リグノセルロース系バイオマスの糖化方法
【課題】本発明は、広く利用されている糸状菌由来のセルラーゼによる、リグノセルロース系バイオマスの糖化を、効率よく行う方法を開発しようとするものである。
【解決手段】自然界では一種類の微生物ではなく、様々な微生物が生産する酵素が融合して作用することにより、バイオマス分解が行われている点に着目した。市販セルラーゼ製剤への放線菌由来糖化酵素の添加により、市販製剤の糖化能を高めることができた。本発明は、多様なリグノセルロース系バイオマスの糖化に対応できる糖化方法を提供するものである。
【解決手段】自然界では一種類の微生物ではなく、様々な微生物が生産する酵素が融合して作用することにより、バイオマス分解が行われている点に着目した。市販セルラーゼ製剤への放線菌由来糖化酵素の添加により、市販製剤の糖化能を高めることができた。本発明は、多様なリグノセルロース系バイオマスの糖化に対応できる糖化方法を提供するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法、より詳しくは、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物由来の組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物以外の生物由来のリグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化するリグノセルロース系バイオマスの糖化方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスの利用は、新しい資源循環型の社会システムの構築の観点から重要である。バイオ燃料への世界的ニーズの高まりに対応して、糖質系バイオマス由来のバイオエタノール製造技術開発競争が世界的規模で繰り広げられている。特に、食料資源と競合しないリグノセルロース系バイオマスの利用技術開発が、欧米のみならず我が国においても最も重要なブレイクスルーとなりうると考えられている。現在セルロース系バイオマスの効率のよい糖化のため、酵素糖化による方法の研究開発が進められている。
【０００３】
リグノセルロースは地球上で最も多量に存在する有機物で、構造性多糖のセルロース及びヘミセルロース、芳香族化合物の重合体のリグニンから構成される。セルロースはグルコースがβ−１，４−グリコシド結合により重合した直鎖状の多糖類であり、ヘミセルロースはセルロースと共に植物細胞壁を構成するセルロース以外の多糖類であって、ホモ多糖類及びヘテロ多糖類の総称をいう。ヘミセルロースとしては、例えば、マンナン、グルコマンナン、ガラクタン、キシラン、アラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、ガラクトグルコマンナン、グルクロノキシラン、キシログルカンなどが挙げられる。また、リグニンは、高等植物の木化に関与する高分子のフェノール性化合物で、光合成（一次代謝）により同化された炭素化合物が更なる代謝（二次代謝）を受けることで合成されるフェニルプロパノイドのうち、ｐ−クマリルアルコール・コニフェニルアルコール・シナピルアルコールという３種類のリグニンモノマーが、酵素（ラッカーゼ・ペルオキシダーゼ）の触媒の元で一電子酸化されフェノキシラジカルとなり、これがランダムなラジカルカップリングで高度に重合することにより三次元網目構造を形成した、巨大な生体高分子である。その構造は複雑で、いまだにはっきりとはわかっていない。リグニンは木材中の２０〜３０％を占めており、高等植物では生育に伴い、道管・仮道管・繊維などの組織でリグニンが生産される。生産されたリグニンはヘミセルロースと同じくセルロースミクロフィブリルに付着していく。まず細胞間層で堆積が始まり、徐々に一次壁、二次壁へと沈着する。同時にヘミセルロースも堆積し、木化してゆく。構造はランダムでアモルファスである。木部の組織はリグニン構造だけ残存して殆どの細胞は死細胞となり、通導・樹体支持を担う。腐朽・食害への抵抗性を有する。生体高分子としては反応性が乏しく、リグニンを分解することが可能な生物は白色腐朽菌のみであるが、白色腐朽菌などにより低分子化されたリグニンはバクテリアにより分解され、無機化することが知られている。
【０００４】
リグノセルロース系バイオマスの糖化には、酸糖化と酵素糖化の２つの方法があり、技術改善が進められている（例えば、特許文献１や２）。酵素糖化法には酸糖化と比べ、低温で糖化できることや過分解が起こらず収率が高いなどの利点がある。
【０００５】
酵素糖化に用いられる市販の糖化酵素セルラーゼ製剤のほとんどは糸状菌Trichoderma reesei由来であり、これは他の微生物に比べてセルラーゼ生産量が極めて多く、安価に大量の酵素製剤を製造することが可能であるためである。リグノセルロース系バイオマスの主要成分は、セルロース・ヘミセルロース・リグニンであるが、ヘミセルロースに着目すると、その種類や含有量はリグノセルロース系バイオマスの種類によって異なる。放線菌は糸状菌とは生産する糖化酵素の種類が異なっており、ヘミセルロース分解酵素が豊富な微生物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１８９２９１号公報
【特許文献２】特開２００８−２６６２２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素、好ましくは広く利用されている糸状菌由来のセルラーゼ等、放線菌以外の生物に由来するリグノセルロース系バイオマス糖化酵素による、リグノセルロース系バイオマスの糖化を、効率よく行う方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、自然界では一種類の微生物ではなく様々な微生物が生産する酵素が複合して作用することにより、バイオマス分解が行われていることから、放線菌が生産する酵素に着目し、放線菌由来糖化酵素を市販セルラーゼ製剤に添加したところ、リグノセルロース系バイオマスを効率よく糖化することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物由来の組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法や、（２）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ加水分解酵素活性を有する組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法や、（３）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法や、（４）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでコードされる組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法や、（５）リグノセルロース系バイオマス糖化酵素が、ストレプトマイセス属に属する微生物以外の生物由来のリグノセルロース系バイオマス糖化酵素であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のリグノセルロース系バイオマスの糖化方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、（６）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物由来の組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法や、（７）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ加水分解酵素活性を有する組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法や、（８）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法や、（９）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでコードされる組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
市販セルラーゼ製剤への放線菌由来糖化酵素の添加により、市販製剤の糖化能を高めることができた。本発明によると、多様なリグノセルロース系バイオマスの糖化に対応できる糖化方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】放線菌S. avermitilis ゲノム上の各酵素遺伝子の位置関係を示す図である。
【図２】ＳＡＶ１８５３によるＣＭ−セルロースの分解プロダクトパターン（反応３時間）を示す図である。Ｃ２はセロビオースを示す。
【図３】ＳＡＶ１８５３によるＣＭ−セルロースの分解プロダクトパターン（反応９時間）を示す図である。Ｃ２はセロビオースを示す。
【図４】スタンダード（セロオリゴ糖）の解析パターンを示す図である。Ｃ２はセロビオース、Ｃ３はセロトリオース、Ｃ４はセロテトラオース、Ｃ５はセロペンタオース、Ｃ６はセロヘキサオースを示す。
【図５】ＳＡＶ１８５５によるＣＭ−セルロースの分解プロダクトパターン（反応３時間）を示す図である。
【図６】ＳＡＶ１８５５によるＣＭ−セルロースの分解プロダクトパターン（反応９時間）を示す図である。Ｃ２はセロビオース、Ｃ３はセロトリオース、Ｃ４はセロテトラオース、Ｃ５はセロペンタオース、Ｃ６はセロヘキサオースを示す。
【図７】スタンダード（セロオリゴ糖）の解析パターンを示す図である。Ｃ２はセロビオース、Ｃ３はセロトリオース、Ｃ４はセロテトラオース、Ｃ５はセロペンタオース、Ｃ６はセロヘキサオースを示す。
【図８】Ａ）ＳＡＶ２５７４、Ｂ）ＳＡＶ１８５６によるTamarind xyloglucanの分解プロダクトパターンをそれぞれ示す図である。
【図９】ＳＡＶ１７６４による、ラミナリンの分解プロダクトパターン（反応０時間）を示す図である。
【図１０】ＳＡＶ１７６４による、ラミナリンの分解プロダクトパターン（反応０．５時間）を示す図である。Ｇはグルコース、Ｇ２はラミナリビオース、Ｇ３はラミナリトリオース、Ｇ４はラミナリテトラオースを示す。
【図１１】スタンダード（グルコース・ラミナリオリゴ糖）の解析パターンを示す図である。Ｇはグルコース、Ｇ２はラミナリビオース、Ｇ３はラミナリトリオース、Ｇ４はラミナリテトラオースを示す。
【図１２】スタンダード（０．０００５％グルクロン酸）の解析パターンを示す図である。グルクロン酸（ＧｌｃＡ）のピークの前に、gradient shockのピークが見られた。
【図１３】コントロールとして、ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａの解析パターンを示す図である。３．３分にイミダゾールのピークが見られた。
【図１４】ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによる、Beech wood xylanの分解プロダクトパターン（反応０時間）を示す図である。
【図１５】ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによる、Beech wood xylanの分解プロダクトパターン（反応７時間）を示す図である。１６．３分、１７．２分の増加したピークを矢印で示す。
【図１６】コントロールとして、Beech wood xylanのみの解析パターンを示す図である。
【図１７】ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによる、Birch wood xylanの分解プロダクトパターン（反応０時間）を示す図である。
【図１８】ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによる、Birch wood xylanの分解プロダクトパターン（反応７時間）を示す図である。
【図１９】コントロールとして、Birch wood xylanのみの解析パターンを示す図である。
【図２０】ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによる、Birch wood xylanの分解のＴＬＣ解析結果を示す図である。
【図２１】セルクラスト１．５Ｌによる、バイオマス（水熱処理イナワラ:１６０℃、１０分間処理）の糖化率を示す図である。
【図２２】セルクラスト１．５Ｌによる、バイオマス（水熱処理イナワラ:１８０℃、１０分間処理）の糖化率を示す図である。
