説明

モノクローナル抗体

【課題】ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに対する新規のモノクローナル抗体を提供する。
【解決手段】ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIの細胞外ドメインに反応し、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIの細胞内ドメインには反応しないモノクローナル抗体が提供される。当該モノクローナル抗体において、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIのナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を行うことが可能な構成が推奨される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はモノクローナル抗体に関し、詳細には、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに対する新規のモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞表面上の膜受容体タンパク質は、細胞外の情報を細胞内へ伝達する極めて重要な働きをしている。そのため、膜受容タンパク質に結合する物質はアゴニスト型医薬品やアンタゴニスト型医薬として候補物質となる。膜受容体タンパク質の中でも特にGタンパク質共役型受容体(G protein-coupled receptor;GPCR)は、現在市販されている低分子医薬品の約半数がこの受容体を標的としているため、医薬品開発において極めて注目を集めている。また、GPCRの約半数は、生体内で機能しているナチュラルリガンドが同定されていないオーファンGPCRであり、ナチュラルリガンドやその類縁化合物が新規医薬品の候補物質として期待されていることから、オーファンGPCRに対するリガンドのスクリーニングも行われている。
【0003】
GPCRは、細胞膜を7回貫通し、そのN末端を細胞外に、C末端を細胞内に向けて存在している。すなわち、GPCRの細胞外ドメインは、N末端ドメイン、細胞外第1ループ、細胞外第2ループ、および細胞外第3ループから構成されている。同様に、GPCRの細胞内ドメインは、細胞内第1ループ、細胞内第2ループ、細胞内第3ループ、およびC末端ドメインから構成されている。
【0004】
アンジオテンシンII受容体タイプI(Angiotensin II receptor type I,以下「AGTR1」と略記することがある。)はGPCRの一種であり、細胞膜を7回貫通する構造を有している。ヒト由来アンジオテンシン受容体タイプI(以下「hAGTR1」と略記することがある。)の1次構造はすでに解明されており、そのN末端ドメイン、各細胞外ドメイン、各細胞内ドメイン、およびC末端ドメインに相当する部位も特定されている。
【0005】
アンジオテンシンII(Angiotensin II;ATII)は8個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、昇圧作用を持つ生理活性物質である。そのためアンジオテンシンIIは高血圧症と密接に関連する。また、AGTR1の遺伝子異常やアンジオテンシンII生成の代謝異常によっては、低血圧症にも関連すると考えられる。
【0006】
AGTR1のアンタゴニストはアンジオテンシンIIが関与する高血圧症の治療薬候補となる可能性があり、いくつかの低分子化合物が拮抗薬としてすでに開発されている(非特許文献1)。また、アンジオテンシンIIはレニン−アンジオテンシン系において、アンジオテンシン変換酵素(ACE)によりアンジオテンシンIから生合成される。そのため、ACEの阻害剤も高血圧症の治療薬としてすでに開発されている(非特許文献2)。
【0007】
一方、低血圧治療薬としてのAGTR1のアゴニスト、すなわち作動薬はあまり知られていない。低血圧症の一般的な治療薬としては、現在、アドレナリンα1受容体作動薬などの昇圧剤が使われている。そして、現状の低血圧治療薬の副作用としては、動悸、めまい、口の渇き、吐き気などの症状が知られている。これらの副作用が低減された低血圧治療薬開発のためには、非常に高い特異性を持ってhAGTR1に結合し、アゴニスト活性を示す化合物を用いることが好ましい。
【0008】
受容体に対する非常に高い特異性を持たせるために、受容体に対する抗体をアンタゴニストまたはアゴニストとして医薬品に応用することも一般に試みられている(アンタゴニスト抗体またはアゴニスト抗体)。AGTR1についても、アゴニスト抗体が低血圧症治療薬となる可能性がある。そして、アゴニスト活性を有するためには、当該抗体が天然(native)状態のAGTR1に反応するものである必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【非特許文献1】モエン(Moen)ら,ドラッグ(Drug),2005年,第65巻,第18号,p2657−2674
【非特許文献2】ソング(Song)ら,クリニカル・ファーマコキネティクス(Clinical Pharmacokinetics),2002年,第41巻,第3号,p207−224
