＡ／ｍ；３８４ Ｏｅ）を隔日に、３回行い、２４時間後に全切除する。
【００４３】
本発明の治療剤の治療効果に関しては、前記実験の群ＩＩＩのマウスにおける予備動物実験にて、３回の薬剤投与と磁場照射により腫瘍はほぼ消失することが判明している。また磁場照射を５回行うと腫瘍は完全に消失している。
しかしながら、患者の温熱免疫効果を発現させるためには、腫瘍を少し残すところまで本発明の治療剤および磁場照射を用いた治療を施した後、腫瘍免疫を高め、その後に腫瘍を外科的切除により完全に除去するのがよい。
【００４４】
本発明が提供する治療剤の剤形としては、外用剤として皮膚外用には親水軟膏基剤を用いるのが好ましく、製剤学的に汎用されている親水基剤を用いて、常法にしたがって軟膏剤を調製することができる。
また、局所投与に際しては注射による溶液投与が好ましく、通常の生理的食塩水を用い、投与するのがよい。
なお、外用軟膏剤を皮膚表面に塗布する前、ストリッピングで表皮のバリアーを省き、密封療法（１２時間）を用い行うのが好ましい。局所投与は微量注入ポンプを用い、４％ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬの場合、２ｍＬを３０分程度かけて、また、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍの場合には、５分程度をかけて投与するのがよい。
【００４５】
本発明が提供する治療剤は、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体自体の抗癌作用と、磁性微粒子、或いは磁性微粒子内包リポソームを用いた温熱による細胞殺効果に加えて、温熱照射に基づく熱ショック蛋白（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）を介した温熱免疫効果が期待できるものである。
【００４６】
事実、マグネタイト内包リポソームを用い、磁場照射を行ったマウス・グリオーマはＨＳＰ７０を介し、抗腫瘍免疫を起し、治療グリオーマの反対側の無治療グリオーマを消失させるものであった。
【００４７】
本発明が提供する治療剤による癌免疫の誘導は、次のようにして行われるものと推測される。まず、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体、例えば、ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ、或いはＮＰｒＣＡＰ／Ｍをメラノーマ細胞にとりこませ、磁場をあてることにより、細胞内でマグネタイトが発熱し、細胞が壊死に陥る。この際、壊死細胞から、ＨＳＰ−癌抗原ペプチド複合体が放出され、ＨＳＰレセプターにより樹状細胞にとりこまれ、ＭＨＣ分子にペプチドが提示され、メラノーマ特異的なｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌを誘導し、獲得免疫を誘導するものと考えられる。またｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒを介して、サイトカインの産生を増加させ、免疫細胞を活性化することにより、自然免疫が活性化される。本発明においては、このような獲得免疫の誘導および自然免疫の活性化の２点により、癌免疫が誘導されるものといえる。
【００４８】
本発明が提供する治療剤による腫瘍免疫機構としては、以下の２経路が考えられる。その主たるものはメラノーマ細胞質に存在するＨＳＰはＴＹＲＰ−Ｉなどのメラノーマ特異癌抗原からプロテアソームにより生成された抗原ペプチドと結合し、癌抗原ペプチドを小胞体へ運ぶシャペロンの役割を果たす経路が挙げられる。
ＨＳＰによって小胞体へ運ばれた癌抗原ペプチドは、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子に受け渡され、このＭＨＣ ｃｌａｓｓ ｉ−癌抗原ペプチド複合体はゴルジ体をへて、細胞表面上に発現し、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌに認識される。
一方、メラノーマ細胞に熱などのストレス負荷、あるいは細胞死が起こった場合、ＨＳＰ−ペプチド複合体（ＨＳＰ結合ペプチド）は細胞外に放出され、樹状細胞に結合もしくはとりこまれて、樹状細胞を活性化する。同時に、ＨＳＰ結合ペプチドは、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ｉ分子によって提示され、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌを誘導すると考えられる。
【００４９】
これまでにＨＳＰにはいくつかの種類があることが知られており、これらのうちＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６の３つが癌免疫に関与していることが報告されている。本発明者等は、予備実験にてＢ１６Ｆ１のメラノーマ細胞にＣＡＰ／ＭＬ、ＭＬを取り込ませ、磁場をかけて、上清をＥＬＩＳＡ法にかけＨＳＰを特定した。例えば、ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ ２００μｇに温熱を加え培養すると、４６時間後にはＨＳＰ７０の放出を認めた。同様にＨＳＰ９０の放出も認められた。
【００５０】
