リグノセルロース系バイオマスをエタノールに変換する好熱性生物
【課題】有機酸（特に酢酸）を作り続けるＴ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ株を提供する。
【解決手段】種々のバイオマスに由来する基質を消費する変異型の好熱性生物が本明細書において開示される。アセテートキナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現が排除されたＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの株が、本明細書において開示される。さらに、ＡＬＫ１株は、 部位特定相同組換えにより操作されて、酢酸および乳酸の生成をノックアウトされている。基質濃度の刺激を伴う連続培養は、ＡＬＫ１の進化と、より頑健なＡＬＫ２と称される株の形成をもたらす。両方の生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現することなく、理論収量に近いエタノールを生成する。
【解決手段】種々のバイオマスに由来する基質を消費する変異型の好熱性生物が本明細書において開示される。アセテートキナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現が排除されたＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの株が、本明細書において開示される。さらに、ＡＬＫ１株は、 部位特定相同組換えにより操作されて、酢酸および乳酸の生成をノックアウトされている。基質濃度の刺激を伴う連続培養は、ＡＬＫ１の進化と、より頑健なＡＬＫ２と称される株の形成をもたらす。両方の生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現することなく、理論収量に近いエタノールを生成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国特許出願第６０／７３１，６７４号（２００５年１０月３１日出願）および米国特許出願第６０／７９６，３８０号（２００６年５月１日出願）に対する優先権を主張し、これら特許出願の各々は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府の権利）
本発明の進展に関する研究がＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＩＳＴ）契約番号６０ＮＡＮＢ１Ｄ００６４によって資金援助されたので、米国政府は、本発明において一定を権利を有し得る。
【０００３】
（背景）
（１．発明の分野）
本発明は、エタノールを生成するためのバイオマス処理の分野に関する。特に、種々のバイオマス由来の基質を消費しかつ高収量でエタノールを生成する新規な好熱性生物、ならびに上記生成のプロセスおよび上記生物の使用が開示される。
【背景技術】
【０００４】
（２．関連技術の説明）
バイオマスは、安価でかつ容易に入手可能なセルロース分解基質の代表であり、この基質から糖が生成され得る。これら糖は、単独で使用されてもよいし、アルコールおよび他の生成物を生成するために醗酵されてもよい。生物変換生成物の中で、エタノールにおける関心は高い。なぜなら、エタノールは、再生可能家庭用燃料（ｒｅｎｅｗａｂｌｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｆｕｅｌ）として使用され得るからである。
【０００５】
反応器設計、前処理プロトコールおよび分離技術の分野でかなりの研究が行われてきた。その結果、生物変換プロセスは、石油燃料技術と経済的に競争できる関係になっている。しかし、最大の費用削減は、２つ以上の処理工程を組み合わせたときに得られ得ると予測される。例えば、同時に存在する糖化と醗酵（ＳＳＦ）、および同時に存在する糖化と並行醗酵（ｃｏ−ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＳＳＣＦ）プロセスとを併用すると、１つの反応器または連続処理装置において酵素的糖化工程と醗酵とが一体となって行われる。より短期間の発酵時間および資本金縮小に関連する費用削減に加えて、並行醗酵プロセスはまた、生成物収量の改善を提供し得る。なぜなら、別の方法では代謝的分解（ｍｅｔａｂｏｌｙｓｉｓ）または加水分解を阻害するレベルにまで蓄積してしまう特定の化合物が、並行醗酵生物によって消費されるからである。１つのこのような例において、β−グルコシダーゼは、グルコースの存在下でセロビオースを加水分解するのをやめてしまい、次には、セロビオースの蓄積が、セルロース分解を妨げる。セルロースおよびヘミセルロースの加水分解生成物の並行醗酵に伴うＳＳＣＦプロセスは、β−グルコシダーゼの加水分解活性を阻害しない１種以上の生成物へとグルコースを変換することによって、この課題を多少解決し得る。
【０００６】
統合バイオプロセス処理（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）（ＣＢＰ）は、４つの生物媒介事象（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｖｅｎｔｓ）を伴う：（１）酵素生成、（２）基質加水分解、（３）ヘキソース醗酵および（４）ペントース醗酵。これら事象は、１つの工程において行われ得る。このストラテジーは、セルロースおよびヘミセルロースを利用する微生物を要する。ＣＢＰ生物の開発は、専ら特定の目的のための（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）処理工程において糖分解性酵素を生成するという、より従来のアプローチと比較して、潜在的に非常に多額の費用削減を生じ得る。１種より多い生物を利用して上記４つの生物媒介事象を達成するＣＢＰプロセスは、統合バイオプロセス処理並行培養醗酵（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）といわれる。
【０００７】
いくらかの細菌は、ペントース糖をヘキソース糖に変換し、かつそのヘキソースを有機酸と解糖による他の生成物との混合物へと醗酵する能力を有する。上記解糖経路は、６炭のグルコース分子を２つの３炭素分子であるピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）に変換することで始まる。次いで、ピルビン酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（「ｌｄｈ」）の作用によって乳酸へと変換され得るか、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼもしくはピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼの作用によってアセチルコエンザイムＡ（「アセチル−ＣｏＡ」）へと変換され得る。アセチル−ＣｏＡはさらに、ホスホトランスアセチラーゼおよびアセテートキナーゼによって酢酸へと変換されるか、またはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（「ＡｃＤＨ」）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（「ａｄｈ」）によってエタノールへと還元される。全般的に、エタノール生成生物の能力は、エタノール以外の有機生成物の生成によって（特に、ピルビン酸から乳酸へのｌｄｈ媒介変換によって、およびホスホトランスアセチラーゼおよびアセテートキナーゼによるアセチル−ＣｏＡから酢酸への変換によって）損なわれる。
【０００８】
細菌の代謝的操作によって、好熱性嫌気性グラム陽性細菌Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍにおいて乳酸デヒドロゲナーゼのノックアウトが近年作り出された。非特許文献１を参照のこと。
【０００９】
上記ｌｄｈのノックアウトは、当該分野においてある進歩を与えているものの、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのこの株が、有機酸（特に酢酸）を作り続ける点において、この生物のいくらかの用途にとっては問題である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｇｕｅｒｉｎｏｔ，Ｍ．Ｌ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｌ−ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５」Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：６００−６０５，２００４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の手段は、種々のバイオマス由来の物質を消費し、そして、理論収量に近いエタノールを生成する好熱性嫌気性細菌を提供することによって、当該分野においてある進歩を与え、上記に概説する問題を克服する。生物を使用してエタノールを生成するための方法もまた開示される。
【００１２】
本明細書において報告される手段は、単独でまたは組み合わせてのいずれかでの種々の遺伝子のノックアウトをもたらし、ネイティブの生物におけるこのような遺伝子は、ノックアウトされなければ、有機酸の形成をもたらす。例えば、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５における（ａ）アセテートキナーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼ、ならびに（ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）、アセテートキナーゼ（ａｃｋ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔｄ）のノックアウトが存在し得る。本明細書において報告される結果は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍについてのものであるが、これらの方法および材料はまた、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｏｔｅａｒｏｅｎｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍおよびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍを含むＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の他のメンバーにも適用される。これらの方法および材料は、代謝的操作された好熱性グラム陽性細菌の分野全般において有用である。
【００１３】
１つの実施形態において、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現しない単離された生物は、セルロース分解基質を醗酵して、理論収量の少なくとも９０％である濃度においてエタノールを生成する。
【００１４】
１つの実施形態において、ネイティブの状態において、醗酵生成物として酢酸を生成する能力をグラム陽性細菌に付与する少なくとも１種の遺伝子を含むグラム陽性細菌は、この少なくとも１種の遺伝子の発現を排除するように形質転換される。この細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｆｙｔｉｃｕｍのようなＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒであり得る。醗酵生成物として酢酸を生成する能力をグラム陽性細菌に付与する遺伝子は、アセテートキナーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼの発現をコードし得る。
【００１５】
別の実施形態において、グラム陽性細菌は、醗酵生成物として乳酸を生成する能力をグラム陽性細菌に付与する１種以上の遺伝子の発現を排除するようにさらに形質され得る。例えば、乳酸を生成する能力を付与する遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼであり得る。
【００１６】
１つの実施形態において、エタノールを生成するための方法は、ネイティブの生物を形質転換して、醗酵生成物として有機酸を生成する能力をグラム陽性細菌に付与する全ての遺伝子の発現を排除するように形質転換されたグラム陽性細菌を生成して、形質転換細菌宿主を生成する工程、ならびにこの形質転換細菌宿主を、グルコース、キシロース、セロビオース、スクロース、キシラン、澱粉およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、これらの基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程を包含する。
【００１７】
１つの実施形態において、ＡＬＫ１と称され、かつ特許寄託指定番号ＰＴＡ−７２０６の下でＡＴＣＣに寄託されている微生物の生物学的に純粋な培養物が記載される。
【００１８】
１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１０の配列、または（ｂ）配列番号９および配列番号１０の配列、または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列を含む。（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の単離されたポリヌクレオチドの相補体を発現するように遺伝子操作された宿主細胞が記載される。別の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１９】
１つの実施形態において、エタノールを生成する方法は、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の単離されたポリヌクレオチドの相補体を発現する変異細菌を、グルコース、キシロース、セロビオース、スクロース、キシラン、澱粉およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質を含有する培地中で、これらの基質をエタノールへと醗酵させることを可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程を包含する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