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
しかし、現在市販されているhAGTR1に対する抗体は、いずれもウェスタンブロッティングや固定化組織切片染色に用いるためのものであり、ホルムアルデヒド処理等により変性したhAGTR1に反応するものである。すなわち、これらのhAGTR1に対する抗体は、天然状態のAGTR1に反応するものはなく、もちろんアゴニスト抗体として使用できるものでもない。
【0011】
上記した現状に鑑み、本発明は、新たな医薬品開発等に有用なヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプ1に対する新規のモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、分子シャペロンの一種であるシャペロニンをコードする遺伝子とヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIをコードする遺伝子との融合遺伝子を用いて、ラットに遺伝子免疫を施し、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに対する免疫応答を誘導した。そして、当該ラットの脾臓細胞とミエローマとを融合させてハイブリドーマの集団を作製し、hAGTR1の細胞外ドメインを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを検索した。その結果、2種のクローンを選抜することに成功した。そして、当該ハイブリドーマから所望のモノクローナル抗体を取得することに成功し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下のとおりである。
【0013】
請求項1に記載の発明は、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIの細胞外ドメインに反応し、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIの細胞内ドメインには反応しないモノクローナル抗体である。
【0014】
本発明のヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに対するモノクローナル抗体(以下、「抗hAGTR1モノクローナル抗体」と略記することがある。)は、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIの細胞外ドメインに特異的に反応するものであり、細胞内ドメインには反応しない。本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに対するアンタゴニスト抗体やアゴニスト抗体として有用であり、当該受容体に関係する疾病の治療薬開発に有用である。また、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに関係する疾病の診断や、当該受容体の免疫測定法の構築にも有用である。
【0015】
請求項1に記載のモノクローナル抗体において、ラット由来のものである構成が推奨される(請求項2)。
【0016】
請求項2に記載のモノクローナル抗体において、以下の性質を有する構成が推奨される(請求項3)。
(a)サブクラス:IgG2a
(b)軽鎖:κ鎖
【0017】
請求項4に記載の発明は、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を行うことが可能な請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体である。
【0018】
かかる構成により、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに対するアゴニストとして使用可能なモノクローナル抗体が提供される。
【発明の効果】
【0019】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに関係する疾病の治療薬開発に有用である。また、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに関係する疾病の診断や、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIの免疫測定法の構築にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】hAGTR1遺伝子導入細胞とAGTR1−r01との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図2】hAGTR1遺伝子導入細胞とAGTR1−r03との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図3】対照の細胞とAGTR1−r01との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図4】対照の細胞とAGTR1−r03との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図5】各モノクローナル抗体におけるCa2+シグナル強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0021】
