モノクローナル抗体、それを用いる検査装置
【課題】迅速かつ簡便にＩＭＰ型ＭＢＬを検出するためのモノクローナル抗体を提供する。
【解決手段】ＩＭＰのアミノ酸配列ＡにおいてＮ末端側１０３番目から１０８番目の６残基がＧＩＥＷＬＮ及びＧＩＧＷＬＮであるＩＭＰの両方に対して特異的に反応するモノクローナル抗体Ｄ。あるいは、ＩＭＰのアミノ酸配列ＡにおいてＮ末端側１１３番目から１２１番目の９残基がＰＴＹＡＳＥＬＴＮ、ＳＴＹＡＳＥＬＴＮ及びＰＴＹＡＳＶＬＴＮであるＩＭＰのいずれに対しても特異的に反応するモノクローナル抗体Ｄ。
【解決手段】ＩＭＰのアミノ酸配列ＡにおいてＮ末端側１０３番目から１０８番目の６残基がＧＩＥＷＬＮ及びＧＩＧＷＬＮであるＩＭＰの両方に対して特異的に反応するモノクローナル抗体Ｄ。あるいは、ＩＭＰのアミノ酸配列ＡにおいてＮ末端側１１３番目から１２１番目の９残基がＰＴＹＡＳＥＬＴＮ、ＳＴＹＡＳＥＬＴＮ及びＰＴＹＡＳＶＬＴＮであるＩＭＰのいずれに対しても特異的に反応するモノクローナル抗体Ｄ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体、それを用いる検査装置に係り、特に、β−ラクタム系薬剤に対する細菌の耐性因子であるＩＭＰ型メタロ−β−ラクタマーゼの検出に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病原性微生物により惹き起される感染症の問題は、人類にとってたいへん重大であり、時として重篤な病状を伴う大流行を発生させ、多数の感染患者、更には死者を出してきた。そして病原性微生物の増殖を抑制できる抗生物質ペニシリンの発見により、細菌性感染症の治療は急速な進展を遂げ、それ以降も様々な抗生物質の開発が行われてきた。しかしながら、これらの抗生物質を使用していく中で、抗生物質を分解または無毒化する能力を獲得した細菌（耐性菌）が現れ、新たな問題となっている。
【０００３】
医療現場において、特に高齢者や乳幼児、長期の入院患者などで免疫力が低下している場合や怪我や手術後の治療患者、各種カテーテル使用患者などで病原菌と直接接触する可能性が考えられる場合に、耐性菌による感染拡大、端的には院内感染が、大きな社会問題となっている。
【０００４】
医療現場では感染対策のため、耐性菌のモニタリングを行い、万が一耐性菌を発見した場合には、適正な薬剤の選択、治療とともに、感染の蔓延を防止するための患者の隔離、消毒の徹底などが求められている。また、医療従事者を介しての感染拡大も考えられるため、徹底した感染経路の遮断や消毒、環境対策などが必要となる。この様な理由から、耐性菌の早期検出は、医療現場において抗生物質が効かない危険な耐性菌の感染蔓延を防止する目的でたいへん重要である。
【０００５】
細菌の薬剤耐性には、いくつかの系統があることが分かっており、菌種により抗菌剤の有効性も当然異なっている。その抗菌剤の中でも人体への毒性が低く、広範囲の細菌種に対して有効な抗菌剤であるβ−ラクタム系薬剤が開発され広く使用されてきた。
【０００６】
１９９０年代になると完全合成β−ラクタムのカルバペネム系薬剤が開発され、殆どの種類の細菌に効果を示すことで大いに期待された。β−ラクタム系薬剤は、分子構造中にβ−ラクタム環を有する抗菌薬の総称である。このβ−ラクタム系薬剤は、広域スペクトラムを示し、ペプチドグリカンを主成分とする細菌の細胞壁の合成を阻害することで、細菌に細胞分裂をできなくさせる効果や、細胞壁が浸透圧に耐えられず細菌を破裂して死菌させる効果がある。
【０００７】
しかし、細菌の中でも特にグラム陰性菌において、このβ−ラクタム系薬剤の分解酵素であるβ−ラクタマーゼを産生し、β−ラクタム系薬剤を加水分解し失活させることで、強い耐性を持つものが出現した。
【０００８】
この中でも、活性中心に亜鉛をもつメタロ−β−ラクタマーゼ（ＭＢＬ）は、ほとんど全てのβ−ラクタム系薬剤に耐性を示すため、最後の砦とされているカルバペネム系薬剤を含め薬剤投与の選択肢がなくなってしまう、最も危険なβ−ラクタマーゼ耐性因子と考えられている。
【０００９】
また、ＭＢＬ産生菌の耐性因子は、その伝播しやすさについても問題視されている。菌自体の遺伝子ＤＮＡとは別に存在する独立したＤＮＡ分子であるプラスミドや可動性エレメントであるインテグロン上に耐性遺伝子を持つため、プラスミドを有する細菌同士の接触のみでこの因子の伝搬が容易に行われるのである。
【００１０】
これは他の耐性菌であるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）などが、多量の薬剤投与によって突然変異を起こし菌自体のＤＮＡにメチシリン耐性を獲得して細胞分裂により増殖するのとは異なり、菌種をも超えて伝達されるため耐性菌が広範囲に劇的に増殖しやすいことを意味する。
【００１１】
ＭＢＬは、Bacteroides fragilis、Serratia marcescens、Klebsiella pneumoniae、Escherichia coli等複数のグラム陰性菌で確認されており、特に緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）においては、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）における耐性因子の一つとしても注目され社会的にも大きな問題となっている。
【００１２】
緑膿菌は常在菌であり、それ自体の病原性は低く健常者に対して感染症を引き起こすことはまれである。しかしながら、免疫力が低下している人などに日和見感染して感染症を引き起こす。特に、緑膿菌敗血症のような重篤な疾患を引き起こした場合の致死率は８０％以上にもなる。
【００１３】
これらの理由から、薬剤耐性菌、特に多剤耐性緑膿菌に代表されるＭＢＬ産生グラム陰性菌は、最も危険で重要な感染病原菌として認識されている。臨床の現場でこれらの産生株が広く蔓延をすることで、将来的に世界規模の深刻な問題を引き起こす可能性も指摘されており、ＭＢＬ産生のグラム陰性菌の早期発見と伝播を止める対策は重要である。
【００１４】
ＭＢＬとしては、ＩＭＰ型、ＶＩＭ型、ＳＰＭ型が世界的によく知られている。その中でもＩＭＰ型が代表的なＭＢＬであり、さらに、近年問題視されている多剤耐性緑膿菌も、主としてＩＭＰ型のＭＢＬを産生していることが分かっている。そのため、ＩＭＰ型のＭＢＬを迅速に検出し、隔離や適切な治療を施すことで、これらの耐性菌を封じ込めることが可能となる。
【００１５】
ＩＭＰ型のＭＢＬには亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）が存在し、現在まででＩＭＰ−１からＩＭＰ−２９までの２９種の亜型が知られており、その中でＩＭＰ−１７，ＩＭＰ−２３，ＩＭＰ−２７，ＩＭＰ−２８，ＩＭＰ−２９を除くＩＭＰ−１，ＩＭＰ−２，ＩＭＰ−３，ＩＭＰ−４，ＩＭＰ−５，ＩＭＰ−６，ＩＭＰ−７，ＩＭＰ−８，ＩＭＰ−９，ＩＭＰ−１０，ＩＭＰ−１１，ＩＭＰ−１２，ＩＭＰ−１３，ＩＭＰ−１４，ＩＭＰ−１５，ＩＭＰ−１６，ＩＭＰ−１８，ＩＭＰ−１９，ＩＭＰ−２０，ＩＭＰ−２１，ＩＭＰ−２２，ＩＭＰ−２４，ＩＭＰ−２５，およびＩＭＰ−２６のアミノ酸配列が分かっている。
【００１６】
これらＩＭＰ型のＭＢＬを簡便・容易に検出することは、これまでに不可能であった。
【００１７】
現在、ＭＢＬを検出する技術としては、２価イオンキレート剤のジピコリン酸を使用したディスク拡散法、特許文献１（特開２００１−２９９３８８号公報）記載のＭＢＬ阻害剤のチオグリコール酸（メルカプト酢酸）を使用した方法がある。
【００１８】
ＭＢＬは活性中心に亜鉛を持っているため、亜鉛とキレートすることで活性を不活化することができ、ジピコリン酸、チオグリコール酸や２−メルカプトプロピオン酸もＭＢＬの阻害剤として用いることができる。この方法を用いた製品としてはドライプレート'栄研'ＤＰＤ１（栄研化学株式会社、商標）やメタロ−β−ラクタマーゼＳＭＡ'栄研'（栄研化学株式会社、商標）がある。
【００１９】
具体的には、検体に分離培養した菌のコロニーを用い、検査する培地上の一方に抗菌薬のみをもう一方には抗菌薬とＭＢＬ阻害剤を近接して置いた状態で、培地に菌体を播いて培養する。培地上に設置した抗菌剤や阻害剤の周辺に、発育の阻害を受けて作る阻止帯の有無や大きさを比較することで、ＭＢＬ産生株かどうかを検出することができる。
【００２０】
しかしながら、検査をするためには１６時間以上培養しなければならず長時間を要してしまう。また阻止帯の大きさによっては判定不能となること、菌体数を濁度法などで正確に定量する必要があることから、簡便・迅速な測定方法とは言い切れない。また、ハイリスクであるプラスミド伝搬性のＩＭＰ型のＭＢＬ産生株のみを検出することはできない。
【００２１】
また、別の方法としては、特許文献２（ＷＯ ０２／２４７０７号公報）記載のＭＢＬに分解され発色するセファロスポリン化合物の基質とＭＢＬ阻害剤を併用する試薬がある。この方法ではＭＢＬおよび基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）によって分解される発色基質をテストストリップに塗布してあり、そこに分離培養コロニーから採取した菌体をこすりつけ、菌の産生するＭＢＬもしくはＥＳＢＬにより発色基質が分解されることでテストストリップが変色して判定できる仕組みである。
【００２２】
さらにＥＳＢＬかＭＢＬかを特定するには、発色基質のみのものと、発色基質と共にＭＢＬ阻害剤を塗ったものとを用意し、同一検体で同時に測定して結果を比較する必要がある。この方法を用いた製品としては、シカベータテストＩ／ＭＢＬ（関東化学株式会社、商標）という検出試薬が市販されている。
【００２３】
ここでＭＢＬ過剰産生菌の場合は、阻害剤の阻害能を超えてしまうことで基質が変色し、判定を誤る可能性もある。検査に使用する菌体を過剰にテストストリップに塗布すると偽陽性、少量であると偽陰性が生じる可能性もあり、適量を塗布するのに技量が必要となる。
【００２４】
さらに、２〜８℃で保存する必要があり貯法にも注意を要する。従ってこの方法は１５分と短時間での測定が可能ではあるが、簡便性には欠けているといわざるを得ない。また、この方法でも、ハイリスクであるプラスミド伝搬性のＩＭＰ型のＭＢＬ産生株のみを検出することはできない。
【００２５】
更に、別の方法としては、プライマーを使って特定のＭＢＬ遺伝子を検出するＰＣＲ法や特許文献３（特開２００７−１９５４２１号公報）記載のＬＡＭＰ法などがある。
【００２６】
遺伝子検査であるため検出感度が高く、各種のプライマーを用意することで遺伝子型まで特定できるが、全ての亜型を検出するプライマーはないため、必要な遺伝子型のプライマーをそれぞれに用意する必要がある。さらに高価な機械や、高度な手技、抽出作業といった手間が必要となり、測定可能な施設や人が限られてしまう問題がある。
【００２７】
検体は、一度分離培養したものを用いるが、従来法ではＭＢＬ検出のためには、さらに検査時にもう一度培養する必要があるため、より多くの時間を要してしまい迅速に結果がわからないことや、無菌操作の手技、培養状況の判定などが必要であり誰でも容易にはできないことがあった。また、ＩＭＰ型のＭＢＬを捕捉しようとするとＰＣＲのような遺伝子検査でしか実現可能でなく、遺伝子検査においては、変異型毎にプライマーを用意する必要があった。
【特許文献１】特開２００１−２９９３８８号公報
【特許文献２】ＷＯ ０２／２４７０７号公報
【特許文献３】特開２００７−１９５４２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
そこで本発明は、迅速かつ簡便にＩＭＰ型ＭＢＬを検出するためのモノクローナル抗体及びその関連技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
第１の発明に係るモノクローナル抗体は、ＩＭＰ−１及びその亜型に対して特異的に反応する。
【００３０】
第２の発明に係るモノクローナル抗体は、第１の発明に加え、ＩＭＰのアミノ酸配列においてＮ末端側１０３番目から１０８番目の６残基に対し特異的に反応する。
【００３１】
第３の発明に係るモノクローナル抗体は、第２の発明に加え、６残基がＧＩＥＷＬＮ及びＧＩＧＷＬＮであるＩＭＰの両方に対して特異的に反応する。
【００３２】