セルロース分解基質を醗酵して、理論収量の少なくとも９０％である濃度においてエタノールを生成する単離された生物であって、該生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現しない、単離された生物。
（項目２）
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
ネイティブの生物を形質転換して、項目１に記載の単離された生物を生成し、形質転換宿主を提供する工程；ならびに
該形質転換宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、該基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
（項目３）
形質転換生物であって、該形質転換生物は、
ネイティブの状態において、醗酵生成物として酢酸を生成する能力を付与する少なくとも１種の遺伝子を含むグラム陽性細菌
を含み、
該グラム陽性細菌は、該少なくとも１種の遺伝子の発現を排除するように形質転換されている、
形質転換生物。
（項目４）
上記グラム陽性細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属のメンバーである、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目５）
上記グラム陽性細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目６）
上記少なくとも１種の遺伝子は、アセテートキナーゼの発現をコードする、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目７）
上記少なくとも１種の遺伝子は、ホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目８）
上記少なくとも１種の遺伝子は、複数種の遺伝子を含む、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目９）
上記複数種の遺伝子は、アセテートキナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、項目８に記載のグラム陽性細菌。
（項目１０）
上記グラム陽性細菌に醗酵生成物として乳酸を生成する能力を付与する１種以上の遺伝子の発現を排除するように、さらに形質転換されている、項目９に記載のグラム陽性細菌。
（項目１１）
上記グラム陽性細菌に醗酵生成物として乳酸を生成する能力を付与する１種以上の遺伝子の発現を排除するように、さらに形質転換されている、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目１２）
上記少なくとも１種の遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼの発現をコードする、項目１１に記載のグラム陽性細菌。
（項目１３）
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
ネイティブの生物を形質転換して、項目１１に記載のグラム陽性細菌を生成し、形質転換細菌宿主を生成する工程；ならびに
該形質転換細菌宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、該基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
（項目１４）
上記細菌宿主は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、およびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
ＡＬＫ１と称されかつ特許寄託指定番号ＰＴＡ−７２０６の下で寄託されている微生物の生物学的に純粋な培養物。
（項目１７）
単離されたポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１０の配列；
（ｂ）配列番号９および配列番号１０の配列；または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列
を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目１８）
上記（ａ）または（ｂ）の配列に対して約９５％の配列同一性を有する、項目１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１９）
項目１８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目２０）
項目１８に記載のポリヌクレオチドの相補体を発現するように遺伝子操作された宿主細胞。
（項目２１）
上記宿主細胞は細菌細胞である、項目２０に記載の宿主細胞。
（項目２２）
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
項目２１に記載の変異細菌を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質を含有する培地中で、該基質をエタノールへと醗酵させることを可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
（項目２３）
上記変異細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記変異細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＬＫ１（ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ１）である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
細菌において発現できるプロモーターに作動可能に連結された配列番号１０を含む、遺伝子構築物。
（項目２６）
項目２５に記載の遺伝子構築物を含む、組換え細菌。
（項目２７）
上記細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、項目２６に記載の組換え細菌。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、解糖経路の反応を示す。
【図２】図２は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの種々のノックアウト株と比較した、野生型のＴ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍにおける水素生成を示す。
【図３−１】図３は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ９のｌｄｈ領域（配列番号９）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図３−２】図３は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ９のｌｄｈ領域（配列番号９）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図３−３】図３は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ９のｌｄｈ領域（配列番号９）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図３−４】図３は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ９のｌｄｈ領域（配列番号９）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図３−５】図３は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ９のｌｄｈ領域（配列番号９）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−１】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−２】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−３】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−４】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−５】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−６】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図５】図５〜７は、ＡＬＫ１の増殖の間の、種々の時間間隔における醗酵培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の追跡を示す。
【図６】図５〜７は、ＡＬＫ１の増殖の間の、種々の時間間隔における醗酵培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の追跡を示す。
【図７】図５〜７は、ＡＬＫ１の増殖の間の、種々の時間間隔における醗酵培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の追跡を示す。
【図８】図８は、ＡＬＫ１株による醗酵の間の、キシロース、有機酸およびエタノールの濃度を示す。
【図９】図９は、野生型Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによる醗酵の間の、キシロース、有機酸およびエタノールの濃度を示す。
【図１０】図１０は、ＡＬＫ１の連続培養刺激の間の、キシロース、有機酸およびエタノールの濃度を示す。
【図１１】図１１は、ＡＬＫ２株による醗酵の間の、キシロース、有機酸およびエタノールの濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（詳細な説明）
ここで、バイオマスのエタノールへの変換において好熱性嫌気性グラム陽性細菌を操作および利用するための方法が示され、かつ記載される。
【００２２】
本明細書において使用される場合、生物は、その生物の遺伝子および／または表現型の構成を意図的に変更する様式で人間の手によって遺伝子操作または他の方法で操作されていない場合、「ネイティブの状態」にある。例えば、野生型の生物は、ネイティブの状態にあると考えられ得る。
【００２３】
ネイティブの状態のＴ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍからの有機酸の生成の完全なる排除は、２回の部位特定ＤＮＡ相同組換え事象を用いて達成された。変異株であるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ１（「ＡＬＫ１」）は、約３０℃〜６６℃の範囲の温度および約３．８５〜６．５の範囲のｐＨの大量培養において、少ない基質の補給で、理論量に近いエタノールを生成する。１つの実施形態において、エタノール収量は、理論最大量の少なくとも約９０％である。ＡＬＫ１およびその子孫（ｄｅｃｅｎｄｅｎｔ）は、その増殖条件に起因して、リグノセルロース系（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ）バイオマスからのエタノールへの変換において有意な費用削減に寄与する潜在能力を有する。この増殖条件は、同時に存在する糖化および平行醗酵（ＳＳＣＦ）プロセスにおけるセルラーゼ活性が実質的に最適である。例えば、最適なセルラーゼ活性のパラーメータとしては、４〜５の間のｐＨと４０℃〜５０℃の間の温度が挙げられる。さらに、有機酸を生成する能力を欠くノックアウト生物が使用される場合は、醗酵培養液のｐＨを調整する必要はない。ＡＬＫ１および類似する生物はまた、統合バイオプロセス処理並行培養醗酵に適切であり得、この統合バイオプロセス処理並行培養醗酵においては、ノックアウト生物が、ペントースをエタノールへと変換し、そして、セルロースが、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのようなセルロース加水分解生物によって分解される。
【００２４】
好熱性の温度においてＳＳＣＦプロセスまたはＣＢＰプロセスのいずれかを行うことにより、３従来の０℃〜３７℃の中温性の醗酵温度を上回るいくつかの重要な利益が提供される。特に、セルラーゼ生成専用のプロセス工程のための費用が、好熱性のＳＳＣＦについては実質的に削減され（例えば、２倍以上）、そして、ＣＢＰについては排除される。醗酵槽（ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）の冷却そしてまた醗酵前後の熱交換に付随する費用もまた、好熱性のＳＳＣＦおよびＣＢＰの両方について削減されることが予想される。最後に、好熱性の生体触媒を特徴とするプロセスは、従来の中温性の生体触媒を特徴とするプロセスと比較して、細菌混入に対する感受性が低下し得る。
【００２５】
天然に存在するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、ならびに、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの組換え株のような公知の「ホモエタノール醗酵」微生物とは対照的に、本明細書により開示される生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの作用によるピルビン酸のアセトアルデヒドへの変換に依存しない（図１、９）。実際、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌は、ネイティブの状態でピルビン酸デカルボキシラーゼを発現しない。図１に示す解糖経路の反応から、酵素ピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼ（２）によって、ピルビン酸がアセチル−ＣｏＡ、二酸化炭素および還元フェレドキシンへと代謝され得ることが観察され得る。しかし、エタノールを唯一の醗酵生成物として生成するために、ＮＡＤ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（３）によって、還元フェレドキシンにより運搬される電子が全て、ＮＡＤへと転移され、ＮＡＤＨＡを形成しなければならない。ＮＡＤＨは、その後、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（７）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（８）によるアセチル−ＣｏＡのエタノールへの２段階の還元の過程で、酸化されてＮＡＤへと戻る。ＮＡＤＨの効率的な利用の証拠は、図２において、ａｃｋおよびｐｔａを発現できないアセテートノックアウト生物と、ａｃｋ、ｐｔａおよびｌｄｈを発現できない二重ノックアウト生物（ＡＬＫ１）との両方によるＨ２生成の減少として、観察され得る。これらの生物は、還元フェレドキシンからＮＡＤへの、そして、その後のエタノールへの化学量論に関する電子の転移という第一の論証を提供する。