前述したように、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプI(hAGTR1)はGタンパク質共役型受容体(GPCR)の一種であり、細胞膜を7回貫通し、そのN末端を細胞外に、C末端を細胞内に向けて存在している。hAGTR1をコードする遺伝子(cDNA)はすでに単離されており、hAGTR1のアミノ酸配列も知られている。配列番号1にhAGTR1遺伝子の塩基配列を、配列番号2にhAGTR1アミノ酸配列のみを示す。
【0022】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIの細胞外ドメインに反応し、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIの細胞内ドメインには反応しないものである。本発明のモノクローナル抗体を製造する方法としては、公知の方法をそのまま採用することができ、例えばケーラーとミルシュタインの細胞融合法を基礎として製造することができる。概説すれば、hAGTR1に対する免疫応答が誘導されたマウスやラット等の動物の脾臓細胞とミエローマとを融合してハイブリドーマの集団を作製し、該ハイブリドーマの集団から所望のモノクローナル抗体を産生するものを選抜する。そして、選抜したハイブリドーマを培養し、その培養物から所望のモノクローナル抗体を単離・精製することができる。
【0023】
hAGTR1に対する免疫応答を誘導する方法としては、動物にhAGTR1(タンパク質)を接種する一般的なタンパク免疫の手法によってもよいが、動物にhAGTR1遺伝子を投与する遺伝子免疫の手法が好ましく用いられる。
【0024】
遺伝子免疫によれば、hAGTR1の全長をコードする遺伝子を用いることにより、抗原となる発現したhAGTR1が、動物体内で天然(native)の状態で存在できるので、hAGTR1の立体構造に特異的な免疫応答を誘導することが可能となる。また遺伝子免疫の手法によれば、hAGTR1遺伝子さえ入手できれば実施可能であり、精製されたhAGTR1を準備する必要がない。
【0025】
より好ましくは、動物に接種する遺伝子として、シャペロニンをコードする遺伝子とhAGTR1をコードする遺伝子との融合遺伝子を用いる。当該融合遺伝子を免疫原として用いることにより、hAGTR1遺伝子を単独で用いる場合よりも免疫応答をより選択的に誘導することができる。当該融合遺伝子を用いた遺伝子免疫の方法については、国際公開第2006/041157号パンフレットにその詳細が記載されている。
【0026】
シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、バクテリア、古細菌、真核生物等の全ての生物に存在している。特に、バクテリアの細胞質、真核細胞のミトコンドリア、葉緑体に多量に存在している。シャペロニンは、タンパク質の折り畳みを促進する活性やタンパク質の変性を阻止する活性を有する。シャペロニンは、分子量約6万のシャペロニンサブユニット(HSP60ともいう)7〜9個からなるリング状構造体が2個重なった、総分子量80万〜100万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。シャペロニンはそのリング状構造体の内部に空洞を有しており、その空洞内に折り畳み途中のタンパク質や変性したタンパク質を一時的に収納して複合体を形成する。そして、空洞内で収納したタンパク質を正しく折り畳み、続いて空洞から正しく折り畳まれたタンパク質を放出することが知られている。
【0027】
シャペロニンは、バクテリアや真核生物のオルガネラにみられるグループI型と、真核生物や古細菌にみられるグループII型に分類される。本発明のモノクローナル抗体を製造する際に行う遺伝子免疫において、前記した融合遺伝子を用いる場合には、グループI型とグループII型のいずれのシャペロニン遺伝子を採用してもよい。グループI型シャペロニンの代表例としては、大腸菌由来のGroELが挙げられる。グループII型シャペロニンの代表例としては、古細菌由来のTCPが挙げられる。GroELサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号3に示す。
【0028】
ここで「シャペロニンをコードする遺伝子(シャペロニン遺伝子)」には、シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子(シャペロニンサブユニット遺伝子)に加え、複数のシャペロニンサブユニットがタンデムに連結された「シャペロニンサブユニット連結体」をコードする遺伝子を含む。シャペロニンサブユニット連結体をコードする遺伝子は、複数のシャペロニンサブユニット遺伝子がタンデムに連結された遺伝子と同じである。なお、シャペロニンサブユニット連結体は、天然のシャペロニンと同様のリング状構造体を形成することができる。
【0029】
