リグニンペルオキシダーゼ変異体
【課題】耐熱性及び耐過酸化水素性に優れたリグニンペルオキシダーゼ変異体を提供する。
【解決手段】リグニンペルオキシダーゼ変異体は、白色腐朽菌由来の特定のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。リグニンペルオキシダーゼ変異体は、前記のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質である。
【解決手段】リグニンペルオキシダーゼ変異体は、白色腐朽菌由来の特定のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。リグニンペルオキシダーゼ変異体は、前記のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白色腐朽菌に由来するリグニンペルオキシダーゼ変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、自動車用燃料として、ガソリン−エタノール混合燃料を用いることが検討されている。前記エタノールとしては、植物性物質の発酵、蒸留により得たバイオエタノールを用いると、土壌管理を厳密に行うことにより所謂カーボンニュートラル効果を得ることができ、二酸化炭素の排出量を低減して地球温暖化の防止に寄与できるものと考えられている。
【０００３】
しかし、前記植物性物質として、例えばサトウキビ、トウモロコシ等の農作物を用いると、該農作物がエタノールの原料として大量に消費されることにより、食料としての供給量が減少するという問題がある。そこで、前記植物性物質として、食用ではないリグノセルロース系バイオマスを用いてエタノールを製造する技術が検討されている。前記リグノセルロース系バイオマスは、セルロースを含んでおり、該セルロースを酵素糖化によりグルコースに分解し、得られたグルコースを発酵させてバイオエタノールを得ることができる。
【０００４】
ところが、前記リグノセルロースは、セルロースの他にヘミセルロース及びリグニンを主な構成成分としており、通常該セルロース及び該ヘミセルロースは、該リグニンにより強固に結合されている。従って、前記リグノセルロースはそのままでは前記酵素糖化反応が阻害されることとなり、予め前記リグニンを除去しておくことが望ましい。
【０００５】
前記リグニンを除去する方法として、微生物または微生物が産生する酵素を用いることが考えられる。前記リグニンを分解する微生物としては白色腐朽菌が知られており、白色腐朽菌はリグニン分解酵素であるリグニンペルオキシダーゼを産生することが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
前記リグニンペルオキシダーゼは、前記糖化前処理としてのリグニン除去の他、製紙工業におけるパルプ漂白の効率化、染料の分解、ダイオキシン等の難分解性環境汚染物質の浄化等のように幅広い産業に応用できる可能性を備えている（例えば、特許文献２，３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１４２７７２号公報
【特許文献２】特開平９−９５８８５号公報
【特許文献３】特開２００６−３３３７５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一般に、酵素を工業的に利用する場合には、室温以上の高温で作用させることが好ましい。しかしながら、前記リグニンペルオキシダーゼは、耐熱性が低く、室温以上の高温、例えば３７℃程度の温度で失活するという不都合がある。
【０００９】
また、前記リグニンペルオキシダーゼは、過酸化水素存在下で前記リグニンを分解する酵素であるにも拘わらず、過酸化水素に対する耐性が低いという不都合がある。
【００１０】
そこで、本発明は、かかる不都合を解消して、耐熱性及び耐過酸化水素性に優れたリグニンペルオキシダーゼ変異体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かかる目的を達成するために、本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【００１２】
前記第１のアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型のリグニンペルオキシダーゼにおいて、２４０番目のＨをＦに、２４１番目のＴをＬに、２４２番目のＩをＬに、それぞれアミノ酸置換したものである。この結果、本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、優れた耐熱性及び耐過酸化水素性を得ることができる。
【００１３】
本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、前記第１のアミノ酸配列又は第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質である。
【００１４】
また、本発明は、前記組換えタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子にもある。本発明の遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子であることが好ましい。
【００１５】
本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、前記遺伝子を含有する組換えベクターを形質転換体に導入することにより発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】野生型のリグニンペルオキシダーゼと相同なアミノ酸配列からなるタンパク質４８個の系統樹を示す図。
【図２】野生型のリグニンペルオキシダーゼのアミノ酸配列と、推定された先祖型のアミノ酸配列との多重配列を示す図。
【図３】本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体の３０℃と３７℃とにおける酵素活性の経時変化を示すグラフ。
【図４】参考例としての野生型のリグニンペルオキシダーゼの３０℃と３７℃とにおける酵素活性の経時変化を示すグラフ。
【図５】比較例としてのリグニンペルオキシダーゼ変異体の３０℃と３７℃とにおける酵素活性の経時変化を示すグラフ。
【図６】本発明及び比較例としてのリグニンペルオキシダーゼ変異体と、参考例としての野生型のリグニンペルオキシダーゼとの過酸化水素存在下における酵素活性の経時変化を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
【００１８】
本実施形態のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の野生型のリグニンペルオキシダーゼの変異体であり、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。前記野生型のリグニンペルオキシダーゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる。