【００２６】
ＰＤＣを発現する能力を有さない生物において化学量論に関するエタノール収量を生成する上記の経路は、これまでに記載されてきたホモエタノール醗酵株において用いられる経路とは対照的である。これまでに記載されてきた株は、内因性のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）を利用するか、または、外因性のＰＤＣを発現するように操作される。ＰＤＣの発現は、微生物界においては稀なことであるので、改変によって、電子の流れを炭素の流れへと方向を変える能力は、広範な影響を有する。例えば、このアプローチは、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｔｙｔｉｃｕｍ以外の株において高いエタノール収量を生成するため、そして／または、エタノール以外の溶媒を生成するために使用され得る。特に、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｅｒ属のメンバー；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍならびに他の好熱性および中温性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ種；好熱性および中温性のＢａｃｉｌｌｕｓ種のようなグラム陽性細菌；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ；Ｆｉｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓおよび他のＦｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｔｈｅｒｍｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａおよび他のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ種；ならびに嫌気性菌門（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｔｉｘ種およびＰｉｒｏｍｙｃｅｓ種を含む）のようなグラム陰性細菌は、ＰＤＣを発現する能力を欠き、そして、開示される手段から利益を受け得る。
【００２７】
リグノセルロース系の物質が、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナンおよび澱粉のうちの１種以上を含有する任意の補給ストックであり得ることが理解される。種々の実施形態において、リグノセルロース系バイオマスは、木、トウモロコシ飼料、おが屑、樹皮、葉、農林業の残留物、アメリカクサキビのような草、反芻動物の消化産物、市の廃棄物、製紙工場の流出物、新聞紙、ボール紙、またはこれらの組み合わせを含む。
【実施例】
【００２８】
（実施例１ ＡＬＫ１株の生成）
（材料および方法）
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ株であるＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５（ＤＳＭ ８６９１）は、Ｗｅｓｔ Ｔｈｕｍｂ Ｂａｓｉｎ ｉｎ Ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｒｋ， Ｗｙｏｍｉｎｇから単離された好熱性嫌気性細菌である（Ｌｕｉ，Ｓ．Ｙ．；Ｇｈｅｒａｒｄｉｎｉ，Ｆ．Ｃ．；Ｍａｔｕｓｃｈｅｋ，Ｍ．；Ｂａｈｌ，Ｈ．；Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．「Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｌａｒｇｅ Ｓ−ｌａｙｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｘｙｌａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ ｓｔｒａｉｎ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１５３９−１５４７，１９９６；Ｍａｉ，Ｖ．；Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ，ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：４８１７−４８２１，２０００）。この株は、３０℃〜６６℃の範囲の温度および３．８５〜６．５の範囲のｐＨにおいて増殖する。この株は、単糖類であるグルコースおよびキシロース、二糖類であるセロビオースおよびスクロース、ならびに、多糖類であるキシランおよび澱粉を含めた、種々のバイオマス由来の基質を消費するが、セルロースは消費しない。この生物は、エタノール、ならびに、有機酸である乳酸および酢酸を、一次醗酵生成物として生成する。
【００２９】
（クローニングおよび配列決定）
乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ｌｄｈ）遺伝子、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔｄ）遺伝子およびアセテートキナーゼ（ａｃｋ）遺伝子を、Ｌ−ｌｄｈについてこれまでに報告されたような標準的な方法（Ｄｅｓａｉ、２００４）を用いて、同定および配列決定した。ＣＯＤＥ−ＨＯＰアルゴリズム（Ｒｏｓｅ，Ｔ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．；Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ，Ｓ．；ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｃ．；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．「Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｈｙｂｒｉｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｔａｎｔｌｙ−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（７）：１６２８−１６３５，１９９８年４月１日）を用いて変質プライマーを作製し、そして、ＰＣＲ反応を行って、保存された領域の間のＤＮＡ配列を得た。この保存された領域の外側の遺伝子フラグメントを、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキットｖ３．１（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と共にＴｈｅｒｍｏＦｉｄｅｌａｓｅ（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）酵素を用いて、ゲノムＤＮＡから直接配列決定した。
【００３０】
（適切なベクターの構築）
（アセテートキナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼノックアウトベクター、ｐＳＧＤ９）
標準的なクローニング技術に従った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）。６．２ｋｂの自殺ベクターｐＳＧＤ９は、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づき、これまでに報告されたものに類似する設計アプローチを用いた（Ｄｅｓａｉ、２００４；Ｍａｉ、２０００）。ｐｔａ／ａｃｋ配列の遺伝子フラグメント（ｐｔａ−上流（約１．２ｋｂ）およびａｃｋ−下流（約０．６ｋｂ））を、配列番号１〜２および配列番号３〜４のプライマー対を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅を行い、そして、このフラグメントを、１％電気泳動ゲルから抽出した。次いで、このフラグメント（ｐｔａ−上流およびａｃｋ−下流）に、Ｔａｑポリメラーゼを用いてＡテイルを付加し、そして、ＴＯＰＯ ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。ｐＩＫＭ１のＰｓｔＩ／ＸｂａＩ消化からカナマイシンマーカーを含む１．５ｋｂフラグメントを得て、これをｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）にサブクローニングした。ｐｔａ−上流を含むＴＯＰＯを、ＸｈｏＩ／ＢｓｉＨＫＡＩで消化し、そしてこれを、ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ消化したｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）の、先にサブクローニングしたカナマイシンマーカーの上流にサブクローニングした。ａｃｋ−下流を含むＴＯＰＯを、ＸｂａＩ／ＳｐｈＩで消化し、そしてこれを、ｐＵＣ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ａｃｋ−下流を含むＸｂａｌ／ＡｆｌＩＩＩフラグメントを消化し、そしてこれをカナマイシンマーカーの下流にサブクローニングして、最終構築物であるｐＳＧＤ９を得た。
【００３１】
（エリスロマイシン耐性を有する乳酸デヒドロゲナーゼノックアウトベクター、ｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ）
５．５ｋｂの自殺ベクターｐＳＧＤ−Ｅｒｍは、Ｄｅｓａｉら、２００４によって生成されたようなプラスミドｐＳＧＤ８に基づいた。ａｐｈカナマイシン抗生物質マーカーの代わりに、ｐＩＫＭ１に由来するａｐｈプロモーターと、プラスミドｐＣＴＣ１（Ｋｌａｐａｔｃｈ，Ｔ．Ｒ．；Ｇｕｅｒｉｎｏｔ，Ｍ．Ｌ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ」、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（６）：３４２−７，１９９６年６月）に由来するエリスロマイシン耐性を付与するアデニンメチラーゼ遺伝子とに基づく融合遺伝子を選択のために使用した。ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔａｔｅｇｅｎｅ）と、ａｐｈプロモーターについては配列番号５〜６のプライマーとを、そして、アデニンメチラーゼオープンリーディングフレームについては配列番号７〜８のプライマーとを用いて、ＰＣＲ遺伝子フラグメントを作製した。このフラグメントを、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ（ａｐｈフラグメント）およびＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（アデニンメチラーゼ）を用いて消化し、そして、ｐＩＫＭ１のマルチプルクローニングサイトにライゲーションした。次いで、この融合遺伝子を、ＢｓｅＲＩ／ＥｃｏＲＩで切除し、そして、同様に消化したｐＳＧＤ８内にライゲーションした。
【００３２】
（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの形質転換）
交換可能な２つの方法（第一の方法は、以前に記載された方法（Ｍａｉ，Ｖ．；Ｌｏｒｅｎｚ，Ｗ．；Ｗｅｉｇｅｌ，Ｊ．「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄ ＰＩＫＭ１ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４８：１６３−１６７，１９９７）であり、第二の方法は、細胞の収穫後にいくつかの改変を加えたものであり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍについて開発された方法に基づくもの（Ｔｙｕｒｉｎ，Ｍ．Ｖ．；Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（２）：８８３−８９０，２００４）であった）を用いて、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの形質転換を行った。予め還元した培地ＤＳＭＺ １２２を用いて、５５℃に維持したインキュベーター内の嫌気性の区画の内側に置いた滅菌の使い捨て培養チューブにおいて、細胞を一晩増殖させた。その後、細胞を、分けて、４μｇ／ｍｌのイソニコチン酸ヒドラジド（イソニナイアシン）と共に培養し、最初の遅延期の後に、この培地に、細胞壁細胞壁弱化剤（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｗｅａｋｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｊ．；Ｂｏｓｃｈｌｏｏ，Ｊ．Ｇ．；ｄｅ Ｂｏｎｔ，Ｊ．Ａ．Ｍ．「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ． ａｕｒｕｍ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ，ｌｙｓｏｚｙｍｅ ａｎｄ ｉｓｏｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒａｚｉｄｅ ｉｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７２，２２１−２２４，１９９０）を加えた。指数増殖期の細胞を収穫し、そして、予め還元し冷やした滅菌の２００ｍＭセロビオース溶液で洗浄し、そして、同じ溶液中に再懸濁して、氷上に維持した。細胞を収穫した後は、遠心分離の間の時間を含めていつ何時も、細胞を冷やした状態（約４℃）に維持することに最大の注意を払った。
