リアルタイムマルチプレックス増幅によるＨＰＶ検出および定量化
【課題】粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶ、特にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出に有用な増幅プライマーおよび検出プローブならびにそのようなプライマー及びプローブを設計及び構築するのに適した鋳型配列を提供する。
【解決手段】増幅および検出系は、群を標的とする系であり、すなわち、Ａ５、Ａ６、Ａ７およびＡ９を標的とする系である。マルチプレックスでのＨＰＶの増幅ならびにリアルタイム検出を可能にし、シングルチューブアッセイにおいて少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶを検出することができる。さらに、リアルタイムマルチプレックス増幅において、信頼できるＨＰＶの定量を可能にする。
【解決手段】増幅および検出系は、群を標的とする系であり、すなわち、Ａ５、Ａ６、Ａ７およびＡ９を標的とする系である。マルチプレックスでのＨＰＶの増幅ならびにリアルタイム検出を可能にし、シングルチューブアッセイにおいて少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶを検出することができる。さらに、リアルタイムマルチプレックス増幅において、信頼できるＨＰＶの定量を可能にする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも１のＨＰＶをサンプル中において検出する方法であって、前記検出は、少なくとも１のアンプリコンが、増幅プライマーを用いた増幅により、前記サンプルまたはそれらの核酸物質から作られたかどうかを決定することを含んでなり、少なくとも１のアンプリコンの生成は、粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも１のＨＰＶが前記サンプル中に存在することを示し、前記増幅プライマーは、
−Ａ６群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ６参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ６参照鋳型配列は、配列番号４２０（受付番号NC_001594.1）のＨＰＶ５６配列の４１３〜７９１位からなる断片（配列番号３３７）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ６を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および／または
−Ａ５群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ５参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ５参照鋳型配列は、配列番号４２１（受付番号NC_001533.1）のＨＰＶ５１配列の６７８〜９０２位からなる断片（配列番号３２６）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ５を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および／または
−Ａ９群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ９参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ９参照鋳型配列は、配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の２７０７〜２７９４位からなる断片（配列番号１２２）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ９を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片であるか、または、配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の３６００〜３８４０位からなる断片（配列番号３７７）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ９を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および／または
−Ａ７群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ７参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ７参照鋳型配列は、配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の１８９５〜２１０３位からなる断片（配列番号４８）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ７を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片であるか、または、配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の９１６〜１０４４位からなる断片（配列番号６５）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ７を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
を含んでなることを特徴とする方法：
ここで、前記Ａ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７参照鋳型配列は、少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ（ＨＰＶ５６、５１、５８、３３、５２、３５、３１、１６、６８、３９、５９、４５および１８）のリアルタイムマルチプレックス増幅、特にそのようなＨＰＶのリアルタイムの定量的なマルチプレックス増幅を可能にするプライマーおよびアンプリコンアニーリングプローブを構築および産生するのに適した、群に基づく参照鋳型配列であるという特別な技術的特徴を有する。
【請求項２】
請求項１に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ６参照鋳型配列は、配列番号２５〜２９および３３４〜３３８の１つであり、前記Ａ６参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ６を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ５参照鋳型配列は、配列番号１〜５および３２０〜３３３の１つであり、前記Ａ５参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ５を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ９参照鋳型配列は、配列番号１２２〜２１０および３５９〜４１９の１つであり、前記Ａ９参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ９を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ７参照鋳型配列は、配列番号４６〜６７および３３９〜３５８の１つであり、前記Ａ７参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ７を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、以下のＡ９群のＨＰＶ；ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３１のそれぞれに由来するＥ１およびＥ２遺伝子からなるＡ９標的領域に由来する少なくとも８０〜２６０ヌクレオチド、好ましくは８５〜２５０ヌクレオチド、より好ましくは８８〜２４１ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適した配列であること、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、以下のＡ７群のＨＰＶ；ＨＰＶ６８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ４５のそれぞれに由来するＥ１遺伝子からなるＡ７標的領域に由来する少なくとも１００〜２２０ヌクレオチド、好ましくは１２０〜２１５ヌクレオチド、より好ましくは１２５〜２０９ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適した配列であること
を特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載のＨＰＶ検出方法であって、
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ５３のＥ６およびＥ７遺伝子からなるＡ６標的領域に由来する少なくとも９０〜３９０ヌクレオチド、好ましくは９５〜３８５ヌクレオチド、より好ましくは１００〜３７９ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および／または
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ８２のＥ７およびＥ１遺伝子からなるＡ５標的領域に由来する少なくとも９０〜２４０ヌクレオチド、好ましくは１００〜２３０ヌクレオチド、より好ましくは１０６〜２２５ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ６７のＥ１およびＥ２遺伝子からなるＡ９標的領域に由来する少なくとも８０〜２６０ヌクレオチド、好ましくは８５〜２５０ヌクレオチド、より好ましくは８８〜２４１ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ８５のＥ１およびＥ２遺伝子からなるＡ７標的領域に由来する少なくとも１００〜２２０ヌクレオチド、好ましくは１２０〜２１５ヌクレオチド、より好ましくは１２５〜２０９ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること
を特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のプライマーは１７〜２５ヌクレオチドからなることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１の粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶは、発癌性の肛門性器ＨＰＶであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１の粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶは、発癌性の子宮頸部ＨＰＶであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のプライマーは、Ａ６群またはＡ５群またはＡ９群またはＡ７群に特異的であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はシングルチューブマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、前記少なくとも１のアンプリコンにアニールすることが意図された少なくとも１のプローブを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はリアルタイム増幅であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、少なくとも１のＡ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７を標的とするプローブを使用することにより行われ、その配列は、前記少なくとも２のＡ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７を標的とするプライマーによりそれぞれ産生される少なくとも１のアンプリコンの検出のためのプローブとして使用するのに適していることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はリアルタイムマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅は定量的なリアルタイムマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、配列番号３０〜３４の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号３５〜３７の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号３８〜４０の１つもしくはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ６を標的とするプローブ、ならびに任意に少なくとも１の５’および／または３’検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係なアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ６を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号４１〜４５の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、配列番号６〜１０の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号１１〜１５の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号１６〜１９の１つもしくはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ５を標的とするプローブ、ならびに任意に少なくとも１の検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ５を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号２０〜２４の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、配列番号２１１〜２３９の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号２４０〜２６５の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号２６６〜２８２の１つまたはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ９を標的とするプローブ、ならびに任意に、少なくとも１の検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ９を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号２８３〜３１９の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、配列番号６８〜７８の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号７９〜８７の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号８８〜１０１の１つまたはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ７を標的とするプローブ、ならびに任意に、少なくとも１の検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ７を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号１０２〜１２１の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はＰＣＲであることを特徴とする方法。
【請求項３６】
Ａ６、Ａ５、Ａ９またはＡ７群の少なくとも１のＨＰＶを含有するＨＰＶ含有サンプルにおいて、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法の実行により得られるアンプリコン。
【請求項３７】
Ａ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７群のＨＰＶを増幅するためにシングルチューブマルチプレックスにおいて使用することができるプライマーの設計において、ならびに前記増幅されたＨＰＶのリアルタイム検出のための前記シングルチューブマルチプレックスにおいて使用することができるプローブの設計において、参照鋳型配列として使用するのに適したポリヌクレオチドであって、前記参照鋳型ポリヌクレオチドは、
−Ａ６群について：配列番号４２０（受付番号NC_001594.1）のＨＰＶ５６配列の４１３〜７９１位からなる断片（配列番号３３７）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；
−Ａ５群について：配列番号４２１（受付番号NC_001533.1）のＨＰＶ５１配列の６７８〜９０２位からなる断片（配列番号３２６）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；
−Ａ９群について：配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の２７０７〜２７９４位からなる断片（配列番号１２２）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；あるいは、配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の３６００〜３８４０位からなる断片（配列番号３７７）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；
−Ａ７群について：配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の１８９５〜２１０３位からなる断片（配列番号４８）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；あるいは、配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の９１６〜１０４４位からなる断片（配列番号６５）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列
から選択され、前記保存的な断片は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする群を標的とするプライマーを構築し、産生するための適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ６を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号２５〜２９および３３４〜３３８の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ５を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号１〜５および３２０〜３３３の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ９を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号１２２〜２１０および３５９〜４１９の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ７を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号４６〜６７および３３９〜３５８の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ増幅に適した以下に示すプライマー：