【図２３】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５３）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１６０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２４】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１６０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２５】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５５）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１６０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２６】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５３）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１８０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２７】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１８０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２８】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５５）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１８０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２９】放線菌由来酵素（ＧＨ１１５；ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａ）添加による、キシラナーゼのキシランの糖化率向上効果を示す図である。
【図３０】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５３）添加による、アクセルレース１５００のアルカリ処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３１】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５５）添加による、アクセルレース１５００のアルカリ処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３２】放線菌酵素（ＳＡＶ１７６４）添加による、アクセルレース１５００のアルカリ処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３３】放線菌酵素（ＳＡＶ２５７４）添加による、アクセルレース１５００のアルカリ処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３４】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの未処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３５】放線菌酵素（ＳＡＶ１７６４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの未処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３６】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３７】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５６）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３８】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理スギ、水熱処理ユーカリ、エリアンサスの糖化率向上効果を示す図である。
【図３９】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５６）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理スギの糖化率向上効果を示す図である。
【図４０】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５５、ＳＡＶ１８５６）併用による水熱処理スギの糖化率向上効果を示す図である。
【図４１】放線菌Streptomyces pristinaespiralis又はS. scabieiのイナワラ培養上清の添加では、アクセルレース１５００のアルカリ処理イナワラ糖化率向上効果が得られないことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明におけるリグノセルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンから構成されるリグノセルロースを主成分とするバイオマスを意味し、具体的には、木本植物・間伐材・廃材・おがくず等を含む木質バイオマス、竹・ケナフ・バガス・稲や麦わら・バナナ等の非木質バイオマス、葦・エレファントグラス等の草本植物、新聞・雑誌・台帳・段ボール等の回収古紙などを挙げることができる。
【００１４】
上記のリグノセルロース系バイオマスに含まれる多糖類を加水分解することによって得られる単糖類としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、キシロース、ラムノース、フコース及びアラビノースなどの単糖類、ガラクツロン酸、グルクロン酸などのウロン酸、水酸基がエステル化されたエステル誘導体、水酸基がメチル基などで誘導体化されたアルキル誘導体を例示することができる。
【００１５】
本発明において、ストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質としては、配列番号１、３、５、７、９、１１又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトミセス・エバーミチルス（Streptomyces avermitilis）由来の組換えタンパク質や、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトミセス・エバーミチルス由来の組換えタンパク質や、配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）由来の組換えタンパク質や、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス由来の組換えタンパク質を挙げることができる。上記ストレプトマイセス・エバーミチルスとして、例えば、ＭＡ−４６８０株がある。このＭＡ−４６８０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に、ストレプトマイセス・エバーミチルスＭＡ−４６８０（ＮＢＲＣ番号：１４８９３）として寄託されている。また、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリスとしては、独立行政法人製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（ＮＢＲＣ番号：１３０７４）として寄託されている菌株を例示することができる。
【００１６】
上記組換えタンパク質は、そのアミノ酸配列に対応する公知のＤＮＡの配列情報を基に、遺伝子工学的手法を用いて常法により調製することができる。例えば、ストレプトミセス・エバーミチルスやストレプトミセス・プリスチナエスピラリスより、常法に従ってゲノムＤＮＡを調製し、次いで、このゲノムＤＮＡから、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなる遺伝子ＤＮＡに特有の適当なプローブ又はプライマーセット、好ましくは制限酵素の認識サイトを備えたプライマーセットを用いて所望クローンを選抜することにより、目的とする遺伝子ＤＮＡを取得することができる。かかる所定の遺伝子ＤＮＡを放線菌又は大腸菌用発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより組換えベクターを構築し、この組換えベクターで放線菌又は大腸菌宿主を形質転換し、この形質転換体を培養することにより、目的とする組換えタンパク質を得ることができる。かかる組換えタンパク質は、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質とすることもできる。このようにして得られる組換えタンパク質は通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００１７】
本発明において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ加水分解酵素活性、好ましくはリグノセルロース系バイオマス糖化酵素活性を有する組換えタンパク質（組換え変異タンパク質）における「１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。かかる組換えタンパク質は、例えば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得し調製することができる。上記遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.（以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997）等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００１８】
本発明において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ加水分解酵素活性、好ましくはリグノセルロース系バイオマス糖化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでコードされる組換えタンパク質（組換え変異タンパク質）における「ストリジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、より具体的には、７０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件であり、例として、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるヌクレオチドをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning, A laboratory manual）、第３版、第６章に記載の方法で行うことができる。
【００１９】
上記組換え変異タンパク質における加水分解酵素活性、好ましくはリグノセルロース系バイオマス糖化酵素活性としては、塩基配列が配列番号１、アミノ酸配列が配列番号２の組換え変異タンパク質の場合はセロビオヒドロラーゼ活性を；塩基配列が配列番号３、アミノ酸配列が配列番号４の組換え変異タンパク質の場合はグルコマンナナーゼ活性を；塩基配列が配列番号５、アミノ酸配列が配列番号６の組換え変異タンパク質の場合はエンドグルカナーゼ活性を；塩基配列が配列番号７、アミノ酸配列が配列番号８の組換え変異タンパク質の場合はエキソ型キシログルカナーゼ活性を；塩基配列が配列番号９、アミノ酸配列が配列番号１０の組換え変異タンパク質の場合はエンド型キシログルカナーゼ活性を；塩基配列が配列番号１１、アミノ酸配列が配列番号１２の組換え変異タンパク質の場合はエンド−β−１，３−グルカナーゼ活性を；塩基配列が配列番号１３、アミノ酸配列が配列番号１４の組換え変異タンパク質の場合はα−グルクロニダーゼ活性を；塩基配列が配列番号１５、アミノ酸配列が配列番号１６の組換え変異タンパク質の場合はキシラナーゼ活性を、それぞれ好適に例示することができる。
【００２０】
本発明において、前記のストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質や、上記組換え変異タンパク質と併用される、ストレプトマイセス属に属する微生物以外、好ましくは放線菌以外の生物由来のリグノセルロース系バイオマス糖化酵素としては、セルロースの加水分解酵素（セルラーゼ）、ヘミセルロースの加水分解酵素（ヘミセルラーゼ）、リグニン分解酵素（リグニナーゼ）の他、ペクチン質を分解する酵素（ペクチナーゼ）も含まれる。これらのリグノセルロース系バイオマス糖化酵素は、市販酵素製剤を用いても、あるいは公知の方法で調製した酵素製剤を用いてもよい。また、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニナーゼ、ペクチナーゼの２種以上の混合物を用いることもできる。
【００２１】
上記セルラーゼとしては、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エキソ−β−１，４ーグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ等を挙げることができ、その由来としては、ストレプトマイセス属に属する微生物以外、好ましくは放線菌以外の生物由来であれば特に制限されず、高等植物、細菌、糸状菌、木材腐朽菌、シロアリの共生原生動物などに由来する天然のセルラーゼを用いてもよいし、遺伝子工学的方法で人工的に産生したものを用いてもよい。セルラーゼの由来として具体的には、トリコデルマ属（Trichoderma）菌、アスペルギルス属（Aspergillus）菌、フミコーラ属（Humicola）菌、スタフィロトリクム属（Staphylotrichum）菌、リゾプス属（Rhizopus）菌、ムコール属（Mucor）菌、アクレモニウム属（Acremonium）菌、カエトミウム属（Chaetomium）菌、アシドサーマス属（Acidothermus）菌、セルロモナス属（Cellulomonas）菌等を好適に例示することができる。