【００１９】
本実施形態のリグニンペルオキシダーゼ変異体の前記配列番号１で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、２４０番目のＨをＦに、２４１番目のＴをＬに、２４２番目のＩをＬに、それぞれアミノ酸置換したものである。また、本実施形態のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、前記野生型のリグニンペルオキシダーゼは、配列番号４で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００２０】
前記野生型のリグニンペルオキシダーゼは、耐熱性及び耐過酸化水素性を備えていない。しかし、ウーズ（Woese）らによって示された１６ｓｒＲＮＡによる系統樹を見ると、８０℃以上で至適に生育する生物が該系統樹の根元に多いことが示されている。この事実から、真正細菌、真核生物、古細菌の共通の祖先は超好熱菌と推定され、先祖型のアミノ酸配列を有するか又はそれに近い配列を有するタンパク質は耐熱性を備えているものと考えられる。このような知見は、特開２００２−２４７９９１号公報に記載されている。
【００２１】
そこで、本実施形態では、リグニンを分解する酵素を含み、前記野生型のリグニンペルオキシダーゼと相同のアミノ酸配列を備えるタンパク質に関する系統樹を作成し、該系統樹における先祖型のアミノ酸配列について検討した。
【００２２】
前記系統樹の作成に当たって、まず、リグニンを分解する酵素を含み、前記野生型のリグニンペルオキシダーゼと相同のアミノ酸配列を備えるタンパク質４８個をＤＤＢＪ内のアミノ酸配列データベースからソフトウェアＢＬＡＳＴＰを用いて抽出した。抽出したタンパク質は、リグニンを分解する酵素として、前記野生型のリグニンペルオキシダーゼの他、子のう菌由来のリグニンペルオキシダーゼ、担子菌由来のマンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼとマンガンペルオキシダーゼとのハイブリッド型酵素であるヴァーサタイルタイルペルオキシダーゼを含んでいる。尚、本明細書では、リグニンペルオキシダーゼを「ＬｉＰ」、マンガンペルオキシダーゼを「ＭｎＰ」、ヴァ−サタイルペルオキシダーゼ「ＶＰ」と略記することがある。
【００２３】
次に、前記野生型ＬｉＰ及び抽出したタンパク質の合わせて４９個のタンパク質について、進化の系統を示す系統樹を作成した。前記系統樹は、ソフトウェアＴｒｅｅｆｉｎｄｅｒとＰｈｙＭＬとを用いて候補系統樹群を作成し、該候補系統樹群の各候補系統樹について、ソフトウェアＰＭＡＬのＣＯＤＥＭＬを用いて尤度を計算した。そして、最尤度を備える候補系統樹を前記４９個のタンパク質の進化の系統を示す系統樹として選択した。選択した系統樹を図１に示す。
【００２４】
図１において、符号１は野生型ＬｉＰ、符号２は担子菌由来ＭｎＰ、符号３は子のう菌由来ＬｉＰ、符号４はＶＰを示す。また、符号５はＭｎＰを示し、符号６はＬｉＰを示す。抽出したタンパク質のうち、野生型ＬｉＰ１及び担子菌由来ＭｎＰ２を除く４７個のタンパク質は論文等に発表されており、図１に示すＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓにより特定することができる。
【００２５】
また、前記担子菌由来ＭｎＰは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、配列番号６で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００２６】
図１において、分岐点Ａは前記野生型ＬｉＰと他のタンパク質との分岐点であり、酵素の機能に関する分岐点である。また、分岐点Ｂは子のう菌と担子菌との分岐点であり、生物の種に関する分岐点である。
【００２７】
そこで、次に、各分岐点Ａ，Ｂのそれぞれに対応するタンパク質と、分岐点Ａ，Ｂの中間の分岐点Ｃに対応するタンパク質とのアミノ酸配列をソフトウェアＰＭＡＬのＣＯＤＥＭＬにより推定し、前記野生型ＬｉＰのアミノ酸配列と、推定された３種のアミノ酸配列とをマルチプルアライメント（多重配列）した。前記マルチプルアライメントの結果を図２に示す。尚、前記野生型ＬｉＰは前記配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、分岐点Ａ，Ｂ，Ｃに対応するタンパク質は、それぞれ配列番号７，８，９で表されるアミノ酸配列からなる。
【００２８】
図２から、前記野生型ＬｉＰのアミノ酸配列の２４０〜２４２番目がＨ，Ｔ，Ｉであるのに対し、分岐点Ａ，Ｂ，Ｃに対応するタンパク質のアミノ酸配列では、いずれもＦ，Ｌ，Ｌとなっていることが明らかである。そこで、前記野生型ＬｉＰのアミノ酸配列（配列番号３）中、２４０番目のＨをＦに、２４１番目のＴをＬに、２４２番目のＩをＬに、それぞれアミノ酸置換したアミノ酸配列を本実施形態の先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１）とした。
【００２９】
次に、前記のようにして決定した先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードする遺伝子の構築を行った。
【００３０】
前記遺伝子の構築のために、まず、前記野生型のリグニンペルオキシダーゼのｃＤＮＡを、Gateway system（商品名、Invitrogen社）を用いて、プラスミドであるｐＰＤＢ−ＧＢに導入し、ベクターとした。前記ベクターを、本明細書ではｐＰＤＢ−ＬｉＰと記載する。尚、前記野生型ＬｉＰのｃＤＮＡは、白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子であり、麻布大学環境生命科学部教授其木茂則氏から分譲を受けた。
【００３１】
次に、前記ｐＰＤＢ−ＬｉＰを鋳型として、次のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq（登録商標、タカラバイオ株式会社））とを用いてＰＣＲを行い、該ｐＰＤＢ−ＬｉＰを増幅させた。
〔プライマー〕
pLiPf-S（配列番号１２）：５’−ＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＡＣＧＧＣＡＡ−３’
pLiPr（配列番号１３）：ＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧ−３’
前記ＰＣＲは、まず、前記ｐＰＤＢ−ＬｉＰと、前記プライマーと、前記ＤＮＡポリメラーゼとの混合物を、９４℃の温度に３分間保持した後、さらに９４℃の温度に３０秒保持して熱変性処理した。次に、５５℃に１分間保持してアニーリング反応を行った後、７２℃の温度に２分間保持して伸長反応を行った。そして、前記熱変性処理と、アニーリング反応と、伸長反応とを１サイクルとして、このサイクルを２５回繰り返した。
【００３２】
