リグニン分解細菌
【課題】バイオマス中の難分解性物質であるリグニンの分解能力を持つ細菌の提供。また、その細菌を用いたリグニンの処理方法の提供。
【解決手段】リグニン分解酵素活性を有するラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトマイセス・シュードグリセオラス（Streptomyces pseudogriseolus）またはキラトコッカス・アサッカロボランス（Chelatococcus asaccharovorans）に属することを特徴とする細菌。
木質系または草本系バイオマスの分解処理において、該バイオマスと上述の細菌とを接触させることを特徴とするバイオマスの処理方法。上述の細菌を用いてリグニンを低分子化することを特徴とするリグニンの処理方法。上述の細菌を含むことを特徴とするバイオマスの処理剤。
【解決手段】リグニン分解酵素活性を有するラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトマイセス・シュードグリセオラス（Streptomyces pseudogriseolus）またはキラトコッカス・アサッカロボランス（Chelatococcus asaccharovorans）に属することを特徴とする細菌。
木質系または草本系バイオマスの分解処理において、該バイオマスと上述の細菌とを接触させることを特徴とするバイオマスの処理方法。上述の細菌を用いてリグニンを低分子化することを特徴とするリグニンの処理方法。上述の細菌を含むことを特徴とするバイオマスの処理剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスの活用に関し、詳しくは、木質系及び草本系バイオマスの活用に関し、より詳しくはリグニンの分解能力を有する細菌およびそれを用いるリグニンの処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物由来の資源であるバイオマスを利用するバイオ燃料は、非化石燃料であり、これを消費して二酸化炭素を排出しても、大気中の二酸化炭素量は増減せず、二酸化炭素の排出はないものとして取り扱われる（カーボンニュートラル）。このため、バイオ燃料は、従来使用されてきた化石燃料に代わる新たなエネルギー源として注目を集めている。
【０００３】
トウモロコシやサトウキビを原料とするバイオエタノールなどのバイオ燃料は、世界的に利用が進んでおり、増産が続いている。しかし、トウモロコシやサトウキビは、食糧としても利用される作物であり（第１世代バイオマス）、食糧との競合により食糧価格の高騰を招くという弊害も生じている。
そこで、近年では食糧とは競合しない木質系・草本系バイオマス（第２世代バイオマス）をバイオ燃料として利用するための研究、開発が進められている。
【０００４】
木質系・草本系バイオマスは、主に、リグニン、セルロースおよびキシランにより構成されている。リグニン、セルロースおよびキシランはいずれもポリマーであり、バイオ燃料として利用するためには、低分子化が必要である。これらの構成要素の中でもリグニンは、難分解性成分として知られている。また、リグニンを希硫酸やアルカリ処理した際に生成するリグニン低分子化可溶化物はアルコール発酵の障害となるほか、セルラーゼやキシラナーゼなどの酵素を吸着し、さらに、廃液の発生原因ともなり、木質系・草本系バイオマス活用の大きな障害となっている。
【０００５】
現在、木質系・草本系バイオマスの処理過程におけるリグニンの除去は、希硫酸やアルカリを用いる化学的処理、または熱処理が一般的である。しかし、化学的処理は前述のアルコール発酵障害と酵素吸着という問題に加え廃液の発生による２次汚染の問題があり、熱処理はエネルギー消費量が多く、新エネルギー源の開発手段として適当とは言い難く、さらに高コストとなるという問題点がある。
これらの問題を解消し、環境問題の要請にもこたえる方法として、リグニンを生物学的に処理する方法が考えられる。例えば、特許文献１には、糸状菌を用いてリグニンを分解処理する方法が開示されている。
しかし、糸状菌によるリグニンの分解は長時間を要するため、より効率的で簡便なリグニンの分解方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３２５６０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、バイオマスに含まれるリグニンを、迅速に効率よく、かつ安価に処理しうる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、糸状菌の代わりに細菌を用いることを想到し、リグニン分解酵素活性を有する細菌について鋭意研究および探索を行った。この結果、ラルストニア（Ralstonia）属、ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属、ストレプトマイセス（Streptmyces）属またはキラトコッカス（Chelatococcus）属に属する細菌がすぐれたリグニン分解酵素活性を有することを見いだし、上記目的を達成しうる本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、リグニン分解酵素活性を有するラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトマイセス・シュードグリセオラス（Streptomyces pseudogriseolus）またはキラトコッカス・アサッカロボランス（Chelatococcus asaccharovorans）に属することを特徴とする細菌を提供する。
【０００９】
本発明においては、前記リグニン分解酵素活性を有する細菌が、ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−９１８）であることが好ましい。
【００１０】
また、本発明は、木質系または草本系バイオマスの分解処理において、該バイオマスと上述の細菌とを接触させることを特徴とするバイオマスの処理方法；上述の細菌を用いてリグニンを低分子化することを特徴とするリグニンの処理方法；および、上述の細菌を含むことを特徴とするバイオマスの処理剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、バイオマスに含まれるリグニンを、迅速に効率よく、かつ安価に処理することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】２７５ｎｍの吸光度の減衰率を示すグラフである。
【図２】４８０ｎｍの吸光度の減衰率を示すグラフである。
【図３】６００ｎｍの吸光度の減衰率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
次に、本発明を実施するための最良の形態を説明する。なお、本発明において「細菌」とは、原核生物のことをいう。
ラルストニア（Ralstonia）属は、分類学上、バークホルデリア科（Burkholderiaceae）ラルストニア属に属する。ラルストニア属に属する細菌は、寒天培地上では白色で直径１ｍｍ程度のコロニーを形成する。
ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属は、分類学上、キサントモナス科（Xanthomonadaceae）ステノトロホモナス属に属する。ステノトロホモナス属に属する細菌は、寒天培地上では白色でほぼ透明な直径０．２ｍｍ程度のコロニーを形成する。
ストレプトマイセス（Streptmyces）属は、分類学上、ストレプトマイセス科（Streptomycetaceae）ストレプトマイセス属に属する。ストレプトマイセスに属する細菌は、放線菌で寒天培地上では白〜灰色である直径０．３ｍｍ程度のコロニーを形成する。
キラトコッカス（Chelatococcus）属は、分類学上、ベイジェリンキー科（Beijerinckiaceae）キラトコッカス属に属する。キラトコッカスに属する細菌は、寒天培地上ではクリーム色で直径０．５ｍｍ程度のコロニーを形成する。
【００１４】
上記ラルストニア・ピッケティに属する菌株の例としては、本発明者らが単離したラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）ＫＳ−１株およびＫＳ−９株を挙げることができる。
