ラフィノースの精製方法
【課題】甜菜製糖工程汁などのラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液から、三糖類であるケストース類を選択的に除去して同じ三糖類であるラフィノースを分離・精製する方法を提供する。
【解決手段】ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて酵素処理することで、三糖類であるラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解し、簡便かつ効率的にラフィノースを精製する。
【解決手段】ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて酵素処理することで、三糖類であるラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解し、簡便かつ効率的にラフィノースを精製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラフィノースの精製方法に関するものであり、より詳細には、同じ三糖類であるラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液からのラフィノース精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ラフィノースは、植物などから抽出、分離・精製して得られる天然のオリゴ糖であり、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコースおよびＤ−フラクトース各１分子から構成され、ショ糖にガラクトースが結合した形の三糖類である。その特徴は、数あるオリゴ糖のなかで全く吸湿性がない唯一のオリゴ糖であること、ビフィズス菌増殖効果、免疫賦活作用、アトピー性皮膚炎改善効果などの生理機能を有することなどが挙げられ、非常に有用なオリゴ糖として各種利用されている。
【０００３】
ラフィノースの製造は、主としてビート（砂糖大根）糖の製糖工程副産物などからクロマトグラフ法等によって取り出され、精製・結晶化して得られる。しかし、例えば甜菜製糖工程汁（三糖類としてラフィノースの他にケストース類（例えば、１−ケストース、ネオケストースなど）が含まれている）からのラフィノースの分離に採用している陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーは、同じ三糖類であるケストース類とラフィノースの分離が不良である。
【０００４】
このことがラフィノースを製造する場合に障害となり、現状では甜菜製糖工程汁などから効率的にラフィノースを製造することができない。つまり、ラフィノース製造工程において回収率を向上させるために結晶化時のシラップをクロマトグラフィー原料および結晶化原料に混合させ工程中を循環させた場合、ケストース類が工程中に蓄積しラフィノース純度が下がって、それ以上のラフィノースの回収が困難になる。
【０００５】
なお、ラフィノースとケストース類の分離精製については、特許文献１に記載の方法が提案されている。これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属菌由来のエキソ型イヌリン分解酵素を用いてラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解するというものである。しかし、この酵素では、実質的にはラフィノースと１−ケストースの混合液からのラフィノース分離のみしか行えず、例えば、当該酵素はネオケストースが分解できないためラフィノースとネオケストースの分離はできない。また、当該酵素の１−ケストースに対する活性の強さ自体についても、ラフィノース精製という目的で利用するには十分なものではない。
【０００６】
ここで、オリゴ糖を分解する酵素については、その基質特異性は様々であり、１−ケストースを分解できる酵素が当然にネオケストースなどの他のケストース類も分解できるとはいえないのが最近の当業界の見解である。例えば、本発明者らが最近見いだしたゴボウ由来のフルクタン加水分解酵素は、1−ケストースは分解するがネオケストースは分解しない（特許文献２）。また、ケストース類全般に対して分解活性を有する酵素では、同じ三糖類であるラフィノースも分解するのが通常である。
【０００７】
このように、ラフィノースと他のオリゴ糖の分離精製技術はいくつか提供されているものの、特に甜菜製糖工程汁から製造する場合などにおいては未だ満足できるものではないのが現状である。そのため、当業界において、甜菜製糖工程汁から製造する場合などにも利用することができる新規なラフィノース精製技術の開発が強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−４２９００号公報
【特許文献２】特開２０１１−５０３６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、甜菜製糖工程汁などのラフィノースとケストース類（いずれも三糖類）が混在しているラフィノース含有液から、ケストース類を選択的に除去してラフィノースを精製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究の結果、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて酵素処理することで、ラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解し、簡便かつ効率的にラフィノースを精製できることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて、ラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解し、ラフィノースは残存させること、を特徴とするラフィノースの精製方法。
（２）１−ケストース及びネオケストースを選択的に分解すること、を特徴とする（１）に記載の方法。
（３）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍであること、を特徴とする（１）又は（２）に記載の方法。
（４）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍが、ＪＣＭ１２１７株であること、を特徴とする（３）に記載の方法。
（５）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質、又は、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子がコードし且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０５５）であること、を特徴とする（１）又は（２）に記載の方法。
（８）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする（１）〜（２）、（７）のいずれか１つに記載の方法。
