リスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を生産するための代謝改変細胞
【課題】リスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を生産する細胞を提供する。
【解決手段】Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼがフェニルアラニンからトランス−ケイヒ酸を作り、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）が該トランスケイヒ酸から４−クマル酸を作り、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）が該４−クマル酸から４−クマロイル−ＣｏＡを作り、リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）が該４−クマロイル−ＣｏＡからリスベラトロールを作る経路によるか、又はＬ−フェニルアラニン−又はチロシン−アンモニアリアーゼ（ＰＡＬ／ＴＡＬ）が４−クマル酸を作り、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）が該４−クマル酸から４−クマロイル−ＣｏＡを作り、リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）が該４−クマロイル−ＣｏＡからリスベラトロールを作る経路によりリスベラトロールを産生する組換え微生物。
【解決手段】Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼがフェニルアラニンからトランス−ケイヒ酸を作り、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）が該トランスケイヒ酸から４−クマル酸を作り、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）が該４−クマル酸から４−クマロイル−ＣｏＡを作り、リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）が該４−クマロイル−ＣｏＡからリスベラトロールを作る経路によるか、又はＬ−フェニルアラニン−又はチロシン−アンモニアリアーゼ（ＰＡＬ／ＴＡＬ）が４−クマル酸を作り、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）が該４−クマル酸から４−クマロイル−ＣｏＡを作り、リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）が該４−クマロイル−ＣｏＡからリスベラトロールを作る経路によりリスベラトロールを産生する組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、微生物細胞を用いたポリフェノールリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体、例えば、そのβ−グルコシドピセイドの生産に関する。さらに、本発明は、リスベラトロール又はそのような誘導体を作る天然微生物又は組換え微生物の、食物、餌及び飲料の生産のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬品の微生物からの生産は、バイオテクノロジーの重要な応用となっている。典型的には、そのようなバイオ生産法の開発の工程として、１）適当な微生物宿主の選択、２）副産物を導く代謝経路の排除、３）酵素活性レベルと転写レベルの両方で望ましい経路の調節解除、及び４）望ましい経路での適当な酵素の過剰発現が挙げられるだろう。好ましい態様において、本発明は、リスベラトロールの望ましい生合成のために必要な前駆体を供給する植物のフェニルプロパノイド経路の酵素により、フェニルアラニン又はチロシンからの炭素の流れを再指示する上記工程の組合せを使用している。
【０００３】
リスベラトロール（すなわち、３，４，５−トリヒロドキシスチルベン）は、感染又は他のストレスに関連する現象に応答して植物中に活動的な防御機構を構成する低分子量の二次的代謝産物であるスチルベンフィトアレキシン類の群に属するフィトフェノールである。スチルベンフィトアレキシン類はスチルベン骨格（トランス−１，２−ジフェニルエチレン）をそれらの共通する基本構造として含み、この構造は他の基の付加により補われてもよい（非特許文献１及び２）。スチルベン類は一定の木（被子植物、裸子植物）に発見されてきたが、一部の多年草（フトモモ科、ブドウ科及びマメ科の種）にも発見されている。該化合物は、有害生物、特に菌類、細菌及び昆虫への毒性がある。ほんのわずかな植物がスチルベン類を合成する能力があるか、又は有害生物に対して十分な耐性を植物に与える量でスチルベン類を生産する能力を有する。
【０００４】
スチルベンシンターゼによる基本的なスチルベン骨格の合成が探究されている。今までに、ピノシルビンシンターゼとリスベラトロールシンターゼという２種類の酵素がスチルベンシンターゼとして示された。現在までに、落花生（Arachis hypogaea）リスベラトロールシンターゼが最も詳細に特性付けられているので、その性質のほとんどが知られている（非特許文献３）。スチルベンシンターゼにより用いられる基質は、マロニル−ＣｏＡ、シンナモイル−ＣｏＡ又はクマロイル−ＣｏＡである。これらの基質は、フラボノイド、花の色素及び脂質等の他の重要な植物構成物の生合成にも同じく用いられるので、すべての植物に存在する。
【０００５】
リスベラトロール（図１：トランス形）は２個の密に結合したフェノール環からなるのでポリフェノール類に属する。ユーカリ、エゾマツ及びユリ等の他の植物やクワの実及びピーナッツ等の他の食物に存在する一方で、リスベラトロールの最も豊富な天然源は、ワイン製造に使用されるヴィティス・ヴィニヘラ、ヴィティス・ラプラスカ及びヴィティス・マスカジン（ロタンディフォリア）のブドウである。この化合物は、ブドウの木、根、種及び茎に存在するが、その最大濃度は、５０〜１００μｇ／ｇ（非特許文献４）を含む皮にある（非特許文献５）。赤ワインの醸造中、ブドウの皮は白ワインの醸造とは対照的にブドウの液汁に含まれるので、リスベラトロールは赤ワインのみに少量見られる。リスベラトロールは、その抗菌性に加えて、その心臓保護活性と発癌予防活性が認識されてきており、それは、血小板凝集の阻害剤であるフィトエストロゲン（非特許文献６、７及び８）や抗酸化物（非特許文献４及び９）として作用する。これらの性質は、所謂、フレンチパラドックス（すわなち、ワインを飲むフランス人は低運動で高脂肪食事にもかかわらず冠動脈心疾患の低い発生率）を説明する。最近、リスベラトロールは、共に寿命の延長に重要な役割を果たす酵母のＳＩＲ２遺伝子及び類似のヒト遺伝子ＳＩＲＴ１を活性化することもできることが示された。それ以来、リスベラトロールの寿命延長効果が非常に注目されている（非特許文献１０及び１１）。
【０００６】
ライフエクステンションファンデーション等のアメリカの健康協同組合は、この医薬の非常に高い薬効を促進しつつあり、それによって、成功した商品化のために理想的な状態を推進しつつある。現在の生産工程は、主に、ブドウ果皮かタデのいずれかからのリスベラトロールの抽出に依存する。これは、労働集約的な過程であり、低い利益を生むため、新規で、さらに効率的で多収量の生産方法の開発に対する動機を促している。
【０００７】
植物において、フェニルプロパノイド経路は、リグニン類、サリチレート類、クマリン類、ヒドロキシケイヒ酸アミド類、色素、フラボノイド類及びフィトアレキシン類等の多様な二次代謝化合物の合成に関与する。実際、植物におけるリスベラトロールの形成はフェニルプロパノイド経路を経る。アミノ酸のＬ−フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）により非酸化脱アミノ化によりトランスケイヒ酸に変換される（図２）。次に、トランスケイヒ酸は、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）と共同するチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ酵素であるシンナメート−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）によりパラ位でヒドロキシル化されて４−クマル酸（４−ヒドロキシケイヒ酸）となる。引き続いて、この４−クマル酸は４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）の作用により４−クマロイル−ＣｏＡに活性化される。最後に、リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）が４−クマロイル−ＣｏＡのフェニルプロパン単位のマロニルＣｏＡへの縮合を触媒して、リスベラトロールの形成をもたらす。
【０００８】
最近、ブドウ液汁に少量見られる４−クマル酸からリスベラトロールを作ることのできる酵母が開示された（非特許文献１２）。Ｓ．セレヴィシエの実験室の菌株における４−クマロイル−ＣｏＡとそれに付随するリスベラトロールの生産は、雑種ポプラに由来する異種コエンザイム−Ａリガーゼ遺伝子をブドウリスベラトロールシンターゼ遺伝子（ｖｓｔ１）とともに共発現させることにより達成された。リスベラトロールシンターゼの他の基質であるマノニル−ＣｏＡは酵母ですでに内因的に産生されており、新規な脂肪酸生合成にかかわる。研究により、Ｓ．セレヴィシエの細胞は、４−クマル酸を補った合成培地で培養した場合、微量のリスベラトロールを遊離形又はグルコシド結合形のいずれかで産生することができることが分かった。
【０００９】
しかし、該酵母は低いリスベラトロール収率に弱点があり、ごくわずかな産業用培地のみにしか存在しない４−クマル酸の添加を必要とするために、商業的利用には適さないだろう。したがって、医薬と栄養補助食品の両方としてのリスベラトロールの利用を容易にし、広げるために、４−クマル酸の添加なしに、グルコースからリスベラトロールを直接産生することのできる酵母を得ることは非常に望ましい。
【００１０】
最近の研究（非特許文献１３）には、ポプラに由来するＰＡＬ、Ｃ４Ｈ及びＣＰＲを導入することによる、Ｓ．セレヴィシエにおけるフェニルプロパノイド経路のエントリポイントの再構成が記載されている。この目的は、ＰＡＬとＣ４Ｈを含む多酵素複合体（ＭＥＣ）が、フェニルプロパノイド代謝へのエントリポイントにおいて機能的に重要かどうかを評価することにあった。組換え酵母に［３Ｈ］−フェニルアラニンを供給することにより、代謝された［３Ｈ］−フェニルアラニンの大多数が４−［３Ｈ］−クマル酸に取り込まれること、及びフェニルアラニン代謝はＣ４Ｈ活性を阻害することにより非常に減少することがわかった。さらに、ＰＬＡのみのエクスプレッサーが微小のフェニルアラニンをケイヒ酸に代謝した。［３Ｈ］−フェニルアラニンと［１４Ｃ］−トランス−ケイヒ酸を同時にトリプルエクスプレッサーに供給した場合、内因的に合成された［３Ｈ］−トランス−ケイヒ酸の４−クマル酸へのチャネリングについていかなる証拠も見られなかった。したがって、ＰＡＬとＣＨ４により触媒される反応によりフェニルアラニンから４−クマル酸への効率的な炭素の流れは酵母におけるＭＥＣによるチャネリングを必要とするようには思えず、ＰＡＬとＣ４Ｈの真の生化学的カップリングが炭素の流れをフェニルプロパノイド経路に引き込むのに十分であるように思える。さらに別の研究（非特許文献１４）において、大腸菌による植物特異的なフラバノン類の生産は多様な異種起源のフェニルプロパノイド経路の３遺伝子（酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａに由来するＰＡＬ、放線菌ストレプトミセス ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒに由来する４ＣＬ及び甘草植物Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｅｃｈｉｎａｔａに由来するカルコンシンターゼ（ＣＨＳ））を含む人工的な遺伝子クラスターの発現により達成された。細菌の４ＣＬ酵素はコエンザイムＡをトランス−ケイヒ酸と４−クマル酸の両方に連結させたので、これらの経路はＣ４Ｈをバイパスした。さらに、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ由来のＰＡＬはフェニルアラニンとチロシンの両方を基質として利用する。したがって、該遺伝子クラスターを含有し、かつグルコースで増殖した大腸菌細胞は、少量の２種類のフラバノン（フェニルアラニンからピノセムブリン（０．２９ｇ／ｌ）及びチロシンからナリンゲニン（０．１７ｇ／ｌ））を産生した。さらに、大量のそれらの前駆体である４−クマル酸とトランス−ケイヒ酸（それぞれ０．４７及び１．２３ｍｇ／リットル）が蓄積された。さらに、これらの化合物の収率はフェニルアラニンとチロシンの添加により増加させることができた。
【００１１】
双子葉植物に由来する酵素がフェニルアラニンのみを効率的に利用する一方で、幾つかの研究によって、単子葉植物及び一部の微生物に由来するＰＡＬがチロシンを同じく利用することが示された（非特許文献１５）。そのような反応において、チロシン活性物はチロシンアンモニアリアーゼと命名されている（ＴＡＬ、図３）。チロシンのＴＡＬによる変換は、Ｃ４ＨとＣＰＲの仲介なしに４−クマル酸の直接の形成をもたらす。主に、両活性は同じポリペプチドに存在し、Ｋｍとターンオーバー数の大きな違いにかかわらず、非常に類似の触媒効率を有する。しかし、植物に由来するほとんどのＰＡＬ／ＴＡＬ酵素はチロシンよりもフェニルアラニンを好む。ＴＡＬ活性のレベルはほとんどＰＡＬ活性よりも低いが、この差の程度は広範囲にわたって変化する。例えば、パセリ酵素はフェニルアラニンに対して１５〜２５μＭ及びチロシンに対して２．０〜８．０ｍＭのＫｍと、それぞれ２２秒−１と０．３秒−１のターンオーバー数を有する。対照的に、トウモロコシ酵素は、フェニルアラニンのみに対してチロシンよりも１５倍高いＫｍ値と約１０倍高いターンオーバー数を有する。さらに、赤酵母であるＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）と−ｒｕｂｒａにおいて、ＴＡＬ触媒活性はＰＡＬ触媒活性に近く、ＴＡＬ／ＰＡＬ比が約０．５８である。これらの酵母のＰＡＬ酵素は異化機能としてフェニルアラニンを分解すると考えられ、形成されるトランス−ケイヒ酸はベンゾエートと他の細胞材料に変換される一方で、植物においては、それは、リグニン、イソフラボノイド類及び他のフェニルプロパノイド類の生合成において調節酵素にすぎないと考えられている。
【００１２】
最近、光活性黄色タンパク質の発色団の生合成にかかわる仮説上の生合成チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）をコードする細菌ロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓで読み取り枠が発見された（非特許文献１６）。これは、ＰＡＬ相同遺伝子が細菌で発見された最初である。ＴＡＬ遺伝子は単離され、大腸菌で過剰生産させた。チロシンの４−クマル酸への変換に関するＫｍとｋｃａｔ値はそれぞれ１５．６μＭと２７．７秒−１であり、Ｌ−フェニルアラニンのトランス−ケイヒ酸への変換に関してはそれぞれ１２７７μＭと１５．１秒−１であった。その小さいＫｍとわずかに高いｋｃａｔの結果として、酵素はＬ−フェニルアラニンよりもチロシンに対する強い好みを示し、フェニルアラニンに対するよりも約１５０倍高いチロシンに対する触媒効率（Ｋｍ／ｋｃａｔ）を有する。動力学的研究によると、Ｌ−フェニルアラニンではなく、チロシンが生理学的条件下で酵素の天然の基質であることが立証されている。ごく最近、ある研究で、大腸菌でのフラボノイド類の産生に関してフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ、４−クマレート−Ｃｏａ−リガーゼ及びカルコンシンターゼの異種共発現が述べられている（非特許文献１７）。しかし、すべての４遺伝子における同時発現は、非機能性のシンナメート−４−ヒドロキシラーゼのために成功しなかった。しかし、ロドバクテリア ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓからクローニングされた新しいチロシンアンモニアリアーゼをフェニルアラニンアンモニアリアーゼとシンナメート−４−ヒドロキシラーゼと置き換えることでその問題が解決され、フラボノンナリンゲニンの高水準生産が導かれた。さらに、ロドバクテリア ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓに由来する該チロシンアンモニアリガーゼは、大腸菌における４−クマル酸（すなわち、パラ−ヒドロキシケイヒ酸）の異種産生のためにも用いられている（特許文献１）。さらに、グルコースを４−クマル酸に変換する生体触媒のさらなる開発方法が記載されている。特許文献２には、大腸菌とサッカロマイセス・セレヴィシエ（出芽酵母）におけるクマル酸の産生のためにＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ酵母に由来するチロシンアンモニアリアーゼが開示されている。特許文献３には、チロシンを４−クマル酸へ直接変換する野生型ＰＡＬの能力を明確に示すために、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ酵母に由来する野生型ＰＡＬの大腸菌への取り込みが記載されている。さらに、植物Ｃ４ＨとＣＰＲに加えて、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ酵母に由来する野生型ＰＡＬの大腸菌とＳ．セレヴィシエとへの取り込みの例示も存在する。増強ＴＡＬ活性を有する野生型酵母ＰＡＬ Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓの突然誘発による生体触媒の開発も記載されている（特許文献４）。上記特許のいずれもリスベラトロールの産生のために４ＣＬ及びＶＳＴの取り込みを請求するものではない。
【００１３】
最近、糸状菌の麹菌（コウジカビ）が、植物中のナリンゲニン等のフラボノイド類の生合成に通常関与するカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）酵素を含むとの証拠が示された（非特許文献１８）。実際、麹菌がフェニルプロパノイド−フラボノイド代謝に関与する主要な一組の遺伝子（すなわち、ＰＡＬ、Ｃ４Ｈ及び４ＣＬ）を含むことも示した。しかし、麹菌がリスベラトロールシンターゼ等のスチルベンシンターゼを含むとの証拠はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＵＳ−Ａ−２００４０５９１０３
【特許文献２】ＵＳ−Ａ−２００４０２３３５７
【特許文献３】ＵＳ−Ａ−２００１０５３８４７
【特許文献４】ＵＳ−Ａ−６５２１７４８
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ハート及びシュリンプトン（Hart and Shrimpton）、１９７９年
【非特許文献２】ハート（Hart）、１９８１年
【非特許文献３】ショップナー及びキンドル（Schoppner and Kindl）、１９８４年
【非特許文献４】ジャングら（Jang et al.）、１９９７年
【非特許文献５】セロッティら（Celotti et al.）、１９９６年
【非特許文献６】コップら（Kopp et al.）、１９９８年
【非特許文献７】ゲームら（Gehm et al.）、１９９７年
【非特許文献８】ロボら（Lobo et al.）、１９９５年
【非特許文献９】ファング（Huang）、１９９７年
【非特許文献１０】ハル（Hall）、２００３年
【非特許文献１１】コウジン（Couzin）、２００４年
【非特許文献１２】ベッカーら（Becker et al.）、２００３年
【非特許文献１３】ロー及びダグラス（Ro and Douglas）、２００４年
【非特許文献１４】Ｈｗａｎｇら、２００３年
【非特許文献１５】Ｒｏｓｌｅｒら、１９９７年
【非特許文献１６】キンドら（Kyndt et al.）、２００２年
【非特許文献１７】Ｗａｔｔｓら、２００４年
【非特許文献１８】Ｓｅｓｈｉｍｅら、２００５年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、
（１）４−クマル酸を生産し、さらに当該４−クマル酸からリスベラトロール又は当該リスベラトロールのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を生産する操作的な代謝経路を有する微生物において、
前記代謝経路において、前記４−クマル酸は、
当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ及びシンナメート４−ヒドロキシラーゼの作用によってＬ−フェニルアラニンから、又は、
当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ又はチロシンアンモニアリアーゼの作用によってチロシンから生成し、
４−クマロイル−ＣｏＡが、当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現する４−クマレート−ＣｏＡリガーゼによる酵素反応で前記４−クマル酸から生成し、
そして前記リスベラトロールが、当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するリスベラトロールシンターゼによって内在性マロニル−ＣｏＡを基質とする反応で前記４−クマロイル−ＣｏＡから生成することを特徴とする微生物、
（２）天然のＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物で過剰発現している、又は、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物に組換えで導入されていることを特徴とする上記（１）に記載の微生物、
（３）チロシンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の微生物、
（４）フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれか一項に記載の微生物、
（５）真菌又は細菌であることを特徴とする上記（１）乃至（４）のいずれか一項に記載の微生物、