また、上記ステノトロホモナス・マルトフィリアに属する菌株の例としては、本発明者らが単離したステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株を挙げることができる。
また、上記ストレプトマイセス・シュードグリセオラスに属する菌株の例としては、本発明者らが単離したストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株を挙げることができる。このＫＳ−３株は、本発明者らにより、受領日：２０１０年３月２３日に受領番号「ＮＩＴＥ ＡＰ−９１８」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託された。
また、上記キラトコッカス・アサッカロボランスに属する菌株の例としては、本発明者らが単離したキラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株を挙げることができる。
【００１５】
本発明の細菌のリグニン分解酵素活性は、少なくとも２種の酵素、リグニンパーオキシダーゼおよびマンガンペルオキシダーゼに由来する。
リグニンパーオキシダーゼは、過酸化水素の存在下でリグニンやそのモデル化合物（例えば、ベラトリルアルコール）の酸化分解を触媒する酵素である。リグニンパーオキシダーゼの働きによりベラトリルアルコールが酸化されベラトルムアルデヒドとなると、３１０ｎｍ付近の吸光度が増加する。この性質を利用して、糸状菌や担子菌類については、過酸化水素の存在下でベラトリルアルコール溶液に試験サンプルを添加し、ベラトリルアルコールからベラトルムアルデヒドへの酸化を吸光度測定により検出して、リグニンパーオキシダーゼ活性を測定する方法が確立されている。本発明者らは、この測定方法を細菌に応用して適用した。
【００１６】
一方、マンガンペルオキシダーゼは、分子量４．６万の糖ヘムタンパク質であり、過酸化水素の存在下でＭｎ2+からＭｎ3+への酸化を触媒する酵素である。このＭｎ3+が、リグニンやジメトキシフェノールなどのフェノール性基質を酸化分解する。２，６−ジメトキシフェノールがマンガンペルオキシダーゼにより酸化されると、４７０ｎｍ付近の吸光度が増加する。この性質を利用して、糸状菌や担子菌類については、過酸化水素の存在下で２，６−ジメトキシフェノール溶液に試験サンプルを添加し、２，６−ジメトキシフェノールの酸化を吸光度測定により検出して、マンガンペルオキシダーゼ活性を測定する方法が確立されている。本発明者らは、この測定方法を細菌に応用して適用した。
【００１７】
また、細菌のリグニン分解能力を測定する方法としては、細菌をリグニン含有液体培地中で培養し、４８０ｎｍ付近の吸光度からリグニンの脱色を測定する方法や、２７５ｎｍ付近の吸光度からリグニンの芳香環の分解を測定する方法が知られている。
【００１８】
本発明のリグニン分解酵素活性を有する細菌は、好気的条件下で培養し増殖することができる。培養液のｐＨは４〜９が好ましく、５〜８であることがより好ましい。
培養温度は１０〜４０℃であることが好ましく、より好ましくは２０〜３０℃である。
本発明のリグニン分解酵素活性を有する細菌の培地組成の一例として、表１に記載の成分を滅菌水で１Ｌにメスアップして調製した液体培地を挙げることができる。
【００１９】
【００２０】
培地中の炭素源としては、スギ微粉末などの木質系炭素源や、ケナフ微粉末、トマト茎微粉末、稲・麦ワラ微粉末などの草本系炭素源を挙げることができる。炭素源として、これらの特定の炭素源を唯一の炭素源として用いて培養することにより、難分解物であるリグニンを分解しうる菌体に対して栄養要求性に基づいて選択圧をかけることができるという利点がある。
窒素源の例としては、一般に酵母エキスが使用される。しかし、本発明者らにより、酵母エキス以外の窒素源を用いることにより、本発明のリグニン分解細菌培養液のリグニン分解酵素活性をさらに向上しうることが判明した。より高いリグニン分解酵素活性を得るために好適な窒素源は、菌株ごとに異なり、一概には言えないが、ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株では硝酸アンモニウムを用いることが好ましく、ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株では硫酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムが好ましく、キラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株では硝酸アンモニウムが好ましく、ステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株では硫酸アンモニウムが好ましい。これらの窒素源は酵母エキスに比較してはるかに安価であるため産業応用に好適である。
【００２１】
本発明の細菌が産生するリグニンパーオキシダーゼおよびマンガンペルオキシダーゼは、上述の液体培地で培養した場合、菌外に分泌され、培養液がリグニン分解酵素活性を発揮する。したがって、菌体が木材などに直接接触して、そこで局所的にリグニンを分解する糸状菌とは異なり、本発明の細菌は、液体培養をすることにより、リグニン分解酵素を大量に入手することができるという利点がある。
本発明の応用としては、木質系バイオマスまたは草本系バイオマスを分解処理する際に、当該バイオマスを本発明の細菌を含む培養槽に投入して当該細菌が分泌するリグニン分解酵素を作用させ、難分解性のリグニンを選択的に低分子化し、分解することが考えられる。この生物学的リグニン分解処理により、バイオマスのこれまでの酸やアルカリによる分解処理の過程で発酵障害や酵素吸着を起こし、分解処理を妨げるリグニンを除去し、バイオマスに含まれるセルロースやキシランを分解しやすい状態にできる利点がある。
【００２２】
また、本発明の細菌を微生物製剤として応用することが考えられる。本発明の細菌を微生物製剤とする場合、各細菌の酵素活性（例えば、リグニンパーオキシダーゼ活性、マンガンペルオキシダーゼ活性、キシラナーゼ活性、セルラーゼ活性）を把握した上で、使用目的に応じて各細菌を組み合わせることが好ましい。
【００２３】
上記、処理対象のバイオマスの例として、建築廃材、稲わら、麦わら、古紙などのバイオマス資源を挙げることができる。また、これらのバイオマス資源を低分子化し、バイオエタノールの製造原料に利用することが考えられる。
さらに、処理対象のバイオマスの例として、木材パルプの製造工程で発生する黒液を挙げることができる。黒液は、従来、燃焼して処理されてきたが、本発明のリグニンの処理方法を黒液に適用して、バイオエタノールの原料として用いることにより、簡便でかつ環境にも配慮した形でリサイクルをすることができる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の単なる例示であって、本発明の限定を意図するものではない。
【００２５】
＜木質系または草本系バイオマスを炭素源とするリグニン分解微生物の探索＞
木質系炭素源としてスギ微粉末を唯一の炭素源として生育する細菌を探索した。同様に、草本系炭素源としてケナフ微粉末を唯一の炭素源として生育する細菌およびトマト茎微粉末を唯一の炭素源として生育する細菌を探索した。
この結果、リグニン分解能力を有する細菌として、５種の細菌が分離された（ＫＳ−１株、ＫＳ−３株、ＫＳ−５株、ＫＳ−８株およびＫＳ−９株）。
【００２６】
これらの菌株について、１６Ｓ ｒＲＮＡ系統解析を行った結果、ＫＳ−１株とＫＳ−９株は、ラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）に属する細菌であること、ＫＳ−８株は、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）に属する細菌であること、ＫＳ−３株は、ストレプトマイセス・シュードグリセオラス（Streptomyces pseudogriseolus）に属する細菌であること、ＫＳ−５株は、キラトコッカス・アサッカロボランス（Chelatococcus asaccharovorans）に属する細菌であることが明らかとなった。なお、１６ＳｒＲＮＡの相同性はＫＳ−１株が１００％、ＫＳ−３株が１００％、ＫＳ−５株が９７％、ＫＳ−８株が１００％であった。
