ラクトフェリン加水分解物の製造方法
【課題】苦味が少なく、抗原性が低いラクトフェリン加水分解物の製造方法、および製造された加水分解物を提供する。
【解決手段】ラクトフェリンを、全蛋白質に対して８０質量％以上のキモシンを含有する酵素組成物により、ｐＨ２〜３、反応温度が３５〜５５℃、及び反応時間が６〜２４時間の条件で加水分解することにより、ラクトフェリンに比べて抗原性が０．１％（１／１０００）以下であるラクトフェリン加水分解物を製造する方法。
【解決手段】ラクトフェリンを、全蛋白質に対して８０質量％以上のキモシンを含有する酵素組成物により、ｐＨ２〜３、反応温度が３５〜５５℃、及び反応時間が６〜２４時間の条件で加水分解することにより、ラクトフェリンに比べて抗原性が０．１％（１／１０００）以下であるラクトフェリン加水分解物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、苦味が少なく、抗原性が低いラクトフェリン加水分解物の製造方法、および当該製造方法によって提供されるラクトフェリン加水分解物に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品蛋白質の機能特性の新たな発現や改良の手段の一つとして蛋白質加水分解酵素（プロテアーゼ）や酸を用いた限定加水分解（断片化）が行なわれている。この様にして得られたペプチドは、消化吸収の観点から、遊離アミノ酸混合物よりも吸収速度及び吸収後のアミノ酸バランスにおいて優れていることが明らかにされている（非特許文献１）。しかしながら、限定加水分解（断片化）により苦味、えぐ味のある苦味ペプチドが生成し、呈味性の悪い、嗜好性に難のある素材になることが指摘されており、アミノ酸遊離率の極端に低い分解物は特に苦味を呈する場合が多く、摂取するときの障害となることがある。そのために利用が制限されているのも事実である。
一方、食餌蛋白質に起因するアレルギー患者が急増し、特に乳児においては、例えば乳清蛋白質、特にβ−ラクトグロブリンに起因するアレルギーが多発していることが明らかになっており（非特許文献１）、食品中の抗原性物質の低減や、蛋白質・ペプチドにおける抗原性の実質的除去が求められている。
このように、苦味等の不快味や抗原性が抑制され、食品加工において有用なペプチド素材の開発が待望されている。
【０００３】
ラクトフェリンは、哺乳動物の乳汁、唾液、涙、精液、種々の粘液等に存在する、非ヘム鉄結合糖蛋白質であり、鉄吸着作用、細胞増殖促進作用、免疫調節作用、および抗菌作用を有する多機能蛋白質である。牛ラクトフェリンは、乳業工場で日常的に取扱う生脱脂乳またはチーズ・ホエーから容易に、かつ大量に得ることができ、商品として直ちに利用することができる。
【０００４】
そして、ラクトフェリンを加水分解して得られるラクトフェリン加水分解物や、ラクトフェリン中の特定のアミノ酸配列を有するラクトフェリンペプチド、例えばラクトフェリシン（本出願人による登録商標）は、抗菌活性（特許文献１、非特許文献２）やチロシナーゼ活性（特許文献２）、アポトーシス誘導剤（特許文献３）、経口がん転移抑制剤（特許文献４）、肝機能改善剤（特許文献５）等の多くの生理活性が知られている。
【０００５】
このようにラクトフェリン加水分解物やラクトフェリンペプチドは、化学物質および化学的に合成されたアミノ酸誘導体を含まない天然物由来のペプチドであるから、人および動物に対して健康的であり、かつ安全である。したがって、ラクトフェリン加水分解物やラクトフェリンペプチドは安全な、かつ有効な医薬、食品、飼料等として例えば、点眼剤、口腔剤、化粧品、皮膚剤、乳幼児用食品、臨床用食品、機能性食品、ペット用製品等の多種多様な商品に利用でき、極めて大きな価値を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平９−１２４５０４号公報
【特許文献２】特開平５−３２００６８号公報
【特許文献３】特開平１０−４５６１８号公報
【特許文献４】特開平１０−５９８６４号公報
【特許文献５】国際公開第００／０６１９２号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】酪農科学・食品の研究、第３９巻、第Ａ−２８３ページ、１９９０年
【非特許文献２】アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Antimicrobial Agents and Chemotherapy）、第４１巻、第１号、１９９７年、第５４−５９ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、苦味が少なく、抗原性が低い（低アレルゲン化）ラクトフェリン加水分解物の製造方法、および当該製造方法によって提供されるラクトフェリン加水分解物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、医薬品、食品、飼料等の様々な分野に利用が可能であるラクトフェリン加水分解物を提供する上で、従来より課題となっていたペプチドによる苦味の問題を克服することを課題として研究を進めた。そして、機能性と共に良好な風味を有する食品分野への適用を図るべく、鋭意検討を重ねた結果、蛋白質加水分解酵素の一種であるキモシンを含有する酵素組成物を用いてラクトフェリンを加水分解することにより、従来に比して顕著に苦味が低減され、かつ抗原性も低く抑えられたラクトフェリン加水分解物が得られることを知見した。
【００１０】
本願の第一の発明は、ラクトフェリンに比べて抗原性が０．１％以下のラクトフェリン加水分解物の製造方法であって、ラクトフェリンを、全蛋白質に対して８０質量％以上のキモシンを含有する酵素組成物により、ｐＨ２〜４、反応温度が３５〜５５℃、及び反応時間が６〜２４時間の条件で加水分解する工程を含む方法である。
【００１１】
上記方法は、抗原性が、ラクトフェリンを標準物質として、抗ラクトフェリン抗体を用いた免疫測定法により測定されるラクトフェリンの濃度として評価されることを好ましい態様としている。
また、上記方法は、酵素組成物の量が、ラクトフェリンの質量に対して、蛋白質の量として０．００１〜５％の範囲であることを好ましい態様としている。
【００１２】
また、本願の第二の発明は、前記第一の発明で特定される製造方法によって製造されるラクトフェリン加水分解物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の製造方法によって製造されるラクトフェリン加水分解物は、口に含んでも苦味が少ないので、食品に添加した場合に食品全体の風味に影響を与えず、また抗原性も低く抑えられているので、ラクトフェリンペプチドが有する様々な生理活性を付与した機能性飲食品の製造に適した原料素材として提供することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