前記融合遺伝子の作製方法としては、例えば、hAGTR1遺伝子とシャペロニン遺伝子とをライゲーション反応によって連結すればよい。なお、融合遺伝子を動物に投与する際には、融合遺伝子が発現ベクターに組み込まれ、プロモーターの制御下にある状態で投与することが好ましい。発現ベクターの例としては、pCI、pSI、pAdVantage、pTriEX、pKA1、pCDM8、pSが挙げられる。また、発現ベクター上のプロモーターの例としては、CMVプロモーター、AMLプロモーター、SV40プロモーター、SRαプロモーター、EF−1αプロモーター等が挙げられる。さらに、発現ベクターには、プロモーター活性を増強するエンハンサーを含めてもよい。またさらに、発現ベクターには、CpGモチーフを含めてもよい。
【0030】
融合遺伝子を動物に投与する方法としては、例えば、皮内注射、皮下注射、筋肉注射、静脈注射等が挙げられる。またパーティクルガンによる投与も適用可能である。また投与量としては、用いる発現ベクターやプロモーターの種類等に応じて適宜決定すればよいが、1回当たりおおむね1〜3mg/kg体重で、これはラットの場合は125〜500μg/回になる。また投与の回数は、1回でもよいが、一定間隔をおいて複数回行う方がより高い免疫応答を誘導することができる。
【0031】
なお、タンパク免疫によって動物に免疫応答を誘導する場合には、一般的に行われている方法をそのまま採用することができる。例えば、精製したhAGTR1を用意し、アジュバントとの混合液を調製する。この混合液をマウスやラット等に皮下注射し、hAGTR1に対する免疫応答を誘導する。必要に応じて、間隔をあけて複数回投与し、追加免疫してもよい。
【0032】
免疫される動物としては特に限定はないが、例えば、ラットが用いられる。これにより、ラット由来のモノクローナル抗体を得ることができる。その他、マウス、ニワトリ、ウサギ等の動物を用いることができる。
【0033】
前述したように、ハイブリドーマの作製は、ケーラーとミルシュタインの方法によって行うことができる。すなわち、上記した手順で遺伝子免疫あるいはタンパク免疫され、hAGTR1に対する免疫応答が誘導された動物から脾臓を摘出し、脾臓細胞を採取する。そして、脾臓細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマの集団を作製する。ハイブリドーマの選抜は、例えば、HAT選択培地を用いて行うことができる。
【0034】
さらに、hAGTR1の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体を産生しているハイブリドーマの選抜は、例えば、フローサイトメトリーによって行うことができる。例えば、候補となるハイブリドーマの培養上清について、hAGTR1を細胞膜上に発現している細胞(hAGTR1発現細胞)に対する結合性を調べることにより、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜することができる。またさらに、アゴニスト活性を有無については、例えば、hAGTR1発現細胞に対してハイブリドーマの培養上清を接触させた際の、細胞内Ca2+濃度の上昇の有無をもって調べることができる。
【0035】
ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法により行うことができる。
【0036】
以上のようにして、所望の性質を有する抗hAGTR1モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜ならびにクローニングすることができる。
【0037】
そして、選抜ならびにクローニングされたハイブリドーマを培養することにより、前記の性質を有する抗hAGTR1モノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマの培養は、動物の腹腔内で行ってもよく、ディッシュ等を用いてインビトロで行ってもよい。動物の腹腔内でハイブリドーマを培養する場合には、腹水を採取し、その腹水からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。インビトロで培養する場合には、その培養液からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。
【0038】
モノクローナル抗体の精製については、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて行うことができる。モノクローナル抗体のサブクラスがIgGである場合には、プロテインAを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。
【0039】
本発明のモノクローナル抗体は、種々の用途に使用できる。例えば、hAGTR1に対するアゴニストとして、医薬品開発に応用することができる。すなわち、hAGTR1が有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達活性を用いることにより、低血圧症治療に応用することができる。また、本発明のモノクローナル抗体の相補性決定領域(CDR)を特定し、キメラ化あるいはヒト化すれば、より安全性が高い医薬品とすることができる。また本発明のモノクローナル抗体は、低分子医薬のスクリーニング用試薬、心筋症・高血圧症検査試薬、組織切片・細胞等を用いたAGTR1局在検証用研究試薬、組換えAGTR1発現細胞調製用検査試薬、AGTR1の結晶構造解析用研究試薬、等の用途にも使用できる。