（６）発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたシンナメート−４−ヒドロキシラーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有することを特徴とする上記（１）に記載の微生物、
（７）シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ活性を欠如し、発現シグナルに作動可能に連結されたチロシンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する上記（１）に記載の微生物、
（８）４−クマル酸の外部源の実質的な非存在下において、上記（１）乃至（７）のいずれか一項に記載の微生物を炭素基質に接触させる工程を含むことを特徴とする、リスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法、
（９）前記炭素基質が、単糖類、小糖類及び多糖類からなる発酵性炭素基質の群より選択されることを特徴とする上記（８）に記載の方法、
（１０）前記炭素基質が、エタノール、アセテート、グリセロール、ラクテート、及びアミノ酸で構成される非発酵性炭素基質からなる群より選択されることを特徴とする上記（８）に記載の方法、
（１１）前記非発酵性炭素基質が、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選択されることを特徴とする上記（１０）に記載の方法、
（１２）さらに、生産されたリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を乳製品又は飲み物中の栄養補助食品として使用することを含む上記（８）乃至（１１）のいずれか一項に記載の方法、
である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、トランス−リスベラトロールの化学構造を示す。
【図２】図２は、Ｌ−ファニルアラニンに作用するフェニルアラニンアンモニアリアーゼを利用するフェニルプロパノイド経路を示す。
【図３】図３は、Ｌ−チロシンに作用するフェニルアラニンアンモニアリアーゼを利用する別の経路を示す。
【図４】図４は、１００ｇ／ｌのガラクトースで成長させたＳ．セレヴィシエ菌株であるＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴ及びＦＳＳＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴの抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。６０ナノグラムの純粋なリスベラトロールのクロマトグラムが含まれる。
【図５】図５は、純粋なトランス−リスベラトロール及び１００ｇ／ｌのガラクトースで成長させたＳ．セレヴィシエ菌株であるＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴにより作られたトランス−リスベラトロールのＵＶ吸収スペクトルを示す。
【図６】図６は、５０ｇ／ｌのグルコースで成長させた大腸菌株であるＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ及びＦＳＥＣコントロールからの抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、２０ｍｇ／ｌのクマル酸を添加した５０ｇ／ｌのグルコースで成長させた大腸菌株であるＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ及びＦＳＥＣコントロールからの抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株で作られたトランス−リスベラトロールのＵＶ吸収スペクトルが含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、少なくとも１種類の活性を含む操作的な代謝経路を有する微生物において、該経路が４−クマル酸を産生し、かつそれからリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体かグリコシド結合誘導体を産生する微生物を本願において提供する。そのような微生物は自然に存在してよく、適切なスクリーニング手順により単離してもよく、さらに好ましくは遺伝子組み換えされている。
【００１９】
好ましくは、該リスベラトロール又は誘導体は、内在性のマロニル−ＣｏＡが基質である酵素により触媒される反応で作られ、好ましくは該リスベラトロールは４−クマロイル−ＣｏＡから生成される。
【００２０】
好ましくは、該リスベラトロール又は誘導体は、微生物において、好ましくは該微生物に固有ではない該酵素をコードする核酸から発現するリスベラトロールシンターゼにより４−クマロイル−ＣｏＡから生成される。
【００２１】
ここでは一般的に、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、リスベラトロールへの言及は、特にピセイドを含む、そのオリゴマー誘導体かグリコシド結合誘導体への言及を含む。
【００２２】
例えば、ある好ましい実施態様において、前記リスベラトロールシンターゼは、Ａｒａｃｈｉｓ属に属する植物、例えば、Ａ．ｇｌａｂａｔｒａ、Ａ．ｈｙｐｏｇａｅａ、Ｒｈｅｕｍ属に属する植物、例えば、Ｒ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ、ヴィティス属に属する植物、例えば、Ｖ．ラプラスカ、Ｖ．ｒｉｐａｒａｉａ、Ｖ．ヴィニヘラ、又はパイナス属、Ｐｉｃｅｅａ属、ユリ属、ユーカリ属、Ｐａｒｔｈｅｎｏｃｉｓｓｕｓ属、ジッサス属、カロコルタス属、タデ属、Ｇｎｅｔｕｍ属、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ属、Ｎｏｔｈｏｆａｇｕｓ属、フェニックス属、ウシノケグサ属、スゲ属、シュロソウ属、ハカマカズラ又はＰｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ属のいずれかに由来するリスベラトロールシンターゼ（ＥＣ２．３．１．９５）である。
【００２３】
前記４−クマル酸は、好適には、酸素が基質であり、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが補因子であり、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋が産物である酵素により触媒される反応で酵素によりトランス−ケイヒ酸から生成されることが好ましい。
【００２４】
例えば、該４−クマル酸はトランス−ケイヒ酸からシンナメート４−ヒドロキシラーゼにより作られてよく、該４−クマル酸は、好ましくは、微生物において、該微生物に固有ではない該酵素をコードする核酸から発現する。
【００２５】
上記段落で言及されたものを含むある実施態様において、該シンナメート−４−ヒドロキシラーゼは植物又は微生物に由来するシンナメート−４−ヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１３．１１）である。植物は、シロイヌナズナ属、例えば、シロイヌナズナ、Ｃｉｔｒｕｓに属する植物、例えば、Ｃ．シネンシス、Ｃ．ｘ ｐａｒａｄｉｓｉ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属する植物、例えば、Ｐ．ヴァガリス、パイナス属する植物、例えば、Ｐ．ｔａｅｄａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ属する植物、例えば、Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、ナス属する植物、例えば、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、ヴィティス属する植物、例えば、ヴィティス ヴィニヘラ、ズィー属する植物、例えば、Ｚ．メイス又は他の植物属、例えば、Ａｍｍｉ属、Ａｖｉｃｅｎｎｉａ属、カメリア属、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、グリシン属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、ハス属、マツバギク属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｒｕｔａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属に属してよい。微生物は、アスペルギルス属に属する真菌類、例えば麹菌であってよい。
【００２６】
好ましくは、前記４−クマル酸は、アンモニアが生成される酵素触媒反応でチロシンから作られ、好適には、該４−クマル酸は、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ又はチロシンアンモニアリアーゼ、例えば酵母又は細菌に由来するチロシンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．５）によりチロシンから生成される。好適には、該チロシンアンモニアリアーゼは酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ又は細菌ロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに由来する。
【００２７】
任意に、該チロシンアンモニアリアーゼは、微生物において、該微生物に固有ではない該酵素をコードする核酸から発現させる。
【００２８】
もしくは、前記トランス−ケイヒ酸は、アンモニアが生成される酵素触媒反応でＬ−フェニルアラニンから作られてよく、好適には、該トランス−ケイヒ酸は、Ｌ−フェニルアラニンからフェニルアラニンアンモニアリアーゼにより形成する。
【００２９】
ある好ましい実施態様において、該Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、植物又は微生物に由来するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．５）である。植物は、シロイヌナズナ属に属する植物、例えば、シロイヌナズナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ属に属する植物、例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、シトラス属に属する植物、例えば、Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ、Ｃ．ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｕｓ、Ｃ．リモン、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ、Ｐ．ヴァリガリス、パイナス属に属する植物、例えば、Ｐ．ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐ．ｍｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｐ．パイナスター、Ｐ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐ．ｔａｅｄａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ、Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ、Ｐ．Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｋｉｔａｋａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、ナス属に属する植物、例えば、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、プラナス属に属する植物、例えば、Ｐ．ａｖｉｕｍ、Ｐ．ｐｅｒｓｉｃａ、ヴィティス属に属する植物、例えば、ヴィティス ヴィニヘラ、ズィー属に属する植物、例えば、Ｚ．メイス又は他の植物属、例えば、Ａｇａｓｔａｃｈｅ属、Ａｎａｎａｓ属、Ａｓｐａｒａｇｕｓ属、Ｂｒｏｍｈｅａｄｉａ属、Ｂａｍｂｕｓａ属、Ｂｅｔａ属、Ｂｅｔｕｌａ属、Ｃｕｃｕｍｉｓ属、カメリア属、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属、Ｃａｓｓｉａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、Ｃｉｃｅｒ属、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ属、Ｃｏｆｆｅａ属、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｄａｕｃｕｓ属、Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ属、Ｄｉａｎｔｈｕｓ属、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ属、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ属、ユーカリ属、Ｇａｌｌｕｓ属、Ｇｉｎｋｇｏ属、グリシン属、Ｈｏｒｄｅｕｍ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｉｐｏｍｏｅａ属、Ｌａｃｔｕｃａ属、リソスパーマム・オフィシナーレ属、ハス属、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マリュス属、Ｍａｎｉｈｏｔ属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マツバギク属、タバコ属、Ｏｌｅａ属、オリザ属、Ｐｉｓｕｍ属、Ｐｅｒｓｅａ属、ペトロセリウム属、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ属、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｐｉｃｅａ属、Ｐｙｒｕｓ属、Ｑｕｅｒｃｕｓ属、Ｒａｐｈａｎｕｓ属、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ属、キイチゴ属、Ｓｏｒｇｈｕｍ属、Ｓｐｈｅｎｏｓｔｙｌｉｓ属、Ｓｔｅｌｌａｒｉａ属、Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｅｓ属、コムギ属、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ属、コムギ属、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属、Ｚｉｎｎｉａ属に属してよい。微生物は、Ａｇａｒｉｃｕｓ属に属する真菌類、例えば、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、アスペルギルス属に属する真菌類、例えば、麹菌、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．フミガーツス、Ｕｓｔｉｌａｇｏ属に属する真菌類、例えば、Ｕ．ｍａｙｄｉｓ、ロドバクテリア属に属する細菌、例えば、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属に属する酵母、例えば、Ｒ．ｒｕｂｒａであってよい。
【００３０】
好適には、該Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、微生物において、該微生物に固有ではない該酵素をコードする核酸から発現させる。
【００３１】
好ましくは、４−クマロイル−ＣｏＡは、ＡＴＰとＣｏＡが基質であり、かつＡＤＰが産物である酵素触媒反応で形成され、好適には、４−クマロイル−ＣｏＡは４−クマレート−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で形成される。
【００３２】
前記４−クマレート−ＣｏＡリガーゼは、植物、微生物又は線虫に由来する４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．１２）であってよい。植物は、Ａｂｉｅｓ属、例えば、Ａ．ｂｅｓｈａｎｚｕｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍａ、Ｂ．ｈｏｌｏｐｈｙｌｌａ、シロイヌナズナ属に属する植物、例えば、シロイヌナズナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ属に属する植物、例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ、シトラス属に属する植物、例えば、Ｃ．シネンシス、Ｌａｒｉｘ属に属する植物、例えば、Ｌ．ｄｅｃｉｄｕａ、Ｌ．ｇｍｅｌｉｎｉｉ、Ｌ．ｇｒｉｆｆｉｔｈｉａｎａ、Ｌ．ｈｉｍａｌａｉｃａ、Ｌ．ｋａｅｍｐｆｅｒｉ、Ｌ．ｌａｒｉｃｉｎａ、Ｌ．ｍａｓｔｅｒｓｉａｎａ、Ｌ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｌ．ｐｏｔａｎｉｎｉｉ、Ｌ．ｓｉｂｉｒｉｃａ、Ｌ．ｓｐｅｃｉｏｓａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ａｃｕｔｉｆｏｌｉｕｓ、Ｐ．ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ、パイナス属に属する植物、例えば、Ｐ．ａｒｍａｎｄｉｉ、Ｐ．ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐ．パイナスター、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ、Ｐ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、ナス属に属する植物、例えば、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、ヴィティス属に属する植物、例えば、ヴィティス ヴィニヘラ、ズィー属に属する植物、例えば、Ｚ．メイス又は他の植物属、例えば、Ａｇａｓｔａｃｈｅ属、アモルファ属、Ｃａｔｈａｙａ属、Ｃｅｄｒｕｓ属、クロッカス属、ウシノケグサ属、グリシン属、Ｊｕｇｌａｎｓ属、Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ属、リソスパーマム・オフィシナーレ属、Ｌｏｌｉｕｍ属、ハス属、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属、マリュス属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マツバギク属、タバコ属、Ｎｏｔｈｏｔｓｕｇａ属、オリザ属、ペラルゴニウム属、ペトロセリウム属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｐｉｃｅａ属、プラナス属、Ｐｓｅｕｄｏｌａｒｉｘ属、Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ属、ローザ属、キイチゴ属、Ｒｙｚａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｓｕａｅｄａ属、Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ属、コムギ属、Ｔｓｕｇａ属に属してよい。微生物は、アスペルギルス属に属する糸状菌、例えば、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、麹菌、Ａ．フミガーツス、アカパンカビ属に属する糸状菌、例えば、アカパンカビ、Ｙａｒｒｏｗｉａ属に属する真菌類、例えば、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ属に属する真菌類、例えば、Ｍ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、マイコバクテリウム属に属する細菌、例えば、ウシ型結核菌、ハンセン菌、ヒト型結核菌、ナイセリア属に属する細菌、例えば、髄膜炎菌、ストレプトミセス属に属する細菌、例えば、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、ロドバクテリア属に属する細菌、例えば、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、鉤虫属に属する線虫類、例えば、Ａ．ｃｅｙｌａｎｉｃｕｍ、シノラブディス属に属する線虫類、例えば、Ｃ．エレガンス、捻転胃虫属に属する線虫類、例えば、Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ、Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ属に属する線虫類、例えば、Ｌ．ｒｕｂｅｌｌｕｓ、Ｍｅｉｌｏｄｏｇｙｎｅ属に属する線虫類、例えば、Ｍ．ｈａｐｌａ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｕｓ属に属する線虫類、例えば、Ｓ．ｒａｔｔｉｉ、糞線虫、Ｐｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ属に属する線虫類、例えば、Ｐ．ｐａｃｉｆｉｃｕｓであってよい。
【００３３】
任意に、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）は組換えで微生物に導入されている。これは非植物微生物に導入された植物ＣＰＲであってよい。あるいは、天然のＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が該微生物で過剰発現している。
【００３４】