さらに、本発明者等は、実際の人での治療法に順じ、予備動物実験で前記動物実験で準備したものと同様のＢ１６Ｆ１メラノーマ担癌マウスに、式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体であるＮＰｒＣＡＰ／Ｍを前記実験群ＩＩＩと同様に投与し、磁場照射（周波数１１８ｋヘルツ；保磁力３０．８ｋＡ/ｍｅｔｅｒ）をＮＰｒＣＡＰ／Ｍの投与日から３日間連続して行い、その後腫瘍を完全に切除し、その後再度同一マウスにＢ１６Ｆ１メラノーマを接種したところ、コントロールは腫瘍の発育をみたが、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍ投与加療群、及びＮＰｒＣＡＰ／Ｍ投与／磁場照射加療群のいずれにおいても、再チャレンジしたＢ１６Ｆ１メラノーマの発育阻止が認められた。
【００５１】
興味を引くことは、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍのみ投与で磁場照射を行わない加療群においても、弱いながら抗メラノーマ発育抑制効果が認められたが、何よりもＨＳＰを介した抗腫瘍免疫が認められ、再チャレンジしたメラノーマの拒絶反応が認められた。このことは、本発明の式（Ｉ）で示されるシステアミニルフェノール誘導体、例えば、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍ自体にもＨＳＰを介した癌拒絶免疫機構が存在することを示しているものであり、本発明の特異性がよく理解される。
【実施例】
【００５２】
以下に本発明を、具体的実施例を示すことにより、より詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１：１−メルカプトプロピオニル−４−Ｓ−ＣＡＰ（ＮＰｒＣＡＰ）の合成
【化６】
【００５４】
［第一工程］
Ｐａｄｇｅｔｔｅらの文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２７：１３５４−１３５７，１９８４）に従い、４−メルカプトフェノールと２−メチル−２−オキサゾリンを２時間還流させ、Ｎ−アセチル−４−Ｓ−システアミニルフェノールを、再結晶後７０％の収率で結晶として得た。
【００５５】
次いで、このものを６Ｍ−塩酸水溶液で３時間還流させ、目的物の４−Ｓ−システアミニルフェノール（４−Ｓ−ＣＡＰ）を、再結晶後８０％の収率で得た。
【００５６】
［第二工程］
上記で得た４−Ｓ−システアミニルフェノール（４−Ｓ−ＣＡＰ）を、Ｎ−スクシンイミジル−３−（（２−ピリジル）ジチオ）プロピオネートとピリジン中室温下に２時間反応させた後、薄層クロマトグラフィーで精製した。得られた生成物をメタノール中ジチオトレイトールと室温下で２時間反応させ、目的物質である、１−メルカプトプロピオニル−４−Ｓ−ＣＡＰ（ＮＰｒＣＡＰ）を薄層クロマトグラフィーで精製後、４０％の収率（２段階）で得た。
【００５７】
実施例２：活性化反応性架橋基を有する直接結合型マグネタイト内包リポソーム（ＭＬ）の合成
リン脂質であるホスファチジルコリン１０ｍｇ（ＳＩＧＭＡ社製）、ホスファチジルエタノールアミン４．５ｍｇ（東京化成社製）と、活性型リン脂質であるＤＰＰＥ−プロピルマレイミド２ｍｇ（日本油脂社製）を５００μＬのクロロホルムに混合、溶解させ、溶媒を留去した後、半日以上４℃のデシケーターにて乾燥保存し、これに平均粒子径１０ｎｍのマグネタイト（戸田工業株式会社製）で４０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した水分散マグネタイトを２ｍＬ加え、激しくボルテックスし、その後超音波処理（２８Ｗ）２０分間を行い、下式で示される、マグネタイトを内包する１重膜のリポソーム（ＭＬ）の表面に活性化反応性架橋基（Ａ）を有する直接結合型マグネタイト内包リポソームを得た。
【化７】
【００５８】
実施例３：活性化反応性架橋基を有する直接結合型マグネタイト（Ｍ）の合成
実施例２で用いたものと同様の４０ｍｇ／ｍＬの濃度の水分散マグネタイトの懸濁液１０ｍＬをスターラーで攪拌しながら、アミノシランカップリング剤として３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＴＣＩ）を１００μＬ滴下し、６０分間室温で反応させた後、２，５００ｒｐｍで２分間遠心分離して上清液を除き、更にミリＱ水にて３回の洗浄を行った後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）に置き換え、この溶液にＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）のＰＢＳ溶液を加え、激しく攪拌し反応させ、遠心分離して上清液を除き、更にミリＱ水にて３回の洗浄を行い、１０ｍＬのミリＱ水を加えることで、下式で示される、活性化反応性架橋基（Ｂ）を有する直接結合型マグネタイト（Ｍ）を得た。
【００５９】
【化８】
【００６０】
実施例４：Ｎ−（１−メルカプトプロピオニル−４−Ｓ−ＣＡＰ結合型マグネタイト内包リポソーム（ＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ）の合成
リポソームの表面に活性化反応性架橋基（Ａ）を有するマグネタイト内包リポソーム（ＭＬ）の４０ｍｇ／ｍＬに、実施例１で得たＮＰｒＣＡＰを１ｍｇ加えて、室温で１０分間攪拌後、４℃の冷蔵庫で一晩放置した。その後、３，０００ｒｐｍ／分で遠心し、沈殿物をミリＱ水による洗浄を３回繰り返した後、ミリＱ水１０ｍＬで懸濁させ、目的とするマレイミド基にＮＰｒＣＡＰが結合したＮＰｒＣＡＰ／ＭＬを得た。