次に、前記ＰＣＲにより増幅させた前記ｐＰＤＢ−ＬｉＰを制限酵素Nde IとHind IIIとで処理し、前記野生型ＬｉＰのｃＤＮＡに対応する遺伝子からなるＤＮＡ断片を得た。次に、前記ＤＮＡ断片を、プラスミドであるｐＥＴ２１ａ（＋）に導入し、ベクターとした。前記ベクターを、本明細書ではｐＥＴ−ＬｉＰと記載する。そして、前記ベクターをEscherichia coli JM109を用いて増幅した。
【００３３】
次に、前記増幅により得られたｐＥＴ−ＬｉＰを鋳型として、次のプライマーと、QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit（商品名、Stratagene社））とを用いてＰＣＲを行った。この結果、先祖型リグニンペルオキシダーゼ変異体のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号２）を含むプラスミドが得られた。
〔プライマー〕
forward primer（配列番号１４）：５’−ＣＧＣＡＴＣＣＡＧＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＣＧＡＣＴＣＡＣＧＣ−３’
reverse primer（配列番号１５）：５’−ＧＣＧＴＧＡＧＴＣＧＣＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＣＧ−３’
尚、前記プライマーにおいて、下線部が前記アミノ酸置換に関わる部分である。
【００３４】
また、図２から、ＬｉＰのアミノ酸配列の１１７，１１８番目がＡ，Ｌであるのに対し、分岐点Ａ，Ｂ，Ｃに対応するタンパク質のアミノ酸配列では、いずれもＧ，Ｖとなっていることが明らかである。そこで、ＬｉＰのアミノ酸配列中、１１７番目のＡをＧに、１１８番目のＬをＶに、それぞれアミノ酸置換したアミノ酸配列を比較のための先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１０）とした。前記比較のための先祖型ＬｉＰ変異体は、配列番号１１で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００３５】
次に、前記のようにして決定した先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードする遺伝子の構築を行った。前記遺伝子の構築は、ｐＥＴ−ＬｉＰを鋳型とするＰＣＲにおいて、次のプライマーを用いた以外は、本実施形態の先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子の構築と全く同一にして行った。この結果、比較のための先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１０）をコードする遺伝子を含むプラスミドが得られた。
〔プライマー〕
forward primer（配列番号１６）：５’−ＴＴＣＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴ−３’
reverse primer（配列番号１７）：５’−ＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＴＧＣＴＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＡ−３’
尚、前記プライマーにおいて、下線部が前記アミノ酸置換に関わる部分である。
【００３６】
次に、本実施形態及び比較のための先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むプラスミドをそれぞれベクターとすると共に、前記野生型ＬｉＰのｃＤＮＡに対応する遺伝子を導入したベクターとしてのｐＥＴ−ＬｉＰを用い、各ベクターに含まれる遺伝子を発現させた。前記各遺伝子の発現は、前記各ベクターをそれぞれEscherichia coli BL21(DE3)に導入することにより次のようにして行った。
【００３７】
まず、前記各ベクターを含むEscherichia coli BL21をアンピシリン０．１ｍｇ／ｍLを含むTerrific Btoth培地中、３７℃の温度に保持して１２時間培養した。前記Terrific Btoth培地は、１リットル当たりポリペプトン１２ｇ、酵母エキストラクト２４ｇ、グリセロール４ｍｌ、ＫＨ２ＰＯ４２．３１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１２．５ｇを含む。
【００３８】
前記培養後、前記培地にＩＰＴＧを添加して該培地中のＩＰＴＧの濃度が０．５ｍＭになるようにして、タンパク質の発現を誘導し、さらに４時間培養した。このようにすることにより、前記Escherichia coli BL21の細胞内に、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体が産生される。
【００３９】
その後、前記Escherichia coli BL21の菌体を回収し、第１の緩衝液中で超音波破砕した。前記第１の緩衝液は、１０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、５ｍＭ−ＤＴＴ、５０μＭ−フッ化フェニルメチルスルフォニル、１容量％−非イオン性界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名））を含む。
【００４０】
前記野生型ＬｉＰ又はその変異体は、いずれも封入体として発現されるので、前記第１の緩衝液中の不溶画分を回収し、該不溶画分１ｇに対して第２の緩衝液１０ｍｌで３回洗浄した。前記第２の緩衝液は、１０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、５ｍＭ−ＤＴＴ、１容量％−非イオン性界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名））を含む。
【００４１】
次に、前記不溶画分を、８Ｍの尿素と２ｍＭのＤＴＴとを含む水溶液中に室温で１時間保持し、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を変性還元状態にした。次に、前記水溶液１容に、１０ｍＭ−ＣａＣｌ２、０．７ｍＭ−酸化グルタチオン、３０μＭ−ヘミン、５０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８）の混合物を３容の体積割合で加え、４倍に希釈し、攪拌しながら暗所に室温で１２時間保持することにより、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を活性型にした。
【００４２】
次に、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）、５ｍＭ−ＣａＣｌ２を含む溶液を用いて、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を含む水溶液を、４℃の温度で１２時間透析した。次に、前記透析により得られた溶液を、６００００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を濾過膜（amicon YM-10（商品名、Millipore社））により濾過して濃縮した。