第４の発明に係るモノクローナル抗体は、第１の発明に加え、ＩＭＰのアミノ酸配列においてＮ末端側１１３番目から１２１番目の９残基に対し特異的に反応する。
【００３３】
第５の発明に係るモノクローナル抗体は、第４の発明に加え、９残基がＰＴＹＡＳＥＬＴＮ、ＳＴＹＡＳＥＬＴＮ及びＰＴＹＡＳＶＬＴＮであるＩＭＰのいずれに対しても特異的に反応する。
【００３４】
第９の発明に係る検査装置は、ストリップと、ストリップの上流側に配置される滴下部と、ストリップの下流側に配置される吸水ろ紙と、滴下部より吸水ろ紙に至る流れ方向下流側に配置され第１の抗体を標識したものを流動可能に保持する塗布部と、塗布部と吸水ろ紙との間に配置され第２の抗体が固相される検査部とを備える検査装置であって、第１の抗体と第２の抗体の一方は、第１の発明に係るモノクローナル抗体であり、第１の抗体と第２の抗体の他方は、第２の発明又は第４の発明に係るモノクローナル抗体である。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、ＩＭＰ型ＭＢＬを特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
（開発の経緯）
まず本発明者らが本願発明の完成に達するまでの経緯を述べる。本発明者らは、薬剤耐性細菌が持っているβ−ラクタム系薬剤に対する耐性因子ＩＭＰを免疫学的に簡便に測定しうる装置を開発するために、その代表的な酵素タンパク質であるＩＭＰ−１を用いてモノクローナル抗体の作製を行った。
【００３７】
モノクローナル抗体の作製は、免疫源にＩＭＰ−１発現タンパク質を使用して行った。すなわち、ＩＭＰ−１蛋白質発現プラスミドｐＥＴ２８−ｂｌａＩＭＰで形質転換した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含むＬＢ培地中、３７℃で培養した。
【００３８】
６００ｎｍでの吸光度が０．８を示した対数増殖期にＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるように加え、組換えＩＭＰ−１タンパク質の発現を誘導した。誘導後、２時間培養し菌体を回集した。これを６Ｍグアニジン塩酸塩、０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム、１０ｍＭトリス、５ｍＭイミダゾール、（ｐＨ８．０）に溶解して、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムに発現ＩＭＰ−１タンパク質を結合させた。８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム、１０ｍＭトリス、１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）で洗浄した後、更にイミダゾールを最終濃度２５０ｍＭになるように加えて組換えＩＭＰ−１をカラムから溶出した。以下に、ＩＭＰ−１発現タンパク質の２４６個のアミノ酸配列を示す。
【００３９】
MSKLSVFFIFLFCSIATAAESLPDLKIEKLDEGVYVHTSFEEVNGWGVVPKHGLVVLVNAEAYLIDTPFTAKDTEKLVTWFVERGYKIKGSISSHFHSDSTGGIEWLNSRSIPTYASELTNELLKKDGKVQATNSFSGVNYWLVKNKIEVFYPGPGHTPDNVVVWLPERKILFGGCFIKPYGLGNLGDANIEAWPKSAKLLKSKYGKAKLVVPSHSEVGDASLLKLTLEQAVKGLNESKKPSKPSN
【００４０】
免疫法は、文献；生化学［６９：１２８−１３１（１９９７）．佐渡義一，香川恵：ラットリンパ節を用いる，効率的で，しかも，抗原量，労力，時間を節約できるモノクローナル抗体作製法］の方法に従い実施した。
【００４１】
１００μｇの免疫源を含む溶液に等量のフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製）を加え完全に混合した後、ＷＫＹラットのフットパッドに投与した。その２週間後に同量の抗原をフロインド不完全アジュバントと混合し、ラット尾根部に投与し、さらに２週間後に同様の追加免疫を実施した。最終免疫後、３〜４日でＰＥＧを用いてラット腸骨リンパ節細胞とミエローマ細胞（ＳＰ２／０）とを融合した。培養液にはＨＡＴ選択培地を使用し、約１週間後に培養上清を採取しスクリーニングに供した。
【００４２】
モノクローナル抗体のスクリーニングには、ＩＭＰ産生緑膿菌のＮＣＧＭ２．Ｓ１株の溶菌物とＩＭＰ−１発現タンパク質を抗原とし、１次抗体に各抗ＩＭＰ−１ラットモノクローナル抗体の培養上清を使用したウエスタンブロッティング法を使用した。
【００４３】
その結果、緑膿菌の溶菌物とＩＭＰ−１発現タンパク質に強い反応性を示す２種のクローン（クローン４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６とクローン４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６）を得た。
【００４４】
これら２種のモノクローナル抗体が認識する反応部位を分析するため、ＩＭＰ−１のアミノ酸配列中の各種断片化ペプチドを合成して、全長ＩＭＰ−１を固相化したマイクロプレートと各モノクローナル抗体の免疫反応における競合ＥＬＩＳＡ法で測定を行った結果、４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６はＮ末端から１０３−１０８番目のＧＩＥＷＬＮを含むアミノ酸配列に、４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６はＮ末端から１１３−１２１番目のＰＴＹＡＳＥＬＴＮを含むアミノ酸配列にエピトープがあることが確認された。
【００４５】
ＩＭＰ−１の亜型は２９種報告されているが、そのうちアミノ酸配列が分かっているものはＩＭＰ−１，ＩＭＰ−２，ＩＭＰ−３，ＩＭＰ−４，ＩＭＰ−５，ＩＭＰ−６，ＩＭＰ−７，ＩＭＰ−８，ＩＭＰ−９，ＩＭＰ−１０，ＩＭＰ−１１，ＩＭＰ−１２，ＩＭＰ−１３，ＩＭＰ−１４，ＩＭＰ−１５，ＩＭＰ−１６，ＩＭＰ−１８，ＩＭＰ−１９，ＩＭＰ−２０，ＩＭＰ−２１，ＩＭＰ−２２，ＩＭＰ−２４，ＩＭＰ−２５ならびにＩＭＰ−２６の２４種類である。
【００４６】
これらの亜型について本発明の２つのモノクローナル抗体のエピトープを含むＮ末端から１０１〜１２５番目の配列のアミノ酸配列について詳細に調べたところ、各変異株についてのアミノ酸配列が異なる部分が確認された。これを次表に示す。
【００４７】
【表１】
これらの各亜型について本発明のモノクローナル抗体が反応するかどうかを確認するために、免疫源の組み換え体ＩＭＰ−１の作製法と同様の方法を用いて変異に対応する各アミノ酸を置換した組み換え亜型Ｔｙｐｅ２〜８を次表に従って作製した。
【００４８】
【表２】
【００４９】
固相化メンブレンにＩＭＰ−１亜型組み換えタンパク質を、金コロイド標識に４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６または４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６の各モノクローナル抗体を用いたイムノクロマト装置にて、各組み換え体タンパク質Ｔｙｐｅ１〜８を添加し反応に阻害がかかるかどうかを調べた。
【００５０】
その結果、４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６、４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６ともに全ての組み換え体タンパク質にて反応に阻害がかかり、本発明のモノクローナル抗体はいずれもこれらの亜型について反応することが確認された。
【００５１】
従って本発明のモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６はＮ末端から１０３−１０８番目のＧＩＥＷＬＮを含むアミノ酸配列のみならず１０５番目のアミノ酸Ｅ（グルタミン酸）をＧ（グリシン）に置換したＧＩＧＷＬＮにも反応性を有することが分かった。
【００５２】
一方、４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６はＮ末端から１１３−１２１番目のＰＴＹＡＳＥＬＴＮを含むアミノ酸配列のみならず、１１３番目のＰ（プロリン）をＳ（セリン）に置換したＳＴＹＡＳＥＬＴＮ、１１８番目のＥ（グルタミン酸）をＶ（バリン）に置換したＰＴＹＡＳＶＬＴＮにも反応性を有することが分かった。
【００５３】
この様に本発明のモノクローナル抗体は、免疫源であるＩＭＰ−１発現タンパク質に反応するのみならず、亜型のＩＭＰも広く認識することが出来ることが確認された。
【００５４】
本モノクローナル抗体がＩＭＰのいずれの亜型にも反応性を有することは、ＩＭＰを広くかつ特異的に検出するために非常に有用である。このようにＩＭＰを広く、特異的に検出するためのアミノ酸配列の条件としてＩＭＰの立体構造において表面にあるアミノ酸配列であり、かつ、どの亜型にもある程度の共通したアミノ酸配列を有しているという条件を満たしていることが必要と考えられる。
【００５５】
本発明のモノクローナル抗体である４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６の認識部位は１０３−１０８であり、４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６の認識部位は１１３−１２１であるが、それ以外の領域では２２−３０のＬＰＤＬＫＩＥＫＬなどもエピトープの候補として考えられよう。そして、これらを認識部位として作製された抗体も、４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６や４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６と同様に、または本抗体と組み合わせることによってＩＭＰの検出に利用できる。
【００５６】
こうして得られたモノクローナル抗体はＩＭＰ−１のみならず、複数の亜型ＩＭＰに対しても反応性を有するため、これらを用いて作製される測定装置は、ＩＭＰを広範囲に、しかしながら特異的に検出可能であり大変有用性の高いものと考えられる。
【００５７】
＜原理＞
（競合法を用いた免疫測定法）
本発明の実施の一形態として、固相化抗原および標識抗体からなる競合法を用いた免疫学的測定装置があげられる。
【００５８】
ＩＭＰ−１の全長またはモノクローナル抗体の認識部位を含むＩＭＰの合成ペプチド（ＩＭＰの部分ペプチド）を固相に用い、本発明のモノクローナル抗体を直接的または間接的に標識して標識抗体として用いる。本発明のモノクローナル抗体に対して、検査対象物中のＩＭＰと固相化されたＩＭＰまたはＩＭＰの部分ペプチドとを競合的に反応させ、検査対象物中のＩＭＰの存在の有無を検出する。
【００５９】
ここで用いる固相用の担体としては、ポリスチレン製のプレートやビーズ、ニトロセルロース性のメンブレンフィルターなど、免疫学的測定装置で一般的に用いられるものが利用できる。また標識抗体用の標識としては、酵素、金属やラテックスからなる有色粒子、蛍光物質など、免疫学的測定装置で一般的に用いられるものが利用できる。
【００６０】
（サンドイッチ法を用いた免疫測定法）
また、別の本発明における実施の一形態として、固相側、および標識抗体側にそれぞれ異なる本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定装置があげられる。
【００６１】
本発明のモノクローナル抗体の一方を固相に用い、他方のモノクローナル抗体を直接的または間接的に標識して標識抗体として用いる。検査対象物中にＩＭＰが存在すると、固相化されたモノクローナル抗体と標識抗体により抗原がサンドイッチ結合し、検査対象物中のＩＭＰの存在の有無を検出する。
【００６２】
（イムノクロマトの作製法）
また、更に好ましい本発明における実施の一形態として、イムノクロマト法を用いた免疫学的測定装置があげられる。
【００６３】