【００３３】
９０μｌの細胞懸濁液と、パルス波を加える直前に添加した２〜６μｌのｐＳＧＤ９またはｐＳＤＧ８−Ｅｒｍ（１〜３μｇ）とから構成されるサンプルを、電気による形質転換用のキュベットとしてはたらく、２ｍｌのポリプロピレン製の微小遠心分離使い捨てチューブ内に入れた。注文製のパルス発生器／チタン電極システムを用いて、１０ｍｓに設定したパルス長を有する四角波を加えた。パルス電圧を２００Ｖの増分で線形的に増加させるときの、細胞サンプルにおける電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｅ）の形成に対応する電圧の閾値を、非線形の電流変化として評価した。所定のＤＮＡ濃度において、形質転換収量 対 細胞生存率の最良の比率を与えた特定の電圧（この特定の場合においては、２５ｋＶ／ｃｍであった）を使用した。パルス波を加えた細胞を、まず、５００μｌのＤＳＭ １２２培地で希釈し、氷上に１０分間保持し、次いで、５５℃にて４〜６時間回復させた。回復させた後、ｐＳＧＤ９で形質転換した細胞を、７５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２％寒天培地と混合し、そして、ペトリ皿上に注ぎ、嫌気性ジャー内で４日間インキュベートした。ｐＳＧＤ８−Ｅｒｍで形質転換した細胞を、４８℃にて４〜６時間回復させ、そして、５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するｐＨ６．０の２％寒天培地中、または、類似の液体培地中のいずれかにプレーティングし、そして、４８℃の嫌気性ジャー内で６日間インキュベートした。形質転換した細胞株のいずれかを、さらに操作することなく使用し得る。しかし、第二の（次の）形質転換を行うことによって、有機酸を生成する能力を付与する全ての遺伝子の発現を排除した生物を得た。この第二の形質転換は、形質転換していない細胞の懸濁物を、最初の形質転換体で置き換えて、上記のようにして行った。第二の形質転換体であるＡＬＫ１を、カナマイシンおよびエリスロマイシンの両方を含有する培地において増殖させた。
【００３４】
（ノックアウト領域の配列決定）
部位特定ノックアウト領域の配列決定を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、および、ゲノムと自殺ベクターとの間の相同性のオーバーラップ領域の外側のプライマーを用いる、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲにより行った。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキットｖ３．１（ＡＢＩ，Ｐｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いた配列決定のために、ＰＣＲ生成物の内側のプライマーを用いた。ＣＡＰ３ソフトウェアプログラム（Ｈｕａｎｇ，Ｘ．「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｇｒａｍ」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３：２１−３１，１９９６）を用いてこれらの領域を整え、そして、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズム（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．；Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｊ．；Ｆｕｃｈｓ，Ｒ．「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ），８（２）：１８９−１９１，１９９２）を用いて予想されるＤＮＡ配列と比較した。実験的に編成した配列と、公知の野生型および自殺ベクターの配列を元にした予想配列との間には、高い程度の相同性（同一性％）が存在した（図３および４）。
【００３５】
「同一性」とは、核酸分子対またはアミノ酸分子対の間の比較をいう。配列同一性を決定するための方法は公知である。例えば、この目的のために一般に用いられるコンピュータープログラム（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９のアルゴリズムを使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））を参照のこと。
【００３６】
（変異株の検証）
変異株Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ１（「ＡＬＫ１」）由来のゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定により、Ｌ−ｌｄｈおよびｐｔａ／ａｃｋ遺伝子座において予想された部位特定相同組換えを示した。両方の組込み事象は、二重組込みであり、これは、より遺伝的に安定な遺伝子型である。
【００３７】
（実施例２ ＡＬＫ１および野生型Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによるエタノールの生成を示す比較データ）
Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍを、２．５ｇ／Ｌの酵母抽出物を含有する部分的に規定されたＭＴＣ培地（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅｓ」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５：２１９−２２２，２００３）中で増殖させた。グルコース、キシロース、酢酸、乳酸およびエタノールを、５５℃においてＡｍｉｎｅｘ ８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上のＨＰＬＣにより分析した。移動相は、５ｍＭ スルホン酸から構成され、流速は０．７ｍｌ／分であった。Ｗａｔｅｒｓ ４１０屈折計（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、屈折率により検出を行った。酢酸についての最小の検出レベルは１．０ｍＭであった。５ｇ／Ｌのキシロース、５ｇ／Ｌの乳酸、５ｇ／Ｌの酢酸および５ｇ／Ｌのエタノールを含有する標準追跡物を、図５に示す。
【００３８】
ＡＬＫ１株は、１７ｇ／Ｌまでのキシロース、または、５ｇ／Ｌのキシロースおよび５ｇ／Ｌのグルコースを含むエタノールのみを生成し、有機酸または他の生成物はＨＰＬＣにより検出されなかった。図６は、ＡＬＫ１株の０時間における醗酵を示し、そして、図７は、ＡＬＫ１株の７２時間における醗酵を示す。６．０の初期ｐＨ、５５℃および１００ｒｐｍでの、８ｇ／ＬのＭＥＳで緩衝化したキシロース培地における、ＡＬＫ１株および野生型の経時的な醗酵のプロットは、ＡＬＫ１株が９９％を超えるキシロースをエタノールへと変換し得ること（図８）、一方で、同じ条件下の野生型は、有機酸の生成に起因してｐＨの制限を受け、存在する全てのキシロースを消費できないこと（図９）を示す。野生型の生物は、０．１５ｍＭのエタノールを得、一方で、ＡＬＫ１は、０．４６ｍＭのエタノールを得た。
【００３９】
（実施例３ ＡＬＫ１の進化）
図１０に示されるように、補給する基質濃度を経時的に増加させる連続培養を利用して、ＡＬＫ１に刺激を与えた。図１０は、連続培養の間の、キシロース、キシルロースおよびエタノールの濃度を示す。このストレス−進化サイクルに対して１０００時間を超えて曝露した後、改善された株ＡＬＫ２を、醗酵培養液から単離した。ＡＬＫ２は、大量培養中、５０ｇ／Ｌのキシロースにおいて増殖を開始し得た。図１１は、ＡＬＫ２株による醗酵の間のキシロース、有機酸、光学濃度（ＯＤ）およびエタノール濃度を示す。
【００４０】
（ＡＬＫ１の寄託）
ＡＬＫ１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９）に寄託されている。この寄託は、２００５年１１月１日になされ、特許寄託指定番号ＰＴＡ−７２０６を受けた。この寄託は、ブダペスト条約の要件（寄託期間は、寄託の日から３０年間、または最新の分譲請求後５年間、または、本願の出願から米国特許の強制力のある期間が満了するまで、のいずれか長い方であるべきである）に従ってなされた。ＡＬＫ１は、寄託当局において生存できない状態となった場合には、補充される。
【００４１】
特定の実施形態の説明は、一般的な概念を明らかにし、この一般的な概念は、他の者が、この一般的な概念から逸脱しない種々の用途または使用のために修正および／または適合し得る。したがって、このような適合および修正は、開示される実施形態の等価物の意味および範囲内であるものと理解されることが意図される。本明細書において使用される語法または用語法は、説明する目的のためのものであり、制限するものではないことが理解されるべきである。
【００４２】
上記の実施例は、あらゆるグラム陽性細菌、特に、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属のメンバー（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｈａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｏｔｅａｒｏｅｎｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｆｙｔｉｃｕｍおよびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｆｙｔｉｃｕｍを含む）と共に使用するために適切に改変され得る。
【００４３】
本願において言及される全ての参考文献は、まるで本明細書において完全に模写されるかのような程度まで、参考として援用される。
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国特許出願第６０／７３１，６７４号（２００５年１０月３１日出願）および米国特許出願第６０／７９６，３８０号（２００６年５月１日出願）に対する優先権を主張し、これら特許出願の各々は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府の権利）
本発明の進展に関する研究がＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＩＳＴ）契約番号６０ＮＡＮＢ１Ｄ００６４によって資金援助されたので、米国政府は、本発明において一定を権利を有し得る。
【０００３】
（背景）
（１．発明の分野）
本発明は、エタノールを生成するためのバイオマス処理の分野に関する。特に、種々のバイオマス由来の基質を消費しかつ高収量でエタノールを生成する新規な好熱性生物、ならびに上記生成のプロセスおよび上記生物の使用が開示される。
【背景技術】
【０００４】
（２．関連技術の説明）
バイオマスは、安価でかつ容易に入手可能なセルロース分解基質の代表であり、この基質から糖が生成され得る。これら糖は、単独で使用されてもよいし、アルコールおよび他の生成物を生成するために醗酵されてもよい。生物変換生成物の中で、エタノールにおける関心は高い。なぜなら、エタノールは、再生可能家庭用燃料（ｒｅｎｅｗａｂｌｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｆｕｅｌ）として使用され得るからである。
【０００５】
反応器設計、前処理プロトコールおよび分離技術の分野でかなりの研究が行われてきた。その結果、生物変換プロセスは、石油燃料技術と経済的に競争できる関係になっている。しかし、最大の費用削減は、２つ以上の処理工程を組み合わせたときに得られ得ると予測される。例えば、同時に存在する糖化と醗酵（ＳＳＦ）、および同時に存在する糖化と並行醗酵（ｃｏ−ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＳＳＣＦ）プロセスとを併用すると、１つの反応器または連続処理装置において酵素的糖化工程と醗酵とが一体となって行われる。より短期間の発酵時間および資本金縮小に関連する費用削減に加えて、並行醗酵プロセスはまた、生成物収量の改善を提供し得る。なぜなら、別の方法では代謝的分解（ｍｅｔａｂｏｌｙｓｉｓ）または加水分解を阻害するレベルにまで蓄積してしまう特定の化合物が、並行醗酵生物によって消費されるからである。１つのこのような例において、β−グルコシダーゼは、グルコースの存在下でセロビオースを加水分解するのをやめてしまい、次には、セロビオースの蓄積が、セルロース分解を妨げる。セルロースおよびヘミセルロースの加水分解生成物の並行醗酵に伴うＳＳＣＦプロセスは、β−グルコシダーゼの加水分解活性を阻害しない１種以上の生成物へとグルコースを変換することによって、この課題を多少解決し得る。
【０００６】
統合バイオプロセス処理（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）（ＣＢＰ）は、４つの生物媒介事象（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｖｅｎｔｓ）を伴う：（１）酵素生成、（２）基質加水分解、（３）ヘキソース醗酵および（４）ペントース醗酵。これら事象は、１つの工程において行われ得る。このストラテジーは、セルロースおよびヘミセルロースを利用する微生物を要する。ＣＢＰ生物の開発は、専ら特定の目的のための（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）処理工程において糖分解性酵素を生成するという、より従来のアプローチと比較して、潜在的に非常に多額の費用削減を生じ得る。１種より多い生物を利用して上記４つの生物媒介事象を達成するＣＢＰプロセスは、統合バイオプロセス処理並行培養醗酵（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）といわれる。
【０００７】