（９）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質、又は、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子がコードし且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする（１）〜（２）、（７）〜（８）のいずれか１つに記載の方法。
（１０）ラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液が、甜菜製糖工程汁であること、を特徴とする（１）〜（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１１）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて処理したラフィノース含有液を、更にクロマト処理すること、を特徴とする（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、甜菜製糖工程汁などの、いずれも三糖類であるラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液から、ケストース類（１−ケストース、ネオケストース）を選択的に除去し、ラフィノースを簡便かつ効率的に精製することができる。したがって、本発明の精製方法を用いることで、有用な機能性素材である高純度ラフィノースを安価且つ大量に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株由来のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（一文字記号）を示す。
【図２】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株由来のβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
【図３】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株由来のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（一文字記号）を示す。
【図４】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株由来のβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明においては、ラフィノース含有液中のケストース類（１−ケストース、ネオケストース）を選択的に分解し、ラフィノースを分離・精製するため、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いる。
【００１５】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼは、これに限定されるものではないが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ由来のものが好ましい。一例として、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株由来のβ−フルクトフラノシダーゼ（配列番号１及び図１にそのアミノ酸配列を示す）を挙げることができる。
【００１６】
また、他の由来の例としては、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株由来のβ−フルクトフラノシダーゼ（配列番号３及び図３にそのアミノ酸配列を示す）を挙げることができる。
【００１７】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株については、信用できる保存機関である日本国茨城県つくば市高野台３丁目１番地の１の独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンターに保存され、当センターの発行する微生物株カタログにより自由に分譲されうる。
【００１８】
また、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株については、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２２０５５として平成２３年（２０１１年）１月１３日に寄託されている。
【００１９】
更には、上記菌株由来のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質、上記菌株由来のβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、例えばこのＤＮＡをプローブとして用いたストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによってハイブリダイズする遺伝子がコードし、且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質なども用いることができる。
【００２０】
なお、ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件の一例を示せば、７０％以上の相同性を有するＤＮＡどうしがハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡどうしがハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃の温度で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００２１】
上記のようなビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼをケストース類を含むラフィノース含有液に作用させれば、三糖類のうちケストース類（１−ケストース、ネオケストース）のみが選択的に分解され、クロマト処理によってラフィノースと分離されやすい二糖類及び／又は単糖類となる。この場合、当該β−フルクトフラノシダーゼはラフィノースに作用しないため、酵素処理後においてもラフィノースは保存される。なお、当該β−フルクトフラノシダーゼにより、１−ケストースにフルクトースが１分子結合したニストースや２分子結合したフルクトシルニストースもケストース類と同様に分解される。本発明におけるケストース類を含むラフィノース含有液の酵素分解反応において、ケストース類が１０〜８０重量％程度含まれていても問題なく処理できる。また、酵素分解反応における糖濃度は０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００２２】
酵素反応温度は、好ましくは２０〜５５℃、より好ましくは３０〜５０℃である。反応温度が２０℃未満では、反応時間がきわめて長くなる。また６０℃を超えると酵素活性の失活が早くなる。酵素反応時のｐＨは、好ましくはｐＨ４．５〜７．５、より好ましくはｐＨ４．５〜６．５である。