【００１５】
本発明において、出発物質として使用するラクトフェリンは、市販のラクトフェリン、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオン交換クロマ
トグラフィー等）により分離したラクトフェリン、それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポラクトフェリン、アポラクトフェリンを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせた金属飽和ラクトフェリン、又はこれらの混合物である（以下、これらをまとめてＬＦと記載することがある。）。
【００１６】
本発明によるラクトフェリン加水分解物（以下、「ＬＦ加水分解物」と記載することがある）は、前記ラクトフェリンをキモシンを含有する酵素組成物で加水分解することによって得られるものである。
前記酵素組成物によりラクトフェリンを加水分解する場合には、ラクトフェリンを０．５〜２０質量％、望ましくは２〜１５質量％の濃度で水、精製水、生理食塩水、緩衝液等に溶解してラクトフェリン（ＬＦ）溶液を調製し、当該ＬＦ溶液のｐＨを２〜４、好ましくは２．５〜３．５、特に好ましくは３に調整する。その後、キモシンを含有する酵素組成物を添加して加水分解を行う。
【００１７】
ラクトフェリンの加水分解に使用される酵素組成物は、同組成物に含まれる蛋白質全量に対してキモシン（Chymosin 、Enzyme Code： 3.4.23.4）を８０質量％以上含有してい
ればよく、含有するキモシン以外の成分に特に制限はなく、他の蛋白質分解酵素が含まれていてもよい。このような蛋白質分解酵素としては、ペプシン、又は、微生物、例えばアスペルギルス属等の糸状菌由来の蛋白質加水分解酵素等が挙げられる
キモシンは、哺乳動物の胃で作られる消化酵素の混合物から単離精製されたキモシン標品、又は粗精製品を使用することが可能であり、遺伝子組換え法により製造された組換え体キモシンを使用しても良い。
【００１８】
なお、本発明においてはキモシンを含有する酵素組成物に含まれるキモシン含量は、蛋白質全量に対して８０質量％以上が好ましく、８４質量％以上がさらに好ましく、８８質量％以上がより好ましく、９２質量％が特に好ましい。また、キモシンを含有する酵素組成物に含まれる蛋白質が、すべてキモシンで構成されるもの、すなわち、キモシン１００質量％の酵素組成物であっても良い。酵素組成物は、蛋白質以外の成分、例えば水分、糖類等を含んでいてもよい。
【００１９】
また、キモシンを含有する酵素組成物としては、キモシン含量が８０質量％以上である限り、哺乳動物の胃で作られる消化酵素の混合物、すなわち、レンネット（凝乳酵素）を使用することが可能である。この場合、仔牛由来のカーフレンネット（通常、キモシン８８〜９４質量％とペプシン６〜１２質量％をそれぞれ含有する）を使用することが好ましい。
【００２０】
加水分解に使用する酵素組成物の量は、基質であるラクトフェリンの質量に対して、蛋白質の量として０．００１〜５％の範囲であることが好ましく、０．０１〜４％の範囲であることがより好ましく、特に、０．１〜３％の範囲であることが好ましい。
【００２１】
（ラクトフェリン加水分解物の製造方法）
本発明の方法によりラクトフェリンを加水分解するにあたっては、ラクトフェリン（ＬＦ）溶液は酵素反応処理を行う前に、塩酸、クエン酸、酢酸等の酸によりｐＨを２〜４、好ましくは２．５〜３．５の範囲に調製されるが、ｐＨ３であることが特に好ましい。
例えば、ｐＨを３に調整したＬＦ溶液は、前記キモシンを含有する酵素組成物を所望の量で添加した後、酵素反応の温度を３５〜５５℃、好ましくは４０〜５０℃、より好ましくは４２〜４８℃に保持して、６時間〜２４時間、好ましくは１２〜１８時間、攪拌しながらラクトフェリンを加水分解させる。
次いで、例えば反応溶液を８０℃に昇温して１０分間維持し、酵素を加熱失活させる。さらに、好ましくは、水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を添加して、ｐＨを５〜７
、例えば６に調整する。
なお、ｐＨ調整後の反応溶液（ラクトフェリン加水分解物）は、溶液のままでもよいが、凍結乾燥等を行って粉末化することが好ましい。また、ラクトフェリン分解物は、クロマトグラフィー、又は限外濾過等により、分画したものを用いることもできる。
【００２２】
上記のようにして得られるラクトフェリン加水分解物は、ラクトフェリン（ラクトフェリン加水分解物と同質量の未分解のラクトフェリン）に比べて抗原性が０．１％（１／１０００）以下である。抗原性は、例えば、抗ラクトフェリン抗体に対する反応性により評価することができる。抗ラクトフェリン抗体に対する反応性は、抗ラクトフェリン抗体を用いた免疫測定法、例えばＥＬＩＳＡ法（Enzyme-linked immunosorbent assay）により
測定されるラクトフェリン濃度として測定することができる。ラクトフェリン濃度は、既知量のラクトフェリンを標準物質として作成した標準曲線を用いて測定することができる。抗ラクトフェリン抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。ＥＬＩＳＡ法の詳細については、後述する。
また、上記のようにして得られるラクトフェリン加水分解物は、他の蛋白質分解酵素、例えばペプシンを用いて得られるラクトフェリン加水分解物に比べて苦味が少ない。
【００２３】
以下に、抗原性及び苦味を評価する具体的な方法を例示する。
（抗原性試験）
抗原性試験は、通常の免疫測定法を採用することができるが、例えば、酵素免疫測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ、川瀬興三他、東邦医会誌、３５巻 ５０６頁、１９８９年）に準じて、ラクトフェリンを対照として行い、ラクトフェリン抗体に対するラクトフェリン加水分解物の反応性として評価することができる。
【００２４】
具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡ法に使用する試薬等の調製、及びそれらを用いた測定は以下のようにして行うことができるが、これらに限定されず、適宜改変することができる。
【００２５】
１）洗浄液
ダルベッコＰＢＳ（DULBECCO'S PBS：Phosphate Buffer Saline）溶液（DULBECCO'S PBS TABLET（ＤＳ ＰＨＡＲＭＡ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ社製、DSBN200）１００錠を１Ｌ