【００４３】
次に、前記濃縮された溶液を、陰イオン交換カラム（DEAE Sepharose Fast Flow anion-exchange column（商品名、GE Healthcare Bioscience社）で分離し、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を精製した。移動相は、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）、０．６Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＣａＣｌ２を用いた。
【００４４】
次に、前記陰イオン交換カラムで分離、精製された前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を含む液を、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）、１ｍＭ−ＣａＣｌ２で３倍に希釈後、さらに、陰イオン交換カラム（HiTrapQ（商品名、GE Healthcare Bioscience社）で分離した。移動相は、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）、０．０１〜０．６Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＣａＣｌ２を用いた。この結果、活性を有する前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を得た。前記野生型ＬｉＰ又はその変異体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる本実施形態のＬｉＰ変異体（実施例）、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる比較のためのＬｉＰ変異体（比較例）、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型ＬｉＰ（参考例）である。
【００４５】
次に、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体の耐熱性を評価した。前記評価は、酒石酸の終濃度が５０ｍＭであると共に、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体の終濃度が２００ｎＭである溶液３ｍｌを調製し、該溶液を３０℃又は３７℃の温度に保持したときのリグニン分解酵素活性の経時変化を測定することにより行った。前記リグニン分解酵素活性の経時変化は、所定時間後の残存活性を示す。
【００４６】
前記リグニン分解酵素活性の残存活性の測定には、ベラトリルアルコールの酸化によるベラトリルアルデヒドの生成反応を用いた。具体的には、酒石酸の終濃度が５０ｍＭ、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体の終濃度が２０ｎＭであると共に、ベラトリアルアルコールの終濃度が２ｍＭである溶液０．５ｍｌを調製し、終濃度が０．５ｍＭになるようにＨ２Ｏ２を滴下して反応を開始した。ベラトリルアルデヒドの濃度は、３１０ｎｍの波長の光線による吸光度で測定し、吸光係数９３００Ｍ−１ｃｍ−１として算出した。前記条件で、１分当たり１μモルのベラトリルアルデヒドを生成する酵素活性を１enzyme unit と定義した。
【００４７】
前記リグニンペルオキシダーゼ又はその変異体のリグニン分解酵素活性の経時変化を、図３（実施例）、図４（比較例）、図５（参考例）にそれぞれ示す。
【００４８】
図３乃至図５から、本実施例のＬｉＰ変異体は、３０℃及び３７℃の温度におけるリグニン分解酵素活性について、所定時間後の残存活性が参考例の野生型ＬｉＰよりも大であり、優れた耐熱性を備えていることが明らかである。一方、配列番号３で表されるアミノ酸配列の他の部分をアミノ酸置換した比較例のＬｉＰ変異体は、３０℃の温度におけるリグニン分解酵素活性については、所定時間後の残存活性が参考例の野生型ＬｉＰより大であるものの、３７℃の温度では参考例の野生型ＬｉＰよりも小であり、十分な耐熱性を備えていないことが明らかである。
【００４９】
次に、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体の耐過酸化水素性を評価した。前記評価は、酒石酸の終濃度が５０ｍＭ、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体の終濃度が２００ｎＭであると共に、Ｈ２Ｏ２の終濃度が０．０１ｍＭである溶液３ｍｌを調製し、該溶液を２５℃の温度に保持したときのリグニン分解酵素活性の経時変化を測定することにより行った。
【００５０】
前記リグニン分解酵素活性の残存活性の測定は、前記耐熱性評価の場合と全く同一にして行った。前記野生型ＬｉＰ又はその変異体のリグニン分解酵素活性の経時変化を、図６に示す。
【００５１】
図６から、本実施例のＬｉＰ変異体は、０．０１ｍＭ−Ｈ２Ｏ２の存在下におけるリグニン分解酵素活性について、所定時間後の残存活性が参考例の野生型ＬｉＰよりも大であり、優れた耐過酸化水素性を備えていることが明らかである。一方、配列番号３で表されるアミノ酸配列の他の部分をアミノ酸置換した比較例のＬｉＰ変異体は、０．０１ｍＭ−Ｈ２Ｏ２の存在下におけるリグニン分解酵素活性について、所定時間後の残存活性が参考例の野生型ＬｉＰよりも小であり、耐過酸化水素性が劣っていることが明らかである。
【００５２】
尚、本実施形態では、本実施例のＬｉＰ変異体を配列番号１のアミノ酸配列で表されるものとしているが、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるものであってもよい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白色腐朽菌に由来するリグニンペルオキシダーゼ変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、自動車用燃料として、ガソリン−エタノール混合燃料を用いることが検討されている。前記エタノールとしては、植物性物質の発酵、蒸留により得たバイオエタノールを用いると、土壌管理を厳密に行うことにより所謂カーボンニュートラル効果を得ることができ、二酸化炭素の排出量を低減して地球温暖化の防止に寄与できるものと考えられている。
【０００３】
しかし、前記植物性物質として、例えばサトウキビ、トウモロコシ等の農作物を用いると、該農作物がエタノールの原料として大量に消費されることにより、食料としての供給量が減少するという問題がある。そこで、前記植物性物質として、食用ではないリグノセルロース系バイオマスを用いてエタノールを製造する技術が検討されている。前記リグノセルロース系バイオマスは、セルロースを含んでおり、該セルロースを酵素糖化によりグルコースに分解し、得られたグルコースを発酵させてバイオエタノールを得ることができる。
【０００４】