【0040】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【0041】
(1)ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプI遺伝子の単離
ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプI(hAGTR1)の遺伝子を、NCBIのACCESSION番号NM_000685の情報に基づいて、人工遺伝子合成(GenScript社)にて取得した。人工合成したhAGTR1遺伝子を鋳型とし、配列番号4及び5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてPCRを行い、配列番号1に示す塩基配列を有するhAGTR1遺伝子を含むDNA断片(以下、「DNA断片A」と称する。)を増幅した。DNA断片Aには、プライマーに由来して、5’末端にNheIサイト、3’末端にSalIサイトが導入された。また、同様にして配列番号4及び6に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてPCRを行い、配列番号1に示す塩基配列を有するhAGTR1遺伝子を含むDNA断片(以下、「DNA断片B」と称する。)を増幅した。DNA断片Bには、プライマーに由来して、5’末端にNheIサイト、3’末端に停止コドンをコードする配列及びSalIサイトが導入された。
【0042】
(2)GroELサブユニット遺伝子の単離
大腸菌HMS174(DE3)株(ノバジェン社)からゲノムDNAを抽出・精製した。次に、精製したゲノムDNAを鋳型とし、配列番号7及び8に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてPCRを行い、配列番号3に示す塩基配列を有するGroELサブユニット遺伝子を含むDNA断片(以下、「DNA断片C」と称する。)を増幅した。DNA断片Cには、プライマーに由来して、5’末端にSalIサイト、3’末端に2個の停止コドン(TAATAG)をコードする配列及びNotIサイトが導入された。
【0043】
(3)hAGTR1とGroELサブユニットとの融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vector(プロメガ社)を制限酵素NheIとSalIで消化し、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ(BAP)にて末端を脱リン酸化処理した後、上記(1)で調製したDNA断片Aを挿入した。さらに、この発現ベクターをSalIおよびNotIで消化し、BAPにて末端を脱リン酸化処理した後、上記(2)で調製したDNA断片Cを挿入し、ベクターpCI−hAGTR1・GroELを構築した。すなわち、ベクターpCI−hAGTR1・GroELは、hAGTR1をコードする遺伝子とGroELサブユニットをコードする遺伝子との融合遺伝子を有している。一方、同様にして、哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vectorを制限酵素NheIとSalIで消化し、BAPにて末端を脱リン酸化処理した後、上記(1)で調製したDNA断片Bを挿入し、ベクターpCI−hAGTR1を構築した。すなわち、ベクターpCI−hAGTR1はhAGTR1遺伝子のみを有している。
【0044】
(4)hAGTR1安定発現細胞の作製
(3)で構築したpCI−hAGTR1・GroELを鋳型とし、SalIおよびNotIで消化し、hAGTR1遺伝子を含むDNA断片を得た。このDNA断片をpCIneo(Promega社)のNheI−NotIサイトに導入し、pCIneo−hAGTR1を構築した。
【0045】
Lipofectamin溶液37.5μLと、OPTI−MEMI培地625μLと、20μgのpCIneo−hAGTR1を含むOPTI―MEMI培地625μLとを混和した。この混和液を用いて、pCIneo−hAGTR1を2×105個のCHO−K1細胞(大日本住友製薬社)に導入した。対照として、pCIneo1のみをCHO−K1細胞に導入した。遺伝子が導入された各CHO−K1細胞を、Ham’sF12K+10%FBS培地(ICN社)にて30時間培養した。さらに、各細胞を剥離、懸濁し、100mmディッシュに5×105個を播き、抗生物質G418(プロメガ社)を0.8mg/mLの濃度で含有するHam’sF12K+10%FBS培地で2週間薬剤処理を行なった。薬剤処理後、限界希釈法により、抗生物質耐性細胞をクローニングした。クローニングした各CHO−K1細胞を、さらに、2×104個/100μLの初期細胞濃度にて、96穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養終了後、10-6〜10-12Mの濃度範囲内のアンジオテンシンII(ペプチド研究所)によって各細胞を刺激したところ、細胞内のCa2+濃度が一過的に上昇した。Ca2+濃度は、Ca2+シグナル解析装置(FLIPR;Molecular Devices社)及び細胞内Ca2+染色キット(Ca3kit;Molecular Devices社)を用いて測定した。このことから、活性型hAGTR1が、CHO−K1細胞膜上に正常に安定発現していることを確認した。