のミリＱ水に溶解したもの）１Ｌに対し、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（polyoxyethylene sorbitan monolaurate））を５ｍＬ添加して、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ １０倍濃縮液を調製した。当該Ｔｗ
ｅｅｎ−ＰＢＳ １０倍濃縮液を、ミリＱ水でさらに１０倍希釈したものを洗浄液とする
。
【００２６】
２）ブロック液
REAGENT DILUENT CONCENTRATE 2（10X）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、DY995）を、
２．２μｍフィルターで濾過したミリＱ水で１０倍に希釈したものをブロック液とする。
【００２７】
３）一次抗体液
抗ウシ・ラクトフェリン・ヤギ抗体（Goat anti-Bovine Lactoferrin affinity Purified 1.0 mL @ 1.0 mg/mL）（Ｂｅｔｈｙｌ社製、A10-126A）１ｍｌを、ＰＢＳ溶液（ｐＨ
７．２）（ギブコ社製、20012）にて４，０００倍に希釈した溶液を一次抗体液とする。
【００２８】
４）希釈液
前記Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ１０倍濃縮液と、前記ブロック液と、ミリＱ水とを、それぞれ、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ１０倍濃縮液：ブロック液：ミリＱ水＝１：１：８、となるように混合して希釈液とする。
【００２９】
５）検量線サンプル
ラクトフェリンを前記希釈液に溶解して、それぞれ３．１２５ｎｇ／ｍＬ、６．２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製して検量線サンプルとする。
【００３０】
６）ＬＦ分解物サンプル
ラクトフェリン加水分解物を希釈液に溶解して、ＬＦ分解物サンプルとする（最大濃度：４０００ｎｇ／ｍＬ）。
【００３１】
７）二次抗体液
ペルオキシダーゼ標識抗ウシ・ラクトフェリン・ヤギ抗体（Goat anti-Bovine Lactoferrin HRP conjugated 1.0 mL @ 1.0 mg/mL）（Ｂｅｔｈｙｌ社製、A10-126P）１ｍＬを前記希釈液で１２，０００倍に希釈した溶液を二次抗体液とする。
【００３２】
８）発色液
ABTS Peroxidase Sulfate（ABTS：2,2'-Azido.bis-3-ethyl benzthiazoline sulfonic acid）とPeroxidase Solution B（H2O2）（ＫＳＰ社製、50-62-00）とを同量（１：１）
混合したものを発色液とする。
【００３３】
９）反応停止液
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：sodium dodecyl sulfate）２０ｇをミリＱ水５０ｍＬに溶解し、これにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍｌを加えて反応停止液とする。
【００３４】
１０）測定手順
ｉ）一次抗体液１００μＬをマイクロプレートのウェルに分注し、常温で１時間〜一晩静置した後、ウェルを洗浄液３００μＬで３回洗浄し、ウェルにブロック液２００μＬを分注する。常温で１〜２時間静置した後、洗浄液３００μＬで３回洗浄する。
【００３５】
ｉｉ）検量線サンプル又はＬＦ分解物１００μＬをウェルに入れ、常温で２〜３時間静置した後、洗浄液３００μＬで３回洗浄する。
【００３６】
ｉｉｉ）ウェルに二次抗体液１００μＬを入れ、常温で２〜３時間静置した後、洗浄液３００μＬで３回洗浄する。
ｉｖ）ウェルに発色液１００μＬを入れ、常温で５〜１５分静置した後、反応停止液５０μＬを加える。
【００３７】
ｖ）反応液の吸光度（４０５ｎｍ）を測定する。吸光度は、例えばマイクロプレートリーダー（コロナ電機社製、ＭＴＰ−３２）を用いて測定することができる。検量線サンプルの濃度と吸光度をプロットして検量線を作成する。ＬＦ分解物サンプルの反応液の吸光度と検量線から、ＬＦ分解物サンプルのラクトフェリン濃度を測定する。
【００３８】
１１）抗原性
抗原性は、以下の式に基づいて算出することができる。
【００３９】
抗原性（％）＝［ＥＬＩＳＡ法により測定されたＬＦ分解物サンプルのラクトフェリン濃度（Ｗ／Ｖ）］×１００／［ＬＦ分解物サンプルのペプチド濃度（Ｗ／Ｖ）］
【００４０】
ＬＦ分解物サンプル中に含まれる蛋白質分解酵素がラクトフェリン及びラクトフェリン
加水分解物に比べて無視できる量であれば、上記式の分母は、加水分解前のラクトフェリン溶液のラクトフェリン濃度で置換えることができる。
尚、ＬＦ分解物サンプルのペプチド濃度は、例えば、紫外吸収法、Bradford法、Lowry
法等の方法により測定することができる。
【００４１】
上記のようにして測定されるＬＦ分解物サンプル中のラクトフェリン濃度は、未分解のラクトフェリンの濃度であるか、抗ラクトフェリン抗体に反応性を有する加水分解ペプチドによるみかけのラクトフェリン濃度であるか、あるいはその両方であるか明らかではないが、いずれにしても、免疫測定法により測定されるラクトフェリン濃度が低いことは、抗ラクトフェリン抗体に対する反応性、すなわち抗原性が低いことを示している。
【００４２】
（苦味試験）
ラクトフェリン加水分解物の苦味は、官能性試験により評価することができる。具体的には、例えば、各試料を精製水に１質量％の濃度に溶解した被検液を、２０℃に保温し、２０歳から４０歳までの男女各２０人のパネルにより官能的に風味を試験し、苦味なし（０点）、苦味ややあり（１点）、苦味あり（２点）、苦味強くあり（３点）の４段階で評価する。評価点の平均値から、例えば、０．５点未満を「苦味なし」、０．５点以上１．５点未満を「苦味ややあり」、１．５点以上２．５点未満を「苦味あり」、及び２．５点以上３．０点未満を「苦味強くあり」として判定することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
ウシ・ラクトフェリン（森永乳業社製）を精製水にて５質量％となるように溶解し、塩酸溶液にてｐＨを３に調整してラクトフェリン溶液を調製した。調製したラクトフェリン溶液を４５に加温し、次いでラクトフェリンの質量に対して３％のカーフレンネット（ＲＥＮＣＯ社製、キモシンを９２質量％、ペプシンを８質量％含有）を添加して、攪拌しながら２４時間反応させて、加水分解を行った。
加水分解終了後、反応液を８０に加温し、１０分間保温して酵素を失活させた。
反応液を氷冷後、水酸化ナトリウム溶液を添加して反応液のｐＨを６に調整し、その後反応液を凍結乾燥してラクトフェリン加水分解物粉末を製造した。