ところが、前記リグノセルロースは、セルロースの他にヘミセルロース及びリグニンを主な構成成分としており、通常該セルロース及び該ヘミセルロースは、該リグニンにより強固に結合されている。従って、前記リグノセルロースはそのままでは前記酵素糖化反応が阻害されることとなり、予め前記リグニンを除去しておくことが望ましい。
【０００５】
前記リグニンを除去する方法として、微生物または微生物が産生する酵素を用いることが考えられる。前記リグニンを分解する微生物としては白色腐朽菌が知られており、白色腐朽菌はリグニン分解酵素であるリグニンペルオキシダーゼを産生することが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
前記リグニンペルオキシダーゼは、前記糖化前処理としてのリグニン除去の他、製紙工業におけるパルプ漂白の効率化、染料の分解、ダイオキシン等の難分解性環境汚染物質の浄化等のように幅広い産業に応用できる可能性を備えている（例えば、特許文献２，３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１４２７７２号公報
【特許文献２】特開平９−９５８８５号公報
【特許文献３】特開２００６−３３３７５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一般に、酵素を工業的に利用する場合には、室温以上の高温で作用させることが好ましい。しかしながら、前記リグニンペルオキシダーゼは、耐熱性が低く、室温以上の高温、例えば３７℃程度の温度で失活するという不都合がある。
【０００９】
また、前記リグニンペルオキシダーゼは、過酸化水素存在下で前記リグニンを分解する酵素であるにも拘わらず、過酸化水素に対する耐性が低いという不都合がある。
【００１０】
そこで、本発明は、かかる不都合を解消して、耐熱性及び耐過酸化水素性に優れたリグニンペルオキシダーゼ変異体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かかる目的を達成するために、本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【００１２】
前記第１のアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型のリグニンペルオキシダーゼにおいて、２４０番目のＨをＦに、２４１番目のＴをＬに、２４２番目のＩをＬに、それぞれアミノ酸置換したものである。この結果、本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、優れた耐熱性及び耐過酸化水素性を得ることができる。
【００１３】
本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、前記第１のアミノ酸配列又は第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質である。
【００１４】
また、本発明は、前記組換えタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子にもある。本発明の遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子であることが好ましい。
【００１５】
本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、前記遺伝子を含有する組換えベクターを形質転換体に導入することにより発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】野生型のリグニンペルオキシダーゼと相同なアミノ酸配列からなるタンパク質４８個の系統樹を示す図。
【図２】野生型のリグニンペルオキシダーゼのアミノ酸配列と、推定された先祖型のアミノ酸配列との多重配列を示す図。
【図３】本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体の３０℃と３７℃とにおける酵素活性の経時変化を示すグラフ。
【図４】参考例としての野生型のリグニンペルオキシダーゼの３０℃と３７℃とにおける酵素活性の経時変化を示すグラフ。
【図５】比較例としてのリグニンペルオキシダーゼ変異体の３０℃と３７℃とにおける酵素活性の経時変化を示すグラフ。
【図６】本発明及び比較例としてのリグニンペルオキシダーゼ変異体と、参考例としての野生型のリグニンペルオキシダーゼとの過酸化水素存在下における酵素活性の経時変化を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
【００１８】
本実施形態のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の野生型のリグニンペルオキシダーゼの変異体であり、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。前記野生型のリグニンペルオキシダーゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる。
【００１９】
本実施形態のリグニンペルオキシダーゼ変異体の前記配列番号１で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、２４０番目のＨをＦに、２４１番目のＴをＬに、２４２番目のＩをＬに、それぞれアミノ酸置換したものである。また、本実施形態のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、前記野生型のリグニンペルオキシダーゼは、配列番号４で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００２０】
前記野生型のリグニンペルオキシダーゼは、耐熱性及び耐過酸化水素性を備えていない。しかし、ウーズ（Woese）らによって示された１６ｓｒＲＮＡによる系統樹を見ると、８０℃以上で至適に生育する生物が該系統樹の根元に多いことが示されている。この事実から、真正細菌、真核生物、古細菌の共通の祖先は超好熱菌と推定され、先祖型のアミノ酸配列を有するか又はそれに近い配列を有するタンパク質は耐熱性を備えているものと考えられる。このような知見は、特開２００２−２４７９９１号公報に記載されている。
【００２１】
そこで、本実施形態では、リグニンを分解する酵素を含み、前記野生型のリグニンペルオキシダーゼと相同のアミノ酸配列を備えるタンパク質に関する系統樹を作成し、該系統樹における先祖型のアミノ酸配列について検討した。
【００２２】
前記系統樹の作成に当たって、まず、リグニンを分解する酵素を含み、前記野生型のリグニンペルオキシダーゼと相同のアミノ酸配列を備えるタンパク質４８個をＤＤＢＪ内のアミノ酸配列データベースからソフトウェアＢＬＡＳＴＰを用いて抽出した。抽出したタンパク質は、リグニンを分解する酵素として、前記野生型のリグニンペルオキシダーゼの他、子のう菌由来のリグニンペルオキシダーゼ、担子菌由来のマンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼとマンガンペルオキシダーゼとのハイブリッド型酵素であるヴァーサタイルタイルペルオキシダーゼを含んでいる。尚、本明細書では、リグニンペルオキシダーゼを「ＬｉＰ」、マンガンペルオキシダーゼを「ＭｎＰ」、ヴァ−サタイルペルオキシダーゼ「ＶＰ」と略記することがある。