ここで、イムノクロマト装置の原理を、図１を参照しながら説明すると、イムノクロマト装置は、短冊形状の多孔質坦体１３（例えば、ニトロセルロース膜からなる）を主として構成される。検体を抽出するための液、すなわち検体抽出液のクロマト的な流動方向に沿って、上流側から順に、滴下部１１と標識区域１２と検出区域１４と対照区域１５と吸液部１６とが、連設される。
【００６４】
多孔質坦体１３あるいはその他の要素は、更に、プラスチック等よりなる基体に固定されて強度が付与されていてもよく、また、保護のために表面に透明なフィルム等が貼られていてもよい。
【００６５】
標識区域１２は、保水性担体を含み、保水性担体は、本発明のモノクローナル抗体（Ｂ）を有色粒子により標識したものを乾燥状態で保持し、試料滴下後に湿潤された状態において流動可能にこれを保持する。
【００６６】
保水性担体としては、例えば、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン等からなる不織布、あるいはセルロース、パルプ、ガラス繊維等からなる濾紙を挙げることができる。
【００６７】
有色粒子としては、例えば、金、セレンからなる金属コロイド、あるいは、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等に着色してなるラテックス微粒子を挙げることができる。
【００６８】
これらのうち、抗体又は抗原の吸着性が優れ、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、金コロイド、またはポリスチレン系の着色ラテックス粒子が有色粒子として好適に用いられる。
【００６９】
抗体を有色粒子に結合するには、例えば、物理的又は化学的な吸着法等によることができる。
【００７０】
さらに、対照区域１５には、標識抗体成分に対して特異的に結合する物質が固相化される。検出対象物の有無にかかわらず、対照区域１５にライン状のサインが現れることでイムノクロマトグラフィー試験が正常に行われたかどうかを判定できる。
【００７１】
（イムノクロマトにおける競合法）
検出区域１４は、ＩＭＰ−１または、ＩＭＰの部分ペプチド（Ａ）が多孔質坦体１３上に固相されている。標識区域１２の本発明のモノクローナル抗体標識物（Ｂ）は、固相化されたＩＭＰ−１またはＩＭＰの部分ペプチド（Ａ）を認識する。
【００７２】
図１（ｂ）のように検査対象物中にＩＭＰが存在しないとき、本発明のモノクローナル抗体（Ｂ）は検出区域１４において固相化されているＩＭＰ−１または、ＩＭＰの部分ペプチド（Ａ）との抗原抗体反応によって複合体を形成する。複合体を形成することで、検出区域１４が有色粒子により色づけされ、ライン状のサインが現れることになる。
【００７３】
一方、図１（ｂ'）のように検査対象物中にＩＭＰが存在し、それが滴下部１１に滴下されたとき、この検査対象物中のＩＭＰ（Ｘ）は、クロマト的な流動により、まず、標識区域１２の本発明のモノクローナル抗体標識物（Ｂ）と抗原抗体反応して、複合体（Ｃ）を形成する。
【００７４】
複合体（Ｃ）が形成され、本発明のモノクローナル抗体標識物（Ｂ）は検出区域に固相化されているＩＭＰ−１または、ＩＭＰの部分ペプチド（Ａ）と抗原抗体反応することができず流れていくため、検出区域１４において線状のサインが現れない。従ってライン状のサインが出現しないことにより検査対象物中のＩＭＰの存在を検出することができる。
【００７５】
（イムノクロマトにおけるサンドイッチ法）
図１（ｃ）において、検出区域１４は、本発明のモノクローナル抗体（Ｄ）が多孔質坦体１３上に固相化されている。
【００７６】
検査対象物中にＩＭＰが存在し、それが滴下部１１に滴下されたとき、この検査対象物中のＩＭＰ（Ｘ）は、クロマト的な流動により、まず、標識区域１２の本発明のモノクローナル抗体標識物（Ｂ）との抗原抗体反応によって、複合体（Ｃ）を形成する。
【００７７】
検出区域１４の本発明のモノクローナル抗体（Ｄ）はＩＭＰ（Ｘ）を認識するため、この複合体（Ｃ）は検出区域１４に捕捉される。例えば、図１（ｃ）の形態のように、モノクローナル抗体（Ｄ）が検出区域１４に線状に固相化されていれば、検出区域１４が有色粒子により色づけされ、ライン状のサインが現れることになる。
【００７８】
以下に緑膿菌を用いたＩＭＰの検出について実例をあげて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、この実施例に限定されるものでない。
【００７９】
＜実施例１＞
［ＥＬＩＳＡ競合法による測定］
検体としてＩＭＰ−１発現タンパク質を用い、免疫源のＩＭＰ−１発現タンパク質を固相に使用したＥＬＩＳＡ競合法による測定を行った。
【００８０】
（検体試料液の調製）
ｐＨ７．４に調整した０．５％のカゼインを含む３０ｍＭ ＰＢＳでＩＭＰ−１発現タンパクを０．１μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬとなるように調整し、検体試料液として用いた。対照として、０．５％のカゼインを含むＰＢＳのみを用いた。
【００８１】
（検出装置の作製と反応性試験）
ＩＭＰ−１発現タンパク質をＰＢＳで１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、ｎｕｎｃマキスソープイムノプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、商標）の各ウエルに１００μｇずつ加え、４℃で１５時間インキュベートし固相化した。
【００８２】
その後、固相化用の溶液を除き、ｐＨ８．５に調整した０．５％カゼインを含むホウ酸緩衝液を３００μｇ加えた後、４℃で１５時間静置し、ブロッキングを行った。ブロッキング液を除き、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で各ウエルを洗浄した。
【００８３】
Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（株式会社同仁化学研究所、商標）を用い、本発明のモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６をアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識し、０．５％のカゼインを含むＰＢＳでＡＬＰ標識４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６を１μｇ／ｍＬに希釈した後、ウエルに５０μｇずつ希釈した。そこに、調整した検体試験薬をそれぞれ５０μｇずつウエルに添加した。
【００８４】
これらを３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ １−Ｓｔｅｐ ＰＮＰＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、商標）を１００μｇ添加し、室温で１２０分反応後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６も以上と同様に測定した。
【００８５】
（結果の検討）
【００８６】
【表３】
【００８７】
結果は表３のとおりとなり、添加したＩＭＰ−１発現タンパク質濃度が上がるにつれ、吸光度が下がっており、競合的に反応することが確認できた。ＥＬＩＳＡ競合法を利用した検出装置によって、検体試料液中のＩＭＰ−１を検出することができた。また、同様の手法により検体に菌体の培養物を用いることにより、検体中のＩＭＰを検出することも可能である。
【００８８】
＜実施例２＞
［イムノクロマト競合法による測定］
【００８９】
検体としてＩＭＰ−１発現タンパク質を用い、免疫源のＩＭＰ−１発現タンパク質を固相に用いたイムノクロマト競合法による測定を行った。以下、図１（ｂ）の形態に沿って検出装置の作製方法を示す。
【００９０】
（標識成分の調製）
Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０−２２，１９７３）の方法に従い金コロイド粒子を作製した。この金コロイド１０ｍＬに対し、抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６を４０μｇ室温にて混合し、金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６を調製した。同様に金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６も調製した。
【００９１】
（標識区域１２の調製）
金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６をＯＤ５２０ｎｍ＝１．０となるように調製し、反応確認のために対照として金コロイド標識ウサギγグロブリンをＯＤ５２０ｎｍ＝０．２となるように調製したものを混合し調製液を作製した。
【００９２】
この調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μＬずつそれぞれ塗布した後、凍結乾燥させ、標識区域１２である金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６塗布パッドを調製した。４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６についても同様に金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６塗布パッドを調製した。
【００９３】
（検出区域１４の調製）
ＩＭＰ−１発現タンパク質を１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ緩衝液で調製し、多孔質坦体１３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社）の所定位置に、テスト当たり０．７３μＬでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。
【００９４】
また、検出区域１４の下流側に、抗ウサギ抗体を同様にテスト当たり０．７３μＬで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。乾燥作業を経て、ＩＭＰ−１発現タンパク質抗原固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。
【００９５】
（検出装置の作製）
滴下部１１としてのＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を用い、金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６塗布パッド、ＩＭＰ−１発現タンパク質抗原固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とをそれぞれ重ね合わせ、粘着剤付きの台紙に貼付してイムノクロマト競合法を利用したＩＭＰ検出装置を作製した。同様に４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６の代わりに４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６を用いたＩＭＰ検出装置も作製した。
【００９６】
（検体試料液の調製）
抽出液としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用い、この緩衝液でＩＭＰ−１発現タンパクを１０μｇ／ｍＬとなるように調製し、検体試料液として用いた。対照として、抽出液のみを用いた。
【００９７】
（反応性試験）
作製した２種の検出装置に検体試料液をピペットで１００μＬ滴下した後、１５分後の検出区域１４のライン発色を確認した。
【００９８】
（結果の検討）
【００９９】
【表４】
【０１００】
４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６を用いた検出装置は、検体試料液が抽出液のみの時、検出区域１４に明確なライン発色が現れた。これは、金コロイド標識された４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６が、ニトロセルロースメンブレン上に固相化されたＩＭＰ−１発現タンパク質と特異的に反応したため、そこで結合がおき、検出区域１４で発色したことによる。