いくらかの細菌は、ペントース糖をヘキソース糖に変換し、かつそのヘキソースを有機酸と解糖による他の生成物との混合物へと醗酵する能力を有する。上記解糖経路は、６炭のグルコース分子を２つの３炭素分子であるピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）に変換することで始まる。次いで、ピルビン酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（「ｌｄｈ」）の作用によって乳酸へと変換され得るか、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼもしくはピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼの作用によってアセチルコエンザイムＡ（「アセチル−ＣｏＡ」）へと変換され得る。アセチル−ＣｏＡはさらに、ホスホトランスアセチラーゼおよびアセテートキナーゼによって酢酸へと変換されるか、またはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（「ＡｃＤＨ」）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（「ａｄｈ」）によってエタノールへと還元される。全般的に、エタノール生成生物の能力は、エタノール以外の有機生成物の生成によって（特に、ピルビン酸から乳酸へのｌｄｈ媒介変換によって、およびホスホトランスアセチラーゼおよびアセテートキナーゼによるアセチル−ＣｏＡから酢酸への変換によって）損なわれる。
【０００８】
細菌の代謝的操作によって、好熱性嫌気性グラム陽性細菌Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍにおいて乳酸デヒドロゲナーゼのノックアウトが近年作り出された。非特許文献１を参照のこと。
【０００９】
上記ｌｄｈのノックアウトは、当該分野においてある進歩を与えているものの、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのこの株が、有機酸（特に酢酸）を作り続ける点において、この生物のいくらかの用途にとっては問題である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｇｕｅｒｉｎｏｔ，Ｍ．Ｌ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｌ−ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５」Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：６００−６０５，２００４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の手段は、種々のバイオマス由来の物質を消費し、そして、理論収量に近いエタノールを生成する好熱性嫌気性細菌を提供することによって、当該分野においてある進歩を与え、上記に概説する問題を克服する。生物を使用してエタノールを生成するための方法もまた開示される。
【００１２】
本明細書において報告される手段は、単独でまたは組み合わせてのいずれかでの種々の遺伝子のノックアウトをもたらし、ネイティブの生物におけるこのような遺伝子は、ノックアウトされなければ、有機酸の形成をもたらす。例えば、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５における（ａ）アセテートキナーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼ、ならびに（ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）、アセテートキナーゼ（ａｃｋ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔｄ）のノックアウトが存在し得る。本明細書において報告される結果は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍについてのものであるが、これらの方法および材料はまた、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｏｔｅａｒｏｅｎｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍおよびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍを含むＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の他のメンバーにも適用される。これらの方法および材料は、代謝的操作された好熱性グラム陽性細菌の分野全般において有用である。
【００１３】
１つの実施形態において、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現しない単離された生物は、セルロース分解基質を醗酵して、理論収量の少なくとも９０％である濃度においてエタノールを生成する。
【００１４】
１つの実施形態において、ネイティブの状態において、醗酵生成物として酢酸を生成する能力をグラム陽性細菌に付与する少なくとも１種の遺伝子を含むグラム陽性細菌は、この少なくとも１種の遺伝子の発現を排除するように形質転換される。この細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｆｙｔｉｃｕｍのようなＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒであり得る。醗酵生成物として酢酸を生成する能力をグラム陽性細菌に付与する遺伝子は、アセテートキナーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼの発現をコードし得る。
【００１５】
別の実施形態において、グラム陽性細菌は、醗酵生成物として乳酸を生成する能力をグラム陽性細菌に付与する１種以上の遺伝子の発現を排除するようにさらに形質され得る。例えば、乳酸を生成する能力を付与する遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼであり得る。
【００１６】
１つの実施形態において、エタノールを生成するための方法は、ネイティブの生物を形質転換して、醗酵生成物として有機酸を生成する能力をグラム陽性細菌に付与する全ての遺伝子の発現を排除するように形質転換されたグラム陽性細菌を生成して、形質転換細菌宿主を生成する工程、ならびにこの形質転換細菌宿主を、グルコース、キシロース、セロビオース、スクロース、キシラン、澱粉およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、これらの基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程を包含する。
【００１７】
１つの実施形態において、ＡＬＫ１と称され、かつ特許寄託指定番号ＰＴＡ−７２０６の下でＡＴＣＣに寄託されている微生物の生物学的に純粋な培養物が記載される。
【００１８】
１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１０の配列、または（ｂ）配列番号９および配列番号１０の配列、または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列を含む。（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の単離されたポリヌクレオチドの相補体を発現するように遺伝子操作された宿主細胞が記載される。別の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１９】
１つの実施形態において、エタノールを生成する方法は、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の単離されたポリヌクレオチドの相補体を発現する変異細菌を、グルコース、キシロース、セロビオース、スクロース、キシラン、澱粉およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質を含有する培地中で、これらの基質をエタノールへと醗酵させることを可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程を包含する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
セルロース分解基質を醗酵して、理論収量の少なくとも９０％である濃度においてエタノールを生成する単離された生物であって、該生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現しない、単離された生物。
（項目２）
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
ネイティブの生物を形質転換して、項目１に記載の単離された生物を生成し、形質転換宿主を提供する工程；ならびに
該形質転換宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、該基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
（項目３）
形質転換生物であって、該形質転換生物は、
ネイティブの状態において、醗酵生成物として酢酸を生成する能力を付与する少なくとも１種の遺伝子を含むグラム陽性細菌
を含み、
該グラム陽性細菌は、該少なくとも１種の遺伝子の発現を排除するように形質転換されている、
形質転換生物。
（項目４）
上記グラム陽性細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属のメンバーである、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目５）
上記グラム陽性細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目６）
上記少なくとも１種の遺伝子は、アセテートキナーゼの発現をコードする、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目７）
上記少なくとも１種の遺伝子は、ホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目８）
上記少なくとも１種の遺伝子は、複数種の遺伝子を含む、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目９）
上記複数種の遺伝子は、アセテートキナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、項目８に記載のグラム陽性細菌。
（項目１０）
上記グラム陽性細菌に醗酵生成物として乳酸を生成する能力を付与する１種以上の遺伝子の発現を排除するように、さらに形質転換されている、項目９に記載のグラム陽性細菌。
（項目１１）
上記グラム陽性細菌に醗酵生成物として乳酸を生成する能力を付与する１種以上の遺伝子の発現を排除するように、さらに形質転換されている、項目３に記載のグラム陽性細菌。
（項目１２）
上記少なくとも１種の遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼの発現をコードする、項目１１に記載のグラム陽性細菌。
（項目１３）
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
ネイティブの生物を形質転換して、項目１１に記載のグラム陽性細菌を生成し、形質転換細菌宿主を生成する工程；ならびに
該形質転換細菌宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、該基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
（項目１４）
上記細菌宿主は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、およびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
ＡＬＫ１と称されかつ特許寄託指定番号ＰＴＡ−７２０６の下で寄託されている微生物の生物学的に純粋な培養物。
（項目１７）
単離されたポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１０の配列；
（ｂ）配列番号９および配列番号１０の配列；または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列
を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目１８）
上記（ａ）または（ｂ）の配列に対して約９５％の配列同一性を有する、項目１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１９）
項目１８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目２０）
項目１８に記載のポリヌクレオチドの相補体を発現するように遺伝子操作された宿主細胞。
（項目２１）
上記宿主細胞は細菌細胞である、項目２０に記載の宿主細胞。
（項目２２）
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
項目２１に記載の変異細菌を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質を含有する培地中で、該基質をエタノールへと醗酵させることを可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
（項目２３）
上記変異細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記変異細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＬＫ１（ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ１）である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
細菌において発現できるプロモーターに作動可能に連結された配列番号１０を含む、遺伝子構築物。
（項目２６）
項目２５に記載の遺伝子構築物を含む、組換え細菌。
（項目２７）
上記細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、項目２６に記載の組換え細菌。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、解糖経路の反応を示す。