【００２７】
ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株は、本発明者らにより、受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−９１８として、受領日：２０１０年３月２３日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託された。
【００２８】
＜リグニン分解能力の測定＞
［実施例１］
本発明のリグニン分解細菌であるラルストニア・ピッケティＫＳ−１株によるリグニンの分解を、特開平９−６７７８５号公報に記載された方法で測定した。具体的には、まず前培養として、表２に記載の組成の液体培地３ｍＬにラルストニア・ピッケティＫＳ−１株を１白金耳入れ、３日間、１５０ｒｐｍで回転振とう培養した。
【００２９】
【００３０】
次いで、表３に記載の組成の培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコに注ぎ、これに前培養した菌体３ｍＬを添加して、１７５ｒｐｍで回転振とう培養した。培養開始直後、培養開始から４７時間後および７２時間後に２７５ｎｍ、４８０ｎｍおよび６００ｎｍの吸光度を測定した。２７５ｎｍでは、リグニンの芳香環に由来する吸光度を測定し、４８０ｎｍではリグニンの脱色、６００ｎｍでは菌体の増殖度を測定することにより、リグニンの分解率を算出した。なお、吸光度の測定には、培養液を１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して得られた上清を用いた。
【００３１】
【００３２】
培養開始直後の吸光度に対する吸光度の減衰率を２７５ｎｍについては図１に、４８０ｎｍについては図２に、６００ｎｍについては図３に、それぞれ×印で示す。測定の結果、７２時間後の吸光度は、実験開始時と比べて２７５ｎｍで約１６％、４８０ｎｍで約９．４％、６００ｎｍでは約１１．１％減衰した。これらの結果から、本発明のリグニン分解細菌であるラルストニア・ピッケティＫＳ−１株がリグニン分解能力を持つことが示された。
【００３３】
［実施例２〜４］
ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株の代わりに、それぞれストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株、キラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株、ステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株を使用して、実施例１と同様の測定を行った。結果を図１〜３に、ＫＳ−３株については■で、ＫＳ−５株については▲で、ＫＳ−８株については●で示す。
これらの結果から、ＫＳ−３株、ＫＳ−５株、ＫＳ−８株のいずれもがリグニン分解能力を持つこと、ならびに、これらの中でもＫＳ−３株とＫＳ−５株は吸光度の減衰率が大きく、優れたリグニン分解能力を持つことが示された。
【００３４】
＜リグニン分解細菌ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株の菌学的性質＞
［実施例５］
（１）リグニンパーオキシダーゼ活性測定法によるリグニン分解活性の分析
ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株のリグニン分解活性をリグニンパーオキシダーゼ（ＬｉＰ）活性測定法により分析した。
【００３５】
具体的には、以下の表４に示す１）から３）の３種の溶液を使用した。
【００３６】
本実施例において、サンプル溶液は、ＫＳ−１株を表５に示す組成の液体培地で７日間、３０℃で振とう培養した後の培養液を、１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離して得られた上清を使用した。なお、炭素源としては、スギ微粉末、ケナフ微粉末またはトマト茎微粉末を使用した。
【００３７】
基質溶液８００μＬとサンプル溶液１００μＬを１ｍＬ容のセル中で混合し、３７℃で１０分間静置した。その後、過酸化水素溶液１００μＬを加えて反応を開始した。反応直後の吸光度とブランクの吸光度（測定波長：３１０ｎｍ）とを比較し、反応直後の吸光度がブランクの吸光度の２倍以上である場合、酵素活性があると判断した（表７に＋で示す）。実験の結果、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約２．６６倍であり、ＫＳ−１株がリグニンパーオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。なお、ブランクとしては、過酸化水素溶液の代わりに水を使用したものを用いた。
【００３８】
（２）マンガンペルオキシダーゼ活性測定法によるリグニン分解活性の分析
ＫＳ−１株のリグニン分解活性をマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）活性測定法により分析した。
【００３９】
具体的には、以下の表６に示す１）から５）の５種の溶液を使用した。
【００４０】
基質溶液５０μＬ、２０ｍＭ硫酸マンガン溶液５０μＬ、マロン酸緩衝液７００μＬおよびサンプル溶液１００μＬを１ｍＬ容のセル中で混合し、３７℃で１０分間静置した。その後、過酸化水素溶液１００μＬを加えて反応を開始した。反応直後の吸光度とブランクの吸光度（測定波長：４６９ｎｍ）を比較し、反応直後の吸光度がブランクの吸光度にの２倍以上である場合、酵素活性があると判断した（表７に＋で示す）。実験の結果、反応直後の吸光度はブランクの約１．６５倍であり、ＫＳ−１株がマンガンペルオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。なお、ブランクとしては、過酸化水素溶液の代わりに水を使用したものを用いた。
【００４１】
上記リグニン分解活性に加え、ＫＳ−１株のキシラン分解活性及びセルロース分解活性ならびに菌学的性質を検討した。結果を表７に示す。
なお、キシラン分解活性はキシラナーゼ活性を、セルロース分解活性はセルラーゼ活性を周知の方法により測定し、分析した。
【００４２】
［実施例６］
ラルストニア・ピッケティに属するＫＳ−９株の菌学的性質を実施例５と同様に分析した。
この結果、リグニンパーオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度に対して約２．４６倍であり、ＫＳ−９株がリグニンパーオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。一方、マンガンペルオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約１．３０倍であった。分析結果を表７に示す。
【００４３】
【００４４】
＜リグニン分解細菌ステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株の菌学的性質＞
［実施例７］
ステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株の菌学的性質を実施例５と同様にして分析した。
この結果、リグニンパーオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約２．４９倍であり、ＫＳ−８株がリグニンパーオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。マンガンペルオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約１．５０倍であり、ＫＳ−８株がマンガンペルオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。分析結果を表８に示す。なお、表中の記号の意味は、表７と同様である。
【００４５】
【００４６】