上記段落で言及されたものを含む好ましい実施態様において、前記ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼは、シロイヌナズナ属に属する植物、例えば、シロイヌナズナ、シトラス属に属する植物、例えば、Ｃ．シネンシス、Ｃ．ｘ ｐａｒａｄｉｓｉ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ヴァガリス、パイナス属に属する植物、例えば、Ｐ．ｔａｅｄａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、ナス属に属する植物、例えば、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、ヴィティス属に属する植物、例えば、ヴィティス ヴィニヘラ、ズィー属に属する植物、例えば、Ｚ．メイス又は他の植物属、例えば、Ａｍｍｉ属、Ａｖｉｃｅｎｎｉａ属、カメリア属、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、グリシン属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、ハス属、マツバギク属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｒｕｔａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属に由来するＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．４）である。
【００３５】
微生物が天然に存在するものであってよい一方で、該代謝経路の各酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが該微生物に組換えで導入されているのが好ましい。
【００３６】
該酵素をコードするコード配列の導入に加えて、又はその代わりに、該生物体中の該コード配列に天然では関連しないプロモーター配列等の１つ以上の発現シグナルを提供してよい。したがって、任意に、チロシンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、該生物中の該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結され、及び／又はＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、該生物中の該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結される。
【００３７】
任意に、シンナメート４−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結される。
【００３８】
任意に、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結される。
【００３９】
任意に、リスベラトロールシンターゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結される。
【００４０】
発現シグナルとして、コード配列の上流（５’−非コード配列）、その内部又はその下流（３’−非コード配列）に配置され、かつ関連するコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシング又は安定性、又は翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列が挙げられる。そのような配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン及びポリアデニル化認識配列が挙げられよう。
【００４１】
ある態様において、本発明は、第１酵素により触媒され、かつその反応工程がアンモニアを作る反応により第１代謝産物が第２代謝産物に変換され、酸素が基質であり、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨが補因子であり、ＮＡＤＰ＋又はＮＡＤ＋が生成物である第２酵素により触媒される反応で該第２代謝産物が第３代謝物に変換され、ＡＴＰ及びＣｏＡが基質であり、ＡＤＰが生成物である第３酵素により触媒される反応で第３代謝産物が第４代謝産物に変換され、内在性マロニル−ＣｏＡが基質である第４酵素により触媒される反応で第４代謝産物が第５代謝産物に変換される作動性代謝経路を有する代謝改変微生物を提供する。
【００４２】
さらに、本発明は、第１酵素により触媒され、かつその反応工程が第２酵素の関与なしにアンモニアを作る反応により、第１代謝産物が第３代謝産物に変換され、ＡＴＰ及びＣｏＡが基質であり、ＡＤＰが生成物である第３酵素により触媒される反応で第３代謝産物が第４代謝産物に変換され、内在性マロニル−ＣｏＡが基質である第４酵素により触媒される反応で第４代謝産物が第５代謝産物に変換される作動性代謝経路を有する代謝改変微生物を提供する。
【００４３】
上記微生物として、発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたシンナメート−４−ヒドロキシラーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する微生物が挙げられる。
【００４４】
それら微生物として、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ活性を欠如し、発現シグナルに作動可能に連結されたチロシンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する微生物も挙げられる。
【００４５】
現在の文脈において、「微生物」は、細菌等の微生物、酵母等の微細菌に関する。
【００４６】
さらに具体的には、微生物は真菌であってよく、さらに具体的には、アスペルギルス属に属する糸状菌、例えば、黒色アスペルギルス、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、麹菌、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母、例えば、Ｓ．セレヴィシエ、Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｓｅｖａｚｚｉ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、カンジダ属に属する酵母、例えば、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、ピチア属に属する酵母、例えば、Ｐ．ｓｔｉｐｉｄｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｓｏｒｂｉｔｏｐｈｉｌａ、又は他の酵母属、例えば、クリプトコッカス属、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、ピチア属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属又はシゾサッカロミセス属であってよい。他の微生物に関して、ペニシリウム属、クモノスカビ属、フサリウム属、Ｆｕｓｉｄｉｕｍ属、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ属、ケカビ属、モルティエラ属、トリコデルマ属に属する種等の好適な糸状菌の非網羅的なリストが提供される。
【００４７】
細菌に関して、好適な細菌の非網羅的なリストは以下の通り与えられる：バシラス属に属する種、エシェリキア属に属する種、乳酸菌属に属する種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する種、コリネバクテリア属に属する種、アセトバクター属に属する種、アシネトバクター属に属する種、シュードモナス属に属する種等。
【００４８】
本発明の好ましい微生物は、Ｓ．セレヴィシエ、黒色アスペルギルス、麹菌、大腸菌、乳酸連鎖球菌又は枯草菌であってよい。
【００４９】
構築され、改変された微生物は、ケモスタット培養、バッチ培養、流加バッチ培養等の一般に知られている方法を用いて培養することができる。
【００５０】
例えば、本発明は、非植物細胞を炭素基質に４−クマル酸の外部源の実質的な非存在下で接触させる工程を含むリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法であって、該細胞が該条件下でリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を作る能力を有し、該微生物が真菌及び細菌、特に酵母からなる群より選択することができる。
【００５１】
前記炭素基質は、単糖類、小糖類及び多糖類、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、マンノース、スクロース、ラクトース、エリトロース、スレオース及び／又はリボースからなる発酵性炭素基質の群より任意に選択される。該炭素基質は、さらに又は代わりに、エタノール、アセテート、グリセロール及び／又はラクテート等の非発酵性炭素基質からなる群より選択してもよい。該非発酵性炭素基質は、さらに又は代わりに、アミノ酸からなる群より選択してよく、フェニルアラニン及び／又はチロシンであってよい。
【００５２】
別の態様において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ、４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼ及びリスベラトロールシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現によるリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法、さらにチロシンアンモニアリアーゼ、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ及びリスベラトロールシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現によるリスベラトロールの製造方法を含む。
【００５３】
そのように生成されるリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体は乳製品又はビール等の飲み物中の栄養補助食品として用いることができる。
【００５４】
本発明にしたがって生成されるリスベラトロールはシス−リスベラトロール又はトランス−リスベラトロールであってよいが、トランス型が通常は優勢であると予想できる。
【００５５】
本発明は更に以下の形態を含む。
［１］少なくとも１種類の酵素活性を含む操作的な代謝経路を有する微生物において、前記経路が４−クマル酸を生産し、かつそれからリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を生産することを特徴とする微生物。
［２］前記リスベラトロールが、内在性のマロニル−ＣｏＡが基質である酵素により触媒される反応で生成されることを特徴とする上記［１］に記載の微生物。
［３］前記リスベラトロールが４−クマロイル−ＣｏＡから生成されることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載の微生物。
［４］前記リスベラトロールが、４−クマロイル−ＣｏＡからリスベラトロールシンターゼにより生成されることを特徴とする上記［３］に記載の微生物。
［５］前記リスベラトロールシンターゼが、前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現することを特徴とする上記［４］に記載の微生物。
【００５６】
［６］前記リスベラトロールシンターゼが、Ａｒａｃｈｉｓ属に属する植物、Ｒｈｅｕｍ属に属する植物、ヴィティス属に属する植物、又はパイナス属、Ｐｉｃｅｅａ属、ユリ属、ユーカリ属、Ｐａｒｔｈｅｎｏｃｉｓｓｕｓ属、ジッサス属、カロコルタス属、タデ属、Ｇｎｅｔｕｍ属、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ属、Ｎｏｔｈｏｆａｇｕｓ属、フェニックス属、ウシノケグサ属、スゲ属、シュロソウ属、ハカマカズラ又はＰｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ属のいずれか１種類に由来するリスベラトロールシンターゼ（ＥＣ２．３．１．９５）であることを特徴とする上記［５］に記載の微生物。
［７］前記４−クマル酸が、トランス−ケイヒ酸から生成されることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［８］前記４−クマル酸が、酸素が基質であり、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが補因子であり、ＮＡＤ又はＮＡＤＰが産物である酵素により触媒される反応で前記酵素によりトランス−ケイヒ酸から生成されることを特徴とする上記［７］に記載の微生物。
［９］前記４−クマル酸が、トランス−ケイヒ酸からシンナメート４−ヒドロキシラーゼにより生成されることを特徴とする上記［８］に記載の微生物。
［１０］前記シンナメート４−ヒドロキシラーゼが、微生物において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現することを特徴とする上記［９］に記載の微生物。
【００５７】
［１１］前記シンナメート−４−ヒドロキシラーゼが、シロイヌナズナ属に属する植物、シトラス属に属する植物、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、パイナス属に属する植物、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、ナス属に属する植物、ヴィティス属に属する植物、ズィー属に属する植物、又はＡｍｍｉ属、Ａｖｉｃｅｎｎｉａ属、カメリア属、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、グリシン属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、ハス属、マツバギク属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｒｕｔａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属のいずれか１種類、及びアスペルギルス属に属する真菌類に由来するシンナメート−４−ヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１３．１１）であることを特徴とする上記［１０］に記載の微生物。
［１２］前記４−クマル酸が、アンモニアが生成される酵素触媒反応でチロシンから生成されることを特徴とする上記［１］〜［６］のいずれかに記載の微生物。
［１３］前記４−クマル酸が、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ又はチロシンアンモニアリアーゼによりチロシンから生成されることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれかに記載の微生物。
［１４］前記４−クマル酸が、酵母又は細菌に由来するチロシンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．５）により生成されることを特徴とする上記［１３］に記載の微生物。
［１５］前記チロシンアンモニアリアーゼが、酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ又は細菌ロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに由来することを特徴とする上記［１４］に記載の微生物。
［１６］前記チロシンアンモニアリアーゼが、微生物において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現することを特徴とする上記［１２］〜［１５］のいずれかに記載の微生物。
［１７］前記トランス−ケイヒ酸が、アンモニアが生成される酵素触媒反応でＬ−フェニルアラニンから生成されることを特徴とする上記［９］〜［１１］のいずれかに記載の微生物。
［１８］前記トランス−ケイヒ酸が、Ｌ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼにより形成されることを特徴とする上記［１７］に記載の微生物。
［１９］前記トランス−ケイヒ酸が、シロイヌナズナ属に属する植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ属に属する植物、シトラス属に属する植物、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、パイナス属に属する植物、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、ナス属に属する植物、プラナス属に属する植物、ヴィティス属に属する植物、ズィー属に属する植物、又はＡｇａｓｔａｃｈｅ属、Ａｎａｎａｓ属、Ａｓｐａｒａｇｕｓ属、Ｂｒｏｍｈｅａｄｉａ属、Ｂａｍｂｕｓａ属、Ｂｅｔａ属、Ｂｅｔｕｌａ属、Ｃｕｃｕｍｉｓ属、カメリア属、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属、Ｃａｓｓｉａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、Ｃｉｃｅｒ属、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ属、Ｃｏｆｆｅａ属、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｄａｕｃｕｓ属、Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ属、Ｄｉａｎｔｈｕｓ属、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ属、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ属、ユーカリ属、Ｇａｌｌｕｓ属、Ｇｉｎｋｇｏ属、グリシン属、Ｈｏｒｄｅｕｍ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｉｐｏｍｏｅａ属、Ｌａｃｔｕｃａ属、リソスパーマム・オフィシナーレ属、ハス属、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マリュス属、Ｍａｎｉｈｏｔ属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マツバギク属、タバコ属、Ｏｌｅａ属、オリザ属、Ｐｉｓｕｍ属、Ｐｅｒｓｅａ属、ペトロセリウム属、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ属、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｐｉｃｅａ属、Ｐｙｒｕｓ属、Ｑｕｅｒｃｕｓ属、Ｒａｐｈａｎｕｓ属、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ属、キイチゴ属、Ｓｏｒｇｈｕｍ属、Ｓｐｈｅｎｏｓｔｙｌｉｓ属、Ｓｔｅｌｌａｒｉａ属、Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｅｓ属、コムギ属、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ属、コムギ属、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属又はＺｉｎｎｉａ属のいずれかに属する植物、又はアスペルギルス属に属する真菌類に由来するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．５）によりＬ−フェニルアラニンから形成されることを特徴とする上記［１８］に記載の微生物。
［２０］前記Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼが、微生物において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現することを特徴とする上記［１８］又は［１９］に記載の微生物。
【００５８】
［２１］４−クマロイル−ＣｏＡが、ＡＴＰとＣｏＡが基質であり、ＡＤＰが産物である酵素により触媒される反応で形成されることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［２２］４−クマロイル−ＣｏＡが、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で形成されることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［２３］前記４−クマレート−ＣｏＡリガーゼが、Ａｂｉｅｓ属に属する植物、シロイヌナズナ属に属する植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ属に属する植物、シトラス属に属する植物、Ｌａｒｉｘ属に属する植物、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、パイナス属に属する植物、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、ナス属に属する植物、ヴィティス属に属する植物、ズィー属に属する植物、又はＡｇａｓｔａｃｈｅ属、アモルファ属、Ｃａｔｈａｙａ属、Ｃｅｄｒｕｓ属、クロッカス属、ウシノケグサ属、グリシン属、Ｊｕｇｌａｎｓ属、Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ属、リソスパーマム・オフィシナーレ属、Ｌｏｌｉｕｍ属、ハス属、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属、マリュス属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マツバギク属、タバコ属、Ｎｏｔｈｏｔｓｕｇａ属、オリザ属、ペラルゴニウム属、ペトロセリウム属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｐｉｃｅａ属、プラナス属、Ｐｓｅｕｄｏｌａｒｉｘ属、Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ属、ローザ属、キイチゴ属、Ｒｙｚａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｓｕａｅｄａ属、Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ属、コムギ属又はＴｓｕｇａ属のいずれかに属する植物、アスペルギルス属に属する糸状菌、アカパンカビ属に属する糸状菌、Ｙａｒｒｏｗｉａ属に属する真菌類、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ属に属する真菌類、マイコバクテリウム属に属する細菌、ナイセリア属に属する細菌、ストレプトミセス属に属する細菌、ロドバクテリア属に属する細菌、鉤虫属に属する線虫類、シノラブディス属に属する線虫類、捻転胃虫属に属する線虫類、Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ属に属する線虫類、Ｍｅｉｌｏｄｏｇｙｎｅ属に属する線虫類、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｕｓ属に属する線虫類、又はＰｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ属に属する線虫類に由来する４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．１２）であることを特徴とする上記［２２］に記載の微生物。
