【課題】リガンド依存的転写に使用するための融合タンパク質を提供する。
【解決手段】細胞内受容体由来の改変されたリガンド結合ドメインと作動可能に連結したヌクレオチド結合ドメインを含む融合タンパク質、さらに転写制御ドメインも含む融合タンパク質、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、およびトランスフェクションされた細胞。該ヌクレオチド結合ドメインは、約３ないし約１８ヌクレオチドの隣接する標的ヌクレオチド配列に結合する亜鉛フィンガーペプチドである。該融合タンパク質は、遺伝子治療に用いられる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内受容体由来の改変されたリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と作動可能に連結したヌクレオチド結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む融合タンパク質であって、
融合タンパク質が、リガンド活性化転写レギュレーターであり；
ヌクレオチド結合ドメインが、亜鉛フィンガーモジュラー部分を含む多指（polydactyl）亜鉛フィンガーであり；
ヌクレオチド結合ドメインの各モジュラー部分が、少なくとも３つのヌクレオチドの隣接するヌクレオチド配列と相互作用し；
ＬＢＤのリガンド特異性が、ＬＢＤが誘導された天然細胞内受容体のリガンド結合ドメインのリガンド特異性と比較してそのリガンド特異性が変化するように改変され、それによって融合タンパク質を活性化するリガンドがＬＢＤが誘導されたレセプターを活性化するリガンドではなく、そして、
融合タンパク質が少なくとも６つの亜鉛フィンガーモジュラー部分を含む、
融合タンパク質。
【請求項２】
モノマーである、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３】
第１のモノマーおよび第２のモノマーを有するダイマーである、請求項１または請求項２の融合タンパク質。
【請求項４】
ヘテロダイマーである、請求項３の融合タンパク質。
【請求項５】
ホモダイマーである、請求項３の融合タンパク質。
【請求項６】
作動可能に連結した転写制御ドメインをさらに含む、請求項１−５のいずれかの融合タンパク質。
【請求項７】
細胞内受容体が核ホルモン受容体である、請求項１−６のいずれかの融合タンパク質。
【請求項８】
亜鉛フィンガーが、式（ＧＮＮ)_ｎ（ただし、Ｇはグアニジン、Ｎは任意のヌクレオチド、そしてｎは３ないし６の整数である。）のヌクレオチド配列に結合する、請求項１−７のいずれかの融合タンパク質。
【請求項９】
ＤＢＤがＣ２Ｈ２亜鉛フィンガー由来の亜鉛フィンガーモジュラー部分を含む、請求項１−８のいずれかの融合タンパク質。
【請求項１０】
細胞内受容体が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、グルココルチコイド−α受容体、グルココルチコイド−β受容体、ミネラルコルチコイド受容体、アンドロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、ビタミンＤ受容体、ＣＯＵＰ−ＴＦ受容体、エクジソン受容体、Ｎｕｒｒ−Ｉ受容体およびオーファン受容体からなる群から選択される核ホルモン受容体である、請求項１−９のいずれかの融合タンパク質。
【請求項１１】
細胞内受容体がステロイド受容体である、請求項１−９のいずれかの融合タンパク質。
【請求項１２】
ホルモン受容体が、プロゲステロン受容体変異体またはエストロゲン受容体変異体である、請求項１０の融合タンパク質。
【請求項１３】
転写制御ドメインが転写活性化ドメインを含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１４】
転写制御ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＴＡ２、ＳＴＡＴ−６、ｐ６５ならびにそれらの転写活性化活性を有する誘導体類、多量体および組合せからなる群から選択される、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１５】
転写制御ドメインが、核ホルモン受容体転写活性化ドメインまたはその転写活性化活性を有する変異体を含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１６】
転写制御ドメインが、ステロイドホルモン受容体転写活性化ドメインまたはその転写活性化活性を維持している変異体を含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１７】
転写制御ドメインが、ウイルス転写活性化ドメインまたはその転写活性化活性を維持している変異体を含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１８】
転写制御ドメインが、ＶＰ１６転写活性化ドメインまたはその変異体を含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１９】
転写制御ドメインが、転写抑制ドメインを含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項２０】