【０１０１】
一方、検体試料液にＩＭＰ−１発現タンパク質が存在する場合、検出区域１４にてライン発色は認められなかった。これは、検体試料液中のＩＭＰ−１発現タンパク質が、クロマト的な流動により金コロイド標識された４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６と先に特異的に反応したため、ニトロセルロースメンブレン上に固相化されたＩＭＰ−１発現タンパク質とは反応ができず、検出区域１４で発色ができないことによる。
【０１０２】
金コロイド標識に４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６を用いた検出装置も同様の結果であった。反応系の確認のための対照区域１５はいずれも明確な発色を示した。
【０１０３】
このように、イムノクロマト競合法を利用した検出装置によって、ニトロセルロース上に固相化されたＩＭＰ−１発現タンパク質と検体試料液中のＩＭＰ−１発現タンパク質を競合的に反応させることで、検体試料液中のＩＭＰ−１発現タンパク質を検出することができた。
【０１０４】
検体と抽出液を混合させるだけで検体試料液は容易に作製でき、さらに滴下後、１５分以内で反応性が確認できるため、非常に簡便かつ迅速に検出することができる。また、同様の手法で検体に菌体の培養物を用いることにより、検体中のＩＭＰを検出することも可能である。
【０１０５】
＜実施例３＞
［イムノクロマトサンドイッチ法による測定］
実施例２の（標識成分の調製）と（標識区域１２の調製）と同じ方法で金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６塗布パッドを調製した。
【０１０６】
（検出区域１４の調製）
本発明のモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６を１．０ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ緩衝液で調製し、多孔質坦体１３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社）の所定位置に、テスト当たり０．７３μＬでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。
【０１０７】
また、検出区域１４の下流側に、抗ウサギ抗体を同様にテスト当たり０．７３μＬで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。乾燥作業を経て、抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。
【０１０８】
（検出装置の作製）
滴下部１１としてのＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を用い、金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６塗布パッドと、抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６固相化メンブレンと、吸液部１６としての濾紙とをそれぞれ重ね合わせ、粘着剤付きの台紙に貼付してイムノクロマトサンドイッチ法を利用したＩＭＰ検出装置を作製した。
【０１０９】
（検体試料液の調製）
緑膿菌のＩＭＰ産生株はＮＣＧＭ２．Ｓ１株を使用した。これをＭＨ寒天培地上にて３７℃の条件下で静置培養した。菌株のコロニーを滅菌された綿棒で１コロニーかきとり、０．７ｍＬの抽出液中で菌体を破砕し、これを検体試料液として用いた。抽出液にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用している。対照として、緑膿菌のＩＭＰ非産生株であるＡＴＣＣ２７８５３株を用いた検体試料液も調製した。
【０１１０】
（反応性試験）
作製した検出装置に検体試料液をピペットで１００μＬ滴下した後、１５分後の検出区域１４のライン発色を確認した。
【０１１１】
（結果の検討）
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
結果は、表５、図２のとおりである。ＩＭＰ非産生緑膿菌検体では、図２（ａ）に示すように、検出区域１４にライン発色が認められなかった。これはＩＭＰが検体試料液に含まれず、本発明のモノクローナル抗体と反応しないためである。
【０１１４】
一方、ＩＭＰ産生緑膿菌検体では、図２（ｂ）に示すように、検出区域１４に明確なライン発色が認められた。これはＩＭＰが検体試料液に含まれているため、金コロイド標識した４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６とニトロセルロースメンブレンに固相化された４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６がそれぞれＩＭＰと特異的に反応し、検出区域１４でこれらがサンドイッチ的に結合したため発色したことによる。
【０１１５】
イムノクロマトサンドイッチ法を利用した検出装置によって、検体試料液中のＩＭＰを検出することができた。実際の菌株を用いても菌株と抽出液を混合させるのみで、検体試料液は調製することができ、さらに、滴下後１５分以内で反応性が確認できるため、非常に簡便かつ迅速に検出することが実証された。
【０１１６】
＜実施例４＞
［イムノクロマトサンドイッチ法とＰＣＲまたはＳＭＡ法による測定の比較］
緑膿菌２４８株を検体として用いた。
【０１１７】
（イムノクロマトサンドイッチ法を利用したＩＭＰ検出装置での測定）
実施例３の（標識成分の調製）から（検出装置の作製）までと同様の方法でイムノクロマトサンドイッチ法を利用したＩＭＰ検出装置を作製した。
【０１１８】
（検出装置の検体試料液の調製）
緑膿菌２４８株をミューラーヒントン（ＭＨ）寒天培地上にて３７℃の条件下でそれぞれ静置培養した。菌株のコロニーを滅菌された綿棒で１コロニーかきとり、０．７ｍＬの抽出液中で菌体を破砕し、これを検体試料液として用いた。抽出液にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用している。
【０１１９】
（反応性試験）
作製した検出装置に検体試料液をピペットで１００μＬ滴下した後、１５分後の検出区域１４のライン発色を確認した。ライン発色が認められたものを陽性とした。
【０１２０】
（ＳＭＡ法での測定）
メタロ−β−ラクタマーゼＳＭＡ'栄研'（栄研化学株式会社，商標）の説明書に基づき検体の２４８株の緑膿菌株を測定した。すなわち、抗菌薬としてイミペネム（ＩＰＭ）含有のＫＢディスク（栄研化学株式会社，商標）を用いた。ＳＭＡディスクはメタロ−β−ラクタマーゼＳＭＡ'栄研'（栄研化学株式会社，商標）を用いた。ＳＭＡディスクに隣接しているＩＰＭの阻止帯の直径がＩＰＭ単独の阻止帯の直径よりも５ｍｍ以上の拡大を認めたとき、陽性とした。
【０１２１】
（ＰＣＲ法での測定）
ＰＣＲに用いる鋳型ＤＮＡは、菌体ボイル法により抽出した。
【０１２２】
ＰＣＲは以下の２種類のプライマーセットを使用して行った。プライマーセット１を用いることにより、ＩＭＰ−１、ＩＭＰ−３、ＩＭＰ−４、ＩＭＰ−６、ＩＭＰ−７、ＩＭＰ−１０、ＩＭＰ−２５及びＩＭＰ−２６を、プライマーセット２を用いることによりＩＭＰ−４、ＩＭＰ−５、ＩＭＰ−７、ＩＭＰ−９、ＩＭＰ−１１、ＩＭＰ−１５、ＩＭＰ−２１及びＩＭＰ−２６の亜型を検出した。詳細な亜型は、ＰＣＲ検出により得られた増幅断片のダイレクトシークエンスを実施することで決定した。
【０１２３】
［プライマーセット１］
blaIMP-F1:GAAGTTAACGGGTGGGGCG
blaIMP-R1:CTTTAACCGCCTGCTCTAAT
【０１２４】
［プライマーセット２］
blaIMP-F2:GTATTCTTTATGTTTTTGTTTTGTAGCATT
blaIMP-R2:AAGCTTCTAAATTTGCGTCACCCAAATTAC
【０１２５】
（結果の検討）
結果をまとめると次表の通りである。
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
表６において、イムノクロマトサンドイッチ法（本法）の結果とＳＭＡ法との結果を比較すると、本法が陽性でＳＭＡ方が陰性となった２５検体にはＩＭＰ遺伝子があり、本法が陰性で、ＳＭＡ方が陽性となった１検体にはＩＭＰ遺伝子がなかった。そのため、本法が、感度・特異度ともにＳＭＡ法より優れている結果となった。
【０１２９】
表７において、本法とＰＣＲ法との結果を比較すると、陽性１９１株、陰性５７株と、全て一致した。このことにより、本法は感度・特異度よくＩＭＰを検出することが確認できた。さらに陽性１９１株についてはダイレクトシークエンスでの分析の結果、ＩＭＰ−１が１４４株、ＩＭＰ−６が６株、ＩＭＰ−７が２５株、ＩＭＰ−１０が１４株およびＩＭＰ−１１が２株となり、ＩＭＰ−１，ＩＭＰ−６，ＩＭＰ−７，ＩＭＰ−１０およびＩＭＰ−１１が検体中に含まれていることが分かった。同一検体を本法でも検出できているため、実際の緑膿菌体の産生するＩＭＰ亜型にも反応することが認められた。
【０１３０】
ここで、判定するまでの手間や時間を考えると、ＳＭＡ法では培地にまく菌体の量を一定にするため濁度法により調製する必要があり、検体の調製に時間と手間がかかった。さらに、判定のために再度培養に１６時間以上時間を要するため、簡便さや迅速さに欠けてしまう。
【０１３１】
また、ＰＣＲ法では、菌体からＤＮＡの抽出作業を行う必要があり、ＩＭＰの亜型を網羅的に検出しようとすると複数のプライマーを用意する必要がある。さらに、測定の為に、高価な機器や設置場所を必要とするため、こちらも簡便さや迅速さに欠けてしまう。
【０１３２】
しかし、本法は菌体と抽出液を混合させるだけで検体試料液を調製でき、さらに判定は１５分以内と短時間であり、判定もライン発色の有無を目視にて確認できるためより容易に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】（ａ）本発明の一実施の形態における検出装置の側面図、（ｂ）〜（ｃ）本発明の一実施の形態における検出装置の正面図
【図２】（ａ）〜（ｂ）本発明の一実施の形態における検出区域の拡大図
【符号の説明】
【０１３４】
１１ 滴下部
１２ 標識区域
１３ 多孔質担体
１４ 検出区域
１５ 対象区域
１６ 吸液部
Ａ ＩＭＰ−１またはＩＭＰの部分ペプチド
Ｂ モノクローナル抗体標識物
Ｃ 複合体
Ｄ モノクローナル抗体
Ｘ ＩＭＰ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体、それを用いる検査装置に係り、特に、β−ラクタム系薬剤に対する細菌の耐性因子であるＩＭＰ型メタロ−β−ラクタマーゼの検出に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病原性微生物により惹き起される感染症の問題は、人類にとってたいへん重大であり、時として重篤な病状を伴う大流行を発生させ、多数の感染患者、更には死者を出してきた。そして病原性微生物の増殖を抑制できる抗生物質ペニシリンの発見により、細菌性感染症の治療は急速な進展を遂げ、それ以降も様々な抗生物質の開発が行われてきた。しかしながら、これらの抗生物質を使用していく中で、抗生物質を分解または無毒化する能力を獲得した細菌（耐性菌）が現れ、新たな問題となっている。
【０００３】
医療現場において、特に高齢者や乳幼児、長期の入院患者などで免疫力が低下している場合や怪我や手術後の治療患者、各種カテーテル使用患者などで病原菌と直接接触する可能性が考えられる場合に、耐性菌による感染拡大、端的には院内感染が、大きな社会問題となっている。
【０００４】
医療現場では感染対策のため、耐性菌のモニタリングを行い、万が一耐性菌を発見した場合には、適正な薬剤の選択、治療とともに、感染の蔓延を防止するための患者の隔離、消毒の徹底などが求められている。また、医療従事者を介しての感染拡大も考えられるため、徹底した感染経路の遮断や消毒、環境対策などが必要となる。この様な理由から、耐性菌の早期検出は、医療現場において抗生物質が効かない危険な耐性菌の感染蔓延を防止する目的でたいへん重要である。