【００２３】
本発明の方法において、ケストース類を加水分解したラフィノース溶液からラフィノースを分離・精製する方法として、陽イオンクロマトグラフィーや陰イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー等のクロマト処理や、結晶化などが挙げられる。クロマト処理はこれらの方法を単独で用いてもよいし、組み合わせてもよい。また、移動床方式や擬似移動床方式、多成分分離循環方式等を利用してもよい。このクロマト処理により、ラフィノースと単糖類及び二糖類（場合によっては４つ以上の糖が結合したオリゴ糖）とを分離でき、また脱塩・脱色も行うことができる。
【００２４】
また、ラフィノースの結晶化については、冷却結晶化法（例えば特公昭５６−３９６４０、特開平１１−７５９００）や、蒸発結晶化法（例えば特開２００９−９５２８１）により行うことができる。
【００２５】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。
【実施例１】
【００２６】
（ビフィドバクテリウム属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼの取得）
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼの取得は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株を用い、これらから該当する遺伝子を取得し、大腸菌で組換えタンパク質として発現させる方法を用いた。
【００２７】
まず、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株をそれぞれＧＡＭブイヨン培地中で３７℃、１２時間静置培養した。その後、遠心分離処理（１７００×ｇ、１０分間）を行って菌体を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。そして、この菌体より、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製品）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００２８】
このゲノムＤＮＡを鋳型として、当該酵素の部分アミノ酸配列情報から作製した各種プライマーを用いてｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ及びｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行い、それぞれのβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子をクローニングし定法により塩基配列を決定した。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株のβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の塩基配列は配列番号２及び図２に、そのコードするタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１及び図１に示した。また、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株のβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の塩基配列は配列番号４及び図４に、そのコードするタンパク質のアミノ酸配列は配列番号３及び図３に示した。
【００２９】
これらの遺伝子を、大腸菌発現ベクターｐＥＴ−３２ｂに挿入し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３））を形質転換した。得られた形質転換体について、組換えタンパク質発現誘導培養を行い、菌体回収、バッファーによる洗浄（５０ｍM ＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）、超音波破砕、遠心分離処理（１７００×ｇ、１０分間）を行って粗酵素液（上清）を調製した。
【００３０】
粗酵素液から、ＴＡＬＯＮ ＣｅｌｌＴｈｒｕ Ｒｅｓｉｎ（タカラバイオ社製品、登録商標）で組換えタンパク質を回収し、更にクロマトグラフィー等によって精製し、β−フルクトフラノシダーゼ活性を有することを確認して精製酵素液とした。なお、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株由来の酵素液を酵素１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株由来の酵素液を酵素２とした。
【００３１】
また、当該酵素液のβ−フルクトフラノシダーゼ活性測定については、１−ケストースの末端フルクトースを加水分解する反応を触媒し、フルクトース残基を遊離する活性をβ―フルクトフラノシダーゼ活性とした。
β―フルクトフラノシダーゼ活性測定方法は、２０ｍＭ １−ケストース５０μＬ、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．７）２５μＬ、酵素液２５μＬを混合し、３７℃で１０分間反応させた後、１００℃で５分間煮沸して反応を停止させた。反応停止後、反応生成物であるフルクトースを高速液体陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ分析条件、Ｄｉｏｎｅｘ社 Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ−１、室温、１５０ｍＭ 水酸化ナトリウム溶液１ｍＬ／ｍｉｎ、パルスドアンペロメトリー検出器）により定量した。酵素活性は、上記条件下で、１分間に１μｍｏｌのフルクトースを生成する酵素量を１Ｕ（ユニット）とした。
【実施例２】
【００３２】
（ラフィノース含有液からのラフィノース精製試験Ｉ）
実施例１で取得した酵素１及び酵素２について、以下のラフィノースと１−ケストースが混在しているラフィノース含有液からのラフィノース分離・精製試験を行った。
【００３３】
（ａ）酵素反応
１−ケストースが終濃度で５０ｍＭ（２．５％ｗ／ｖ）と、ラフィノースが終濃度で５０ｍＭ（２．５％）となるように、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に溶解した糖液８Ｌに、各β−フラクトフラノシダーゼ液（酵素１又は酵素２、６４００Ｕ）を混合し、３７℃で１時間酵素反応を行った。反応終了後、沸騰水中で５分間保持することで反応を停止した。反応溶液を高速液体陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ分析条件、Ｄｉｏｎｅｘ社 Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ−１、室温、１５０ｍＭ 水酸化ナトリウム溶液１ｍＬ／ｍｉｎ、パルスドアンペロメトリー検出器）で分析した。