【００２２】
上記ヘミセルラーゼとしては、β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、グルクロニダーゼ、マンノシダーゼ、マンナナーゼ、アラビナナーゼ、ガラクタナーゼ等を挙げることができ、その由来としては、ストレプトマイセス属に属する微生物以外、好ましくは放線菌以外の生物由来であれば特に制限されず、高等植物、細菌、糸状菌などに由来する天然のヘミセルラーゼを用いてもよいし、遺伝子工学的方法で人工的に産生したものを用いてもよい。ヘミセルラーゼの由来として具体的には、アスペルギルス属菌、ペニシリウム属（Penicillium）菌、フサリウム属（Fusarium）菌、トリコデルマ属菌、フミコーラ属菌、アシドサーマス属（Acidothermus）菌、アガリクス属（Agaricus）菌、バチルス属（Bacillus）菌、セルロリティカス属（Cellulolyticus）菌、サーモマイセス属（Thermomyces）菌、クロストリジウム属（Clostridium）菌、サーモトガ属（Thermotoga）菌、サーモアスクス属（Thermoascus）菌、カルドセラム属（Caldocellum）菌、サーモモノスポラ属（Thermomonospora）菌等を好適に例示することができる。
【００２３】
上記リグニナーゼとしては、ラッカーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ等を挙げることができ、その由来としては、ストレプトマイセス属に属する微生物以外、好ましくは放線菌以外の生物由来であれば特に制限されず、木材腐朽菌、細菌、糸状菌、木材腐朽菌などに由来する天然のリグニナーゼを用いてもよいし、遺伝子工学的方法で人工的に産生したものを用いてもよい。リグニナーゼの由来として具体的には、ファネロケーテ属（Phanerochaete）菌、プレイロータス属（Pleurotus）菌、トラメテス属（Trametes）菌、ガノデルマ属（Ganoderma）菌、レンチナス属（Lentinus）菌、ポリポラス属（Polyporus）菌、ステレウム属（Stereum）菌、フレビア属（Phlebia）菌等を好適に例示することができる。
【００２４】
前記市販の酵素製剤としては、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、アクセルレース１５００（ジェネンコア協和社製）、ＴＰ−６０（明治製菓社製）、ウルトラフロＬ（ノボザイムズ社製）、メイセラーゼ（明治製菓社製）、アクレモニウムセルラーゼ（明治製菓製）、マセロチーム（ヤクルト本社製）、セルロシンＭＥ（阪急バイオインダストリー製）、スミチームＣ（新日本化学工業社製）、スミチームＸ（新日本化学工業社製）、ビスコチーム（ノボザイムズ社製）、スクラーゼＸ（三菱化学フーズ社製）、ヘミセルラーゼ「アマノ」９０（天野エンザイム社製）、グリンドアミルＨ（ダニスコ ジャパン社製）、ペントパン（ノボザイムズ社製）、及びアミログルコシダーゼ（メガザイム社製）などを挙げることができる。
【００２５】
本発明おけるリグノセルロース系バイオマスの糖化工程は、従来公知の方法を適宜採用して行うことができる。まず、上記のリグノセルロース系バイオマス、好ましくはその粉砕処理物を水性媒体に懸濁して懸濁液を調製するが、水性媒体としては水、緩衝液、酸性水溶液、アルカリ性水溶液を挙げることができる。糖化（加水分解）反応は、リグノセルロース系バイオマスの粉砕物の懸濁液中に加水分解酵素を添加し、該懸濁液をインキュベート、好ましくは通気・撹拌することによって行うことができる。懸濁液中に含まれるリグノセルロース系バイオマスの濃度としては、バイオマスの種類、使用するリグノセルロース系バイオマス糖化酵素の種類によって適宜選択することができるが、水性媒体１Ｌに対して、通常、乾燥（無水）状態のバイオマス５〜３００ｇ、好ましくは５０〜２００ｇである。また、糖化反応条件として、ｐＨは使用する酵素の至適ｐＨが好ましいが、通常ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜７であり、また、温度は通常２０〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃であり、反応時間は通常１２〜１４４時間、好ましくは２４〜７２時間である。用いられるリグノセルロース系バイオマス糖化酵素量は、使用する酵素の種類によって適宜選択することができるが、懸濁するリグノセルロース系バイオマスの質量（乾物換算）に対し、好ましくは０．００１〜１５質量％、好ましくは０．０１〜５質量％である。また、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素量に対する組換えタンパク質の量は、使用するリグノセルロース系バイオマス糖化酵素及び組換えタンパク質の種類によって適宜選択することができるが、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素の質量に対し、好ましくは０．０５〜３０質量％、好ましくは０．５〜１５質量％である。
【００２６】
また、リグノセルロース系バイオマス、好ましくはその粉砕物や爆砕処理物は、反応効率向上の観点から、加水分解反応に供する前に蒸煮処理を行うことが好ましい。さらに、加水分解反応の前に適宜酸又はアルカリ処理を行ってもよい。粉砕処理、爆砕処理、蒸煮処理、酸処理、アルカリ処理等は、従来公知の方法を用いることができる。
【００２７】
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例によって限定されるものではない。以下の実施例においては、まず、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質（酵素）の基質特異性を調べた。次いで、かかる組換えタンパク質（酵素）と市販のセルラーゼ製剤とを併用し、市販のセルラーゼ製剤によるリグノセルロース系バイオマスの糖化効率が相乗的に向上することを確認した。
【実施例１】
【００２８】
＜Streptomyces avermitilis由来酵素について＞
表１に、実施例で使用した放線菌Streptomyces avermitilis由来の酵素について示す。
ＳＡＶ○○○○はStreptomyces avermitilisの遺伝子番号であり、以下その遺伝子がコードするタンパクを表している。
【００２９】
【表１】
【００３０】
＜放線菌S. avermitilis ゲノム上の各遺伝子の位置関係＞
ＳＡＶ１８５３、ＳＡＶ１８５４、ＳＡＶ１８５５、ＳＡＶ１８５６はゲノム上では図１で示される位置関係にある。
【００３１】
＜放線菌酵素の調製＞
フォワードプライマーの５’側にNdeIサイト、リバースプライマーの５’側にHindIIIサイトをそれぞれ導入した配列番号１７〜３２のプライマーを用い、分泌シグナル配列を含む、配列番号１、３、５、７、９、１１又は１５で表される各放線菌酵素のＯＲＦ全長のＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。増幅産物をpGEM-T Easy vector（プロメガ社製）にＴＡクローニングした。該ベクターに挿入されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列をシークエンスし、確認後、S.avermitilis由来７酵素は放線菌発現ベクター（特開２００９−１５３５１６、Hatanaka, T., Onaka, H., Arima, J., Uraji, M., Uesugi, Y., Usuki, H., Nishimoto, Y., Iwabuchi, M., 2008. Protein Expr. Purif. 62, 244-248に記載のベクター）にNdeI-HindIIIサイトで導入した。作製した放線菌発現ベクターを放線菌Streptomyces lividans 1326に導入し、形質転換体を得た。形質転換体を液体培養することにより、組換えタンパク質は培養上清に分泌された。該培養液から菌体を除去し、得られた組換えタンパク質を含む培養上清を、粗酵素液とした。S.pristinaespiralis由来のＳｐＧｌｃＡ１１５Ａは、配列番号１３で表される、分泌シグナル配列を含まない放線菌酵素のＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、増幅産物を大腸菌発現ベクターpET30にNdeI-HindIIIサイトで導入した。作製した大腸菌発現ベクターで形質転換した大腸菌を液体培養することにより、分泌シグナル配列を含まず、Ｃ末側にヒスチジンタグが融合した組換えタンパク質が大腸菌内に生産された。該培養液から回収した菌体を破砕した後、遠心操作を行い、得られた上清を粗酵素液とした。
【００３２】
以下に各放線菌酵素の性質を示す。
＜ＳＡＶ１８５３＞
ＳＡＶ１８５３は分泌シグナル配列＋ＣＢＭ２＋ＧＨ６のモジュラー構造からなり、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
各基質に対する活性（基質特異性）を表２に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
ＣＭ−セルロースの分解パターンを図２、３に、スタンダードとしてセロオリゴ糖の解析結果を図４に示す。反応液およびスタンダード溶液をHPAEC-PAD system（DX-500；Dionex社製）により解析した。ＣＭ−セルロースの分解物としてＣ２で示すセロビオースのみが生産された。すなわち、ＳＡＶ１８５３はセロビオヒドロラーゼである。
【００３５】
＜ＳＡＶ１８５４＞
ＳＡＶ１８５４は分泌シグナル配列＋ＣＢＭ２＋ＧＨ５のモジュラー構造からなり、配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
各基質に対する活性（基質特異性）を表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】
ＳＡＶ１８５４はKonjac glucomannanに対し高い活性を示した。すなわち、ＳＡＶ１８５４はグルコマンナナーゼである。
【００３８】
＜ＳＡＶ１８５５＞
ＳＡＶ１８５５は分泌シグナル配列＋ＣＢＭ２＋ＧＨ４８のモジュラー構造からなり、配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
各基質に対する活性（基質特異性）を表４に示す。
【００３９】
【表４】
【００４０】
ＣＭ−セルロースの分解パターンを図５、６に、スタンダードとしてセロオリゴの解析結果を図７に示す。反応液およびスタンダード溶液をHPAEC-PAD system（DX-500；Dionex社製）により解析した。ＣＭ−セルロースの分解物としてセロオリゴ糖が生産された。すなわち、ＳＡＶ１８５５はエンドグルカナーゼである。
【００４１】
＜ＳＡＶ１８５６＞
ＳＡＶ１８５６は分泌シグナル配列＋ＣＢＭ２＋ＧＨ７４のモジュラー構造からなり、配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
＜ＳＡＶ２５７４＞
ＳＡＶ２５７４は分泌シグナル配列＋ＧＨ７４のモジュラー構造からなり、配列番号９で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
各基質に対するＳＡＶ１８５６、ＳＡＶ２５７４の活性（基質特異性）を表５に示す。
【００４２】
【表５】
【００４３】
ＳＡＶ１８５６、ＳＡＶ２５７４はTamarind xyloglucanに対して高い活性を示した。すなわち、ＳＡＶ１８５６、ＳＡＶ２５７４は共にキシログルカナーゼである。
【００４４】
Tamarind xyloglucanの分解反応液をHPAEC-PAD system（DX-500；Dionex社製）により解析したパターンを図８に示す。ＳＡＶ２５７４により様々な長さのキシログルカンオリゴ糖が遊離していることから、ＳＡＶ２５７４はエンド型キシログルカナーゼであることが分かる。一方、ＳＡＶ１８５６は、ある決まった長さのオリゴ糖が反応初期から生産され、反応時間を経て蓄積されている。この結果から、ＳＡＶ１８５６はエキソ型キシログルカナーゼであると考えられる。
【００４５】
＜ＳＡＶ１７６４＞
ＳＡＶ１７６４は分泌シグナル配列＋ＧＨ１６＋ＣＢＭ６のモジュラー構造からなり、配列番号１１で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
各基質に対する活性（基質特異性）を表６に示す。
【００４６】
【表６】
【００４７】
ラミナリンの分解パターンを図９、１０に、スタンダードとしてグルコース・ラミナリオリゴ等の解析結果を図１１に示す。反応液およびスタンダード溶液をHPAEC-PAD system（DX-500；Dionex社製）により解析した。ラミナリンの分解物としてグルコースＧとラミナリオリゴ糖Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４が生産された。すなわち、ＳＡＶ１７６４はエンド−β−１，３−グルカナーゼである。
【００４８】
＜ＳＡＶ２０９６＞