【０００５】
細菌の薬剤耐性には、いくつかの系統があることが分かっており、菌種により抗菌剤の有効性も当然異なっている。その抗菌剤の中でも人体への毒性が低く、広範囲の細菌種に対して有効な抗菌剤であるβ−ラクタム系薬剤が開発され広く使用されてきた。
【０００６】
１９９０年代になると完全合成β−ラクタムのカルバペネム系薬剤が開発され、殆どの種類の細菌に効果を示すことで大いに期待された。β−ラクタム系薬剤は、分子構造中にβ−ラクタム環を有する抗菌薬の総称である。このβ−ラクタム系薬剤は、広域スペクトラムを示し、ペプチドグリカンを主成分とする細菌の細胞壁の合成を阻害することで、細菌に細胞分裂をできなくさせる効果や、細胞壁が浸透圧に耐えられず細菌を破裂して死菌させる効果がある。
【０００７】
しかし、細菌の中でも特にグラム陰性菌において、このβ−ラクタム系薬剤の分解酵素であるβ−ラクタマーゼを産生し、β−ラクタム系薬剤を加水分解し失活させることで、強い耐性を持つものが出現した。
【０００８】
この中でも、活性中心に亜鉛をもつメタロ−β−ラクタマーゼ（ＭＢＬ）は、ほとんど全てのβ−ラクタム系薬剤に耐性を示すため、最後の砦とされているカルバペネム系薬剤を含め薬剤投与の選択肢がなくなってしまう、最も危険なβ−ラクタマーゼ耐性因子と考えられている。
【０００９】
また、ＭＢＬ産生菌の耐性因子は、その伝播しやすさについても問題視されている。菌自体の遺伝子ＤＮＡとは別に存在する独立したＤＮＡ分子であるプラスミドや可動性エレメントであるインテグロン上に耐性遺伝子を持つため、プラスミドを有する細菌同士の接触のみでこの因子の伝搬が容易に行われるのである。
【００１０】
これは他の耐性菌であるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）などが、多量の薬剤投与によって突然変異を起こし菌自体のＤＮＡにメチシリン耐性を獲得して細胞分裂により増殖するのとは異なり、菌種をも超えて伝達されるため耐性菌が広範囲に劇的に増殖しやすいことを意味する。
【００１１】
ＭＢＬは、Bacteroides fragilis、Serratia marcescens、Klebsiella pneumoniae、Escherichia coli等複数のグラム陰性菌で確認されており、特に緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）においては、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）における耐性因子の一つとしても注目され社会的にも大きな問題となっている。
【００１２】
緑膿菌は常在菌であり、それ自体の病原性は低く健常者に対して感染症を引き起こすことはまれである。しかしながら、免疫力が低下している人などに日和見感染して感染症を引き起こす。特に、緑膿菌敗血症のような重篤な疾患を引き起こした場合の致死率は８０％以上にもなる。
【００１３】
これらの理由から、薬剤耐性菌、特に多剤耐性緑膿菌に代表されるＭＢＬ産生グラム陰性菌は、最も危険で重要な感染病原菌として認識されている。臨床の現場でこれらの産生株が広く蔓延をすることで、将来的に世界規模の深刻な問題を引き起こす可能性も指摘されており、ＭＢＬ産生のグラム陰性菌の早期発見と伝播を止める対策は重要である。
【００１４】
ＭＢＬとしては、ＩＭＰ型、ＶＩＭ型、ＳＰＭ型が世界的によく知られている。その中でもＩＭＰ型が代表的なＭＢＬであり、さらに、近年問題視されている多剤耐性緑膿菌も、主としてＩＭＰ型のＭＢＬを産生していることが分かっている。そのため、ＩＭＰ型のＭＢＬを迅速に検出し、隔離や適切な治療を施すことで、これらの耐性菌を封じ込めることが可能となる。
【００１５】
ＩＭＰ型のＭＢＬには亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）が存在し、現在まででＩＭＰ−１からＩＭＰ−２９までの２９種の亜型が知られており、その中でＩＭＰ−１７，ＩＭＰ−２３，ＩＭＰ−２７，ＩＭＰ−２８，ＩＭＰ−２９を除くＩＭＰ−１，ＩＭＰ−２，ＩＭＰ−３，ＩＭＰ−４，ＩＭＰ−５，ＩＭＰ−６，ＩＭＰ−７，ＩＭＰ−８，ＩＭＰ−９，ＩＭＰ−１０，ＩＭＰ−１１，ＩＭＰ−１２，ＩＭＰ−１３，ＩＭＰ−１４，ＩＭＰ−１５，ＩＭＰ−１６，ＩＭＰ−１８，ＩＭＰ−１９，ＩＭＰ−２０，ＩＭＰ−２１，ＩＭＰ−２２，ＩＭＰ−２４，ＩＭＰ−２５，およびＩＭＰ−２６のアミノ酸配列が分かっている。
【００１６】
これらＩＭＰ型のＭＢＬを簡便・容易に検出することは、これまでに不可能であった。
【００１７】
現在、ＭＢＬを検出する技術としては、２価イオンキレート剤のジピコリン酸を使用したディスク拡散法、特許文献１（特開２００１−２９９３８８号公報）記載のＭＢＬ阻害剤のチオグリコール酸（メルカプト酢酸）を使用した方法がある。
【００１８】
ＭＢＬは活性中心に亜鉛を持っているため、亜鉛とキレートすることで活性を不活化することができ、ジピコリン酸、チオグリコール酸や２−メルカプトプロピオン酸もＭＢＬの阻害剤として用いることができる。この方法を用いた製品としてはドライプレート'栄研'ＤＰＤ１（栄研化学株式会社、商標）やメタロ−β−ラクタマーゼＳＭＡ'栄研'（栄研化学株式会社、商標）がある。
【００１９】
具体的には、検体に分離培養した菌のコロニーを用い、検査する培地上の一方に抗菌薬のみをもう一方には抗菌薬とＭＢＬ阻害剤を近接して置いた状態で、培地に菌体を播いて培養する。培地上に設置した抗菌剤や阻害剤の周辺に、発育の阻害を受けて作る阻止帯の有無や大きさを比較することで、ＭＢＬ産生株かどうかを検出することができる。
【００２０】
しかしながら、検査をするためには１６時間以上培養しなければならず長時間を要してしまう。また阻止帯の大きさによっては判定不能となること、菌体数を濁度法などで正確に定量する必要があることから、簡便・迅速な測定方法とは言い切れない。また、ハイリスクであるプラスミド伝搬性のＩＭＰ型のＭＢＬ産生株のみを検出することはできない。
【００２１】
また、別の方法としては、特許文献２（ＷＯ ０２／２４７０７号公報）記載のＭＢＬに分解され発色するセファロスポリン化合物の基質とＭＢＬ阻害剤を併用する試薬がある。この方法ではＭＢＬおよび基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）によって分解される発色基質をテストストリップに塗布してあり、そこに分離培養コロニーから採取した菌体をこすりつけ、菌の産生するＭＢＬもしくはＥＳＢＬにより発色基質が分解されることでテストストリップが変色して判定できる仕組みである。
【００２２】
さらにＥＳＢＬかＭＢＬかを特定するには、発色基質のみのものと、発色基質と共にＭＢＬ阻害剤を塗ったものとを用意し、同一検体で同時に測定して結果を比較する必要がある。この方法を用いた製品としては、シカベータテストＩ／ＭＢＬ（関東化学株式会社、商標）という検出試薬が市販されている。
【００２３】
ここでＭＢＬ過剰産生菌の場合は、阻害剤の阻害能を超えてしまうことで基質が変色し、判定を誤る可能性もある。検査に使用する菌体を過剰にテストストリップに塗布すると偽陽性、少量であると偽陰性が生じる可能性もあり、適量を塗布するのに技量が必要となる。
【００２４】
さらに、２〜８℃で保存する必要があり貯法にも注意を要する。従ってこの方法は１５分と短時間での測定が可能ではあるが、簡便性には欠けているといわざるを得ない。また、この方法でも、ハイリスクであるプラスミド伝搬性のＩＭＰ型のＭＢＬ産生株のみを検出することはできない。
【００２５】
更に、別の方法としては、プライマーを使って特定のＭＢＬ遺伝子を検出するＰＣＲ法や特許文献３（特開２００７−１９５４２１号公報）記載のＬＡＭＰ法などがある。
【００２６】
遺伝子検査であるため検出感度が高く、各種のプライマーを用意することで遺伝子型まで特定できるが、全ての亜型を検出するプライマーはないため、必要な遺伝子型のプライマーをそれぞれに用意する必要がある。さらに高価な機械や、高度な手技、抽出作業といった手間が必要となり、測定可能な施設や人が限られてしまう問題がある。
【００２７】
検体は、一度分離培養したものを用いるが、従来法ではＭＢＬ検出のためには、さらに検査時にもう一度培養する必要があるため、より多くの時間を要してしまい迅速に結果がわからないことや、無菌操作の手技、培養状況の判定などが必要であり誰でも容易にはできないことがあった。また、ＩＭＰ型のＭＢＬを捕捉しようとするとＰＣＲのような遺伝子検査でしか実現可能でなく、遺伝子検査においては、変異型毎にプライマーを用意する必要があった。
【特許文献１】特開２００１−２９９３８８号公報
【特許文献２】ＷＯ ０２／２４７０７号公報
【特許文献３】特開２００７−１９５４２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
そこで本発明は、迅速かつ簡便にＩＭＰ型ＭＢＬを検出するためのモノクローナル抗体及びその関連技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
第１の発明に係るモノクローナル抗体は、ＩＭＰ−１及びその亜型に対して特異的に反応する。
【００３０】
第２の発明に係るモノクローナル抗体は、第１の発明に加え、ＩＭＰのアミノ酸配列においてＮ末端側１０３番目から１０８番目の６残基に対し特異的に反応する。
【００３１】
第３の発明に係るモノクローナル抗体は、第２の発明に加え、６残基がＧＩＥＷＬＮ及びＧＩＧＷＬＮであるＩＭＰの両方に対して特異的に反応する。
【００３２】
第４の発明に係るモノクローナル抗体は、第１の発明に加え、ＩＭＰのアミノ酸配列においてＮ末端側１１３番目から１２１番目の９残基に対し特異的に反応する。
【００３３】
第５の発明に係るモノクローナル抗体は、第４の発明に加え、９残基がＰＴＹＡＳＥＬＴＮ、ＳＴＹＡＳＥＬＴＮ及びＰＴＹＡＳＶＬＴＮであるＩＭＰのいずれに対しても特異的に反応する。
【００３４】
第９の発明に係る検査装置は、ストリップと、ストリップの上流側に配置される滴下部と、ストリップの下流側に配置される吸水ろ紙と、滴下部より吸水ろ紙に至る流れ方向下流側に配置され第１の抗体を標識したものを流動可能に保持する塗布部と、塗布部と吸水ろ紙との間に配置され第２の抗体が固相される検査部とを備える検査装置であって、第１の抗体と第２の抗体の一方は、第１の発明に係るモノクローナル抗体であり、第１の抗体と第２の抗体の他方は、第２の発明又は第４の発明に係るモノクローナル抗体である。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、ＩＭＰ型ＭＢＬを特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
（開発の経緯）
まず本発明者らが本願発明の完成に達するまでの経緯を述べる。本発明者らは、薬剤耐性細菌が持っているβ−ラクタム系薬剤に対する耐性因子ＩＭＰを免疫学的に簡便に測定しうる装置を開発するために、その代表的な酵素タンパク質であるＩＭＰ−１を用いてモノクローナル抗体の作製を行った。
【００３７】
モノクローナル抗体の作製は、免疫源にＩＭＰ−１発現タンパク質を使用して行った。すなわち、ＩＭＰ−１蛋白質発現プラスミドｐＥＴ２８−ｂｌａＩＭＰで形質転換した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含むＬＢ培地中、３７℃で培養した。
【００３８】
６００ｎｍでの吸光度が０．８を示した対数増殖期にＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるように加え、組換えＩＭＰ−１タンパク質の発現を誘導した。誘導後、２時間培養し菌体を回集した。これを６Ｍグアニジン塩酸塩、０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム、１０ｍＭトリス、５ｍＭイミダゾール、（ｐＨ８．０）に溶解して、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムに発現ＩＭＰ−１タンパク質を結合させた。８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム、１０ｍＭトリス、１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）で洗浄した後、更にイミダゾールを最終濃度２５０ｍＭになるように加えて組換えＩＭＰ−１をカラムから溶出した。以下に、ＩＭＰ−１発現タンパク質の２４６個のアミノ酸配列を示す。