−配列番号３０〜３４および配列番号３５〜３７のいずれか１からなる、Ａ６を標的とするプライマー；または
−配列番号６〜１０および配列番号１１〜１５のいずれか１からなる、Ａ５を標的とするプライマー；または
−配列番号２１１〜２３９および配列番号２４０〜２６５のいずれか１からなる、Ａ９を標的とするプライマー；または
−配列番号６８〜７８および配列番号７９〜８７のいずれか１からなる、Ａ７を標的とするプライマー。
【請求項４３】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ増幅に適したプライマー系であって、
−配列番号３０〜３４の１つからなる少なくとも１のＡ６を標的とするプライマーおよび配列番号３５〜３７の１つからなる少なくとも１のＡ６を標的とするプライマー；および／または
−配列番号６〜１０の１つからなる少なくとも１のＡ５を標的とするプライマーおよび配列番号１１〜１５の１つからなる少なくとも１のＡ５を標的とするプライマー；および／または
−配列番号２１１〜２３９の１つからなる少なくとも１のＡ９を標的とするプライマーおよび配列番号２４０〜２６５の１つからなる少なくとも１のＡ９を標的とするプライマー；および／または
−配列番号６８〜７８の１つからなる少なくとも１のＡ７を標的とするプライマーおよび配列番号７９〜８７の１つからなる少なくとも１のＡ７を標的とするプライマー
を含んでなるプライマー系。
【請求項４４】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ検出に適した以下に示すプローブ：
−配列番号３８〜４０のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ６を標的とするプローブ；または
−配列番号１６〜１９のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ５を標的とするプローブ；または
−配列番号２６６〜２８２のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ９を標的とするプローブ；または
−配列番号８８〜１０１のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ７を標的とするプローブ。
【請求項４５】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ検出に適した以下に示すビーコンプローブ：
−配列番号４１〜４５のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ６を標的とするプローブ；または
−配列番号２０〜２４のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ５を標的とするプローブ；または
−配列番号２８３〜３１９のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ９を標的とするプローブ；または
−配列番号１０２〜１２１のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ７を標的とするプローブ。
【請求項４６】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ増幅に適したプライマーおよびプローブ系であって、請求項５３に記載の少なくとも１のプライマーおよび請求項５４または５５に記載の少なくとも１のプローブを含んでなるプライマーおよびプローブ系。
【請求項４７】
請求項４３に記載の少なくとも１のプライマー系を用いて、ＨＰＶのＡ６、Ａ５、Ａ９またはＡ７群に由来する少なくとも１の核酸を増幅することにより得られるアンプリコン。
【請求項４８】
請求項３６または４７に記載の少なくとも１のアンプリコンを含んでなる増幅組成物。
【請求項４９】
以下を含んでなる、子宮頸部新形成または子宮頸癌の診断または予後のためのキット：
−請求項４３に記載の少なくとも１のプライマー系、および／または
−請求項４４または４５に記載の少なくとも１のプローブ、
−任意に、それらの使用および／またはヌクレオチドについての説明書。
【請求項１】
粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも１のＨＰＶをサンプル中において検出する方法であって、前記検出は、少なくとも１のアンプリコンが、増幅プライマーを用いた増幅により、前記サンプルまたはそれらの核酸物質から作られたかどうかを決定することを含んでなり、少なくとも１のアンプリコンの生成は、粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも１のＨＰＶが前記サンプル中に存在することを示し、前記増幅プライマーは、
−Ａ６群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ６参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ６参照鋳型配列は、配列番号４２０（受付番号NC_001594.1）のＨＰＶ５６配列の４１３〜７９１位からなる断片（配列番号３３７）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ６を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および／または
−Ａ５群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ５参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ５参照鋳型配列は、配列番号４２１（受付番号NC_001533.1）のＨＰＶ５１配列の６７８〜９０２位からなる断片（配列番号３２６）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ５を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および／または
−Ａ９群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ９参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ９参照鋳型配列は、配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の２７０７〜２７９４位からなる断片（配列番号１２２）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ９を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片であるか、または、配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の３６００〜３８４０位からなる断片（配列番号３７７）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ９を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および／または
−Ａ７群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ７参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ７参照鋳型配列は、配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の１８９５〜２１０３位からなる断片（配列番号４８）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ７を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片であるか、または、配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の９１６〜１０４４位からなる断片（配列番号６５）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ７を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
を含んでなることを特徴とする方法：
ここで、前記Ａ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７参照鋳型配列は、少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ（ＨＰＶ５６、５１、５８、３３、５２、３５、３１、１６、６８、３９、５９、４５および１８）のリアルタイムマルチプレックス増幅、特にそのようなＨＰＶのリアルタイムの定量的なマルチプレックス増幅を可能にするプライマーおよびアンプリコンアニーリングプローブを構築および産生するのに適した、群に基づく参照鋳型配列であるという特別な技術的特徴を有する。
【請求項２】
