本発明は、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を選択的に阻害する化合物を提供する。また本発明は、生体内での２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達を刺激するために、並びに内在性カンナビノイドシグナル伝達する症状を治療するために、ＭＡＧＬの選択的阻害剤を使用する方法をも提供する。加えて本発明は、ＭＡＧＬの選択的阻害剤でＭＡＧＬを薬物標的にすることよって癌を治療する又は腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。さらに本発明は、改良された生化学的及び薬学的特性を有するＭＡＧＬ阻害剤のスクリーニング方法をも提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
著作権告知
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．７１（ｅ）に基づき、出願人は、本情報開示の一部が著作権保護を受ける資料を含むことに特に言及しておく。本著作権者は、何人による本特許書類又は本特許の情報開示の複写複製に対しても、それが特許商標局の特許ファイル又は記録中に出現する場合には異議を唱えないが、その他の場合には全ての著作権を留保する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本特許出願は、米国仮出願第６１／１９９，２８６号（出願日２００８年１１月１４日）による優先権の利益を主張する。優先権基礎出願の全ての情報開示は、参照することにより、そのまま、すべての目的のために本明細書で援用されている。
【０００３】
政府支援に関する陳述
本発明は、一部、国立衛生研究所の助成金第Ｒ０１−ＤＡ０１７２５９号及びＲ０１−ＤＡ０２５２８５号による政府支援により成された。それ故に、米国政府は、本発明に一定の権利を有することができる。
【０００４】
発明の分野
本発明は、全体として他の脳セリンヒドロラーゼにモノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を選択的に阻害するための、並びに被験者における２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達を刺激するための方法及び組成物に関する。また本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害するための及び癌を治療するための方法にも関連する。
【０００５】
発明の背景
カンナビノイド受容体ＣＢ１及びＣＢ２は、マリファナの向精神成分、Δ^９−テトラヒドロカンナビノールの分子標的である。ＣＢ１は主に脳で発現するが、また肺、肝臓及び腎臓でも発現する。ＣＢ２は、主に免疫系及び造血細胞で発現する。また、二つの内在性リガンド、言い換えれば「内在性カンナビノイド」、即ちアラキドン酸含有脂質アナンダミド（Ｎ−アラキドノイルエタノールアミン、ＡＥＡ）及び２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）も同定されている。内在性カンナビノイド系は、食欲、痛覚、炎症、及び記憶を含むさまざまな生理的プロセスを制御しており、並びにそれは、肥満、慢性疼痛、、及び抑鬱等の障害を治療するために、重要な最新の薬学的興味の中心となっている。
【０００６】
内在性カンナビノイドシグナル伝達は、酵素的加水分解によって堅固に制御されている。２−ＡＧ又はＡＥＡの加水分解により、アラキドン酸（ＡＡ）が産生される。主要なＡＥＡ−加水分解酵素は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）である。遺伝子的な又は薬理学的なＦＡＡＨの破壊により、神経系及び抹消の至る所でＡＥＡレベルが著しく上昇し、結果的に、痛覚、炎症、、及び抑鬱の減少を含む、多発性のＣＢ１−及び／又はＣＢ−２依存性の行動的影響に帰着する。興味深いことに、低体温症及び運動障害等の、直接作用性ＣＢ１アゴニストの周知の他の行動的影響の幾つかは、ＦＡＡＨ破壊動物では観察されない（ゴパーラジュら（Ｇｏｐａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．）、「フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）」、１９９８年、第４２２巻：ｐ．６９−７３；及びカスリアら（Ｋａｔｈｕｒｉａ ｅｔ． ａｌ．）、「ネイチャー・メディスン（Ｎａｔ Ｍｅｄ）」、２００３年、第９巻：ｐ．７６−８１）。これらの動物は、また野生型の２−ＡＧ１７レベルを有しており、このことは生体内でさらなるＣＢ１制御の挙動プロセスが２−ＡＧによって媒介されているかもしれないことを示唆している。幾つかのエビデンスは、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）が神経系における２−ＡＧの加水分解のための主要な酵素であることを示唆している。例えば、ディンら（Ｄｉｎｈ ｅｔ ａｌ．）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」、２００２年、第９９巻：ｐ．１０８１９−２４；ディンら（Ｄｉｎｈ ｅｔ ａｌ．）、「モレキュラー・ファルマコロジー（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）」、２００４年、第６６巻：ｐ．１２６０−４；ブランクマンら（Ｂｌａｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００７年、第１４巻：ｐ．１３４７−５６；及び野村ら（Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー・ケミカル・バイオロジー（Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００８年、第４巻：ｐ３７３−８、を参照。しかしながら、これら以前の研究のどれも、ＭＡＧＬが生体内における２−ＡＧの加水分解で果たす役割を明確には検討していない。一方、幾つかのＭＡＧＬ阻害剤が当該技術分野において開示されているが（ホーマンら（Ｈｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００５年、第４３５巻：ｐ．１１０８−１２；ヴァーヴェルら（Ｖａｒｖｅｌ ｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・ファルマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティックス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｓｐ．Ｔｈｅｒ．）」、２００２年、第３０１巻：ｐ．９１５−２４；及びサーリオら（Ｓａａｒｉｏ ｅｔ ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００５年、第１２巻：ｐ．６４９−５６）、そのどれも生体内で薬理学的なツールとして一般的に使用するために要求されるレベルの有効性も明確性も示していない。
【０００７】
腫瘍及び癌は、多くの人々の生命と健康を脅かす疾患又は症状である。侵襲性の腫瘍細胞の無抑制の増殖が、しばしば結果として悪性腫瘍（癌）を形成する。癌を根治的に治療することのできる有効な医薬又は治療法は未だ存在しない。現時点で腫瘍の治療に使用される主要な方法は、手術、放射線療法、化学療法、生物学的療法、及びホルモン療法、中国の伝統療法、温熱療法、ラジオ波焼灼療法等の他の療法等々である。しかし、利用可能なほとんどの治療法は、被験者の症候及び身体的症候を軽減することができるだけであり、疾患を治療することはできず、しかも通常、各治療法は副作用を含む不利益を有している。
【０００８】
当該技術分野において、生体内で強力かつ選択的にＭＡＧＬを阻害する化合物を求める、並びに内在性カンナビノイドシグナル伝達活性する症状又は障害を治療するための新規な方法を求めるが存在する。また発明者らには、腫瘍増殖の阻害及び癌治療のための代替可能で効果的な方法を求めるが存在する。本発明は、これら及び当該技術分野において実現されていない他の。
【発明の概要】
【０００９】
一態様において、本発明は、被験者における２−アラキドノイルグリセロール媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達を刺激するための方法を提供する。当該方法は、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を選択的に阻害する化合物の治療的に有効な量を、被験者に対し投与すること（例えば、腹腔内注射又は経口投与）を。これらの方法の幾つかにおいて、化合物は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）にＭＡＧＬ選択的。例えば、化合物は、ＦＡＡＨＭＡＧＬの阻害に少なくとも１００倍の選択性を有することができる。これらの方法の幾つかで用いるＭＡＧＬ選択的阻害剤は、本明細書に開示する式Ｉに示す構造を有する。幾つかの他の方法において、ＭＡＧＬ特異的阻害剤は、ＦＡＡＨ及びα／βヒドロラーゼ６（ＡＢＨＤ６）の両方にＭＡＧＬ選択的である。幾つかの好ましい実施態様においては、ＭＡＧＬ選択的阻害剤は化合物ＪＺＬ１８４である。好ましくは、本発明の方法で治療されるべき被験者はである。これらの方法の幾つかにおいて治療されるべき被験者は、例えば疼痛、炎症、抑鬱又は等の、内在性カンナビノイドシグナル伝達によって媒介される又は関連する、症状又は障害を患っている。
【００１０】
関連する態様において、本発明は、被験者における、内在性カンナビノイドシグナル伝達する症状、又はその治療効果が増加したカンナビノイド（例えば、２−ＡＧ）レベルに由来することができる疾患、を治療又は回復するための方法を提供する。これらの方法は、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を選択的に阻害する化合物の治療的に有効な量を含む医薬組成物を被験者に投与することを含んでいる。これらの方法の幾つかは、２−ＡＧシグナル伝達が役割を果たす、例えば疼痛等の症状又は障害を治療することに向けられる。これらの方法の幾つかは、式Ｉに示す構造を有するＭＡＧＬ選択的阻害剤を用いる。当該方法の幾つかにおいて、ＭＡＧＬ選択的阻害剤は、ＦＡＡＨにモノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を選択的に阻害する。幾つかの他の方法において、用いた化合物はＦＡＡＨ及びＡＢＨＤ６の両方にＭＡＧＬの阻害に選択的である。幾つかの好ましい実施態様において、用いるＭＡＧＬ選択的阻害剤は化合物ＪＺＬ１８４である。
【００１１】
他の態様において、本発明はＭＡＧＬ選択的阻害剤の化合物を提供する。これらの化合物は、下記の式Ｉに示す構造を有する：
【化１】

【００１２】
式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ_１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々は、下記の構造の有する。
【化２】

【００１３】
本発明の好ましいＭＡＧＬ選択的阻害剤の化合物は化合物ＪＺＬ１８４である。その構造は、式Ｉに示すが、式中ＸはＣＨ、Ｒ１はＯＨであり、そしてＲ２及びＲ３の各々は、下記に示す構造を有する。
【化３】