［２４］前記代謝経路の各酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物に組換えで導入されていることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［２５］天然のＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物で過剰発現していることを特徴とする上記［２４］に記載の微生物。
【００５９】
［２６］ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物に組換えで導入されていることを特徴とする上記［２４］に記載の微生物。
［２７］前記ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼが、シロイヌナズナを含むＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに属する植物、Ｃ．シネンシス、Ｃ．ｘ ｐａｒａｄｉｓｉを含むＣｉｔｒｕｓに属する植物、Ｐ．ヴァガリスを含むＰｈａｓｅｏｌｕｓに属する植物、Ｐ．ｔａｅｄａを含むＰｉｎｕｓに属する植物、Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａを含むＰｏｐｕｌｕｓに属する植物、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍを含むＳｏｌａｎｕｍに属する植物、ヴィティス ヴィニヘラを含むヴィティスに属する植物、Ｚ．メイスを含むＺｅａに属する植物、又はＡｍｍｉ属、Ａｖｉｃｅｎｎｉａ属、カメリア属、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、グリシン属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、ハス属、マツバギク属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｒｕｔａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属を含む他の植物属に由来するＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．４）であることを特徴とする上記［２６］に記載の微生物。
［２８］チロシンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［２９］フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［３０］シンナメート４−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記生物において前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していること特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
【００６０】
［３１］４−クマレート−ＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記生物において前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［３２］リスベラトロールシンターゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記生物において前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［３３］真菌であることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［３４］糸状菌であることを特徴とする上記［３３］に記載の微生物。
［３５］アスペルギルス属に属する微生物であることを特徴とする上記［３４］に記載の微生物。
【００６１】
［３６］菌株アスペルギルス ｎｉｇｅｒ又は麹菌であることを特徴とする上記［３５］に記載の微生物。
［３７］酵母であることを特徴とする上記［３３］に記載の微生物。
［３８］Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、カンジダ属、ピチア属、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属又はシゾサッカロミセス属に属する微生物であることを特徴とする上記［３７］に記載の微生物。
［３９］サッカロマイセス・セレヴィシエ、Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｓｅｖａｚｚｉ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ、Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｄｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｓｏｒｂｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ又はシゾサッカロミセス・ポンベの菌株であることを特徴とする上記［３８］に記載の微生物。
［４０］細菌であることを特徴とする［１］〜［３２］に記載の微生物。
【００６２】
［４１］エシェリキア属又はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物であることを特徴とする上記［４０］に記載の微生物。
［４２］大腸菌又は乳酸連鎖球菌の菌株であることを特徴とする上記［４１］に記載の微生物。
［４３］発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたシンナメート−４−ヒドロキシラーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有することを特徴とする上記［１］に記載の微生物。
［４４］シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ活性を欠如し、発現シグナルに作動可能に連結されたチロシンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する上記［１］に記載の微生物。
［４５］適当なリスベラトロール産生代謝経路を有する非植物細胞を炭素基質に４−クマル酸の外部源の実質的な非存在下において接触させる工程を含むことを特徴とする、リスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法。
【００６３】
［４６］前記非植物細胞が、真菌及び細菌からなる群より選択されることを特徴とする上記［４５］に記載の方法。
［４７］前記非植物細胞が、酵母からなる群より選択される真菌であることを特徴とする上記［４６］に記載の方法。
［４８］前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｅｓ種から選択されることを特徴とする上記［４７］に記載の方法。
［４９］前記非植物細胞が、上記［１］〜［４４］に記載の微生物の細胞であることを特徴とする上記［４５］〜［４８］に記載の方法。
［５０］前記炭素基質が、単糖類、小糖類及び多糖類からなる発酵性炭素基質の群より選択されることを特徴とする上記［４５］〜［４９］のいずれかに記載の方法。
【００６４】
［５１］前記発酵性炭素基質が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、マンノース、スクロース、ラクトース、エリトロース、スレオース、リボースであることを特徴とする上記［５０］に記載の方法。
［５２］前記炭素基質が、非発酵性炭素基質からなる群より選択されることを特徴とする上記［４５］〜［４９］のいずれかに記載の方法。
［５３］前記非発酵性炭素基質が、エタノール、アセテート、グリセロール、ラクテートであることを特徴とする上記［５２］に記載の方法。
［５４］前記非発酵性炭素基質が、アミノ酸からなる群より選択されることを特徴とする上記［５２］に記載の方法。
［５５］前記非発酵性炭素基質が、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選択されることを特徴とする上記［５４］に記載の方法。
【００６５】
［５６］フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ、４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼ及びリスベラトロールシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現によるリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法。
［５７］チロシンアンモニアリアーゼ、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ及びリスベラトロールシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現によるリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法。
［５８］さらに、生産されたリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を乳製品又は飲み物中の栄養補助食品として使用することを含む上記［４５］〜［５７］のいずれかに記載の方法。
［５９］前記リスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体をビール中の栄養補助食品として使用することを特徴とする上記［５８］に記載の方法。
【００６６】
本発明の上記説明の容易な理解を助けるために、添付の図面を参照されたい。
【００６７】
以下の限定されない実施例により本発明をさらに説明し、例示する。
【００６８】
（実施例１）
ＰＡＬ、ＴＡＬ、Ｃ４Ｈ、ＣＰＲ、４ＣＬ及びＶＳＴをコードする遺伝子の単離
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）（Ｃｏｃｈｒａｎｅら、２００４年；配列番号１、配列番号２）、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）（Ｍｉｚｕｔａｎｉら、１９９７年；配列番号３、配列番号４）及び４−クマレート：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ１）（ハンバーガー及びハルブロック（Hamberger and Hahlbrock）、２００４年；エルチングら（Ehlting et al.）、１９９９年；配列番号５、配列番号６）を、ＰＣＲにより、表１のプライマーを用いて、シロイヌナズナのｃＤＮＡ（バイオキャット社（BioCat）、ハイデルベルグ、ドイツ）からＰＣＲにより単離した。コハク酸とクマロイル−ＣｏＡのそれぞれに対する好ましい速度パラメーターのために、幾つかのシロイヌナズナ相同体のうち、ＰＡＬ２と４ＣＬ１を選択した（コクレンら（Cochrane et al.）、２００４年；ハンバーガー及びハルブロック（Hamberger and Hahlbrock）、２００４年；エルチングら（Ehlting et al.）、１９９９年）。
【００６９】
Ｒｈｅｕｍ ｔａｔａｒｉｃｕｍに由来するリスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）のコード配列（サマピトら（Samappito et al）、２００３年；配列番号７、配列番号８）及びロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに由来するチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）（キンドら（Kyndt et al.）、２００２年；配列番号１１、配列番号１２）は、Ｓ．セレヴィシエでの発現のために、ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍのオンラインサービスバックトランスレーションツールを用いてコドン最適化を行って、それぞれ配列番号９と１０及び配列番号１３と１４を得た。合成遺伝子組立てのためのオリゴはＭＷＧバイオテック社（MWG Biotech）で構築され、合成遺伝子は、以下に説明するマーチンら（Martin et al.）（２００３年）の若干改良された方法プロトコールを用いて、ＰＣＲにより組み立てられた。
【００７０】
【表１】
【００７１】
合成遺伝子の組立てのためにＭＷＧ社のプライマーをミリＱ水に１００ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度に溶解した。各プライマーの５μｌのアリコートをトータルミックス中で一緒にし、次にミリＱ水で１０倍希釈した。遺伝子は、融合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）のために５０μｌあたり鋳型として５μｌの希釈トータルミックスを用いたＰＣＲにより組み立てた。ＰＣＲプログラムは以下の通りである。最初に９８℃で３０秒間、次に、１０００塩基対あたり、９８℃で１０秒間、４０℃で１分間及び７２℃で１分間の３０サイクル、及び最後に７２℃で５分間とした。得られたＰＣＲ反応物から、２０μｌ
を１％アガロースゲルで精製した。その結果はＰＣＲスメアであり、欲する大きさの周囲の領域をアガロースゲルから切り取り、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社（Qiagen））を用いて精製した。表１の（ＴＡＬ及びＶＳＴ用の）外側のプライマーによる最終的なＰＣＲは、要求されたＴＡＬ遺伝子とＶＳＴ遺伝子を与えた。Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発ＩＩキット（ストラタジン社（Stratagene）、ラホーヤ、カリフォルニア州）を用いるか、又は幾つかの異なる大腸菌サブクローンに由来するオーバーラップエラーフリーＤＮＡストレッチからＰＣＲを用いて点突然変異を補正した。
【００７２】
シロイヌナズナ（ＡＲ２）に由来するＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）（ミズタニ及びオータ（Mizutani and Ohta）、１９９８年；配列番号１７、配列番号１８）及びＳ．セレヴィシエ（ＣＰＲ１）に由来するＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ１）（アオヤマら（Aoyama et al.）、１９７８年；配列番号１５、配列番号１６）は、表１のプライマーを用いて、シロイヌナズナのｃＤＮＡ（バイオキャット社（BioCat）、ハイデルベルグ、ドイツ）及びＳ．セレヴィシエのゲノムＤＮＡからそれぞれ単離した。
【００７３】
（実施例２）
ＰＡＬ発現用の酵母ベクターの構築
実施例１に記載のように単離されたＰＡＬをコードする遺伝子を、ＥｃｏＲ１とＳｐｅ１の制限部位（表１）を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いるＰＣＲにより再増幅した。増幅されたＰＡＬ ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１／Ｓｐｅ１により消化し、ＥｃｏＲ１／Ｓｐｅ１で消化されたｐＥＳＣ−ＵＲＡベクター（ストラタジン社（Stratagene））に連結して、ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬを得た。遺伝子の配列は２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７４】
（実施例３）
ＰＡＬ及びＣ４Ｈ発現用の酵母ベクターの構築
実施例１に記載のように単離されたＣ４Ｈをコードする遺伝子を、Ｘｈｏ１とＫｐｎ１の制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。増幅されたＣ４Ｈ ＰＣＲ産物をＸｈｏ１／Ｋｐｎ１により消化し、同様に消化されたｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬベクターに連結した。得られたプラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈは、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターの制御下にＰＡＬとＣ４Ｈをコードする遺伝子を含有した。Ｃ４Ｈをコードする遺伝子の配列は２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７５】
（実施例４）
４ＣＬ発現用酵母ベクターの構築
４ＣＬをコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅された４ＣＬ ＰＣＲ産物をＸｂａ１／ＢａｍＨ１により消化し、Ｓｐｅ１／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＥＳＣ−ＴＲＰベクター（ストラタジン社（Stratagene））に連結して、ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬを得た。ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬの２つの異なるクローンの配列を決定して、クローニングされた遺伝子の配列を検証した。
【００７６】
（実施例５）
４ＣＬ及びＶＳＴ発現用の酵母ベクターの構築
ＶＳＴをコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅された合成ＶＳＴ遺伝子をＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１により消化し、ＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１で消化されたｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ（実施例４）に連結した。得られたプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴは、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターの制御下に４ＣＬとＶＳＴをコードする遺伝子を含んでいた。ＶＳＴをコードする遺伝子の配列はｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴの２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７７】
（実施例６）
ＴＡＬ発現用酵母ベクターの構築
ＴＡＬをコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅された合成ＴＡＬ遺伝子をＥｃｏＲ１／Ｓｐｅ１により消化し、ＥｃｏＲ１／Ｓｐｅ１で消化されたｐＥＳＣ−ＵＲＡベクターに連結した。得られたプラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬは、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターの制御下にＴＡＬをコードする遺伝子を含有した。その配列はｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬの２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７８】
（実施例７）
Ｓ．セレヴィシエ内在性ＣＰＲの過剰発現用酵母ベクターの構築
Ｓ．セレヴィシエに由来するＣＰＲ（ＣＰＲ１）をコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅されたＣＰＲ１遺伝子をＸｈｏ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｘｈｏ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＥＳＣ−ＬＥＵベクター（ストラタジン社（Stratagene））に連結して、ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＣＰＲ１を得た。その配列はｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＣＰＲ１の２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７９】
（実施例８）
シロイヌナズナ ＣＰＲ（ＡＲ２）の過剰発現用酵母ベクターの構築