【化９】
【００６１】
実施例５：ｎ−（１−メルカプトプロピオニル−４−Ｓ−ＣＡＰ直接結合型マグネタイト（ＮＰｒＣＡＰ／Ｍ）の合成
マグネタイトの表面に活性化反応性架橋基（Ｂ）を有する直接結合型マグネタイト（Ｍ）の４０ｍｇ／ｍＬに、実施例１で得たＮＰｒＣＡＰを１ｍｇ加えて、室温で１０分間攪拌後、４℃の冷蔵庫で一晩放置した。その後、３，０００ｒｐｍ／分で遠心し、沈殿物をミリＱ水による洗浄を３回繰り返した後、ミリＱ水１０ｍＬで懸濁させ、目的とするマレイミド基にＮＰｒＣＡＰが結合したＮＰｒＣＡＰ／Ｍを得た。
【化１０】
【００６２】
実施例６：ＮＰｒＣＡＰのマグネタイトへの取り込み量の測定
ＮＰｒＣＡＰのマグネタイトへの取り込み量は、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍを６Ｍ−塩酸（５％チオグリコール酸を含む）で１１０℃、１．５時間反応させ、生成する４−Ｓ−ＣＡＰ量をＨＰＬＣで定量することにより測定した。
【００６３】
その結果、マグネタイト１ｍｇあたり６１０ｎｍｏｌのＮＰｒＣＡＰが結合していることがわかった。
【００６４】
ＨＰＬＣの分析条件
カラム：Ｃａｐｃｅｌ ｐａｋ（Ｃ18)、
移動相：メタノール：水：１Ｍ−ＨＣｌＯ4（用量比で１０：９０：１．５）、
流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ、
検出器：ＵＶ（２５０ｎｍ）、
カラム温度：５０℃
【００６５】
実施例７：ＮＰｒＣＡＰのチロシナーゼ酸化
ＮＰｒＣＡＰ／Ｍは４−Ｓ−ＣＡＰ部分を含むので、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍのチロシナーゼ酸化を行う前に、４−Ｓ−ＣＡＰのチロシナーゼ酸化を検討した。
【００６６】
０．１ｍＭの４−Ｓ−ＣＡＰを０．２ｍＭシステインの共存下に、チロシナーゼ（４０μｇ／ｍＬ）酸化した。酸化反応は、１０分で終了した。
【００６７】
生成した４−Ｓ−システアミニル−６−Ｓ−システイニル カテコールは７．５分の保持時間であった。なお、初期濃度が半分になる時間は、４．２分であった。
【００６８】
実施例８：ＮＰｒＣＡＰ／Ｍのチロシナーゼ酸化
ＮＰｒＣＡＰ／Ｍの０．１ｍＭを０．２ｍＭのシステインの共存下、チロシナーゼ（４０μｇ／ｍＬ）酸化し、３０分、１時間、３時間反応させた。反応生成物を６Ｍ−塩酸（５％チオグルコール酸を含む）で１１０℃、１．５時間反応させＨＰＬＣで分析後、残存する４−Ｓ−ＣＡＰ量と生成する４−Ｓ−システアミニル−６−Ｓ−システイニル カテコール量を測定した。ＮＰｒＣＡＰ／Ｍの初期濃度が半分になる時間は、６９分であった。
【００６９】
この結果から、４−Ｓ−ＣＡＰ／（ＮＰｒＣＡＰ／Ｍ）の反応速度の比は、１６．４になった。
【００７０】
一方、生成した４−Ｓ−システアミニル−６−Ｓ−システイニル カテコール量は時間とともに増加し、３時間後、８０μＭとなった。
【００７１】
以上の事から、ＮＰｒＣＡＰ／Ｍがチロシナーゼの基質になることが判明した。
【００７２】
実施例９：製剤例（１）軟膏剤
実施例４又は５で得たＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ又はＮＰｒＣＡＰ／Ｍを、日本薬局方記載のマクロゴール軟膏に、１０％含有量で混合し、軟膏剤を得た。
【００７３】
（２）注射剤
実施例４又は５で得たＮＰｒＣＡＰ／ＭＬ又はＮＰｒＣＡＰ／Ｍを、用時生理食塩水と４％濃度で懸濁させ、注射剤とした。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上記載のように、本発明は、磁気微粒子が有する腫瘍細胞に対する温熱免疫効果と、システアミニルフェノール誘導体が有する殺腫瘍細胞効果を相乗的に発現させることにより、従来のメラノーマ治療法の概念とは全く異なる新しい、化学・温熱免疫ナノメディシン療法に使用することができるメラノーマ標的温熱免疫治療剤を提供するものであり、その医療上の価値は多大なものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ8のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ8のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１〜５までの整数を表す。ただしｎが１のとき、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が同時に水素原子であることはない。）
で表されるシステアミニルフェノール誘導体と、磁性微粒子、または磁性微粒子を内包するリポソームとの重合体を有効成分とすることを特徴とするメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【請求項２】
前記磁性微粒子がマグネタイトであることを特徴とする請求項１に記載のメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【請求項３】
前記式（Ｉ）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ6のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ6のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１または２の整数である請求項１又は２に記載のメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【請求項４】