【００４４】
［試験例１］
本試験は、本発明のラクトフェリン加水分解物の抗原性について検討するために行った。
【００４５】
実施例１で製造したラクトフェリン加水分解物について、前記の抗原性試験（ＥＬＩＳＡ法）に記載される方法に基づいて抗原性の試験を行った。
【００４６】
その結果、実施例１で製造したラクトフェリン加水分解物を水に溶解した溶液のペプチド濃度は８０００ｎｇ／ｍＬ、抗原性試験で測定されたラクトフェリン濃度は３．６ｎｇ／ｍＬであり、ラクトフェリン加水分解物の抗原性は、同量のラクトフェリンに比べて０．０４５％（１／１０００以下）であることが確認された。
【００４７】
［試験例２］
本試験は、本発明のラクトフェリン加水分解物と他の加水分解酵素によって消化されたラクトフェリン加水分解物の苦味について検討するために行った。
【００４８】
（試験試料）
ラクトフェリンの加水分解に用いる酵素として、それぞれ、キモシン（１００質量％：ＤＳＭ社製）を用いたラクトフェリン加水分解物を試料１、キモシンを９２質量％含有する酵素組成物を用いたラクトフェリン加水分解物を試料２、キモシンを８８質量％含有する酵素組成物を用いたラクトフェリン加水分解物を試料３、キモシンを５０質量％含有する酵素組成物を用いたラクトフェリン加水分解物を試料４、ウシレンネット（ＲＥＮＣＯ社製。キモシン５質量％、ペプシン９５質量％）を用いたラクトフェリン加水分解物を試料５、豚ペプシンを用いたラクトフェリン加水分解物を対照１、モルシンＦを用いたラクトフェリン加水分解物を対照２、スミチームＡＰを用いたラクトフェリン加水分解物を対照３として苦味試験に供した。試料２〜４の作製に使用した酵素組成物は、試料１及び試料５の作製に各々用いたキモシン及びウシレンネットを、所定のキモシン含量となるように混合することにより調製した。スミチームＡＰはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のプロテアーゼであり、モルシンＦはアスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）由来のプロテアーゼである。
【００４９】
（試験方法）
ラクトフェリンを加水分解するに際し、ラクトフェリンは精製水にて５質量％に調製して加水分解を行った。
また、酵素量はすべて、ラクトフェリンの質量に対して３％となるように各酵素を添加し、すべての試料について、ｐＨ３の条件にて酵素反応を行った。
反応温度は、試料１〜５は４５℃に設定し、対照１〜３については、用いられる各酵素の至適温度に設定し、また、すべて反応時間を６時間に揃えて加水分解を行った。
なお、苦味は、前記の４段階の官能評価に基づいて評価した。
【００５０】
（試験結果）
本試験の結果は表１に示されるとおりである、その結果、ラクトフェリンの加水分解に用いる酵素が、キモシン、キモシンを９２質量％含有する酵素組成物、又はキモシンを８８質量％含有する酵素組成物である場合、本試験により苦味は検出されなかった。
これに対し、ラクトフェリンの加水分解に用いる酵素が、キモシンを５０質量％含有する酵素組成物では、若干ではあるものの苦味を感じる結果となり、さらに、キモシンを５質量％含有する酵素組成物では、明確に苦味を感じる結果となった。
また、ラクトフェリンの加水分解に用いる酵素が、ペプシンである場合は、苦味を感じることが確認され、モルシンＦやスミチームＡＰである場合は、苦味を強く感じる結果となった。
【００５１】
すなわち、ラクトフェリンに用いる加水分解酵素は、ラクトフェリン加水分解物の苦味を抑えるという点で、上記反応条件では少なくともキモシンを８０質量％程度含有する酵素組成物であることが好ましいことが判明した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
［試験例３］
本試験は、本発明とは酵素反応条件が異なる方法により得られたラクトフェリン加水分解物の苦味と抗原性について検討するために行った。
【００５４】
Hoek, K.S.ら（アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Antimicrobial Agents and Chemotherapy）、第４１巻、第１号、１９９７年、第５４−５９
ページ）には、ラクトフェリンの加水分解に用いる酵素がキモシンである点、ｐＨが３である点で、本発明のラクトフェリン加水分解物の製造方法と条件が共通するものの、酵素反応時間が本発明に比して短い（反応時間：１時間）ことが記載されている。
そこで、文献１に記載されているラクトフェリン加水分解物の製造方法に基づいて調製したラクトフェリン加水分解物を対照４とし、当該対照４と、前記本発明の実施例１で製造したラクトフェリン加水分解物とについて、抗原性試験および苦味試験を行った。
【００５５】
その結果を表２に示す。表２から明らかなとおり、本発明の実施例１と対照４の苦味は、いずれも感じられない結果となった。
一方、抗原性（％）は実施例１が０．０４５であるのに対し、対照４では１．６２４であり、上記Hoek, K.S.らに記載されるラクトフェリン加水分解物は、本発明のラクトフェリン加水分解物に比して抗原性が３６倍も顕著に高い値を示すことが判明した。
【００５６】
【表２】
【００５７】
なお、文献１に記載されるとおり、対照４の試料の調製にあたっては、酵素量が、ラクトフェリンの質量に対して４％相当のキモシンを用い、また、酵素反応の温度条件が、６０℃である点で、本発明と相違するものであった。
すなわち、本発明に比してキモシンの酵素量が１．４５倍であり、酵素反応温度も１５℃高いにもかかわらず、抗原性は、本発明に比して高い値を示していた。
【００５８】
よって、苦味が抑えられ、抗原性が十分に低いラクトフェリン加水分解物を製造するためには、加水分解に用いる酵素がキモシン含量が８０質量％以上である酵素組成物を用い
て、少なくとも６時間以上、好ましくは２４時間の酵素反応を行うことが重要であることが判明した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、苦味が少なく、抗原性が低いラクトフェリン加水分解物の製造方法、および当該製造方法によって提供されるラクトフェリン加水分解物に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品蛋白質の機能特性の新たな発現や改良の手段の一つとして蛋白質加水分解酵素（プロテアーゼ）や酸を用いた限定加水分解（断片化）が行なわれている。この様にして得られたペプチドは、消化吸収の観点から、遊離アミノ酸混合物よりも吸収速度及び吸収後のアミノ酸バランスにおいて優れていることが明らかにされている（非特許文献１）。しかしながら、限定加水分解（断片化）により苦味、えぐ味のある苦味ペプチドが生成し、呈味性の悪い、嗜好性に難のある素材になることが指摘されており、アミノ酸遊離率の極端に低い分解物は特に苦味を呈する場合が多く、摂取するときの障害となることがある。そのために利用が制限されているのも事実である。