【図２】図２は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの種々のノックアウト株と比較した、野生型のＴ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍにおける水素生成を示す。
【図３−１】図３は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ９のｌｄｈ領域（配列番号９）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図３−２】図３は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ９のｌｄｈ領域（配列番号９）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図３−３】図３は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ９のｌｄｈ領域（配列番号９）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図３−４】図３は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ９のｌｄｈ領域（配列番号９）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図３−５】図３は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ９のｌｄｈ領域（配列番号９）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−１】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−２】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−３】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−４】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−５】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図４−６】図４は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノム内に挿入された自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍのｐｔａ／ａｃｋ領域（配列番号１０）についての、実験により生成したポリヌクレオチド配列と、予想されるポリヌクレオチド配列との比較を示す。
【図５】図５〜７は、ＡＬＫ１の増殖の間の、種々の時間間隔における醗酵培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の追跡を示す。
【図６】図５〜７は、ＡＬＫ１の増殖の間の、種々の時間間隔における醗酵培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の追跡を示す。
【図７】図５〜７は、ＡＬＫ１の増殖の間の、種々の時間間隔における醗酵培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の追跡を示す。
【図８】図８は、ＡＬＫ１株による醗酵の間の、キシロース、有機酸およびエタノールの濃度を示す。
【図９】図９は、野生型Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによる醗酵の間の、キシロース、有機酸およびエタノールの濃度を示す。
【図１０】図１０は、ＡＬＫ１の連続培養刺激の間の、キシロース、有機酸およびエタノールの濃度を示す。
【図１１】図１１は、ＡＬＫ２株による醗酵の間の、キシロース、有機酸およびエタノールの濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（詳細な説明）
ここで、バイオマスのエタノールへの変換において好熱性嫌気性グラム陽性細菌を操作および利用するための方法が示され、かつ記載される。
【００２２】
本明細書において使用される場合、生物は、その生物の遺伝子および／または表現型の構成を意図的に変更する様式で人間の手によって遺伝子操作または他の方法で操作されていない場合、「ネイティブの状態」にある。例えば、野生型の生物は、ネイティブの状態にあると考えられ得る。
【００２３】
ネイティブの状態のＴ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍからの有機酸の生成の完全なる排除は、２回の部位特定ＤＮＡ相同組換え事象を用いて達成された。変異株であるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ１（「ＡＬＫ１」）は、約３０℃〜６６℃の範囲の温度および約３．８５〜６．５の範囲のｐＨの大量培養において、少ない基質の補給で、理論量に近いエタノールを生成する。１つの実施形態において、エタノール収量は、理論最大量の少なくとも約９０％である。ＡＬＫ１およびその子孫（ｄｅｃｅｎｄｅｎｔ）は、その増殖条件に起因して、リグノセルロース系（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ）バイオマスからのエタノールへの変換において有意な費用削減に寄与する潜在能力を有する。この増殖条件は、同時に存在する糖化および平行醗酵（ＳＳＣＦ）プロセスにおけるセルラーゼ活性が実質的に最適である。例えば、最適なセルラーゼ活性のパラーメータとしては、４〜５の間のｐＨと４０℃〜５０℃の間の温度が挙げられる。さらに、有機酸を生成する能力を欠くノックアウト生物が使用される場合は、醗酵培養液のｐＨを調整する必要はない。ＡＬＫ１および類似する生物はまた、統合バイオプロセス処理並行培養醗酵に適切であり得、この統合バイオプロセス処理並行培養醗酵においては、ノックアウト生物が、ペントースをエタノールへと変換し、そして、セルロースが、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのようなセルロース加水分解生物によって分解される。
【００２４】
好熱性の温度においてＳＳＣＦプロセスまたはＣＢＰプロセスのいずれかを行うことにより、３従来の０℃〜３７℃の中温性の醗酵温度を上回るいくつかの重要な利益が提供される。特に、セルラーゼ生成専用のプロセス工程のための費用が、好熱性のＳＳＣＦについては実質的に削減され（例えば、２倍以上）、そして、ＣＢＰについては排除される。醗酵槽（ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）の冷却そしてまた醗酵前後の熱交換に付随する費用もまた、好熱性のＳＳＣＦおよびＣＢＰの両方について削減されることが予想される。最後に、好熱性の生体触媒を特徴とするプロセスは、従来の中温性の生体触媒を特徴とするプロセスと比較して、細菌混入に対する感受性が低下し得る。
【００２５】
天然に存在するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、ならびに、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの組換え株のような公知の「ホモエタノール醗酵」微生物とは対照的に、本明細書により開示される生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの作用によるピルビン酸のアセトアルデヒドへの変換に依存しない（図１、９）。実際、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌は、ネイティブの状態でピルビン酸デカルボキシラーゼを発現しない。図１に示す解糖経路の反応から、酵素ピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼ（２）によって、ピルビン酸がアセチル−ＣｏＡ、二酸化炭素および還元フェレドキシンへと代謝され得ることが観察され得る。しかし、エタノールを唯一の醗酵生成物として生成するために、ＮＡＤ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（３）によって、還元フェレドキシンにより運搬される電子が全て、ＮＡＤへと転移され、ＮＡＤＨＡを形成しなければならない。ＮＡＤＨは、その後、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（７）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（８）によるアセチル−ＣｏＡのエタノールへの２段階の還元の過程で、酸化されてＮＡＤへと戻る。ＮＡＤＨの効率的な利用の証拠は、図２において、ａｃｋおよびｐｔａを発現できないアセテートノックアウト生物と、ａｃｋ、ｐｔａおよびｌｄｈを発現できない二重ノックアウト生物（ＡＬＫ１）との両方によるＨ２生成の減少として、観察され得る。これらの生物は、還元フェレドキシンからＮＡＤへの、そして、その後のエタノールへの化学量論に関する電子の転移という第一の論証を提供する。
【００２６】
ＰＤＣを発現する能力を有さない生物において化学量論に関するエタノール収量を生成する上記の経路は、これまでに記載されてきたホモエタノール醗酵株において用いられる経路とは対照的である。これまでに記載されてきた株は、内因性のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）を利用するか、または、外因性のＰＤＣを発現するように操作される。ＰＤＣの発現は、微生物界においては稀なことであるので、改変によって、電子の流れを炭素の流れへと方向を変える能力は、広範な影響を有する。例えば、このアプローチは、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｔｙｔｉｃｕｍ以外の株において高いエタノール収量を生成するため、そして／または、エタノール以外の溶媒を生成するために使用され得る。特に、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｅｒ属のメンバー；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍならびに他の好熱性および中温性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ種；好熱性および中温性のＢａｃｉｌｌｕｓ種のようなグラム陽性細菌；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ；Ｆｉｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓおよび他のＦｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｔｈｅｒｍｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａおよび他のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ種；ならびに嫌気性菌門（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｔｉｘ種およびＰｉｒｏｍｙｃｅｓ種を含む）のようなグラム陰性細菌は、ＰＤＣを発現する能力を欠き、そして、開示される手段から利益を受け得る。
【００２７】
リグノセルロース系の物質が、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナンおよび澱粉のうちの１種以上を含有する任意の補給ストックであり得ることが理解される。種々の実施形態において、リグノセルロース系バイオマスは、木、トウモロコシ飼料、おが屑、樹皮、葉、農林業の残留物、アメリカクサキビのような草、反芻動物の消化産物、市の廃棄物、製紙工場の流出物、新聞紙、ボール紙、またはこれらの組み合わせを含む。
【実施例】
【００２８】
（実施例１ ＡＬＫ１株の生成）
（材料および方法）
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ株であるＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５（ＤＳＭ ８６９１）は、Ｗｅｓｔ Ｔｈｕｍｂ Ｂａｓｉｎ ｉｎ Ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｒｋ， Ｗｙｏｍｉｎｇから単離された好熱性嫌気性細菌である（Ｌｕｉ，Ｓ．Ｙ．；Ｇｈｅｒａｒｄｉｎｉ，Ｆ．Ｃ．；Ｍａｔｕｓｃｈｅｋ，Ｍ．；Ｂａｈｌ，Ｈ．；Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．「Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｌａｒｇｅ Ｓ−ｌａｙｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｘｙｌａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ ｓｔｒａｉｎ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１５３９−１５４７，１９９６；Ｍａｉ，Ｖ．；Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ，ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：４８１７−４８２１，２０００）。この株は、３０℃〜６６℃の範囲の温度および３．８５〜６．５の範囲のｐＨにおいて増殖する。この株は、単糖類であるグルコースおよびキシロース、二糖類であるセロビオースおよびスクロース、ならびに、多糖類であるキシランおよび澱粉を含めた、種々のバイオマス由来の基質を消費するが、セルロースは消費しない。この生物は、エタノール、ならびに、有機酸である乳酸および酢酸を、一次醗酵生成物として生成する。
【００２９】
（クローニングおよび配列決定）
乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ｌｄｈ）遺伝子、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔｄ）遺伝子およびアセテートキナーゼ（ａｃｋ）遺伝子を、Ｌ−ｌｄｈについてこれまでに報告されたような標準的な方法（Ｄｅｓａｉ、２００４）を用いて、同定および配列決定した。ＣＯＤＥ−ＨＯＰアルゴリズム（Ｒｏｓｅ，Ｔ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．；Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ，Ｓ．；ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｃ．；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．「Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｈｙｂｒｉｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｔａｎｔｌｙ−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（７）：１６２８−１６３５，１９９８年４月１日）を用いて変質プライマーを作製し、そして、ＰＣＲ反応を行って、保存された領域の間のＤＮＡ配列を得た。この保存された領域の外側の遺伝子フラグメントを、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキットｖ３．１（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と共にＴｈｅｒｍｏＦｉｄｅｌａｓｅ（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）酵素を用いて、ゲノムＤＮＡから直接配列決定した。
【００３０】
（適切なベクターの構築）
（アセテートキナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼノックアウトベクター、ｐＳＧＤ９）
標準的なクローニング技術に従った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）。６．２ｋｂの自殺ベクターｐＳＧＤ９は、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づき、これまでに報告されたものに類似する設計アプローチを用いた（Ｄｅｓａｉ、２００４；Ｍａｉ、２０００）。ｐｔａ／ａｃｋ配列の遺伝子フラグメント（ｐｔａ−上流（約１．２ｋｂ）およびａｃｋ−下流（約０．６ｋｂ））を、配列番号１〜２および配列番号３〜４のプライマー対を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅を行い、そして、このフラグメントを、１％電気泳動ゲルから抽出した。次いで、このフラグメント（ｐｔａ−上流およびａｃｋ−下流）に、Ｔａｑポリメラーゼを用いてＡテイルを付加し、そして、ＴＯＰＯ ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。ｐＩＫＭ１のＰｓｔＩ／ＸｂａＩ消化からカナマイシンマーカーを含む１．５ｋｂフラグメントを得て、これをｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）にサブクローニングした。ｐｔａ−上流を含むＴＯＰＯを、ＸｈｏＩ／ＢｓｉＨＫＡＩで消化し、そしてこれを、ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ消化したｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）の、先にサブクローニングしたカナマイシンマーカーの上流にサブクローニングした。ａｃｋ−下流を含むＴＯＰＯを、ＸｂａＩ／ＳｐｈＩで消化し、そしてこれを、ｐＵＣ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ａｃｋ−下流を含むＸｂａｌ／ＡｆｌＩＩＩフラグメントを消化し、そしてこれをカナマイシンマーカーの下流にサブクローニングして、最終構築物であるｐＳＧＤ９を得た。
【００３１】
（エリスロマイシン耐性を有する乳酸デヒドロゲナーゼノックアウトベクター、ｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ）
５．５ｋｂの自殺ベクターｐＳＧＤ−Ｅｒｍは、Ｄｅｓａｉら、２００４によって生成されたようなプラスミドｐＳＧＤ８に基づいた。ａｐｈカナマイシン抗生物質マーカーの代わりに、ｐＩＫＭ１に由来するａｐｈプロモーターと、プラスミドｐＣＴＣ１（Ｋｌａｐａｔｃｈ，Ｔ．Ｒ．；Ｇｕｅｒｉｎｏｔ，Ｍ．Ｌ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ」、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（６）：３４２−７，１９９６年６月）に由来するエリスロマイシン耐性を付与するアデニンメチラーゼ遺伝子とに基づく融合遺伝子を選択のために使用した。ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔａｔｅｇｅｎｅ）と、ａｐｈプロモーターについては配列番号５〜６のプライマーとを、そして、アデニンメチラーゼオープンリーディングフレームについては配列番号７〜８のプライマーとを用いて、ＰＣＲ遺伝子フラグメントを作製した。このフラグメントを、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ（ａｐｈフラグメント）およびＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（アデニンメチラーゼ）を用いて消化し、そして、ｐＩＫＭ１のマルチプルクローニングサイトにライゲーションした。次いで、この融合遺伝子を、ＢｓｅＲＩ／ＥｃｏＲＩで切除し、そして、同様に消化したｐＳＧＤ８内にライゲーションした。
【００３２】
（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの形質転換）
交換可能な２つの方法（第一の方法は、以前に記載された方法（Ｍａｉ，Ｖ．；Ｌｏｒｅｎｚ，Ｗ．；Ｗｅｉｇｅｌ，Ｊ．「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄ ＰＩＫＭ１ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４８：１６３−１６７，１９９７）であり、第二の方法は、細胞の収穫後にいくつかの改変を加えたものであり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍについて開発された方法に基づくもの（Ｔｙｕｒｉｎ，Ｍ．Ｖ．；Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（２）：８８３−８９０，２００４）であった）を用いて、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの形質転換を行った。予め還元した培地ＤＳＭＺ １２２を用いて、５５℃に維持したインキュベーター内の嫌気性の区画の内側に置いた滅菌の使い捨て培養チューブにおいて、細胞を一晩増殖させた。その後、細胞を、分けて、４μｇ／ｍｌのイソニコチン酸ヒドラジド（イソニナイアシン）と共に培養し、最初の遅延期の後に、この培地に、細胞壁細胞壁弱化剤（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｗｅａｋｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｊ．；Ｂｏｓｃｈｌｏｏ，Ｊ．Ｇ．；ｄｅ Ｂｏｎｔ，Ｊ．Ａ．Ｍ．「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ． ａｕｒｕｍ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ，ｌｙｓｏｚｙｍｅ ａｎｄ ｉｓｏｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒａｚｉｄｅ ｉｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７２，２２１−２２４，１９９０）を加えた。指数増殖期の細胞を収穫し、そして、予め還元し冷やした滅菌の２００ｍＭセロビオース溶液で洗浄し、そして、同じ溶液中に再懸濁して、氷上に維持した。細胞を収穫した後は、遠心分離の間の時間を含めていつ何時も、細胞を冷やした状態（約４℃）に維持することに最大の注意を払った。
【００３３】
９０μｌの細胞懸濁液と、パルス波を加える直前に添加した２〜６μｌのｐＳＧＤ９またはｐＳＤＧ８−Ｅｒｍ（１〜３μｇ）とから構成されるサンプルを、電気による形質転換用のキュベットとしてはたらく、２ｍｌのポリプロピレン製の微小遠心分離使い捨てチューブ内に入れた。注文製のパルス発生器／チタン電極システムを用いて、１０ｍｓに設定したパルス長を有する四角波を加えた。パルス電圧を２００Ｖの増分で線形的に増加させるときの、細胞サンプルにおける電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｅ）の形成に対応する電圧の閾値を、非線形の電流変化として評価した。所定のＤＮＡ濃度において、形質転換収量 対 細胞生存率の最良の比率を与えた特定の電圧（この特定の場合においては、２５ｋＶ／ｃｍであった）を使用した。パルス波を加えた細胞を、まず、５００μｌのＤＳＭ １２２培地で希釈し、氷上に１０分間保持し、次いで、５５℃にて４〜６時間回復させた。回復させた後、ｐＳＧＤ９で形質転換した細胞を、７５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２％寒天培地と混合し、そして、ペトリ皿上に注ぎ、嫌気性ジャー内で４日間インキュベートした。ｐＳＧＤ８−Ｅｒｍで形質転換した細胞を、４８℃にて４〜６時間回復させ、そして、５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するｐＨ６．０の２％寒天培地中、または、類似の液体培地中のいずれかにプレーティングし、そして、４８℃の嫌気性ジャー内で６日間インキュベートした。形質転換した細胞株のいずれかを、さらに操作することなく使用し得る。しかし、第二の（次の）形質転換を行うことによって、有機酸を生成する能力を付与する全ての遺伝子の発現を排除した生物を得た。この第二の形質転換は、形質転換していない細胞の懸濁物を、最初の形質転換体で置き換えて、上記のようにして行った。第二の形質転換体であるＡＬＫ１を、カナマイシンおよびエリスロマイシンの両方を含有する培地において増殖させた。
【００３４】
（ノックアウト領域の配列決定）
部位特定ノックアウト領域の配列決定を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、および、ゲノムと自殺ベクターとの間の相同性のオーバーラップ領域の外側のプライマーを用いる、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲにより行った。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキットｖ３．１（ＡＢＩ，Ｐｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いた配列決定のために、ＰＣＲ生成物の内側のプライマーを用いた。ＣＡＰ３ソフトウェアプログラム（Ｈｕａｎｇ，Ｘ．「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｇｒａｍ」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３：２１−３１，１９９６）を用いてこれらの領域を整え、そして、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズム（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．；Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｊ．；Ｆｕｃｈｓ，Ｒ．「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ），８（２）：１８９−１９１，１９９２）を用いて予想されるＤＮＡ配列と比較した。実験的に編成した配列と、公知の野生型および自殺ベクターの配列を元にした予想配列との間には、高い程度の相同性（同一性％）が存在した（図３および４）。
【００３５】
「同一性」とは、核酸分子対またはアミノ酸分子対の間の比較をいう。配列同一性を決定するための方法は公知である。例えば、この目的のために一般に用いられるコンピュータープログラム（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９のアルゴリズムを使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））を参照のこと。
【００３６】
（変異株の検証）
変異株Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ１（「ＡＬＫ１」）由来のゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定により、Ｌ−ｌｄｈおよびｐｔａ／ａｃｋ遺伝子座において予想された部位特定相同組換えを示した。両方の組込み事象は、二重組込みであり、これは、より遺伝的に安定な遺伝子型である。
【００３７】
（実施例２ ＡＬＫ１および野生型Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによるエタノールの生成を示す比較データ）
Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍを、２．５ｇ／Ｌの酵母抽出物を含有する部分的に規定されたＭＴＣ培地（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅｓ」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５：２１９−２２２，２００３）中で増殖させた。グルコース、キシロース、酢酸、乳酸およびエタノールを、５５℃においてＡｍｉｎｅｘ ８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上のＨＰＬＣにより分析した。移動相は、５ｍＭ スルホン酸から構成され、流速は０．７ｍｌ／分であった。Ｗａｔｅｒｓ ４１０屈折計（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、屈折率により検出を行った。酢酸についての最小の検出レベルは１．０ｍＭであった。５ｇ／Ｌのキシロース、５ｇ／Ｌの乳酸、５ｇ／Ｌの酢酸および５ｇ／Ｌのエタノールを含有する標準追跡物を、図５に示す。