【0046】
(5)遺伝子免疫
生理食塩水にベクターpCI−hAGTR1・GroELを250μg/mLの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、8週齢のラットLEW(雌)の両足大腿筋に各0.6mLずつ注射を行い、免疫した(0日目)。これにより、pCI−hAGTR1・GroELを両足に各75μgずつ、すなわち、1匹につき1回あたり150μg投与した。その後、7日目、21日目、及び28日目にも同様に繰り返し免疫した。そして、0、7、14、21、28、35、42日目に採血を行い、血清を調製した。
【0047】
(6)フローサイトメトリー法を用いたhAGTR1発現細胞に対する血清の結合評価
pCIneo−hAGTR1が導入され安定発現を確認したCHO−K1細胞(以下、「hAGTR1遺伝子導入細胞」と称する。)、pCIneoが導入されたCHO−K1細胞(対照の細胞)をPBSで洗浄した。免疫後35日目の血清を500倍希釈し、各細胞と一緒にインキュベートした。さらに、各細胞をPBSで洗浄し、2次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスIgG抗体(ベックマンコールター社)を添加した後、フローサイトメーターFACScalibur(ベクトンディッキンソン社)を用いて、各細胞と血清中の抗hAGTR1抗体との相互作用を解析した。
【0048】
その結果、免疫したラット群において、遺伝子免疫前の血清ではフィコエリスリン蛍光の平均値が2.4であり、遺伝子免疫後の血清では平均値が45.1と検出された個体の存在を確認した。これは、免疫後の血清中の抗hAGTR1抗体がhAGTR1遺伝子導入細胞に結合することを示していた。
【0049】
(7)抗hAGTR1モノクローナル抗体の作製
上記(6)の段階で血清の力価向上が確認されたラット1匹に対して追加免疫を行った。追加免疫の3日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。PEG法により、1×108個の脾細胞と、1×107個のBALB/Cマウス由来のHAT選択性のミエローマSP2/0細胞とを融合した(細胞融合)。融合した細胞(ハイブリドーマ)の集団をRPMI培地に懸濁し、96穴マイクロプレート14枚の各穴に播種した。この段階で、1082種のハイブリドーマが得られた。
【0050】
細胞融合の翌日から2週間、3日に1度の頻度で、上記マイクロプレート内の培地をHAT Media Supplement(50×)(Sigma社、品番:H0262)を添加したRPMI培地に置き換えた。
【0051】
上記(6)と同様のフローサイトメトリーによって抗体結合評価を行い、hAGTR1遺伝子導入細胞と各穴のハイブリドーマ培養上清中の抗体との結合性を調べた。その結果、2穴において抗体との結合性が確認された。
【0052】
抗体との結合性が確認された2種のハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングを行った。すなわち、2種のハイブリドーマについて96穴マイクロプレートに細胞が1個以下/穴になるように播種し、培養した。2週間後、同様にフローサイトメトリーを用いた抗体の結合評価を行い、クローニングされた培養上清中の抗体(抗hAGTR1モノクローナル抗体)の結合性を確認した。その結果、抗hAGTR1モノクローナル抗体を産生する2種のハイブリドーマがクローニングされた。
【0053】
各ハイブリドーマについてRPMI培地100mL内でフラスコ培養を2週間行った。各培養上清を、プロテインGカラム(アマシャムバイオサイエンス社)に供して精製・濃縮し、精製された2種の抗hAGTR1モノクローナル抗体を各々約2mg得た。
【0054】
各々の抗hAGTR1モノクローナル抗体について、以下に示す試験を行った。それらの結果から、得られた2種の抗AGTR1モノクローナル抗体は、いずれもアゴニスト活性を有することがわかった。これら2種の抗AGTR1モノクローナル抗体を、それぞれクローン番号AGTR1−r01及びAGTR1−r03とした(以下、クローン番号AGTR1−r01とAGTR1−r03の抗hAGTR1モノクローナル抗体を、それぞれ「AGTR1−r01」、「AGTR1−r03」と略記することがある。)。AGTR1−r01とAGTR1−r03についての試験手順とその結果を順次示す。
【0055】
(8)フローサイトメトリーによるhAGTR1に対する結合性評価