＜リグニン分解細菌ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株の菌学的性質＞
［実施例８］
ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株の菌学的性質を実施例５と同様にして分析した。
この結果、リグニンパーオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約２．２８倍であり、ＫＳ−３株がリグニンパーオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。マンガンペルオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約２．０倍であり、ＫＳ−３株がマンガンペルオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。分析結果を表９に示す。なお、表中の記号の意味は、表７と同様である。
【００４７】
【００４８】
＜リグニン分解細菌キラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株の菌学的性質＞
［実施例９］
キラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株の菌学的性質を実施例５と同様にして分析した。
この結果、リグニンパーオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約２．５８倍であり、ＫＳ−５株がリグニンパーオキシダーゼ活性を有することが確認された。マンガンペルオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約１．５７倍であり、ＫＳ−５株のマンガンペルオキシダーゼ活性が確認された。分析結果を表１０に示す。なお、表中の記号の意味は、表７と同様である。
【００４９】
【００５０】
＜リグニン分解酵素活性を増強する培養液の探索＞
［実施例１０］
表１１に記載の液体培地５ｍＬを試験管に注ぎ、これに本発明のリグニン分解細菌であるラルストニア・ピッケティＫＳ−１株を１白金耳植菌し、ローラー回転式培養装置にセットして、７日間、３０ｒｐｍで培養した。
培養終了後、培養液を１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して得られた上清をサンプル溶液とした。
【００５１】
【００５２】
１ｍＬ容の吸光度測定用セルに、サンプル溶液１００μＬと表１２に記載の基質溶液８００μＬを加えて混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後表１２に記載の過酸化水素溶液１００μＬを加え、よく混合して酵素反応を開始させ、反応開始から１分後に吸光度を測定した。
この吸光度の値を、ブランクの吸光度で割りリグニンパーオキシダーゼ活性値として２．２０が得られた。なお、ブランクの吸光度は、過酸化水素溶液の代わりに水を用いたこと以外は同様の測定を行って得た。
【００５３】
【００５４】
［実施例１１］
液体培地の窒素源として酵母エキスの代わりに硫酸アンモニウムを用いたこと以外は実施例１０と同様にして吸光度測定を行い、リグニンパーオキシダーゼ活性値１．６８３を得た。
【００５５】
［実施例１２］
液体培地の窒素源として酵母エキスの代わりに硝酸アンモニウムを用いたこと以外は実施例１０と同様にして吸光度測定を行い、リグニンパーオキシダーゼ活性値３．４１３を得た。結果のまとめを表１３に示す。
実施例１０〜１２の結果から、ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株は、窒素源として硝酸アンモニウムを使用した場合に、優れたリグニンパーオキシダーゼ活性を示すことが明らかとなった。
【００５６】
［実施例１３〜１５］
リグニン分解細菌として、ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株に代えてストレプトマイセス・シュードグリセオラス（Streptomyces pseudogriseolus）ＫＳ−３株を用いたこと以外は、それぞれ実施例１０〜１２と同様にして吸光度測定を行った。窒素源として酵母エキスを用いた実施例１３のリグニンパーオキシダーゼ活性は２．１６３、硫酸アンモニウムを用いた実施例１４では４．３１４、硝酸アンモニウムを用いた実施例１５では４．０７０であった。結果のまとめを表１３に示す。
これらの結果から、ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株は、窒素源として硫酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムを用いることにより、従来汎用されている酵母エキスを用いる場合と比べて２倍程度の酵素活性を得ることができる。
【００５７】
［実施例１６〜１８］
リグニン分解細菌として、ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株に代えてキラトコッカス・アサッカロボランス（Chelatococcus asaccharovorans）ＫＳ−５株を用いたこと以外は、それぞれ実施例１０〜１２と同様にして吸光度測定を行った。窒素源として酵母エキスを用いた実施例１６のリグニンパーオキシダーゼ活性は２．４７８、硫酸アンモニウムを用いた実施例１７では１．８８２、硝酸アンモニウムを用いた実施例１８では３．１８８であった。結果のまとめを表１３に示す。
これらの結果から、キラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株は、窒素源として硝酸アンモニウムを用いることにより、優れたリグニンパーオキシダーゼ活性を示すことが明らかとなった。
【００５８】
［実施例１９〜２１］
リグニン分解細菌として、ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株に代えてステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＫＳ−８株を用いたこと以外は、それぞれ実施例１０〜１２と同様にして吸光度測定を行った。窒素源として酵母エキスを用いた実施例１９のリグニンパーオキシダーゼ活性は２．４５７、硫酸アンモニウムを用いた実施例２０では３．９２１、硝酸アンモニウムを用いた実施例２１では２．８８９であった。結果のまとめを表１３に示す。
これらの結果から、ステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株は、窒素源として硫酸アンモニウムを用いることにより、優れたリグニンパーオキシダーゼ活性を示すことが明らかとなった。
【００５９】
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、バイオマスに含まれるリグニンを、迅速に効率よく、かつ安価に処理することができるリグニン分解細菌が提供される。また、本発明のリグニン分解細菌を利用することにより、バイオマスに含まれるリグニンを迅速に効率よく、かつ安価に処理することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスの活用に関し、詳しくは、木質系及び草本系バイオマスの活用に関し、より詳しくはリグニンの分解能力を有する細菌およびそれを用いるリグニンの処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物由来の資源であるバイオマスを利用するバイオ燃料は、非化石燃料であり、これを消費して二酸化炭素を排出しても、大気中の二酸化炭素量は増減せず、二酸化炭素の排出はないものとして取り扱われる（カーボンニュートラル）。このため、バイオ燃料は、従来使用されてきた化石燃料に代わる新たなエネルギー源として注目を集めている。
【０００３】
トウモロコシやサトウキビを原料とするバイオエタノールなどのバイオ燃料は、世界的に利用が進んでおり、増産が続いている。しかし、トウモロコシやサトウキビは、食糧としても利用される作物であり（第１世代バイオマス）、食糧との競合により食糧価格の高騰を招くという弊害も生じている。