シロイヌナズナに由来するＣＰＲ（ＡＲ２）をコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅されたＡＲ２遺伝子をＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１で消化し、ＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１で消化されたｐＥＳＣ−ＬＥＵベクター（ストラタジン社（Stratagene））に連結して、ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＡＲ２を得た。その配列はｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＡＲ２の２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００８０】
（実施例９）
酵母Ｓ．セレヴィシエにおいてＰＡＬ、Ｃ４Ｈ、４ＣＬ及びＶＳＴを用いてリスベラトロールを導く経路の発現
適当な遺伝子マーカーを含む酵母菌株を実施例２、実施例３、実施例４、実施例５、実施例６、実施例７及び実施例８で記載したベクターにより別々に、又は組合せて形質転換した。酵母細胞の形質転換は、当分野で公知の方法にしたがって、例えば、コンピテント細胞又は電気穿孔法を用いて実施した（例えば、サムブルックら（Sambrook et al.）（１９８９年）を参照）。形質転換体は、ウラシル及び／又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【００８１】
Ｓ．セレヴィシエ菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（ＭＡＴａ ｕｒａ３）をベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ（実施例２）で形質転換して、ＦＳＳＣ−ＰＡＬ菌株を得て、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）で形質転換して、ＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ菌株を得た。Ｓ．セレヴィシエ菌株ＦＳ０１２６７（ＭＡＴａ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）はｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ及びｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ（実施例４）により同時形質転換し、形質転換された菌株をＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬと命名した。同菌株は、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ及びｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）によっても同時形質転換して、ＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴ菌株を得た。
【００８２】
（実施例１０）
Ｓ．セレヴィシエにおいてＴＡＬ、４ＣＬ及びＶＳＴを用いてリスベラトロールを導く経路の発現
Ｓ．セレヴィシエ菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（ＭＡＴａ ｕｒａ３）をベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬ（実施例６）で別に形質転換して、ＦＳＳＣ−ＴＡＬ菌株を得た。Ｓ．セレヴィシエ菌株ＦＳ０１２６７（ＭＡＴａ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）をｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬ（実施例６）及びｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ（実施例４）で同時形質転換し、形質転換された菌株をＦＳＳＣ−ＴＡＬ４ＣＬと命名した。同菌株は、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬとｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）とによっても同時形質転換して、ＦＳＳＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株を得た。形質転換体は、ウラシル及び／又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【００８３】
（実施例１１）
Ｓ．セレヴィシエにおける過剰発現内在性ＣＰＲによるリスベラトロールを導く経路の発現
Ｓ．セレヴィシエ菌株ＦＳ０１２７７（ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１）を、ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）、ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ（実施例４）及びベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＣＰＲ１（実施例７）により同時形質転換した。形質転換された菌株をＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴＣＰＲと命名した。形質転換体は、ウラシル及び／又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【００８４】
（実施例１２）
Ｓ．セレヴィシエにおける過剰発現シロイヌナズナ ＣＰＲ（ＡＲ２）によるリスベラトロールを導く経路の発現
Ｓ．セレヴィシエ菌株ＦＳ０１２７７（ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１）を、ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）、ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ（実施例４）及びベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＡＲ２（実施例８）により同時形質転換した。形質転換された菌株をＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴＡＲ２と命名した。形質転換体は、ウラシル及び／又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【００８５】
（実施例１３）
振盪フラスコによる組換え酵母菌株による発酵
前記組換え酵母菌株を滅菌した接種用ループにより寒天プレートに接種し、ビタミン類、微量元素、５ｇ／ｌのグルコース及び４０ｇ／ｌ又は１００ｇ／ｌのガラクトースを含有する２００ｍｌの合成無機培地（ベルダインら（Verduyn et al.）、１９９２年）で増殖させた。５００ｍｌのコック付き振盪フラスコを３日間、３０℃、１６０ｒｐｍでインキュベートした。
【００８６】
（実施例１４）
リスベラトロールの抽出
５０００ｇで５分間の遠心により細胞を回収した。５０ｍｌの上清アリコートを２０ｍｌの酢酸エチルで一回抽出した。この酢酸エチルを凍結乾燥し、乾燥生成物を０．７ｍｌメタノールで再溶解し、ろ過してＨＰＬＣバイアルに入れた。
【００８７】
２００ｍｌ培地から得られた細胞ペレットを１〜２ｍｌの水に溶解し、３本の迅速調製チューブに分割し、ガラス玉で砕いた。これらの３チューブからの粗製抽出物を、５０ｍｌの縫工チューブ中の１０ｍｌの１００％メタノール中にプールし、４℃の冷暗部屋でロータリーチャンバーにより４８時間抽出した。４８時間後、細胞デブリスを遠心により５分間、５０００ｇで除去し、該メタノールを一晩の凍結乾燥により除去した。乾燥残留物を１ｍｌのリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）に再溶解し、アーモンドに由来する１０単位のベータ−グルコシダーゼ（シグマ社（Sigma）製）を加えて、推定上グルコシド結合とされる構造物からリスベラトロールを遊離させた。混合物を３時間、３７℃でインキュベートし、次に、１ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。一緒にした酢酸エチルを凍結乾燥し、乾燥残留物を０．７ｍｌのメタノールに再溶解し、ろ過してＨＰＬＣバイアルに入れた。
【００８８】
（実施例１５）
リスベラトロールの分析
（薄層クロマトグラフィー）
同一のＴＬＣプレートによるケイヒ酸、クマル酸及びリスベラトロールの迅速な分離を可能とする薄層クロマトグラフィーに基づく方法を迅速なスクリーニング分析のために開発した。細胞と上清の両方を含む１ｍｌの培養物アリコートを５００マイクロリットルの酢酸エチルで抽出し、微小遠心機により１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。該酢酸エチルを乾燥し、メタノールに再溶解した。抽出物を、蛍光指示薬を含むシリカＧプレート（０．２ｍｍ Ａｌｕｇｒａｍ ＳＩＬ Ｇ／ＵＶ２５４、マシュレ・ナーゲル社（Macherey-Nagel）製）により分析した。移動相はクロロホルム、酢酸エチル及び蟻酸の混合物（２５：１０：１）であった。
【００８９】
（ＨＰＬＣ）
ケイヒ酸、クマル酸及びリスベラトロールの定量的分析のために、試料を、λ＝３０６ｎｍのＵＶダイオードアレイ検出前に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アジレント（Agilent）シリーズ１１００システム（ヒューレットパッカード社（Hewlett Packard）製）による分離に供した。フェノメネックス社（Phenomenex）（トランス、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）製Ｌｕｎａ３マイクロメートルＣ１８（１００×２．００ｍｍ）カラムを４０℃で用いた。移動相として、アセトニトリルとミリＱ水（両方とも５０ｐｐｍのトリフルオロ酢酸を含む）のグラジエントを０．４ｍｌ／分の流速で用いた。グラジエントのプロフィールは２０分間にわたる１５％アセトニトリルから１００％アセトニトリルへのリニアであった。溶出時間はクマル酸で約３．４分、遊離トランス−リスベラトロールで５．５分、ケイヒ酸で６．８分であった。
【００９０】
純粋なリスベラトロールスタンダードはケーマンケミカル社（Cayman chemical company）から購入し、純粋なクマル酸スタンダードとケイヒ酸スタンダードはシグマ社（Sigma）から購入した。
【００９１】
（結果）
ＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴ菌株とＦＳＳＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株を実施例１３に記載のように１００ｇ／ｌのガラクトースで培養し、実施例１４と実施例１５にしたがって細胞内リスベラトロールの含量を分析した。さらに、空のベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ及びｐＥＳＣ−ＴＲＰのみを含むコントロール菌株のＦＳＳＣコントロールを含めた。ＨＰＬＣ分析は、ＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴ菌株とＦＳＳＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株がトランス−リスベラトロールと同じ５．５分の保持時間を有する成分を含むことを示した（図４）。この結果は、約３０６ｎｍのλｍａｘを有する純粋なトランス−リスベラトロールの吸収スペクトルに類似するＵＶ吸収スペクトル（図５）によっても確認された。
【００９２】
したがって、これらの結果は、トランス−リスベラトロールのインビボ生産を導くＳ．セレヴィシエの活性フェニル−プロパノイド経路の存在を示した。明確な増殖条件下にバッチ培養及び連続培養で菌株を培養し、及び／又は個々の酵素の発現／活性を最適化することによってリスベラトロールの生産が最も高い可能性で向上できるだろう。
【００９３】
（実施例１６）
大腸菌におけるＴＡＬ発現用細菌ベクターの構築
実施例１に記載したように単離されたＴＡＬをコードする遺伝子を、フォワードプライマー５’−ＣＣＧ ＣＴＣＧＡＧ ＣＧＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＡＡ Ｇ−３’（配列番号３３）とリバースプライマー５’−ＧＣ ＧＧＡＴＣＣ ＴＴＡ ＡＧＣ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＧＣ Ｔ−３’（配列番号３４）（制限酵素部位ＸｈｏＩとＢａｍＨＩをそれぞれ有する５’突出を有する）を用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬ（実施例６）から、ＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物のＸｈｏＩとＢａｍＨＩとで消化したｐＥＴ１６ｂベクター（ノバゲン社（Novagen）製）への連結が可能となり、ｐＥＴ１６ｂ−ＴＡＬが得られた。ｐＥＴ１６ｂベクターはアンピシリン耐性遺伝子とＴ７プロモーターの両方を含んでいた。よって、上記手順は、Ｔ７プロモーターの制御下にＴＡＬをコードする遺伝子を含み、抗生物質選択マーカーを有するベクターをもたらした。ＴＡＬをコードする遺伝子の配列はｐＥＴ１６ｂ−ＴＡＬの１つのクローンの配列決定により検証した。
【００９４】
（実施例１７）
大腸菌における４ＣＬとＶＳＴの発現用細菌ベクターの構築
実施例１に記載したように単離されたＶＳＴをコードする遺伝子を、制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩとにより４ＣＬとＶＳＴをコードする遺伝子を含む消化プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）から切り出した。カナマイシン耐性遺伝子を含有し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したｐＥＴ２６ｂベクター（ノバゲン社（Novagen）製）にこのＶＳＴ遺伝子を連結してｐＥＴ２６ｂ−ＶＳＴを得た。制限酵素ＸｈｏＩとＳａｌＩは適合性末端を有し、適当な連結を可能とした。ｐＥＴ２６ｂベクターはカナマイシン耐性遺伝子とＴ７プロモーターの両方を含んでいた。よって、上記手順は、Ｔ７プロモーターの制御下にＶＳＴをコードする遺伝子を含み、抗生物質選択マーカーを有するベクターをもたらした。
【００９５】
実施例１に記載したように単離された４ＣＬをコードする遺伝子を、フォワードプライマー５’−ＴＧ ＣＣＡＴＧＧ ＣＡ ＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣ ＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣ ＡＧＴＴＴ−３’（配列番号３５）とリバースプライマー５’−ＧＣ ＧＧＡＴＣＣ ＣＣＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＴＴ ＴＧＣ ＴＡＧ ＴＴＴ ＴＧＣＣ−３’（配列番号３６）（制限酵素部位ＮｃｏＩとＢａｍＨＩをそれぞれ有する５’突出を有する）を用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）から、ＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物のＮｃｏＩとＢａｍＨＩとで消化したｐＥＴ１６ｂベクター（ノバゲン社（Novagen）製）への連結を可能とした。得られたプラスミドｐＥＴｌ６ｂ−４ＣＬは、Ｔ７プロモーターの制御下に４ＣＬをコードする遺伝子を含んでいた。Ｔ７プロモーターと４ＣＬをコードする遺伝子との両方を、フォワードプライマー５’−ＴＴ ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＡＡＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＣＣ ＣＧＣ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＣＧ−３’（配列番号３７）とリバースプライマー５’−ＣＧ ＣＴＣＧＡＧ ＣＣＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＴＴ ＴＧＣ ＴＡＧ ＴＴＴ ＴＧＣＣ−３’（配列番号３８）（制限酵素部位ＮｏｔＩとＸｈｏＩをそれぞれ有する５’突出を有する）を用いて、プラスミドｐＥＴｌ６ｂ−４ＣＬから、ＰＣＲにより１つの断片として再増幅した。ＤＮＡ断片の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、連結前にＮｏｔＩＸｈｏＩとで消化したプラスミドｐＥＴ２６ｂ−ＶＳＴへの制限ＰＣＲ産物の連結を可能とした。得られたプラスミドｐＥＴ２６ｂ−ＶＳＴ−４ＣＬは、それぞれが個々のＴ７プロモーターの制御下にある２つの遺伝子（４ＣＬ及びＶＳＴ）を含んでいた。
【００９６】
（実施例１８）
大腸菌において、ＴＡＬ、４ＣＬ及びＶＳＴを用いてリスベラトロールを導く経路の発現
細菌細胞の形質転換を当分野で公知の方法にしたがって、例えば、コンピテント細胞又は電気穿孔法を用いて実施した（例えば、サムブルックら（Sambrook et al.）（１９８９年）を参照）。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバゲン社（Novagen）製）を２種類のベクターｐＥＴ１６ｂ−ＴＡＬ（実施例１６）とｐＥＴ２６ｂ−ＶＳＴ−４ＣＬ（実施例１７）とにより同時形質転換して、ＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株を得た。さらに、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、２種類の空のベクターｐＥＴ１６ｂ（ノバゲン社（Novagen）製）とｐＥＴ２６ｂ（ノバゲン社（Novagen）製）とで同時形質転換して、コントロール菌株として用いられるＦＳＥＣコントロール菌株を得た。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地により選択した。
【００９７】
（実施例１９）
振盪フラスコでの組換え大腸菌株による発酵
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の前培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む７ｍｌのＬＢ培地で、１６０ｒｐｍ、３７℃にてガラス管中で増殖させた。指数関数的に成長する前培養物を、５０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、８０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを追加した２００ｍｌのＬＢ培地を含む５００ｍｌバッフル付き振盪フラスコの接種に用いて、１６０ｒｐｍ、３７℃でインキュベートした。５時間後、３遺伝子（ＴＡＬ、４ＣＬ及びＶＳＴ）のそれぞれの上流に存在するＴ７プロモーターの誘導因子として、イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度で加えた。３７℃での４８時間のインキュベーション時間の後、細胞を採取し、抽出手順に供し、産生したリスベラトロールの有無を分析した。
【００９８】
（実施例２０）
大腸菌のリスベラトロールの抽出と分析
抽出及び分析は、実施例１４と実施例１５に記載の方法を用いて実施した。
【００９９】
（結果）
菌株ＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ及びＦＳＥＣコントロールを、実施例１９に記載のように５０ｇ／ｌグルコースで培養し、実施例１４と実施例１５にしたがって細胞内リスベラトロールの含量を分析した。ＨＰＬＣ分析は、ＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株が、クマル酸と同じ３．４分の保持時間を有するかなりの量の成分を含むことを示した（図６）。しかし、その抽出物はトランス−リスベラトロールと同じ時間で溶出する成分を含んでいなかった。したがって、この結果は、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）は実際に活性はあるが、検出可能な量のリスベラトロールの生産を導くことはないことを示した。しかし、リスベラトロール形成の欠如は、ｉ）非機能性クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、ｉｉ）非機能性リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）、ｉｉｉ）非最適培養条件又はＴＡＬの非最適発現／活性により引き起こされるか、又はクマル酸の他の産物への分岐により引き起こされる非常に低いレベルのクマル酸との結果でありうるだろう。この仮説を評価するために、実施例１９に記載の類似の培地を用いたが、ここでは２０ｍｇ／ｌのクマル酸の存在下で菌株を増殖させた。ＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴの抽出物の引き続くＨＰＬＣ分析は、トランス−リスベラトロールと同じ保持時間あたりに一群のピークを実際に示し、これはＦＳコントロールの抽出物には観察されなかった（図６）。実際、５．５分の保持時間を有するピークのＵＶ吸収スペクトルは純粋なリスベラトロールのスペクトルに類似したが（図７）、そのようなスペクトルはコントロール菌株でのピークでは得られなかった。したがって、これらの結果は、リスベラトロールの生産を導きうる大腸菌の活性フェニルプロパノイド経路の存在を強く示唆する。明確な増殖条件下にバッチ培養及び連続培養で菌株を培養し、及び／又は個々の酵素の発現／活性を最適化することによって、クマル酸添加なしのリスベラトロールの生産が最も高い可能性で達成できるだろう。
【０１００】
（実施例２１）
乳酸連鎖球菌におけるＰＡＬとＣ４Ｈの発現用細菌ベクターの構築