【００３８】
ＡＬＫ１株は、１７ｇ／Ｌまでのキシロース、または、５ｇ／Ｌのキシロースおよび５ｇ／Ｌのグルコースを含むエタノールのみを生成し、有機酸または他の生成物はＨＰＬＣにより検出されなかった。図６は、ＡＬＫ１株の０時間における醗酵を示し、そして、図７は、ＡＬＫ１株の７２時間における醗酵を示す。６．０の初期ｐＨ、５５℃および１００ｒｐｍでの、８ｇ／ＬのＭＥＳで緩衝化したキシロース培地における、ＡＬＫ１株および野生型の経時的な醗酵のプロットは、ＡＬＫ１株が９９％を超えるキシロースをエタノールへと変換し得ること（図８）、一方で、同じ条件下の野生型は、有機酸の生成に起因してｐＨの制限を受け、存在する全てのキシロースを消費できないこと（図９）を示す。野生型の生物は、０．１５ｍＭのエタノールを得、一方で、ＡＬＫ１は、０．４６ｍＭのエタノールを得た。
【００３９】
（実施例３ ＡＬＫ１の進化）
図１０に示されるように、補給する基質濃度を経時的に増加させる連続培養を利用して、ＡＬＫ１に刺激を与えた。図１０は、連続培養の間の、キシロース、キシルロースおよびエタノールの濃度を示す。このストレス−進化サイクルに対して１０００時間を超えて曝露した後、改善された株ＡＬＫ２を、醗酵培養液から単離した。ＡＬＫ２は、大量培養中、５０ｇ／Ｌのキシロースにおいて増殖を開始し得た。図１１は、ＡＬＫ２株による醗酵の間のキシロース、有機酸、光学濃度（ＯＤ）およびエタノール濃度を示す。
【００４０】
（ＡＬＫ１の寄託）
ＡＬＫ１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９）に寄託されている。この寄託は、２００５年１１月１日になされ、特許寄託指定番号ＰＴＡ−７２０６を受けた。この寄託は、ブダペスト条約の要件（寄託期間は、寄託の日から３０年間、または最新の分譲請求後５年間、または、本願の出願から米国特許の強制力のある期間が満了するまで、のいずれか長い方であるべきである）に従ってなされた。ＡＬＫ１は、寄託当局において生存できない状態となった場合には、補充される。
【００４１】
特定の実施形態の説明は、一般的な概念を明らかにし、この一般的な概念は、他の者が、この一般的な概念から逸脱しない種々の用途または使用のために修正および／または適合し得る。したがって、このような適合および修正は、開示される実施形態の等価物の意味および範囲内であるものと理解されることが意図される。本明細書において使用される語法または用語法は、説明する目的のためのものであり、制限するものではないことが理解されるべきである。
【００４２】
上記の実施例は、あらゆるグラム陽性細菌、特に、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属のメンバー（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｈａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｏｔｅａｒｏｅｎｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｆｙｔｉｃｕｍおよびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｆｙｔｉｃｕｍを含む）と共に使用するために適切に改変され得る。
【００４３】
本願において言及される全ての参考文献は、まるで本明細書において完全に模写されるかのような程度まで、参考として援用される。
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース分解基質を醗酵して、理論収量の少なくとも９０％である濃度においてエタノールを生成する単離された生物であって、該生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現せず、少なくとも２つの遺伝子が該生物において破壊されており、該少なくとも２つの遺伝子は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子、およびアセテートキナーゼ（ａｃｋ）遺伝子を含む、単離された生物。
【請求項２】
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
ネイティブの生物を形質転換して、請求項１に記載の単離された生物を生成し、形質転換宿主を提供する工程；ならびに
該形質転換宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、該基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
形質転換生物であって、該形質転換生物は、
ネイティブの状態において、醗酵生成物として酢酸を生成する能力を付与する２以上の遺伝子を含むグラム陽性細菌
を含み、
該グラム陽性細菌は、該２以上の遺伝子の発現を排除するように形質転換されており、該２以上の遺伝子は、アセテートキナーゼ（ａｃｋ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）をコードする、
形質転換生物。
【請求項４】
前記グラム陽性細菌は、サーモアネロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属のメンバーである、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項５】
前記グラム陽性細菌は、サーモアネロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）である、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項６】
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
ネイティブの生物を形質転換して、請求項３に記載のグラム陽性細菌を生成し、形質転換細菌宿主を生成する工程；ならびに
該形質転換細菌宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、該基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
前記細菌宿主は、サーモアネロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＡＬＫ２と称されかつ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０２５の下で寄託されている微生物の生物学的に純粋な培養物。
【請求項９】
単離されたポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１０の配列；
（ｂ）配列番号９および配列番号１０の配列；または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列
を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドに含まれるコード配列を発現するように遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞は細菌細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
請求項１３に記載の宿主細胞を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質を含有する培地中で、該基質をエタノールへと醗酵させることを可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞は、サーモアネロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞は、サーモアネロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ） ＡＬＫ２（ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ２）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
セルロース分解基質を醗酵して、理論収量の少なくとも９０％である濃度においてエタノールを生成する単離された生物であって、該生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現せず、少なくとも２つの遺伝子が該生物において破壊されており、該少なくとも２つの遺伝子は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子、およびアセテートキナーゼ（ａｃｋ）遺伝子を含む、単離された生物。
【請求項２】
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
ネイティブの生物を形質転換して、請求項１に記載の単離された生物を生成し、形質転換宿主を提供する工程；ならびに
該形質転換宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、該基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
形質転換生物であって、該形質転換生物は、
ネイティブの状態において、醗酵生成物として酢酸を生成する能力を付与する２以上の遺伝子を含むグラム陽性細菌
を含み、
該グラム陽性細菌は、該２以上の遺伝子の発現を排除するように形質転換されており、該２以上の遺伝子は、アセテートキナーゼ（ａｃｋ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）をコードする、
形質転換生物。
【請求項４】
前記グラム陽性細菌は、サーモアネロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属のメンバーである、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項５】
前記グラム陽性細菌は、サーモアネロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）である、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項６】
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
ネイティブの生物を形質転換して、請求項３に記載のグラム陽性細菌を生成し、形質転換細菌宿主を生成する工程；ならびに
該形質転換細菌宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、該基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
前記細菌宿主は、サーモアネロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＡＬＫ２と称されかつ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０２５の下で寄託されている微生物の生物学的に純粋な培養物。
【請求項９】
単離されたポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１０の配列；
（ｂ）配列番号９および配列番号１０の配列；または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列
を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドに含まれるコード配列を発現するように遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞は細菌細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
請求項１３に記載の宿主細胞を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質を含有する培地中で、該基質をエタノールへと醗酵させることを可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞は、サーモアネロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞は、サーモアネロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ） ＡＬＫ２（ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ２）である、請求項１５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図４−６】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図４−６】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−１８７１２１（Ｐ２０１２−１８７１２１Ａ）
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１４１１３７（Ｐ２０１２−１４１１３７）
【出願日】平成２４年６月２２日（２０１２．６．２２）
【分割の表示】特願２００８−５３８１０１（Ｐ２００８−５３８１０１）の分割
【原出願日】平成１８年１０月３１日（２００６．１０．３１）
【出願人】（５０４３０３７１３）ザ トラスティーズ オブ ダートマウス カレッジ (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１４１１３７（Ｐ２０１２−１４１１３７）
【出願日】平成２４年６月２２日（２０１２．６．２２）
【分割の表示】特願２００８−５３８１０１（Ｐ２００８−５３８１０１）の分割
【原出願日】平成１８年１０月３１日（２００６．１０．３１）
【出願人】（５０４３０３７１３）ザ トラスティーズ オブ ダートマウス カレッジ (12)
【Ｆターム（参考）】
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