【００１４】
さらに他の態様において、本発明は、改良された性質を有するＭＡＧＬ阻害剤の化合物を同定するための方法を提供する。当該方法は、（ａ）本明細書で開示されるＭＡＧＬ選択的阻害剤（例えば、ＪＺＬ１８４）の一以上の構造アナログを合成すること、（ｂ）ＭＡＧＬ選択的阻害剤の比較して改良された生物学的又は薬学的性質を有するアナログを同定すること、を。式Ｉに包含される任意の化合物も、構造アナログの合成ためのリード化合物として役立つことができる。幾つかの好ましい実施態様において、化合物ＪＺＬ１８４が使用される。これらのスクリーニング法において、アナログにおいて同定されるべき、改良された生物学的又は薬学的性質は、例えば、ＭＡＧＬに対する増強された阻害活性又は脳セリンヒドロラーゼＭＡＧＬに対する増加された選択性等であることができる。
【００１５】
他の態様において、本発明は、腫瘍細胞、特に侵襲性の腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。当該方法は、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を特異的に阻害する化合物と接触させることを。幾つかの実施態様において、当該方法は被験者に存在する腫瘍の増殖を阻害することに向けられる。被験者は、癌を有すると診断された者であることができる。また被験者は、癌にかかりやすい又は癌になる危険のある者であことができる。当該方法は、充実性腫瘍及び白血病の細胞を含む、任意の腫瘍細胞の増殖を阻害するために用いることができる。幾つかの実施態様において、当該方法は、乳房腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、黒色腫細胞、肺腫瘍細胞又は脳腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用される。
【００１６】
本発明の幾つかの方法において、用いられるＭＡＧＬ阻害化合物（又は「ＭＡＧＬ拮抗化合物」又は「ＭＡＧＬアンタゴニスト化合物」）は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）にＭＡＧＬの阻害に選択的である。例えば、化合物は、本明細書で開示される任意のＭＡＧＬ選択的阻害剤であることができる。幾つかの他の実施態様において、用いられるＭＡＧＬ阻害化合物は、ＭＡＧＬに特異的な阻害ポリヌクレオチドである。このような阻害性ポリヌクレオチドの例には、低分子緩衝ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸及び相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が含まれる。
【００１７】
関連する態様において、本発明は、被験者の腫瘍の症候を治療又は回復する方法を提供する。これらの方法は、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を特異的に阻害する化合物の治療的に有効な量を含む医薬組成物を被験者に投与することを含んでいる。任意の腫瘍又は癌により苦しめられる被験者も、これらの方法による治療のために回復可能である。例えば、当該方法は、乳腺腫瘍、卵巣腫瘍、黒色腫、肺腫瘍又は脳腫瘍を患う被験者を治療するために使用することができる。幾つかの方法において、用いられるＭＡＧＬ阻害剤は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）にＭＡＧＬの阻害に選択的である化合物である。幾つかの他の方法において、ＭＡＧＬの発現又は細胞内レベルを特異的に減少させる阻害ポリヌクレオチドが使用される。
【００１８】
本発明の特徴及び長所に関するより深い理解は、明細書及び特許請求の範囲の残りの部分を参照することによって得ることができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａ−１Ｂは、ＭＡＧＬ阻害剤の構造及び拮抗ＡＢＰＰプロファイルを示している。Ａ：ＭＡＧＬ阻害剤の構造；Ｂ：マウス脳膜プロテオーム中のセリンヒドロラーゼ活性へのＭＡＧＬ阻害剤の影響を示す拮抗ＡＢＰＰ。比較のために示したものは、それぞれ選択的ＦＡＡＨ及びＡＢＨＤ６阻害剤、ＵＲＢ５９７（カスリアら（Ｋａｔｈｕｒｉａ ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー・メディスン（Ｎａｔ Ｍｅｄ）」、２００３年、第９巻：ｐ．７６−８１）及びＷＷＬ７０（リーら（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」、２００７年、第１２９巻：ｐ．９５９４−５）である。阻害剤を脳膜と共に３０分間インキュベートし、次にセリンヒドロラーゼ指向ＡＢＰＰプローブＦＰローダミン（２マイクロＭ、３０分間）で処理し、それからプロテオームをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びインゲル蛍光スキャニングによって分析し、阻害された酵素を検出した。対照プロテオームは、ＤＭＳＯのみで処理した。蛍光ゲルをグレイスケールで示す。文献（例えば、ブランクマンら（Ｂｌａｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００７年、第１４巻：ｐ．１３４７−５６）に報告された通り、脳ＭＡＧＬがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって３５ｋＤａの二重線として移動することに特に言及しておく。
【図２】図２Ａ−２Ｃは、ＪＺＬ１８４の二の生体外キャラクタリゼーションを示している。Ａ：拮抗的ＡＢＰＰによって定量した、マウス脳膜セリンヒドロラーゼへのＪＺＬ１８４の濃度依存的影響；Ｂ：基質アッセイ法（それぞれ２−ＡＧ及びオレイン酸アミド）によって定量した、ＪＺＬ１８４による脳膜ＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ活性の遮断；Ｃ：基質アッセイ法（それぞれ２−ＡＧ及びアナンダミド）によって定量した、ＪＺＬ１８４による組換え型ＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ活性の遮断。酵素はＣＯＳ７細胞中で組換えにより発現させた。ＪＺＬ１８４は、組換え型ＭＡＧＬ活性のほぼ完全な遮断を引き起こしたが（＞９５％）、おそらく他の酵素の活性を反映して、脳膜においては２−ＡＧ加水分解活性の〜１５％の残存が観察されたことに特に言及しておく。Ａ−Ｃについては、分析に先立って試料をＪＺＬ１８４で３０分間処理した。Ｂ及びＣについては、データは、三つの独立した実験に対する平均±標準誤差として表した。
【図３】図３Ａ−３Ｆは、ＪＺＬ１８４の生体内でのキャラクタリゼーションを示している。Ａ及びＢ：明示の投与量（４−４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）でＪＺＬ１８４により４時間処理したマウスから調製した脳膜の、セリンヒドロラーゼ活性プロファイル（Ａ）並びにＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ活性（Ｂ）；Ｃ：ＪＺＬ１８４により処理（１６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与、４時間）したマウスから調製された脳膜中のセリンヒドロラーゼ活性のＡＢＰＰ−ＭｕｄＰＩＴ分析。ＭＡＧＬ及びＦＡＡＨの対照シグナルは、それぞれ赤色及び青色のバーで示す；Ｄ−Ｆ：明示の投与量（４−４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）でＪＺＬ１８４により４時間処理したマウス由来の、脳の２−ＡＧ（Ｄ）、アラキドン酸（Ｅ）、及びＮＡＥ（Ｆ）レベル（Ｆ）。Ｆについては、このＦＡＡＨ阻害剤によって誘導されるＮＡＥの増加を確認するために、ＵＲＢ５９７で処理（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）したマウスからのデータも示す。Ｂ−Ｆについては、溶媒処理対照動物と対比した阻害剤処理動物について、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝３−５である。
【図４】図４Ａ−４Ｅは、生体内でのＪＺＬ１８４の阻害活性の時間経過解析を示している。Ａ及びＢ：明示の時間、ＪＺＬ１８４（１６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）により処理したマウスから調製した脳膜のセリンヒドロラーゼ活性プロファイル（Ａ）並びにＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ活性（Ｂ）；Ｃ−Ｅ：明示の時間ＪＺＬ１８４により処理（１６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）したマウス由来の、脳の２−ＡＧ（Ｄ）、アラキドン酸（Ｅ）、及びＮＡＥレベル。Ｂ−Ｅについては、溶媒処理対照動物と対比した阻害剤処理動物について、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝３−５である。
【図５】図５Ａ−５Ｅは、ＪＺＬ１８４の行動的影響を示している。Ａ及びＢ：ＪＺＬ１８４（１６ｍｇ／ｋｇ）は、熱痛覚の尾浸漬アッセイ法において（Ａ）並びに有害な化学痛覚の酢酸腹腔緊張アッセイ法において（Ｂ）鎮痛作用を引き起こした。これらの効果は、ＣＢ１アンタゴニスト、リモナバン（３ｍｇ／ｋｇ）による前処理によって遮断された；Ｃ−Ｅ：ＪＺＬ１８４は、著しい低体温症（Ｃ）、運動性低下症（Ｄ）、及び反射亢進（Ｅ）を引き起こしたが、それらはまたリモナバンによって著しく減弱された。ベースラインの尾浸漬潜伏時間及び直腸温度は、それぞれ０．８２±０．０２秒及び３７．４±０．１℃であった。溶媒−ＪＺＬ１８４処理マウスと対比した溶媒−溶媒処理マウスについて、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。溶媒処理マウス、リモナバン-ＪＺＬ１８４処理マウス対比した溶媒−ＪＺＬ１８４処理マウスについて、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝１０−１４である。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、化合物ＷＷＬ９８の構造（Ａ）及び化合物ＪＺＬ１８４の合成経路（Ｂ）を示している。他のカルバミン酸系阻害剤も同様の経路で合成した。
【図７】図７Ａ−７Ｃは、ＭＡＧＬ及びＦＡＡＨのＩＺＬ１８４による経時的な阻害を示している。Ａ：マウス脳膜プロテオーム中のＭＡＧＬ活性のＦＰローダミン標識化のＪＺＬ１８４による阻害；Ｂ：マウス脳膜プロテオーム中のＦＡＡＨ活性のＦＰローダミン標識化のＪＺＬ１８４による阻害；Ｃ：ＪＺＬ１８４によるＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ阻害についての計算値ｋ_ｏｂｓ／［Ｉ］。
【図８】図８Ａ−８Ｂは、化合物ＪＺＬ１８４は、ＣＢ１受容体に結合しないこと又は２−ＡＧ生合成酵素ＤＡＧＬβを阻害しないことを示している。Ａ：ＪＺＬ１８４は、ＣＢ１受容体から^３Ｈ−リモナバンの結合を置換しなかった；Ｂ：ＪＺＬ１８４（２５μＭ）は、組換えでＣＯＳ−７細胞中に発現されたＤＡＧＬβを阻害しなかった。既知のＤＡＧＬβ阻害剤テトラヒドロリプスタチン（ＴＨＬ、２５μＭ）を正の対照として使用した。
【図９】図９Ａ−９ＢはＪＺＬ１８４の用量反応のための脳脂質測定値を示している。ＪＺＬ１８４（４−４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）の投与４時間後に脳のＣ１８：１又はＣ１６：０ＭＡＧ（Ａ）又は遊離脂肪酸（Ｂ）レベルにおける著しい変化は測定されないことが認められた。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｅは、ＪＺＬ１８４の経口投与の効果を示している。Ａ及びＢ：明示の投与量（４−４０ｍｇ／ｋｇ、経口投与）でＪＺＬ１８４により４時間処理したマウスから調製した脳膜の、セリンヒドロラーゼ活性プロファイル（Ａ）並びにＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ活性（Ｂ）；Ｃ及びＤ：ＪＺＬ１８４（１−４０ｍｇ／ｋｇ、経口投与）により４時間処理したマウス由来の、脳の２−ＡＧ（Ｃ）及びＡＥＡ（Ｄ）レベル；Ｅ：腹腔内又は経口投与によって処理したマウス由来の脳のＪＺＬ１８４の相対レベル。Ｂ−Ｄについては、溶媒処理動物と対比した阻害剤処理動物について、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝３−５である。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｃは、ＪＺＬ１８４処理に続くマウスにおける脳脂質測定値の時間経過を示している。ＪＺＬ１８４投与（１６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）に続く２４時間を通して、脳のＣ１８：１又はＣ１６：０のＮＡＥ（Ａ）、ＭＡＧ（Ｂ）、又は遊離脂肪酸（Ｃ）レベルにおいて著しい変化は認められなかった。
【図１２】図１２は、マウス脳中のＪＺＬ１８４レベルの時間経過解析を示している。ＪＺＬ１８４を１６ｍｇ／ｋｇで経口投与した。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｄは、侵襲性の癌細胞内でＭＡＧＬが増加することを示しているが、ここで当該酵素はモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）レベルを制御する。（Ａ）非侵襲性（青色）及び侵襲性（赤色）のヒト癌細胞株内のセリンヒドロラーゼ活性のＡＢＰＰ。セリンヒドロラーゼ活性は、細胞全体のプロテオームにおいて活性に基づくプローブ、ＦＰローダミンで標識化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びインゲル蛍光スキャニング（蛍光ゲルをグレイスケールで示す）によって検出した。赤色枠で強調したのは二の酵素、ＭＡＧＬ及びＫＩＡＡ１３６３は、非侵襲性癌細胞と対比して侵襲性癌細胞において一貫して増加している。３３及び３５ｋＤａのＦＰローダミン標識バンドがＭＡＧＬを表すことを確認するために、プロテオームを、ＤＭＳＯ又は選択的ＭＡＧＬ阻害剤ＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）により前処理した癌細胞からも調製した。（Ｂ）ＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）の存在下（赤色バー）又は非存在下（黒色バー）における癌細胞のＣ２０：４ＭＡＧ加水分解活性。（Ｃ、Ｄ）ＭＡＧＬの阻害（ＪＺＬ１８４ １μＭ、４時間）は、侵襲性細胞のＭＡＧレベルを増加し（Ｃ）ＦＦＡレベルを減少するが（Ｄ）、しかし非侵襲性細胞ではそうではない。侵襲性の癌細胞は、それぞれのＭＡＧＬ活性を反映して、非侵襲性の癌細胞と比較して基本的により高レベルのＦＦＡ（及びより低レベルのＭＡＧ）を有することに特に言及しておく。ＤＭＳＯ処理対照群と対比したＪＺＬ１８４処理群について、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。非侵襲性癌細胞と対比した侵襲性癌細胞について、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝４−５である。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｆは、ＭＡＧＬの安定なｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンが侵襲性癌細胞においてＦＦＡレベルを低下することを示している。（Ａ、Ｄ）ＭＡＧＬを、二の独立した短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）オリゴヌクレオチド（ｓｈＭＡＧＬ１、ｓｈＭＡＧＬ２）を使用して安定にノックダウンした結果、異なるセリンヒドロラーゼ（ＤＰＰＩＶ）を標的とするｓｈＲＮＡを発現するｓｈ対照細胞と比較してＣ８１６１及びＳＫＯＶ３細胞のＭＡＧＬ活性において＞７０％が減少した。（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）ｓｈＭＡＧＬ細胞は、ＭＡＧレベルの増加（Ｂ、Ｅ）及びＦＦＡレベルの減少（Ｃ、Ｆ）を示している。ｓｈ対照群と対比したｓｈＭＡＧＬ群について、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。非侵襲性癌細胞と対比した侵襲性癌細胞について、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１である。ｓｈ対照細胞のＭＡＧＬ活性並びにＭＡＧ及びＦＦＡレベルは、親癌細胞株のそれらからそれほど異なっていなかった。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝４−５である。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｃは、高悪性度の原発性ヒト卵巣腫瘍が良性腫瘍と比較して増加したＭＡＧＬ活性及びＦＦＡを有することを示している。（Ａ）個体の腫瘍検体についてのＣ２０：４ＭＡＧ加水分解活性測定値。ＪＺＬ１８４（１μＭ、３０分間）による前処理が、測定された加水分解活性の大部分はＭＡＧＬによることを確認した。（Ｂ）高悪性度腫瘍と対比した良性腫瘍におけるＭＡＧＬ活性の概要図であり、ここで各値は、（Ａ）に示した総Ｃ２０：４ＭＡＧ加水分解活性のＪＺＬ１８４感受性の部分として表した。（Ｃ）高悪性度腫瘍と対比した良性腫瘍におけるＦＦＡレベル。良性腫瘍群と対比した高悪性度群について、^＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝１０−１３である。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｊは、ｓｈＲＮＡ媒介ノックダウン及びＭＡＧＬの薬理学的阻害が癌の侵襲性をことを示している。（Ａ−Ｃ、Ｆ−Ｇ）ｓｈＭＡＧＬ細胞は、ｓｈ対照及び非感染の親細胞と比較して、減少した移動（Ａ、Ｆ）、浸潤（Ｂ、Ｇ）、及び細胞生存（Ｃ、Ｈ）を示す。移動及び浸潤アッセイは、細胞５０，０００個をコラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）で被覆した膜又はバイオコートＴＭマトリゲル（ＢｉｏＣｏａｔＴＭ Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）を含有する８μｍ孔径を備えたインサートに播種する前に、癌細胞を４時間無血清培地に移植することによってそれぞれ実施した。Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３の移動時間は、それぞれ５時間及び２０時間だった。移動又は浸潤した細胞は、倍率４００Ｘで４視野当たり計数した平均数±標準誤差で言及する。細胞生存アッセイは、細胞２０、０００個を無血清培地中で９６ウェルプレートに播種することによって実施した。生存は、ＷＳＴ−１増殖アッセイを使用して評価した。代表的な移動プレート（倍率４００Ｘ）をｓｈＭＡＧＬ細胞と対比したｓｈ対照細胞について示す（Ａ、Ｆ）。（Ｄ、Ｉ）ｓｈＭＡＧＬ細胞は、ｓｈ対照細胞及び非感染の親細胞と比較して、ＳＣＩＤマウスにおいて損傷した腫瘍増殖を示している。Ｃ８１６１又はＳＫＯＶ３細胞２ｘ１０６個／１００μｌを側腹部の皮下に注入し、ノギスを使用して腫瘍増殖を測定した。（Ｅ、Ｊ）ＪＺＬ１８４処理（４μｌ／ｇポリエチレングリセロール３００溶媒として毎日４０ｍｇ／ｋｇを経口投与）は、溶媒処理と比較してＳＣＩＤマウスにおける異種移植した腫瘍増殖速度を著しく減少する。ｓｈ対照群と対比したｓｈＭＡＧＬ群又は溶媒処理群と対比したＪＺＬ１８４群について、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。ｓｈ対照細胞及び親癌細胞は、その移動、細胞生存、浸潤、又は生体内での腫瘍増殖においてそれほど異なっていなかった。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝５−８である。
【図１７】図１７Ａ−１７Ｆは、ＭＡＧＬの異所性発現がＦＦＡレベルを増加し、そしてＭＵＭ２Ｃ黒色腫細胞の生体外及び生体内の病原性を亢進することを示している。（Ａ）ＡＢＰＰ（上段パネル）、ウェスタンブロット（中断パネル）及びＣ２０：４ＭＡＧ加水分解活性（下段パネル）によって確認したＭＵＭ２Ｃ細胞中のＭＡＧＬの過剰発現（ＭＡＧＬ−ＯＥ、赤色バー）。対照細胞及びＳ１２２Ａ細胞（黒色バー）は、それぞれ空のベクター（ＥＶ）に感染した癌細胞又は触媒的に不活性なＭＡＧＬ変異株（Ｓ１２２Ａ）に相当する。ウェスタン分析によりＳ１２２Ａ−ＭＡＧＬ変異株の過剰発現を確認したが、当該変異株は、ＡＢＰＰ及びＣ２０：４ＭＡＧ加水分解アッセイによって評価されたように、いかなる活性も示さなかった。（Ｂ、Ｃ）ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞は、ＥＶ対照細胞及びＳ１２２Ａ細胞と比較してより低いＭＡＧレベル（Ｂ）及びより高いＦＦＡレベル（Ｃ）を含んでいる。これらの代謝的効果は、生体内原位置でのＪＺＬ１８４による処理（１μＭ、４時間、栗色のバー）によって逆転された。（Ｄ、Ｅ）ＭＡＧＬ−ＯＥ ＭＵＭ２Ｃ細胞は、ＥＶ及びＳ１２２Ａ対照細胞と比較して、増加した移動（Ｄ）及び浸潤（Ｅ）を示している。この亢進した移動及び浸潤は、ＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）によって逆転された。代表的な移動パネルを示す（Ｄ）。（Ｆ）ＭＡＧＬ−ＯＥ ＭＵＭ２Ｃ細胞は、ＥＶ又はＳ１２２Ａ対照細胞と比較してＳＣＩＤマウスにおいて著しく亢進した腫瘍増殖速度を示す（細胞２ｘ１０^６個を正所性に移植）。対照群と対比したＭＡＧＬ−ＯＥ群について、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。データは平均±標準誤差で表す。群当たりｎ＝４−６である。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｄは、外来性脂肪酸での処理によるｓｈＭＡＧＬ癌細胞の病原性の特性の回復をいる。（Ａ）減少したｓｈＭＡＧＬ細胞の移動は、パルミチン酸又はステアリン酸による処理（２０μＭ、４時間、斜線赤色バー）によって逆転される。（Ｂ）パルミチン酸又はステアリン酸の添加（２０μＭ、４時間）は、ＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３細胞の移動を増加し、そしてＪＺＬ１８４処理ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞における減少した移動を救出する。（Ｃ）ｓｈＭＡＧＬ−Ｃ８１６１細胞の減少した腫瘍増殖は、高脂肪食（ＨＦＤ）（６０ｋｃａｌ％脂肪）による処理によって逆転される。癌細胞を側腹部へ注入する前の２週間、マウスを通常固形飼料（ＮＣ）又はＨＦＤで飼い、腫瘍増殖の時間経過を通じてこれらの飼料で養った。挿入図は、時間経過を通じての動物の体重である。ＨＦＤ群由来の外植されたｓｈＭＡＧＬ腫瘍（斜線赤色バー）は、ＮＣ群由来のｓｈＭＡＧＬ腫瘍（赤色バー）と比較して増加したＦＦＡレベルを含んでいる。ｓｈ対照群と対比したｓｈＭＡＧＬ群について、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。ｓｈＭＡＧＬ対照群（それそれＤＭＳＯ処理群及びＮＣ処理群）と対比したパルミチン酸又はステアリン酸又はＨＦＤ処理したｓｈＭＡＧＬ群について、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。（Ａ）については、群当たりｎ＝４−５；（Ｂ、Ｃ）については、群当たりｎ＝７−８である。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｉは、ＭＡＧＬがプロ腫瘍原性シグナル伝達分子に富む脂質代謝ネットワークを制御することを示している。（Ａ、Ｂ）ＥＶ対照細胞と対比したＭＡＧＬ−ＯＥ（ＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３の両方）（Ａ）及びｓｈ対照細胞と対比したｓｈＭＡＧＬ（Ｂ）の異常ＭＡＧＬ活性に関する癌細胞モデルのリピドーム解析。示した代謝産物は、ＥＶ対照細胞と対比したＭＡＧＬ−ＯＥ細胞（ＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３の両方）において増加した（赤色）又は減少した（青色）代謝産物であり（Ａ）、そしてｓｈ対照細胞と対比したｓｈＭＡＧＬ細胞（Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３の両方）においては逆の特性を示した（Ｂ）。代謝産物の親質量を提供しており、円の大きさは相対的な変化の大きさを示している。（Ｃ、Ｄ）癌細胞モデルにおけるＣ１６：０ＬＰＡ及びＰＧＥ_２レベルの定量。（Ｅ）Ｃ１６：０ＬＰＡ（１００ｎＭ、４時間）又はＰＧＥ_２（１００ｎＭ、４時間）によるｓｈＭＡＧＬ癌細胞の処理は、ｓｈ対照細胞と比較してそれらの移動障害を救出する。百日咳毒素（ＰＴＸ）（１００ｎｇ／ｍｌ、４時間）は、ＭＡＧＬ−ＯＥ癌細胞の増加した移動を逆転する。（Ｇ）ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞と対比したＥＶ対照細胞におけるＬＰＡによる移動の濃度依存的刺激。ＬＰＡによって誘導されるＥＶ対照細胞における移動の最大刺激は、ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞において見出される亢進した移動と基本的に一致し、そしてＬＰＡはＭＡＧＬ−ＯＥ細胞の移動をそれ以上増加しないことに特に言及しておく。（Ｈ）移動損傷パーセンテージで表した、ｓｈＭＡＧＬ癌細胞と対比したｓｈ対照癌細胞のＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）阻害剤チロホスチンＡＧ−１４７８に対する感受性。チロホスチンの抗移動効果に関するＩＣ_５０値をパネル中に提供する。（Ｉ）ＭＡＧＬ−ＦＦＡ経路を他のプロ腫瘍原性脂質へと結びつけることが可能な代謝ネットワークを示す図。（Ａ）及び（Ｂ）について、データは比較群間の平均相対変化として表した；群当たりｎ＝４−５。（Ｃ−Ｇ）について、それぞれの対照細胞群と比較したＭＡＧＬ−ＯＥ細胞群又はｓｈＭＡＧＬ細胞群（Ｃ−Ｇ）、ＤＭＳＯ処理対照細胞と対比したＪＺＬ１８４処理細胞（Ｃ、Ｄ）については、^＊はＰ＜０．０５、^＊＊はＰ＜０．０１である。侵襲性細胞（Ｃ８１６１、ＳＫＯＶ３）と対比した非侵襲性親細胞（ＭＵＭ２Ｃ、ＯＶＣＡＲ３）（Ｃ、Ｄ）、又はｓｈ対照細胞と対比したＬＰＡ／ＰＧＥ_２処理ｓｈＭＡＧＬ細胞（Ｅ）については、＃＃はＰ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差で表した；群当たりｎ＝３−５。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｇは、パネルを通して、非侵襲性と対比した侵襲性の黒色腫細胞株及び卵巣癌細胞株のＭＡＧＬ、ＫＩＡＡ１３６３及び脂肪分解プロファイルを示している。ＭＡＧＬ阻害剤ＪＺＬ１８４による癌細胞処理によって引き起こされる増加したＭＡＧと減少したＦＦＡとの間に質量バランスの矛盾が存在する。（Ａ−Ｃ）侵襲性黒色腫細胞（Ｃ８１６１）及び卵巣細胞（ＳＫＯＶ３）は、それらの非侵襲性カウンターパート（それぞれＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３細胞）と比較してより大きな移動（Ａ）及び浸潤（Ｂ）及びより速い腫瘍増殖速度（Ｃ）を示す。（Ｄ）癌細胞株の脂肪分解特性は、他の脂肪分解活性と比較して、侵襲性癌細胞において強いＭＡＧ加水分解活性を示す。生体外での、種々の脂質基質からの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の遊離を測定した。細胞を無血清培地中、生体内原位置でＤＭＳＯ又はＪＺＬ１８４により４時間処理した。細胞溶解物（２０μｇ）を１００μＭ脂質基質と共に室温で１時間インキュベートした。上段及び下段のパネルは、比較及び可視化を容易にするために同じデータを異なったｙ軸の尺度（ＭＡＧ加水分解活性の有無）で示している。脂質基質についての略称は下記のとおりである。ＴＡＧ、トリアシルグリセロール；ＤＡＧ、ジアシルグリセロール；ＭＡＧ、モノアシルグリセロール；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＬＰＣ、リゾホスファチジルコリン；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン；ＬＰＥ、リゾホスファチジルエタノールアミン。非侵襲性癌株群と対比した侵襲性癌株群については、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１であり、ＪＺＬ１８４と対比したＤＭＳＯについては、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した；群当たり、ｎ＝３−１５（Ｇ）リゾリン脂質の増加は、ＭＡＧＬ阻害剤ＪＺＬ１８４による癌細胞処理によって引き起こされる増加したＭＡＧと減少したＦＦＡの間の質量バランスの矛盾を説明する。（Ｅ）ＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）は、Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３細胞において５５００−６１００ｐｍｏｌ／１０^６のＦＦＡレベルの減少を引き起こす。このＦＦＡレベルの減少は、ＪＺＬ１８４処理癌細胞において見出されるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）及びリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）レベルの正味の増加（４１００−６５００ｐｍｏｌ／１０^６細胞）と同様の大きさである。（Ｆ）Ｃ１７：０ＭＡＧ（２０μＭ、１時間）は、癌細胞によってＣ１７：０ＬＰＣ及びＣ１７：０ＬＰＥに変換されるが、しかもこの変換は癌細胞をＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）と共にプレインキュベーションすることによってより亢進される。Ｃ１７：０ＭＡＧは、またＣ１７：０ＬＰＡにも変換されるが、しかしこの場合には、当該変換はＪＺＬ１８４によって遮断される。これらのデータは、Ｃ１７：０ＭＡＧは、癌細胞中でＣ１７：０ＬＰＣ及びＣ１７：０ＬＰＥに直接転換されるが、一方、Ｃ１７：０ＭＡＧのＣ１７：０ＬＰＡへの変換には、Ｃ１７：０ＭＡＧのＣ１７：０ＦＦＡへのＭＡＧＬ依存加水分解が要求されることを示している。Ｃ２０：４ＭＡＧ（２０μＭ、１時間）は、プロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ２）に変換されるが、この変換はＪＺＬ１８４によって遮断される。（Ｇ）Ｃ１６：０及びＣ２０：４ＦＦＡは、侵襲性癌細胞によってそれぞれＬＰＡ及びＰＧＥ２に変換される。Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３細胞を、無血清培地中、ｄ_２−Ｃ１６：０ＦＦＡ又はｄ_８−Ｃ２０：４ＦＦＡ（１０μＭ、４時間）で処理した。ｄ_２−Ｃ１６：０ＦＦＡは、ｄ_２−Ｃ１６：０ ＬＰＡに変換され、ｄ_８−Ｃ２０：４ＦＦＡは、ｄ_８−Ｃ２０：４ＰＧＥ_２に変換された。処理細胞と対比した対照細胞の比較については、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１であり、ＭＡＧ単独処理細胞と対比したＪＺＬ１８４／ＭＡＧ処理細胞の比較については、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差で表した；群当たり、ｎ＝３−４。