ＳＡＶ２０９６は分泌シグナル配列＋ＧＨ１０からなり、配列番号１５で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなる酵素で、キシラナーゼである。
【００４９】
＜Streptomyces pristinaespiralis由来酵素について＞
表７に、以下で使用した放線菌Streptomyces pristinaespiralis由来の酵素ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａについて示す。
【００５０】
【表７】
【００５１】
＜ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａ＞
ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａは分泌シグナル配列＋ＧＨ１１５からなる酵素であり、配列番号１３で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによるキシラン分解活性を調べた。
【００５２】
反応液
２％基質 (Beech wood xylan又はBirch wood xylan)
５０ｍＭ acetate buffer、ｐＨ５．０
リコンビナントＳｐＧｌｃＡ１１５Ａ（１０mｇ）
４０℃、０−７時間
反応液をHPAEC-PAD system（DX-500；Dionex社製）により解析した結果を図１２〜１９に示す。スタンダードとしてグルクロン酸を解析した結果、グルクロン酸のピークの前に、gradient shockのピークが見られた（図１２）。また、コントロールとしてＳｐＧｌｃＡ１１５Ａのみを解析した結果、３．３分にイミダゾールのピークが見られた（図１３）。ＳｐＧｌｃＡ１１５ＡとBeech wood xylanを０時間（図１４）又は７時間（図１５）反応させた反応液の解析では、反応７時間において１６．３分、１７．２分のピークが増加した。スタンダードとして、基質Beech woodのみの解析結果を図１６に示す。ＳｐＧｌｃＡ１１５ＡとBirch wood xylanを０時間又は７時間反応させた反応液の解析結果をそれぞれ図１７、図１８に示す。スタンダードとして、基質Birch woodのみの解析結果を図１９に示す。
【００５３】
反応液を以下に示す。
２％ Birch wood xylan
５０ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．０）
４０℃、０−４８時間
酢酸エチル：酢酸：１−プロパノール：ギ酸: 水＝２５：１０：５：１：１５
スポッティング量
スタンダード(キシロース、グルクロン酸)；１％反応液１μｌ
Sample； 反応液４μｌ
N-(1-naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride１．８ｇ／２００ｍｌエタノール／２０ｍｌ ｃｏｎｃ．Ｈ２ＳＯ４
反応産物を、ＴＬＣにより検出した結果を図２０に示す。ＭｅＧｌｃＡに対応する弱いシグナルのスポットが検出された。すなわち、ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａはα−グルクロニダーゼである。
【実施例２】
【００５４】
放線菌Streptomyces avermitilis NBRC14893由来酵素群を利用したイナワラの糖化方法
；セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）と放線菌酵素による糖化方法
反応液の組成を表８に示す。
【００５５】
【表８】
【００５６】
反応：５０℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら１日間（ｎ＝２又は３）
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
上記反応系において使用した酵素タンパク質の量は（ＢＣＡ法により測定）、
セルクラスト１．５Ｌ：４．５ｍｇ
放線菌酵素：約３５μｇ
である。
【００５７】
上の反応系において、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）をそれぞれ０．５ＦＰＵ／１００ｍｇ ｂｉｏｍａｓｓ又は１ＦＰＵ／１００ｍｇ ｂｉｏｍａｓｓになるように加え、それぞれ１６０℃又は１８０℃で１０分間処理した場合の糖化率は、図２１、２２のようになった。
【００５８】
セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）０．５ＦＰＵ／１００ｍｇ ｂｉｏｍａｓｓの条件で、放線菌酵素（ＳＡＶ１８５３、ＳＡＶ１８５４、ＳＡＶ１８５５）を添加し、１６０℃又は１８０℃で１０分間処理した場合の糖化率を図２３〜２８に示す。微量の放線菌酵素を添加することにより、セルクラストを２倍量使用した糖化率とほぼ同等の糖化率を得ることができた。
【実施例３】
【００５９】
放線菌由来酵素のイナワラ糖化への応用
；Streptomyces avermitilis由来ＧＨ１０酵素（キシラナーゼ）
；Streptomyces pristinaespiralis由来ＧＨ１１５酵素（α−グルクロニダーゼ）ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａ
反応液の組成を表９に示す。
【００６０】
【表９】
【００６１】
反応：５０℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら２日間
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
【００６２】
上の反応系における、キシラン糖化率を図２９に示す。微量のＳｐＧｌｃＡ１１５Ａ（ＧＨ１１５酵素）をキシラナーゼ（ＧＨ１０酵素）に添加することにより、キシラン分解率を上昇させることができた。
【実施例４】
【００６３】
放線菌Streptomyces avermitilis NBRC14893由来酵素群を利用したイナワラの糖化方法
；アクセルレース１５００（ジェネンコア協和）と放線菌酵素による糖化方法
反応液の組成を表１０に示す。
【００６４】
【表１０】
【００６５】
反応：５０℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら１日間（ｎ＝２又は３）
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
上記反応系に使用した酵素タンパク質の量は（ＢＣＡ法により測定）、
アクセルレース１５００：３５０μｇ
放線菌酵素：約３５μｇ
である。
【００６６】
上の反応系において、放線菌酵素にＳＡＶ１８５３、ＳＡＶ１８５５、ＳＡＶ１７６４、ＳＡＶ２５７４をそれぞれ添加した場合のアルカリ処理イナワラのキシラン糖化率は図３０〜３３となる。セルラーゼ製剤に各放線菌酵素を添加することにより、糖化率を上昇させることができた。
【実施例５】
【００６７】
放線菌Streptomyces avermitilis NBRC14893由来酵素群を利用したイナワラの糖化方法
；セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）と放線菌酵素による糖化方法
反応液の組成を表１１に示す。
【００６８】
【表１１】
【００６９】
反応：５０℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら３日間
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
上記反応系において使用した粗酵素タンパク量（Bradford法により測定）は、
Ｘ＝６０μｇ（ＳＡＶ１８５４）、６５μｇ（ＳＡＶ１７６４）である。
上の反応系において、放線菌酵素にＳＡＶ１８５４又はＳＡＶ１７６４を使用した場合の未処理イナワラ粉末の糖化率を、それぞれ図３４、３５に示す。前処理を施していないイナワラの糖化において、セルラーゼ製剤に放線菌酵素を添加することにより、糖化率を上昇させることができた。
【実施例６】
【００７０】
放線菌Streptomyces avermitilis NBRC14893由来酵素を利用したバイオマスの糖化方法
；セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）と放線菌酵素による糖化方法
反応液の組成を表１２に示す。
【００７１】
【表１２】
【００７２】
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
上の反応系において、放線菌酵素にＳＡＶ１８５４又はＳＡＶ１８５６を使用した場合の水熱処理イナワラの糖化率を、それぞれ図３６、図３７に示す。水熱処理を施したイナワラ、すなわちバイオマスの糖化において、セルラーゼ製剤に放線菌酵素を添加することにより、糖化率を上昇させることができた。
【００７３】
反応液の組成を表１３及び表１４に示す。
【００７４】
【表１３】
【００７５】
【表１４】
【００７６】
反応：４５℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら１日間
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
上の反応系において、ＳＡＶ１８５４を添加した場合のセルクラスト１．５Ｌによる水熱処理スギ、水熱処理ユーカリ、未処理エリアンサス分解評価の結果を図３８に、ＳＡＶ１８５６を添加した場合のセルクラスト１．５Ｌによる水熱処理スギ分解評価の結果を図３９に示す。分解率は小さいが、放線菌酵素を添加することにより、スギ、ユーカリのように分解の困難な基質でも糖化率を上昇させることができた。
【００７７】
上の反応系において、ＳＡＶ１８５５及びＳＡＶ１８５６を添加した場合のセルクラスト１．５Ｌによる水熱処理スギの分解評価の結果を図４０に示す。放線菌酵素を併用した場合には、その組み合わせによりシナジー効果が得られ、放線菌酵素のみでの糖化率が上昇した。その結果、反応系の糖化率を高めることが可能である。
【実施例７】
【００７８】
＜放線菌のイナワラ培養上清をセルラーゼ製剤に添加した場合の糖化率＞
【００７９】
【表１５】
【００８０】
反応：５０℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら１日間
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
アルカリ処理イナワラを基質とし、セルラーゼ製剤に加えて放線菌のイナワラ培養上清を添加した場合の糖化反応の結果を図４１に示す。アクセルレース１５００のみによる糖化率を一番左に、放線菌Streptomyces pristinaespiralis又はS. scabieiのイナワラ培養上清のみによる糖化率をそれぞれ左から２番目、４番目に、アクセルレース１５００に各培養上清を添加した場合の糖化率をそれぞれ左から３番目、５番目のカラムで示した。アクセルレース１５００に単に放線菌の培養上清を加えただけでは、糖化率は十分に上昇しなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法、より詳しくは、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物由来の組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物以外の生物由来のリグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化するリグノセルロース系バイオマスの糖化方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスの利用は、新しい資源循環型の社会システムの構築の観点から重要である。バイオ燃料への世界的ニーズの高まりに対応して、糖質系バイオマス由来のバイオエタノール製造技術開発競争が世界的規模で繰り広げられている。特に、食料資源と競合しないリグノセルロース系バイオマスの利用技術開発が、欧米のみならず我が国においても最も重要なブレイクスルーとなりうると考えられている。現在セルロース系バイオマスの効率のよい糖化のため、酵素糖化による方法の研究開発が進められている。
【０００３】
リグノセルロースは地球上で最も多量に存在する有機物で、構造性多糖のセルロース及びヘミセルロース、芳香族化合物の重合体のリグニンから構成される。セルロースはグルコースがβ−１，４−グリコシド結合により重合した直鎖状の多糖類であり、ヘミセルロースはセルロースと共に植物細胞壁を構成するセルロース以外の多糖類であって、ホモ多糖類及びヘテロ多糖類の総称をいう。ヘミセルロースとしては、例えば、マンナン、グルコマンナン、ガラクタン、キシラン、アラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、ガラクトグルコマンナン、グルクロノキシラン、キシログルカンなどが挙げられる。また、リグニンは、高等植物の木化に関与する高分子のフェノール性化合物で、光合成（一次代謝）により同化された炭素化合物が更なる代謝（二次代謝）を受けることで合成されるフェニルプロパノイドのうち、ｐ−クマリルアルコール・コニフェニルアルコール・シナピルアルコールという３種類のリグニンモノマーが、酵素（ラッカーゼ・ペルオキシダーゼ）の触媒の元で一電子酸化されフェノキシラジカルとなり、これがランダムなラジカルカップリングで高度に重合することにより三次元網目構造を形成した、巨大な生体高分子である。その構造は複雑で、いまだにはっきりとはわかっていない。リグニンは木材中の２０〜３０％を占めており、高等植物では生育に伴い、道管・仮道管・繊維などの組織でリグニンが生産される。生産されたリグニンはヘミセルロースと同じくセルロースミクロフィブリルに付着していく。まず細胞間層で堆積が始まり、徐々に一次壁、二次壁へと沈着する。同時にヘミセルロースも堆積し、木化してゆく。構造はランダムでアモルファスである。木部の組織はリグニン構造だけ残存して殆どの細胞は死細胞となり、通導・樹体支持を担う。腐朽・食害への抵抗性を有する。生体高分子としては反応性が乏しく、リグニンを分解することが可能な生物は白色腐朽菌のみであるが、白色腐朽菌などにより低分子化されたリグニンはバクテリアにより分解され、無機化することが知られている。