下記実施例に使用されるプラスミドｐＳＨ７１とその誘導体は、大腸菌と乳酸連鎖球菌に由来する複数の複製開始点を有する二機能性シャトルベクターである。それによって、宿主域特異性は大腸菌及び他の種の乳酸菌にわたる。したがって、乳酸連鎖球菌の形質転換は通常は問題なく進むが、他の種の乳酸菌の推定上の困難な形質転換は組換えプラスミドの構築のための中間ホストとして大腸菌を用いることにより克服することができる。プラスミドは１つ以上のマーカー遺伝子を持っており、それらを持つ微生物を、それらを持たない微生物から選択することができる。乳酸連鎖球菌に用いられる選択システムは、優性マーカー、例えば、エリスロマイシンとクロラムフェニコールに対する耐性に基づくが、糖質代謝に関与する遺伝子、ペプチダーゼ及び食品用マーカーに基づくシステムも記載されてきた。さらに、プラスミドは、組換え遺伝子の発現を可能とするプロモーター配列とターミネーター配列を含む。好適なプロモーターは、乳酸連鎖球菌の遺伝子、例えば、ｌａｃＡから取られる。さらに、プラスミドはＤＮＡ断片のクローニングとそれに引き続く組換え体の同定を容易にする好適な独自の制限部位を含む。
【０１０１】
下記の実施例において、プラスミドは、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒと呼ばれるエリスロマイシン耐性遺伝子又はｐＳＨ７１−ＣＭｒと呼ばれるクロラムフェニコール耐性遺伝子のいずれかを含む。
【０１０２】
実施例１に記載のように単離されたＰＡＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）からＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を乳酸連鎖球菌に由来するｌａｃＡプロモーターを含む消化ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬは、乳酸連鎖球菌由来のｌａｃＡプロモーターの制御下にＰＡＬをコードする遺伝子を含有する。
【０１０３】
実施例１に記載のように単離されたＣ４Ｈをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）からＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＳＨ７１−ＣＭｒベクターに連結して、ｐＳＨ７１−ＣＭｒ−Ｃ４Ｈを得ることができる。ｌａｃＡプロモーターとＣ４Ｈをコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＳＨ７１−ＣＭｒ−Ｃ４ＨからＰＣＲにより１つの断片として再増幅する。ＤＮＡ断片の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化プラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈは、個々のｌａｃＡプロモーターの制御下にＰＡＬとＣ４Ｈをそれぞれコードする遺伝子を含む。ＰＡＬとＣ４Ｈをコードする遺伝子の配列を、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１０４】
（実施例２２）
乳酸連鎖球菌におけるＴＡＬ発現用細菌ベクターの構築
実施例１に記載のように単離されたＴＡＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてプラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬ（実施例６）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＴＡＬは、乳酸連鎖球菌に由来するｌａｃＡプロモーターの制御下にＴＡＬをコードする遺伝子を含む。ＴＡＬをコードする遺伝子の配列を、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＴＡＬの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１０５】
（実施例２３）
乳酸連鎖球菌における４ＣＬとＶＳＴの発現用細菌ベクターの構築
実施例１に記載のように単離された４ＣＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＳＨ７１−ＣＭｒベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬは、乳酸桿菌（Lactobacillus lactis）由来のｌａｃＡプロモーターの制御下に４ＣＬをコードする遺伝子を含有する。
【０１０６】
実施例１に記載のように単離されたＶＳＴをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）からＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＶＳＴは、乳酸連鎖球菌に由来するｌａｃＡプロモーターの制御下にＶＳＴをコードする遺伝子を含む。ｌａｃＡプロモーターと、ＶＳＴをコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＶＳＴからＰＣＲにより１つの断片として再増幅する。ＤＮＡ断片の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化プラスミドｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ−ＶＳＴは、個々のｌａｃＡプロモーターの制御下に４ＣＬ及びＶＳＴをそれぞれコードする遺伝子を含む。４ＣＬとＶＳＴをコードする遺伝子の配列を、ｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ−ＶＳＴの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１０７】
（実施例２４）
乳酸連鎖球菌においてリスベラトロールを導く経路の発現
乳酸連鎖球菌株を、実施例２１、実施例２２及び実施例２３に記載されたベクターで別々に、又は組合せて形質転換する。細菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、コンピテント細胞又は電気穿孔法を用いて実施した（例えば、サムブルックら（Sambrook et al.）（１９８９年）を参照）。形質転換体は、抗生物質のエリスロマイシンとクロラムフェニコールとを含有する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【０１０８】
別に、乳酸連鎖球菌株ＭＧ１３６３をベクターｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＴＡＬ（実施例２２）により形質転換して、菌株ＦＳＬＬ−ＴＡＬを得て、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例２１）により菌株ＦＳＬＬ−ＰＡＬＣ４Ｈを得て、ｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２３）により菌株ＦＳＬＬ−４ＣＬＶＳＴを得る。さらに、乳酸連鎖球菌株ＭＧ１３６３を、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＴＡＬ（実施例２２）及びｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２３）により同時形質転換し、この形質転換された菌株をＦＳＬＬ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴと命名する。同菌株をｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例２１）とｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２３）によっても同時形質転換して、菌株ＦＳＬＬ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴを得る。
【０１０９】
（実施例２５）
発酵槽での組換え乳酸連鎖球菌株による発酵
組換え酵母菌株は、バッチ培養、流加バッチ培養又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。
【０１１０】
（バッチ培養と流加バッチ培養）
微生物を、１．５リットルの有効容積のバッフル付きバイオリアクターで、嫌気的、好気的又は微好気的条件で増殖させる。すべての培養物を３０℃で、３５０ｒｐｍにてインキュベートする。ｐＨ６．６で一定になるように１０ＭのＫＯＨの自動添加により維持する。細胞を、以下の成分を補充した合成ＭＳ１０培地中でラクトースにより増殖させて好気的条件下の増殖を可能とする：ＭｎＳＯ４（１．２５×１０−５ｇ／ｌ）、チアミン（１ｍｇ／ｌ）及びＤＬ−６，８−チオクト酸（２．５ｍｇ／ｌ）。ラクトース濃度は、例えば、５０ｇ／ｌである。３倍高い濃度のＫ２ＨＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４で緩衝化した上記培地により、振盪フラスコ内、３０℃で増殖させた前培養物の細胞をバイオリアクターに接種する。接種前にＮ２（純度９９．９９８％）を培地に流すことにより、かつ培養中にバイオリアクターの上部空間にＮ２５０ｍｌ／分の定速を維持することにより好気的条件を確保する。微好気的条件及び好気的培養のために用いられるバイオリアクターは、空気（ＤＯＴ、１００％）及びＮ２（ＤＯＴ、０％）で較正されたポーラログラフィー酸素センサーを備える。好気的条件はバイオリアクターに空気を１ｖｖｍの速度で拡散させてＤＯＴが８０％を超えることを確保することで得られる。微好気的実験中、Ｎ２と大気の空気の混合物からなる気体を０．２５ｖｖｍの速度でリアクターに拡散することによりＤＯＴが５％の一定に保たれる。
【０１１１】
（ケモスタット培養物）
ケモスタット培養物において、細胞は例えば１Ｌの有効容積のアプリコン（Applikon）実験室用発酵槽で、３０℃、３５０ｒｐｍで増殖させることができる。希釈率（Ｄ）は、異なった値、例えば、０．０５０ｈ−１、０．１０ｈ−１、０．１５ｈ−１又は０．２０ｈ−１に設定することができる。消泡剤（５０μｌ／ｌ）を追加した上記成長培地を用いて、５ＭのＫＯＨの自動追加によりｐＨを一定、例えば６．６に保つ。ラクトースの濃度を異なる値、例えば、３．０ｇ／ｌ、６．０ｇ／ｌ、１２．０ｇ／ｌ、１５．０ｇ／ｌ又は１８．０ｇ／ｌに設定することができる。バイオリアクターに１ｍｇ／ｌの初期バイオマス濃度で接種し、指数増殖期の終わりにフィードポンプを作動させる。
【０１１２】
嫌気的定常状態は５０ｍｌ／分のＮ２（純度９９．９９８％）をバイオリアクターの上部空間に導入することにより得る。異なる無酸素性定常状態は、Ｎ２（純度９９．９９８％）と大気の空気とから多様な比率で構成される２５０ｍｌ／分のガスをリアクターに拡散させることにより得ることができる。バイオリアクターに空気（１００％ＤＯＴ）とＮ２（０％ＤＯＴ）を拡散させることにより酸素電極を較正する。
【０１１３】
すべての条件で、ガスはバイオリアクターに導入する前に滅菌ろ過する。オフガスは、−８℃未満に冷却した冷却器を経て、アコースティックガスアナライザーによりそのＣＯ２とＯ２の体積含量が分析される。
【０１１４】
少なくとも５滞留時間後、及びバイオマスと発酵最終生成物の濃度が最後の少なくとも２滞留時間にわたって変化しない（５％相対偏差未満）の場合、培養は定常状態にあると考えられる。
【０１１５】
（実施例２６）
乳酸連鎖球菌におけるリスベラトロールの抽出と分析
抽出と分析は実施例１４と実施例１５に記載された方法を用いて実施する。
【０１１６】
（実施例２７）
アスペルギルス属に属する種におけるＰＡＬとＣ４Ｈの発現用真菌ベクターの構築
下記実施例で使用されるプラスミドは、黒色アスペルギルスと麹菌で自己プラスミド複製も維持する、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のＡＭＡ１開始複製配列を含有するｐＡＲｐ１から得られる（ゲムスら（Gems et al.）、１９９１年）。さらに、プラスミドは大腸菌の複製配列を含むシャトルベクターであるので、黒色アスペルギルス及び麹菌での固有の困難な形質転換が、組換えプラスミドの構築のために中間ホストとして大腸菌を用いることにより克服することができる。プラスミドは１つ以上のマーカー遺伝子を持っており、それらを持つ微生物を、それらを持たない微生物から選択することを可能とする。選択システムは、優性マーカー、例えば、ハイグロマイシンＢ、フレオマイシン及びブレオマイシンに対する耐性、又は異種マーカー、例えば、アミノ酸及びｐｙｒＧ遺伝子に基づくことができる。さらに、プラスミドは組換え遺伝子の発現を可能とするプロモーター配列とターミネーター配列を含む。好適なプロモーターは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓの遺伝子、例えば、ａｌｃＡ、ｇｌａＡ、ａｍｙ、ｎｉａＤ及びｇｐｄＡから得られる。さらに、プラスミドはＤＮＡ断片のクローニング及びその後の組換え体の同定を容易にする好適な独自の制限部位を含む。
【０１１７】
下記の実施例で用いられるプラスミドは強力な構成的ｇｐｄＡプロモーターと栄養要求性マーカーを含み、これらすべてがアスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓを起源とする。メチオニン生合成に関与する遺伝子ｍｅｔｈＧを含むプラスミドをｐＡＭＡ１−ＭＥＴと命名する。ヒスチジン生合成に関与する遺伝子ｈｉｓＡを含むプラスミドをｐＡＭＡ１−ＨＩＳと命名する。
【０１１８】
実施例１に記載のように単離されたＰＡＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含
む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物をアスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓに由来するｇｐｄＡプロモーターを含む消化ｐＡＭＡ１−ＭＥＴベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｇｐｄＡプロモーターの制御下にＰＡＬをコードする遺伝子を含有する。
【０１１９】
実施例１に記載のように単離されたＣ４Ｈをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＡＭＡ１−ＨＩＳベクターに連結してｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−Ｃ４Ｈを得ることができる。ｇｐｄＡプロモーターと、Ｃ４Ｈをコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−Ｃ４ＨからＰＣＲにより１つの断片として再増幅する。ＤＮＡ断片の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化プラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓに由来する個々のｐｇｄＡプロモーターの制御下にＰＡＬとＣ４Ｈをそれぞれコードする遺伝子を含む。ＰＡＬとＣ４Ｈをコードする遺伝子の配列をｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１２０】
（実施例２８）
アスペルギルス属に属する種におけるＴＡＬの発現用真菌ベクターの構築
実施例１に記載のように単離されたＴＡＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬ（実施例６）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＡＭＡ１−ＭＥＴベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＴＡＬは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓに由来するｇｐｄＡプロモーターの制御下にＴＡＬをコードする遺伝子を含む。ＴＡＬをコードする遺伝子の配列をｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＴＡＬの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１２１】
（実施例２９）
アスペルギルス属に属する種における４ＣＬとＶＳＴの発現用真菌ベクターの構築
実施例１に記載のように単離された４ＣＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｇｐｄＡプロモーターを含む消化ｐＡＭＡ１−ＨＩＳベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓに由来するｇｐｄＡプロモーターの制御下に４ＣＬをコードする遺伝子を含む。
【０１２２】
実施例１に記載のように単離されたＶＳＴをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＡＭＡ１−ＭＥＴベクターに連結してｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＶＳＴを得ることができる。ｇｐｄＡプロモーターと、ＶＳＴをコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＶＳＴからＰＣＲにより１つの断片として再増幅する。ＤＮＡ断片の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化プラスミドｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ−ＶＳＴは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓに由来する個々のｐｇｄＡプロモーターの制御下にＣ４ＬとＶＳＴをそれぞれコードする遺伝子を含む。４ＣＬとＶＳＴをコードする遺伝子の配列をｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ−ＶＳＴの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１２３】
（実施例３０）
黒色アスペルギルスにおいてリスベラトロールを導く経路の発現
黒色アスペルギルス菌株を、実施例２７、実施例２８及び実施例２９に記載されたベクターで、別々に、又は組合せて形質転換する。細菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、電気穿孔法又は接合を用いて実施する（例えば、サムブルックら（Sambrook et al.）（１９８９年）を参照）。形質転換体は、メチオニン及び／又はヒスチジンを欠く最小培地により選択する。
【０１２４】
ヒスチジンとメチオニンに対して栄養要求性のあるアスペルギルス ｎｉｇｅｒの菌株、例えば、別々にＦＧＳＣ Ａ９１９菌株（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔを参照）をベクターｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＴＡＬ（実施例２８）により形質転換して菌株ＦＳＡＮ−ＴＡＬを得て、ｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例２７）により菌株ＦＳＡＮ−ＰＡＬＣ４Ｈを得て、ｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２９）により菌株ＦＳＡＮ−４ＣＬＶＳＴを得る。さらに、黒色アスペルギルス菌株ＦＧＳＣ Ａ９１９をｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＴＡＬ（実施例２８）とｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２９）とで同時形質転換して、形質転換菌株をＦＳＡＮ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴと名付ける。また、同菌株をｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例２７）及びｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２９）によっても同時形質転換して菌株ＦＳＡＮ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴを得る。
【０１２５】
（実施例３１）
麹菌においてリスベラトロールを導く経路の発現
ＰＡＬ、Ｃ４Ｈ及び４ＣＬをコードする天然の遺伝子組を含有する麹菌の菌株（非特許文献１８）であって、メチオニンに対して栄養要求性のある菌株をベクターｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＶＳＴ（実施例２９）により形質転換して、菌株ＦＳＡＯ−ＶＳＴを得る。真菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、電気穿孔法又は接合を用いて実施する（例えば、サムブルックら（Sambrook et al.）（１９８９年）を参照）。形質転換体はメチオニンを欠く培地により選択する。
【０１２６】
（実施例３２）
培養槽における黒色アスペルギルス及び麹菌の組換え菌株による発酵
組換え酵母菌株は、バッチ培養、流加バッチ培養又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。
【０１２７】
（バッチ培養及び流加バッチ培養）