【図２１】図２１Ａ−２１Ｉは、ＭＡＧＬが侵襲性癌細胞株においてＭＡＧ、ＦＦＡ及び癌細胞の病原性を制御することを示している。（Ａ、Ｂ）ＪＺＬ１８４処理（１μＭ、４時間）は、２３１ＭＦＰ細胞においてＭＡＧレベルを増加し（Ａ）及びＦＦＡレベルを減少する。（Ｃ）ｓｈＭＡＧＬプローブは、活性に基づいたタンパク質プロファイリング（ＡＢＰＰ）によって判断すると、侵襲性癌細胞Ｃ８１６１、ＳＫＯＶ３、及び２３１ＭＦＰにおいて他のセリンヒドロラーゼと比較してＭＡＧＬの活性を選択的に減少する。活性に基づいたプローブＦＰローダミンにより細胞全体のプロテオームにおいてセリンヒドロラーゼ活性を標識化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びインゲル蛍光スキャニング（蛍光ゲルをグレイスケールで示す）によって検出した。、ＡＢＰＰ（対Ｃ８１６１、ＳＫＯＶ３、及び２３１ＭＦＰ）及びＣ２０：４ＭＡＧ基質アッセイ（対２３１ＭＦＰ）によって評価しところ、ＭＡＧＬ活性は両方のｓｈＭＡＧＬプローブ（ｓｈＭＡＧＬ１、ｓｈＭＡＧＬ２）により＞７５％減少した。（Ｄ、Ｅ）ｓｈＭＡＧＬ細胞は、ｓｈ対照又は２３１ＭＦＰ親細胞と比較して増加したＭＡＧレベル（Ｄ）及び減少したＦＦＡレベル（Ｅ）を示す。（Ｆ−Ｈ）ｓｈＭＡＧＬ細胞は、ｓｈ対照又は２３１ＭＦＰ親細胞と比較して減少した移動（Ｆ）、浸潤（Ｇ）、及び細胞生存（Ｈ）を示す。移動障害は、Ｃ１６：０ＦＦＡ又はＣ１８：０ＦＦＡによる処理（２０μＭ、４時間）によって救出された。（Ｉ）ＪＺＬ１８４によるＭＡＧＬの急性遮断により、癌細胞の移動が損傷される。それぞれの対照群と対比したＪＺＬ１８４処理細胞又はｓｈＭＡＧＬ細胞については、^＊＊はｐ＜０．０１である。ＤＭＳＯ処理ｓｈＭＡＧＬ群と対比したＣ１６：０又はＣ１８：０ＦＦＡ処理群については、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した；群当たり、ｎ＝４−６。
【図２２】図２２Ａ−２２Ｂは、生体内でのＪＺＬ１８４処理（経口強制飼養４０ｍｇ／ｋｇ、３０日間、４μＬ／ｇポリエチレングリコールを毎日１回投与）が腫瘍異種移植片ＭＡＧＬ活性を阻害すること（Ａ）及びｓｈＭＡＧＬ腫瘍がｓｈ対照細胞と比較してより低いＦＦＡレベルを含んでいたこと（Ｂ）を示している。溶媒又はＪＺＬ１８４処理したマウス腫瘍ホモジネートを、１００μＭＣ２０：４ＭＡＧの添加前に、ＤＭＳＯ又はＪＺＬ１８４（１μＭ、３０分間）と共に生体外で３０分間インキュベートした。それぞれ溶媒腫瘍又はｓｈ対照腫瘍と対比したＪＺＬ１８４処理腫瘍又はｓｈＭＡＧＬ腫瘍については、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した；グループ当たり、ｎ＝４。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｇは、ＭＡＧＬの異所性発現がＦＦＡレベルを増加し、卵巣癌細胞ＯＶＣＡＲ３及びＭＵＭ２Ｃ並びに黒色腫細胞の生体外及び生体内での病原性を亢進することを示している。（Ａ）ＡＢＰＰ（上段パネル）、ウェスタンブロット（中段パネル）及びＣ２０：４ＭＡＧ加水分解活性（下段パネル）によって確認した、ＯＶＣＡＲ３細胞におけるＭＡＧＬの過剰発現（ＭＡＧＬ−ＯＥ、赤色バー）。対照及びＳ１２２Ａ細胞（黒色バー）は、空ベクターにより感染した癌細胞又は触媒的に不活性なＭＡＧＬ変異株（Ｓ１２２Ａ）に相当する。ウェスタン分析は、Ｓ１２２Ａ−ＭＡＧＬ変異株の過剰発現を確認したが、当該変異株はＡＢＰＰ及びＣ２０：４ＭＡＧ加水分解アッセイによる評価においてはいかなる活性をも示さなかった。（Ｂ、Ｃ）ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞は、ＥＶ対照細胞及びＳ１２２Ａ細胞と比較してより低いＭＡＧレベル（Ｂ）及びより高いＦＦＡレベル（Ｃ）を含んでいる。これらの代謝的効果は、生体内原位置でのＪＺＬ１８４による処理（１μＭ、４時間、栗色のバー）によって逆転された。（Ｄ、Ｅ）ＭＡＧＬ−ＯＥ ＯＶＣＡＲ３細胞は、ＥＶ及びＳ１２２Ａ対照細胞と比較して増加した移動（Ｄ）及び浸潤（Ｅ）を示す。この亢進した移動及び浸潤は、ＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）によって逆転された。代表的な移動のパネルを示す（Ｄ）。（Ｆ）ＭＡＧＬ−ＯＥ ＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３細胞は、ＥＶ対照細胞と比較して著しく亢進した細胞生存（血清飢餓培養後２４時間）を示す。（Ｇ）ＭＡＧＬ−ＯＥ ＭＵＭ２Ｃ細胞の亢進した腫瘍増殖速度は、侵襲性のＣ８１６１黒色腫細胞の腫瘍増殖速度と同様である。Ｃ８１６１及びＭＵＭ２Ｃのデータは、それぞれ図１６Ｅ及び図１７Ｆに由来する（これらの実験は、腫瘍増殖速度の直接比較を可能にするために同時に実施したことを特に言及しておく）。対照群と対比したＭＡＧＬ−ＯＥ群については、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した；群当たり、ｎ＝４−６。
【図２４】図２４Ａ−２４Ｊは、癌の攻撃性における、カンナビノイドのシグナル伝達、エネルギー力学、脂肪酸ベータ酸化又は脂肪酸合成の評価を示している。ｓｈ対照及びｓｈＭＡＧＬ癌細胞におけるＦＦＡレベルは、ＣＢ１アンタゴニスト（リモナバン、１μＭ、４時間）又はＣＢ２アンタゴニスト処理（ＡＭ６３０、１μＭ、４時間）によって変化しなかった。Ｃ１６：０及びＣ２０：４ＦＦＡについてのデータを示す。他のＦＦＡ（Ｃ１８：０、Ｃ１８：１）についても同様の結果が見出された。（Ｂ）ｓｈＭＡＧＬ癌細胞における移動障害は、ＣＢ１アンタゴニストであるリモナバン又はＣＢ２アンタゴニストであるＡＭ６３０のどちらの処理（１μＭ、４時間）によっても、又は両方のアンタゴニストによる共同処理によっても救出されなかった。ｓｈ対照細胞と対比した各ｓｈＭＡＧＬ群について、^＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した；群当たり、ｎ＝６。（Ｃ、Ｄ）ＤＮＡマイクロアレイ分析によって測定したＣＢ１受容体（Ｃ）及びＣＢ２受容体（Ｄ）ｍＲＮＡレベル。左の棒グラフは、ＨＵ１３３ＡＰｌｕｓ２．０アフィメトリクスアレイにより実施されたヒト癌細胞株のＮＣＩ６０パネルの分析から抽出したデータに相当する（ロスら（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．）、２０００年）。右の棒グラフは、ＨＵ１３３ＡＰｌｕｓ２．０アフィメトリクスアレイにより実施された本研究に使用した侵襲性及び非侵襲性癌細胞株の分析から抽出したデータに相当する。比較のために、高いＣＢ１受容体レベルを含むＳＮＢ−１９癌細胞株を示す。（Ｅ−Ｈ）ＭＡＧＬの増加した発現（ＭＡＧＬ−ＯＥ）又は減少した発現（ｓｈＭＡＧＬ）は、癌細胞におけるＮＡＤ^＋（Ｅ）、ＮＡＤＨ（Ｆ）、ピルビン酸（Ｇ）、又は乳酸（Ｈ）レベルを変化させない。データは、平均±標準誤差として表した；群当たり、ｎ＝６。（Ｉ）脂肪酸β酸化阻害剤トリメタジジン（３−ケトアシルコエンザイムＡチオラーゼ阻害剤、１００μＭ、４時間のプレインキュベーション及び移動に関してはコインキュベーション）又はエトモキシル（ＣＰＴＩ阻害剤、１００μＭ、４時間のプレインキュベーション及び移動に関してはコインキュベーション）は、癌細胞の移動に影響を与えなかった。対照群と対比したＭＡＧＬ−ＯＥ群について、^＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した、群当たり、ｎ＝３。（Ｊ）エトモキシル処理（１００μＭ、４時間）は、Ｃ２０：４ＦＦＡを除いては癌細胞中のＦＦＡレベルを変化させなかったが、当該ＦＦＡはＣ８１６１及びＳＫＯＶ３細胞において増加した。それぞれの対照群と対比したｓｈＭＡＧＬ又はＭＡＧＬ−ＯＥ細胞について、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１である。ＤＭＳＯ処理対照群と対比したエトモキシル処理群については、＃はｐ＜０．０５である。データは、平均±標準誤差で表した；群当たり、ｎ＝３−４。
【図２５】図２５Ａ−２５Ｄは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤チロホスチンの癌細胞への影響を示している。チロホスチンは、ｓｈＭＡＧＬ癌細胞において見出される移動及び細胞生存の障害と同様のレベルで、Ｃ８１６１（Ａ、Ｂ）及びＳＫＯＶ３（Ｃ、Ｄ）細胞において、移動及び細胞生存（４８時間、無血清）を減少した。Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３ｓｈＭＡＧＬ細胞は、細胞移動及び細胞生存（Ａ、Ｂ）においてチロホスチン誘発障害に対する亢進した感受性を示す。溶媒処理ｓｈ対照細胞又はｓｈＭＡＧＬ癌細胞と対比したチロホスチン処理細胞の間では、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はＰ＜０．０１である；同処理群のｓｈ対照とｓｈＭＡＧＬ癌細胞との間では、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した、群当たり、ｎ＝４。
【００２０】
発明の詳細な説明
Ｉ．概要
２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）及びアナンダミドは、カンナビノイド受容体ＣＢ１及びＣＢ２を活性化する脂質伝達物質である。内在性カンナビノイドシグナル伝達は、アナンダミドについては、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）によって媒介される過程、２−ＡＧについては、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）によって基本的に制御されていると考えられている過程である、酵素的加水分解によって終結する。本発明は、ＭＡＧＬの選択的阻害剤の本発明者らによる合成及びキャラクタリゼーションに一部基づいている。ＭＡＧＬ選択的阻害剤はＭＡＧＬのヒドロラーゼ活性を強力に阻害する一方で、ＦＡＡＨ等の他の脳セリンヒドロラーゼにほとんど又は全く阻害活性を有しないことが見出された。加えて、マウスへの腹腔内注射又は経口投与において、選択的ＭＡＧＬ阻害剤は、脳の２−ＡＧレベルを著しく増加させることができたが、アナンダミド又は他のＮ−アシルエタノールアミン等の他の既知の脂質シグナル伝達分子のレベルを変化。また、阻害剤により処理されたマウスも、痛覚消失症を含む一連のＣＢ１依存的行動的影響を示。
【００２１】
発明者らは、ＭＡＧＬ及びその遊離脂肪酸（ＦＦＡ）産物が、侵襲性のヒト癌細胞及び原発性の腫瘍において上方制御されており、それによって、移動、浸潤、生存、及び生体内での腫瘍増殖を促進する、発癌性のシグナル伝達脂質に富む脂肪酸代謝ネットワークが制御されることをさらに発見した。非侵襲性癌細胞におけるＭＡＧＬの過剰発現がこの脂肪酸代謝ネットワークを繰り返し、ＭＡＧＬ阻害剤によって逆転される、病原性−表現型を増加することが見出された。発明者らは、ＭＡＧＬの遮断が生体外での移動だけでなく生体内での腫瘍増殖をも障害することを見出した。加えて、ＭＡＧＬ遮断に由来する表現型は、外来源のＦＦＡによって救出された。これらのデータは、癌細胞においてＦＦＡを増加するために、並びに移動活性及び腫瘍活性を増加するために、ＭＡＧＬが必要かつ十分であることを示している。
【００２２】
これらの発見に従って、本発明は、ＭＡＧＬ選択的アンタゴニスト化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む治療的な組成物を提供する。これらの組成物は、異所性の又は不十分なカンナビノイドシグナル伝達、特に２−ＡＧ媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達に連結又は媒介される、被験者の障害又は症状の症候を治療又は回復するために、又は増加したカンナビノイドレベルから有利な効果を引き出すことのできる疾患を治療するために使用することができる。このような障害又は症状には、例えば、疼痛、炎症、抑鬱、、多発性硬化症、緑内障、及びアルツハイマー病が含まれる。これらの特殊な症状又は障害のいずれかを患う被験者における治療応用に加えて、本発明の組成物は、一般的にカンナビノイド依存性行動的影響（例えば、痛覚消失症）を誘導するために、又は２−ＡＧ媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達活性を刺激又は増大するために、他の被験者においても用いることができる。本明細書で例示するＭＡＧＬ選択的阻害化合物をリード化合物として使用することにより、本発明は、改良された生物学的活性及び薬学的特性を備えた新規なＭＡＧＬ阻害剤のためのスクリーニング方法をさらに提供する。当該新規ＭＡＧＬ阻害剤は、異常な又は減少したカンナビノイドシグナル伝達活性によって引き起こされる又は関連する、障害又は症状の治療における増強された特性を備えた治療薬を提供することができる。次節に、本発明の組成物の生成及び使用、並びに本発明の実施方法についてのガイダンスを提供する。
【００２３】
ＩＩ．定義
別途定義が無い限り、本明細書で使用する技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者によって通常に理解されるのと同様の意味を有する。下記の参考文献は、本発明において使用する多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：シングルトンら（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）著、「微生物学及び分子生物学辞典（ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」（第２版、１９９４年）；「ケンブリッジ科学・技術辞典（ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）」、（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）編、１９８８年）；及びヘイル＆マーハム（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ）著、「ハーパー・コリンズ生物学辞典（ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ）」、（１９９１年）。加えて、本発明の実施において読者を援助するために下記の定義を提供する。
【００２４】
用語「薬剤（ａｇｎｔ）」又は「試験薬（ｔｅｓｔ ａｇｅｎｔ）」には、任意の物質、分子、元素、化合物、実体、又はそれらの組合せが含まれる。限定されるものではないが、例えば、タンパク質、ポリペプチド、有機小分子、多糖類、ポリヌクレオチド、その他等が含まれる。天然物、合成化合物、又は化学物質、又は二以上の物質の組合せであることができる。特に指定のない限り、用語「薬剤（ａｇｅｎｔ）」、「物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）」、及び「化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、本明細書で互換的に使用する。
【００２５】
用語「アナログ（ａｎａｌｏｇ）」は、基準分子（例えば、本明細書で開示するＭＡＧＬ選択的阻害剤）に構造的に類似するが、しかし、代替置換基で基準分子の特異的な置換基を置換することによって、標的化され制御された方法で修飾された分子に言及するために本明細書で使用する。基準分子と比較してアナログは、当業者にとり、同一、類似の、又は改良された有用性が期待されるであろう。改良した特性（標的分子に対する高結合親和性等）を有する、既知化合物の変異型を同定するためのアナログの合成及びスクリーニングは、製薬化学において周知の研究法である。
【００２６】
「抗悪性腫瘍剤（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」は、の新生物、特に細胞腫、肉腫、リンパ腫、又は白血病等の悪性（癌性）の病変の発達又は進行を阻害する機能特性を有する薬剤に言及するために本明細書で使用する。転移阻害はしばしば抗悪性腫瘍剤の一特性である。
【００２７】
化学療法剤は、腫瘍性疾患の治療方法においてポリクローナル抗グリカン抗体と併用して使用することができる。抗グリカン抗体を含む抗体−細胞毒抱合体もまた、標準的な癌治療によって誘導された免疫を追加免疫するために使用することができる。これらの場合には、投与される化学療法剤の服用量を減少することが可能である（モキールら（Ｍｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．）、「カンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９８年、第５８巻：５３０１−５３０４）。抗グリカン抗体併用の科学理論的な解釈は、ほとんどの化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、結果として抗原提示経路において増加した腫瘍抗原レベルに帰着するというものである。このように、抗グリカン抗体は、腫瘍細胞の化学療法放出を刺激して免疫応答を追加免疫することができる。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「接触（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」は、その通常の意味を有するが、二以上の分子の組み合わせ又は分子と細胞の組み合わせ（例えば、一化合物と一細胞）をも意味する。接触は、生体外で、例えば、二以上の薬剤を組み合わせて又は一薬剤と一細胞若しくは一細胞溶解物を組み合わせて、試験管又は他の容器中で引き起こすことができる。接触は、生体内でも、例えば、被験者の体内のタンパク質又はポリペプチドを特異的に標的とする薬剤を被験者に投与することによって引き起こすことができる。
【００２９】
カンナビノイドシグナル伝達と関連する症状又は障害とは、異所性の又は抑制された内在性カンナビノイドシグナル伝達に連結、媒介又は関連する障害をいう。このように、当該障害には、減少した内在性カンナビノイドレベル（例えば、２−ＡＧ）又は内在性カンナビノイドを分解する過剰な酵素活性によって引き起こされる症状が包含される。カンナビノイドシグナル伝達と関連する症状又は障害には、内在性カンナビノイドシグナル伝達の増大によって有益な効果（例えば、疼痛）を誘導することのできる症状が含まれる。当該用語には広く、治療効果が増加したカンナビノイドレベル又は減少したアラキドン酸レベルから獲得することのできる疾病も含まれる（例えば、アルツハイマー病又は多発性硬化症）。本発明の幾つかの好ましい実施態様において、当該症状又は障害は、２−ＡＧシグナル伝達と関連又は付随する（例えば、異所性の又は抑制された２−ＡＧシグナル伝達）症状・障害であり、又は２−ＡＧシグナル伝達活性を刺激することによって有益な効果を誘導することのできる症状・障害である。このような症状又は障害の例には、疼痛、抑鬱、、心血管障害、代謝障害、炎症性症候群及び卒中が含まれる。
【００３０】
本発明において使用する場合、心血管障害は、心臓又は血管（動脈及び静脈）に関わる疾患のクラスをいう。それは、心臓血管系に悪影響を及ぼす任意の疾患を含むが、しかし特にアテローム性動脈硬化症（動脈疾患）と関連するこれらの症状をいう。これらの症状は同様の原因、機序、及び治療法を有する。通常の心血管障害の例には、動脈硬化症（動脈の硬化）、アテローム性動脈硬化症（血管壁上のコレステロール蓄積等の粥腫）、リウマチ性心疾患、全身性高血圧症及び卒中が含まれる。本明細書で使用する場合、炎症性疾患とは、異常な、過剰な又は調節解除された炎症に付随する疾患又は症状である。それらには、の種々の疾患の根底にある、、無な疾患群含まれる。代謝障害とは、正常な成長発育に必須のある代謝反応が起きないときに発生する健康状態をいう。これらには、アミノ酸代謝障害（例えば、メープルシロップ尿症及びホモシスチン尿症）、有機酸代謝障害（例えば、メチルマロン酸尿症）、脂肪酸ベータ酸化障害（例えば、ＭＣＡＤ欠損症）、テイ・サックス病及びゴーシェ病等の脂質代謝障害（脂質蓄積症）、ミトコンドリア障害（例えば、ミトコンドリア心筋症）、及びペルオキソーム病（例えば、ツェルベルガー症候群）含まれる。
【００３１】
カンナビノイドの行動的影響（又はＣＢ１依存性及び／又はＣＢ２依存性行動的影響）とは、カンナビノイドシグナル伝達活性の結果として被験者によって示される生理学的及び行動上の応答をいう。カンナビノイドの行動的影響の幾つかは、２−ＡＧシグナル伝達に関与するが、本明細書では２−ＡＧ媒介行動的影響（又は２−ＡＧ依存行動的影響）と。下記の実施例において詳述する通り、２−ＡＧ媒介行動的影響には無痛覚症（減少した痛覚）が含まれる。特に指定のない限り、カンナビノイドの行動影響には、また被験者に存する又は被験者によって経験される、炎症、又は抑鬱に付随する症候の軽減又は回復も包含される。
【００３２】
内在性カンナビノイド系とは、食欲、痛覚、気分、及び記憶を含む、種々の生理学的過程に関与する、神経調節物質及びその受容体の一群をいう。カンナビノイド受容体（カンナビスの向精神効果を媒介する受容体と同一）に結合する内在性の脂質がカンナビノイド命名される。、内在性カンナビノイド系には（１）それぞれ主に中枢神経系及び抹消神経に位置する２のＧタンパク質共役型受容体である；（２）内在性アラキドン酸に基づく脂質である、アナンダミド（N-アラキドニルエタノールアミン又はＡＥＡ）及び２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）集合的に「内在性カンナビノイド」と；及び（３）内在性カンナビノイドアナンダミド及び２−ＡＧを合成及び分解する酵素。内在性カンナビノイド系は、遺伝的及び薬理学的方法を使用して研究されてきた。これらの研究は、神経調節物質放出、運動学習、シナプス可塑性、食欲、及び痛覚を含む、様々な生理学的過程における内在性カンナビノイドシグナル伝達についての広範な役割を明らかにした。
【００３３】
痛覚過敏は、被験者（例えば、温血動物）が疼痛に対し増加した感受性を示す症状である。それは、身体への物理的損傷、例えば、手術によって不可避的に生じた受傷に付随することが知られている。疼痛は、関節炎及びリウマチ性疾患等のの炎症症状に付随することも知られている。痛覚過敏には、限定されるものではないが、炎症（例えば、リウマチ性関節炎及び変形性関節症）と関連する疼痛、術後痛、後分娩痛、歯科症状（齲蝕及び歯肉炎）と関連する疼痛、限定されるものではないが、日焼け、擦過傷、挫傷その他を含む熱症と関連する疼痛、スポーツ損傷及び捻挫、限定されるものではないが、ツタウルシ、アレルギー性皮疹及び皮膚炎を含む皮膚症状と関連する疼痛、及び軽い刺激に対する感受性を増加する有害冷感等の他の疼痛等の軽中度の疼痛から激痛までが含まれる。
【００３４】
基準分子（例えば、ＭＡＧＬポリペプチド）又は細胞（例えば、腫瘍細胞）の活性に関する用語「調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」とは、活性の上方制御（、活性化又は刺激）又は下方制御（、阻害又は抑制）をいう。ポリペプチド等の基準分子の調節には、分子の発現又は細胞内レベルの変化も含まれる。生物学的活性（例えば、ＭＡＧＬ発現又はリパーゼ活性、又は腫瘍細胞増殖）に関する用語「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」又は「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」とは、活性の抑制又は下方制御をいう。阻害の機序は、例えば基準分子又は細胞への結合によって直接的であことができる。阻害は、例えば、別の方法で基準分子又は細胞に結合し調節する他の分子への結合及び／又は修飾によって間接的であことができる。
【００３５】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸配列」とは、ヌクレオチドのをいう。幾つかの例において、ポリヌクレオチドとは、それが由来するところの生物体のゲノム中において、それがすぐ近くに隣接しているどちらのコード配列ともすぐ近くに隣接していない配列をいう。それ故に、当該用語には、例えば、ベクター：自己複製プラスミド若しくはウイルス；又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれた、又は他の配列とは別個の独立した分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は各々のヌクレオチドの修飾型であることができる。
【００３６】
ポリペプチド又はタンパク質とは、単量体がアミド結合によって結合したアミノ酸残基である重合体をいう。アミノ酸がアルファ-アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体又はＤ−光学異性体のどちらでも使用することができるが、Ｌ−異性体が典型的である。ポリペプチド又はタンパク質フラグメントは、自然界に見出されるタンパク質のものと同じ又は実質的に同一のアミノ酸配列を有することができる。実質的に同一の配列を有するポリペプチド又はタンパク質とは、アミノ酸配列が完全ではないが大部分同じであり、それが関連する配列の機能活性が維持されていることを意味する。
【００３７】
用語「被験者」には、他の非動物、例えば、ウマ、イヌ、ネコ、マウス及びラットが含まれる。
【００３８】
基準分子（例えば、ＭＡＧＬ選択的阻害剤）の変異型とは、基準分子全体又はそのフラグメントのどちらかと構造及び生物学的活性が実質的に類似する分子をいうことを示している。このように、二つの分子が類似の活性を有するならば、一方の分子の成分又は構造が他の分子に見出されるものと同じでなくても、又はアミノ酸残基の配列が同じでなくても、それらは当該用語が本明細書で使用するところの変異型とみなされる。
【００３９】
侵襲性癌又は侵襲性腫瘍とは、迅速に増殖及び拡散する癌又は腫瘍をいう。いかなる起源の癌又は腫瘍も適した条件下では侵襲性となることができる。従って、侵襲性腫瘍には、例えば、侵襲性乳癌、侵襲性前立腺癌、侵襲性脳腫瘍、侵襲性子宮頚部癌、侵襲性結腸癌、侵襲性肺癌、侵襲性胃癌、侵襲性肝癌、侵襲性腎臓癌、侵襲性黒色腫及び侵襲性卵巣癌が含まれる。腫瘍が侵襲性となるためには、血管からはるか遠くにあるその腫瘤の中央の細胞に栄養を与えることができなければならない。これは血管新生によって達成される。突然変異によって、わずかな癌細胞は、血管新生成長因子を産生する能力を獲得できるかもしれない。これらの成長因子は、腫瘍によって近くの組織に放出されるタンパク質であり、そこでは、それらが新生血管を刺激して腫瘍内に成長させる。このことが、腫瘍が腫瘤中で急速に拡大し組織を囲んで浸潤することを可能にしている。それは、癌細胞のために新生血管中へ漏出し及び身体中を循環する経路をも提供するが、そこでそれらは転移を形成しながら他の器官に停止する。
【００４０】
ＩＩＩ．ＭＡＧＬ選択的阻害剤
本発明は、新規なＭＡＧＬ阻害剤を提供する。ＭＡＧＬ阻害剤には、ＭＡＧＬの発現、修飾、制御若しくは活性を妨害する化合物、又はＭＡＧＬの正常な生物学的活性（例えば、そのセリンヒドロラーゼ活性）の一以上を下方制御する化合物が含まれる。特に本発明のＭＡＧＬ阻害剤は、ＭＡＧＬ酵素活性を遮断又は阻害する。上記で言及したように、ＭＡＧＬは、神経系における、カンナビノイド受容体リガンド、２−ＡＧの加水分解の原因となる主要な酵素である。ＭＡＧＬ阻害剤又はアンタゴニスト化合物は、痛覚消失症等のカンナビノイド依存行動的影響を誘発するのに有用である。ＭＡＧＬ酵素活性を特異的に阻害又は抑制する化合物は、異常な（例えば、抑制又は減少した）カンナビノイドシグナル伝達活性によって引き起こされる又はする障害又は症状を治療するうえで種々の治療的又は予防的応用を有することができる。ＭＡＧＬ酵素活性を阻害するいかなる分子も、カンナビノイド依存行動的影響を誘発する、又は抑制されたカンナビノイドシグナル伝達活性に連結した症状を治療することができるかもしれない。しかしならが、他の脳セリンヒドロラーゼ（例えば、ＦＡＡＨ）をも阻害するＭＡＧＬアンタゴニスト化合物は、これらの他の酵素によって媒介される様々な生物学的機能により妨害されるかもしれない。このような非選択的ＭＡＧＬ阻害剤は、抑制されたカンナビノイドシグナル伝達活性に連結した障害（例えば、疼痛消失）を治療することができるが、多くの望まれない副作用を有しがちである。従って、このような治療的な応用においてはＭＡＧＬ酵素活性を選択的に阻害する分子が好ましい。ＭＡＧＬ酵素活性を特異的に阻害することによって、一方では他の脳セリンヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）に著しい影響を生じずに、不十分な又は抑制された２−ＡＧシグナル伝達活性と関連した又は連結した症候を治療又は回復することができる。
【００４１】
従って本発明は、他の脳セリンヒドロラーゼ（例えば、ＦＡＡＨ又はＡＢＨＤ６）の一以上の酵素活性が著しくは悪影響を受けない濃度で、ＭＡＧＬの酵素活性を実質的に遮断又は阻害する、新規なＭＡＧＬ−選択的阻害剤（又は「ＭＡＧＬ−特異的阻害剤」）を提供する。幾つかの好ましい実施態様において、ＭＡＧＬ阻害剤は、ＭＡＧＬによる２−ＡＧの加水分解を遮断する。特に、本発明のＭＡＧＬ選択的阻害剤又はＭＡＧＬ選択的アンタゴニストは、ＦＡＡＨ阻害に比較してＭＡＧＬの阻害に対し選択性を示す化合物である。他の脳セリンヒドロラーゼ（例えば、ＦＡＡＨ）にまさったＭＡＧＬに対する化合物の選択性は、当該化合物の存在下にに関する各酵素の酵素活性を分析することによって測定することができる。明細書の実施例で詳述する通り、選択性は、脳膜プロテオームにおける化合物による基質（例えば、ＭＡＧＬに対しては２−ＡＧ及びＦＡＡＨには対してはオレイン酸アミド）の加水分解阻害のＩＣ_５０値を測定することによって決定することができる。ＩＣ_５０値を測定するのに加えて、ＦＡＡＨにＭＡＧＬに対する阻害剤の選択性は、化合物存在下での酵素的触媒加水分解反応の擬一次速度定数（ｋ_ｏｂｓ／［Ｉ］）を測定することによっても決定することができる。これは、下記の実施例に記載した通り、脳膜プロテオーム中に存在する酵素により生体外で実施することもできる。脳膜プロテオームに存在する加水分解酵素を使用する以外に、酵素活性アッセイは、組換え酵素によっても実施することができる。例えば、他の脳セリンヒドロラーゼと同様にＭＡＧＬ、ＦＡＡＨは、本明細書に記載した方法又は当該技術分野で報告された方法に従って組換えで容易に得ることができる（例えば、ブランクら（Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００７年、第１４巻：ｐ．１３４７−５６）。典型的には、ＭＡＧＬ選択的阻害剤は、ＦＡＡＨに対するそのＩＣ_５０値よりも少なくとも２０倍、好ましくは少なくとも５０、１００、２５０又は５００倍低いＭＡＧＬに対するＩＣ_５０値を有すべきである。ｋ_ｏｂｓ／［Ｉ］により測定するならば、ＭＡＧＬ選択的阻害剤は、通常、ＦＡＡＨに対するそれよりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２５、５０、７５、１００又は３００倍高いＭＡＧＬに対する速度定数を有するだろう。
【００４２】
本発明のＭＡＧＬ選択的阻害剤の幾つかは、ＦＡＡＨに加えて、また一以上の他の脳セリンヒドロラーゼＭＡＧＬに対して選択的でもある。例えば、化合物は、ＡＢＨＤ６及び／又はＡＢＨＤ１２ＭＡＧＬに対して選択的であることができる。ＡＢＨＤ６及びＡＢＨＤ１２は、マウス脳において２−ＡＧヒドロラーゼ活性を示すことが明らかにされた他の二つの脳酵素であり、明確な細胞内分布を示している（例えば、ブランクら（Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００７年、第１４巻：ｐ．１３４７−５６を参照）。これらの酵素を阻害しないＭＡＧＬ選択的アンタゴニストは、内在性カンナビノイドシグナル伝達と関連した現在は未知の機能を研究及び証明するために有用である。
【００４３】
本発明においては、種々のＭＡＧＬ選択的アンタゴニストを使用することができる。本発明によって合成されたこれらＭＡＧＬ選択的阻害剤の幾つか、下記の実施例に記載する。これらの化合物は、下記に示す式Ｉの構造を有する。これらの化合物は、本明細書の実施例において開示した合成スキームに従って容易に調製することができる。
【化４】