【０００４】
リグノセルロース系バイオマスの糖化には、酸糖化と酵素糖化の２つの方法があり、技術改善が進められている（例えば、特許文献１や２）。酵素糖化法には酸糖化と比べ、低温で糖化できることや過分解が起こらず収率が高いなどの利点がある。
【０００５】
酵素糖化に用いられる市販の糖化酵素セルラーゼ製剤のほとんどは糸状菌Trichoderma reesei由来であり、これは他の微生物に比べてセルラーゼ生産量が極めて多く、安価に大量の酵素製剤を製造することが可能であるためである。リグノセルロース系バイオマスの主要成分は、セルロース・ヘミセルロース・リグニンであるが、ヘミセルロースに着目すると、その種類や含有量はリグノセルロース系バイオマスの種類によって異なる。放線菌は糸状菌とは生産する糖化酵素の種類が異なっており、ヘミセルロース分解酵素が豊富な微生物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１８９２９１号公報
【特許文献２】特開２００８−２６６２２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素、好ましくは広く利用されている糸状菌由来のセルラーゼ等、放線菌以外の生物に由来するリグノセルロース系バイオマス糖化酵素による、リグノセルロース系バイオマスの糖化を、効率よく行う方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、自然界では一種類の微生物ではなく様々な微生物が生産する酵素が複合して作用することにより、バイオマス分解が行われていることから、放線菌が生産する酵素に着目し、放線菌由来糖化酵素を市販セルラーゼ製剤に添加したところ、リグノセルロース系バイオマスを効率よく糖化することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物由来の組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法や、（２）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ加水分解酵素活性を有する組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法や、（３）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法や、（４）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでコードされる組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法や、（５）リグノセルロース系バイオマス糖化酵素が、ストレプトマイセス属に属する微生物以外の生物由来のリグノセルロース系バイオマス糖化酵素であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のリグノセルロース系バイオマスの糖化方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、（６）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物由来の組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法や、（７）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ加水分解酵素活性を有する組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法や、（８）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法や、（９）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでコードされる組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
市販セルラーゼ製剤への放線菌由来糖化酵素の添加により、市販製剤の糖化能を高めることができた。本発明によると、多様なリグノセルロース系バイオマスの糖化に対応できる糖化方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】放線菌S. avermitilis ゲノム上の各酵素遺伝子の位置関係を示す図である。
【図２】ＳＡＶ１８５３によるＣＭ−セルロースの分解プロダクトパターン（反応３時間）を示す図である。Ｃ２はセロビオースを示す。
【図３】ＳＡＶ１８５３によるＣＭ−セルロースの分解プロダクトパターン（反応９時間）を示す図である。Ｃ２はセロビオースを示す。
【図４】スタンダード（セロオリゴ糖）の解析パターンを示す図である。Ｃ２はセロビオース、Ｃ３はセロトリオース、Ｃ４はセロテトラオース、Ｃ５はセロペンタオース、Ｃ６はセロヘキサオースを示す。
【図５】ＳＡＶ１８５５によるＣＭ−セルロースの分解プロダクトパターン（反応３時間）を示す図である。
【図６】ＳＡＶ１８５５によるＣＭ−セルロースの分解プロダクトパターン（反応９時間）を示す図である。Ｃ２はセロビオース、Ｃ３はセロトリオース、Ｃ４はセロテトラオース、Ｃ５はセロペンタオース、Ｃ６はセロヘキサオースを示す。
【図７】スタンダード（セロオリゴ糖）の解析パターンを示す図である。Ｃ２はセロビオース、Ｃ３はセロトリオース、Ｃ４はセロテトラオース、Ｃ５はセロペンタオース、Ｃ６はセロヘキサオースを示す。
【図８】Ａ）ＳＡＶ２５７４、Ｂ）ＳＡＶ１８５６によるTamarind xyloglucanの分解プロダクトパターンをそれぞれ示す図である。
【図９】ＳＡＶ１７６４による、ラミナリンの分解プロダクトパターン（反応０時間）を示す図である。
【図１０】ＳＡＶ１７６４による、ラミナリンの分解プロダクトパターン（反応０．５時間）を示す図である。Ｇはグルコース、Ｇ２はラミナリビオース、Ｇ３はラミナリトリオース、Ｇ４はラミナリテトラオースを示す。
【図１１】スタンダード（グルコース・ラミナリオリゴ糖）の解析パターンを示す図である。Ｇはグルコース、Ｇ２はラミナリビオース、Ｇ３はラミナリトリオース、Ｇ４はラミナリテトラオースを示す。
【図１２】スタンダード（０．０００５％グルクロン酸）の解析パターンを示す図である。グルクロン酸（ＧｌｃＡ）のピークの前に、gradient shockのピークが見られた。
【図１３】コントロールとして、ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａの解析パターンを示す図である。３．３分にイミダゾールのピークが見られた。
【図１４】ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによる、Beech wood xylanの分解プロダクトパターン（反応０時間）を示す図である。
【図１５】ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによる、Beech wood xylanの分解プロダクトパターン（反応７時間）を示す図である。１６．３分、１７．２分の増加したピークを矢印で示す。
【図１６】コントロールとして、Beech wood xylanのみの解析パターンを示す図である。
【図１７】ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによる、Birch wood xylanの分解プロダクトパターン（反応０時間）を示す図である。
【図１８】ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによる、Birch wood xylanの分解プロダクトパターン（反応７時間）を示す図である。
【図１９】コントロールとして、Birch wood xylanのみの解析パターンを示す図である。
【図２０】ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによる、Birch wood xylanの分解のＴＬＣ解析結果を示す図である。
【図２１】セルクラスト１．５Ｌによる、バイオマス（水熱処理イナワラ:１６０℃、１０分間処理）の糖化率を示す図である。
【図２２】セルクラスト１．５Ｌによる、バイオマス（水熱処理イナワラ:１８０℃、１０分間処理）の糖化率を示す図である。
【図２３】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５３）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１６０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２４】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１６０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２５】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５５）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１６０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２６】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５３）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１８０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２７】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１８０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２８】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５５）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラ（１８０℃、１０分間処理）の糖化率向上効果を示す図である。
【図２９】放線菌由来酵素（ＧＨ１１５；ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａ）添加による、キシラナーゼのキシランの糖化率向上効果を示す図である。
【図３０】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５３）添加による、アクセルレース１５００のアルカリ処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３１】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５５）添加による、アクセルレース１５００のアルカリ処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３２】放線菌酵素（ＳＡＶ１７６４）添加による、アクセルレース１５００のアルカリ処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３３】放線菌酵素（ＳＡＶ２５７４）添加による、アクセルレース１５００のアルカリ処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３４】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの未処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３５】放線菌酵素（ＳＡＶ１７６４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの未処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３６】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３７】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５６）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理イナワラの糖化率向上効果を示す図である。