微生物は、好気的条件下で、１．５リットルの有効容積のバッフル付きバイオリアクターで増殖させる。すべての培養物を３０℃で、５００ｒｐｍにてインキュベートする。ｐＨ６．０で一定となるように１０ＭのＫＯＨの自動添加により維持し、好気的条件は空気を１ｖｖｍの速度でバイオリアクターに拡散させてＤＯＴが８０％を超えることを確保することで得られる。以下の成分からなる合成培地中で細胞をグルコースで増殖させてバッチ培養で増殖させる：７．３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．１ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｌ／ｌのシグマ社製の消泡剤、７．２ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．５ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ及び６．９ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。グルコース濃度は、例えば、１０ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ、３０ｇ／ｌ、４０ｇ／ｌ又は５０ｇ／ｌである。流加バッチ培養で細胞を増殖させるために、培地は、バッチ相中の７．３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１．９ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．１０ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｌ／ｌのシグマ社製の消泡剤、７．２ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．５ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ及び６．９ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・Ｈ２Ｏからなる。次に、リアクターに、例えば、２８５ｇ／ｋｇのグルコースと４２ｇ／ｋｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４を供給する。
【０１２８】
前バッチからの遊離した菌糸体を用いて、バッチ培養物及び流加バッチ培養物に接種する。２．１０９／ｌ濃度の胞子を用いて、ｐＨ２．５の前バッチ培養物に接種する。以下の成分が添加された２９ｇの米により凍結乾燥胞子を増殖させて胞子を得る：６ｍｌの１５ｇ／ｌのスクロース、２．３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５０ｇ／ｌのＮａＣｌ、１４．３ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｍｇ／ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５０ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ及び１３．８ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。これらの胞子は、３０℃で、７〜１４日間増殖して米粒上に胞子の黒い層を生じ、滅菌水中の１００ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えることにより胞子を回収する。すべての条件に関して、ガスはバイオリアクターに導入する前に滅菌ろ過する。オフガスは−８℃未満に冷却した冷却器を経て、アコースティックガスアナライザーによりそのＣＯ２とＯ２の体積含量を分析する。
【０１２９】
ケモスタット培養
ケモスタット培養では、例えば１．５リットルの有効容積のバッフル付きバイオスタットＢ実験室用発酵槽で、３０℃、５００ｒｐｍで細胞を増殖させることができる。ｐＨ６．６で一定になるように１０ＭのＫＯＨの自動添加により維持し、好気的条件は、空気を１ｖｖｍの速度でバイオリアクターに拡散して、確実にＤＯＴが８０％を超えさせることにより得られる。希釈率（Ｄ）は、異なる値、例えば、０．０５０ｈ−１、０．１０ｈ−１、０．１５ｈ−１又は０．２０ｈ−１に設定できる。以下の成分を有する最小成長培地を用いて、１０Ｍの自動追加によりｐＨを一定、例えば、６．６に保持する：２．５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．１ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｌ／ｌのシグマ社製消泡剤、７．２ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．５ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ及び６．９ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。グルコースの濃度は異なる値、例えば、３．０ｇ／ｌ、６．０ｇ／ｌ、１２．０ｇ／ｌ、１５．０ｇ／ｌ又は１８．０ｇ／ｌに設定することができる。バイオリアクターには上記のように前バッチ培養物からの遊離菌糸体が接種され、指数増殖期の終わりにフィードポンプを作動させる。
【０１３０】
すべての条件について、ガスはバイオリアクターに導入する前に滅菌ろ過する。オフガスは−８℃未満に冷却した冷却器を経て、アコースティックガスアナライザーによりそのＣＯ２とＯ２の体積含量を分析する。
【０１３１】
少なくとも５滞留時間後、及びバイオマスグルコースとオフガスの組成が最後の２滞留時間にわたって変化しない（５％相対偏差未満）の場合、培養は定常状態にあると考えられる。
【０１３２】
（実施例３３）
黒色アスペルギルス及び麹菌におけるリスベラトロールの抽出と分析
抽出と分析は実施例１４と実施例１５に記載された方法を用いて実施する。
【０１３３】
参考文献
米国特許出願公開第６５２１７４８号
米国特許出願公開第２００１０５３８４７号
米国特許出願公開第２００４０５９１０３号
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【０１３４】
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【０１４５】
Ｓｃｈｏｐｐｎｅｒ，Ａ．；Ｋｉｎｄｌ，Ｈ．（１９８４）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｓｔｉｌｂｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，６８０６−６８１１．
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【０１４６】
Ｗａｔｔｓ，Ｋ．Ｔ．，Ｌｅｅ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ，Ｃ．（２００４）．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ５，５００−５０７．
【０１４７】
以下は本明細書に現れるヌクレオチド配列とアミノ酸配列の概要である。
配列番号１は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）をコードするシロイヌナズナ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、配列番号１によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号３は、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）をコードするシロイヌナズナ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、配列番号３によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５は、４−クマレート：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ１）をコードするシロイヌナズナ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号６は、配列番号５によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号７は、リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）をコードするＲｈｅｕｍ ｔａｔａｒｉｃｕｍ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号８は、配列番号７によりコードされるアミノ酸配列である。
【０１４８】
配列番号９は、Ｓ．セレヴィシエでの発現のためにコドン最適化されたリスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）をコードするＲｈｅｕｍ ｔａｔａｒｉｃｕｍ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、配列番号９によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１１は、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）をコードするロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、配列番号１１によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１３は、Ｓ．セレヴィシエでの発現のためにコドン最適化されたチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）をコードするロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、配列番号１３によりコードされるアミノ酸配列である。
【０１４９】
配列番号１５は、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ１）をコードするＳ．セレヴィシエ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１６は、配列番号１５によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１７は、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＡＲ２）をコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎｕｓ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１８は、配列番号１７によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１９〜３２は、表１に現れる実施例１のプライマー配列である。
配列番号３３〜３４は、実施例１６に現れるプライマー配列である。
配列番号３５〜３８は、実施例１７に現れるプライマー配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、微生物細胞を用いたポリフェノールリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体、例えば、そのβ−グルコシドピセイドの生産に関する。さらに、本発明は、リスベラトロール又はそのような誘導体を作る天然微生物又は組換え微生物の、食物、餌及び飲料の生産のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬品の微生物からの生産は、バイオテクノロジーの重要な応用となっている。典型的には、そのようなバイオ生産法の開発の工程として、１）適当な微生物宿主の選択、２）副産物を導く代謝経路の排除、３）酵素活性レベルと転写レベルの両方で望ましい経路の調節解除、及び４）望ましい経路での適当な酵素の過剰発現が挙げられるだろう。好ましい態様において、本発明は、リスベラトロールの望ましい生合成のために必要な前駆体を供給する植物のフェニルプロパノイド経路の酵素により、フェニルアラニン又はチロシンからの炭素の流れを再指示する上記工程の組合せを使用している。
【０００３】
リスベラトロール（すなわち、３，４，５−トリヒロドキシスチルベン）は、感染又は他のストレスに関連する現象に応答して植物中に活動的な防御機構を構成する低分子量の二次的代謝産物であるスチルベンフィトアレキシン類の群に属するフィトフェノールである。スチルベンフィトアレキシン類はスチルベン骨格（トランス−１，２−ジフェニルエチレン）をそれらの共通する基本構造として含み、この構造は他の基の付加により補われてもよい（非特許文献１及び２）。スチルベン類は一定の木（被子植物、裸子植物）に発見されてきたが、一部の多年草（フトモモ科、ブドウ科及びマメ科の種）にも発見されている。該化合物は、有害生物、特に菌類、細菌及び昆虫への毒性がある。ほんのわずかな植物がスチルベン類を合成する能力があるか、又は有害生物に対して十分な耐性を植物に与える量でスチルベン類を生産する能力を有する。
【０００４】
スチルベンシンターゼによる基本的なスチルベン骨格の合成が探究されている。今までに、ピノシルビンシンターゼとリスベラトロールシンターゼという２種類の酵素がスチルベンシンターゼとして示された。現在までに、落花生（Arachis hypogaea）リスベラトロールシンターゼが最も詳細に特性付けられているので、その性質のほとんどが知られている（非特許文献３）。スチルベンシンターゼにより用いられる基質は、マロニル−ＣｏＡ、シンナモイル−ＣｏＡ又はクマロイル−ＣｏＡである。これらの基質は、フラボノイド、花の色素及び脂質等の他の重要な植物構成物の生合成にも同じく用いられるので、すべての植物に存在する。
【０００５】
リスベラトロール（図１：トランス形）は２個の密に結合したフェノール環からなるのでポリフェノール類に属する。ユーカリ、エゾマツ及びユリ等の他の植物やクワの実及びピーナッツ等の他の食物に存在する一方で、リスベラトロールの最も豊富な天然源は、ワイン製造に使用されるヴィティス・ヴィニヘラ、ヴィティス・ラプラスカ及びヴィティス・マスカジン（ロタンディフォリア）のブドウである。この化合物は、ブドウの木、根、種及び茎に存在するが、その最大濃度は、５０〜１００μｇ／ｇ（非特許文献４）を含む皮にある（非特許文献５）。赤ワインの醸造中、ブドウの皮は白ワインの醸造とは対照的にブドウの液汁に含まれるので、リスベラトロールは赤ワインのみに少量見られる。リスベラトロールは、その抗菌性に加えて、その心臓保護活性と発癌予防活性が認識されてきており、それは、血小板凝集の阻害剤であるフィトエストロゲン（非特許文献６、７及び８）や抗酸化物（非特許文献４及び９）として作用する。これらの性質は、所謂、フレンチパラドックス（すわなち、ワインを飲むフランス人は低運動で高脂肪食事にもかかわらず冠動脈心疾患の低い発生率）を説明する。最近、リスベラトロールは、共に寿命の延長に重要な役割を果たす酵母のＳＩＲ２遺伝子及び類似のヒト遺伝子ＳＩＲＴ１を活性化することもできることが示された。それ以来、リスベラトロールの寿命延長効果が非常に注目されている（非特許文献１０及び１１）。
【０００６】
ライフエクステンションファンデーション等のアメリカの健康協同組合は、この医薬の非常に高い薬効を促進しつつあり、それによって、成功した商品化のために理想的な状態を推進しつつある。現在の生産工程は、主に、ブドウ果皮かタデのいずれかからのリスベラトロールの抽出に依存する。これは、労働集約的な過程であり、低い利益を生むため、新規で、さらに効率的で多収量の生産方法の開発に対する動機を促している。
【０００７】
植物において、フェニルプロパノイド経路は、リグニン類、サリチレート類、クマリン類、ヒドロキシケイヒ酸アミド類、色素、フラボノイド類及びフィトアレキシン類等の多様な二次代謝化合物の合成に関与する。実際、植物におけるリスベラトロールの形成はフェニルプロパノイド経路を経る。アミノ酸のＬ−フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）により非酸化脱アミノ化によりトランスケイヒ酸に変換される（図２）。次に、トランスケイヒ酸は、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）と共同するチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ酵素であるシンナメート−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）によりパラ位でヒドロキシル化されて４−クマル酸（４−ヒドロキシケイヒ酸）となる。引き続いて、この４−クマル酸は４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）の作用により４−クマロイル−ＣｏＡに活性化される。最後に、リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）が４−クマロイル−ＣｏＡのフェニルプロパン単位のマロニルＣｏＡへの縮合を触媒して、リスベラトロールの形成をもたらす。
【０００８】
最近、ブドウ液汁に少量見られる４−クマル酸からリスベラトロールを作ることのできる酵母が開示された（非特許文献１２）。Ｓ．セレヴィシエの実験室の菌株における４−クマロイル−ＣｏＡとそれに付随するリスベラトロールの生産は、雑種ポプラに由来する異種コエンザイム−Ａリガーゼ遺伝子をブドウリスベラトロールシンターゼ遺伝子（ｖｓｔ１）とともに共発現させることにより達成された。リスベラトロールシンターゼの他の基質であるマノニル−ＣｏＡは酵母ですでに内因的に産生されており、新規な脂肪酸生合成にかかわる。研究により、Ｓ．セレヴィシエの細胞は、４−クマル酸を補った合成培地で培養した場合、微量のリスベラトロールを遊離形又はグルコシド結合形のいずれかで産生することができることが分かった。
【０００９】
しかし、該酵母は低いリスベラトロール収率に弱点があり、ごくわずかな産業用培地のみにしか存在しない４−クマル酸の添加を必要とするために、商業的利用には適さないだろう。したがって、医薬と栄養補助食品の両方としてのリスベラトロールの利用を容易にし、広げるために、４−クマル酸の添加なしに、グルコースからリスベラトロールを直接産生することのできる酵母を得ることは非常に望ましい。
【００１０】
最近の研究（非特許文献１３）には、ポプラに由来するＰＡＬ、Ｃ４Ｈ及びＣＰＲを導入することによる、Ｓ．セレヴィシエにおけるフェニルプロパノイド経路のエントリポイントの再構成が記載されている。この目的は、ＰＡＬとＣ４Ｈを含む多酵素複合体（ＭＥＣ）が、フェニルプロパノイド代謝へのエントリポイントにおいて機能的に重要かどうかを評価することにあった。組換え酵母に［３Ｈ］−フェニルアラニンを供給することにより、代謝された［３Ｈ］−フェニルアラニンの大多数が４−［３Ｈ］−クマル酸に取り込まれること、及びフェニルアラニン代謝はＣ４Ｈ活性を阻害することにより非常に減少することがわかった。さらに、ＰＬＡのみのエクスプレッサーが微小のフェニルアラニンをケイヒ酸に代謝した。［３Ｈ］−フェニルアラニンと［１４Ｃ］−トランス−ケイヒ酸を同時にトリプルエクスプレッサーに供給した場合、内因的に合成された［３Ｈ］−トランス−ケイヒ酸の４−クマル酸へのチャネリングについていかなる証拠も見られなかった。したがって、ＰＡＬとＣＨ４により触媒される反応によりフェニルアラニンから４−クマル酸への効率的な炭素の流れは酵母におけるＭＥＣによるチャネリングを必要とするようには思えず、ＰＡＬとＣ４Ｈの真の生化学的カップリングが炭素の流れをフェニルプロパノイド経路に引き込むのに十分であるように思える。さらに別の研究（非特許文献１４）において、大腸菌による植物特異的なフラバノン類の生産は多様な異種起源のフェニルプロパノイド経路の３遺伝子（酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａに由来するＰＡＬ、放線菌ストレプトミセス ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒに由来する４ＣＬ及び甘草植物Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｅｃｈｉｎａｔａに由来するカルコンシンターゼ（ＣＨＳ））を含む人工的な遺伝子クラスターの発現により達成された。細菌の４ＣＬ酵素はコエンザイムＡをトランス−ケイヒ酸と４−クマル酸の両方に連結させたので、これらの経路はＣ４Ｈをバイパスした。さらに、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ由来のＰＡＬはフェニルアラニンとチロシンの両方を基質として利用する。したがって、該遺伝子クラスターを含有し、かつグルコースで増殖した大腸菌細胞は、少量の２種類のフラバノン（フェニルアラニンからピノセムブリン（０．２９ｇ／ｌ）及びチロシンからナリンゲニン（０．１７ｇ／ｌ））を産生した。さらに、大量のそれらの前駆体である４−クマル酸とトランス−ケイヒ酸（それぞれ０．４７及び１．２３ｍｇ／リットル）が蓄積された。さらに、これらの化合物の収率はフェニルアラニンとチロシンの添加により増加させることができた。
【００１１】
双子葉植物に由来する酵素がフェニルアラニンのみを効率的に利用する一方で、幾つかの研究によって、単子葉植物及び一部の微生物に由来するＰＡＬがチロシンを同じく利用することが示された（非特許文献１５）。そのような反応において、チロシン活性物はチロシンアンモニアリアーゼと命名されている（ＴＡＬ、図３）。チロシンのＴＡＬによる変換は、Ｃ４ＨとＣＰＲの仲介なしに４−クマル酸の直接の形成をもたらす。主に、両活性は同じポリペプチドに存在し、Ｋｍとターンオーバー数の大きな違いにかかわらず、非常に類似の触媒効率を有する。しかし、植物に由来するほとんどのＰＡＬ／ＴＡＬ酵素はチロシンよりもフェニルアラニンを好む。ＴＡＬ活性のレベルはほとんどＰＡＬ活性よりも低いが、この差の程度は広範囲にわたって変化する。例えば、パセリ酵素はフェニルアラニンに対して１５〜２５μＭ及びチロシンに対して２．０〜８．０ｍＭのＫｍと、それぞれ２２秒−１と０．３秒−１のターンオーバー数を有する。対照的に、トウモロコシ酵素は、フェニルアラニンのみに対してチロシンよりも１５倍高いＫｍ値と約１０倍高いターンオーバー数を有する。さらに、赤酵母であるＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）と−ｒｕｂｒａにおいて、ＴＡＬ触媒活性はＰＡＬ触媒活性に近く、ＴＡＬ／ＰＡＬ比が約０．５８である。これらの酵母のＰＡＬ酵素は異化機能としてフェニルアラニンを分解すると考えられ、形成されるトランス−ケイヒ酸はベンゾエートと他の細胞材料に変換される一方で、植物においては、それは、リグニン、イソフラボノイド類及び他のフェニルプロパノイド類の生合成において調節酵素にすぎないと考えられている。
【００１２】