【００３９】
MSKLSVFFIFLFCSIATAAESLPDLKIEKLDEGVYVHTSFEEVNGWGVVPKHGLVVLVNAEAYLIDTPFTAKDTEKLVTWFVERGYKIKGSISSHFHSDSTGGIEWLNSRSIPTYASELTNELLKKDGKVQATNSFSGVNYWLVKNKIEVFYPGPGHTPDNVVVWLPERKILFGGCFIKPYGLGNLGDANIEAWPKSAKLLKSKYGKAKLVVPSHSEVGDASLLKLTLEQAVKGLNESKKPSKPSN
【００４０】
免疫法は、文献；生化学［６９：１２８−１３１（１９９７）．佐渡義一，香川恵：ラットリンパ節を用いる，効率的で，しかも，抗原量，労力，時間を節約できるモノクローナル抗体作製法］の方法に従い実施した。
【００４１】
１００μｇの免疫源を含む溶液に等量のフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製）を加え完全に混合した後、ＷＫＹラットのフットパッドに投与した。その２週間後に同量の抗原をフロインド不完全アジュバントと混合し、ラット尾根部に投与し、さらに２週間後に同様の追加免疫を実施した。最終免疫後、３〜４日でＰＥＧを用いてラット腸骨リンパ節細胞とミエローマ細胞（ＳＰ２／０）とを融合した。培養液にはＨＡＴ選択培地を使用し、約１週間後に培養上清を採取しスクリーニングに供した。
【００４２】
モノクローナル抗体のスクリーニングには、ＩＭＰ産生緑膿菌のＮＣＧＭ２．Ｓ１株の溶菌物とＩＭＰ−１発現タンパク質を抗原とし、１次抗体に各抗ＩＭＰ−１ラットモノクローナル抗体の培養上清を使用したウエスタンブロッティング法を使用した。
【００４３】
その結果、緑膿菌の溶菌物とＩＭＰ−１発現タンパク質に強い反応性を示す２種のクローン（クローン４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６とクローン４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６）を得た。
【００４４】
これら２種のモノクローナル抗体が認識する反応部位を分析するため、ＩＭＰ−１のアミノ酸配列中の各種断片化ペプチドを合成して、全長ＩＭＰ−１を固相化したマイクロプレートと各モノクローナル抗体の免疫反応における競合ＥＬＩＳＡ法で測定を行った結果、４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６はＮ末端から１０３−１０８番目のＧＩＥＷＬＮを含むアミノ酸配列に、４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６はＮ末端から１１３−１２１番目のＰＴＹＡＳＥＬＴＮを含むアミノ酸配列にエピトープがあることが確認された。
【００４５】
ＩＭＰ−１の亜型は２９種報告されているが、そのうちアミノ酸配列が分かっているものはＩＭＰ−１，ＩＭＰ−２，ＩＭＰ−３，ＩＭＰ−４，ＩＭＰ−５，ＩＭＰ−６，ＩＭＰ−７，ＩＭＰ−８，ＩＭＰ−９，ＩＭＰ−１０，ＩＭＰ−１１，ＩＭＰ−１２，ＩＭＰ−１３，ＩＭＰ−１４，ＩＭＰ−１５，ＩＭＰ−１６，ＩＭＰ−１８，ＩＭＰ−１９，ＩＭＰ−２０，ＩＭＰ−２１，ＩＭＰ−２２，ＩＭＰ−２４，ＩＭＰ−２５ならびにＩＭＰ−２６の２４種類である。
【００４６】
これらの亜型について本発明の２つのモノクローナル抗体のエピトープを含むＮ末端から１０１〜１２５番目の配列のアミノ酸配列について詳細に調べたところ、各変異株についてのアミノ酸配列が異なる部分が確認された。これを次表に示す。
【００４７】
【表１】
これらの各亜型について本発明のモノクローナル抗体が反応するかどうかを確認するために、免疫源の組み換え体ＩＭＰ−１の作製法と同様の方法を用いて変異に対応する各アミノ酸を置換した組み換え亜型Ｔｙｐｅ２〜８を次表に従って作製した。
【００４８】
【表２】
【００４９】
固相化メンブレンにＩＭＰ−１亜型組み換えタンパク質を、金コロイド標識に４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６または４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６の各モノクローナル抗体を用いたイムノクロマト装置にて、各組み換え体タンパク質Ｔｙｐｅ１〜８を添加し反応に阻害がかかるかどうかを調べた。
【００５０】
その結果、４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６、４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６ともに全ての組み換え体タンパク質にて反応に阻害がかかり、本発明のモノクローナル抗体はいずれもこれらの亜型について反応することが確認された。
【００５１】
従って本発明のモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６はＮ末端から１０３−１０８番目のＧＩＥＷＬＮを含むアミノ酸配列のみならず１０５番目のアミノ酸Ｅ（グルタミン酸）をＧ（グリシン）に置換したＧＩＧＷＬＮにも反応性を有することが分かった。
【００５２】
一方、４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６はＮ末端から１１３−１２１番目のＰＴＹＡＳＥＬＴＮを含むアミノ酸配列のみならず、１１３番目のＰ（プロリン）をＳ（セリン）に置換したＳＴＹＡＳＥＬＴＮ、１１８番目のＥ（グルタミン酸）をＶ（バリン）に置換したＰＴＹＡＳＶＬＴＮにも反応性を有することが分かった。
【００５３】
この様に本発明のモノクローナル抗体は、免疫源であるＩＭＰ−１発現タンパク質に反応するのみならず、亜型のＩＭＰも広く認識することが出来ることが確認された。
【００５４】
本モノクローナル抗体がＩＭＰのいずれの亜型にも反応性を有することは、ＩＭＰを広くかつ特異的に検出するために非常に有用である。このようにＩＭＰを広く、特異的に検出するためのアミノ酸配列の条件としてＩＭＰの立体構造において表面にあるアミノ酸配列であり、かつ、どの亜型にもある程度の共通したアミノ酸配列を有しているという条件を満たしていることが必要と考えられる。
【００５５】
本発明のモノクローナル抗体である４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６の認識部位は１０３−１０８であり、４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６の認識部位は１１３−１２１であるが、それ以外の領域では２２−３０のＬＰＤＬＫＩＥＫＬなどもエピトープの候補として考えられよう。そして、これらを認識部位として作製された抗体も、４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６や４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６と同様に、または本抗体と組み合わせることによってＩＭＰの検出に利用できる。
【００５６】
こうして得られたモノクローナル抗体はＩＭＰ−１のみならず、複数の亜型ＩＭＰに対しても反応性を有するため、これらを用いて作製される測定装置は、ＩＭＰを広範囲に、しかしながら特異的に検出可能であり大変有用性の高いものと考えられる。
【００５７】
＜原理＞
（競合法を用いた免疫測定法）
本発明の実施の一形態として、固相化抗原および標識抗体からなる競合法を用いた免疫学的測定装置があげられる。
【００５８】
ＩＭＰ−１の全長またはモノクローナル抗体の認識部位を含むＩＭＰの合成ペプチド（ＩＭＰの部分ペプチド）を固相に用い、本発明のモノクローナル抗体を直接的または間接的に標識して標識抗体として用いる。本発明のモノクローナル抗体に対して、検査対象物中のＩＭＰと固相化されたＩＭＰまたはＩＭＰの部分ペプチドとを競合的に反応させ、検査対象物中のＩＭＰの存在の有無を検出する。
【００５９】
ここで用いる固相用の担体としては、ポリスチレン製のプレートやビーズ、ニトロセルロース性のメンブレンフィルターなど、免疫学的測定装置で一般的に用いられるものが利用できる。また標識抗体用の標識としては、酵素、金属やラテックスからなる有色粒子、蛍光物質など、免疫学的測定装置で一般的に用いられるものが利用できる。
【００６０】
（サンドイッチ法を用いた免疫測定法）
また、別の本発明における実施の一形態として、固相側、および標識抗体側にそれぞれ異なる本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定装置があげられる。
【００６１】
本発明のモノクローナル抗体の一方を固相に用い、他方のモノクローナル抗体を直接的または間接的に標識して標識抗体として用いる。検査対象物中にＩＭＰが存在すると、固相化されたモノクローナル抗体と標識抗体により抗原がサンドイッチ結合し、検査対象物中のＩＭＰの存在の有無を検出する。
【００６２】
（イムノクロマトの作製法）
また、更に好ましい本発明における実施の一形態として、イムノクロマト法を用いた免疫学的測定装置があげられる。
【００６３】
ここで、イムノクロマト装置の原理を、図１を参照しながら説明すると、イムノクロマト装置は、短冊形状の多孔質坦体１３（例えば、ニトロセルロース膜からなる）を主として構成される。検体を抽出するための液、すなわち検体抽出液のクロマト的な流動方向に沿って、上流側から順に、滴下部１１と標識区域１２と検出区域１４と対照区域１５と吸液部１６とが、連設される。
【００６４】
多孔質坦体１３あるいはその他の要素は、更に、プラスチック等よりなる基体に固定されて強度が付与されていてもよく、また、保護のために表面に透明なフィルム等が貼られていてもよい。
【００６５】
標識区域１２は、保水性担体を含み、保水性担体は、本発明のモノクローナル抗体（Ｂ）を有色粒子により標識したものを乾燥状態で保持し、試料滴下後に湿潤された状態において流動可能にこれを保持する。
【００６６】
保水性担体としては、例えば、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン等からなる不織布、あるいはセルロース、パルプ、ガラス繊維等からなる濾紙を挙げることができる。
【００６７】
有色粒子としては、例えば、金、セレンからなる金属コロイド、あるいは、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等に着色してなるラテックス微粒子を挙げることができる。
【００６８】
これらのうち、抗体又は抗原の吸着性が優れ、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、金コロイド、またはポリスチレン系の着色ラテックス粒子が有色粒子として好適に用いられる。
【００６９】
抗体を有色粒子に結合するには、例えば、物理的又は化学的な吸着法等によることができる。
【００７０】
さらに、対照区域１５には、標識抗体成分に対して特異的に結合する物質が固相化される。検出対象物の有無にかかわらず、対照区域１５にライン状のサインが現れることでイムノクロマトグラフィー試験が正常に行われたかどうかを判定できる。
【００７１】
（イムノクロマトにおける競合法）
検出区域１４は、ＩＭＰ−１または、ＩＭＰの部分ペプチド（Ａ）が多孔質坦体１３上に固相されている。標識区域１２の本発明のモノクローナル抗体標識物（Ｂ）は、固相化されたＩＭＰ−１またはＩＭＰの部分ペプチド（Ａ）を認識する。
【００７２】
図１（ｂ）のように検査対象物中にＩＭＰが存在しないとき、本発明のモノクローナル抗体（Ｂ）は検出区域１４において固相化されているＩＭＰ−１または、ＩＭＰの部分ペプチド（Ａ）との抗原抗体反応によって複合体を形成する。複合体を形成することで、検出区域１４が有色粒子により色づけされ、ライン状のサインが現れることになる。
【００７３】