そこで、近年では食糧とは競合しない木質系・草本系バイオマス（第２世代バイオマス）をバイオ燃料として利用するための研究、開発が進められている。
【０００４】
木質系・草本系バイオマスは、主に、リグニン、セルロースおよびキシランにより構成されている。リグニン、セルロースおよびキシランはいずれもポリマーであり、バイオ燃料として利用するためには、低分子化が必要である。これらの構成要素の中でもリグニンは、難分解性成分として知られている。また、リグニンを希硫酸やアルカリ処理した際に生成するリグニン低分子化可溶化物はアルコール発酵の障害となるほか、セルラーゼやキシラナーゼなどの酵素を吸着し、さらに、廃液の発生原因ともなり、木質系・草本系バイオマス活用の大きな障害となっている。
【０００５】
現在、木質系・草本系バイオマスの処理過程におけるリグニンの除去は、希硫酸やアルカリを用いる化学的処理、または熱処理が一般的である。しかし、化学的処理は前述のアルコール発酵障害と酵素吸着という問題に加え廃液の発生による２次汚染の問題があり、熱処理はエネルギー消費量が多く、新エネルギー源の開発手段として適当とは言い難く、さらに高コストとなるという問題点がある。
これらの問題を解消し、環境問題の要請にもこたえる方法として、リグニンを生物学的に処理する方法が考えられる。例えば、特許文献１には、糸状菌を用いてリグニンを分解処理する方法が開示されている。
しかし、糸状菌によるリグニンの分解は長時間を要するため、より効率的で簡便なリグニンの分解方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３２５６０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、バイオマスに含まれるリグニンを、迅速に効率よく、かつ安価に処理しうる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、糸状菌の代わりに細菌を用いることを想到し、リグニン分解酵素活性を有する細菌について鋭意研究および探索を行った。この結果、ラルストニア（Ralstonia）属、ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属、ストレプトマイセス（Streptmyces）属またはキラトコッカス（Chelatococcus）属に属する細菌がすぐれたリグニン分解酵素活性を有することを見いだし、上記目的を達成しうる本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、リグニン分解酵素活性を有するラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトマイセス・シュードグリセオラス（Streptomyces pseudogriseolus）またはキラトコッカス・アサッカロボランス（Chelatococcus asaccharovorans）に属することを特徴とする細菌を提供する。
【０００９】
本発明においては、前記リグニン分解酵素活性を有する細菌が、ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−９１８）であることが好ましい。
【００１０】
また、本発明は、木質系または草本系バイオマスの分解処理において、該バイオマスと上述の細菌とを接触させることを特徴とするバイオマスの処理方法；上述の細菌を用いてリグニンを低分子化することを特徴とするリグニンの処理方法；および、上述の細菌を含むことを特徴とするバイオマスの処理剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、バイオマスに含まれるリグニンを、迅速に効率よく、かつ安価に処理することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】２７５ｎｍの吸光度の減衰率を示すグラフである。
【図２】４８０ｎｍの吸光度の減衰率を示すグラフである。
【図３】６００ｎｍの吸光度の減衰率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
次に、本発明を実施するための最良の形態を説明する。なお、本発明において「細菌」とは、原核生物のことをいう。
ラルストニア（Ralstonia）属は、分類学上、バークホルデリア科（Burkholderiaceae）ラルストニア属に属する。ラルストニア属に属する細菌は、寒天培地上では白色で直径１ｍｍ程度のコロニーを形成する。
ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属は、分類学上、キサントモナス科（Xanthomonadaceae）ステノトロホモナス属に属する。ステノトロホモナス属に属する細菌は、寒天培地上では白色でほぼ透明な直径０．２ｍｍ程度のコロニーを形成する。
ストレプトマイセス（Streptmyces）属は、分類学上、ストレプトマイセス科（Streptomycetaceae）ストレプトマイセス属に属する。ストレプトマイセスに属する細菌は、放線菌で寒天培地上では白〜灰色である直径０．３ｍｍ程度のコロニーを形成する。
キラトコッカス（Chelatococcus）属は、分類学上、ベイジェリンキー科（Beijerinckiaceae）キラトコッカス属に属する。キラトコッカスに属する細菌は、寒天培地上ではクリーム色で直径０．５ｍｍ程度のコロニーを形成する。
【００１４】
上記ラルストニア・ピッケティに属する菌株の例としては、本発明者らが単離したラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）ＫＳ−１株およびＫＳ−９株を挙げることができる。
また、上記ステノトロホモナス・マルトフィリアに属する菌株の例としては、本発明者らが単離したステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株を挙げることができる。
また、上記ストレプトマイセス・シュードグリセオラスに属する菌株の例としては、本発明者らが単離したストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株を挙げることができる。このＫＳ−３株は、本発明者らにより、受領日：２０１０年３月２３日に受領番号「ＮＩＴＥ ＡＰ−９１８」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託された。
また、上記キラトコッカス・アサッカロボランスに属する菌株の例としては、本発明者らが単離したキラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株を挙げることができる。
【００１５】
本発明の細菌のリグニン分解酵素活性は、少なくとも２種の酵素、リグニンパーオキシダーゼおよびマンガンペルオキシダーゼに由来する。
リグニンパーオキシダーゼは、過酸化水素の存在下でリグニンやそのモデル化合物（例えば、ベラトリルアルコール）の酸化分解を触媒する酵素である。リグニンパーオキシダーゼの働きによりベラトリルアルコールが酸化されベラトルムアルデヒドとなると、３１０ｎｍ付近の吸光度が増加する。この性質を利用して、糸状菌や担子菌類については、過酸化水素の存在下でベラトリルアルコール溶液に試験サンプルを添加し、ベラトリルアルコールからベラトルムアルデヒドへの酸化を吸光度測定により検出して、リグニンパーオキシダーゼ活性を測定する方法が確立されている。本発明者らは、この測定方法を細菌に応用して適用した。
【００１６】
一方、マンガンペルオキシダーゼは、分子量４．６万の糖ヘムタンパク質であり、過酸化水素の存在下でＭｎ2+からＭｎ3+への酸化を触媒する酵素である。このＭｎ3+が、リグニンやジメトキシフェノールなどのフェノール性基質を酸化分解する。２，６−ジメトキシフェノールがマンガンペルオキシダーゼにより酸化されると、４７０ｎｍ付近の吸光度が増加する。この性質を利用して、糸状菌や担子菌類については、過酸化水素の存在下で２，６−ジメトキシフェノール溶液に試験サンプルを添加し、２，６−ジメトキシフェノールの酸化を吸光度測定により検出して、マンガンペルオキシダーゼ活性を測定する方法が確立されている。本発明者らは、この測定方法を細菌に応用して適用した。