【００２３】
次に、前記野生型ＬｉＰ及び抽出したタンパク質の合わせて４９個のタンパク質について、進化の系統を示す系統樹を作成した。前記系統樹は、ソフトウェアＴｒｅｅｆｉｎｄｅｒとＰｈｙＭＬとを用いて候補系統樹群を作成し、該候補系統樹群の各候補系統樹について、ソフトウェアＰＭＡＬのＣＯＤＥＭＬを用いて尤度を計算した。そして、最尤度を備える候補系統樹を前記４９個のタンパク質の進化の系統を示す系統樹として選択した。選択した系統樹を図１に示す。
【００２４】
図１において、符号１は野生型ＬｉＰ、符号２は担子菌由来ＭｎＰ、符号３は子のう菌由来ＬｉＰ、符号４はＶＰを示す。また、符号５はＭｎＰを示し、符号６はＬｉＰを示す。抽出したタンパク質のうち、野生型ＬｉＰ１及び担子菌由来ＭｎＰ２を除く４７個のタンパク質は論文等に発表されており、図１に示すＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓにより特定することができる。
【００２５】
また、前記担子菌由来ＭｎＰは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、配列番号６で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００２６】
図１において、分岐点Ａは前記野生型ＬｉＰと他のタンパク質との分岐点であり、酵素の機能に関する分岐点である。また、分岐点Ｂは子のう菌と担子菌との分岐点であり、生物の種に関する分岐点である。
【００２７】
そこで、次に、各分岐点Ａ，Ｂのそれぞれに対応するタンパク質と、分岐点Ａ，Ｂの中間の分岐点Ｃに対応するタンパク質とのアミノ酸配列をソフトウェアＰＭＡＬのＣＯＤＥＭＬにより推定し、前記野生型ＬｉＰのアミノ酸配列と、推定された３種のアミノ酸配列とをマルチプルアライメント（多重配列）した。前記マルチプルアライメントの結果を図２に示す。尚、前記野生型ＬｉＰは前記配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、分岐点Ａ，Ｂ，Ｃに対応するタンパク質は、それぞれ配列番号７，８，９で表されるアミノ酸配列からなる。
【００２８】
図２から、前記野生型ＬｉＰのアミノ酸配列の２４０〜２４２番目がＨ，Ｔ，Ｉであるのに対し、分岐点Ａ，Ｂ，Ｃに対応するタンパク質のアミノ酸配列では、いずれもＦ，Ｌ，Ｌとなっていることが明らかである。そこで、前記野生型ＬｉＰのアミノ酸配列（配列番号３）中、２４０番目のＨをＦに、２４１番目のＴをＬに、２４２番目のＩをＬに、それぞれアミノ酸置換したアミノ酸配列を本実施形態の先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１）とした。
【００２９】
次に、前記のようにして決定した先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードする遺伝子の構築を行った。
【００３０】
前記遺伝子の構築のために、まず、前記野生型のリグニンペルオキシダーゼのｃＤＮＡを、Gateway system（商品名、Invitrogen社）を用いて、プラスミドであるｐＰＤＢ−ＧＢに導入し、ベクターとした。前記ベクターを、本明細書ではｐＰＤＢ−ＬｉＰと記載する。尚、前記野生型ＬｉＰのｃＤＮＡは、白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子であり、麻布大学環境生命科学部教授其木茂則氏から分譲を受けた。
【００３１】
次に、前記ｐＰＤＢ−ＬｉＰを鋳型として、次のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq（登録商標、タカラバイオ株式会社））とを用いてＰＣＲを行い、該ｐＰＤＢ−ＬｉＰを増幅させた。
〔プライマー〕
pLiPf-S（配列番号１２）：５’−ＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＡＣＧＧＣＡＡ−３’
pLiPr（配列番号１３）：ＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧ−３’
前記ＰＣＲは、まず、前記ｐＰＤＢ−ＬｉＰと、前記プライマーと、前記ＤＮＡポリメラーゼとの混合物を、９４℃の温度に３分間保持した後、さらに９４℃の温度に３０秒保持して熱変性処理した。次に、５５℃に１分間保持してアニーリング反応を行った後、７２℃の温度に２分間保持して伸長反応を行った。そして、前記熱変性処理と、アニーリング反応と、伸長反応とを１サイクルとして、このサイクルを２５回繰り返した。
【００３２】
次に、前記ＰＣＲにより増幅させた前記ｐＰＤＢ−ＬｉＰを制限酵素Nde IとHind IIIとで処理し、前記野生型ＬｉＰのｃＤＮＡに対応する遺伝子からなるＤＮＡ断片を得た。次に、前記ＤＮＡ断片を、プラスミドであるｐＥＴ２１ａ（＋）に導入し、ベクターとした。前記ベクターを、本明細書ではｐＥＴ−ＬｉＰと記載する。そして、前記ベクターをEscherichia coli JM109を用いて増幅した。
【００３３】
次に、前記増幅により得られたｐＥＴ−ＬｉＰを鋳型として、次のプライマーと、QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit（商品名、Stratagene社））とを用いてＰＣＲを行った。この結果、先祖型リグニンペルオキシダーゼ変異体のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号２）を含むプラスミドが得られた。
〔プライマー〕
forward primer（配列番号１４）：５’−ＣＧＣＡＴＣＣＡＧＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＣＧＡＣＴＣＡＣＧＣ−３’
reverse primer（配列番号１５）：５’−ＧＣＧＴＧＡＧＴＣＧＣＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＣＧ−３’
尚、前記プライマーにおいて、下線部が前記アミノ酸置換に関わる部分である。
【００３４】
また、図２から、ＬｉＰのアミノ酸配列の１１７，１１８番目がＡ，Ｌであるのに対し、分岐点Ａ，Ｂ，Ｃに対応するタンパク質のアミノ酸配列では、いずれもＧ，Ｖとなっていることが明らかである。そこで、ＬｉＰのアミノ酸配列中、１１７番目のＡをＧに、１１８番目のＬをＶに、それぞれアミノ酸置換したアミノ酸配列を比較のための先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１０）とした。前記比較のための先祖型ＬｉＰ変異体は、配列番号１１で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。
【００３５】