【図３８】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５４）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理スギ、水熱処理ユーカリ、エリアンサスの糖化率向上効果を示す図である。
【図３９】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５６）添加による、セルクラスト１．５Ｌの水熱処理スギの糖化率向上効果を示す図である。
【図４０】放線菌酵素（ＳＡＶ１８５５、ＳＡＶ１８５６）併用による水熱処理スギの糖化率向上効果を示す図である。
【図４１】放線菌Streptomyces pristinaespiralis又はS. scabieiのイナワラ培養上清の添加では、アクセルレース１５００のアルカリ処理イナワラ糖化率向上効果が得られないことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明におけるリグノセルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンから構成されるリグノセルロースを主成分とするバイオマスを意味し、具体的には、木本植物・間伐材・廃材・おがくず等を含む木質バイオマス、竹・ケナフ・バガス・稲や麦わら・バナナ等の非木質バイオマス、葦・エレファントグラス等の草本植物、新聞・雑誌・台帳・段ボール等の回収古紙などを挙げることができる。
【００１４】
上記のリグノセルロース系バイオマスに含まれる多糖類を加水分解することによって得られる単糖類としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、キシロース、ラムノース、フコース及びアラビノースなどの単糖類、ガラクツロン酸、グルクロン酸などのウロン酸、水酸基がエステル化されたエステル誘導体、水酸基がメチル基などで誘導体化されたアルキル誘導体を例示することができる。
【００１５】
本発明において、ストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質としては、配列番号１、３、５、７、９、１１又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトミセス・エバーミチルス（Streptomyces avermitilis）由来の組換えタンパク質や、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトミセス・エバーミチルス由来の組換えタンパク質や、配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）由来の組換えタンパク質や、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス由来の組換えタンパク質を挙げることができる。上記ストレプトマイセス・エバーミチルスとして、例えば、ＭＡ−４６８０株がある。このＭＡ−４６８０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に、ストレプトマイセス・エバーミチルスＭＡ−４６８０（ＮＢＲＣ番号：１４８９３）として寄託されている。また、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリスとしては、独立行政法人製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（ＮＢＲＣ番号：１３０７４）として寄託されている菌株を例示することができる。
【００１６】
上記組換えタンパク質は、そのアミノ酸配列に対応する公知のＤＮＡの配列情報を基に、遺伝子工学的手法を用いて常法により調製することができる。例えば、ストレプトミセス・エバーミチルスやストレプトミセス・プリスチナエスピラリスより、常法に従ってゲノムＤＮＡを調製し、次いで、このゲノムＤＮＡから、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなる遺伝子ＤＮＡに特有の適当なプローブ又はプライマーセット、好ましくは制限酵素の認識サイトを備えたプライマーセットを用いて所望クローンを選抜することにより、目的とする遺伝子ＤＮＡを取得することができる。かかる所定の遺伝子ＤＮＡを放線菌又は大腸菌用発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより組換えベクターを構築し、この組換えベクターで放線菌又は大腸菌宿主を形質転換し、この形質転換体を培養することにより、目的とする組換えタンパク質を得ることができる。かかる組換えタンパク質は、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質とすることもできる。このようにして得られる組換えタンパク質は通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００１７】
本発明において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ加水分解酵素活性、好ましくはリグノセルロース系バイオマス糖化酵素活性を有する組換えタンパク質（組換え変異タンパク質）における「１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。かかる組換えタンパク質は、例えば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得し調製することができる。上記遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.（以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997）等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００１８】
本発明において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ加水分解酵素活性、好ましくはリグノセルロース系バイオマス糖化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでコードされる組換えタンパク質（組換え変異タンパク質）における「ストリジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、より具体的には、７０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件であり、例として、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるヌクレオチドをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning, A laboratory manual）、第３版、第６章に記載の方法で行うことができる。
【００１９】
上記組換え変異タンパク質における加水分解酵素活性、好ましくはリグノセルロース系バイオマス糖化酵素活性としては、塩基配列が配列番号１、アミノ酸配列が配列番号２の組換え変異タンパク質の場合はセロビオヒドロラーゼ活性を；塩基配列が配列番号３、アミノ酸配列が配列番号４の組換え変異タンパク質の場合はグルコマンナナーゼ活性を；塩基配列が配列番号５、アミノ酸配列が配列番号６の組換え変異タンパク質の場合はエンドグルカナーゼ活性を；塩基配列が配列番号７、アミノ酸配列が配列番号８の組換え変異タンパク質の場合はエキソ型キシログルカナーゼ活性を；塩基配列が配列番号９、アミノ酸配列が配列番号１０の組換え変異タンパク質の場合はエンド型キシログルカナーゼ活性を；塩基配列が配列番号１１、アミノ酸配列が配列番号１２の組換え変異タンパク質の場合はエンド−β−１，３−グルカナーゼ活性を；塩基配列が配列番号１３、アミノ酸配列が配列番号１４の組換え変異タンパク質の場合はα−グルクロニダーゼ活性を；塩基配列が配列番号１５、アミノ酸配列が配列番号１６の組換え変異タンパク質の場合はキシラナーゼ活性を、それぞれ好適に例示することができる。
【００２０】
本発明において、前記のストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質や、上記組換え変異タンパク質と併用される、ストレプトマイセス属に属する微生物以外、好ましくは放線菌以外の生物由来のリグノセルロース系バイオマス糖化酵素としては、セルロースの加水分解酵素（セルラーゼ）、ヘミセルロースの加水分解酵素（ヘミセルラーゼ）、リグニン分解酵素（リグニナーゼ）の他、ペクチン質を分解する酵素（ペクチナーゼ）も含まれる。これらのリグノセルロース系バイオマス糖化酵素は、市販酵素製剤を用いても、あるいは公知の方法で調製した酵素製剤を用いてもよい。また、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニナーゼ、ペクチナーゼの２種以上の混合物を用いることもできる。
【００２１】
上記セルラーゼとしては、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エキソ−β−１，４ーグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ等を挙げることができ、その由来としては、ストレプトマイセス属に属する微生物以外、好ましくは放線菌以外の生物由来であれば特に制限されず、高等植物、細菌、糸状菌、木材腐朽菌、シロアリの共生原生動物などに由来する天然のセルラーゼを用いてもよいし、遺伝子工学的方法で人工的に産生したものを用いてもよい。セルラーゼの由来として具体的には、トリコデルマ属（Trichoderma）菌、アスペルギルス属（Aspergillus）菌、フミコーラ属（Humicola）菌、スタフィロトリクム属（Staphylotrichum）菌、リゾプス属（Rhizopus）菌、ムコール属（Mucor）菌、アクレモニウム属（Acremonium）菌、カエトミウム属（Chaetomium）菌、アシドサーマス属（Acidothermus）菌、セルロモナス属（Cellulomonas）菌等を好適に例示することができる。
【００２２】
上記ヘミセルラーゼとしては、β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、グルクロニダーゼ、マンノシダーゼ、マンナナーゼ、アラビナナーゼ、ガラクタナーゼ等を挙げることができ、その由来としては、ストレプトマイセス属に属する微生物以外、好ましくは放線菌以外の生物由来であれば特に制限されず、高等植物、細菌、糸状菌などに由来する天然のヘミセルラーゼを用いてもよいし、遺伝子工学的方法で人工的に産生したものを用いてもよい。ヘミセルラーゼの由来として具体的には、アスペルギルス属菌、ペニシリウム属（Penicillium）菌、フサリウム属（Fusarium）菌、トリコデルマ属菌、フミコーラ属菌、アシドサーマス属（Acidothermus）菌、アガリクス属（Agaricus）菌、バチルス属（Bacillus）菌、セルロリティカス属（Cellulolyticus）菌、サーモマイセス属（Thermomyces）菌、クロストリジウム属（Clostridium）菌、サーモトガ属（Thermotoga）菌、サーモアスクス属（Thermoascus）菌、カルドセラム属（Caldocellum）菌、サーモモノスポラ属（Thermomonospora）菌等を好適に例示することができる。
【００２３】
上記リグニナーゼとしては、ラッカーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ等を挙げることができ、その由来としては、ストレプトマイセス属に属する微生物以外、好ましくは放線菌以外の生物由来であれば特に制限されず、木材腐朽菌、細菌、糸状菌、木材腐朽菌などに由来する天然のリグニナーゼを用いてもよいし、遺伝子工学的方法で人工的に産生したものを用いてもよい。リグニナーゼの由来として具体的には、ファネロケーテ属（Phanerochaete）菌、プレイロータス属（Pleurotus）菌、トラメテス属（Trametes）菌、ガノデルマ属（Ganoderma）菌、レンチナス属（Lentinus）菌、ポリポラス属（Polyporus）菌、ステレウム属（Stereum）菌、フレビア属（Phlebia）菌等を好適に例示することができる。
【００２４】
前記市販の酵素製剤としては、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、アクセルレース１５００（ジェネンコア協和社製）、ＴＰ−６０（明治製菓社製）、ウルトラフロＬ（ノボザイムズ社製）、メイセラーゼ（明治製菓社製）、アクレモニウムセルラーゼ（明治製菓製）、マセロチーム（ヤクルト本社製）、セルロシンＭＥ（阪急バイオインダストリー製）、スミチームＣ（新日本化学工業社製）、スミチームＸ（新日本化学工業社製）、ビスコチーム（ノボザイムズ社製）、スクラーゼＸ（三菱化学フーズ社製）、ヘミセルラーゼ「アマノ」９０（天野エンザイム社製）、グリンドアミルＨ（ダニスコ ジャパン社製）、ペントパン（ノボザイムズ社製）、及びアミログルコシダーゼ（メガザイム社製）などを挙げることができる。
【００２５】