【００３４】
結果を表１に示す。この結果から、上記酵素を用いて処理することで１−ケストースのみが分解され、ラフィノースは分解されずに保存された。なお、ラフィノースに対する活性を１とした１−ケストースに対する相対活性値の算出式は次の通りである。
【００３５】
相対活性値＝酵素分解によって分解した１−ケストース量（ｍｏｌ）／
酵素分解によって分解したラフィノース量（ｍｏｌ）
【００３６】
【表１】
【００３７】
（ｂ）ラフィノースの分離方法
反応溶液を１０００ｍＬ（糖濃度５８％ｗ／ｗ）にまで減圧濃縮する。反応液を陽イオン交換樹脂（ナトリウム型）に負荷し、水にて三糖、二糖類、単糖類の順に溶出させ、三糖溶出画分を集めた。
なお、反応溶液を１０００ｍＬ（糖濃度７７％ｗ／ｖ）にまで減圧濃縮し、温度約８０℃で擬似移動床法による多成分分離装置に通液して多成分分離（三糖画分、二糖類画分、単糖類画分）を行うことによっても同様の結果を得ることができた。
【００３８】
（ｃ）ラフィノースの結晶化
上記（ｂ）にて得られた三糖画分（ラフィノース純度９０〜９８％）を５８％（ｗ／ｗ）まで濃縮した後、液温を４０時間で最終２０℃迄に、時間の経過とともに大略逆比例的に低下させた。また、攪拌機の攪拌速度は１０ｒｐｍで行った。得られた白下を、分離機で分離して、ラフィノース結晶と振蜜を得た。ラフィノースの結晶化率は６０％であった（表２）。これに対し、酵素反応前のケストース：ラフィノース＝１：１混合液についても同様に結晶化を行ったが、ラフィノースの結晶化率は３５％であった（表２）。なお、ラフィノースの結晶化率の算出式は次の通りである。
【００３９】
ラフィノース結晶化率 ＝
｛結晶純度×（白下純度―振蜜純度）｝×１００／｛白下純度×（結晶純度―振蜜純度）｝
【００４０】
【表２】
【実施例３】
【００４１】
（ラフィノース含有液からのラフィノース精製試験ＩＩ）
実施例１で取得した酵素１及び酵素２について、以下のラフィノースと１−ケストース、ネオケストースが混在しているラフィノース含有液からのラフィノース分離・精製試験を行った。
【００４２】
１−ケストースが終濃度で５０ｍＭ（２．５％ｗ／ｖ）と、ネオケストースが終濃度で５０ｍＭ（２．５％ｗ／ｖ）、さらにラフィノースが終濃度で５０ｍＭ（２．５％）となるように、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に溶解した糖液８Ｌに、各β−フラクトフラノシダーゼ液（酵素１又は酵素２、６４００Ｕ）を混合し、３７℃で１時間酵素反応を行った。反応終了後、沸騰水中で５分間保持することで反応を停止した。反応溶液を高速液体陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ分析条件、Ｄｉｏｎｅｘ社 Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ−１、室温、１５０ｍＭ 水酸化ナトリウム溶液１ｍＬ／ｍｉｎ、パルスドアンペロメトリー検出器）で分析した。
【００４３】
結果を表３〜５に示す。この結果から、上記酵素を用いて処理することで１−ケストース及びネオケストースが分解され、ラフィノースは分解されずに保存された。なお、ラフィノースに対する活性を１とした１−ケストース、ネオケストースに対する相対活性値の算出式は次の通りである。
【００４４】
相対活性値＝酵素分解によって分解した１−ケストース又はネオケストース量（ｍｏｌ）
／酵素分解によって分解したラフィノース量（ｍｏｌ）
【００４５】
【表３】
【００４６】
【表４】
【００４７】
【表５】
【００４８】
これらを、実施例２と同様にクロマト処理及びラフィノースの結晶化を行い、ラフィノースの結晶化率は実施例２と同じ６０％であったのに対し、ケストース類とラフィノースの混合液は３５％であった（表６）。なお、ラフィノースの結晶化率の算出については実施例２の方法に準じた。
【００４９】
【表６】
【００５０】
本発明を要約すれば、以下の通りである。
【００５１】
本発明は、甜菜製糖工程汁などのラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液から、三糖類であるケストース類を選択的に除去して同じ三糖類であるラフィノースを分離・精製する方法を提供することを目的とする。
【００５２】
そして、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて、三糖類であるラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解することで、簡便かつ効率的にラフィノースを精製する。
【受託番号】
【００５３】
本発明において寄託されている微生物の受託番号を下記に示す。
（１）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０５５）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラフィノースの精製方法に関するものであり、より詳細には、同じ三糖類であるラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液からのラフィノース精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ラフィノースは、植物などから抽出、分離・精製して得られる天然のオリゴ糖であり、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコースおよびＤ−フラクトース各１分子から構成され、ショ糖にガラクトースが結合した形の三糖類である。その特徴は、数あるオリゴ糖のなかで全く吸湿性がない唯一のオリゴ糖であること、ビフィズス菌増殖効果、免疫賦活作用、アトピー性皮膚炎改善効果などの生理機能を有することなどが挙げられ、非常に有用なオリゴ糖として各種利用されている。
【０００３】
ラフィノースの製造は、主としてビート（砂糖大根）糖の製糖工程副産物などからクロマトグラフ法等によって取り出され、精製・結晶化して得られる。しかし、例えば甜菜製糖工程汁（三糖類としてラフィノースの他にケストース類（例えば、１−ケストース、ネオケストースなど）が含まれている）からのラフィノースの分離に採用している陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーは、同じ三糖類であるケストース類とラフィノースの分離が不良である。
【０００４】
このことがラフィノースを製造する場合に障害となり、現状では甜菜製糖工程汁などから効率的にラフィノースを製造することができない。つまり、ラフィノース製造工程において回収率を向上させるために結晶化時のシラップをクロマトグラフィー原料および結晶化原料に混合させ工程中を循環させた場合、ケストース類が工程中に蓄積しラフィノース純度が下がって、それ以上のラフィノースの回収が困難になる。
【０００５】