次に、前記のようにして決定した先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードする遺伝子の構築を行った。前記遺伝子の構築は、ｐＥＴ−ＬｉＰを鋳型とするＰＣＲにおいて、次のプライマーを用いた以外は、本実施形態の先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子の構築と全く同一にして行った。この結果、比較のための先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１０）をコードする遺伝子を含むプラスミドが得られた。
〔プライマー〕
forward primer（配列番号１６）：５’−ＴＴＣＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴ−３’
reverse primer（配列番号１７）：５’−ＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＴＧＣＴＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＡ−３’
尚、前記プライマーにおいて、下線部が前記アミノ酸置換に関わる部分である。
【００３６】
次に、本実施形態及び比較のための先祖型ＬｉＰ変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むプラスミドをそれぞれベクターとすると共に、前記野生型ＬｉＰのｃＤＮＡに対応する遺伝子を導入したベクターとしてのｐＥＴ−ＬｉＰを用い、各ベクターに含まれる遺伝子を発現させた。前記各遺伝子の発現は、前記各ベクターをそれぞれEscherichia coli BL21(DE3)に導入することにより次のようにして行った。
【００３７】
まず、前記各ベクターを含むEscherichia coli BL21をアンピシリン０．１ｍｇ／ｍLを含むTerrific Btoth培地中、３７℃の温度に保持して１２時間培養した。前記Terrific Btoth培地は、１リットル当たりポリペプトン１２ｇ、酵母エキストラクト２４ｇ、グリセロール４ｍｌ、ＫＨ２ＰＯ４２．３１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１２．５ｇを含む。
【００３８】
前記培養後、前記培地にＩＰＴＧを添加して該培地中のＩＰＴＧの濃度が０．５ｍＭになるようにして、タンパク質の発現を誘導し、さらに４時間培養した。このようにすることにより、前記Escherichia coli BL21の細胞内に、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体が産生される。
【００３９】
その後、前記Escherichia coli BL21の菌体を回収し、第１の緩衝液中で超音波破砕した。前記第１の緩衝液は、１０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、５ｍＭ−ＤＴＴ、５０μＭ−フッ化フェニルメチルスルフォニル、１容量％−非イオン性界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名））を含む。
【００４０】
前記野生型ＬｉＰ又はその変異体は、いずれも封入体として発現されるので、前記第１の緩衝液中の不溶画分を回収し、該不溶画分１ｇに対して第２の緩衝液１０ｍｌで３回洗浄した。前記第２の緩衝液は、１０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、５ｍＭ−ＤＴＴ、１容量％−非イオン性界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名））を含む。
【００４１】
次に、前記不溶画分を、８Ｍの尿素と２ｍＭのＤＴＴとを含む水溶液中に室温で１時間保持し、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を変性還元状態にした。次に、前記水溶液１容に、１０ｍＭ−ＣａＣｌ２、０．７ｍＭ−酸化グルタチオン、３０μＭ−ヘミン、５０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８）の混合物を３容の体積割合で加え、４倍に希釈し、攪拌しながら暗所に室温で１２時間保持することにより、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を活性型にした。
【００４２】
次に、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）、５ｍＭ−ＣａＣｌ２を含む溶液を用いて、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を含む水溶液を、４℃の温度で１２時間透析した。次に、前記透析により得られた溶液を、６００００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を濾過膜（amicon YM-10（商品名、Millipore社））により濾過して濃縮した。
【００４３】
次に、前記濃縮された溶液を、陰イオン交換カラム（DEAE Sepharose Fast Flow anion-exchange column（商品名、GE Healthcare Bioscience社）で分離し、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を精製した。移動相は、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）、０．６Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＣａＣｌ２を用いた。
【００４４】
次に、前記陰イオン交換カラムで分離、精製された前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を含む液を、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）、１ｍＭ−ＣａＣｌ２で３倍に希釈後、さらに、陰イオン交換カラム（HiTrapQ（商品名、GE Healthcare Bioscience社）で分離した。移動相は、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）、０．０１〜０．６Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＣａＣｌ２を用いた。この結果、活性を有する前記野生型ＬｉＰ又はその変異体を得た。前記野生型ＬｉＰ又はその変異体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる本実施形態のＬｉＰ変異体（実施例）、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる比較のためのＬｉＰ変異体（比較例）、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型ＬｉＰ（参考例）である。