【００４４】
式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ_１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々は、下記の構造の一つを有する。
【化５】

【００４５】
例示したＭＡＧＬ−特異的阻害剤の幾つかは、ＦＡＡＨにＭＡＧＬ選択的。実施例において詳述する通り、図１Ａに示す化合物ＷＷＬ１５２、ＷＷＬ１６２、ＪＺＬ１７５及びＪＺＬ１８４の全ては、ＦＡＡＨＭＡＧＬに対して選択性を示す。化合物の幾つかは、ＦＡＡＨに加えて他の脳セリンヒドロラーゼにもまさってＭＡＧＬに対して選択的である。これらには、式Ｉによって包含される化合物ＪＺＬ１８４及びＪＺＬ１７５が含まれる。これらの二つの化合物は、特異的にＭＡＧＬを阻害し、ＡＢＨＤ６と同様にＦＡＡＨに関して全く又は非常に減少した阻害活性しか有しない。
【００４６】
これらのＭＡＧＬ選択的阻害剤のいずれも、下記の実施例に詳述する合成スキームに従って生産することができる。例示したＭＡＧＬ選択的アンタゴニスト以外に、追加のＭＡＧＬ選択的阻害剤（例えば、ＪＺＬ１８４又はＪＺＬ１７５の機能的な誘導体又はアナログ）は、本明細書に記載した方法又は当該技術分野において記載された方法を使用して容易に同定することができる。本明細書に記載する通り、例示するＭＡＧＬ選択的阻害剤のアナログ化合物のライブラリーを作成することができる。アナログ化合物は、それからＭＡＧＬ阻害の特異的活性及び他の脳セリンヒドロラーゼにまさった選択性に関してスクリーニングすることができる。
【００４７】
ＩＶ．内在性カンナビノイドシグナル伝達の亢進及びそれに付随する症状の治療
本発明は、このような治療を必要とする被験者において、内在性カンナビノイドシグナル伝達（特に２−ＡＧシグナル伝達活性）を刺激若しくは増大する、又はカンナビノイドの加水分解（例えば、２−ＡＧの加水分解）を阻害する方法を提供する。下記の実施例に明らかにする通り、本発明のＭＡＧＬ特異的阻害剤によるＭＡＧＬの阻害は、生体内での２−ＡＧ媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達を増大するために十分であるが、一方、脳セリンヒドロラーゼの非選択的阻害により別に生じるかもしれない、いかなる意図しない結果も制限している。本発明者らは、幾つかのカンナビノイド依存性の行動的影響がＭＡＧＬの選択的阻害に由来こともした。これらの行動的影響（２−ＡＧ媒介行動的影響）には、例えば、痛覚消失症、運動性低下症、低温低下、及び反射亢進が含まれる。種々の状況下で、ある被験者においては一定の２−ＡＧ媒介行動的影響（例えば、痛覚消失症）を誘発することが望ましいかもしれない。例えば、疼痛を患う被験者は、ＭＡＧＬ選択的阻害によって誘発される痛覚消失から治療的利益を得ることができる。被験者における２−ＡＧシグナル伝達活性を刺激又は増大するために、当該方法は、本明細書で開示するＭＡＧＬ選択的阻害剤の治療的に有効な量を被験者に投与することを含んでいる。いくつかの関連する方法は、本発明のＭＡＧＬ選択的阻害剤を被験者に投与することによって、ＣＢ１及び／又はＣＢ２依存性の行動的影響を被験者に誘発することに向けられている。いくつかの方法において、被験者は、例えば、２−ＡＧによって媒介される行動的影響、例えば痛覚消失を誘発することができるように、化合物を投与される。
【００４８】
本明細書で開示するＭＡＧＬ選択的阻害剤は、また一般的に異常なカンナビノイドシグナル伝達（特に２−ＡＧシグナル伝達活性）により引き起こされる又は関連する障害、又は２−ＡＧシグナル伝達活性を増大又は刺激することによって有益な効果を得ることができる症状を治療するためにも適している。従って、ＭＡＧＬ選択的阻害剤を用いる場合、本発明は、カンナビノイドシグナル伝達に連結する又は関連する障害又は症状を患う被験者を治療するための方法をさらに提供する。当該方法は、本明細書で開示するＭＡＧＬ選択的阻害剤の治療的に有効な量を、治療を必要とする被験者に投与することを必要とする。治療されるべき被験者には、異常な（不十分又は抑制された）カンナビノイドシグナル伝達により媒介される又は関連する障害又は症状を患う被験者が含まれる。治療されるべき被験者には、また増大したカンナビノイドシグナル伝達活性から有益な効果を得ることができる症状を有する被験者でもあることができる。いくつかの好ましい実施態様において、当該方法は、２−ＡＧシグナル伝達と関連する症状を患う被験者において、２−ＡＧ媒介シグナル伝達活性を刺激することに向けられる。これらの障害及び症状の例には、疼痛、炎症、、抑鬱、心血管障害、代謝障害、及び卒中が含まれる。本発明の方法に適した多くの炎症性障害が存在する。これらの障害は、例えば、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再灌流障害、リウマチ性関節炎、移植拒絶及び脈管炎等、当該技術分野において周知である。卒中に加えて、本発明の治療方法に適した心血管障害には、また動脈瘤、狭心症、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、及び心筋梗塞（心臓発作）も含まれる。同様に、増大する内在性カンナビノイドシグナル伝達（例えば、２−ＡＧ媒介シグナル伝達活性）から利益を売ることのできる代謝障害は当該技術分野で周知である。このような障害の例には、フェニルケトン尿症、アルカプトン尿症、地中海貧血症、ポルフィリン症、テイ・サックス病、ハーラー症候群、ゴーシェ病、ガラクトース血症、クッシング症候群、真性糖尿病、甲状腺機能亢進症、及び甲状腺機能低下症が含まれる。
【００４９】
本発明のＭＡＧＬ選択的阻害剤は、又そのカンナビノイドの治療効果が報告されている他の症状を治療するためにも利用することができる。このような症状又は障害の例には、緑内障、多発性硬化症及び抑制された食欲によって引き起こされる消耗疾患が含まれる。消耗（ｗａｓｔｉｎｇ）とは、筋肉及び脂肪組織を衰弱させる衰弱性の疾患（例えば、細菌又はウイルス感染）又は症状の経過をいう。カンナビノイドがこれらの疾患又は障害に対する一定の治療的効果を提供することができると報告されている。例えば、ニューウェルら（Ｎｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、「トランスアクションズ・オブ・ザ・オフタルモロジカル・ソサイアティ・オブ・ザ・ユナイテッド・キングダム（Ｔｒａｎｓ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｓｏｃ．ＵＫ）」、１９７９年、第９９巻：ｐ．２６９−７１；ブッシュヴァルトら（Ｗｕｓｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．）、「ディー・ファルマジー（Ｐｈａｒｍａｚｉｅ．）」、２００２年、第５７巻：ｐ．１０８−１４；クロックスフォードら（Ｃｒｏｘｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．）、「ドラッグス・オブ・トゥデイ（Ｄｒｕｇｓ Ｔｏｄａｙ）」、２００４年、第４０巻：ｐ．６６３−７６；ウィラン（Ｗｈｅｌａｎ）、「ドラッグ・ディスカバリー・トゥデイ（Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ）」、２００２年、第７巻：ｐ．７４５−６；及びコスチニユックら（Ｃｏｓｔｉｎｉｕｋ ｅｔ ａｌ．）、「ザ・カナディアン・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．）」、２００８年、第２２巻：ｐ．３７６−８０を参照。本発明のＭＡＧＬ選択的阻害剤は、２−ＡＧの加水分解を阻害することによって治療効果を促進することができる。本発明のＭＡＧＬ選択的阻害剤は、アルツハイマー病を患う被験者に治療的利益を提供するためにさらに用いることができる。アルツハイマー被験者の脳に増加したアラキドン酸が存在することが報告されており、それはアルツハイマー病上の発達と進行におけるアラキドン酸の役割を示唆している。例えば、ロスら（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．）」、１９９８年、第７０巻、ｐ．７８６−９３；チャールイモイックら（Ｃｈａｒｌｉｍｏｎｉｕｋ ｅｔ ａｌ．）、「ニューロケミストリー・インターナショナル（Ｎｅｒｕｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．）」、２００６年、第４８巻：ｐ．１−８；及びラポポートプロスタグランジン・ロイコット・エッセント・（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ）」２００８年１０月２８日、参照。本発明のＭＡＧＬ阻害剤によりＭＡＧＬ酵素活性を阻害することによって、２−ＡＧの加水分解及び結果として生じるアラキドン酸産物を抑制又は減少することができる。
【００５０】
典型的には、本発明の治療方法には、本発明のＭＡＧＬ特異的阻害剤を含有する医薬組成物を治療の必要な被験者に投与することが含まれる。ＭＡＧＬ特異的阻害剤は、単独で又は障害に適した他の既知の治療薬と併用して使用することができる。例えば、疼痛を有する被験者には、疼痛を緩和する他の鎮痛剤を追加的に投与することができる。このような既知の鎮痛剤には、モルヒネ及びモクソニジンが含まれる（米国特許第６，１１７，８７９号を参照）。幾つかの他の方法において、本発明のＭＡＧＬ特異的阻害剤は、被験者の内在性カンナビノイドシグナル伝達活性を亢進するためにＦＡＡＨ選択的阻害剤と併用して使用することもできる。ＭＡＧＬ阻害剤単独又はＦＡＡＨ阻害単独と比較して、ＭＡＧＬ選択的阻害剤及びＦＡＡＨ選択阻害剤両方の投与は、望むカンナビノイド依存性の行動的影響、例えば疼痛の減少又は炎症、、及び抑鬱に付随する症候の回復を被験者に強力により良く誘発することができた。ＦＡＡＨ選択的阻害剤は当該技術分野で既知である（例えば、フェグリーら（Ｆｅｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．））、「ジャーナル・オブ・ファルマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティクス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）」、２００５年、第３１３巻：ｐ．３５２−８）。例えば、ＦＡＡＨ選択的阻害剤ＵＲＢ５９７は、ケイマンケミカル社（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（アナーバー、ミシガン州）等から容易に市販品を入手することができる。
【００５１】
例として、本発明のＭＡＧＬ選択的阻害剤は、疼痛を患う被験者の症候を治療又は緩和するために使用することができる。疼痛は、多くの医的障害に存する。例えば、炎症は疼痛を誘発することができる。炎症性疾患の例には、変形性関節症、大腸炎、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、リウマチ性関節炎及び狼瘡等の膠原病性脈管疾患が含まれる。これらの症状のどれかを有する被験者は、しばしば亢進した痛覚を体験する。過度の疼痛を引き起こすかもしれない他の病状又は医療行為には、外傷、手術、切断、膿瘍、灼熱痛、脱髄疾患、三叉神経痛、慢性アルコール中毒、卒中、視床痛症候群、糖尿病、癌ウイルス感染、及び化学療法が含まれる。
【００５２】
一般的に、治療は、被験者が薬理学的及び／又は生理学的な効果を獲得することを可能にする。当該効果は、カンナビノイドシグナル伝達と関連する症状若しくは障害又はその前兆又はその症候から被験者を完全に又は部分的に防止するかとの点からは、予防的であってもよい。それはまた、カンナビノイドシグナル伝達及び／又は障害に有害作用（例えば、疼痛）と関連する症状又は疾患に対する部分的か又は完全な治癒の点からは治療的であることができる。被験者がである場合、人が知覚する疼痛のレベルは、被験者当人に疼痛を述べること又は疼痛を他の痛みの経験と比較することを頼むことによって評価することができる。あるいは、疼痛のレベルは、ストレス関連因子の放出又は抹消神経系若しくはＣＮＳ（中枢神経系）中の疼痛伝達神経の活動等の、被験者の疼痛に対する身体反応を測定することによって較正することができる。又、疼痛レベルは、人が疼痛がないと報告するのに要求される、又は被験者が疼痛の症候を示すことを停止するのに要求される、十分に特性化された鎮痛剤の量を測定することによっても較正することができる。
【００５３】
本発明の治療法に適した被験者は、の被験者、以外の哺乳動物及びＭＡＧＬを発現する他の動物であることができる。被験者は、現在疼痛を引き起こしておりそして疼痛を引き起こし続けそうな進行中の症状を有していてもよい。また被験者は、通常痛みの結果を伴う術式又は事象を耐えてきてもよいし又は耐えることになってもよい。例えば、被験者は、糖尿病性神経因性疼痛又は膠原病性脈管疾患等の慢性の疼痛症状を有していてもよい。被験者は、また炎症、神経損傷、又は毒暴露（化学療法薬への暴露を含む）を有していてもよい。治療又は治療介入は、被験者の疼痛を減少又は和らげ、その結果、被験者が知覚する疼痛レベルが、治療しなかったとしたならば被験者が知覚したであろう疼痛レベルと比較して減少することを意図している。
【００５４】
幾つかの実施態様において、神経性疼痛を有する被験者の治療を意図している。これらの被験者は、神経根障害、単神経障害、多発性単神経障害、多発性神経障害又は神経叢障害に分類される神経障害を有していてもよい。これらの種類の疾患は、限定されないが、外傷、卒中、脱髄疾患、膿瘍、手術、切断、神経の炎症性疾患、灼熱痛、糖尿病、膠原病性脈管疾患、三叉神経痛、リウマチ性関節炎、毒、癌（直接的又は間接的に（例えば、腫瘍随伴性）神経損傷を引き起こすことのできるもの）、慢性アルコール中毒、ヘルペス感染症、エイズ、及び化学療法を含む、さまざまな神経損傷症状又は術式によって引き起こされていてもよい。疼痛を引き起こす神経損傷は、末梢又はＣＮＳ神経の中にあってもよい。
【００５５】
本発明の幾つかの実施態様において、痛覚過敏の治療又は緩和を必要とする被験者には、ＭＡＧＬの阻害剤を一以上の追加の疼痛緩和剤と併用した組成物が投与される。これは、個々の鎮痛剤はしばしば疼痛緩和効果を部分的にのみ提供するからであるが、というのもそれは多くのなかのまさに一つの疼痛伝達経路を妨害するからである。しかしながら、疾患又は病状と関連する疼痛には、しばしば多様な受容器及び異なったシグナル伝達経路が関与している。それ故に、これらの状況下で侵害受容器を緩和するために一以上の疼痛軽減剤が必要であるかもしれない。幾つかの他の応用において、ＭＡＧＬ阻害剤は疼痛知覚経路中の異なる箇所に作用する鎮痛剤と併用して投与することができる。例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、アセトアミノフェン、イブブロフェン、及びインドメタシン）等の一クラスの鎮痛剤は、侵害受容器によって検出される刺激の化学伝達物質を下方制御する。オピオイド等の他のクラスの薬剤は、ＣＮＳにおける侵害受容情報の処理を変化させる。また、抗痙攣薬及び抗鬱薬を含む局所麻酔薬等の他の鎮痛剤が含まれていてもよい。ＭＡＧＬ阻害剤に加え、一以上のクラスの薬剤を投与することにより、より効果的な疼痛緩和を提供することができる。
【００５６】
Ｖ．新規ＭＡＧＬ阻害剤のスクリーニング
本明細書に記載する特異的ＭＡＧＬ阻害剤に加えて、本発明は、また改良された特性を有する新規ＭＡＧＬ阻害剤のスクリーニング方法をも提供する。薬剤発見過程における重要な段階は、化学アナログリード化学鋳型の選択である。一定の分子標的のためのリード化学鋳型を同定する過程には、典型的には、機能アッセイにおける多数の化合物（しばしば１００、０００以上）のスクリーニング、活性を確認するための二次アッセイの試験用のある任意の活性閾値に基づく亜集合の選抜、並びに次に残った活性化合物の化学的合成の適合性の評価、が含まれる。本明細書に記載する新規ＭＡＧＬ阻害剤、例えば、式Ｉの化合物は、改良された生物学的又は薬学的特性を有する関連化合物を探索するためのリード化合物を提供する。例えば、これらＭＡＧＬ阻害剤のアナログ又は誘導体は、ＭＡＧＬに対するより高い親和性を有する又は皮膚により浸透性である化合物を同定することによって選別することができる。このような改良された特性を有する化合物は、種々の薬学的応用のために適している。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法には、典型的には最初に本明細書で例示するＭＡＧＬ選択的阻害剤（例えば、ＪＺＬ184又はＪＺＬ１７５）のアナログ、誘導体又は変形型の合成が含まれる。スクリーニングのために一定のＭＡＧＬ阻害剤の構造的アナログのライブラリーを作成すると、次に、当該アナログ又は変異型が由来するＭＡＧＬ阻害剤の当該特性と比較して改良された生物学的特性を有するアナログ又は誘導体を同定するために機能アッセイを実施する。例えば、現有するＭＡＧＬ選択的阻害剤のアナログ化合物は、その選択性を維持しつつ、ＭＡＧＬに対する高められた阻害活性（例えば、減少したＩＣ_５０）を求めて選別することができる。あるいは、アナログは、ＦＡＡＨ及び／又はＡＢＨＤ６にＭＡＧＬに対する亢進した選択性を求めて選別することができる。それらは、また追加の脳セリンヒドロラーゼ（例えば、ＡＢＨＤ１２）にＭＡＧＬに対する選択性を求めて選別することもできる。幾つかの他の実施態様において、アナログは、ＭＡＧＬポリペプチドに対する亢進した結合親和性を求めて選別することができる。さらに、アナログ化合物のライブラリーは、例えば、より良い皮膚浸透性等の薬学的な性質又は薬物動態学的な性質を有する化合物を同定することにより評価することができる。
【００５８】
さらに幾つかの実施態様において、本発明のスクリーニング法は、ＦＡＡＨ及びＭＡＧＬの両方を選択的に阻害することのできる治療薬を同定することにも向けられる。ＡＥＡ及び２−ＡＧの両方によって制御される行動的過程（例えば、痛覚）は、ＭＡＧＬ−ＦＡＡＨ二重阻害剤によってより強力に影響を受けることができるであろう。実施例で証明する通り、ＭＡＧＬ選択的阻害剤（例えば、ＪＺＬ184）は、高濃度において他の脳セリンヒドロラーゼに著しい影響を与えずにＦＡＡＨを阻害することもできる。それ故に、これらの化合物は、ＭＡＧＬ及びＦＡＡＨの二重阻害剤の開発のリード化合物の骨格構造として役立つことができる。
【００５９】
本明細書で例示するＭＡＧＬ選択的阻害剤の化学的骨格に基づくアナログ又は誘導体を合成するためには、当該技術分野で周知の有機化学方法がだけである。例えば、既知化合物の化学アナログのコンビナトリアルライブラリーは、段階的な方法で合成することができる。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーは、ＷＯ第９５／１２６０８号、ＷＯ第９３／０６１２１号、ＷＯ第９４／０８０５１号、ＷＯ第９５／３５５０３号及びＷＯ第９５／３０６４２号に記載された、エンコードされた合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によって構築することができる。種々のアナログの他の合成方法は、例えば、オーバーマン（Ｏｖｅｒｍａｎ）著、「有機反応（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」、第１−６２巻、ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、２００３年；ブルームら（Ｂｒｏｏｍ ｅｔ ａｌ．）、「フェデラル・プロキュアメント（ＦｅｄＰｒｏｃ．）」、１９８６年、第４５巻：ｐ．２７７９−８３；ベン−メナームら（Ｂｅｎ−Ｍｅｎａｈｅｍ ｅｔ ａｌ．）、「リーセント・プログレス・イン・ホルモン・リサーチ（ＲｅｃｅｎｔＰｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．）」、１９９９年、第５４巻：ｐ．２７１−８８；シュラムら（Ｓｃｈｒａｍｍ ｅｔ ａｌ．）、「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）」、１９９８年、第６７巻：ｐ．６９３−７２０；ボーリンら（Ｂｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．）、「バイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）」、１９９５年、第３７巻：ｐ．５７−６６；カールテンら（Ｋａｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．）、「エンドクライン・レビューズ（ＥｎｄｏｃｒＲｅｖ．）」、１９８６年、第７巻：ｐ．４４−６６；ホら（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．）著、「有機合成戦略（Ｔａｃｔｉｃｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｓｉｓ）」、ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９４年；及びシャイトら（Ｓｃｈｅｉｔ ｅｔ ａｌ）著、「ヌクレオチド・アナログ：合成及び生物学的機能（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、ジョンウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、１９８０年、に記載されている。
【００６０】
のＭＡＧＬ選択的阻害剤のアナログ化合物のライブラリー亢進した生物学的活性又は薬学的特性は、当該技術分野で周知の機能アッセイによっても容易に選別することができる。例えば、ＭＡＧＬ及び他の脳セリンヒドロラーゼの化合物による阻害は、例えば、脳膜プロテオーム中に存在する酵素によって同族基質の加水分解を定量すること等、本明細書で開示する又は当該技術分野で周知の酵素活性アッセイにより試験することができる。又は他の種由来の他の脳セリンヒドロラーゼと同様にＭＡＧＬ、ＦＡＡＨも当該技術分野で周知である。その塩基配列のクローニング並びにその酵素的及び他の生物学的活性のキャラクタリゼーションは、当該技術分野で全て報告されている。例えば、ブランクマンら（Ｂｌａｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ）」、２００７年、第１４巻：ｐ．１３４７−５６；ソンマ・デルペロら（Ｓｏｍｍａ−Ｄｅｌｐｅｒｏ ｅｔ ａｌ．）、「ザ・バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．）」、１９９５年、第３１２巻：ｐ．５１９−２５；ディンら（Ｄｉｎｈ ｅｔ ａｌ．）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、２００２年、第９９巻、ｐ．１０８１９−９；ディンら（Ｄｉｎｈ ｅｔ ａｌ．）、「モレキュラー・ファルマコロジー（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）」、２００４年、第６６巻：ｐ．１２６０−４；ムッソリーら（Ｍｕｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．）、「ザ・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）」、２００７年、第２７巻：ｐ．２８８３−９；ザンら（Ｇｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９７年、第９４巻、ｐ．２２３８−２２４２；ワンら（Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．）、「ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、１９９８年、第５４巻：ｐ．４０８−４１４；パトリセリら（Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．）、「バイオオーガニック＆メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．）」、１９９８年、第８巻：ｐ．６１３−６１８；及びゴーパルディ（Ｇｏｐａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．）、「バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）」、１９９９年、第１４４１巻：ｐ．７７−８４、を参照。
【００６１】
化合物の他の生物学的又は生化学的活性の改良（例えば、ＭＡＧＬに対する亢進した結合親和性）は、当該技術分野で方法により試験することができる。一般的な概要については、例えば、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）著、「モレキュラー・クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）、第３版（２０００年）；アウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）、「分子生物学カレントプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョンウィリー＆サンズ、インク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９９年）；及びバーガー及びキンメル（Ｂｅｒｇｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ）著、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｅｇｏ）、アカデミックプレス、インク（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｓｓ，Ｉｎｃ）を参照。また本発明のスクリーニング法において用いることのできる追加の生化学的又は薬学的アッセイ法も当該技術分野で周知であり日常的に実施されている。例えば、ＭＡＧＬ選択的阻害剤のアナログ化合物の皮膚浸透特性は、例えば、レミントン著「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、ジェンナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、リッピンコット・ウィリアムズ＆ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍａｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、（第２０版、２００３年）、等に記載された方法を使用して分析することができる。
【００６２】
ＶＩ．ＭＡＧＬ標的化による癌治療及び腫瘍増殖阻害
本発明は、腫瘍細胞増殖阻害ための方法及び組成物を提供する。典型的には、これら本発明の治療応用には、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）と特異的に拮抗又は阻害する化合物が用いられる。腫瘍細胞の増殖は、当該腫瘍細胞をＭＡＧＬ拮抗化合物の治療的に有効な量と接触させることによって阻害、抑制又は遅延される。幾つかの実施態様において、腫瘍細胞は、例えば癌発症の危険を有する又は危険にある被験者に存在する。これらの治療応用の幾つかの好ましい実施態様は、侵襲性の腫瘍又は腫瘍細胞の増殖を阻害することに向けられる。
【００６３】
幾つかの関連する実施態様において、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害することによって被験者体内の癌を治療するための方法を提供する。当該方法は、また被験者体内の腫瘍形成を防止するためにも有用である。典型的には、当該方法には、治療を必要とする被験者に本明細書で開示するＭＡＧＬ拮抗化合物を含有する医薬組成物を投与することが含まれる。ＭＡＧＬ拮抗化合物は、単独で、又は被験者体内で相乗効果を提供するために、他の既知の抗癌剤と併用して使用することができる。
【００６４】
本発明で用いるＭＡＧＬ拮抗化合物には、ＭＡＧＬの細胞レベルを下方制御する又は生物学的活性（例えば、リパーゼ活性）を阻害するいかなる薬剤も含まれる。適したＭＡＧＬ拮抗化合物には、以下に記載するスクリーニングに従って同定することができる新規薬剤、例えば追加の小分子化合物又は抗体（例えば、アンタゴニスト抗体）等も含まれる。幾つかの実施態様において、腫瘍増殖を阻害する又は癌を治療するために用いられるＭＡＧＬ拮抗化合物は、特異的にＭＡＧＬ発現を阻害する又はその細胞レベルを下方制御する薬剤（例えば、阻害ポリヌクレオチド）である。例えば、ＭＡＧＬを標的にする阻害ポリヌクレオチドには、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、又は相補ＤＮＡが含まれる。これらの核酸薬剤を標的遺伝子の発現を特異的に停止させるために使用することは、周知であり当該技術分野において。ＭＡＧＬを特異的に標的とするこのような核酸薬剤は、当該技術分野で周知の方法を使用して調製することができる。例として、ＭＡＧＬ遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡは、下記の実施例で明らかなとおり、ＭＡＧＬ発現レベルを下方制御するために使用することができる。
【００６５】
二本鎖ＲＮＡによる内在性遺伝子の機能及び発現との干渉は、例えば、ファイアーら（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９８年、第３９１巻：ｐ．８０６−８１１、に記載された線虫；例えば、ケンネーデルら（Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９８年、第９５巻：ｐ．１０１７−１０２６、に記載されたショウジョウバエ；及び例えば、ウィアニら（Ｗｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．）」、２０００年、第２巻：ｐ．７０−７５、に記載されたマウス胎仔等の種々の生物で示されている。このような二本鎖ＲＮＡは、鋳型の両方向から読み取る一本鎖ＲＮＡの生体外転写並びにセンス及びアンチセンスＲＮＡ鎖の生体外アニーリングによって合成することができる。二本鎖ＲＮＡは、またＭＡＧＬ遺伝子が逆向き反復配列によって引き離された反対方向にクローンされたｃＤＮＡベクター構築物から合成することもできる。細胞へ遺伝子導入された後、当該ＲＮＡは転写され相補鎖と再アニールされる。ＭＡＧＬ遺伝子を標的とする二本鎖ＲＮＡは、適当な構築物の形質移入によって細胞（例えば、腫瘍細胞）に導入することができる。例として、ＭＡＧＬ発現を下方制御する特異的なｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのアンチセンス及びセンス鎖の配列を本明細書で開示する。ＭＡＧＬを標的とする他の型の阻害ポリヌクレオチドと同様に追加のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知に標準的技術に従って容易に作成することができる。
【００６６】
幾つかの他の実施態様において、本発明の治療応用は、ＭＡＧＬの生物学的活性を阻害するＭＡＧＬ拮抗化合物を用いる。これらには、ＭＡＧＬの酵素活性と拮抗する本明細書に開示するＭＡＧＬ選択的阻害剤が含まれる。適したＭＡＧＬ拮抗化合物には、またＭＡＧＬポリペプチドに特異的に結合しそのリパーゼ活性と拮抗するアンタゴニスト抗体も含まれる。この点については、これらの中でモノクローナル抗体薬剤が最も好ましい。抗ＭＡＧＬアンタゴニスト抗体は、例えば、「モノクローナル抗体−生産、工学及び臨床応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ‐‐Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｇｎ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、リッターら（Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）編、ケンブリッジ大学プレス（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、英国（ＵＫ）、１９９５年；及びハーロー及びレイン（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）著、「抗体、実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）」、コールドスプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、第３版、２０００年、等の当該技術分野で周知であり日常的に実施されている方法を使用して作成することができる。癌治療用の放射標識モノクローナル抗体は特に周知であり例えば、「放射標識抗体による癌治療（Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｗｉｔｈ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、ＤＭゴールデンベルク（Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）編、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、ボカラトン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）、フロリダ（Ｆｌａ）、１９９５年、に記載されている。
【００６７】
ＭＡＧＬ発現又はその酵素活性を阻害又は下方制御する化合物は、他の治療法と併用して使用することができる。例えば、手術及び放射線療法受けている被験者には、本発明の医薬組成物を投与することもできる。加えて、また化学療法、ホルモン療養及び凍結療法は、癌を患う被験者を治療するために、本発明の治療応用と併用することもできる。ＭＡＧＬ拮抗化合物は、これらの疾患の治療又は防止するための他の治療化合物の投与と共に、腫瘍増殖を防止するため又は癌を治療するために被験者に使用することもできる。ＭＡＧＬ拮抗化合物を他の抗癌剤と共に投与する場合、両者はどちらの順番でも又は同時に投与することができる。これらの治療化合物は、化学療法剤、焼灼術又は他の治療用ホルモン、抗腫瘍薬、癌に有用なモノクローナル抗体及び血管新生阻害剤であっても良い。
【００６８】
当該技術分野で知られた多数の抗癌剤があり、例えば、「癌治療学：試験薬及び臨床薬（Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｇｅｎｔｓ）」、タイヒャー（Ｔｅｉｃｈｅｒ）（編）、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）（第１版、１９９７年）；及び「グッドマン及びギルマンズの薬物療法学の薬理学的基礎（Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ‘ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、ハルドマンら（Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．）（編）、マッグローヒル・プロフェッショナル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）（第１０版、２００１年）、に記載されている通りである。適した抗癌剤の例には、５−フルオロウラシル、硫酸ビンブラスチン、リン酸エストラムスチン、スラミン及びストロンチウム−８９が含まれる。適した化学療法薬の例には、アスパラギナーゼ、硫酸ブレオマイシン、シスプラチン、シタラビン、リン酸フルダラビン、マイトマイシン、及びストレプトゾシンが含まれる。本発明と併用して使用されるかもしれないホルモンは、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、ロイプロリド、フルタミド、酢酸シプロテロン、ケトコナゾール及びアミノグルテチミドである。
【００６９】
本発明の方法による治療に適した被験者は、種々の型の癌を患っている被験者、又は癌発症の危険にある又はを有する被験者である。本発明の方法は、多数の腫瘍細胞の増殖を阻害するために用いることができる。治療を施すことのできる腫瘍又は癌の例には、肺、皮膚、乳房、脳、胃腸、尿生殖路（例えば、腎臓、膀胱及び尿道、前立腺、睾丸）、血管、神経系、骨及び肝臓由来の腫瘍が含まれる。それらは、充実性腫瘍、白血病及び転移性腫瘍を包含する。本発明に適した充実性腫瘍には、例えば、肉腫、黒色腫、癌腫、又は他の充実性腫瘍癌が含まれる。
【００７０】
肉腫は、胚性結合組織のような物質から構成される腫瘍を包含し、一般的に原線維又は均質な物質中に包埋したぎっしりと詰まった細胞から構成される。肉腫には、限定されるものではないが、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー肉腫、脂肪性肉腫、脂肪肉腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルム肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞免疫芽球肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞免疫芽球肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー星細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉肉腫、傍骨性骨肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、及び血管拡張型肉腫が含まれる。
【００７１】
黒色腫とは、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍をいう。黒色腫には、例えば、末端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング・パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、小結節性黒色腫、爪下黒子性黒色腫、及び表在拡大型黒色腫が含まれる。
【００７２】
癌腫とは、周囲の組織に浸潤し転移を起こす、上皮細胞から構成される悪性の新生物をいう。代表的な癌腫には、例えば、上皮癌、結腸直腸癌、胃癌、口腔癌、膵癌、卵巣癌、又は腎細胞癌がさらに含まれる。代表的な癌腫には、例えば、腺房癌、小葉癌、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌、腺癌、副腎皮質癌、肺胞癌、肺胞上皮癌、基底細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、基底細胞癌（ｂａｓａｌｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底有棘細胞癌、気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性肺癌、セレブリフォルム癌、胆管細胞癌、絨毛膜癌腫、粘液性癌腫、面疱癌、子宮体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱癌、円柱細胞癌、腺管癌、デュラム癌腫、胎児性癌、髄癌、類表皮癌腫、腺様上皮癌、外向方発育癌、潰瘍癌、癌腫血管腫、膠様癌、粘液性癌腫、巨細胞癌腫、巨細胞癌、腺癌、顆粒膜細胞腫、毛母癌、血性癌腫、肝細胞癌、ハースル細胞癌、卵黄嚢腫瘍、副腎癌、小児胎児性癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、
Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ‘ｓ癌、クルチツキー細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫、リンパ上皮性癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｌｌａｒｙ ｃａｒｉｎｏｍａ）、黒色癌、軟部癌腫、粘液性癌（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞性癌、粘表皮癌、粘液癌（ｃａｒｉｎｏｂａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌（ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫状癌、鼻咽頭癌腫、燕麦細胞癌、類骨癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）、類骨癌腫（ｏｓｔｅｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、のリ状癌、腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫状癌、シュナイダー癌腫、硬性癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌腫、回転楕円面細胞癌腫、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮細胞癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ストリング癌、毛血管拡張性癌（ｃａｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張症様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節癌（ａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節性癌（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、いぼ状癌、及び絨毛癌が含まれる。
【００７３】
白血病は、造血器官の進行性の悪性疾患を包含し、血管及び骨髄中の白血球及びその前駆体の歪んだ増殖及び生育によって一般的に特徴づけられる。白血病は、臨床的には一般的に（１）疾患の継続期間及び特性‐‐急性又は慢性；（２）関与する細胞の型；骨髄系（骨髄性）、リンパ系（リンパ向性の）、又は単球系；並びに（３）血液中の異常細胞数の増加又は非増加‐白血病性又は無白血病性（亜白血病性）、に基づいて分類される。白血病には、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球白血病、慢性顆粒球白血病、急性前骨髄球白血病、急性Ｔ細胞白血病、非白血病性白血病、白血球血症白血病、好塩基球性白血病、芽球細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎児性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛状細胞性白血病、肝細胞性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血球芽細胞性白血病、組織球白血病、肝細胞白血病（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、形質細胞性白血病（ｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、前骨髄球性白血病、リーダー細胞白血病、シリング白血病、肝細胞白血病（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、亜白血性白血病、及び未分化細胞白血病が含まれる。
【００７４】
本発明の方法により治療することのできる他の癌又は腫瘍には、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵島細胞腺腫、悪性類癌腫、膀胱癌、前癌皮膚障害、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽腫、食道癌、泌尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮頚部癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、及び前立腺癌が含まれる。
【００７５】
ＶＩＩ．医薬組成物及び投与
本発明は、内在性カンナビノイドシグナル伝達によって媒介される又は関連する症状又は障害を治療するための薬剤の製造においてＭＡＧＬアンタゴニスト化合物（例えば、ＭＡＧＬ選択的阻害剤）の使用を提供する。幾つかの関連する応用において、ＭＡＧＬ拮抗化合物は、腫瘍細胞増殖阻害及び癌治療のために使用される。これらの治療応用において、治療を必要とする被験者には、ＭＡＧＬアンタゴニスト化合物を単独で投与することができる。しかしながら、ＭＡＧＬアンタゴニスト化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物の投与の方がより好ましい。医薬組成物に用いることのできるＭＡＧＬアンタゴニスト化合物の例には、小分子有機化合物であるＪＺＬ１８４、ＪＺＬ１７５、ＷＷＬ１５２及びＷＷＬ１６２と同様に下記の実施例に記載する阻害ポリヌクレオチドが含まれる。本発明のスクリーニング方法に従って同定するこのできる新規のＭＡＧＬ阻害剤もまた使用することができる。本発明は、例えば、キット等の医薬品の組み合せも提供する。このような医薬品の組み合せは、本明細書で開示するＭＡＧＬアンタゴニスト化合物である活性薬剤と同様に、どのような形態又は組成物であっても、少なくとも一つを併用組成物と、薬剤の投与説明書を含むことができる。
【００７６】
ＭＡＧＬ選択的阻害剤を含む医薬組成物は種々の形態で調製することができる。適した固形又は液体製剤形態は、例えば、顆粒、粉末、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル、座薬、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、エアロゾル剤、滴剤又はアンプル形態の注射液であり、並びに活性化合物の遅延性放出に関する製剤である。それらは、当該技術分野で周知の標準的なプロトコル、例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、ジェンナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、リッピンコット・ウィリアムズ＆ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第２０版、２００３年）、に従って調製することができる。医薬組成物は、典型的には腫瘍増殖を阻害するために、又は２−ＡＧシグナル伝達に関連する又は媒介される障害又は症状の症候を減じる又は回復するために十分なＭＡＧＬアンタゴニスト化合物の有効な量を含んでいる。ＭＡＧＬアンタゴニスト化合物に加えて、医薬組成物は、組成物を高める若しくは安定させる、又は組成物の調製を促進する一定の薬学的に許容可能な担体を含むこともできる。例えば、ＭＡＧＬアンタゴニスト化合物は、安定性又は薬理学的特性を高めるために、その投与前に卵白アルブミン又は血清アルブミン等の担体タンパク質と複合体を形成することができる。医薬組成物の種々の形態は、また崩壊剤、結合剤、被覆剤、膨潤剤、滑沢剤、着香料、甘味剤及び精製水等の通常当該技術分野で日常的に使用される不活性な希釈剤を含むエリキシル剤等の賦形剤及び添加物及び／又は補助剤を含むこともできる。
【００７７】
薬学的に許容可能な担体は、部分的には投与される特定の成分と同様に組成物の特定の投与方法によって決定される。それらは、他の成分と適合しかつ被験者に有害でないという意味において、薬学的及び生理学的の両方においても許容可能でなければならない。担体は、例えば経口、舌下、直腸、経鼻、静脈内、非経口等の投与に望ましい製剤形態に依存して様々な形態をとってもよい。例えば、非水系の溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。密封包帯用の担体は、皮膚透過性を増すため及び吸収を高めるために使用することができる。経口投与用の液体剤形は、一般的に液体剤形を含有するリポソーム溶液を含んでいてもよい。
【００７８】
ＭＡＧＬ阻害化合物を含有する医薬組成物は、治療的に有効な量又は服用量で局所的に又は全身的に投与することができる。それらは、非経口的に、腸管的に、注射、迅速点滴、鼻咽頭吸収、経皮吸収によって、直腸的に及び経口的に投与することができる。治療的に有効な量とは、被験者の治療すべき障害又は症状の症候（例えば、侵害受容性疼痛）を減少又は阻害するために十分な量を意味する。このような有効な量は、被験者の疼痛に対する常態の感受性、その身長、体重、年齢、及び健康状態、疼痛の起源、ＭＡＧＬアンタゴニスト化合物の投与方法、投与された特定の阻害剤、及び他の要因に依存して被験者ごとに異なるであろう。結果として、特定の状況下において特定の被験者に対する有効な量を経験的に決めるのが賢明である。
【００７９】
のＭＡＧＬアンタゴニスト化合物について、当業者であれば薬学的な方法を使用して、容易に腫瘍増殖を阻害し及び癌を治療する当該化合物の有効量、又はカンナビノイドシグナル伝達と関連する症状を治療する化合物の有効量を同定することができる。典型的には、生体外で使用される投与量は、医薬組成物の生体内原位置での投与のための有用な量に関する役立つガイダンスを提供することができ、並びに動物モデルはの被験者における特定の障害の治療のための有効な投与量を決定するために使用することができる。よりしばしば、適した薬用量は、通常のに関する、最大許容用量及び安全投与量を決めるために、哺乳動物種に関する臨床研究によって決定することができる。より高い投与量が要求される特定の状況を除いて、ＭＡＧＬアンタゴニスト化合物の好ましい投与量は普通には、一日当たり約０．００１から約１０００ｍｇ、より普通には約０．０１から約５００ｍｇの範囲にある。一般に、投与されるＭＡＧＬアンタゴニスト化合物の分量は、被験者の症状を有効に及び確実に防止又は最小化する最少の投与量である。それ故に、上記の投与量の範囲は、本明細書での教示のための一般的なガイダンス及び補助を提供することを意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の医薬組成物の調製及び投与に関する追加のガイダンスもまた当該技術分野で記載されている。例えば、「グッドマン及びギルマンズの薬物療法学の薬理学的基礎（Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ‘ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、ハルドマン（Ｈａｒｄｍａｎ）ら編、マッグローヒル・プロフェッショナル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（第１０版、２００１年）；レミントン（Ｒｍｉｎｇｔｏｎ）著「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、ジェンナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、リッピンコット・ウィリアムズ＆ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第２０版、２００３年）；及び「製剤投与形態及び薬剤デリバリーシステム（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アンセルら（Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．）編、リッピンコット・ウィリアムズ＆ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第７版、１９９９年）を参照。
【００８０】
実施例
下記の実施例は、例示するために提供するものであり、本発明を限定するものではない。
【００８１】
実施例１．ＭＡＧＬ選択的阻害剤の開発
セリンヒドロラーゼに対する選択的阻害剤の探究には、この酵素クラスに特別な多様な特徴から利益を得ることができるという可能性がある。第一に、セリンヒドロラーゼは、他の酵素クラスとは交差反応性をほとんど又は全く示さない特異的な化学基による共有結合性の不活性化に感受性である。これらの反応性のケモタイプの間で主要なのはカルバメートであるが、それは、これらの酵素の保存セリン求核剤との共有結合性反応（カルバミル化）の後の、その穏やかな求電子性及び加水分解安定性のために、選択的で不可逆的なセリンヒドロラーゼ阻害剤の設計のために特権的な骨格構造として同定された。第二に、セリンヒドロラーゼの機能状態は、活性に基づいたタンパク質プロファイリング（ＡＢＰＰ）法を使用して天然の生物システムにおいて集合的にプロファイルすることができる。セリンヒドロラーゼのＡＢＰＰには、この大きく多様な種類の酵素のための一般的な活性に基づくプローブとして役立つ、レポータータグ付フルオロホスホネート（ＦＰ）を使用する（リォウら（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）」、１９９９年、第９６巻：ｐ．１４６９４−９）。拮抗的な方法で実施する場合、ＡＢＰＰは、小分子の酵素阻害剤の潜在能力と選択性を複合プロテオーム中で直接評価するための強力な選別法として役立つことができる。選別法は、当該技術分野で、例えば、リォウら（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）」、１９９９年、第９６巻：ｐ．１４９４−９；リーら（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」、２００７年、第１２９巻：ｐ．９５９４−５；ロイングら（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）」、２００３年、第２１巻：ｐ．６８７−９１；及びグリーンバウムら（Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．）、「モレキュラー＆セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」、２００２年、第１巻：ｐ．６０−６８、等に既述の通り実施することができる。
【００８２】
構造的に多様なカルバメートのライブラリーについて拮抗的ＡＢＰＰ選別を実施している間に、発明者らは、ＦＡＡＨ、ＭＡＧＬ及び、ＡＢＨＤ６（図１Ｂ）を含む脳セリンヒドロラーゼの特定の亜集合を阻害する化合物ＷＷＬ９８（図６）を同定した。発明者らは、次にＭＡＧＬの潜在能力及び選択性を改良するためにＷＷＬ９８を修飾することに注力した。ＷＷＬ１５２及びＷＷＬ１６２（図１Ａ）で代表される通り、ピペラジンのスペーサ及び末端ビスアリールモチーフの取り込は、ＭＡＧＬ及びＡＢＨＤ６に関する潜在能力を維持しつつ、一方ＦＡＡＨに関する活性を顕著に減少すること（図１Ｂ）が発見された。ピペラジンをピペリジニルメタノール骨格構造で置換すると、ＦＡＡＨ及びＡＢＨＤ６の両方にＭＡＧＬに対する選択性を示す化合物である、ＪＺＬ１７５（図１Ｂ）を産出した。最後に、追加の選択性の増強は、ピペリジニルメタノール骨格構造上へのビス（メチレン−３，４−ジオキシフェニル）の包接によって行いＪＺＬ１８４（図１Ａ及びＢ）を与えた。
【００８３】
実施例２．脳プロテオーム中のＭＡＧＬ選択的阻害剤活性
マウス脳膜プロテオームの５０ｎＭの低濃度のＪＺＬ１８４による３０分間のプレインキュベーションの後に、拮抗的ＡＢＰＰによってＭＡＧＬ活性のほぼ完全な遮断が認められた（図２Ａ）。対照的に、他の酵素（ＦＡＡＨ、ＡＢＨＤ６）の阻害は、より高濃度のＪＺＬ１８４（１０μＭ）まで認められなかった。基質アッセイにより、ＪＺＬ１８４が脳膜中において２−ＡＧ及びオレイン酸アミド（ＦＡＡＨ基質）の加水分解の遮断に対しそれぞれ８ｎＭ及び４μＭのＩＣ_５０値を示した（図２Ｂ）通りの選択性度を確認した。ＣＯＳ７細胞で発現した場合に（図２Ｃ）、組換えＭＡＧＬ及びＦＡＡＨに関して同等の阻害効果が認められた。興味深いことに、脳膜は、試験したＪＺＬ１８４の最高濃度においてさえも２−ＡＧ加水分解活性の〜１５％を維持したが、おそらくＪＺＬ１８４に非感受性の他の２−ＡＧ加水分解酵素の寄与を反映している。ＪＺＬ１８４は、ＭＡＧＬの時間依存的な阻害（図７）を示したが、それは共有結合型の不活性化機序を暗示している。そこで発明者らは、またＭＡＧＬ及びＦＡＡＨに対するＪＺＬ１８４の相対活性をｋ_ｏｂｓ／［Ｉ］値を測定することによって評価したが、当該値よりＭＡＧＬの阻害にたいする選択性が＞３００倍であることが（それぞれ４４００及び１３Ｍ^−１ｓ^−１）確認された。最後に発明者らは、内在性カンナビノイド系の他の成分に関するＪＺＬ１８４の活性を試験した。当該化合物は、ＣＢ１受容体と相互作用せず、又は２−ＡＧ生合成酵素であるジアシルグリセロールリパーゼ−βを阻害しなかった（図８）。まとめると、これらのデータは、ＪＺＬ１８４がマウス脳プロテオーム中でＭＡＧＬを強力かつ選択的に阻害することを示している。
【００８４】
実施例３．選択的阻害活性剤の生体内活性
生体内でのＪＺＬ１８４のＭＡＧＬ遮断活性を評価するために、Ｃ５７Ｂ１／６雄マウスにＪＺＬ１８４を投与し（４−４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、分析のために４時間後に屠殺した。脳膜プロテオームの拮抗的ＡＢＰＰは、試験したＪＺＬ１８４の最少投与量（４ｍｇ／ｋｇ）における、ＦＡＡＨを含む他の脳セリンヒドロラーゼに最少の影響をともなった、ＭＡＧＬの７５％阻害を明らかにした（図３Ａ）。また、これらのデータは、ＭＡＧＬ及びＦＡＡＨに対しても基質アッセイによって確認した（図３Ｂ）。脳２−ＡＧ加水分解の残存活性は、ＪＺＬ１８４の４から１６ｍｇ／ｋｇへの投与量の増加によって対照値の２５％から１５％にさらに減少することができたが（図３Ｂ）、そのことは拮抗的ＡＢＰＰによって定量された通りＭＡＧＬ活性のほぼ完全な遮断と関連していた（図３Ａ）。ＦＡＡＨは、また用量依存的様式でも阻害されたが、しかし１６ｍｇ／ｋｇのＪＺＬ１８４においても、拮抗的ＡＢＰＰ（図３Ａ）又は基質アッセイ（図３Ｂ）によって定量した通り、ＦＡＡＨ活性の実質的な部分（〜３５％）は無傷で残存していた。
【００８５】
発明者らのゲルに基づくＡＢＰＰ分析は既に生体内でのＭＡＧＬに対する高選択性を示唆したが、本法の分解能の制限により、ＪＺＬ１８４処理動物中の脳セリンヒドロラーゼの機能状態の完全な評価が妨げられていた。そこで発明者らは、ゲルに基づくＡＢＰＰと比較して高い分解能及び感受性を示す、ＡＢＰＰ−ＭｕｄＰＩＴと命名した、高性能液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）プラットフォーム（ジェサニーら（Ｊｅｓｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、２００５年、第２巻：ｐ．６９１−７、を参照）を使用して脳プロテオームを試験した。ＡＢＰＰ−ＭｕｄＰＩＴは、トランスポーター及び生合成酵素を含む、内在性カンナビノイド系の他の成分の阻害剤に対する予期しない標的を同定するために以前使用した。手短に言えば、ＪＺＬ１８４又は溶媒で処理したマウス由来の脳膜プロテオームを、ビオチン標識したＦＰプローブであるＦＰ−ビオチンと共に拮抗的ＡＢＰＰにかけた。次にＦＰビオチン標識タンパク質をアビジンで増強し、ビーズ上でトリプシンにより消化し、多次元ＬＣ−ＭＳで分析し、探索アルゴリズムＳＥＱＵＥＳＴを使用して同定した。ＡＢＰＰ−ＭｕｄＰＩＴは、ＪＺＬ１８４（１６ｍｇ／ｋｇ、４時間）がほぼ完全なＭＡＧＬ活性の遮断及びＦＡＡＨの部分的な阻害を引き起こしたことを確認した（図３Ｃ）。印象的なことに、ＡＢＰＰ−ＭｕｄＰＩＴによってプロファイルされた他の〜４０の脳セリンヒドロラーゼのいずれもＪＺＬ１８４によって著しい影響を受けなかった（図３Ｃ及び表１）。これらのデータは、高投与量で（１６ｍｇ／ｋｇ）長時間（４時間）投与された場合でさえ、ＪＺＬ１８４が脳内でＭＡＧＬに対する優れた選択性を維持することを証明している。
【表１】