なお、ラフィノースとケストース類の分離精製については、特許文献１に記載の方法が提案されている。これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属菌由来のエキソ型イヌリン分解酵素を用いてラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解するというものである。しかし、この酵素では、実質的にはラフィノースと１−ケストースの混合液からのラフィノース分離のみしか行えず、例えば、当該酵素はネオケストースが分解できないためラフィノースとネオケストースの分離はできない。また、当該酵素の１−ケストースに対する活性の強さ自体についても、ラフィノース精製という目的で利用するには十分なものではない。
【０００６】
ここで、オリゴ糖を分解する酵素については、その基質特異性は様々であり、１−ケストースを分解できる酵素が当然にネオケストースなどの他のケストース類も分解できるとはいえないのが最近の当業界の見解である。例えば、本発明者らが最近見いだしたゴボウ由来のフルクタン加水分解酵素は、1−ケストースは分解するがネオケストースは分解しない（特許文献２）。また、ケストース類全般に対して分解活性を有する酵素では、同じ三糖類であるラフィノースも分解するのが通常である。
【０００７】
このように、ラフィノースと他のオリゴ糖の分離精製技術はいくつか提供されているものの、特に甜菜製糖工程汁から製造する場合などにおいては未だ満足できるものではないのが現状である。そのため、当業界において、甜菜製糖工程汁から製造する場合などにも利用することができる新規なラフィノース精製技術の開発が強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−４２９００号公報
【特許文献２】特開２０１１−５０３６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、甜菜製糖工程汁などのラフィノースとケストース類（いずれも三糖類）が混在しているラフィノース含有液から、ケストース類を選択的に除去してラフィノースを精製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究の結果、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて酵素処理することで、ラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解し、簡便かつ効率的にラフィノースを精製できることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて、ラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解し、ラフィノースは残存させること、を特徴とするラフィノースの精製方法。
（２）１−ケストース及びネオケストースを選択的に分解すること、を特徴とする（１）に記載の方法。
（３）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍであること、を特徴とする（１）又は（２）に記載の方法。
（４）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍが、ＪＣＭ１２１７株であること、を特徴とする（３）に記載の方法。
（５）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質、又は、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子がコードし且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０５５）であること、を特徴とする（１）又は（２）に記載の方法。
（８）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする（１）〜（２）、（７）のいずれか１つに記載の方法。
（９）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質、又は、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子がコードし且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする（１）〜（２）、（７）〜（８）のいずれか１つに記載の方法。
（１０）ラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液が、甜菜製糖工程汁であること、を特徴とする（１）〜（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１１）ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて処理したラフィノース含有液を、更にクロマト処理すること、を特徴とする（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、甜菜製糖工程汁などの、いずれも三糖類であるラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液から、ケストース類（１−ケストース、ネオケストース）を選択的に除去し、ラフィノースを簡便かつ効率的に精製することができる。したがって、本発明の精製方法を用いることで、有用な機能性素材である高純度ラフィノースを安価且つ大量に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株由来のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（一文字記号）を示す。
【図２】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株由来のβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
【図３】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株由来のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（一文字記号）を示す。
【図４】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株由来のβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明においては、ラフィノース含有液中のケストース類（１−ケストース、ネオケストース）を選択的に分解し、ラフィノースを分離・精製するため、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いる。