【００４５】
次に、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体の耐熱性を評価した。前記評価は、酒石酸の終濃度が５０ｍＭであると共に、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体の終濃度が２００ｎＭである溶液３ｍｌを調製し、該溶液を３０℃又は３７℃の温度に保持したときのリグニン分解酵素活性の経時変化を測定することにより行った。前記リグニン分解酵素活性の経時変化は、所定時間後の残存活性を示す。
【００４６】
前記リグニン分解酵素活性の残存活性の測定には、ベラトリルアルコールの酸化によるベラトリルアルデヒドの生成反応を用いた。具体的には、酒石酸の終濃度が５０ｍＭ、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体の終濃度が２０ｎＭであると共に、ベラトリアルアルコールの終濃度が２ｍＭである溶液０．５ｍｌを調製し、終濃度が０．５ｍＭになるようにＨ２Ｏ２を滴下して反応を開始した。ベラトリルアルデヒドの濃度は、３１０ｎｍの波長の光線による吸光度で測定し、吸光係数９３００Ｍ−１ｃｍ−１として算出した。前記条件で、１分当たり１μモルのベラトリルアルデヒドを生成する酵素活性を１enzyme unit と定義した。
【００４７】
前記リグニンペルオキシダーゼ又はその変異体のリグニン分解酵素活性の経時変化を、図３（実施例）、図４（比較例）、図５（参考例）にそれぞれ示す。
【００４８】
図３乃至図５から、本実施例のＬｉＰ変異体は、３０℃及び３７℃の温度におけるリグニン分解酵素活性について、所定時間後の残存活性が参考例の野生型ＬｉＰよりも大であり、優れた耐熱性を備えていることが明らかである。一方、配列番号３で表されるアミノ酸配列の他の部分をアミノ酸置換した比較例のＬｉＰ変異体は、３０℃の温度におけるリグニン分解酵素活性については、所定時間後の残存活性が参考例の野生型ＬｉＰより大であるものの、３７℃の温度では参考例の野生型ＬｉＰよりも小であり、十分な耐熱性を備えていないことが明らかである。
【００４９】
次に、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体の耐過酸化水素性を評価した。前記評価は、酒石酸の終濃度が５０ｍＭ、前記野生型ＬｉＰ又はその変異体の終濃度が２００ｎＭであると共に、Ｈ２Ｏ２の終濃度が０．０１ｍＭである溶液３ｍｌを調製し、該溶液を２５℃の温度に保持したときのリグニン分解酵素活性の経時変化を測定することにより行った。
【００５０】
前記リグニン分解酵素活性の残存活性の測定は、前記耐熱性評価の場合と全く同一にして行った。前記野生型ＬｉＰ又はその変異体のリグニン分解酵素活性の経時変化を、図６に示す。
【００５１】
図６から、本実施例のＬｉＰ変異体は、０．０１ｍＭ−Ｈ２Ｏ２の存在下におけるリグニン分解酵素活性について、所定時間後の残存活性が参考例の野生型ＬｉＰよりも大であり、優れた耐過酸化水素性を備えていることが明らかである。一方、配列番号３で表されるアミノ酸配列の他の部分をアミノ酸置換した比較例のＬｉＰ変異体は、０．０１ｍＭ−Ｈ２Ｏ２の存在下におけるリグニン分解酵素活性について、所定時間後の残存活性が参考例の野生型ＬｉＰよりも小であり、耐過酸化水素性が劣っていることが明らかである。
【００５２】
尚、本実施形態では、本実施例のＬｉＰ変異体を配列番号１のアミノ酸配列で表されるものとしているが、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるものであってもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることを特徴とするリグニンペルオキシダーゼ変異体。
【請求項２】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項３】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項４】
請求項３記載の遺伝子において、配列番号２で表される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
【請求項５】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターにおいて、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項７】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体において、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子を含有する組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項１】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることを特徴とするリグニンペルオキシダーゼ変異体。
【請求項２】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項３】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項４】
請求項３記載の遺伝子において、配列番号２で表される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
【請求項５】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターにおいて、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項７】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体において、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子を含有する組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１８８７７１（Ｐ２０１１−１８８７７１Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５６３８９（Ｐ２０１０−５６３８９）
【出願日】平成２２年３月１２日（２０１０．３．１２）
【出願人】（５９２０６８２００）学校法人東京薬科大学 (32)
【出願人】（０００００５３２６）本田技研工業株式会社 (23,863)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１２日（２０１０．３．１２）
【出願人】（５９２０６８２００）学校法人東京薬科大学 (32)
【出願人】（０００００５３２６）本田技研工業株式会社 (23,863)
【Ｆターム（参考）】
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