一方、図１（ｂ'）のように検査対象物中にＩＭＰが存在し、それが滴下部１１に滴下されたとき、この検査対象物中のＩＭＰ（Ｘ）は、クロマト的な流動により、まず、標識区域１２の本発明のモノクローナル抗体標識物（Ｂ）と抗原抗体反応して、複合体（Ｃ）を形成する。
【００７４】
複合体（Ｃ）が形成され、本発明のモノクローナル抗体標識物（Ｂ）は検出区域に固相化されているＩＭＰ−１または、ＩＭＰの部分ペプチド（Ａ）と抗原抗体反応することができず流れていくため、検出区域１４において線状のサインが現れない。従ってライン状のサインが出現しないことにより検査対象物中のＩＭＰの存在を検出することができる。
【００７５】
（イムノクロマトにおけるサンドイッチ法）
図１（ｃ）において、検出区域１４は、本発明のモノクローナル抗体（Ｄ）が多孔質坦体１３上に固相化されている。
【００７６】
検査対象物中にＩＭＰが存在し、それが滴下部１１に滴下されたとき、この検査対象物中のＩＭＰ（Ｘ）は、クロマト的な流動により、まず、標識区域１２の本発明のモノクローナル抗体標識物（Ｂ）との抗原抗体反応によって、複合体（Ｃ）を形成する。
【００７７】
検出区域１４の本発明のモノクローナル抗体（Ｄ）はＩＭＰ（Ｘ）を認識するため、この複合体（Ｃ）は検出区域１４に捕捉される。例えば、図１（ｃ）の形態のように、モノクローナル抗体（Ｄ）が検出区域１４に線状に固相化されていれば、検出区域１４が有色粒子により色づけされ、ライン状のサインが現れることになる。
【００７８】
以下に緑膿菌を用いたＩＭＰの検出について実例をあげて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、この実施例に限定されるものでない。
【００７９】
＜実施例１＞
［ＥＬＩＳＡ競合法による測定］
検体としてＩＭＰ−１発現タンパク質を用い、免疫源のＩＭＰ−１発現タンパク質を固相に使用したＥＬＩＳＡ競合法による測定を行った。
【００８０】
（検体試料液の調製）
ｐＨ７．４に調整した０．５％のカゼインを含む３０ｍＭ ＰＢＳでＩＭＰ−１発現タンパクを０．１μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬとなるように調整し、検体試料液として用いた。対照として、０．５％のカゼインを含むＰＢＳのみを用いた。
【００８１】
（検出装置の作製と反応性試験）
ＩＭＰ−１発現タンパク質をＰＢＳで１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、ｎｕｎｃマキスソープイムノプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、商標）の各ウエルに１００μｇずつ加え、４℃で１５時間インキュベートし固相化した。
【００８２】
その後、固相化用の溶液を除き、ｐＨ８．５に調整した０．５％カゼインを含むホウ酸緩衝液を３００μｇ加えた後、４℃で１５時間静置し、ブロッキングを行った。ブロッキング液を除き、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で各ウエルを洗浄した。
【００８３】
Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（株式会社同仁化学研究所、商標）を用い、本発明のモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６をアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識し、０．５％のカゼインを含むＰＢＳでＡＬＰ標識４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６を１μｇ／ｍＬに希釈した後、ウエルに５０μｇずつ希釈した。そこに、調整した検体試験薬をそれぞれ５０μｇずつウエルに添加した。
【００８４】
これらを３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ １−Ｓｔｅｐ ＰＮＰＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、商標）を１００μｇ添加し、室温で１２０分反応後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６も以上と同様に測定した。
【００８５】
（結果の検討）
【００８６】
【表３】
【００８７】
結果は表３のとおりとなり、添加したＩＭＰ−１発現タンパク質濃度が上がるにつれ、吸光度が下がっており、競合的に反応することが確認できた。ＥＬＩＳＡ競合法を利用した検出装置によって、検体試料液中のＩＭＰ−１を検出することができた。また、同様の手法により検体に菌体の培養物を用いることにより、検体中のＩＭＰを検出することも可能である。
【００８８】
＜実施例２＞
［イムノクロマト競合法による測定］
【００８９】
検体としてＩＭＰ−１発現タンパク質を用い、免疫源のＩＭＰ−１発現タンパク質を固相に用いたイムノクロマト競合法による測定を行った。以下、図１（ｂ）の形態に沿って検出装置の作製方法を示す。
【００９０】
（標識成分の調製）
Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０−２２，１９７３）の方法に従い金コロイド粒子を作製した。この金コロイド１０ｍＬに対し、抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６を４０μｇ室温にて混合し、金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６を調製した。同様に金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６も調製した。
【００９１】
（標識区域１２の調製）
金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６をＯＤ５２０ｎｍ＝１．０となるように調製し、反応確認のために対照として金コロイド標識ウサギγグロブリンをＯＤ５２０ｎｍ＝０．２となるように調製したものを混合し調製液を作製した。
【００９２】
この調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μＬずつそれぞれ塗布した後、凍結乾燥させ、標識区域１２である金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６塗布パッドを調製した。４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６についても同様に金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６塗布パッドを調製した。
【００９３】
（検出区域１４の調製）
ＩＭＰ−１発現タンパク質を１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ緩衝液で調製し、多孔質坦体１３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社）の所定位置に、テスト当たり０．７３μＬでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。
【００９４】
また、検出区域１４の下流側に、抗ウサギ抗体を同様にテスト当たり０．７３μＬで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。乾燥作業を経て、ＩＭＰ−１発現タンパク質抗原固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。
【００９５】
（検出装置の作製）
滴下部１１としてのＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を用い、金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６塗布パッド、ＩＭＰ−１発現タンパク質抗原固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とをそれぞれ重ね合わせ、粘着剤付きの台紙に貼付してイムノクロマト競合法を利用したＩＭＰ検出装置を作製した。同様に４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６の代わりに４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６を用いたＩＭＰ検出装置も作製した。
【００９６】
（検体試料液の調製）
抽出液としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用い、この緩衝液でＩＭＰ−１発現タンパクを１０μｇ／ｍＬとなるように調製し、検体試料液として用いた。対照として、抽出液のみを用いた。
【００９７】
（反応性試験）
作製した２種の検出装置に検体試料液をピペットで１００μＬ滴下した後、１５分後の検出区域１４のライン発色を確認した。
【００９８】
（結果の検討）
【００９９】
【表４】
【０１００】
４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６を用いた検出装置は、検体試料液が抽出液のみの時、検出区域１４に明確なライン発色が現れた。これは、金コロイド標識された４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６が、ニトロセルロースメンブレン上に固相化されたＩＭＰ−１発現タンパク質と特異的に反応したため、そこで結合がおき、検出区域１４で発色したことによる。
【０１０１】
一方、検体試料液にＩＭＰ−１発現タンパク質が存在する場合、検出区域１４にてライン発色は認められなかった。これは、検体試料液中のＩＭＰ−１発現タンパク質が、クロマト的な流動により金コロイド標識された４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６と先に特異的に反応したため、ニトロセルロースメンブレン上に固相化されたＩＭＰ−１発現タンパク質とは反応ができず、検出区域１４で発色ができないことによる。
【０１０２】
金コロイド標識に４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６を用いた検出装置も同様の結果であった。反応系の確認のための対照区域１５はいずれも明確な発色を示した。
【０１０３】
このように、イムノクロマト競合法を利用した検出装置によって、ニトロセルロース上に固相化されたＩＭＰ−１発現タンパク質と検体試料液中のＩＭＰ−１発現タンパク質を競合的に反応させることで、検体試料液中のＩＭＰ−１発現タンパク質を検出することができた。
【０１０４】
検体と抽出液を混合させるだけで検体試料液は容易に作製でき、さらに滴下後、１５分以内で反応性が確認できるため、非常に簡便かつ迅速に検出することができる。また、同様の手法で検体に菌体の培養物を用いることにより、検体中のＩＭＰを検出することも可能である。
【０１０５】
＜実施例３＞
［イムノクロマトサンドイッチ法による測定］
実施例２の（標識成分の調製）と（標識区域１２の調製）と同じ方法で金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６塗布パッドを調製した。
【０１０６】
（検出区域１４の調製）
本発明のモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６を１．０ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ緩衝液で調製し、多孔質坦体１３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社）の所定位置に、テスト当たり０．７３μＬでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。
【０１０７】