【００１５】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼは、これに限定されるものではないが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ由来のものが好ましい。一例として、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株由来のβ−フルクトフラノシダーゼ（配列番号１及び図１にそのアミノ酸配列を示す）を挙げることができる。
【００１６】
また、他の由来の例としては、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株由来のβ−フルクトフラノシダーゼ（配列番号３及び図３にそのアミノ酸配列を示す）を挙げることができる。
【００１７】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株については、信用できる保存機関である日本国茨城県つくば市高野台３丁目１番地の１の独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンターに保存され、当センターの発行する微生物株カタログにより自由に分譲されうる。
【００１８】
また、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株については、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２２０５５として平成２３年（２０１１年）１月１３日に寄託されている。
【００１９】
更には、上記菌株由来のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質、上記菌株由来のβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、例えばこのＤＮＡをプローブとして用いたストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによってハイブリダイズする遺伝子がコードし、且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質なども用いることができる。
【００２０】
なお、ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件の一例を示せば、７０％以上の相同性を有するＤＮＡどうしがハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡどうしがハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃の温度で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００２１】
上記のようなビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼをケストース類を含むラフィノース含有液に作用させれば、三糖類のうちケストース類（１−ケストース、ネオケストース）のみが選択的に分解され、クロマト処理によってラフィノースと分離されやすい二糖類及び／又は単糖類となる。この場合、当該β−フルクトフラノシダーゼはラフィノースに作用しないため、酵素処理後においてもラフィノースは保存される。なお、当該β−フルクトフラノシダーゼにより、１−ケストースにフルクトースが１分子結合したニストースや２分子結合したフルクトシルニストースもケストース類と同様に分解される。本発明におけるケストース類を含むラフィノース含有液の酵素分解反応において、ケストース類が１０〜８０重量％程度含まれていても問題なく処理できる。また、酵素分解反応における糖濃度は０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００２２】
酵素反応温度は、好ましくは２０〜５５℃、より好ましくは３０〜５０℃である。反応温度が２０℃未満では、反応時間がきわめて長くなる。また６０℃を超えると酵素活性の失活が早くなる。酵素反応時のｐＨは、好ましくはｐＨ４．５〜７．５、より好ましくはｐＨ４．５〜６．５である。
【００２３】
本発明の方法において、ケストース類を加水分解したラフィノース溶液からラフィノースを分離・精製する方法として、陽イオンクロマトグラフィーや陰イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー等のクロマト処理や、結晶化などが挙げられる。クロマト処理はこれらの方法を単独で用いてもよいし、組み合わせてもよい。また、移動床方式や擬似移動床方式、多成分分離循環方式等を利用してもよい。このクロマト処理により、ラフィノースと単糖類及び二糖類（場合によっては４つ以上の糖が結合したオリゴ糖）とを分離でき、また脱塩・脱色も行うことができる。
【００２４】
また、ラフィノースの結晶化については、冷却結晶化法（例えば特公昭５６−３９６４０、特開平１１−７５９００）や、蒸発結晶化法（例えば特開２００９−９５２８１）により行うことができる。
【００２５】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。
【実施例１】
【００２６】
（ビフィドバクテリウム属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼの取得）
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼの取得は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株を用い、これらから該当する遺伝子を取得し、大腸菌で組換えタンパク質として発現させる方法を用いた。
【００２７】
まず、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株をそれぞれＧＡＭブイヨン培地中で３７℃、１２時間静置培養した。その後、遠心分離処理（１７００×ｇ、１０分間）を行って菌体を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。そして、この菌体より、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製品）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００２８】
このゲノムＤＮＡを鋳型として、当該酵素の部分アミノ酸配列情報から作製した各種プライマーを用いてｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ及びｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行い、それぞれのβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子をクローニングし定法により塩基配列を決定した。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株のβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の塩基配列は配列番号２及び図２に、そのコードするタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１及び図１に示した。また、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株のβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の塩基配列は配列番号４及び図４に、そのコードするタンパク質のアミノ酸配列は配列番号３及び図３に示した。