生体内でのＪＺＬ１８４の選択性に関するプロファイルを確立した後、発明者らは、次にＭＡＧＬ及びＦＡＡＨに対する内在性の基質及び産物の候補の脳レベルを測定した。試験したＪＺＬ１８４の最低投与量（４ｍｇ／ｋｇ）においてさえ、２−ＡＧレベルは処理４時間後に５倍に増加し、阻害剤のより高投与量においてはベースラインより８−１０倍に増加することができた（図３ｄ）。予想通り、脳２−ＡＧの増加には、アラキドン酸レベルの著しい減少が伴った（図３Ｅ）。モノ−パルミトイルグリセロール（ＰＧ）及びモノ−オレオイルグリセロール等の他のＭＡＧ、及びその相応する遊離脂肪酸（それぞれパルミチン酸及びオレイン酸）は、ＪＺＬ１８４処理動物由来の脳で著しくは変化しなかった（図９）。重要なことには、また脳アナンダミドレベルも試験された全ての投与量のＪＺＬ１８４によって影響を受けなかった（図３Ｆ）。Ｎ−パルミトイルエタノールアミン（ＰＥＡ）、及びＮ−オレオイルエタノールアミン（ＯＥＡ）等の他のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）は、試験された最高投与量のＪＺＬ１８４（４０ｍｇ／ｋｇ）を除き変化しなかったが、そこでは、これらの脂質のわずかな増加（〜２倍）が認められた。ＮＡＥレベルへの影響の欠如は、生体内のＮＡＥレベルを高めるためにはＦＡＡＨの部分的な破壊では不十分であることを明らかにした公表された研究と一致している。ＪＺＬ１８４処理マウスの脂質プロファイルは、脳ＦＡＡＨ活性を完全に阻害し、この組織中の２−ＡＧ又はアラキドン酸レベルを変えずにアナンダミド及び他のＮＡＥレベルの著しい増加を引き起こす、選択的ＦＡＡＨ阻害剤ＵＲＢ５９７によって誘発されたプロファイルとは著しく違っていた。同様なデータがまたＪＺＬ１８４の経口投与の後でも得られたが（図１０）、このことは生体内のＭＡＧＬの選択的遮断を実施するために本化合物は、多様な経路によって投与することができることを示している。
【００８６】
実施例４．ＪＺＬ１８４処理マウスにおける迅速持続的ＭＡＧＬ阻害
生体内でのＪＺＬ１８４阻害の経時変化を測定するために、マウスにＪＺＬ１８４を投与し（１６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、分析のために０．５、１、２、４、８、及び２４時間に屠殺した。脳膜プロテオームのＡＢＰＰ（図４Ａ）と同様に２−ＡＧ及びオレイン酸アミド加水分解アッセイ（図４Ｂ）は、ＭＡＧＬ阻害が、処理後３０分以内に最大速度を達成するほど迅速であり、２−ＡＧ加水分解活性の＞８０％阻害を少なくとも２４時間持続するほど長期持続性であることを示した（図４Ａ）。対照的に、ＦＡＡＨ遮断は、よりゆっくりと起こり、試験のどの時点においても決して７０％を超えなかった（図４Ｂ）。ＭＡＧＬの迅速阻害に付随してＪＺＬ１８４処理は、脳で２−ＡＧ蓄積を即座に引き起こした。３０分間のうちに脳２−ＡＧレベルは既に７倍に増加し、少なくとも８時間は対照レベルの７−９倍が残存した（図４Ｃ）。興味深いことに、ＭＡＧＬの活性の＞８０％がこの時点で阻害されたままであるのに、２−ＡＧレベルは２４時間のうちにほぼ対照レベルに回復した。２−ＡＧの増加は、アラキドン酸の急速かつ持続性の減少と一致した（図４Ｄ）。アナンアミドを含むＮＡＥと同様に他のＭＡＧ及び遊離脂肪酸も、ＪＺＬ１８４処理マウスの分析時間経過を通して変化しなかった（図４Ｅ及び図１１）。
【００８７】
実施例５．ＭＡＧＬ選択的阻害剤によって誘発されるマウスの行動的影響
ＪＺＬ１８４によって引き起こされる劇的かつ持続性の脳２−ＡＧレベルの増加は、本阻害剤が内在性カンナビノイド媒介行動的影響を誘発するかもしれないことを示唆した。直接的なＣＢ１アゴニストは、げっ歯類において、痛覚消失症、運動性低下症、低体温症、及び強硬症（あわせてカンナビノイド活性の四つ組み試験と呼ばれる）を含む多様な行動的影響を促進することが知られている。興味深いことに、ＦＡＡＨ阻害剤は、四つ組み試験において、痛覚消失症を引き起こすが他のカンナビノイド行動的表現型を引きおこさず、大部分は不活性である（リヒトマンら（Ｌｉｃｈｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、「ザ・ジャーナル・オブ・ファルマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティクス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）」、２００４年、第３１１巻：ｐ．４４１−８）。ＪＺＬ１８４（１６ｍｇ／ｋｇ、２時間）は、また急性熱痛覚の尾浸漬試験（図５Ａ）及び内臓痛の酢酸苦悶試験（図５Ｂ）を含む、多数の疼痛アッセイにおいて著しい鎮痛作用を示すことも見出された。両方の場合において、ＪＺＬ１８４の効果は、ＣＢ１アンタゴニストであるリモナバンでの前処理（３ｍｇ／ｋｇ）によって遮断された（図５Ａ及びＢ）。ＦＡＡＨ阻害剤とは著しく対照的にＪＺＬ１８４は、また低体温症（図５Ｃ）及び運動性低下症（図５Ｄ）をも顕著に促進した。ＪＺＬ１８４処理は強硬症を誘発しなかった一方で、バー試験で評価した場合に、処理マウス１４匹中７匹が反射亢進又は「ポップコーン」行動（ペイテルら（Ｐａｔｅｌｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・ファルマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティックス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）」、２００１年、第２９７巻：ｐ．６２９−３７）を示した（図５Ｅ）。低体温及び反射亢進の効果は、リモナバンによって完全に遮断されたが、そのことは、それらがＣＢ１受容体によって媒介されることを示している。発明者らは、ＪＺＬ１８４の運動性低下効果に対するＣＢ１受容体の寄与を明確に決定することができなかったが、というのはリモナバンが独自に運動性の顕著な減少を誘発することを見出したからである（図５Ｄ）。しかしながら、ＪＺＬ１８４誘発性不動症の部分的遮断がリモナバンにより認められ（図５Ｄ）、そのことは本表現型に対するＣＢ１受容体の寄与を示唆している。
【００８８】
まとめると、これらのデータは、ＪＺＬ１８４が直接的ＣＢ１アゴニストの薬理学的なプロファイルに定性的に似た広い一連のカンナビノイドの行動的影響をげっ歯類において誘発することを示している。加えて、これらの表現型の幾つか（例えば、低体温症及び反射亢進）は、生体内でのＭＡＧＬ阻害の大きさを用量設定することによって、より有益な効果（例えば、痛覚消失）から薬理学的に脱共役することができた。実際に、より低い投与量はＭＡＧＬ活性のより低い遮断に帰着したけれども、発明者らは、本研究で試験したＪＺＬ１８４の全投与量範囲（４−４０ｍｇ／ｋｇ）にわたって顕著な２−ＡＧの増加を認めた。これらのデータは、このようにＭＡＧＬの部分的な阻害であっても生体内の２−ＡＧ媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達の増大にとって十分であるかもしれないことを示している。
【００８９】
実施例６．ＭＡＧＬ阻害剤の合成
合成法一般特に断りがない限り、全ての試薬は、より市販品を購入しそれ以上精製せずに使用した。脱水溶媒は、市販の予備脱水した酸素不含の製剤を活性化アルミナカラムに通すことによって得た。他に断らない限り、全ての反応は、乾燥器で乾燥したガラス器具を使用して窒素雰囲気下で実施した。フラッシュクロマトグラフィーは２３０−４００メッシュのシリカゲルを使用して実施した。ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ_３中バリアン・イノバ-４００（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ−４００）又はブルカーＤＭＸ−６００（Ｂｒｕｋｅｒ ＤＭＸ−６００）スペクトルメータで記録し、トリメチルシラン（ＴＭＳ）又は残存溶媒のピークに対しリファレンス設定した。化学シフトはＴＭＳに対し相対的にｐｐｍで報告し、Ｊ値はＨｚで報告する。高分解能質量分析実験は、スクリップス研究所質量分析コア部（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅ）において、エレクトロンスプレーイオン化飛行時間（ＥＳＩ−ＴＯＦ）を使用してアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）質量分析計で実施した。
【００９０】
ＪＺＬ１８４の合成撹拌する４−ブロモ−１，２−メチレンジオキシベンゼン（２．０１ｇ、１０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液（３０ｍｌ）にｎ−ＢｕＬｉ（ｎ−ブチルリチウム）（３．８ｍｌ、トルエン中２．６Ｍ、９．９ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下し添加した。同温度で１．５時間撹拌した後、エチルＮ−Ｃｂｚ−イソニペコチン酸（１．０２ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液（１０ｍｌ）を滴下して添加し、移行を定量化するために追加分のＴＨＦ（３ｍｌ）を使用した。試薬の添加が終了した後、冷却浴槽を取り除いたところ、懸濁液は徐々に透明溶液に変わった。３時間後、反応を水で停止しＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）で希釈した。層は分離し、有機層を水で２回、食塩水で１回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、減圧下で濃縮した。粗製油をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６：１その後４：１）で精製して白色固形物として中間体アルコール（０．８１ｇ、収率４７％）を得た：^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ ＭＨｚ）δ １．２９（ｑｄ、Ｊ＝４、１２ Ｈｚ、２Ｈ）、１．５１（ｂｓ、２Ｈ）、２．３８（ｔｔ、Ｊ＝２．８、１２ Ｈｚ、１Ｈ）、２．５８（ｓ、１Ｈ）、２．７５（ｔ、Ｊ＝１２ Ｈｚ、２Ｈ）、４．１９（ｂｓ、２Ｈ）、５．０３（ｄ、Ｊ＝５ Ｈｚ、２Ｈ）、５．８５（ｓ、４Ｈ）、６．７０（ｄ、Ｊ＝８ Ｈｚ、２Ｈ）、６．８８−６．９２（ｍ、４Ｈ）、７．２４−７．３３（ｍ、５Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、１００ ＭＨｚ）δ ２６．６、４４．４、４４．６、６７．１、７９．４、１０１．１、１０６．９、１０７．９、１１８．９、１２７．９、１２８．０、１２８．５、１３６．９、１４０．１、１４６．２、１４７．７、１５５．２；Ｃ_２８Ｈ_２７ＮＮａＯ_７［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算上のＨＲＭＳ５１２．１６８０は５１２．１６７０に見出された。本中間体の一部分（０．７２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＨ（１：１ ｖ／ｖ、４０ｍｌ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（パラジウム炭素）（１０％、０．２０ｇ）を一度に添加した。反応液はＨ_２下（１気圧）で一晩撹拌した。出発原料が完全に消費された後（１２−２４時間）、反応液をろ過し減圧下で濃縮した。生じた粗製油をＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍＬ）に溶解し、それにＥｔ_３Ｎ（トリエチルアミン）（２ｍｌ、１５ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（４６０ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を順次添加した。反応液を一晩撹拌した。翌朝、反応を水で停止しＥｔＯＡｃで希釈した。層は分離し、有機層を２Ｎ ＮａＯＨで２回、食塩水で１回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、減圧下で濃縮した。粗製油をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６：１その後４：１）で精製して、減圧下で放置すると黄色固形物に変わる、淡黄色の油としてＪＺＬ１８４（５５０ｍｇ、２段階収率７１％）を得た。
【００９１】
ＪＺＬ１７５の合成撹拌するエチルＮ−Ｃｂｚ−イソニペコチン酸（０．８４ｇ、２．９ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液（１０ｍｌ）にブロモ(４−メトキシフェニル)マグネシウム（１５ｍｌ、ＴＨＦ中０．５Ｍ）を室温で滴下し添加した。試薬の添加終了後に、反応液を加熱して一晩還流した。翌朝、反応を水で停止しＥｔＯＡｃで希釈した。層は分離し、有機層を水で２回、食塩水で１回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、減圧下で濃縮した。粗製油をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６：１その後２：１）で精製して淡黄色固形物として中間体アルコール（０．９０ｇ、収率６９％）を得た：^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ ＭＨｚ）δ １．２４−１．３３（ｍ、２Ｈ）、１．５４（ｂｓ、２Ｈ）、２．１４−２．１８（ｍ、１Ｈ）、２．４６（ｔ、Ｊ＝１２ Ｈｚ、１Ｈ）、２．７７（ｔ、Ｊ＝１１ Ｈｚ、２Ｈ）、３．７５（ｓ、６Ｈ）、４．２１（ｂｓ、２Ｈ）、５．０６（ｓ、２Ｈ）、６．８１（ｄ、Ｊ＝９ Ｈｚ、４Ｈ）、７．２７−７．３４（ｍ、９Ｈ）。この物質は、これ以上のキャラクタリゼーションをせずに使用した。本中間体の一部（５５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を、ＪＺＬ１８４の合成と同様の方法で、Ｐｄ／Ｃ及びクロロギ酸４−ニトロフェニルによる２段階手順によって処理した。粗製油をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６：１その後２：１）で精製し、減圧下に放置すると黄色固形物に変化する、淡黄色油としてＪＺＬ１７５（５５ｍｇ、２段階収率６２％）を得た：^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ ＭＨｚ）δ １．４０（ｍ、２Ｈ）、１．６５（ｔ、Ｊ＝１１ Ｈｚ、２Ｈ）、２．２６（ｂｓ、１Ｈ）、２．５５（ｔ、Ｊ＝１２ Ｈｚ、１Ｈ）、２．８７（ｔ、Ｊ＝１２ Ｈｚ、１Ｈ）、３．００（ｔ、Ｊ＝１３ Ｈｚ、１Ｈ）、３．７６（ｓ、６Ｈ）、４．２７（ｔ、Ｊ＝１３ Ｈｚ、２Ｈ）、６．８４（ｄ、Ｊ＝９ Ｈｚ、４Ｈ）、７．２４（ｄ、Ｊ＝９ Ｈｚ、２Ｈ）、７．３４（ｄ、Ｊ＝９ Ｈｚ、４Ｈ）、８．１９（ｄ、Ｊ＝９ Ｈｚ、２Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、１００ ＭＨｚ）δ ２６．６、２６．９、４４．４、４５．２、５５．４、７９．２、１１３．６、１１３．７、１２２．４、１２５．１、１２７．３、１３７．８、１３７．９、１４４．８、１５２．２、１５６．５、１５８．４；Ｃ_２７Ｈ_２７Ｎ_２Ｏ_６［Ｍ−Ｈ_２Ｏ＋Ｈ］^＋に対する計算上のＨＲＭＳ４７５．１８６４は４７５．１８６４に見出された。
【００９２】
ＷＷＬ１５２の合成撹拌するＮ−Ｂｏｃピペラジン（１００ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２溶液（５ｍｌ）にクロロギ酸４−ニトロフェニル（１０９ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）及びＥｔ_３Ｎ（７５μｌ、０．５４ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。３時間後、反応液を減圧下で濃縮した。粗製混合物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製して白色固形物としてＢｏｃ保護中間体（１００ｍｇ、収率５２％）を得た：^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ ＭＨｚ）δ ８．２４（ｄ、Ｊ＝９ Ｈｚ、２Ｈ）、７．３１（ｄ、Ｊ＝９ Ｈｚ、２Ｈ）、３．６７（ｂｓ、２Ｈ）、３．５４（ｂｓ、６Ｈ），１．５０（ｓ、９Ｈ）。当該中間体（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）に１：１ ｖ／ｖ ＴＦＡ：ＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍｌ）を室温で添加した。２時間後、反応液を減圧下で濃縮した。粗製物はそれ以上精製せずに使用した。撹拌する４−メトキシベンゾフェノン（１００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）ＥｔＯＨ溶液（５ｍｌ）にＮａＢＨ_４（３８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を室温で添加した。翌朝、反応液を水（１０ｍｌ）上に注ぎ込み、１時間撹拌し、次に生成物をフィルターで除き減圧下で濃縮した。ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍｌ）中の粗製アルコールに塩化オキサリル（４０μＬ、０．４６ｍｍｏｌ）を室温で滴下して添加した。粗製物をＣＨ_３ＣＮ（２ｍｌ）に再溶解し、それに４−ニトロフェニルピペラジン-１−カルボキシレート（５８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）及びＥｔ_３Ｎ（３２μｌ、０．２３ｍｍｏｌ）を順次添加した。試薬の添加終了後に、反応液を加熱し一晩還流した。翌朝、反応液を減圧下で濃縮した。粗製混合物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製して白色固形物としてＷＷＬ１５２（２０１ｍｇ、３段階収率８４％）を得た：^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、６００ ＭＨｚ）δ ８．２４（ｄ、Ｊ＝９ Ｈｚ、２Ｈ）、７．３２（ｄ、Ｊ＝８ Ｈｚ、４Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝９ Ｈｚ、２Ｈ）、６．８４（ｄ、Ｊ＝８ Ｈｚ、４Ｈ）、４．２２（ｓ、１Ｈ）、３．７６（ｓ、６Ｈ）、３．６６（ｓ、２Ｈ）、３．５７（ｓ、２Ｈ）、２．４５（ｓ、４Ｈ）；。Ｃ_２６Ｈ_２７Ｎ_３Ｏ_６［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算上のＨＲＭＳ４７８．１９７３は、４７８．１９７７に見出された。
【００９３】
ＷＷＬ１６２の合成ＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）中の１−（ビス（４−フルオロフェニル）メチル）ピペラジン（２９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）にクロロギ酸４−ニトロフェニル（２０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及びＥｔ_３Ｎ（１４μｌ、０．１ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。３時間後、反応液を減圧下で濃縮した。粗製混合物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製して白色固形物としてＷＷＬ１６２（４２ｍｇ、収率９２％）を得た：^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、６００ ＭＨｚ）δ ８．２４（ｄ、Ｊ＝９ Ｈｚ、２Ｈ）、７．３６（ｍ、４Ｈ）、７．２８（ｄ、Ｊ＝９ Ｈｚ、２Ｈ）、７．００（ｍ、４Ｈ）、４．２９（ｓ、１Ｈ）、３．６８（ｓ、２Ｈ）、３．５９（ｓ、２Ｈ）、２．４４（ｓ、４Ｈ）；Ｃ_２４Ｈ_２１Ｆ_２Ｎ_３Ｏ_４［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算上のＨＲＭＳ４５４．１５７３は、４５４．１５７８に見出された。
【００９４】
実施例７．他の方法及び実験材料
実験材料２−ＡＧ、ペンタデカン酸（ＰＤＡ）、ＡＥＡ、及びＵＲＢ５９７は、ケイマンケミカル社（アナーバー、ミシガン州）（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））から購入した。テトラヒドロリプスタチン（ＴＨＬ）は、シグマ社（セントルイス、ミズーリ州）（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から購入した。ＦＰローダミン及びＦＰビオチンは、既述の通り合成した（リォウら（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）」、１９９９年、第９６巻：ｐ．１４６９４−９）；及びパトリセリら（Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．）、「プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」、２００１年、第１巻：ｐ．１０６７−７１）。リモナバンはＮＩＤＡ（ロックヴィル、メリーランド州（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））から購入し、容量比１８：１：１の食塩水、エタノール、及びａｌｋａｍｕｌｓ-６２０（ローヌプーラン社製、プリンストン、ニュージャージー州（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｉｃ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ））からなる溶媒に溶解した。^１３Ｃオレイン酸アミド（^１３Ｃ_１８Ｈ_３５ＮＯ）は、クラヴァットら（Ｃｒａｖａｔｔ ｅｔ ａｌ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９５年、第２６８巻、ｐ．１５０６−９、に記載された方法に従って^１３Ｃオレイン酸（スペクトラ・ステイブル・アイソトープ社製、コロンビア、メリーランド州（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ、Ｃｏｌｌｕｍｂｉａ、ＭＤ））から合成した。
【００９５】
マウス組織プロテオームの調製マウス脳をｐＨ７．５のＰＢＳ中、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで均質化し、続いて壊死組織片を取り除くために低速回転（１，４００ｇ、５分間）した。それから、細胞質画分を上清に、膜画分を沈渣として得るために、上清を遠心（６４，０００ｇ、４５分間）にかけた。沈渣を洗浄し超音波処理によってＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。各画分の総タンパク質濃度は、タンパク質アッセイキット（バイオラド社製（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を使用して定量した。試料は、使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【００９６】
ＣＯＳ７又はＨＥＫ２９３細胞における組換え体の発現手短にいえば、マウスのセリンヒドロラーゼをコードする完全長ｃＤＮＡは、オープン・バイオ・システム社（ハンツビル、アラバマ州）（ＯｐｅｎＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ））から購入した。ｃＤＮＡは、直接形質移入するか（利用可能ならば真核細胞発現ベクター中に）又はｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にサブクローニングした。ＣＯＳ７細胞は、完全培地（Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びＦＣＳ添加ＤＭＥＭ）、３７℃及び５％ＣＯ_２で１０ｃｍディッシュ中、〜７０％集密まで培養した。当該細胞は、適切なｃＤＮＡ又は空ベクター対照（「ニセの」）及び製造者のプロトコルに従って形質移入試薬ＦＵＧＥＮＥ６（ロシュ・アプライド・サイエンス社製（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ））を使用することによって一過性に形質移入を行った。４８時間後、細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、擦過により採取し、ＰＢＳ０．２５ｍｌに再懸濁し、超音波処理によって溶解した。細胞溶解物は、アッセイにおいて細胞全体のホモジネートとして使用した。
【００９７】
酵素活性アッセイ手短に言うと、２−ＡＧ（１００μＭ）を、マウス脳膜（２０μｇ）又はＣＯＳ７細胞中の組換えＭＡＧＬ（０．１μｇ）と、ＰＢＳ（２００μｌ）中、室温で１０分間インキュベートした。容量比２：１のＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ５００μＬの添加によって反応を停止し、ＰＤＡ０．５ｎｍｏｌを投与し、ボルテックスし、次に相を分離するために遠心分離（１，４００ｇ、３分間）した。結果として生じた有機相の３０μｌをアジレント１１００シリーズＬＣ−ＭＳＤ ＳＬ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ−ＭＳＤ ＳＬ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）に注入した。ＬＣ分離は、プレカラム（Ｃ１８、３．５μｍ、２ｍｍｘ２０ｍｍ）と共にジェミニ（Ｇｅｍｉｎｉ）逆相Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６ｍｍｘ５０ｍｍ、フェノモネクス社製（Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ））によって行った。移動相Ａは、容量比９５：５のＨ_２Ｏ：ＭｅＯＨから構成し、移動相Ｂは、容量比６０：３５：５のｉ−ＰｒＯＨ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏから構成した。陰イオン化法におけるイオン形成を補助するために０．１％の水酸化アンモニウムを含有させた。流束は０．５ｍｌ／分であり、濃度勾配は、１．５分間は０％Ｂ、５分間かけて直線的に１００％Ｂに増加し、続いて３．５分間は１００％Ｂの均一濃度勾配とし、２分間かけて０％Ｂに平衡化した。ＭＳ分析は、エレクトロスプレーイオン源により実行した。キャピラリ電圧は３．０ｋＶに設定し、フラグメンター電圧は１００Ｖに設定した。乾燥ガス温度は３５０℃、乾燥ガス流束は１０ ｌ／分、及びネブライザ圧力は３５ｐｓｉであった。加水分解産物は、ＰＤＡ標準と比較したピーク下の面積を測定して定量した。^１３Ｃオレイン酸アミド又はＡＥＡ加水分解活性は、ＰＢＳ（１００μｌ）中、それぞれマウス脳膜（５０μｇ）又はＣＯＳ７細胞（５μｇ）中の組換えＦＡＡＨを使用して測定した。反応は、インキュベーション時間を３７℃で２０分間とし、反応を停止するために容量比２：１のＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ３００μｌを使用した以外、２−ＡＧ加水分解のために記載したのと同様の方法で実施した。ＤＡＧＬβ加水分解活性は、ＰＢＳ（１００μｌ）中でＨＥＫ細胞（５０μｇ）中の組換えＤＡＧＬβを使用して測定した。反応は、インキュベーション時間を３７℃で３０分間とした以外、オレイン酸アミド加水分解のために記載したのと同様の方法で実施した。
【００９８】
［^３Ｈ］リモナバン結合によるＪＺＬ１８４置換上記の通り膜を調製した。膜タンパク質（８μｇ）を、非標識リモナバン５μＭの存在下又は非存在下に（非特異的結合を定量するため）、０．２-３ｎＭ［３Ｈ］リモナバン含有５０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、 １．２５ｇ／ｌ 、と３０℃で９０分間インキュベートした。２番目のセットの試料も、ＪＺＬ１８４濃度を変化させる（０．００１−１０μＭ）以外は、同様のプロトコルを使用して調製した。反応は、リットル当たりトリス緩衝液５ｇを含有するＢＳＡ（トリスＢＳＡ）に予浸したワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルタ減圧ろ過によって停止し、続いて４℃のトリスＢＳＡで３回洗浄した。結合した放射活性は、シンチレーション液であるサイニット・セイフ、エコノ１（ＳｃｉｎｉｔＳａｆｅ Ｅｃｏｎｏ １）で抽出後に４５％の効率で液体シンチレーション分光光度法によって測定した。
【００９９】