一方、食餌蛋白質に起因するアレルギー患者が急増し、特に乳児においては、例えば乳清蛋白質、特にβ−ラクトグロブリンに起因するアレルギーが多発していることが明らかになっており（非特許文献１）、食品中の抗原性物質の低減や、蛋白質・ペプチドにおける抗原性の実質的除去が求められている。
このように、苦味等の不快味や抗原性が抑制され、食品加工において有用なペプチド素材の開発が待望されている。
【０００３】
ラクトフェリンは、哺乳動物の乳汁、唾液、涙、精液、種々の粘液等に存在する、非ヘム鉄結合糖蛋白質であり、鉄吸着作用、細胞増殖促進作用、免疫調節作用、および抗菌作用を有する多機能蛋白質である。牛ラクトフェリンは、乳業工場で日常的に取扱う生脱脂乳またはチーズ・ホエーから容易に、かつ大量に得ることができ、商品として直ちに利用することができる。
【０００４】
そして、ラクトフェリンを加水分解して得られるラクトフェリン加水分解物や、ラクトフェリン中の特定のアミノ酸配列を有するラクトフェリンペプチド、例えばラクトフェリシン（本出願人による登録商標）は、抗菌活性（特許文献１、非特許文献２）やチロシナーゼ活性（特許文献２）、アポトーシス誘導剤（特許文献３）、経口がん転移抑制剤（特許文献４）、肝機能改善剤（特許文献５）等の多くの生理活性が知られている。
【０００５】
このようにラクトフェリン加水分解物やラクトフェリンペプチドは、化学物質および化学的に合成されたアミノ酸誘導体を含まない天然物由来のペプチドであるから、人および動物に対して健康的であり、かつ安全である。したがって、ラクトフェリン加水分解物やラクトフェリンペプチドは安全な、かつ有効な医薬、食品、飼料等として例えば、点眼剤、口腔剤、化粧品、皮膚剤、乳幼児用食品、臨床用食品、機能性食品、ペット用製品等の多種多様な商品に利用でき、極めて大きな価値を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平９−１２４５０４号公報
【特許文献２】特開平５−３２００６８号公報
【特許文献３】特開平１０−４５６１８号公報
【特許文献４】特開平１０−５９８６４号公報
【特許文献５】国際公開第００／０６１９２号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】酪農科学・食品の研究、第３９巻、第Ａ−２８３ページ、１９９０年
【非特許文献２】アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Antimicrobial Agents and Chemotherapy）、第４１巻、第１号、１９９７年、第５４−５９ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、苦味が少なく、抗原性が低い（低アレルゲン化）ラクトフェリン加水分解物の製造方法、および当該製造方法によって提供されるラクトフェリン加水分解物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、医薬品、食品、飼料等の様々な分野に利用が可能であるラクトフェリン加水分解物を提供する上で、従来より課題となっていたペプチドによる苦味の問題を克服することを課題として研究を進めた。そして、機能性と共に良好な風味を有する食品分野への適用を図るべく、鋭意検討を重ねた結果、蛋白質加水分解酵素の一種であるキモシンを含有する酵素組成物を用いてラクトフェリンを加水分解することにより、従来に比して顕著に苦味が低減され、かつ抗原性も低く抑えられたラクトフェリン加水分解物が得られることを知見した。
【００１０】
本願の第一の発明は、ラクトフェリンに比べて抗原性が０．１％以下のラクトフェリン加水分解物の製造方法であって、ラクトフェリンを、全蛋白質に対して８０質量％以上のキモシンを含有する酵素組成物により、ｐＨ２〜４、反応温度が３５〜５５℃、及び反応時間が６〜２４時間の条件で加水分解する工程を含む方法である。
【００１１】
上記方法は、抗原性が、ラクトフェリンを標準物質として、抗ラクトフェリン抗体を用いた免疫測定法により測定されるラクトフェリンの濃度として評価されることを好ましい態様としている。
また、上記方法は、酵素組成物の量が、ラクトフェリンの質量に対して、蛋白質の量として０．００１〜５％の範囲であることを好ましい態様としている。
【００１２】
また、本願の第二の発明は、前記第一の発明で特定される製造方法によって製造されるラクトフェリン加水分解物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の製造方法によって製造されるラクトフェリン加水分解物は、口に含んでも苦味が少ないので、食品に添加した場合に食品全体の風味に影響を与えず、また抗原性も低く抑えられているので、ラクトフェリンペプチドが有する様々な生理活性を付与した機能性飲食品の製造に適した原料素材として提供することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
【００１５】
本発明において、出発物質として使用するラクトフェリンは、市販のラクトフェリン、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオン交換クロマ
トグラフィー等）により分離したラクトフェリン、それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポラクトフェリン、アポラクトフェリンを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせた金属飽和ラクトフェリン、又はこれらの混合物である（以下、これらをまとめてＬＦと記載することがある。）。
【００１６】
本発明によるラクトフェリン加水分解物（以下、「ＬＦ加水分解物」と記載することがある）は、前記ラクトフェリンをキモシンを含有する酵素組成物で加水分解することによって得られるものである。
前記酵素組成物によりラクトフェリンを加水分解する場合には、ラクトフェリンを０．５〜２０質量％、望ましくは２〜１５質量％の濃度で水、精製水、生理食塩水、緩衝液等に溶解してラクトフェリン（ＬＦ）溶液を調製し、当該ＬＦ溶液のｐＨを２〜４、好ましくは２．５〜３．５、特に好ましくは３に調整する。その後、キモシンを含有する酵素組成物を添加して加水分解を行う。
【００１７】
ラクトフェリンの加水分解に使用される酵素組成物は、同組成物に含まれる蛋白質全量に対してキモシン（Chymosin 、Enzyme Code： 3.4.23.4）を８０質量％以上含有してい