転写抑制ドメインが、ＥＲＤ、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、デアセチラーゼ、ならびにそれらの誘導体類、多量体および組合せ、例えばＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、（ＫＲＡＢ）_２、（ＫＲＡＢ）_３、ＫＲＡＢ−Ａ、（ＫＲＡＢ−Ａ）_２、（ＳＩＤ）_２、（ＫＲＡＢ−Ａ）−ＳＩＤおよびＳＩＤ−（ＫＲＡＢ−Ａ）からなる群から選択される、請求項１９の融合タンパク質。
【請求項２１】
転写抑制ドメインが、ＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、（ＫＲＡＢ）_２、（ＫＲＡＢ）_３、ＫＲＡＢ−Ａ、（ＫＲＡＢ−Ａ）_２、（ＳＩＤ）_２、（ＫＲＡＢ−Ａ）−ＳＩＤおよびＳＩＤ−（ＫＲＡＢ−Ａ）からなる群から選択されるドメインの組合せである、請求項１９の融合タンパク質。
【請求項２２】
配列番号１ないし配列番号１８のいずれかに示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２３】
核酸結合ドメインが、標的核酸分子と約１．０ナノモルより小さい解離定数で結合する、請求項１−２２のいずれかの融合タンパク質。
【請求項２４】
２つのリガンド結合ドメインを含む、請求項１−２３のいずれかの融合タンパク質。
【請求項２５】
リガンド結合ドメインが同じである、請求項２４の融合タンパク質。
【請求項２６】
リガンド結合ドメインが異なっている、請求項２４の融合タンパク質。
【請求項２７】
請求項１−２６のいずれかの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２８】
請求項１−２６のいずれかの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２９】
融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む請求項２８のベクターであって、
融合タンパク質が細胞内受容体由来のリガンド結合ドメインと作動可能に連結したヌクレオチド結合ドメインを含み、ヌクレオチド結合ドメインが少なくとも１８個のヌクレオチドの隣接するヌクレオチド配列と相互作用する多指Ｃ２Ｈ２亜鉛フィンガーペプチドまたはそのモジュラー部分であり、
融合タンパク質がリガンド活性化転写レギュレーターである、
ベクター。
【請求項３０】
ウイルスベクターである、請求項２８または請求項２９のベクター。
【請求項３１】
ウイルスベクターがＤＮＡウイルスまたはレトロウイルスに由来する、請求項３０のベクター。
【請求項３２】
アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３０のベクター。
【請求項３３】
請求項２８−３２のいずれかのベクターを含む単離細胞。
【請求項３４】
真核生物細胞である、請求項３３の細胞。
【請求項３５】
有効量の請求項１−２６のいずれかの融合タンパク質または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および医薬的に許容し得る賦形剤を含む、遺伝子発現を制御するための医薬組成物。
【請求項３６】
単回投与用に製剤された、請求項３５の医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１−２６のいずれかの融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸分子；および融合タンパク質または核酸分子の非ウイルス送達を達成するための試剤を含む、非ウイルス送達システム。
【請求項３８】
発現カセットを含む核酸分子をさらに含み、該発現カセットは、融合タンパク質の核酸結合ドメインが相互作用するヌクレオチド配列を含有するものである、請求項３７の非ウイルス送達システム。
【請求項３９】
非ウイルス送達を達成するための試剤が、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡ直接注入用試剤、ＣａＰＯ_４沈殿用試剤、遺伝子銃法用試剤、エレクトロポレーション用試剤、リポソームおよびリポフェクション用試剤からなる群から選択される、請求項３７または請求項３８の非ウイルス送達システム。
【請求項４０】
融合タンパク質のヌクレオチド結合ドメインが結合する核酸配列を含む遺伝子の転写を調節するための薬剤の製造における、請求項１−２６のいずれかの融合タンパク質または請求項２７の核酸分子の使用。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【公開番号】特開２００９−２７３４６３（Ｐ２００９−２７３４６３Ａ）
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４７５２０（Ｐ２００９−１４７５２０）
【出願日】平成２１年６月２２日（２００９．６．２２）
【分割の表示】特願２００１−５３３８４０（Ｐ２００１−５３３８４０）の分割
【原出願日】平成１２年１０月２３日（２０００．１０．２３）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ　スクリップス　リサーチ　インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】