【００１７】
また、細菌のリグニン分解能力を測定する方法としては、細菌をリグニン含有液体培地中で培養し、４８０ｎｍ付近の吸光度からリグニンの脱色を測定する方法や、２７５ｎｍ付近の吸光度からリグニンの芳香環の分解を測定する方法が知られている。
【００１８】
本発明のリグニン分解酵素活性を有する細菌は、好気的条件下で培養し増殖することができる。培養液のｐＨは４〜９が好ましく、５〜８であることがより好ましい。
培養温度は１０〜４０℃であることが好ましく、より好ましくは２０〜３０℃である。
本発明のリグニン分解酵素活性を有する細菌の培地組成の一例として、表１に記載の成分を滅菌水で１Ｌにメスアップして調製した液体培地を挙げることができる。
【００１９】
【００２０】
培地中の炭素源としては、スギ微粉末などの木質系炭素源や、ケナフ微粉末、トマト茎微粉末、稲・麦ワラ微粉末などの草本系炭素源を挙げることができる。炭素源として、これらの特定の炭素源を唯一の炭素源として用いて培養することにより、難分解物であるリグニンを分解しうる菌体に対して栄養要求性に基づいて選択圧をかけることができるという利点がある。
窒素源の例としては、一般に酵母エキスが使用される。しかし、本発明者らにより、酵母エキス以外の窒素源を用いることにより、本発明のリグニン分解細菌培養液のリグニン分解酵素活性をさらに向上しうることが判明した。より高いリグニン分解酵素活性を得るために好適な窒素源は、菌株ごとに異なり、一概には言えないが、ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株では硝酸アンモニウムを用いることが好ましく、ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株では硫酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムが好ましく、キラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株では硝酸アンモニウムが好ましく、ステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株では硫酸アンモニウムが好ましい。これらの窒素源は酵母エキスに比較してはるかに安価であるため産業応用に好適である。
【００２１】
本発明の細菌が産生するリグニンパーオキシダーゼおよびマンガンペルオキシダーゼは、上述の液体培地で培養した場合、菌外に分泌され、培養液がリグニン分解酵素活性を発揮する。したがって、菌体が木材などに直接接触して、そこで局所的にリグニンを分解する糸状菌とは異なり、本発明の細菌は、液体培養をすることにより、リグニン分解酵素を大量に入手することができるという利点がある。
本発明の応用としては、木質系バイオマスまたは草本系バイオマスを分解処理する際に、当該バイオマスを本発明の細菌を含む培養槽に投入して当該細菌が分泌するリグニン分解酵素を作用させ、難分解性のリグニンを選択的に低分子化し、分解することが考えられる。この生物学的リグニン分解処理により、バイオマスのこれまでの酸やアルカリによる分解処理の過程で発酵障害や酵素吸着を起こし、分解処理を妨げるリグニンを除去し、バイオマスに含まれるセルロースやキシランを分解しやすい状態にできる利点がある。
【００２２】
また、本発明の細菌を微生物製剤として応用することが考えられる。本発明の細菌を微生物製剤とする場合、各細菌の酵素活性（例えば、リグニンパーオキシダーゼ活性、マンガンペルオキシダーゼ活性、キシラナーゼ活性、セルラーゼ活性）を把握した上で、使用目的に応じて各細菌を組み合わせることが好ましい。
【００２３】
上記、処理対象のバイオマスの例として、建築廃材、稲わら、麦わら、古紙などのバイオマス資源を挙げることができる。また、これらのバイオマス資源を低分子化し、バイオエタノールの製造原料に利用することが考えられる。
さらに、処理対象のバイオマスの例として、木材パルプの製造工程で発生する黒液を挙げることができる。黒液は、従来、燃焼して処理されてきたが、本発明のリグニンの処理方法を黒液に適用して、バイオエタノールの原料として用いることにより、簡便でかつ環境にも配慮した形でリサイクルをすることができる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の単なる例示であって、本発明の限定を意図するものではない。
【００２５】
＜木質系または草本系バイオマスを炭素源とするリグニン分解微生物の探索＞
木質系炭素源としてスギ微粉末を唯一の炭素源として生育する細菌を探索した。同様に、草本系炭素源としてケナフ微粉末を唯一の炭素源として生育する細菌およびトマト茎微粉末を唯一の炭素源として生育する細菌を探索した。
この結果、リグニン分解能力を有する細菌として、５種の細菌が分離された（ＫＳ−１株、ＫＳ−３株、ＫＳ−５株、ＫＳ−８株およびＫＳ−９株）。
【００２６】
これらの菌株について、１６Ｓ ｒＲＮＡ系統解析を行った結果、ＫＳ−１株とＫＳ−９株は、ラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）に属する細菌であること、ＫＳ−８株は、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）に属する細菌であること、ＫＳ−３株は、ストレプトマイセス・シュードグリセオラス（Streptomyces pseudogriseolus）に属する細菌であること、ＫＳ−５株は、キラトコッカス・アサッカロボランス（Chelatococcus asaccharovorans）に属する細菌であることが明らかとなった。なお、１６ＳｒＲＮＡの相同性はＫＳ−１株が１００％、ＫＳ−３株が１００％、ＫＳ−５株が９７％、ＫＳ−８株が１００％であった。
【００２７】
ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株は、本発明者らにより、受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−９１８として、受領日：２０１０年３月２３日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託された。
【００２８】
＜リグニン分解能力の測定＞
［実施例１］
本発明のリグニン分解細菌であるラルストニア・ピッケティＫＳ−１株によるリグニンの分解を、特開平９−６７７８５号公報に記載された方法で測定した。具体的には、まず前培養として、表２に記載の組成の液体培地３ｍＬにラルストニア・ピッケティＫＳ−１株を１白金耳入れ、３日間、１５０ｒｐｍで回転振とう培養した。
【００２９】
【００３０】
次いで、表３に記載の組成の培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコに注ぎ、これに前培養した菌体３ｍＬを添加して、１７５ｒｐｍで回転振とう培養した。培養開始直後、培養開始から４７時間後および７２時間後に２７５ｎｍ、４８０ｎｍおよび６００ｎｍの吸光度を測定した。２７５ｎｍでは、リグニンの芳香環に由来する吸光度を測定し、４８０ｎｍではリグニンの脱色、６００ｎｍでは菌体の増殖度を測定することにより、リグニンの分解率を算出した。なお、吸光度の測定には、培養液を１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して得られた上清を用いた。
【００３１】
【００３２】
培養開始直後の吸光度に対する吸光度の減衰率を２７５ｎｍについては図１に、４８０ｎｍについては図２に、６００ｎｍについては図３に、それぞれ×印で示す。測定の結果、７２時間後の吸光度は、実験開始時と比べて２７５ｎｍで約１６％、４８０ｎｍで約９．４％、６００ｎｍでは約１１．１％減衰した。これらの結果から、本発明のリグニン分解細菌であるラルストニア・ピッケティＫＳ−１株がリグニン分解能力を持つことが示された。
【００３３】
［実施例２〜４］
ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株の代わりに、それぞれストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株、キラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株、ステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株を使用して、実施例１と同様の測定を行った。結果を図１〜３に、ＫＳ−３株については■で、ＫＳ−５株については▲で、ＫＳ−８株については●で示す。
これらの結果から、ＫＳ−３株、ＫＳ−５株、ＫＳ−８株のいずれもがリグニン分解能力を持つこと、ならびに、これらの中でもＫＳ−３株とＫＳ−５株は吸光度の減衰率が大きく、優れたリグニン分解能力を持つことが示された。
【００３４】
＜リグニン分解細菌ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株の菌学的性質＞
［実施例５］
（１）リグニンパーオキシダーゼ活性測定法によるリグニン分解活性の分析
ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株のリグニン分解活性をリグニンパーオキシダーゼ（ＬｉＰ）活性測定法により分析した。
【００３５】
具体的には、以下の表４に示す１）から３）の３種の溶液を使用した。
【００３６】
本実施例において、サンプル溶液は、ＫＳ−１株を表５に示す組成の液体培地で７日間、３０℃で振とう培養した後の培養液を、１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離して得られた上清を使用した。なお、炭素源としては、スギ微粉末、ケナフ微粉末またはトマト茎微粉末を使用した。
【００３７】
基質溶液８００μＬとサンプル溶液１００μＬを１ｍＬ容のセル中で混合し、３７℃で１０分間静置した。その後、過酸化水素溶液１００μＬを加えて反応を開始した。反応直後の吸光度とブランクの吸光度（測定波長：３１０ｎｍ）とを比較し、反応直後の吸光度がブランクの吸光度の２倍以上である場合、酵素活性があると判断した（表７に＋で示す）。実験の結果、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約２．６６倍であり、ＫＳ−１株がリグニンパーオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。なお、ブランクとしては、過酸化水素溶液の代わりに水を使用したものを用いた。
【００３８】
（２）マンガンペルオキシダーゼ活性測定法によるリグニン分解活性の分析
ＫＳ−１株のリグニン分解活性をマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）活性測定法により分析した。
【００３９】
具体的には、以下の表６に示す１）から５）の５種の溶液を使用した。
【００４０】
基質溶液５０μＬ、２０ｍＭ硫酸マンガン溶液５０μＬ、マロン酸緩衝液７００μＬおよびサンプル溶液１００μＬを１ｍＬ容のセル中で混合し、３７℃で１０分間静置した。その後、過酸化水素溶液１００μＬを加えて反応を開始した。反応直後の吸光度とブランクの吸光度（測定波長：４６９ｎｍ）を比較し、反応直後の吸光度がブランクの吸光度にの２倍以上である場合、酵素活性があると判断した（表７に＋で示す）。実験の結果、反応直後の吸光度はブランクの約１．６５倍であり、ＫＳ−１株がマンガンペルオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。なお、ブランクとしては、過酸化水素溶液の代わりに水を使用したものを用いた。
【００４１】
上記リグニン分解活性に加え、ＫＳ−１株のキシラン分解活性及びセルロース分解活性ならびに菌学的性質を検討した。結果を表７に示す。
なお、キシラン分解活性はキシラナーゼ活性を、セルロース分解活性はセルラーゼ活性を周知の方法により測定し、分析した。
【００４２】
［実施例６］
ラルストニア・ピッケティに属するＫＳ−９株の菌学的性質を実施例５と同様に分析した。
この結果、リグニンパーオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度に対して約２．４６倍であり、ＫＳ−９株がリグニンパーオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。一方、マンガンペルオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約１．３０倍であった。分析結果を表７に示す。
【００４３】
【００４４】
＜リグニン分解細菌ステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株の菌学的性質＞
［実施例７］
ステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株の菌学的性質を実施例５と同様にして分析した。
この結果、リグニンパーオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約２．４９倍であり、ＫＳ−８株がリグニンパーオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。マンガンペルオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約１．５０倍であり、ＫＳ−８株がマンガンペルオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。分析結果を表８に示す。なお、表中の記号の意味は、表７と同様である。
【００４５】
【００４６】
＜リグニン分解細菌ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株の菌学的性質＞
［実施例８］
ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株の菌学的性質を実施例５と同様にして分析した。
この結果、リグニンパーオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約２．２８倍であり、ＫＳ−３株がリグニンパーオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。マンガンペルオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約２．０倍であり、ＫＳ−３株がマンガンペルオキシダーゼ活性を有することが明らかとなった。分析結果を表９に示す。なお、表中の記号の意味は、表７と同様である。
【００４７】
【００４８】
＜リグニン分解細菌キラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株の菌学的性質＞
［実施例９］
キラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株の菌学的性質を実施例５と同様にして分析した。
この結果、リグニンパーオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約２．５８倍であり、ＫＳ−５株がリグニンパーオキシダーゼ活性を有することが確認された。マンガンペルオキシダーゼ活性測定では、反応直後の吸光度はブランクの吸光度の約１．５７倍であり、ＫＳ−５株のマンガンペルオキシダーゼ活性が確認された。分析結果を表１０に示す。なお、表中の記号の意味は、表７と同様である。
【００４９】
【００５０】
＜リグニン分解酵素活性を増強する培養液の探索＞
［実施例１０］
表１１に記載の液体培地５ｍＬを試験管に注ぎ、これに本発明のリグニン分解細菌であるラルストニア・ピッケティＫＳ−１株を１白金耳植菌し、ローラー回転式培養装置にセットして、７日間、３０ｒｐｍで培養した。
培養終了後、培養液を１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して得られた上清をサンプル溶液とした。
【００５１】
【００５２】
１ｍＬ容の吸光度測定用セルに、サンプル溶液１００μＬと表１２に記載の基質溶液８００μＬを加えて混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後表１２に記載の過酸化水素溶液１００μＬを加え、よく混合して酵素反応を開始させ、反応開始から１分後に吸光度を測定した。