ればよく、含有するキモシン以外の成分に特に制限はなく、他の蛋白質分解酵素が含まれていてもよい。このような蛋白質分解酵素としては、ペプシン、又は、微生物、例えばアスペルギルス属等の糸状菌由来の蛋白質加水分解酵素等が挙げられる
キモシンは、哺乳動物の胃で作られる消化酵素の混合物から単離精製されたキモシン標品、又は粗精製品を使用することが可能であり、遺伝子組換え法により製造された組換え体キモシンを使用しても良い。
【００１８】
なお、本発明においてはキモシンを含有する酵素組成物に含まれるキモシン含量は、蛋白質全量に対して８０質量％以上が好ましく、８４質量％以上がさらに好ましく、８８質量％以上がより好ましく、９２質量％が特に好ましい。また、キモシンを含有する酵素組成物に含まれる蛋白質が、すべてキモシンで構成されるもの、すなわち、キモシン１００質量％の酵素組成物であっても良い。酵素組成物は、蛋白質以外の成分、例えば水分、糖類等を含んでいてもよい。
【００１９】
また、キモシンを含有する酵素組成物としては、キモシン含量が８０質量％以上である限り、哺乳動物の胃で作られる消化酵素の混合物、すなわち、レンネット（凝乳酵素）を使用することが可能である。この場合、仔牛由来のカーフレンネット（通常、キモシン８８〜９４質量％とペプシン６〜１２質量％をそれぞれ含有する）を使用することが好ましい。
【００２０】
加水分解に使用する酵素組成物の量は、基質であるラクトフェリンの質量に対して、蛋白質の量として０．００１〜５％の範囲であることが好ましく、０．０１〜４％の範囲であることがより好ましく、特に、０．１〜３％の範囲であることが好ましい。
【００２１】
（ラクトフェリン加水分解物の製造方法）
本発明の方法によりラクトフェリンを加水分解するにあたっては、ラクトフェリン（ＬＦ）溶液は酵素反応処理を行う前に、塩酸、クエン酸、酢酸等の酸によりｐＨを２〜４、好ましくは２．５〜３．５の範囲に調製されるが、ｐＨ３であることが特に好ましい。
例えば、ｐＨを３に調整したＬＦ溶液は、前記キモシンを含有する酵素組成物を所望の量で添加した後、酵素反応の温度を３５〜５５℃、好ましくは４０〜５０℃、より好ましくは４２〜４８℃に保持して、６時間〜２４時間、好ましくは１２〜１８時間、攪拌しながらラクトフェリンを加水分解させる。
次いで、例えば反応溶液を８０℃に昇温して１０分間維持し、酵素を加熱失活させる。さらに、好ましくは、水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を添加して、ｐＨを５〜７
、例えば６に調整する。
なお、ｐＨ調整後の反応溶液（ラクトフェリン加水分解物）は、溶液のままでもよいが、凍結乾燥等を行って粉末化することが好ましい。また、ラクトフェリン分解物は、クロマトグラフィー、又は限外濾過等により、分画したものを用いることもできる。
【００２２】
上記のようにして得られるラクトフェリン加水分解物は、ラクトフェリン（ラクトフェリン加水分解物と同質量の未分解のラクトフェリン）に比べて抗原性が０．１％（１／１０００）以下である。抗原性は、例えば、抗ラクトフェリン抗体に対する反応性により評価することができる。抗ラクトフェリン抗体に対する反応性は、抗ラクトフェリン抗体を用いた免疫測定法、例えばＥＬＩＳＡ法（Enzyme-linked immunosorbent assay）により
測定されるラクトフェリン濃度として測定することができる。ラクトフェリン濃度は、既知量のラクトフェリンを標準物質として作成した標準曲線を用いて測定することができる。抗ラクトフェリン抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。ＥＬＩＳＡ法の詳細については、後述する。
また、上記のようにして得られるラクトフェリン加水分解物は、他の蛋白質分解酵素、例えばペプシンを用いて得られるラクトフェリン加水分解物に比べて苦味が少ない。
【００２３】
以下に、抗原性及び苦味を評価する具体的な方法を例示する。
（抗原性試験）
抗原性試験は、通常の免疫測定法を採用することができるが、例えば、酵素免疫測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ、川瀬興三他、東邦医会誌、３５巻 ５０６頁、１９８９年）に準じて、ラクトフェリンを対照として行い、ラクトフェリン抗体に対するラクトフェリン加水分解物の反応性として評価することができる。
【００２４】
具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡ法に使用する試薬等の調製、及びそれらを用いた測定は以下のようにして行うことができるが、これらに限定されず、適宜改変することができる。
【００２５】
１）洗浄液
ダルベッコＰＢＳ（DULBECCO'S PBS：Phosphate Buffer Saline）溶液（DULBECCO'S PBS TABLET（ＤＳ ＰＨＡＲＭＡ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ社製、DSBN200）１００錠を１Ｌ
のミリＱ水に溶解したもの）１Ｌに対し、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（polyoxyethylene sorbitan monolaurate））を５ｍＬ添加して、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ １０倍濃縮液を調製した。当該Ｔｗ
ｅｅｎ−ＰＢＳ １０倍濃縮液を、ミリＱ水でさらに１０倍希釈したものを洗浄液とする
。
【００２６】
２）ブロック液
REAGENT DILUENT CONCENTRATE 2（10X）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、DY995）を、
２．２μｍフィルターで濾過したミリＱ水で１０倍に希釈したものをブロック液とする。
【００２７】
３）一次抗体液
抗ウシ・ラクトフェリン・ヤギ抗体（Goat anti-Bovine Lactoferrin affinity Purified 1.0 mL @ 1.0 mg/mL）（Ｂｅｔｈｙｌ社製、A10-126A）１ｍｌを、ＰＢＳ溶液（ｐＨ
７．２）（ギブコ社製、20012）にて４，０００倍に希釈した溶液を一次抗体液とする。
【００２８】
４）希釈液
前記Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ１０倍濃縮液と、前記ブロック液と、ミリＱ水とを、それぞれ、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ１０倍濃縮液：ブロック液：ミリＱ水＝１：１：８、となるように混合して希釈液とする。