本発明おけるリグノセルロース系バイオマスの糖化工程は、従来公知の方法を適宜採用して行うことができる。まず、上記のリグノセルロース系バイオマス、好ましくはその粉砕処理物を水性媒体に懸濁して懸濁液を調製するが、水性媒体としては水、緩衝液、酸性水溶液、アルカリ性水溶液を挙げることができる。糖化（加水分解）反応は、リグノセルロース系バイオマスの粉砕物の懸濁液中に加水分解酵素を添加し、該懸濁液をインキュベート、好ましくは通気・撹拌することによって行うことができる。懸濁液中に含まれるリグノセルロース系バイオマスの濃度としては、バイオマスの種類、使用するリグノセルロース系バイオマス糖化酵素の種類によって適宜選択することができるが、水性媒体１Ｌに対して、通常、乾燥（無水）状態のバイオマス５〜３００ｇ、好ましくは５０〜２００ｇである。また、糖化反応条件として、ｐＨは使用する酵素の至適ｐＨが好ましいが、通常ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜７であり、また、温度は通常２０〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃であり、反応時間は通常１２〜１４４時間、好ましくは２４〜７２時間である。用いられるリグノセルロース系バイオマス糖化酵素量は、使用する酵素の種類によって適宜選択することができるが、懸濁するリグノセルロース系バイオマスの質量（乾物換算）に対し、好ましくは０．００１〜１５質量％、好ましくは０．０１〜５質量％である。また、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素量に対する組換えタンパク質の量は、使用するリグノセルロース系バイオマス糖化酵素及び組換えタンパク質の種類によって適宜選択することができるが、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素の質量に対し、好ましくは０．０５〜３０質量％、好ましくは０．５〜１５質量％である。
【００２６】
また、リグノセルロース系バイオマス、好ましくはその粉砕物や爆砕処理物は、反応効率向上の観点から、加水分解反応に供する前に蒸煮処理を行うことが好ましい。さらに、加水分解反応の前に適宜酸又はアルカリ処理を行ってもよい。粉砕処理、爆砕処理、蒸煮処理、酸処理、アルカリ処理等は、従来公知の方法を用いることができる。
【００２７】
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例によって限定されるものではない。以下の実施例においては、まず、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質（酵素）の基質特異性を調べた。次いで、かかる組換えタンパク質（酵素）と市販のセルラーゼ製剤とを併用し、市販のセルラーゼ製剤によるリグノセルロース系バイオマスの糖化効率が相乗的に向上することを確認した。
【実施例１】
【００２８】
＜Streptomyces avermitilis由来酵素について＞
表１に、実施例で使用した放線菌Streptomyces avermitilis由来の酵素について示す。
ＳＡＶ○○○○はStreptomyces avermitilisの遺伝子番号であり、以下その遺伝子がコードするタンパクを表している。
【００２９】
【表１】
【００３０】
＜放線菌S. avermitilis ゲノム上の各遺伝子の位置関係＞
ＳＡＶ１８５３、ＳＡＶ１８５４、ＳＡＶ１８５５、ＳＡＶ１８５６はゲノム上では図１で示される位置関係にある。
【００３１】
＜放線菌酵素の調製＞
フォワードプライマーの５’側にNdeIサイト、リバースプライマーの５’側にHindIIIサイトをそれぞれ導入した配列番号１７〜３２のプライマーを用い、分泌シグナル配列を含む、配列番号１、３、５、７、９、１１又は１５で表される各放線菌酵素のＯＲＦ全長のＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。増幅産物をpGEM-T Easy vector（プロメガ社製）にＴＡクローニングした。該ベクターに挿入されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列をシークエンスし、確認後、S.avermitilis由来７酵素は放線菌発現ベクター（特開２００９−１５３５１６、Hatanaka, T., Onaka, H., Arima, J., Uraji, M., Uesugi, Y., Usuki, H., Nishimoto, Y., Iwabuchi, M., 2008. Protein Expr. Purif. 62, 244-248に記載のベクター）にNdeI-HindIIIサイトで導入した。作製した放線菌発現ベクターを放線菌Streptomyces lividans 1326に導入し、形質転換体を得た。形質転換体を液体培養することにより、組換えタンパク質は培養上清に分泌された。該培養液から菌体を除去し、得られた組換えタンパク質を含む培養上清を、粗酵素液とした。S.pristinaespiralis由来のＳｐＧｌｃＡ１１５Ａは、配列番号１３で表される、分泌シグナル配列を含まない放線菌酵素のＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、増幅産物を大腸菌発現ベクターpET30にNdeI-HindIIIサイトで導入した。作製した大腸菌発現ベクターで形質転換した大腸菌を液体培養することにより、分泌シグナル配列を含まず、Ｃ末側にヒスチジンタグが融合した組換えタンパク質が大腸菌内に生産された。該培養液から回収した菌体を破砕した後、遠心操作を行い、得られた上清を粗酵素液とした。
【００３２】
以下に各放線菌酵素の性質を示す。
＜ＳＡＶ１８５３＞
ＳＡＶ１８５３は分泌シグナル配列＋ＣＢＭ２＋ＧＨ６のモジュラー構造からなり、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
各基質に対する活性（基質特異性）を表２に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
ＣＭ−セルロースの分解パターンを図２、３に、スタンダードとしてセロオリゴ糖の解析結果を図４に示す。反応液およびスタンダード溶液をHPAEC-PAD system（DX-500；Dionex社製）により解析した。ＣＭ−セルロースの分解物としてＣ２で示すセロビオースのみが生産された。すなわち、ＳＡＶ１８５３はセロビオヒドロラーゼである。
【００３５】
＜ＳＡＶ１８５４＞
ＳＡＶ１８５４は分泌シグナル配列＋ＣＢＭ２＋ＧＨ５のモジュラー構造からなり、配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
各基質に対する活性（基質特異性）を表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】
ＳＡＶ１８５４はKonjac glucomannanに対し高い活性を示した。すなわち、ＳＡＶ１８５４はグルコマンナナーゼである。
【００３８】
＜ＳＡＶ１８５５＞
ＳＡＶ１８５５は分泌シグナル配列＋ＣＢＭ２＋ＧＨ４８のモジュラー構造からなり、配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
各基質に対する活性（基質特異性）を表４に示す。
【００３９】
【表４】
【００４０】
ＣＭ−セルロースの分解パターンを図５、６に、スタンダードとしてセロオリゴの解析結果を図７に示す。反応液およびスタンダード溶液をHPAEC-PAD system（DX-500；Dionex社製）により解析した。ＣＭ−セルロースの分解物としてセロオリゴ糖が生産された。すなわち、ＳＡＶ１８５５はエンドグルカナーゼである。
【００４１】
＜ＳＡＶ１８５６＞
ＳＡＶ１８５６は分泌シグナル配列＋ＣＢＭ２＋ＧＨ７４のモジュラー構造からなり、配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
＜ＳＡＶ２５７４＞
ＳＡＶ２５７４は分泌シグナル配列＋ＧＨ７４のモジュラー構造からなり、配列番号９で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
各基質に対するＳＡＶ１８５６、ＳＡＶ２５７４の活性（基質特異性）を表５に示す。
【００４２】
【表５】
【００４３】
ＳＡＶ１８５６、ＳＡＶ２５７４はTamarind xyloglucanに対して高い活性を示した。すなわち、ＳＡＶ１８５６、ＳＡＶ２５７４は共にキシログルカナーゼである。
【００４４】
Tamarind xyloglucanの分解反応液をHPAEC-PAD system（DX-500；Dionex社製）により解析したパターンを図８に示す。ＳＡＶ２５７４により様々な長さのキシログルカンオリゴ糖が遊離していることから、ＳＡＶ２５７４はエンド型キシログルカナーゼであることが分かる。一方、ＳＡＶ１８５６は、ある決まった長さのオリゴ糖が反応初期から生産され、反応時間を経て蓄積されている。この結果から、ＳＡＶ１８５６はエキソ型キシログルカナーゼであると考えられる。
【００４５】
＜ＳＡＶ１７６４＞
ＳＡＶ１７６４は分泌シグナル配列＋ＧＨ１６＋ＣＢＭ６のモジュラー構造からなり、配列番号１１で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
各基質に対する活性（基質特異性）を表６に示す。
【００４６】
【表６】
【００４７】
ラミナリンの分解パターンを図９、１０に、スタンダードとしてグルコース・ラミナリオリゴ等の解析結果を図１１に示す。反応液およびスタンダード溶液をHPAEC-PAD system（DX-500；Dionex社製）により解析した。ラミナリンの分解物としてグルコースＧとラミナリオリゴ糖Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４が生産された。すなわち、ＳＡＶ１７６４はエンド−β−１，３−グルカナーゼである。
【００４８】
＜ＳＡＶ２０９６＞
ＳＡＶ２０９６は分泌シグナル配列＋ＧＨ１０からなり、配列番号１５で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなる酵素で、キシラナーゼである。
【００４９】
＜Streptomyces pristinaespiralis由来酵素について＞
表７に、以下で使用した放線菌Streptomyces pristinaespiralis由来の酵素ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａについて示す。
【００５０】
【表７】
【００５１】
＜ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａ＞
ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａは分泌シグナル配列＋ＧＨ１１５からなる酵素であり、配列番号１３で示される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる酵素である。
ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａによるキシラン分解活性を調べた。
【００５２】
反応液
２％基質 (Beech wood xylan又はBirch wood xylan)
５０ｍＭ acetate buffer、ｐＨ５．０
リコンビナントＳｐＧｌｃＡ１１５Ａ（１０mｇ）
４０℃、０−７時間
反応液をHPAEC-PAD system（DX-500；Dionex社製）により解析した結果を図１２〜１９に示す。スタンダードとしてグルクロン酸を解析した結果、グルクロン酸のピークの前に、gradient shockのピークが見られた（図１２）。また、コントロールとしてＳｐＧｌｃＡ１１５Ａのみを解析した結果、３．３分にイミダゾールのピークが見られた（図１３）。ＳｐＧｌｃＡ１１５ＡとBeech wood xylanを０時間（図１４）又は７時間（図１５）反応させた反応液の解析では、反応７時間において１６．３分、１７．２分のピークが増加した。スタンダードとして、基質Beech woodのみの解析結果を図１６に示す。ＳｐＧｌｃＡ１１５ＡとBirch wood xylanを０時間又は７時間反応させた反応液の解析結果をそれぞれ図１７、図１８に示す。スタンダードとして、基質Birch woodのみの解析結果を図１９に示す。
【００５３】
反応液を以下に示す。
２％ Birch wood xylan
５０ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．０）
４０℃、０−４８時間
酢酸エチル：酢酸：１−プロパノール：ギ酸: 水＝２５：１０：５：１：１５
スポッティング量
スタンダード(キシロース、グルクロン酸)；１％反応液１μｌ
Sample； 反応液４μｌ
N-(1-naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride１．８ｇ／２００ｍｌエタノール／２０ｍｌ ｃｏｎｃ．Ｈ２ＳＯ４
反応産物を、ＴＬＣにより検出した結果を図２０に示す。ＭｅＧｌｃＡに対応する弱いシグナルのスポットが検出された。すなわち、ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａはα−グルクロニダーゼである。
【実施例２】
【００５４】