この吸光度の値を、ブランクの吸光度で割りリグニンパーオキシダーゼ活性値として２．２０が得られた。なお、ブランクの吸光度は、過酸化水素溶液の代わりに水を用いたこと以外は同様の測定を行って得た。
【００５３】
【００５４】
［実施例１１］
液体培地の窒素源として酵母エキスの代わりに硫酸アンモニウムを用いたこと以外は実施例１０と同様にして吸光度測定を行い、リグニンパーオキシダーゼ活性値１．６８３を得た。
【００５５】
［実施例１２］
液体培地の窒素源として酵母エキスの代わりに硝酸アンモニウムを用いたこと以外は実施例１０と同様にして吸光度測定を行い、リグニンパーオキシダーゼ活性値３．４１３を得た。結果のまとめを表１３に示す。
実施例１０〜１２の結果から、ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株は、窒素源として硝酸アンモニウムを使用した場合に、優れたリグニンパーオキシダーゼ活性を示すことが明らかとなった。
【００５６】
［実施例１３〜１５］
リグニン分解細菌として、ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株に代えてストレプトマイセス・シュードグリセオラス（Streptomyces pseudogriseolus）ＫＳ−３株を用いたこと以外は、それぞれ実施例１０〜１２と同様にして吸光度測定を行った。窒素源として酵母エキスを用いた実施例１３のリグニンパーオキシダーゼ活性は２．１６３、硫酸アンモニウムを用いた実施例１４では４．３１４、硝酸アンモニウムを用いた実施例１５では４．０７０であった。結果のまとめを表１３に示す。
これらの結果から、ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株は、窒素源として硫酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムを用いることにより、従来汎用されている酵母エキスを用いる場合と比べて２倍程度の酵素活性を得ることができる。
【００５７】
［実施例１６〜１８］
リグニン分解細菌として、ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株に代えてキラトコッカス・アサッカロボランス（Chelatococcus asaccharovorans）ＫＳ−５株を用いたこと以外は、それぞれ実施例１０〜１２と同様にして吸光度測定を行った。窒素源として酵母エキスを用いた実施例１６のリグニンパーオキシダーゼ活性は２．４７８、硫酸アンモニウムを用いた実施例１７では１．８８２、硝酸アンモニウムを用いた実施例１８では３．１８８であった。結果のまとめを表１３に示す。
これらの結果から、キラトコッカス・アサッカロボランスＫＳ−５株は、窒素源として硝酸アンモニウムを用いることにより、優れたリグニンパーオキシダーゼ活性を示すことが明らかとなった。
【００５８】
［実施例１９〜２１］
リグニン分解細菌として、ラルストニア・ピッケティＫＳ−１株に代えてステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＫＳ−８株を用いたこと以外は、それぞれ実施例１０〜１２と同様にして吸光度測定を行った。窒素源として酵母エキスを用いた実施例１９のリグニンパーオキシダーゼ活性は２．４５７、硫酸アンモニウムを用いた実施例２０では３．９２１、硝酸アンモニウムを用いた実施例２１では２．８８９であった。結果のまとめを表１３に示す。
これらの結果から、ステノトロホモナス・マルトフィリアＫＳ−８株は、窒素源として硫酸アンモニウムを用いることにより、優れたリグニンパーオキシダーゼ活性を示すことが明らかとなった。
【００５９】
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、バイオマスに含まれるリグニンを、迅速に効率よく、かつ安価に処理することができるリグニン分解細菌が提供される。また、本発明のリグニン分解細菌を利用することにより、バイオマスに含まれるリグニンを迅速に効率よく、かつ安価に処理することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグニン分解酵素活性を有するラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトマイセス・シュードグリセオラス（Streptomyces pseudogriseolus）またはキラトコッカス・アサッカロボランス（Chelatococcus asaccharovorans）に属することを特徴とする細菌。
【請求項２】
ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−９１８）である請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
木質系または草本系バイオマスの分解処理において、該バイオマスと請求項１または２に記載の細菌とを接触させることを特徴とするバイオマスの処理方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の細菌を用いてリグニンを低分子化することを特徴とするリグニンの処理方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の細菌を含むことを特徴とするバイオマスの処理剤。
【請求項１】
リグニン分解酵素活性を有するラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトマイセス・シュードグリセオラス（Streptomyces pseudogriseolus）またはキラトコッカス・アサッカロボランス（Chelatococcus asaccharovorans）に属することを特徴とする細菌。
【請求項２】
ストレプトマイセス・シュードグリセオラスＫＳ−３株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−９１８）である請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
木質系または草本系バイオマスの分解処理において、該バイオマスと請求項１または２に記載の細菌とを接触させることを特徴とするバイオマスの処理方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の細菌を用いてリグニンを低分子化することを特徴とするリグニンの処理方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の細菌を含むことを特徴とするバイオマスの処理剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１９３８４８（Ｐ２０１１−１９３８４８Ａ）
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６６８４６（Ｐ２０１０−６６８４６）
【出願日】平成２２年３月２３日（２０１０．３．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名；平成２１年度 日本生物工学会大会、主催者名；社団法人 日本生物工学会、公開日；平成２１年９月２３日
【出願人】（５００４３３２２５）学校法人中部大学 (105)
【出願人】（０００１５６５８１）日鉄環境エンジニアリング株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２３日（２０１０．３．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名；平成２１年度 日本生物工学会大会、主催者名；社団法人 日本生物工学会、公開日；平成２１年９月２３日
【出願人】（５００４３３２２５）学校法人中部大学 (105)
【出願人】（０００１５６５８１）日鉄環境エンジニアリング株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]