また、検出区域１４の下流側に、抗ウサギ抗体を同様にテスト当たり０．７３μＬで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。乾燥作業を経て、抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。
【０１０８】
（検出装置の作製）
滴下部１１としてのＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を用い、金コロイド標識抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６塗布パッドと、抗ＩＭＰモノクローナル抗体４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６固相化メンブレンと、吸液部１６としての濾紙とをそれぞれ重ね合わせ、粘着剤付きの台紙に貼付してイムノクロマトサンドイッチ法を利用したＩＭＰ検出装置を作製した。
【０１０９】
（検体試料液の調製）
緑膿菌のＩＭＰ産生株はＮＣＧＭ２．Ｓ１株を使用した。これをＭＨ寒天培地上にて３７℃の条件下で静置培養した。菌株のコロニーを滅菌された綿棒で１コロニーかきとり、０．７ｍＬの抽出液中で菌体を破砕し、これを検体試料液として用いた。抽出液にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用している。対照として、緑膿菌のＩＭＰ非産生株であるＡＴＣＣ２７８５３株を用いた検体試料液も調製した。
【０１１０】
（反応性試験）
作製した検出装置に検体試料液をピペットで１００μＬ滴下した後、１５分後の検出区域１４のライン発色を確認した。
【０１１１】
（結果の検討）
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
結果は、表５、図２のとおりである。ＩＭＰ非産生緑膿菌検体では、図２（ａ）に示すように、検出区域１４にライン発色が認められなかった。これはＩＭＰが検体試料液に含まれず、本発明のモノクローナル抗体と反応しないためである。
【０１１４】
一方、ＩＭＰ産生緑膿菌検体では、図２（ｂ）に示すように、検出区域１４に明確なライン発色が認められた。これはＩＭＰが検体試料液に含まれているため、金コロイド標識した４Ｅ７−Ｃ／Ｆ６とニトロセルロースメンブレンに固相化された４Ｃ９−Ｃ／Ｆ６がそれぞれＩＭＰと特異的に反応し、検出区域１４でこれらがサンドイッチ的に結合したため発色したことによる。
【０１１５】
イムノクロマトサンドイッチ法を利用した検出装置によって、検体試料液中のＩＭＰを検出することができた。実際の菌株を用いても菌株と抽出液を混合させるのみで、検体試料液は調製することができ、さらに、滴下後１５分以内で反応性が確認できるため、非常に簡便かつ迅速に検出することが実証された。
【０１１６】
＜実施例４＞
［イムノクロマトサンドイッチ法とＰＣＲまたはＳＭＡ法による測定の比較］
緑膿菌２４８株を検体として用いた。
【０１１７】
（イムノクロマトサンドイッチ法を利用したＩＭＰ検出装置での測定）
実施例３の（標識成分の調製）から（検出装置の作製）までと同様の方法でイムノクロマトサンドイッチ法を利用したＩＭＰ検出装置を作製した。
【０１１８】
（検出装置の検体試料液の調製）
緑膿菌２４８株をミューラーヒントン（ＭＨ）寒天培地上にて３７℃の条件下でそれぞれ静置培養した。菌株のコロニーを滅菌された綿棒で１コロニーかきとり、０．７ｍＬの抽出液中で菌体を破砕し、これを検体試料液として用いた。抽出液にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用している。
【０１１９】
（反応性試験）
作製した検出装置に検体試料液をピペットで１００μＬ滴下した後、１５分後の検出区域１４のライン発色を確認した。ライン発色が認められたものを陽性とした。
【０１２０】
（ＳＭＡ法での測定）
メタロ−β−ラクタマーゼＳＭＡ'栄研'（栄研化学株式会社，商標）の説明書に基づき検体の２４８株の緑膿菌株を測定した。すなわち、抗菌薬としてイミペネム（ＩＰＭ）含有のＫＢディスク（栄研化学株式会社，商標）を用いた。ＳＭＡディスクはメタロ−β−ラクタマーゼＳＭＡ'栄研'（栄研化学株式会社，商標）を用いた。ＳＭＡディスクに隣接しているＩＰＭの阻止帯の直径がＩＰＭ単独の阻止帯の直径よりも５ｍｍ以上の拡大を認めたとき、陽性とした。
【０１２１】
（ＰＣＲ法での測定）
ＰＣＲに用いる鋳型ＤＮＡは、菌体ボイル法により抽出した。
【０１２２】
ＰＣＲは以下の２種類のプライマーセットを使用して行った。プライマーセット１を用いることにより、ＩＭＰ−１、ＩＭＰ−３、ＩＭＰ−４、ＩＭＰ−６、ＩＭＰ−７、ＩＭＰ−１０、ＩＭＰ−２５及びＩＭＰ−２６を、プライマーセット２を用いることによりＩＭＰ−４、ＩＭＰ−５、ＩＭＰ−７、ＩＭＰ−９、ＩＭＰ−１１、ＩＭＰ−１５、ＩＭＰ−２１及びＩＭＰ−２６の亜型を検出した。詳細な亜型は、ＰＣＲ検出により得られた増幅断片のダイレクトシークエンスを実施することで決定した。
【０１２３】
［プライマーセット１］
blaIMP-F1:GAAGTTAACGGGTGGGGCG
blaIMP-R1:CTTTAACCGCCTGCTCTAAT
【０１２４】
［プライマーセット２］
blaIMP-F2:GTATTCTTTATGTTTTTGTTTTGTAGCATT
blaIMP-R2:AAGCTTCTAAATTTGCGTCACCCAAATTAC
【０１２５】
（結果の検討）
結果をまとめると次表の通りである。
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
表６において、イムノクロマトサンドイッチ法（本法）の結果とＳＭＡ法との結果を比較すると、本法が陽性でＳＭＡ方が陰性となった２５検体にはＩＭＰ遺伝子があり、本法が陰性で、ＳＭＡ方が陽性となった１検体にはＩＭＰ遺伝子がなかった。そのため、本法が、感度・特異度ともにＳＭＡ法より優れている結果となった。
【０１２９】
表７において、本法とＰＣＲ法との結果を比較すると、陽性１９１株、陰性５７株と、全て一致した。このことにより、本法は感度・特異度よくＩＭＰを検出することが確認できた。さらに陽性１９１株についてはダイレクトシークエンスでの分析の結果、ＩＭＰ−１が１４４株、ＩＭＰ−６が６株、ＩＭＰ−７が２５株、ＩＭＰ−１０が１４株およびＩＭＰ−１１が２株となり、ＩＭＰ−１，ＩＭＰ−６，ＩＭＰ−７，ＩＭＰ−１０およびＩＭＰ−１１が検体中に含まれていることが分かった。同一検体を本法でも検出できているため、実際の緑膿菌体の産生するＩＭＰ亜型にも反応することが認められた。
【０１３０】
ここで、判定するまでの手間や時間を考えると、ＳＭＡ法では培地にまく菌体の量を一定にするため濁度法により調製する必要があり、検体の調製に時間と手間がかかった。さらに、判定のために再度培養に１６時間以上時間を要するため、簡便さや迅速さに欠けてしまう。
【０１３１】
また、ＰＣＲ法では、菌体からＤＮＡの抽出作業を行う必要があり、ＩＭＰの亜型を網羅的に検出しようとすると複数のプライマーを用意する必要がある。さらに、測定の為に、高価な機器や設置場所を必要とするため、こちらも簡便さや迅速さに欠けてしまう。
【０１３２】
しかし、本法は菌体と抽出液を混合させるだけで検体試料液を調製でき、さらに判定は１５分以内と短時間であり、判定もライン発色の有無を目視にて確認できるためより容易に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】（ａ）本発明の一実施の形態における検出装置の側面図、（ｂ）〜（ｃ）本発明の一実施の形態における検出装置の正面図
【図２】（ａ）〜（ｂ）本発明の一実施の形態における検出区域の拡大図
【符号の説明】
【０１３４】
１１ 滴下部
１２ 標識区域
１３ 多孔質担体
１４ 検出区域
１５ 対象区域
１６ 吸液部
Ａ ＩＭＰ−１またはＩＭＰの部分ペプチド
Ｂ モノクローナル抗体標識物
Ｃ 複合体
Ｄ モノクローナル抗体
Ｘ ＩＭＰ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＭＰ−１及びその亜型に対して特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＩＭＰのアミノ酸配列においてＮ末端側１０３番目から１０８番目の６残基に対し特異的に反応する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記６残基がＧＩＥＷＬＮ及びＧＩＧＷＬＮであるＩＭＰの両方に対して特異的に反応する請求項２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＩＭＰのアミノ酸配列においてＮ末端側１１３番目から１２１番目の９残基に対し特異的に反応する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記９残基がＰＴＹＡＳＥＬＴＮ、ＳＴＹＡＳＥＬＴＮ及びＰＴＹＡＳＶＬＴＮであるＩＭＰのいずれに対しても特異的に反応する請求項４記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
ストリップと、
前記ストリップの上流側に配置される滴下部と、
前記ストリップの下流側に配置される吸水ろ紙と、
前記滴下部より前記吸水ろ紙に至る流れ方向下流側に配置され第１の抗体を標識したものを流動可能に保持する塗布部と、
前記塗布部と前記吸水ろ紙との間に配置され第２の抗体が固相される検査部とを備える検査装置であって、
前記第１の抗体と前記第２の抗体の一方は、請求項１記載のモノクローナル抗体であり、前記第１の抗体と前記第２の抗体の他方は、請求項２又は４記載のモノクローナル抗体である検査装置。
【請求項１】
ＩＭＰ−１及びその亜型に対して特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＩＭＰのアミノ酸配列においてＮ末端側１０３番目から１０８番目の６残基に対し特異的に反応する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記６残基がＧＩＥＷＬＮ及びＧＩＧＷＬＮであるＩＭＰの両方に対して特異的に反応する請求項２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＩＭＰのアミノ酸配列においてＮ末端側１１３番目から１２１番目の９残基に対し特異的に反応する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記９残基がＰＴＹＡＳＥＬＴＮ、ＳＴＹＡＳＥＬＴＮ及びＰＴＹＡＳＶＬＴＮであるＩＭＰのいずれに対しても特異的に反応する請求項４記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
ストリップと、
前記ストリップの上流側に配置される滴下部と、
前記ストリップの下流側に配置される吸水ろ紙と、
前記滴下部より前記吸水ろ紙に至る流れ方向下流側に配置され第１の抗体を標識したものを流動可能に保持する塗布部と、
前記塗布部と前記吸水ろ紙との間に配置され第２の抗体が固相される検査部とを備える検査装置であって、
前記第１の抗体と前記第２の抗体の一方は、請求項１記載のモノクローナル抗体であり、前記第１の抗体と前記第２の抗体の他方は、請求項２又は４記載のモノクローナル抗体である検査装置。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−２４０９２３（Ｐ２０１２−２４０９２３Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０９４５６（Ｐ２０１１−１０９４５６）
【出願日】平成２３年５月１６日（２０１１．５．１６）
【出願人】（５１０１９２８０２）独立行政法人国立国際医療研究センター (8)
【出願人】（５９８０３４７２０）株式会社ミズホメディー (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１６日（２０１１．５．１６）
【出願人】（５１０１９２８０２）独立行政法人国立国際医療研究センター (8)
【出願人】（５９８０３４７２０）株式会社ミズホメディー (17)
【Ｆターム（参考）】
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