【００２９】
これらの遺伝子を、大腸菌発現ベクターｐＥＴ−３２ｂに挿入し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３））を形質転換した。得られた形質転換体について、組換えタンパク質発現誘導培養を行い、菌体回収、バッファーによる洗浄（５０ｍM ＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）、超音波破砕、遠心分離処理（１７００×ｇ、１０分間）を行って粗酵素液（上清）を調製した。
【００３０】
粗酵素液から、ＴＡＬＯＮ ＣｅｌｌＴｈｒｕ Ｒｅｓｉｎ（タカラバイオ社製品、登録商標）で組換えタンパク質を回収し、更にクロマトグラフィー等によって精製し、β−フルクトフラノシダーゼ活性を有することを確認して精製酵素液とした。なお、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７株由来の酵素液を酵素１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株由来の酵素液を酵素２とした。
【００３１】
また、当該酵素液のβ−フルクトフラノシダーゼ活性測定については、１−ケストースの末端フルクトースを加水分解する反応を触媒し、フルクトース残基を遊離する活性をβ―フルクトフラノシダーゼ活性とした。
β―フルクトフラノシダーゼ活性測定方法は、２０ｍＭ １−ケストース５０μＬ、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．７）２５μＬ、酵素液２５μＬを混合し、３７℃で１０分間反応させた後、１００℃で５分間煮沸して反応を停止させた。反応停止後、反応生成物であるフルクトースを高速液体陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ分析条件、Ｄｉｏｎｅｘ社 Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ−１、室温、１５０ｍＭ 水酸化ナトリウム溶液１ｍＬ／ｍｉｎ、パルスドアンペロメトリー検出器）により定量した。酵素活性は、上記条件下で、１分間に１μｍｏｌのフルクトースを生成する酵素量を１Ｕ（ユニット）とした。
【実施例２】
【００３２】
（ラフィノース含有液からのラフィノース精製試験Ｉ）
実施例１で取得した酵素１及び酵素２について、以下のラフィノースと１−ケストースが混在しているラフィノース含有液からのラフィノース分離・精製試験を行った。
【００３３】
（ａ）酵素反応
１−ケストースが終濃度で５０ｍＭ（２．５％ｗ／ｖ）と、ラフィノースが終濃度で５０ｍＭ（２．５％）となるように、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に溶解した糖液８Ｌに、各β−フラクトフラノシダーゼ液（酵素１又は酵素２、６４００Ｕ）を混合し、３７℃で１時間酵素反応を行った。反応終了後、沸騰水中で５分間保持することで反応を停止した。反応溶液を高速液体陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ分析条件、Ｄｉｏｎｅｘ社 Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ−１、室温、１５０ｍＭ 水酸化ナトリウム溶液１ｍＬ／ｍｉｎ、パルスドアンペロメトリー検出器）で分析した。
【００３４】
結果を表１に示す。この結果から、上記酵素を用いて処理することで１−ケストースのみが分解され、ラフィノースは分解されずに保存された。なお、ラフィノースに対する活性を１とした１−ケストースに対する相対活性値の算出式は次の通りである。
【００３５】
相対活性値＝酵素分解によって分解した１−ケストース量（ｍｏｌ）／
酵素分解によって分解したラフィノース量（ｍｏｌ）
【００３６】
【表１】
【００３７】
（ｂ）ラフィノースの分離方法
反応溶液を１０００ｍＬ（糖濃度５８％ｗ／ｗ）にまで減圧濃縮する。反応液を陽イオン交換樹脂（ナトリウム型）に負荷し、水にて三糖、二糖類、単糖類の順に溶出させ、三糖溶出画分を集めた。
なお、反応溶液を１０００ｍＬ（糖濃度７７％ｗ／ｖ）にまで減圧濃縮し、温度約８０℃で擬似移動床法による多成分分離装置に通液して多成分分離（三糖画分、二糖類画分、単糖類画分）を行うことによっても同様の結果を得ることができた。
【００３８】
（ｃ）ラフィノースの結晶化
上記（ｂ）にて得られた三糖画分（ラフィノース純度９０〜９８％）を５８％（ｗ／ｗ）まで濃縮した後、液温を４０時間で最終２０℃迄に、時間の経過とともに大略逆比例的に低下させた。また、攪拌機の攪拌速度は１０ｒｐｍで行った。得られた白下を、分離機で分離して、ラフィノース結晶と振蜜を得た。ラフィノースの結晶化率は６０％であった（表２）。これに対し、酵素反応前のケストース：ラフィノース＝１：１混合液についても同様に結晶化を行ったが、ラフィノースの結晶化率は３５％であった（表２）。なお、ラフィノースの結晶化率の算出式は次の通りである。
【００３９】
ラフィノース結晶化率 ＝
｛結晶純度×（白下純度―振蜜純度）｝×１００／｛白下純度×（結晶純度―振蜜純度）｝
【００４０】
【表２】
【実施例３】
【００４１】
（ラフィノース含有液からのラフィノース精製試験ＩＩ）
実施例１で取得した酵素１及び酵素２について、以下のラフィノースと１−ケストース、ネオケストースが混在しているラフィノース含有液からのラフィノース分離・精製試験を行った。
【００４２】
１−ケストースが終濃度で５０ｍＭ（２．５％ｗ／ｖ）と、ネオケストースが終濃度で５０ｍＭ（２．５％ｗ／ｖ）、さらにラフィノースが終濃度で５０ｍＭ（２．５％）となるように、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に溶解した糖液８Ｌに、各β−フラクトフラノシダーゼ液（酵素１又は酵素２、６４００Ｕ）を混合し、３７℃で１時間酵素反応を行った。反応終了後、沸騰水中で５分間保持することで反応を停止した。反応溶液を高速液体陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ分析条件、Ｄｉｏｎｅｘ社 Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ−１、室温、１５０ｍＭ 水酸化ナトリウム溶液１ｍＬ／ｍｉｎ、パルスドアンペロメトリー検出器）で分析した。
【００４３】