脳脂質測定脳半分の重量を量り、続いて、Ｎ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）又は遊離脂肪酸（ＦＦＡ）測定用の標準品（２００ｐｍｏｌのｄ_４−ＯＥＡ、２０ｐｍｏｌのｄ_４−ＡＥＡ、４００ｐｍｏｌのＣ１５：０−ＭＡＧ、及び４ｎｍｏｌのＰＤＡ）を含む、容量比２：１：１のＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：トリスｐＨ８．０（８ｍｌ）、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで均質化した。混合物をボルテックスし、次に遠心分離した（１，４００ｇ、１０分間）。有機層を取り除き、終容量が再び８ｍｌになるまでＣＨＣｌ_３を添加し、抽出を繰り返した。有機抽出液を併せＮ_２気流下で乾燥し、容量比２：１のＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ（１２０μｌ）に再可溶化した。再可溶化脂質の３０μＬ及び１５μＬを、それぞれポジティブモード測定（ＭＡＧ及びＮＡＥ）及びネガティブモード測定（遊離脂肪酸）のために注入した。脂質測定は、上記と同様の装置及び溶媒を使用してＬＣ−ＭＳによって実施した。０．１％ギ酸又は０．１％水酸化アンモニウム等の溶媒改良剤を、それぞれポジティブ及びネガティブイオン化モードにおいてイオン形成を補助するために含有させた。ポジティブモード測定のためには、各操作とも流速０．１ｍｌ／分、５分間で開始した。濃度勾配は、０％Ｂで開始し、流速０．４ｍｌ／分で４０分間かけて直線的に１００％Ｂに増加し、続いて７分間は１００％Ｂの均一濃度勾配とし、次に流速０．５ｍｌ／分で８分間かけて０％Ｂに平衡化した。ネガティブモード測定のためには、各操作とも流速０．１ｍｌ／分、３分間で開始した。濃度勾配は、０％Ｂで開始し、流速０．４ｍｌ／分で１７分間かけて直線的に１００％Ｂに増加し、続いて７分間は１００％Ｂの均一濃度勾配とし、次に流速０．５ｍｌ／分で３分間かけて０％Ｂに平衡化した。ＭＡＧ、ＮＡＥ、及びＦＦＡは、Ｃ１５：０又は重水素化標準品と比較したピーク下面積を測定することによって定量した。標的ＬＣ−ＭＳ測定は、選択イオン検出（ＳＩＭ）を使用して実施した。
【０１００】
生体内でＪＺＬ１８４の標的となるＳＨのＡＢＰＰ−ＭｕｄＰＩＴ解析上記の通り、ＪＺＬ１８４又は溶媒で処理したマウス由来の脳膜プロテオームの一部（１ｍｌ、ｍｌＰＢＳ当たり１ｍｇ）を、５μＭのＦＰビオチンにより室温で１時間標識し、Ｌｙｓ−Ｃ消化段階を省略した以外は、当該技術分野で既述の通りＡＢＰＰ−ＭｕｄＴＩＴ分析のために調製した（グリーンバウムら、「モレキュラー＆セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」、２００２年、第１巻：ｐ．６０−６８；及びアレキサンダーら（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」、２００６年、第１２８巻：ｐ．９６９９−７０４）。溶出したペプチドのＭｕｄＰＩＴ解析は、直結型アジレント１００ＬＣ−テルモフィニガンＬＴＱ−ＭＳ装置（ａ ｃｏｕｐｌｅｄ Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣ−ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ−ＭＳ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）に関し既述した通り実施した。全データセットは、ＳＥＱＵＥＳＴ検索アルゴリズムを使用してマウスのＩＰＩデータベースで検索し、結果はＤＴＡＳＥＬＥＣＴによりフィルター処理しグループ分けした。１．８（＋１）、２．５（＋２）、３．５（＋３）以上大きな相互相関スコア及び０．０８以上大きなデルタＣＮスコアを有するペプチドを、スペクトラル・カウンティング分析に含めた。対照試料の中で平均して５以上のスペクトル・カウントが同定されたタンパク質のみを、比較分析の考慮に入れた。特に、プローブ標識タンパク質は、「無プローブ」対照の操作（ビオチン標識ＦＰ不含の上述の通り実施した実験）において認められるよりも少なくとも５倍大きなスペクトル数を有するＦＰ処理試料の中に存在することによって更に同定される。スペクトル・カウントは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を付随する三試料の平均として報告する。
【０１０１】
行動的研究リモナバンと対比したＪＺＬ１８４の薬理学的効果を下記の指標を使用して評価した：自発運動活性、ホットプレート試験及び尾浸漬試験による侵害受容、バー試験による強硬症、及び低体温症。群当たり１４匹のマウスのサンプルサイズで、全４グループのマウスを使用した。注射前に、尾浸漬試験におけるベースライン応答、並びに直腸温度に関する評価を行った。被験者にリモナバン又は溶媒を腹腔内注射し、続いて１０分後にＪＺＬ１８４又はそれぞれの溶媒を腹腔内注射した。自発運動活性はＪＺＬ１８４又は溶媒投与の１２０分後に評価し、退避反応潜時は、２回目の注射１３５分後に評価し、並びに強硬症及び直腸温度は注射１４５分後に評価した。運動性低下を測定するために、各マウスを透明なプレキシガラス製箱（４２．７ｘ２１．０ｘ２０．４ｃｍ）に評価時間の１０分間放置し、エニメイズ（Ａｎｙｍａｚｅ）ソフトウェアを使用して（ステールティング社製、ウッドデール、イリノイ州（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ））静止時間のパーセントを測定した。被験者の侵害受容は、尾浸漬アッセイにより評価した。頭を先にし尾をバッグから外に状態で、各マウスを吸収パッドで製作された小さなバッグ（ＶＷＲサイエンティフィック・プロダクツ社製（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；直径４ｃｍ、長さ１１ｃｍ）に配置した。実験者はマウスを優しく抱き、尾の先約１ｃｍを５６．０℃に維持した温浴に浸漬した。１０秒以内の遮断時間にマウスがその尾を温浴から退かせるための潜時を評価した。強硬症は、各被験者の前足を、床面から４．５ｃｍ高い棒（直径０．７５ｃｍ）の上に載せるバー試験を使用して評価した。その足を棒の上に１０秒間置き静止したままのマウス（呼吸運動を除外）を強硬症と評価した。本研究においていずれのマウスも強硬症でなかったにもかかわらず、ＪＺＬ１８４で単独処理したマウスの半数が、前足を棒の上に載せられた時に、跳躍又は「ポップコーン」行動と例示される、反射亢進を示した。直腸温度は、熱電対探針を直腸に２．０ｃｍ挿入して測定し、温度は遠隔時期温度計によって得た。
【０１０２】
未処理の被験者の第二群（群当たりｎ＝１０−１１匹マウス）を酢酸ストレッチングアッセイで評価した。被験者にリモナバン又はその溶媒を皮下注射し、続いて１０分後にＪＺＬ１８４又は溶媒を皮下注射した。二番目の注射の１２０分後に、酢酸（０．６％）を１０μｌ／ｇ体重の量で腹腔内に注入した。酢酸投与後の２０分間のマウス当たりのストレッチング（腹部の収斂、体幹の回転（ねじれ）及び全身及び後肢の伸展）回数を計数した。
【０１０３】
拮抗的活性に基づいたタンパク質プロファイリング（ＡＢＰＰ）実験生体外での阻害活性の選択性を当該技術分野で記載された拮抗的ＡＢＰＰ法を使用して試験した（例えば、リーら、「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」、２００７年、第１２９巻：ｐ．９５９４−５；及びロイングら（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）」、２００３年：第２１巻、ｐ．６８７−９１）。手短に言えば、本明細書に記載の通りに調製したマウスの脳膜プロテオームを、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈し、全反応液量５０μｌ中、終濃度２μＭでのＦＰローダミンの添加前に、種々の濃度の阻害剤（１ｎＭから１０μＭ）と３７℃で３０分間プレインキュベートした。室温で３０分後、反応液は、４ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ローディング緩衝液により反応停止し、９０℃で５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、フラットベッド蛍光スキャナを使用してゲル中で可視化した。
【０１０４】
ＪＺＬ１８４による生体外研究標準アッセイは、基質又はＡＢＰＰプローブの添加前に、タンパク質試料をＪＺＬ１８４と３７℃で３０分間プレインキュベートすることによって実施した。基質アッセイから濃度依存阻害曲線が得られ、当該曲線は、プリズム（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェア（グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ））を使用して９５％の信頼区間を有するＥＣ_５０値を得るために適していた。ｋ_ｏｂｓ／［Ｉ］値の測定のために、脳膜プロテオーム（１ｍｇ／ｍｌ、全量３００μｌ）をＪＺＬ１８４とインキュベートした（０．０１−１５μＭ、１０−４０分間、３７℃）。１０分ごとに反応液の５０μｌを取り出し、ＦＰローダミン（２μＭ）で２分間処理し、４ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液で反応停止し、９０℃で５分間煮沸した。混合性の反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、フラットベット蛍光スキャナを使用してゲル中で可視化した。残存活性のパーセントは、ＭＡＧＬ又はＦＡＡＨのバンドに相当する統合した光学密度を測定することによって決定したが、その結果は擬一次速度定数を決定する指数曲線と適合した。
【０１０５】
ＪＺＬ１８４による生体内研究ＪＺＬ１８４（純品）をボルテックスし、超音波処理し、及び穏やかに加熱することによって容量比４：１のＰＥＧ３００：ツイーン８０に直接溶解した（１０、４、２、又は１ｍｇ／ｇ）。Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ雄マウス（６−８週令、２０−２６ｇ）にＪＺＬ１８４又はＪＺＬ１８４無添加の容量比４：１のＰＥＧ３００：ツイーン８０溶媒を４μ／ｇ体重の量で腹腔内投与した（上記希釈によって４０、１６、８、又は４ｍｇ／ｋｇ）。明示した時間後に、マウスをイソフルランで麻酔し、断頭によって屠殺した。脳を取り除き、正中矢状面に沿って半側切断し、次に各半分を液体Ｎ_２で瞬間凍結した。脳の半分は上記の通りタンパク質分析用に調製し、他の半分は代謝産物分析用に使用した。ＵＲＢ５９７を超音波によって容量比１８：１：１の食塩水：エマルファオー（ｅｍｕｌｐｈｏｒ）：エタノールに溶解したのと１０μｌ／ｇ体重（最終投与量１０ｍｇ／ｋｇ）の量で腹腔内投与したのを除き、ＵＲＢ５９７によるＦＡＡＨの選択的阻害も上記と同様の方法で行った。
【０１０６】
実施例８．癌発症機序における増加ＭＡＧ活性の同定
癌発発症機序に寄与する酵素活性を同定するために、発明者らは、黒色腫［侵襲性（Ｃ８１６１、ＭＵＭ２Ｂ）、非侵襲性（ＭＵＭ２Ｃ）］、卵巣癌［侵襲性（ＳＫＯＶ３）、非侵襲性（ＯＶＣＡＲ３）］、及び乳癌［侵襲性（２３１ＭＦＰ）、非侵襲性（ＭＣＦ７）］を含む、多様な起源の腫瘍由来の、侵襲性及び非侵襲性のヒト癌細胞株のパネル（調査対照群）の機能的なプロテオーム解析を行った。侵襲性癌細胞株は、その非侵襲性のカウンターパートと比較して、より大きな生体外での移動及び生体内での腫瘍増殖速度を示すことが確認された。これらの癌細胞株由来のプロテオームを、セリンヒドロラーゼ指向フルオロホスホネート（ＦＰ）活性に基づいたプローブを使用して、活性に基づいたタンパク質プロファイリング（ＡＢＰＰ）によって選別した。本研究の目的は、これらの保存酵素の変化が癌細胞の病態に対し寄与する高い可能性を有するであろうとの仮説の下に研究しつつ、非侵襲性と比較して侵襲性癌細胞株において一貫して変化する加水分解酵素活性を同定することにあった。
【０１０７】
スペクトラル・カウンティングによって判断したところ、この分析で検出された５０以上のセリンヒドロラーゼの中で、二の酵素、ＫＩＡＡ１３６３及びＭＡＧＬが非侵襲性のカウンターパートと比較して侵襲性癌細胞において一貫して増加することが見出された。発明者らは、侵襲性癌細胞におけるＫＩＡＡ１３６３及びＭＡＧＬの増加をゲルに基づくＡＢＰＰによって確認したが、そこではプロテオームをローダミンタグＦＰで処理し、１Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びインゲル蛍光スキャニングによって分析する（図１３Ａ）。どちらの場合も、ＫＩＡＡ１３６３についての差別的グリコシル化のため、及びおそらくＭＡＧＬについての選択的スプライシングのために（カールソンら（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、「ジーン（Ｇｅｎｅ）」、２００１年、第２７２巻：ｐ．１１−１８）、各酵素の二つの型が検出された（図１３Ａ）。襲性癌細胞におけるＭＡＧＬの高められた活性は、基質Ｃ２０：４ＭＡＧを使用して侵確認した（図１３Ｂ）。数種類の酵素がＭＡＧ加水分解活性を示すことが明らかにされてきたので（ブランクマンら（Ｂｌａｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（ＣｈｅｍＢｉｏｌ）」、２００７年、第１４巻：ｐ１３４７−１３５６）、発明者らは、強力で選択的なＭＡＧＬ阻害剤ＪＺＬ１８４を使用して、ＭＡＧＬが癌細胞中のこの過程に成す寄与を確認した。ＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）は癌細胞のＭＡＧ加水分解活性を劇的に減少し（図１３Ｂ）、ＭＡＧＬの３３及び３５ｋＤＡ型の両方のＦＰローダミンシグナルを選択的に遮断した（図１３Ａ）。対照的に、発明者らは、ＪＺＬ１８４処理が癌細胞によって示されるジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、リゾリン脂質、及びリン脂質を含む、数種類の追加のクラスの脂質に対する加水分解活性を変化させないことを見出した。これらのデータは、侵襲性癌細胞が極めて増加したＭＡＧ活性を示し、例え全てではないにしても、この活性の殆どがＭＡＧＬ酵素に基づくことを明らかにしている。
【０１０８】
研究は、ＭＡＧＬが侵襲性癌細胞の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）レベルを制御することを明らかにしている。ＭＡＧＬの既知の機能と調和して、発明者らは、ＪＺＬ１８４によるＭＡＧＬの遮断が（１μＭ、４時間）、各々の侵襲性癌細胞株において、２−ＡＧを含む数種類のモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）レベルの著しい増加を引き起こすことを見出した（図１３Ｃ）。興味深いことに、しかしながら、ＭＡＧＬ阻害はまた侵襲性癌細胞におけるＦＦＡレベルの著しい減少も引き起こした（図１３Ｄ）。この驚くべき発見は正常細胞におけるＭＡＧＬの機能とは対照をなしている。この酵素が一般的にはＦＦＡレベルを制御しないことは知られていた（野村ら（Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー・ケミカル・バイオロジー（ＮａｔＣｈｅｍＢｉｏ）」、２００８年、第４巻、ｐ．３７３−３７８）。発明者らは、またＣ２０：４ＦＦＡ及びＭＡＧを除いては、ＦＦＡの減少の大きさが相応するＭＡＧの増加を大いに上回る（Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、及びＣ１８：１脂質に対し、それぞれ〜５０００−６１００ｐｍｏｌ及び４１−７５ｐｍｏｌ）ことにも注目した。質量収支におけるこの明らかな矛盾が、ＪＺＬ１８４処理癌細胞における増加したＭＡＧの他の代謝産物への変換によって説明することは可能かもしれない。この前提と一致して、発明者らは、リピドーム解析がＪＺＬ１８４処理癌細胞においてリゾリン脂質の二の主要なクラス、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）及びリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）の著しい増加を明らかにすることを見出した。これらのリゾリン脂質の増加の累積的大きさは（４１００−６５００ｐｍｏｌ）、ＪＺＬ１８４処理細胞において認められるＦＦＡの減少とぴったりと一致した。とりわけ、発明者らは、癌細胞においてＣ２０：４リゾリン脂質を検出しなかったが、これは、なぜＪＺＬ１８４がそれぞれＣ２０：４ＭＡＧ及びＦＦＡの同様の大きさの増加及び減少を引き起こしたかの、ありそうな説明を提供している。非天然Ｃ１７：０−ＭＡＧを使用した代謝標識研究は、ＭＡＧが侵襲誠意癌細胞によってＬＰＣ及びＬＰＥに変換されること、並びにこの代謝変換がＪＺＬ１８４処理によって著しく亢進されること確認した。最後に、発明者らは、ＪＺＬ１８４処理が非侵襲性癌細胞株におけるＭＡＧ及びＦＦＡレベルに影響を与えなかったことを見出したが（図１３Ｃ、１３Ｄ）、これはこれらの細胞における無視できるＭＡＧ発現と一致する（図１３Ａ、１３Ｂ）。
【０１０９】
発明者らは、次に、二の独立したｓｈＲＮＡプローブを使用するＲＮＡ干渉技術によってＭＡＧＬの発現を安定してノックダウンしたが、その両方とも侵襲性癌細胞株においてＭＡＧＬ活性の７０−８０％を減少した、（図１４Ａ、図１４及び図２１）。他のセリンヒドロラーゼ活性は、ｓｈＭＡＧＬプローブによっては影響されなかったが（図１４Ａ、図１４及び図２１）、このことはこれらの試薬の特異性を確認している。両方のｓｈＭＡＧＬプローブとも、侵襲性黒色腫（図１４Ｂ、１４Ｃ）、卵巣癌（図１４Ｅ、１４Ｆ）、及び乳癌細胞（図２１）において、著しいＭＡＧの増加及び相応するＦＦＡの減少を引き起こした。あわせて、これらのデータは、急性の（薬理学的）及び安定した（ｓｈＲＮＡ）ＭＡＧＬの両方の遮断が侵襲性癌細胞においてＭＡＧの増加及びＦＦＡの減少を引き起こすことを明らかにしている。さらに、侵襲性癌細胞が非侵襲性癌細胞よりも高い基礎レベルのＦＦＡを発現すること、並びにこの変化した代謝プロファイルがＭＡＧＬ阻害によってほとんど根絶されることに注目すべきである。これらの興味ある発見は、ＭＡＧＬが侵襲性癌細胞におけるＦＦＡレベルの主要な制御因子であることを示している。最後に、発明者らは、ＭＡＧＬ活性（図１５Ａ、１５Ｂ）及びＦＦＡレベル（図１５Ｃ）が、良性又は低悪性度腫瘍と比較して高悪性度の原発性ヒト卵巣腫瘍においても増加することを確認した。このように、ＭＡＧＬ−ＦＦＡ経路の高められた発現は、侵襲性ヒト癌細胞株及び原発性腫瘍両方の顕著な特徴である。
【０１１０】
実施例９．ＭＡＧＬ調節による癌の病原性制御
発明者らは、最初にＭＡＧＬ発現の破壊の影響及び癌の病原性に関する活性を特定した。病原性の変化について、一組の生体外及び生体内アッセイを使用して、ｓｈＭＡＧＬ癌細胞株を試験した。ｓｈＭＡＧＬ黒色腫細胞（Ｃ８１６１）、卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３）、及び乳癌細胞（２３１ＭＦＰ）は、著しく減少した生体外の移動（図１６Ａ、図１６Ｆ及び図２１）、浸潤（図１６Ｂ、図１６Ｇ及び図２１）、及び血清飢餓条件下の細胞生存（図１６Ｃ、図１６Ｈ及び図２１）を示した。ＪＺＬ１８４によるＭＡＧＬの急性の薬理学的遮断もまた癌細胞の移動を減少し（図２１）、生存を減少しなかったが、これは、おそらく癌の病原力を最大に障害するには、持続性のＭＡＧＬ阻害が要求されることを示している。
【０１１１】
ｓｈＭＡＧＬ−Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３癌細胞は、免疫不全マウスで実施した皮下異種移植片移植の研究において（図１６Ｄ、１６Ｉ）、著しく減少した腫瘍増殖速度を示した。同様の腫瘍増殖速度の障害が、腫瘍中のＭＡＧＬ活性を遮断することが確認された治療レジームに従って（データ不掲載）、ＪＺＬ１８４を一日一回投与した（４０ｍｇ／ｋｇ、経口投与）Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３異種移植片移植マウスにおいても認められた（図１６Ｅ、１６Ｊ）。とりわけ、ＭＡＧＬ破壊腫瘍は、かなり低いＦＦＡレベルを有したが、このことは、ＭＡＧＬが生体内で増殖する癌細胞内の脂肪酸代謝に対する制御を維持することを示している。まとめると、これらの生体外及び生体内での研究は、ＭＡＧＬ活性が悪性の癌細胞によって示される侵襲性の特性の幾つかを支持することを証明している。
【０１１２】
発明者らは、次に非侵襲性癌細胞におけるＭＡＧＬの発現がその脂質代謝プロファイル及び病原性を変化させることができるか否かを。ＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３細胞の安定なＭＡＧＬ過発現変異体（ＭＡＧＬ−ＯＥ）並びに対照変異体［空ベクター発現体又はセリン求核試薬がアラニンに変異された（Ｓ１２２Ａ）触媒的に不活性な変異体］をレトロウイルス感染によって作成し、それらのそれぞれのＭＡＧＬ活性を、ＡＢＰＰ及びＣ２０：４ＭＡＧ基質アッセイによって評価した。両アッセイにより、ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞が対照細胞と比較して１０倍以上大きなＭＡＧＬ活性の増加を有することを確認した（図１７Ａ）。ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞は、また著しいＭＡＧの減少（図１７Ｂ）とＦＦＡの増加（図１７Ｃ）も示した。この変化した代謝プロファイルは、ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞において増加した移動（図１７Ｄ）、浸潤（図１７Ｅ）、及び生存（データ不掲載）を付随した。これらの効果のいずれもＳ１２２Ａ ＭＡＧＬ変異体を発現する癌細胞において認められなかったが、そのことは、それらがＭＡＧＬ活性を要求することを示している。また、この前提と一致して、ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞において認められた代謝及び病原性効果の両方ともＪＺＬ１８４の単回処理によって逆転された。最後に、ＭＡＧＬ−ＯＥ ＭＵＭ２Ｃ細胞は、また対照細胞と比較して生体内での増加した腫瘍増殖も示した（図１７Ｆ）。とりわけ、ＭＡＧＬ−ＯＥ ＭＵＭ２Ｃ細胞の増加した腫瘍増殖速度は侵襲性Ｃ８１６１細胞のそれにほぼ匹敵したが（データ不掲載）、このことは、ＭＡＧＬが黒色腫細胞において高度に腫瘍原性の表現型を誘発するのに充分であることを示している。まとめるとこれらのデータは、非侵襲性癌細胞における異所的なＭＡＧＬの発現が、生体外及び生体内の両方でそのＦＦＡレベルを増加し及び病原性を促進するのに充分であることを示している。
【０１１３】
実施例１０．ＭＡＧＬ⁻癌細胞の障害病原性の代謝レスキュー
ＭＡＧＬは、そのＭＡＧ基質レベルを減少することによって、又はそのＦＦＡ産物レベルを増加することによって、又はその両方によって、癌細胞の侵襲性を支持することができた。ＭＡＧの中で、主要なシグナル伝達分子は内在性カンナビノイドである２−ＡＧであり、それはＣＢ１及びＣＢ２受容体を活性化する。そこで発明者らは、亢進した内在性カンナビノイドシグナル伝達（増加した２−ＡＧレベルから生じる）が、ＭＡＧＬ破壊癌細胞において認められる抗移動効果を媒介することができるか否かを試験した。しかしながら、発明者らは、ＣＢ１アンタゴンストもＣＢ２アンタゴニストもｓｈＭＡＧＬ癌細胞の移動障害を救出しないことを見出した。ＣＢ１及びＣＢ２アンタゴニストは、また癌細胞中のＭＡＧ又はＦＦＡレベルにも影響をあたえなかった（データ不掲載）。これらの発見は、侵襲性癌細胞における低いＣＢ１及びＣＢ２受容体の発現レベルと結びついて（データ不掲載）、ＭＡＧＬの癌の侵襲性に関する効果は内在性カンナビノイドシグナル伝達によって媒介されなかったことを主張している。
【０１１４】
ＭＧＡＬ触媒反応の産物に注目して、発明者らは、仮にＭＡＧＬの前腫瘍形成性効果がＦＦＡ（又はその二次代謝産物）によって媒介されるとするならば、ｓｈＭＡＧＬ癌細胞の病原性の障害は、外来起源の脂肪酸による処理によって救出されるかもしれないと推論した。この仮説を支持するが、侵襲性癌細胞におけるＭＡＧＬによって制御される二の主要なＦＦＡ、パルミチン酸又はステアリン酸のｓｈＭＡＧＬ又はＪＺＬ１８４処理ＭＡＧＬ−ＯＥ癌細胞への添加は（それぞれＣ１６：０及びＣ１８：０ＦＦＡ；２０μＭ、４時間）、当該細胞の移動活性を完全に回復させた（図１８Ａ、１８Ｂ）。Ｃ１６：０及びＣ１８：０ＦＦＡは、また非侵襲性癌細胞ＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３の移動活性を刺激することも見出された（図１８Ｂ）。発明者らは、次に増加したＦＦＡ送達量が生体内でｓｈＭＡＧＬについて見出される腫瘍増殖障害を修正することができるか否かを特定した。免疫不全マウスを異種移植片腫瘍増殖実験の期間を通して通常の固形飼料か又は高脂肪食で飼育した。とりわけ、ｓｈＭＡＧＬ−Ｃ８１６１細胞の障害した腫瘍増殖速度は、高脂肪食を与えられたマウスにおいて完全に救出された。対照的に、ｓｈ対照Ｃ８１６１細胞は、通常飼料と高脂肪食とにおいて同等の腫瘍増殖速度を示した。高脂肪食群のｓｈＭＡＧＬ−Ｃ８１６１細胞に対する腫瘍増殖の回復は、切除した腫瘍中の著しく増加したＦＦＡレベルと相互に関連があった（図１８Ｄ）。
【０１１５】
まとめると、これらの結果は、ＭＡＧＬが増加したＦＦＡレベルを持続的に維持することによって癌細胞の病原性の特性を支持することを示している。発明者らは、次にこの代謝プロファイルが侵襲性癌細胞の大きな脂質代謝ネットワークに影響することができるか否かを尋ねた。
【０１１６】
実施例１１．ＭＡＧＬは前腫瘍形成性シグナルに富んだ脂肪酸代謝ネットワークを制御する
発明者らは、最初にＭＡＧＬ−ＦＦＡ経路が、解糖系に燃料を供給するためにＮＡＤ＋を再生する（連続的な脂肪アシルグリセリド／ＦＦＡ再循環による）ための方法として貢献することができるか否かを検討したが、それは、癌における増加した中性脂質ヒドララーゼ活性に対する必要性を説明するために仮定されたものである（プルジビッツコウスキーら（Ｐｒｚｙｂｙｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）、「バイオケミストリー＆セル・バイオロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．）」、２００７年、第８５巻：ｐ．３０１−３１０）。このモデルの議論をするうちに、発明者らは、対照細胞と比較してｓｈＭＡＧＬ及びＭＡＧＬ−ＯＥ細胞中においてＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの比率並びにピルビン酸及び乳酸レベルが不変であることを見出した。増加した脂肪分解に対する他の可能な理由は、癌細胞の重要なエネルギー源として役立つことができる、β酸化のためのＦＦＡ基質を産生することであるかもしれなかった。しかしながら、発明者らは、β酸化の律速段階を触媒する、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）の阻害剤が、癌細胞（ｓｈ対照、ｓｈＭＡＧＬ、又はＭＡＧＬ−ＯＥ）の移動活性に影響を与えないことを見出した。ＣＰＴ１遮断は、ｓｈ対照細胞においてのみ増加したＣ２０：４ＦＦＡを除き、癌細胞中のＦＦＡレベルを変化することもできなかった。さらなる研究により侵襲性癌細胞における減少したＣＰＴ１発現が明らかとなったが、そのことは、ＭＡＧＬ脂肪酸代謝経路の病原性効果の下流の伝達物質としてのβ酸化に関する役割に対するエビデンスを提供している。
【０１１７】
ＦＦＡが膜構造物及びシグナル伝達分子の産生及び再構築のための基礎的な構成要素であることを考慮すると、ＭＡＧＬにおける攪乱が悪性腫瘍にとって重要な幾つかの脂肪依存性生化学的ネットワークに影響を与えることを期待できるかもしれない。この仮説を検証するために、発明者らは、１）対照癌細胞と比較したＭＡＧＬ−ＯＥ（ＯＶＣＡＲ３、ＭＵＭ２Ｃ）、及び２）ｓｈ対照癌細胞と比較したｓｈＭＡＧＬ（ＳＫＯＶ３、Ｃ８１６１）の比較を含む、変更したＭＡＧＬ活性を有する癌細胞モデルのリピドーム解析を行った。癌細胞の有機抽出物を、数種の主要な脂質ファミリーをプロファイルする、非標的液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）プラットホームを使用して分析し、比較群の間で顕著に変化したレベルを有する代謝産物を、ＸＣＭＳソフトウェアを使用して同定した。全体的なプロファイルを補完するために、発明者らは、標準的なリピドミック方法による検出にとっては低すぎる存在量である、特別な生理活性脂質（例えば、プロスタグランジン）の標的測定も行った。結果として得られたデータセットは、次にＭＡＧＬによって制御される脂質代謝産物の共通のサインを同定するために採掘されたが、発明者らは、当該産物を、ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞において著しく増加し又は減少し、並びにそのそれぞれの対照群と比較してｓｈＭＡＧＬ細胞において逆の変化を示した代謝産物と定義した（図１９Ａ、１９Ｂ）。
【０１１８】
幾つかのリゾリン脂質（ＬＰＣ、ＬＰＡ、ＬＰＥ）、エーテル脂質（ＭＡＧＥ、アルキルＬＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ_２）を含む、ＭＡＧＬ脂肪酸代謝ネットワーク中の脂質の殆どは、ＭＡＧＬ−ＯＥ及びｓｈＭＡＧＬ細胞において、それぞれ一貫して増加及び減少するというＦＦＡにたいする同様のプロファイルを示した。ＭＡＧのみが、逆のプロファイルを示すことが見出された（ｓｈＭＡＧＬ及びＭＡＧＬ−ＯＥ細胞において、それぞれ増加及び減少する）。興味深いことに、この全体のリピドミックなサインは、その非侵襲性のカウンターパートと比較したときに侵襲性癌細胞においても実質的に認められた（例えば、それぞれＭＵＭ２Ｃと比較したＣ８１６１及びＯＶＣＡＲ３と比較したＳＫＯＶ３）。これらの発見は、ＭＡＧＬが侵襲性癌細胞において、ＦＦＡ及びＭＡＧだけでなく多数の二次脂質代謝産物からも成る脂質代謝ネットワークを制御することを証明している。発明者らは、ＪＺＬ１８４によるＭＡＧＬの急性阻害が、特徴的な二次リピドミックなサインを引き起こすことを見出したことにさらに興味をそそられた。ｓｈＭＡＧＬ細胞において認められた通りＪＺＬ１８４処理は、高ＭＡＧＬレベルを発現する各癌細胞株においてＬＰＡ及びＰＧＥ_２の減少を引き起こした（図１９Ｃ、１９Ｄ）。対照的に、以前にも説明した通り、ＬＰＣ及びＬＰＥの（減少というより）増加がＪＺＬ１８４処理細胞において認められた（図２０）。これらのデータは、急性及び慢性のＭＡＧＬ遮断が癌細胞において明確なメタボロミック効果を引き起こすことを示しているが、おそらくＦＦＡの長期枯渇と対比した短期枯渇の特異的な成果を反映している。最後に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴシン−１−リン酸、コレステロール、ジアシルグリセロール、及びトリアシルグリセロールを含む幾つかのクラスの脂質は、ＭＡＧＬ活性の減少又は増加によって影響を受けなかったが、このことは、それらが、この酵素により制御される脂肪酸代謝ネットワークの制限成分であることを強調している。