【００２９】
５）検量線サンプル
ラクトフェリンを前記希釈液に溶解して、それぞれ３．１２５ｎｇ／ｍＬ、６．２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製して検量線サンプルとする。
【００３０】
６）ＬＦ分解物サンプル
ラクトフェリン加水分解物を希釈液に溶解して、ＬＦ分解物サンプルとする（最大濃度：４０００ｎｇ／ｍＬ）。
【００３１】
７）二次抗体液
ペルオキシダーゼ標識抗ウシ・ラクトフェリン・ヤギ抗体（Goat anti-Bovine Lactoferrin HRP conjugated 1.0 mL @ 1.0 mg/mL）（Ｂｅｔｈｙｌ社製、A10-126P）１ｍＬを前記希釈液で１２，０００倍に希釈した溶液を二次抗体液とする。
【００３２】
８）発色液
ABTS Peroxidase Sulfate（ABTS：2,2'-Azido.bis-3-ethyl benzthiazoline sulfonic acid）とPeroxidase Solution B（H2O2）（ＫＳＰ社製、50-62-00）とを同量（１：１）
混合したものを発色液とする。
【００３３】
９）反応停止液
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：sodium dodecyl sulfate）２０ｇをミリＱ水５０ｍＬに溶解し、これにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍｌを加えて反応停止液とする。
【００３４】
１０）測定手順
ｉ）一次抗体液１００μＬをマイクロプレートのウェルに分注し、常温で１時間〜一晩静置した後、ウェルを洗浄液３００μＬで３回洗浄し、ウェルにブロック液２００μＬを分注する。常温で１〜２時間静置した後、洗浄液３００μＬで３回洗浄する。
【００３５】
ｉｉ）検量線サンプル又はＬＦ分解物１００μＬをウェルに入れ、常温で２〜３時間静置した後、洗浄液３００μＬで３回洗浄する。
【００３６】
ｉｉｉ）ウェルに二次抗体液１００μＬを入れ、常温で２〜３時間静置した後、洗浄液３００μＬで３回洗浄する。
ｉｖ）ウェルに発色液１００μＬを入れ、常温で５〜１５分静置した後、反応停止液５０μＬを加える。
【００３７】
ｖ）反応液の吸光度（４０５ｎｍ）を測定する。吸光度は、例えばマイクロプレートリーダー（コロナ電機社製、ＭＴＰ−３２）を用いて測定することができる。検量線サンプルの濃度と吸光度をプロットして検量線を作成する。ＬＦ分解物サンプルの反応液の吸光度と検量線から、ＬＦ分解物サンプルのラクトフェリン濃度を測定する。
【００３８】
１１）抗原性
抗原性は、以下の式に基づいて算出することができる。
【００３９】
抗原性（％）＝［ＥＬＩＳＡ法により測定されたＬＦ分解物サンプルのラクトフェリン濃度（Ｗ／Ｖ）］×１００／［ＬＦ分解物サンプルのペプチド濃度（Ｗ／Ｖ）］
【００４０】
ＬＦ分解物サンプル中に含まれる蛋白質分解酵素がラクトフェリン及びラクトフェリン
加水分解物に比べて無視できる量であれば、上記式の分母は、加水分解前のラクトフェリン溶液のラクトフェリン濃度で置換えることができる。
尚、ＬＦ分解物サンプルのペプチド濃度は、例えば、紫外吸収法、Bradford法、Lowry
法等の方法により測定することができる。
【００４１】
上記のようにして測定されるＬＦ分解物サンプル中のラクトフェリン濃度は、未分解のラクトフェリンの濃度であるか、抗ラクトフェリン抗体に反応性を有する加水分解ペプチドによるみかけのラクトフェリン濃度であるか、あるいはその両方であるか明らかではないが、いずれにしても、免疫測定法により測定されるラクトフェリン濃度が低いことは、抗ラクトフェリン抗体に対する反応性、すなわち抗原性が低いことを示している。
【００４２】
（苦味試験）
ラクトフェリン加水分解物の苦味は、官能性試験により評価することができる。具体的には、例えば、各試料を精製水に１質量％の濃度に溶解した被検液を、２０℃に保温し、２０歳から４０歳までの男女各２０人のパネルにより官能的に風味を試験し、苦味なし（０点）、苦味ややあり（１点）、苦味あり（２点）、苦味強くあり（３点）の４段階で評価する。評価点の平均値から、例えば、０．５点未満を「苦味なし」、０．５点以上１．５点未満を「苦味ややあり」、１．５点以上２．５点未満を「苦味あり」、及び２．５点以上３．０点未満を「苦味強くあり」として判定することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
ウシ・ラクトフェリン（森永乳業社製）を精製水にて５質量％となるように溶解し、塩酸溶液にてｐＨを３に調整してラクトフェリン溶液を調製した。調製したラクトフェリン溶液を４５に加温し、次いでラクトフェリンの質量に対して３％のカーフレンネット（ＲＥＮＣＯ社製、キモシンを９２質量％、ペプシンを８質量％含有）を添加して、攪拌しながら２４時間反応させて、加水分解を行った。
加水分解終了後、反応液を８０に加温し、１０分間保温して酵素を失活させた。
反応液を氷冷後、水酸化ナトリウム溶液を添加して反応液のｐＨを６に調整し、その後反応液を凍結乾燥してラクトフェリン加水分解物粉末を製造した。
【００４４】
［試験例１］
本試験は、本発明のラクトフェリン加水分解物の抗原性について検討するために行った。
【００４５】
実施例１で製造したラクトフェリン加水分解物について、前記の抗原性試験（ＥＬＩＳＡ法）に記載される方法に基づいて抗原性の試験を行った。
【００４６】
その結果、実施例１で製造したラクトフェリン加水分解物を水に溶解した溶液のペプチド濃度は８０００ｎｇ／ｍＬ、抗原性試験で測定されたラクトフェリン濃度は３．６ｎｇ／ｍＬであり、ラクトフェリン加水分解物の抗原性は、同量のラクトフェリンに比べて０．０４５％（１／１０００以下）であることが確認された。
【００４７】
［試験例２］
本試験は、本発明のラクトフェリン加水分解物と他の加水分解酵素によって消化されたラクトフェリン加水分解物の苦味について検討するために行った。
【００４８】
（試験試料）
ラクトフェリンの加水分解に用いる酵素として、それぞれ、キモシン（１００質量％：ＤＳＭ社製）を用いたラクトフェリン加水分解物を試料１、キモシンを９２質量％含有する酵素組成物を用いたラクトフェリン加水分解物を試料２、キモシンを８８質量％含有する酵素組成物を用いたラクトフェリン加水分解物を試料３、キモシンを５０質量％含有する酵素組成物を用いたラクトフェリン加水分解物を試料４、ウシレンネット（ＲＥＮＣＯ社製。キモシン５質量％、ペプシン９５質量％）を用いたラクトフェリン加水分解物を試料５、豚ペプシンを用いたラクトフェリン加水分解物を対照１、モルシンＦを用いたラクトフェリン加水分解物を対照２、スミチームＡＰを用いたラクトフェリン加水分解物を対照３として苦味試験に供した。試料２〜４の作製に使用した酵素組成物は、試料１及び試料５の作製に各々用いたキモシン及びウシレンネットを、所定のキモシン含量となるように混合することにより調製した。スミチームＡＰはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のプロテアーゼであり、モルシンＦはアスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）由来のプロテアーゼである。