請求項１に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ６参照鋳型配列は、配列番号２５〜２９および３３４〜３３８の１つであり、前記Ａ６参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ６を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ５参照鋳型配列は、配列番号１〜５および３２０〜３３３の１つであり、前記Ａ５参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ５を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ９参照鋳型配列は、配列番号１２２〜２１０および３５９〜４１９の１つであり、前記Ａ９参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ９を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ７参照鋳型配列は、配列番号４６〜６７および３３９〜３５８の１つであり、前記Ａ７参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ７を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、以下のＡ９群のＨＰＶ；ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３１のそれぞれに由来するＥ１およびＥ２遺伝子からなるＡ９標的領域に由来する少なくとも８０〜２６０ヌクレオチド、好ましくは８５〜２５０ヌクレオチド、より好ましくは８８〜２４１ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適した配列であること、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、以下のＡ７群のＨＰＶ；ＨＰＶ６８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ４５のそれぞれに由来するＥ１遺伝子からなるＡ７標的領域に由来する少なくとも１００〜２２０ヌクレオチド、好ましくは１２０〜２１５ヌクレオチド、より好ましくは１２５〜２０９ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適した配列であること
を特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載のＨＰＶ検出方法であって、
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ５３のＥ６およびＥ７遺伝子からなるＡ６標的領域に由来する少なくとも９０〜３９０ヌクレオチド、好ましくは９５〜３８５ヌクレオチド、より好ましくは１００〜３７９ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および／または
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ８２のＥ７およびＥ１遺伝子からなるＡ５標的領域に由来する少なくとも９０〜２４０ヌクレオチド、好ましくは１００〜２３０ヌクレオチド、より好ましくは１０６〜２２５ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ６７のＥ１およびＥ２遺伝子からなるＡ９標的領域に由来する少なくとも８０〜２６０ヌクレオチド、好ましくは８５〜２５０ヌクレオチド、より好ましくは８８〜２４１ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ８５のＥ１およびＥ２遺伝子からなるＡ７標的領域に由来する少なくとも１００〜２２０ヌクレオチド、好ましくは１２０〜２１５ヌクレオチド、より好ましくは１２５〜２０９ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること
を特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のプライマーは１７〜２５ヌクレオチドからなることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１の粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶは、発癌性の肛門性器ＨＰＶであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１の粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶは、発癌性の子宮頸部ＨＰＶであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のプライマーは、Ａ６群またはＡ５群またはＡ９群またはＡ７群に特異的であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はシングルチューブマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、前記少なくとも１のアンプリコンにアニールすることが意図された少なくとも１のプローブを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はリアルタイム増幅であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、少なくとも１のＡ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７を標的とするプローブを使用することにより行われ、その配列は、前記少なくとも２のＡ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７を標的とするプライマーによりそれぞれ産生される少なくとも１のアンプリコンの検出のためのプローブとして使用するのに適していることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はリアルタイムマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅は定量的なリアルタイムマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、配列番号３０〜３４の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号３５〜３７の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号３８〜４０の１つもしくはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ６を標的とするプローブ、ならびに任意に少なくとも１の５’および／または３’検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係なアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ６を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号４１〜４５の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、配列番号６〜１０の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号１１〜１５の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号１６〜１９の１つもしくはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ５を標的とするプローブ、ならびに任意に少なくとも１の検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ５を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号２０〜２４の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、配列番号２１１〜２３９の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号２４０〜２６５の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号２６６〜２８２の１つまたはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ９を標的とするプローブ、ならびに任意に、少なくとも１の検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ９を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号２８３〜３１９の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、配列番号６８〜７８の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号７９〜８７の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号８８〜１０１の１つまたはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ７を標的とするプローブ、ならびに任意に、少なくとも１の検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ７を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号１０２〜１２１の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はＰＣＲであることを特徴とする方法。
【請求項３６】