放線菌Streptomyces avermitilis NBRC14893由来酵素群を利用したイナワラの糖化方法
；セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）と放線菌酵素による糖化方法
反応液の組成を表８に示す。
【００５５】
【表８】
【００５６】
反応：５０℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら１日間（ｎ＝２又は３）
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
上記反応系において使用した酵素タンパク質の量は（ＢＣＡ法により測定）、
セルクラスト１．５Ｌ：４．５ｍｇ
放線菌酵素：約３５μｇ
である。
【００５７】
上の反応系において、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）をそれぞれ０．５ＦＰＵ／１００ｍｇ ｂｉｏｍａｓｓ又は１ＦＰＵ／１００ｍｇ ｂｉｏｍａｓｓになるように加え、それぞれ１６０℃又は１８０℃で１０分間処理した場合の糖化率は、図２１、２２のようになった。
【００５８】
セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）０．５ＦＰＵ／１００ｍｇ ｂｉｏｍａｓｓの条件で、放線菌酵素（ＳＡＶ１８５３、ＳＡＶ１８５４、ＳＡＶ１８５５）を添加し、１６０℃又は１８０℃で１０分間処理した場合の糖化率を図２３〜２８に示す。微量の放線菌酵素を添加することにより、セルクラストを２倍量使用した糖化率とほぼ同等の糖化率を得ることができた。
【実施例３】
【００５９】
放線菌由来酵素のイナワラ糖化への応用
；Streptomyces avermitilis由来ＧＨ１０酵素（キシラナーゼ）
；Streptomyces pristinaespiralis由来ＧＨ１１５酵素（α−グルクロニダーゼ）ＳｐＧｌｃＡ１１５Ａ
反応液の組成を表９に示す。
【００６０】
【表９】
【００６１】
反応：５０℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら２日間
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
【００６２】
上の反応系における、キシラン糖化率を図２９に示す。微量のＳｐＧｌｃＡ１１５Ａ（ＧＨ１１５酵素）をキシラナーゼ（ＧＨ１０酵素）に添加することにより、キシラン分解率を上昇させることができた。
【実施例４】
【００６３】
放線菌Streptomyces avermitilis NBRC14893由来酵素群を利用したイナワラの糖化方法
；アクセルレース１５００（ジェネンコア協和）と放線菌酵素による糖化方法
反応液の組成を表１０に示す。
【００６４】
【表１０】
【００６５】
反応：５０℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら１日間（ｎ＝２又は３）
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
上記反応系に使用した酵素タンパク質の量は（ＢＣＡ法により測定）、
アクセルレース１５００：３５０μｇ
放線菌酵素：約３５μｇ
である。
【００６６】
上の反応系において、放線菌酵素にＳＡＶ１８５３、ＳＡＶ１８５５、ＳＡＶ１７６４、ＳＡＶ２５７４をそれぞれ添加した場合のアルカリ処理イナワラのキシラン糖化率は図３０〜３３となる。セルラーゼ製剤に各放線菌酵素を添加することにより、糖化率を上昇させることができた。
【実施例５】
【００６７】
放線菌Streptomyces avermitilis NBRC14893由来酵素群を利用したイナワラの糖化方法
；セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）と放線菌酵素による糖化方法
反応液の組成を表１１に示す。
【００６８】
【表１１】
【００６９】
反応：５０℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら３日間
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
上記反応系において使用した粗酵素タンパク量（Bradford法により測定）は、
Ｘ＝６０μｇ（ＳＡＶ１８５４）、６５μｇ（ＳＡＶ１７６４）である。
上の反応系において、放線菌酵素にＳＡＶ１８５４又はＳＡＶ１７６４を使用した場合の未処理イナワラ粉末の糖化率を、それぞれ図３４、３５に示す。前処理を施していないイナワラの糖化において、セルラーゼ製剤に放線菌酵素を添加することにより、糖化率を上昇させることができた。
【実施例６】
【００７０】
放線菌Streptomyces avermitilis NBRC14893由来酵素を利用したバイオマスの糖化方法
；セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）と放線菌酵素による糖化方法
反応液の組成を表１２に示す。
【００７１】
【表１２】
【００７２】
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
上の反応系において、放線菌酵素にＳＡＶ１８５４又はＳＡＶ１８５６を使用した場合の水熱処理イナワラの糖化率を、それぞれ図３６、図３７に示す。水熱処理を施したイナワラ、すなわちバイオマスの糖化において、セルラーゼ製剤に放線菌酵素を添加することにより、糖化率を上昇させることができた。
【００７３】
反応液の組成を表１３及び表１４に示す。
【００７４】
【表１３】
【００７５】
【表１４】
【００７６】
反応：４５℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら１日間
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
上の反応系において、ＳＡＶ１８５４を添加した場合のセルクラスト１．５Ｌによる水熱処理スギ、水熱処理ユーカリ、未処理エリアンサス分解評価の結果を図３８に、ＳＡＶ１８５６を添加した場合のセルクラスト１．５Ｌによる水熱処理スギ分解評価の結果を図３９に示す。分解率は小さいが、放線菌酵素を添加することにより、スギ、ユーカリのように分解の困難な基質でも糖化率を上昇させることができた。
【００７７】
上の反応系において、ＳＡＶ１８５５及びＳＡＶ１８５６を添加した場合のセルクラスト１．５Ｌによる水熱処理スギの分解評価の結果を図４０に示す。放線菌酵素を併用した場合には、その組み合わせによりシナジー効果が得られ、放線菌酵素のみでの糖化率が上昇した。その結果、反応系の糖化率を高めることが可能である。
【実施例７】
【００７８】
＜放線菌のイナワラ培養上清をセルラーゼ製剤に添加した場合の糖化率＞
【００７９】
【表１５】
【００８０】
反応：５０℃、１０００ｒｐｍで振とうしながら１日間
反応停止：１００℃、２０分加熱処理
還元糖量測定法：ソモギー・ネルソン法
糖化率：還元糖量をグルコース換算とした。
アルカリ処理イナワラを基質とし、セルラーゼ製剤に加えて放線菌のイナワラ培養上清を添加した場合の糖化反応の結果を図４１に示す。アクセルレース１５００のみによる糖化率を一番左に、放線菌Streptomyces pristinaespiralis又はS. scabieiのイナワラ培養上清のみによる糖化率をそれぞれ左から２番目、４番目に、アクセルレース１５００に各培養上清を添加した場合の糖化率をそれぞれ左から３番目、５番目のカラムで示した。アクセルレース１５００に単に放線菌の培養上清を加えただけでは、糖化率は十分に上昇しなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物由来の組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【請求項２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ加水分解酵素活性を有する組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【請求項３】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【請求項４】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでコードされる組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【請求項５】
リグノセルロース系バイオマス糖化酵素が、ストレプトマイセス属に属する微生物以外の生物由来のリグノセルロース系バイオマス糖化酵素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【請求項６】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物由来の組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法。
【請求項７】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ加水分解酵素活性を有する組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法。
【請求項８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法。
【請求項９】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでコードされる組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法。
【請求項１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物由来の組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【請求項２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ加水分解酵素活性を有する組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【請求項３】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【請求項４】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでコードされる組換えタンパク質のいずれか１種又は２種以上を、リグノセルロース系バイオマス糖化酵素と併用して、リグノセルロース系バイオマスを糖化することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【請求項５】
リグノセルロース系バイオマス糖化酵素が、ストレプトマイセス属に属する微生物以外の生物由来のリグノセルロース系バイオマス糖化酵素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【請求項６】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物由来の組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法。
【請求項７】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ加水分解酵素活性を有する組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法。
【請求項８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡを発現させることにより得られるストレプトマイセス属に属する微生物由来の組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法。
【請求項９】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでコードされる組換えタンパク質をリグノセルロース系バイオマス糖化酵素として使用する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【公開番号】特開２０１２−３９８９５（Ｐ２０１２−３９８９５Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８１５４８（Ｐ２０１０−１８１５４８）
【出願日】平成２２年８月１６日（２０１０．８．１６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、経済産業省、独立行政法人新エネルギー・産業技術開発機構「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１６日（２０１０．８．１６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、経済産業省、独立行政法人新エネルギー・産業技術開発機構「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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