【０１１９】
ＭＡＧＬ脂肪酸代謝ネットワーク内にＬＰＡ及びＰＧＥ_２を含む数種類の前腫瘍形成性脂質メッセンジャーが存在するが、それらは癌細胞の侵襲性を促進することが報告されている。代謝標識研究により、侵襲性癌細胞がＭＡＧ及びＦＦＡの両方をＬＰＡ及びＰＧＥ２に変換することができ、ＭＡＧに関しては、この変換がＪＺＬ１８４によって遮断されることが確認された（データ不掲載）。興味深いことに、ＬＰＡ又はＰＧＥ_２どちらかの処理は、ｓｈ対照細胞の移動に影響を与えない濃度において、ｓｈＭＡＧＬ癌細胞の障害した移動を救出した（図１９Ｅ）。逆に、ＭＡＧＬ−ＯＥ癌細胞の増加した移動活性は、Ｇ_ｉ／Ｇ_ｏ阻害剤である百日咳毒素によって完全に遮断された（図１９Ｆ）。最後に、ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞において認められた刺激された移動の程度は、外からのＬＰＡ添加によって引き起こされる最大効果に匹敵した（図１９Ｇ）。まとめると、これらのデータは、Ｇタンパク質共役型受容体に作用して高い移動活性を促進する生理活性脂質の産生を増加させることによって少なくとも部分的に、ＭＡＧＬが癌の病原性に寄与することを示唆している。ＭＡＧＬ脂肪酸代謝ネットワークが他の前腫瘍形成性シグナル伝達系と相互作用するか否かを評価するために、発明者らは、ｓｈＭＡＧＬ及びｓｈ対照細胞を上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤で処理した。ｓｈＭＡＧＬ細胞は、ＥＧＦＲ遮断の抗移動効果（図１９Ｈ）及び抗生存効果（データ不掲載）に対する著しく高められた感受性を示す。これらのデータは、以前の発見と一致しており、このことは、癌細胞におけるＬＰＡとＥＧＦＲシグナル伝達経路との間の実質的なクロストーク（相互干渉）を示している。
【０１２０】
実施例１２．腫瘍発症機序におけるＭＡＧＬ研究のための実験材料及び方法
実験材料Ｃ８１６１、ＭＵＭ−２Ｂ、ＭＵＭ−２Ｃ、及び２３１ＭＦＰを除き、全ての細胞株は、ＮＣＩ６０癌細胞株パネルの部分であり、米国国立癌研究所開発治療プログラムから入手した。Ｃ８１６１、ＭＵＭ−２Ｂ、及びＭＵＭ−２Ｃ細胞株は、マリー・ヘンドリックス（Ｍａｒｙ Ｈｅｎｄｒｉｘ）から提供を受けた。２３１ＭＦＰ細胞は、既述の通り（ジェサニーら、２００４年；前掲書）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の外植した異種移植片腫瘍から作成した。Ｃ１５：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０及びＣ１８：１ ＦＦＡ、Ｃ１８：１ ＦＦＡ−ＯＨ及びＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、及びＣ２０：４ＭＡＧは、シグマ社から購入した。Ｃ１２：０ＭＡＧＥ及びＣ１５：０ＭＡＧは、それぞれアレッキス・バイオケミカルズ社（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及びヌ・チェック・プリプ社（Ｎｕ−ｃｈｅｃｋ Ｐｒｅｐ）から購入した。Ｃ２０：４ＦＦＡ及びＰＧＥ_２は、ケイマン・ケミカルズ社から購入した。他の代表的な種々のクラスの脂質の脂質標準品は、シグマ社、ケイマン・ケミカルズ社、ヌ・チェック・プリプ社、又はアヴァンチー・リピッズ社（Ａｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓ）から購入した。ＦＰローダミン及びＦＰビオチンは、既述の方法に従って合成した。ＪＺＬ１８４は、以前詳述した通り合成した。ヒトＭＡＧＬ抗体（抗Ｎ末端アミノ酸１−１２１）は、ノヴァス・バイオロジカルズ社（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）から購入した。
【０１２１】
癌細胞におけるＭＡＧＬの薬理学的阻害薬理学的阻害研究は、既述の通り行った（チャングら（Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００６年、第１３巻：ｐ．１０４１−１０５０）。癌細胞は、ウシ胎児血清１０％（ｖ／ｖ）添加ＲＰＭＩ培地１６４０中、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿した雰囲気で維持した。集密度８０％で細胞をトリプシン処理し、血球計数板を使用して計数し、そして１ｘ１０^６個の細胞を６ｃｍのディッシュに播いた（亜集密的）。播種の総２０時間後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、阻害剤を無血清ＲＰＭＩ培地中、０．１％でＪＺＬ１８４（１μＭ）又は溶媒（ＤＭＳＯ）とインキュベートした。４時間のインキュベーション後、細胞を採取しＡＢＰＰ又はＬＣ−ＭＳによって分析した。
【０１２２】
ＡＢＰＰ−ＭｕｄＰＩＴによる癌細胞プロテオーム由来のセリンヒドロラーゼ活性の同定及び比較定量各々のヒト癌細胞株由来の可溶性及び不溶性のプロテオーム画分を既述の通り作成し（ジェサニーら、２００２年；前掲書）、ＡＢＰＰ−ＭｕｄＰＩＴによって分析した（ジェサニーら、２００５年；前掲書）。ＦＰビオチンンによるプロテオームの標識化反応の標準的な条件は下記の通りであった：プロテオームを最終タンパク質濃度１．０μｇ／μｌに調節し、プロテオーム１０００μｇを５μＭのＦＰビオチンにより室温（ＲＴ）で２時間標識した。インキュベーション後、不溶性プロテオームを４℃で１時間回転して１％トリトンＸにより可溶化した。可溶性及び不溶性プロテオーム画分由来のＦＰ標識タンパク質の増強は、既述の通り行った（キッドら（Ｋｉｄｄ ｅｔ ａｌ．）、「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００１年、第４０巻：ｐ．４００５−１５）。アビジン強化プロテオームを、１）１％ＳＤＳ、２）６Ｍ尿素、３）５０ｍＭトリスｐＨ８．０で８分間２回洗浄し、最終的に２００μｌの８Ｍ尿素５０ｍＭトリスｐＨ８．０に再懸濁した。次に、ビーズ上の消化をするための試料を１０ｍＭのＴＣＥＰによる室温、３０分間での還元によって調製し、当該試料を１２ｍＭのヨードアセトアミドにより暗所下、室温で３０分間アルキル化した。消化は、試料を５０ｍＭトリスｐＨ８．０で２Ｍ尿素に希釈後に、トリプシン（２ｍＭのＣａＣｌ２存在下５．５μｇ／μｌの３μＬ）により３７℃で１２時間行った。最後に、ペプチド試料を５％ギ酸の最終濃度に酸性化した。
【０１２３】
消化したペプチド混合物を二相性（強陽イオン交換／逆相）のキャピラリ―カラムにし、タンデム型質量分析法を組み合わせた二次元液体クロマトグラフィー（２Ｄ−ＬＣ）分離によって分析した。ペプチドは、５段階のＭｕｄＰＩＴ実験で溶出し（０、１０、２５、８０及び１００％の塩濃度段階（ｓａｌｔ ｂｕｍｐｓ）を使用）、データは、ダイナミック排出点灯（６０秒）でデータ依存性獲得モードに設定した、イオントラップ型質量分析計ＬＴＱ（サーモ・サイエンティフィック社製（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で収集した。特に、１のＭＳサーベイ（ｍｓ^１）フルスキャンには、７のｍｓ^２のスキャンが続いた。ｍｓ^２のスペクトルデータは、ロー・エックストラクター（１．９．１版）（ＲＡＷ Ｘｔｒａｃｔｏｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．９．１））を使用して未加工のファイルから抽出した。ｍｓ^２スペクトルデータは、結果として総数２２９３５のユニークな収録項目に帰着した、各集合遺伝子の識別子に関連する３．２６版のヒトＩＰＩデータベース由来の最も長期にわたる収録項目を含む、注文製のデータベースを対照してセクウェスト・アルゴリズム（３版）（ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０））を使用して検索した。加えて、これらの収録項目を置き換え、フォースル・ディスカバリー・レート（ｆａｌｓｅ−ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）の評価のためにデータベースに付加した。ＳＥＱＵＥＳＴ検索は、メチオニン残基（１６Ｄａ）の酸化、システイン残基（アルキル化のため５７Ｄａ）のｓｔａｔｉｃ修飾、非酵素的特異性及び前駆質量に対する±１．５Ｄａ及び生成物イオン質量に対する±０．５Ｄａの質量許容誤差を考慮した。一致するｍｓ^２スペクトルの結果を集合し、ＤＴＡセレクト（２．０．２７版）（ＤＴＡＳｅｌｅｃｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０．２７））を使用してフィルター処理した。ペプチドの最大偽陽性率０．１％を達成するために、二次判別分析を使用した。
【０１２４】
得られた全プロテオミックのデータは、最初にセリンヒドロラーゼに関して、既知のこのファミリーのメンバーに相応する、インタープロ（ＩｎｔｅｒＰｒｏ）ドメイン識別子（ＩＰＲ０００１２０、ＩＰＲ０００３７９、ＩＰＲ００１０３１、ＩＰＲ００１０８７、ＩＰＲ００１４６６、ＩＰＲ００２６４１、ＩＰＲ００２６４２、ＩＰＲ００２９２１、ＩＰＲ００４１７７、ＩＰＲ００５１８１、ＩＰＲ００７７５１、ＩＰＲ００８２６２、ＩＰＲ０１０６６２）の手作業で集められたリストを使用してフィルター処理した。セリンヒドロラーゼの結果のセットを、次に、試験した少なくとも一の癌細胞株について、「無プローブ」対照プロテオームと比較してＦＰローダミン処理プロテオームにおいて、＞１０倍の高いスペクトルカウントを示す酵素に対してフィルター処理した。これらの計算のために、膜及び可溶性プロテオーム由来のスペクトルカウント値を、各癌細胞株由来の各セリンヒドロラーゼについて合併した。この分析は、〜５０のセリンヒドロラーゼ活性のリストに帰着した。以前の研究は、比較定量が、比較中の二のグループの少なくとも一グループにおいて、平均≧１０のスペクトルカウントを示すタンパク質にかなり限定されることを明らかにしている（ジェサニーら（Ｊｅｓｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．）、２００５年；前掲書）。このフィルター処理を使用して（ここで、比較グループは、その非侵襲性カウンターパートと比較した侵襲性癌細胞株と定義した）、発明者らは、比較定量のための〜３５のセリンヒドロラーゼを同定した。これらのセリンヒドロラーゼの中で、ＫＩＡＡ１３６３及びＭＡＧＬが侵襲性関連ヒドロラーゼ用に定義された下記の判定基準に適った：１）その非侵襲性カウンターパートと比較して三の全ての侵襲性癌細胞株における平均スペクトルカウントが＞２倍である、並びに２）侵襲性及び非侵襲性癌細胞株対の間の較差に対するｐ値が＜０．０１である。
【０１２５】
癌細胞プロテオームのＡＢＰＰ及び加水分解活性アッセイＡＢＰＰ−ＭｕｄＰＩＴ又はゲルに基づくＡＢＰＰによる癌細胞プロテオーム由来のセリンヒドロラーゼ活性の同定及び比較定量は、既述の通りそれぞれＦＰビオチン（５μＭ）及びＦＴローダミン（２μＭ）を使用して行った（ジェサニーら（Ｊｅｓｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）」、２００２年、第９９巻：ｐ．１０３３５−１０２４０；及びジェサニーら（Ｊｅｓｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、２００５年、第２巻：ｐ．６９１−６９７）。Ｃ２０：４ＭＡＧ加水分解活性アッセイは、既述の通り行った（ブランクマンら（Ｂｌａｎｋｍａｎ ｅｔ ａ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００７年、第１４巻：ｐ．１３４７−１３５６）。ＡＢＰＰ実験に関しては、細胞可溶化プロテオームを２μＭ ＦＰローダミンにより室温で３０分間処理した（全反応液量５０μｌ）。反応を１容量の標準４ｘＳＤＳ／ＰＡＧＥローディング緩衝液で停止し（還元）、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ（アクリルアミド１０％）によって分離し、日立ＦＭＢｉｏ ＩＩｅフラットベッド蛍光スキャナ（Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢイオＩＩｅ ｆｌａｔｂｅｄ ｆｌｕｏｒｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｃａｎｎｅｒ）（ミライバイオ社製（ＭｉｒａｉＢｉｏ））によりインゲルで可視化した。統合したバンドの強度を標識タンパク質に対し計算し、各酵素活性のレベルを測定するために独立した細胞三試料から平均をとった。ＩＣ５０値は、各阻害剤濃度での３回の試行からの得た用量反応曲線から、シグマプロット１０．０（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １０．０）を使用して決定した。ＭＡＧＬ発現もまた標準法を使用してウェスタンブロッティングによって評価した。
【０１２６】
加水分解活性アッセイのために、擦過により細胞を採取する前に、細胞を生体内原位置で無血清ＲＰＭＩ培地中ＪＺＬ１８４（１μＭ）により４時間処理した。次に、トリス緩衝液中の細胞溶解物（２０μｇ）を脂質（１００μＭ、例えばＭＡＧＬ活性に対してはＣ２０：４ＭＡＧ）と室温で３０分間、２００μｌ容量でインキュベートした。反応を６００μｌの２：１クロロホルム：メタノールにより停止し、内部標準のＣ１５：０ＦＦＡ又はＣ１２：０ＭＡＧＥ１０ｎｍｏｌを添加した。産物は有機層に抽出され、当該有機層を抽出してＬＣ−ＭＳに直接注入した。ＬＣ−ＭＳの設定は、既述の通りとした（ブランクマンら（Ｂｌａｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、２００７年；前掲書）。産物レベルは（例えば、ＭＡＧＬ活性に対するＣ２０：４ＦＦＡ）、内部標準レベルと比較して定量し、一定の内部標準レベルと変化する脂質濃度の間の標準曲線を作成した。酵素反応の直線位相の間で比活性を決定した（例えば、基質２０％未満利用）。
【０１２７】
ヒト原発性卵巣腫瘍被験者は、診断され、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院（Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ‘ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）及びダナファーバー癌センター（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）（ボストン、マサチューセッツ州（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ））で卵巣腫瘍の治療を受けていた。すべて被験者由来の生物学的な検体を収集し、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院の被験者委員会によって承認されたプロトコルに従って保存記録した。病理組織学的診断は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院の婦人科の病理医によって判定された。腫瘍を分類し、産婦人科の国際連盟システム（ＦＩＧＯ）に従って悪性度の類別をした。本研究に関し、１０の良性及び１３の高悪性度の悪性卵巣腫瘍試料をＭＡＧＬ活性及び代謝産物測定のために使用した。良性の症例には、良性嚢腫、卵巣線維腫及び良性漿液性嚢胞腺腫が含まれ、一方悪性の症例は、全て高悪性度の漿液性乳頭状癌であった。新鮮な腫瘍組織をメスで２−５ｍｍ片に切り離し、個々にアルミ箔に包み、液体窒素中で瞬間凍結（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）し、−８０℃の冷凍庫に保存した。ＭＡＧＬ活性及びＦＦＡレベルは上述の通り測定した。
【０１２８】
ヒト癌細胞株におけるＲＮＡ干渉研究ＲＮＡ干渉の研究は、既述の通り行った（チャングら（Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、２００６年）。手短に言えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ構築物をｐＬＰ−レトロＱ（ｐＬＰ−ＲｅｔｒｏＱ）アクセプターシステムにサブクローンし、アンフォパック（ＡｍｐｈｏＰａｃｋ）−２９３細胞株（クロンテック社製（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してレトロウイルスを作成した。ＲＮＡ干渉の研究に利用したヘアピン型オリゴヌクレオチドは；ＭＡＧＬ用には（ｓｈＭＡＧＬ１）、５‘−ＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号３）及び（ｓｈＭＡＧＬ２）、５‘−ＡＧＡＣＴＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＣ−３’（配列番号４）；ｓｈ対照用には（ｓｈＤＰＰＩＶ）５‘−ＧＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号５）であった。ｓｈ対照構築物は、侵襲性と非侵襲性癌細胞（ＤＰＰＩＶ）の間で一貫して変化しない他と別なセリンヒドロラーゼを標的とするよう設計した。内在性タンパク質を標的とするｓｈ対照構築物（非機能的なスクランブルド構築物よりは）を使用することが、ＲＮＡ干渉機構の一般的な活性による非特異的な効果を制御する。培養１−６日の上清を含むウイルスを収集し、超遠心分離で濃縮し、１０μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下に４８時間安定して細胞を感染するために使用した。感染に続いて、ピューロマイシン（Ｃ８１６１、ＭＵＭ２Ｃ、ＳＫＯＶ３、及び２３１ＭＦＰに対しては１μｇ／ｍｌ、ＯＶＣＡＲ３に対しては０．３μｇ／ｍｌ）を含む培地で３日間選抜を行ったが、それは、レトロウイルスベクターがこの選択マーカーを含んでいたからである。感染した細胞を増殖し、ＡＢＰＰによって酵素活性の損失及びＣ２０：４ＭＡＧ加水分解活性に関し試験を行った。
【０１２９】
ヒト癌細胞株における過剰発現の研究安定したＭＡＧＬ過剰発現は、ＲＮＡ干渉研究に関し上述した通りＡｍｐｈｏＰａｃｋ−２９３細胞株を使用してレトロウイルスを作成し、ＭＡＧＬ遺伝子をｐＭＳＣＶｐｕｒｏベクター（ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ ｖｅｃｔｏｒ）（クロンテック社製）にサブクローニングすることによって達成した。ヒトＭＡＧＬ構築物は、プライマー、５’−ＧＣＴＣＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＣＣ−３’（配列番号６）及び５’−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’（配列番号７）によるＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、XhoＩ及びＥｃｏＲＩの制限サイトを使用してｐＭＳＣＶＣｐｕｒｏ（クロンテック社製）にサブクローニングした。
【０１３０】
細胞移動、細胞生存、及び浸潤の研究移動アッセイは、コラーゲン１０μｇ／ｍｌで被覆した孔径８μｍの膜を有するトランスウェル・チャンバー（コーニング社製）（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ））中で３７℃で４時間行った。移動アッセイ開始前、全２４時間に、癌細胞株を６ｃｍのディッシュ当たり１ｘ１０^６細胞の濃度で播いた。移動アッセイ開始時に、細胞をＰＢＳで２回洗浄して採取し、次に無血清培地で４時間、血清飢餓とした。この４時間の間に、阻害剤、脂質又は溶媒（０．１％ＤＭＳＯ）を細胞とプレインキュベートした。血清飢餓細胞をトリプシン処理し、１４００ｇで３分間回転し、再懸濁して計数した。（阻害剤、脂質又は溶媒を含有する）無血清培地２００μｌ中の５０，０００個の細胞をトランスウェルの上部室（ｃｈａｍｂｅｒ）に播種した。阻害剤、脂質又は溶媒を下部室にも添加し、細胞を５時間（Ｃ８１６１及び２３１ＭＦＰ細胞）又は２０時間（ＳＫＯＶ３、ＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３細胞）移動させた。次にフィルターを固定し、ディフ・クイック（デイド・ベーリング社製）（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ））で染色した。室を通って移動しなかった細胞を綿球で取り除いた。移動した細胞を倍率４００ｘで計数し、各移動室から４視野を独立して計数した。１移動室についての４視野における細胞の平均をｎ＝１と表す。
【０１３１】
細胞生存アッセイは、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（ロッシュ社製）を使用して既述の通り行った（ロカら（Ｒｏｃａ ｅｔ ａｌ．）、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」、２００８年、第２８３巻、ｐ．２５０５７−７３；及びシッディキュイら（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅｔ ａｌ．）、「ブレスト・カンサー・リサーチ（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ）」、２００５年、第７巻、ｐ．Ｒ６４５−６５４）。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理によって採取し、ＰＢＳで２回洗浄し、１４００ｇで遠心分離し、無血清培地に再懸濁した。ＷＳＴ−１（２０μｌ）の添加前、０、２４又は４８時間に、２０，０００細胞を９６ウェルプレートの無血清培地２００μｌ中で３７℃／５％ＣＯ２で４時間放置した。分光光度計を使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。浸潤アッセイは、ＢＤマトリゲルインベージョンチャンバー（ＢＤ Ｍｔｒｉｇｅｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒｓ）を使用して製造者のプロトコルに従って行った。
【０１３２】
腫瘍異種移植研究ヒト癌異種移植片は、癌細胞株をＣ．Ｂ１７ＳＣＩＤマウス（タコニック・ファームス社製（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ））の側腹部に異所的に移植することによって確立した。手短に言えば、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、そして血清を含有する培地で採取した。次に、採取した細胞を無血清培地で２回洗浄し、濃度２．０ｘ１０^４細胞／μｌで再懸濁し、１００μｌを注入した。腫瘍の増殖は、３日ごとにカリパスで測定した。ＨＦＤ研究のために、マウスを癌細胞注入の２週間前に６０ｋｃａｌ％脂肪食（調査食）の状況に置いた。３−６日ごとにマウスの体重を量った。慢性ＪＺＬ１８４処理研究のために、ポリエチレングリコール３００（４μＬ／ｇ）の経口胃内投与によって、マウスをＪＺＬ１８４又は溶媒で日に一回（毎日ほぼ同時間）処理した。処理は、癌細胞の異所的注入後直ちに開始した。
【０１３３】
癌細胞中の脂質測定脂質測定は、既述のプロトコルと同様に行った（チャングら（Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、２００６年；前掲書）。癌細胞を、細胞プロファイルへの血清由来脂質の寄与を最小にするために、無血清培地で４時間生育した。細胞を（１ｘ１０^６細胞／６ｃｍディッシュ、集密度８０％）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１、４００ｇで遠心分離によって分離し、クロロホルム：メタノール：トリス緩衝液の２：１：１混合液４ｍｌ中Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで均質化した。試料は、次の合成標準品の存在下に均質化した：Ｃ１２：０ＭＡＧＥ（１０ｎｍｏｌ）、Ｃ１５：０ＦＦＡ（１０ｎｍｏｌ）。有機層及び水層は、２０００ｇ、５分間の遠心分離によって分別し、有機層を収集した。水層を５％ギ酸の添加によって酸性化し（ＬＰＡ等の代謝産物に対し）、続いてクロロホルム２ｍｌを添加した。混合液をボルテックスし、有機層を併せてＮ_２下で完全に乾燥し、クロロホルム１００μｌに溶解し、その３０μｌをＬＣ−ＭＳによって分析した。
【０１３４】
ＬＣ−ＭＳ分析は、アジレント１１００ＬＣ−ＭＳＤ ＳＬ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣ−ＭＳＤ ＳＬ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して行った。ＬＣ分離は、プレカラム（Ｃ１８、３．５μｍ、２ｍｍｘ２０ｍｍ）と共にフェノモネックス社製（Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ）のジェミニ（Ｇｅｍｉｎｉ）逆相Ｃ１８カラム（直径５μｍの粒子、５０ｍｍｘ４．６ｍｍ）によって行った。移動相Ａは、９５：５の比の水：メタノールから構成し、移動相Ｂは、６０：３５：５の比の２−プロパノール、メタノール、及び水から構成した。０．１％ギ酸及び０．１％水酸化アンモニウム等の溶媒改良剤を、それぞれポジティブ及びネガティブイオン化モードにおいて、ＬＣ分離能を改善するためと同様にイオン形成を補助するために、使用した。各操作の流速は、クロロホルム注入に付随する背圧を軽減するために、５分間、０．１ｍｌ／分で開始した。濃度勾配は、０％Ｂで開始し、流速０．４ｍｌ／分で４５分間かけて直線的に１００％Ｂに増加し、続いて１７分間は流速０．５ｍｌ／分の１００％Ｂの均一濃度勾配とし、次に流速０．５ｍｌ／分で８分間かけて０％Ｂに平衡化した。ＭＳ分析は、エレクトロンスプレーイオン化（ＥＳＩ）源によって行った。キャピラリ電圧は３．０ｋＶに設定し、フラグメンター電圧は１００Ｖに設定した。乾燥ガス温度は３５０℃、乾燥ガス流束は１０Ｌ／分、及びネブライザ圧力は３５ｐｓｉであった。
【０１３５】
リピドーム解析は、標的及び非標的モードの両方でＣ−ＭＳ分析によって行った。標準的な脂質クラスは、選択イオン検出（ＳＩＭ）を使用して標的化によって定量し（非標的化分析によって定量した高存在量の代謝産物を除く）、代謝産物の同一性は、代謝産物のそれぞれの標準品との共溶出、及びアジレント６５２０精密質量ＱＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ ６５２０ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ ＱＴＯＦ−ＭＡＳ−ＭＳ）による精密質量分析により測定される１０ｐｐｍ以内の質量精度によって確認した。これらの脂質は、ピーク下の面積を測定することによって定量し、内部標準に対し規準化した（ポジティブモードにおけるＣ１２：０ＭＡＧＥ又はネガティブモードにおけるＣ１５：０ＦＦＡ）。各々の脂質種のｐｍｏｌｅｓ／１ｘ１０^６細胞における絶対定量は、１０ｎｍｏｌのＣ１２：０ＭＡＧＥ及び／又はＣ１５：０ＦＦＡと対照して分析した各クラスのそれぞれの脂質の標準曲線の作成に基づいたが、そこでは脂質及び標準品の相対抽出効率も考慮に入れた。ＭＡＧは、内部標準Ｃ１５：０ＭＡＧ（Ｃ１２：０ＭＡＧＥの代わりに）に基づいても定量したが、同一の結果が得られた。ＭＳインターフェースにおいてＭＡＧの脂肪酸アシルアニオン種への５％未満の分解が存在した。発明者らは、非天然のＣ１５：０ＭＡＧ種（これもまた、内在性ＭＡＧ種と同様の分解パターンを有する）と対照してＭＡＧレベルを定量したので、インターフェースにおける極小のＭＡＧ分解レベルは、ＭＡＧの絶対定量を妨げなかった。ＭＡＧ及びＦＦＡ定量のための動的線形範囲は、それぞれ０．６−１０，０００ｐｍｏｌｅｓ及び１−１０，０００ｐｍｏｌｅｓであった。非標的化データを質量範囲２００−１２００Ｄａを使用してアジレント１１００ＬＣ−ＭＳＤ ＳＬ装置に収集し、計算的な分析のためにコモン・データ・フォーマット（ＣＤＦ）として転送した。試料対の間の違った発現代謝産物は、多数のＬＣ−ＭＳトレースからの質量ピークの相対シグナル強度を一列に並べ定量する、ＸＣＭＳ分析物プロファイリングソフトウェアを使用することによって同定した。重要な阻害剤、ｓｈＭＡＧＬ又はＭＡＧＬ−ＯＥ感受性のピーク変化は、内部標準に対し規準化したピーク下面積を使用することにより手作業の定量によって確認した。
【０１３６】
本明細書で記載された実施例及び実施態様は、例示的な目的のためだけにあること、並びに当該実施例等に照らしての種々の修正又は変更は、当業者に提案されており、そして本出願及び別記の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれることを理解されたい。本明細書に記載された方法及び材料と類似の又は同等の如何なる方法及び材料も本発明の実施又は試験に使用することができるのであるが、好ましい方法及び材料が記載されている。
【０１３７】
本明細書で引用した、全ての刊行物、ジェンバンク配列、ＡＴＣＣ寄託、特許及び特許出願は、これによってそっくりそのまま及び全ての目的のために、各々が個々にそのように表示されているかのような言及によって明確に援用される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達を刺激するための方法。
【請求項２】
化合物が脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）にＭＡＧＬの阻害に対して選択的である請求項１記載の方法。
【請求項３】
化合物がＦＡＡＨにＭＡＧＬの阻害に対して少なくとも１００倍の選択性を有する請求項２記載の方法。
【請求項４】
がである請求項１記載の方法。
【請求項５】
化合物が下記に示す式Ｉの構造を有する請求項１記載の方法：
【化１】