Ａ６、Ａ５、Ａ９またはＡ７群の少なくとも１のＨＰＶを含有するＨＰＶ含有サンプルにおいて、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法の実行により得られるアンプリコン。
【請求項３７】
Ａ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７群のＨＰＶを増幅するためにシングルチューブマルチプレックスにおいて使用することができるプライマーの設計において、ならびに前記増幅されたＨＰＶのリアルタイム検出のための前記シングルチューブマルチプレックスにおいて使用することができるプローブの設計において、参照鋳型配列として使用するのに適したポリヌクレオチドであって、前記参照鋳型ポリヌクレオチドは、
−Ａ６群について：配列番号４２０（受付番号NC_001594.1）のＨＰＶ５６配列の４１３〜７９１位からなる断片（配列番号３３７）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；
−Ａ５群について：配列番号４２１（受付番号NC_001533.1）のＨＰＶ５１配列の６７８〜９０２位からなる断片（配列番号３２６）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；
−Ａ９群について：配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の２７０７〜２７９４位からなる断片（配列番号１２２）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；あるいは、配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の３６００〜３８４０位からなる断片（配列番号３７７）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；
−Ａ７群について：配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の１８９５〜２１０３位からなる断片（配列番号４８）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；あるいは、配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の９１６〜１０４４位からなる断片（配列番号６５）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列
から選択され、前記保存的な断片は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする群を標的とするプライマーを構築し、産生するための適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ６を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号２５〜２９および３３４〜３３８の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ５を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号１〜５および３２０〜３３３の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ９を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号１２２〜２１０および３５９〜４１９の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ７を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号４６〜６７および３３９〜３５８の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ増幅に適した以下に示すプライマー：
−配列番号３０〜３４および配列番号３５〜３７のいずれか１からなる、Ａ６を標的とするプライマー；または
−配列番号６〜１０および配列番号１１〜１５のいずれか１からなる、Ａ５を標的とするプライマー；または
−配列番号２１１〜２３９および配列番号２４０〜２６５のいずれか１からなる、Ａ９を標的とするプライマー；または
−配列番号６８〜７８および配列番号７９〜８７のいずれか１からなる、Ａ７を標的とするプライマー。
【請求項４３】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ増幅に適したプライマー系であって、
−配列番号３０〜３４の１つからなる少なくとも１のＡ６を標的とするプライマーおよび配列番号３５〜３７の１つからなる少なくとも１のＡ６を標的とするプライマー；および／または
−配列番号６〜１０の１つからなる少なくとも１のＡ５を標的とするプライマーおよび配列番号１１〜１５の１つからなる少なくとも１のＡ５を標的とするプライマー；および／または
−配列番号２１１〜２３９の１つからなる少なくとも１のＡ９を標的とするプライマーおよび配列番号２４０〜２６５の１つからなる少なくとも１のＡ９を標的とするプライマー；および／または
−配列番号６８〜７８の１つからなる少なくとも１のＡ７を標的とするプライマーおよび配列番号７９〜８７の１つからなる少なくとも１のＡ７を標的とするプライマー
を含んでなるプライマー系。
【請求項４４】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ検出に適した以下に示すプローブ：
−配列番号３８〜４０のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ６を標的とするプローブ；または
−配列番号１６〜１９のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ５を標的とするプローブ；または
−配列番号２６６〜２８２のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ９を標的とするプローブ；または
−配列番号８８〜１０１のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ７を標的とするプローブ。
【請求項４５】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ検出に適した以下に示すビーコンプローブ：
−配列番号４１〜４５のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ６を標的とするプローブ；または
−配列番号２０〜２４のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ５を標的とするプローブ；または
−配列番号２８３〜３１９のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ９を標的とするプローブ；または
−配列番号１０２〜１２１のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ７を標的とするプローブ。
【請求項４６】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ増幅に適したプライマーおよびプローブ系であって、請求項５３に記載の少なくとも１のプライマーおよび請求項５４または５５に記載の少なくとも１のプローブを含んでなるプライマーおよびプローブ系。
【請求項４７】
請求項４３に記載の少なくとも１のプライマー系を用いて、ＨＰＶのＡ６、Ａ５、Ａ９またはＡ７群に由来する少なくとも１の核酸を増幅することにより得られるアンプリコン。
【請求項４８】
請求項３６または４７に記載の少なくとも１のアンプリコンを含んでなる増幅組成物。
【請求項４９】
以下を含んでなる、子宮頸部新形成または子宮頸癌の診断または予後のためのキット：
−請求項４３に記載の少なくとも１のプライマー系、および／または
−請求項４４または４５に記載の少なくとも１のプローブ、
−任意に、それらの使用および／またはヌクレオチドについての説明書。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【図５−５】
【図５−６】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図６−５】
【図６−６】
【図７】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【図５−５】
【図５−６】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図６−５】
【図６−６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−１６１３１４（Ｐ２０１２−１６１３１４Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−４９０４１（Ｐ２０１２−４９０４１）
【出願日】平成２４年３月６日（２０１２．３．６）
【分割の表示】特願２００９−５０４５７１（Ｐ２００９−５０４５７１）の分割
【原出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【出願人】（５９２０９６７１９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−４９０４１（Ｐ２０１２−４９０４１）
【出願日】平成２４年３月６日（２０１２．３．６）
【分割の表示】特願２００９−５０４５７１（Ｐ２００９−５０４５７１）の分割
【原出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【出願人】（５９２０９６７１９）
【Ｆターム（参考）】
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