前記式（Ｉ）中、Ｒ1が水素原子又はメチル基であり、Ｒ2が水素原子又はメチル基であり、Ｒ3がメチル基、アセチル基又はプロピオニル基である請求項１〜３のいずれかに記載のメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【請求項５】
前記重合体において、前記磁性微粒子又は前記リポソーム間の結合が活性化架橋結合基およびメルカプト基との結合を介しており、前記メルカプト基は前記式（Ｉ）の末端に付加されてなるものである請求項１〜４のいずれかに記載のメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【請求項６】
前記活性化架橋結合基が、マレイミド基である請求項５に記載のメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ8のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ8のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１〜５までの整数を表す。ただしｎが１のとき、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が同時に水素原子であることはない。）
で表されるシステアミニルフェノール誘導体と、磁性微粒子、または磁性微粒子を内包するリポソームとの重合体を有効成分とすることを特徴とするメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【請求項２】
前記磁性微粒子がマグネタイトであることを特徴とする請求項１に記載のメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【請求項３】
前記式（Ｉ）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はＣ1〜Ｃ6のアルキル基を、Ｒ3は、水素原子、Ｃ1〜Ｃ6のアルキル基又はＣ1〜Ｃ8のアルカノイル基を表し、ｎは１または２の整数である請求項１又は２に記載のメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【請求項４】
前記式（Ｉ）中、Ｒ1が水素原子又はメチル基であり、Ｒ2が水素原子又はメチル基であり、Ｒ3がメチル基、アセチル基又はプロピオニル基である請求項１〜３のいずれかに記載のメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【請求項５】
前記重合体において、前記磁性微粒子又は前記リポソーム間の結合が活性化架橋結合基およびメルカプト基との結合を介しており、前記メルカプト基は前記式（Ｉ）の末端に付加されてなるものである請求項１〜４のいずれかに記載のメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【請求項６】
前記活性化架橋結合基が、マレイミド基である請求項５に記載のメラノーマ標的温熱免疫療法治療剤。
【公開番号】特開２００８−１９２０２（Ｐ２００８−１９２０２Ａ）
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１９１９４０（Ｐ２００６−１９１９４０）
【出願日】平成１８年７月１２日（２００６．７．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年１月１３日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｎａｎｏｊａａｍｅ．ｏｒ．ｊｐ／ｓｏｃｉｅｔｙ／ｆｏｒｕｍ０９．ｈｔｍｌ」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年２月４日 日本生体医工学会専門別研究会／ナノメディシン研究会／次世代治療技術開発のための細胞組織・分子機能の計測・制御研究会主催の「第９回ナノメディシン研究会・第３回次世代治療技術開発のための細胞組織・分子機能の計測・制御研究会」において文書をもって発表
【出願人】（５０６２３９７４０）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１２日（２００６．７．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年１月１３日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｎａｎｏｊａａｍｅ．ｏｒ．ｊｐ／ｓｏｃｉｅｔｙ／ｆｏｒｕｍ０９．ｈｔｍｌ」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年２月４日 日本生体医工学会専門別研究会／ナノメディシン研究会／次世代治療技術開発のための細胞組織・分子機能の計測・制御研究会主催の「第９回ナノメディシン研究会・第３回次世代治療技術開発のための細胞組織・分子機能の計測・制御研究会」において文書をもって発表
【出願人】（５０６２３９７４０）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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