AGTR1−r01とAGTR1−r03のPBS溶液(濃度10μg/mL;以下、「AGTR1−r01溶液」、「AGTR1−r03溶液」と称する。)を調製した。一方、hAGTR1遺伝子導入細胞、および対照の細胞をそれぞれPBSで洗浄した後、AGTR1−r01溶液、AGTR1−r03溶液を各細胞と共にインキュベートした。さらに、各細胞をPBSで洗浄し、2次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスIgG抗体(ベックマンコールター社)を添加した後、フローサイトメーターFACScalibur(ベクトンディッキンソン社)を用いて、各細胞とAGTR1−r01または、AGTR1−r03との相互作用を解析した。結果を図1〜4に示す。図1はhAGTR1遺伝子導入細胞とAGTR1−r01との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図2はhAGTR1遺伝子導入細胞とAGTR1−r03との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図3は、対照の細胞とAGTR1−r01との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図4は、対照の細胞とAGTR1−r03との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図1〜4において、縦軸は細胞数、横軸はフィコエリスリン(PE)由来の蛍光強度を表す。また、2つのエリア(R1、R2)のうち、R2(右領域)に属する細胞がAGTR1−r01または、AGTR1−r03と結合した細胞を表す。
【0056】
その結果、hAGTR1遺伝子導入細胞を用いた場合は、R2のエリアに多くの細胞が検出された(図1、図2)。これは、AGTR1−r01およびAGTR1−r03がhAGTR1遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、対照の細胞を用いた場合(図3、図4)は、図1,図2におけるR2に相当するエリアにはほとんど細胞が検出されなかった。これは、hATAGTR1−r01およびAGTR1−r03が、hAGTR1発現細胞の対照の細胞には結合しないことを示していた。以上のことから、AGTR1−r01およびAGTR1−r03が細胞上に発現するhAGTR1、すなわち、天然状態のhAGTR1の細胞外ドメインを特異的に認識するものであることが示された。
【0057】
(11)細胞内Ca2+シグナル伝達活性(アゴニスト活性)評価
hAGTR1遺伝子導入細胞を、2×104個/100μLの初期細胞濃度にて、96穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養した各穴に2.5×10-7MのAGTR1−r01を添加した。また同様にして、5×10-7MのAGTR1−r03を添加した。さらに対照として、非免疫のラット血清からプロテインGカラムで精製したラットIgG(陰性対照)を5×10-7Mの濃度で添加した。添加した後、各細胞が抗体によって刺激された際の細胞内Ca2+濃度の一過的上昇度を測定した。測定はN=3で実施した。Ca2+濃度変化測定は、Ca2+シグナル解析装置(FLIPR;Molecular Devices社)及び細胞内Ca染色キット(Ca3kit;Molecular Devices社)を用いて行った。結果を図5に示す。図5は、各モノクローナル抗体におけるCa2+シグナル強度を示すグラフである。図5に示す様に、AGTR1−r01とAGTR1−r03のいずれにおいてもカルシウムシグナルの上昇が見られた。
以上より、AGTR1−r01とAGTR1−r03は、いずれも、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達(アゴニスト活性)を行えるものであることが示された。
【0058】
(12)アイソタイプ解析
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(GEヘルスケア社)を用いて、AGTR1−r01およびAGTR1−r03のアイソタイプを決定した。その結果、AGTR1−r01およびAGTR1−r03ともサブクラスはIgG2a、軽鎖はκ鎖であった。
【0059】
なお、AGTR1−r01、AGTR1−r03と同様の性質を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、上記(5)〜(7)の操作を行うことにより、再現性をもって取得することができる。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIの細胞外ドメインに反応し、ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIの細胞内ドメインには反応しないモノクローナル抗体。
【請求項2】
ラット由来のものである請求項1に記載のモノクローナル抗体。
【請求項3】
以下の性質を有する請求項2に記載のモノクローナル抗体。
(a)サブクラス:IgG2a
(b)軽鎖:κ鎖
【請求項4】
ヒト由来アンジオテンシンII受容体タイプIが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を行うことが可能な請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【公開番号】特開2011−111422(P2011−111422A)
【公開日】平成23年6月9日(2011.6.9)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−270432(P2009−270432)
【出願日】平成21年11月27日(2009.11.27)
【出願人】(000002174)積水化学工業株式会社 (5,781)
【Fターム(参考)】