式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ_１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々は、下記の構造の一つを有する。
【化２】

【請求項６】
化合物が脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）及びα／βヒドロラーゼ６（ＡＢＨＤ６）の両方にＭＡＧＬの阻害に対して選択的である請求項１記載の方法。
【請求項７】
化合物が下記に示す式Ｉの構造を有する請求項６記載の方法：
【化３】

式中、ＸはＣＨ、Ｒ_１はＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々は、下記の構造の一つを有する。
【化４】

【請求項８】
がである請求項１記載の方法。
【請求項９】
が疼痛、炎症、抑鬱又は不安を患っている請求項１記載の方法。
【請求項１０】
内在性カンナビノイドシグナル伝達するの症状を治療又は回復する方法。
【請求項１１】
症状が、疼痛、抑鬱、、炎症性症候群、心血管障害、代謝障害、卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症又は緑内障である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
症状が２−ＡＧシグナル伝達により媒介される又は関連する請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
化合物が下記に示す式Ｉの構造を有する請求項１０記載の方法：
【化５】

式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ_１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々は、下記の構造の一つを有する。
【化６】

【請求項１４】
式中、ＸがＣＨ、Ｒ_１がＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々が、下記に示す構造を有する請求項１３記載の方法。
【化７】

【請求項１５】
化合物がＦＡＡＨにＭＡＧＬの阻害に対して選択的である請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
化合物がＦＡＡＨ及びＡＢＨＤ６の両方にＭＡＧＬの阻害に対して選択的である請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
がである請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
下記に示す式Ｉの化合物：
【化８】

式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ_１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々は、下記の構造の一つを有する。
【化９】

【請求項１９】
式中、ＸがＣＨ、Ｒ_１がＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々が、下記に示す構造を有する請求項１８記載の方法。
【化１０】

【請求項２０】
改良された特性を有するモノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）の阻害剤同定方法：
（ａ）既知のＭＡＧＬ阻害剤の一以上の構造アナログ合成；
（ｂ）ＭＡＧＬ阻害剤と比較して改良された生物学的又は薬学的特性を有するアナログを同定するためのアナログに関する機能アッセイ実施；それに改良された特性を有するＭＡＧＬ阻害剤同定；ここで既知のＭＡＧＬ阻害剤は、下記に示す式Ｉの化合物である
【化１１】

式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ_１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々は、下記の構造の一つを有する。
【化１２】

【請求項２１】
式中、ＸがＣＨ、Ｒ_１がＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々が、下記に示す構造を有する請求項２０記載の方法。
【化１３】

【請求項２２】
改良された生物学的又は薬学的特性がＭＡＧＬに対する亢進した阻害活性である請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
改良された生物学的又は薬学的特性が他の脳セリンヒドロラーゼにＭＡＧＬに対する増加した選択性である請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
侵襲性の腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法。
【請求項２５】
腫瘍細胞が癌を有する又は癌になる危険のあるに存在する請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍細胞が、乳腺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、黒色腫細胞、肺腫瘍細胞又は脳腫瘍細胞である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
化合物が脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）にＭＡＧＬの阻害に対して選択的である請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
化合物が下記に示す式Ｉの構造を有する請求項２７記載の方法：
【化１４】

式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ_１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々は、下記の構造の一つを有する。
【化１５】

【請求項２９】
化合物がＭＡＧＬに特異的な阻害ポリヌクレオチドである請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
阻害ヌクレオチドが低分子緩衝ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸及び相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
腫瘍の症候を治療又は回復するための方法。
【請求項３２】
腫瘍が、乳腺腫瘍、卵巣腫瘍、黒色腫、肺腫瘍又は脳腫瘍である請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
化合物が脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）にＭＡＧＬの阻害に対して選択的である請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
化合物が下記に示す式Ｉの構造を有する請求項３３記載の方法：
【化１６】

式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ_１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ_２及びＲ_３の各々は、下記の構造の一つを有する。
【化１７】

【請求項３５】
化合物がＭＡＧＬに特異的な阻害ポリヌクレオチドである請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
阻害ヌクレオチドが低分子緩衝ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸及び相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である請求項３５記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【公表番号】特表２０１２−５０８７３７（Ｐ２０１２−５０８７３７Ａ）
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３６３１６（Ｐ２０１１−５３６３１６）
【出願日】平成２１年１１月１０日（２００９．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００６０４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５６３０９
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（３９９０３８６２０）ザ　スクリプス　リサーチ　インスティチュート (51)
【Ｆターム（参考）】