【００４９】
（試験方法）
ラクトフェリンを加水分解するに際し、ラクトフェリンは精製水にて５質量％に調製して加水分解を行った。
また、酵素量はすべて、ラクトフェリンの質量に対して３％となるように各酵素を添加し、すべての試料について、ｐＨ３の条件にて酵素反応を行った。
反応温度は、試料１〜５は４５℃に設定し、対照１〜３については、用いられる各酵素の至適温度に設定し、また、すべて反応時間を６時間に揃えて加水分解を行った。
なお、苦味は、前記の４段階の官能評価に基づいて評価した。
【００５０】
（試験結果）
本試験の結果は表１に示されるとおりである、その結果、ラクトフェリンの加水分解に用いる酵素が、キモシン、キモシンを９２質量％含有する酵素組成物、又はキモシンを８８質量％含有する酵素組成物である場合、本試験により苦味は検出されなかった。
これに対し、ラクトフェリンの加水分解に用いる酵素が、キモシンを５０質量％含有する酵素組成物では、若干ではあるものの苦味を感じる結果となり、さらに、キモシンを５質量％含有する酵素組成物では、明確に苦味を感じる結果となった。
また、ラクトフェリンの加水分解に用いる酵素が、ペプシンである場合は、苦味を感じることが確認され、モルシンＦやスミチームＡＰである場合は、苦味を強く感じる結果となった。
【００５１】
すなわち、ラクトフェリンに用いる加水分解酵素は、ラクトフェリン加水分解物の苦味を抑えるという点で、上記反応条件では少なくともキモシンを８０質量％程度含有する酵素組成物であることが好ましいことが判明した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
［試験例３］
本試験は、本発明とは酵素反応条件が異なる方法により得られたラクトフェリン加水分解物の苦味と抗原性について検討するために行った。
【００５４】
Hoek, K.S.ら（アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Antimicrobial Agents and Chemotherapy）、第４１巻、第１号、１９９７年、第５４−５９
ページ）には、ラクトフェリンの加水分解に用いる酵素がキモシンである点、ｐＨが３である点で、本発明のラクトフェリン加水分解物の製造方法と条件が共通するものの、酵素反応時間が本発明に比して短い（反応時間：１時間）ことが記載されている。
そこで、文献１に記載されているラクトフェリン加水分解物の製造方法に基づいて調製したラクトフェリン加水分解物を対照４とし、当該対照４と、前記本発明の実施例１で製造したラクトフェリン加水分解物とについて、抗原性試験および苦味試験を行った。
【００５５】
その結果を表２に示す。表２から明らかなとおり、本発明の実施例１と対照４の苦味は、いずれも感じられない結果となった。
一方、抗原性（％）は実施例１が０．０４５であるのに対し、対照４では１．６２４であり、上記Hoek, K.S.らに記載されるラクトフェリン加水分解物は、本発明のラクトフェリン加水分解物に比して抗原性が３６倍も顕著に高い値を示すことが判明した。
【００５６】
【表２】
【００５７】
なお、文献１に記載されるとおり、対照４の試料の調製にあたっては、酵素量が、ラクトフェリンの質量に対して４％相当のキモシンを用い、また、酵素反応の温度条件が、６０℃である点で、本発明と相違するものであった。
すなわち、本発明に比してキモシンの酵素量が１．４５倍であり、酵素反応温度も１５℃高いにもかかわらず、抗原性は、本発明に比して高い値を示していた。
【００５８】
よって、苦味が抑えられ、抗原性が十分に低いラクトフェリン加水分解物を製造するためには、加水分解に用いる酵素がキモシン含量が８０質量％以上である酵素組成物を用い
て、少なくとも６時間以上、好ましくは２４時間の酵素反応を行うことが重要であることが判明した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンに比べて抗原性が０．１％以下のラクトフェリン加水分解物の製造方法であって、ラクトフェリンを、全蛋白質に対して８０質量％以上のキモシンを含有する酵素組成物により、ｐＨ２〜４、反応温度が３５〜５５℃、及び反応時間が６〜２４時間の条件で加水分解する工程を含む方法。
【請求項２】
抗原性が、ラクトフェリンを標準物質として、抗ラクトフェリン抗体を用いた免疫測定法により測定されるラクトフェリンの濃度として評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵素組成物の量が、ラクトフェリンの質量に対して、蛋白質の量として０．００１〜５％の範囲である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法によって製造されるラクトフェリン加水分解物。
【請求項１】
ラクトフェリンに比べて抗原性が０．１％以下のラクトフェリン加水分解物の製造方法であって、ラクトフェリンを、全蛋白質に対して８０質量％以上のキモシンを含有する酵素組成物により、ｐＨ２〜４、反応温度が３５〜５５℃、及び反応時間が６〜２４時間の条件で加水分解する工程を含む方法。
【請求項２】
抗原性が、ラクトフェリンを標準物質として、抗ラクトフェリン抗体を用いた免疫測定法により測定されるラクトフェリンの濃度として評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵素組成物の量が、ラクトフェリンの質量に対して、蛋白質の量として０．００１〜５％の範囲である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法によって製造されるラクトフェリン加水分解物。
【公開番号】特開２０１２−２３５７６８（Ｐ２０１２−２３５７６８Ａ）
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２１０１４（Ｐ２０１２−２１０１４）
【出願日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
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