結果を表３〜５に示す。この結果から、上記酵素を用いて処理することで１−ケストース及びネオケストースが分解され、ラフィノースは分解されずに保存された。なお、ラフィノースに対する活性を１とした１−ケストース、ネオケストースに対する相対活性値の算出式は次の通りである。
【００４４】
相対活性値＝酵素分解によって分解した１−ケストース又はネオケストース量（ｍｏｌ）
／酵素分解によって分解したラフィノース量（ｍｏｌ）
【００４５】
【表３】
【００４６】
【表４】
【００４７】
【表５】
【００４８】
これらを、実施例２と同様にクロマト処理及びラフィノースの結晶化を行い、ラフィノースの結晶化率は実施例２と同じ６０％であったのに対し、ケストース類とラフィノースの混合液は３５％であった（表６）。なお、ラフィノースの結晶化率の算出については実施例２の方法に準じた。
【００４９】
【表６】
【００５０】
本発明を要約すれば、以下の通りである。
【００５１】
本発明は、甜菜製糖工程汁などのラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液から、三糖類であるケストース類を選択的に除去して同じ三糖類であるラフィノースを分離・精製する方法を提供することを目的とする。
【００５２】
そして、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて、三糖類であるラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解することで、簡便かつ効率的にラフィノースを精製する。
【受託番号】
【００５３】
本発明において寄託されている微生物の受託番号を下記に示す。
（１）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０５５）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて、ラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解し、ラフィノースは残存させること、を特徴とするラフィノースの精製方法。
【請求項２】
１−ケストース及びネオケストースを選択的に分解すること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍであること、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍが、ＪＣＭ１２１７株であること、を特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質、又は、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子がコードし且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０５５）であること、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする請求項１〜２、７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質、又は、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子がコードし且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする請求項１〜２、７〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液が、甜菜製糖工程汁であること、を特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて処理したラフィノース含有液を、更にクロマト処理すること、を特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて、ラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液中のケストース類を選択的に分解し、ラフィノースは残存させること、を特徴とするラフィノースの精製方法。
【請求項２】
１−ケストース及びネオケストースを選択的に分解すること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍであること、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍが、ＪＣＭ１２１７株であること、を特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質、又は、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子がコードし且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＴ８３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０５５）であること、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする請求項１〜２、７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼが、配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質、又は、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子がコードし且つβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であること、を特徴とする請求項１〜２、７〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ラフィノースとケストース類が混在しているラフィノース含有液が、甜菜製糖工程汁であること、を特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて処理したラフィノース含有液を、更にクロマト処理すること、を特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−２７３５９（Ｐ２０１３−２７３５９Ａ）
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６６０６４（Ｐ２０１１−１６６０６４）
【出願日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０３０９６５９１）学校法人酪農学園 (13)
【出願人】（０００２３１９８１）日本甜菜製糖株式会社 (58)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０３０９６５９１）学校法人酪農学園 (13)
【出願人】（０００２３１９８１）日本甜菜製糖株式会社 (58)
【Ｆターム（参考）】
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