最近、光活性黄色タンパク質の発色団の生合成にかかわる仮説上の生合成チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）をコードする細菌ロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓで読み取り枠が発見された（非特許文献１６）。これは、ＰＡＬ相同遺伝子が細菌で発見された最初である。ＴＡＬ遺伝子は単離され、大腸菌で過剰生産させた。チロシンの４−クマル酸への変換に関するＫｍとｋｃａｔ値はそれぞれ１５．６μＭと２７．７秒−１であり、Ｌ−フェニルアラニンのトランス−ケイヒ酸への変換に関してはそれぞれ１２７７μＭと１５．１秒−１であった。その小さいＫｍとわずかに高いｋｃａｔの結果として、酵素はＬ−フェニルアラニンよりもチロシンに対する強い好みを示し、フェニルアラニンに対するよりも約１５０倍高いチロシンに対する触媒効率（Ｋｍ／ｋｃａｔ）を有する。動力学的研究によると、Ｌ−フェニルアラニンではなく、チロシンが生理学的条件下で酵素の天然の基質であることが立証されている。ごく最近、ある研究で、大腸菌でのフラボノイド類の産生に関してフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ、４−クマレート−Ｃｏａ−リガーゼ及びカルコンシンターゼの異種共発現が述べられている（非特許文献１７）。しかし、すべての４遺伝子における同時発現は、非機能性のシンナメート−４−ヒドロキシラーゼのために成功しなかった。しかし、ロドバクテリア ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓからクローニングされた新しいチロシンアンモニアリアーゼをフェニルアラニンアンモニアリアーゼとシンナメート−４−ヒドロキシラーゼと置き換えることでその問題が解決され、フラボノンナリンゲニンの高水準生産が導かれた。さらに、ロドバクテリア ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓに由来する該チロシンアンモニアリガーゼは、大腸菌における４−クマル酸（すなわち、パラ−ヒドロキシケイヒ酸）の異種産生のためにも用いられている（特許文献１）。さらに、グルコースを４−クマル酸に変換する生体触媒のさらなる開発方法が記載されている。特許文献２には、大腸菌とサッカロマイセス・セレヴィシエ（出芽酵母）におけるクマル酸の産生のためにＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ酵母に由来するチロシンアンモニアリアーゼが開示されている。特許文献３には、チロシンを４−クマル酸へ直接変換する野生型ＰＡＬの能力を明確に示すために、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ酵母に由来する野生型ＰＡＬの大腸菌への取り込みが記載されている。さらに、植物Ｃ４ＨとＣＰＲに加えて、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ酵母に由来する野生型ＰＡＬの大腸菌とＳ．セレヴィシエとへの取り込みの例示も存在する。増強ＴＡＬ活性を有する野生型酵母ＰＡＬ Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓの突然誘発による生体触媒の開発も記載されている（特許文献４）。上記特許のいずれもリスベラトロールの産生のために４ＣＬ及びＶＳＴの取り込みを請求するものではない。
【００１３】
最近、糸状菌の麹菌（コウジカビ）が、植物中のナリンゲニン等のフラボノイド類の生合成に通常関与するカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）酵素を含むとの証拠が示された（非特許文献１８）。実際、麹菌がフェニルプロパノイド−フラボノイド代謝に関与する主要な一組の遺伝子（すなわち、ＰＡＬ、Ｃ４Ｈ及び４ＣＬ）を含むことも示した。しかし、麹菌がリスベラトロールシンターゼ等のスチルベンシンターゼを含むとの証拠はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＵＳ−Ａ−２００４０５９１０３
【特許文献２】ＵＳ−Ａ−２００４０２３３５７
【特許文献３】ＵＳ−Ａ−２００１０５３８４７
【特許文献４】ＵＳ−Ａ−６５２１７４８
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ハート及びシュリンプトン（Hart and Shrimpton）、１９７９年
【非特許文献２】ハート（Hart）、１９８１年
【非特許文献３】ショップナー及びキンドル（Schoppner and Kindl）、１９８４年
【非特許文献４】ジャングら（Jang et al.）、１９９７年
【非特許文献５】セロッティら（Celotti et al.）、１９９６年
【非特許文献６】コップら（Kopp et al.）、１９９８年
【非特許文献７】ゲームら（Gehm et al.）、１９９７年
【非特許文献８】ロボら（Lobo et al.）、１９９５年
【非特許文献９】ファング（Huang）、１９９７年
【非特許文献１０】ハル（Hall）、２００３年
【非特許文献１１】コウジン（Couzin）、２００４年
【非特許文献１２】ベッカーら（Becker et al.）、２００３年
【非特許文献１３】ロー及びダグラス（Ro and Douglas）、２００４年
【非特許文献１４】Ｈｗａｎｇら、２００３年
【非特許文献１５】Ｒｏｓｌｅｒら、１９９７年
【非特許文献１６】キンドら（Kyndt et al.）、２００２年
【非特許文献１７】Ｗａｔｔｓら、２００４年
【非特許文献１８】Ｓｅｓｈｉｍｅら、２００５年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、
（１）４−クマル酸を生産し、さらに当該４−クマル酸からリスベラトロール又は当該リスベラトロールのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を生産する操作的な代謝経路を有する微生物において、
前記代謝経路において、前記４−クマル酸は、
当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ及びシンナメート４−ヒドロキシラーゼの作用によってＬ−フェニルアラニンから、又は、
当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ又はチロシンアンモニアリアーゼの作用によってチロシンから生成し、
４−クマロイル−ＣｏＡが、当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現する４−クマレート−ＣｏＡリガーゼによる酵素反応で前記４−クマル酸から生成し、
そして前記リスベラトロールが、当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するリスベラトロールシンターゼによって内在性マロニル−ＣｏＡを基質とする反応で前記４−クマロイル−ＣｏＡから生成することを特徴とする微生物、
（２）天然のＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物で過剰発現している、又は、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物に組換えで導入されていることを特徴とする上記（１）に記載の微生物、
（３）チロシンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の微生物、
（４）フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれか一項に記載の微生物、
（５）真菌又は細菌であることを特徴とする上記（１）乃至（４）のいずれか一項に記載の微生物、
（６）発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたシンナメート−４−ヒドロキシラーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有することを特徴とする上記（１）に記載の微生物、
（７）シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ活性を欠如し、発現シグナルに作動可能に連結されたチロシンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する上記（１）に記載の微生物、
（８）４−クマル酸の外部源の実質的な非存在下において、上記（１）乃至（７）のいずれか一項に記載の微生物を炭素基質に接触させる工程を含むことを特徴とする、リスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法、
（９）前記炭素基質が、単糖類、小糖類及び多糖類からなる発酵性炭素基質の群より選択されることを特徴とする上記（８）に記載の方法、
（１０）前記炭素基質が、エタノール、アセテート、グリセロール、ラクテート、及びアミノ酸で構成される非発酵性炭素基質からなる群より選択されることを特徴とする上記（８）に記載の方法、
（１１）前記非発酵性炭素基質が、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選択されることを特徴とする上記（１０）に記載の方法、
（１２）さらに、生産されたリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を乳製品又は飲み物中の栄養補助食品として使用することを含む上記（８）乃至（１１）のいずれか一項に記載の方法、
である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、トランス−リスベラトロールの化学構造を示す。
【図２】図２は、Ｌ−ファニルアラニンに作用するフェニルアラニンアンモニアリアーゼを利用するフェニルプロパノイド経路を示す。
【図３】図３は、Ｌ−チロシンに作用するフェニルアラニンアンモニアリアーゼを利用する別の経路を示す。
【図４】図４は、１００ｇ／ｌのガラクトースで成長させたＳ．セレヴィシエ菌株であるＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴ及びＦＳＳＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴの抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。６０ナノグラムの純粋なリスベラトロールのクロマトグラムが含まれる。
【図５】図５は、純粋なトランス−リスベラトロール及び１００ｇ／ｌのガラクトースで成長させたＳ．セレヴィシエ菌株であるＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴにより作られたトランス−リスベラトロールのＵＶ吸収スペクトルを示す。
【図６】図６は、５０ｇ／ｌのグルコースで成長させた大腸菌株であるＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ及びＦＳＥＣコントロールからの抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、２０ｍｇ／ｌのクマル酸を添加した５０ｇ／ｌのグルコースで成長させた大腸菌株であるＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ及びＦＳＥＣコントロールからの抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株で作られたトランス−リスベラトロールのＵＶ吸収スペクトルが含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、少なくとも１種類の活性を含む操作的な代謝経路を有する微生物において、該経路が４−クマル酸を産生し、かつそれからリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体かグリコシド結合誘導体を産生する微生物を本願において提供する。そのような微生物は自然に存在してよく、適切なスクリーニング手順により単離してもよく、さらに好ましくは遺伝子組み換えされている。
【００１９】
好ましくは、該リスベラトロール又は誘導体は、内在性のマロニル−ＣｏＡが基質である酵素により触媒される反応で作られ、好ましくは該リスベラトロールは４−クマロイル−ＣｏＡから生成される。
【００２０】
好ましくは、該リスベラトロール又は誘導体は、微生物において、好ましくは該微生物に固有ではない該酵素をコードする核酸から発現するリスベラトロールシンターゼにより４−クマロイル−ＣｏＡから生成される。
【００２１】
ここでは一般的に、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、リスベラトロールへの言及は、特にピセイドを含む、そのオリゴマー誘導体かグリコシド結合誘導体への言及を含む。
【００２２】
例えば、ある好ましい実施態様において、前記リスベラトロールシンターゼは、Ａｒａｃｈｉｓ属に属する植物、例えば、Ａ．ｇｌａｂａｔｒａ、Ａ．ｈｙｐｏｇａｅａ、Ｒｈｅｕｍ属に属する植物、例えば、Ｒ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ、ヴィティス属に属する植物、例えば、Ｖ．ラプラスカ、Ｖ．ｒｉｐａｒａｉａ、Ｖ．ヴィニヘラ、又はパイナス属、Ｐｉｃｅｅａ属、ユリ属、ユーカリ属、Ｐａｒｔｈｅｎｏｃｉｓｓｕｓ属、ジッサス属、カロコルタス属、タデ属、Ｇｎｅｔｕｍ属、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ属、Ｎｏｔｈｏｆａｇｕｓ属、フェニックス属、ウシノケグサ属、スゲ属、シュロソウ属、ハカマカズラ又はＰｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ属のいずれかに由来するリスベラトロールシンターゼ（ＥＣ２．３．１．９５）である。
【００２３】
前記４−クマル酸は、好適には、酸素が基質であり、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが補因子であり、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋が産物である酵素により触媒される反応で酵素によりトランス−ケイヒ酸から生成されることが好ましい。
【００２４】
例えば、該４−クマル酸はトランス−ケイヒ酸からシンナメート４−ヒドロキシラーゼにより作られてよく、該４−クマル酸は、好ましくは、微生物において、該微生物に固有ではない該酵素をコードする核酸から発現する。
【００２５】
上記段落で言及されたものを含むある実施態様において、該シンナメート−４−ヒドロキシラーゼは植物又は微生物に由来するシンナメート−４−ヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１３．１１）である。植物は、シロイヌナズナ属、例えば、シロイヌナズナ、Ｃｉｔｒｕｓに属する植物、例えば、Ｃ．シネンシス、Ｃ．ｘ ｐａｒａｄｉｓｉ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属する植物、例えば、Ｐ．ヴァガリス、パイナス属する植物、例えば、Ｐ．ｔａｅｄａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ属する植物、例えば、Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、ナス属する植物、例えば、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、ヴィティス属する植物、例えば、ヴィティス ヴィニヘラ、ズィー属する植物、例えば、Ｚ．メイス又は他の植物属、例えば、Ａｍｍｉ属、Ａｖｉｃｅｎｎｉａ属、カメリア属、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、グリシン属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、ハス属、マツバギク属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｒｕｔａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属に属してよい。微生物は、アスペルギルス属に属する真菌類、例えば麹菌であってよい。
【００２６】
好ましくは、前記４−クマル酸は、アンモニアが生成される酵素触媒反応でチロシンから作られ、好適には、該４−クマル酸は、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ又はチロシンアンモニアリアーゼ、例えば酵母又は細菌に由来するチロシンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．５）によりチロシンから生成される。好適には、該チロシンアンモニアリアーゼは酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ又は細菌ロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに由来する。
【００２７】
任意に、該チロシンアンモニアリアーゼは、微生物において、該微生物に固有ではない該酵素をコードする核酸から発現させる。
【００２８】
もしくは、前記トランス−ケイヒ酸は、アンモニアが生成される酵素触媒反応でＬ−フェニルアラニンから作られてよく、好適には、該トランス−ケイヒ酸は、Ｌ−フェニルアラニンからフェニルアラニンアンモニアリアーゼにより形成する。
【００２９】
ある好ましい実施態様において、該Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、植物又は微生物に由来するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．５）である。植物は、シロイヌナズナ属に属する植物、例えば、シロイヌナズナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ属に属する植物、例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、シトラス属に属する植物、例えば、Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ、Ｃ．ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｕｓ、Ｃ．リモン、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ、Ｐ．ヴァリガリス、パイナス属に属する植物、例えば、Ｐ．ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐ．ｍｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｐ．パイナスター、Ｐ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐ．ｔａｅｄａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ、Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ、Ｐ．Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｋｉｔａｋａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、ナス属に属する植物、例えば、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、プラナス属に属する植物、例えば、Ｐ．ａｖｉｕｍ、Ｐ．ｐｅｒｓｉｃａ、ヴィティス属に属する植物、例えば、ヴィティス ヴィニヘラ、ズィー属に属する植物、例えば、Ｚ．メイス又は他の植物属、例えば、Ａｇａｓｔａｃｈｅ属、Ａｎａｎａｓ属、Ａｓｐａｒａｇｕｓ属、Ｂｒｏｍｈｅａｄｉａ属、Ｂａｍｂｕｓａ属、Ｂｅｔａ属、Ｂｅｔｕｌａ属、Ｃｕｃｕｍｉｓ属、カメリア属、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属、Ｃａｓｓｉａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、Ｃｉｃｅｒ属、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ属、Ｃｏｆｆｅａ属、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｄａｕｃｕｓ属、Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ属、Ｄｉａｎｔｈｕｓ属、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ属、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ属、ユーカリ属、Ｇａｌｌｕｓ属、Ｇｉｎｋｇｏ属、グリシン属、Ｈｏｒｄｅｕｍ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｉｐｏｍｏｅａ属、Ｌａｃｔｕｃａ属、リソスパーマム・オフィシナーレ属、ハス属、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マリュス属、Ｍａｎｉｈｏｔ属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マツバギク属、タバコ属、Ｏｌｅａ属、オリザ属、Ｐｉｓｕｍ属、Ｐｅｒｓｅａ属、ペトロセリウム属、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ属、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｐｉｃｅａ属、Ｐｙｒｕｓ属、Ｑｕｅｒｃｕｓ属、Ｒａｐｈａｎｕｓ属、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ属、キイチゴ属、Ｓｏｒｇｈｕｍ属、Ｓｐｈｅｎｏｓｔｙｌｉｓ属、Ｓｔｅｌｌａｒｉａ属、Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｅｓ属、コムギ属、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ属、コムギ属、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属、Ｚｉｎｎｉａ属に属してよい。微生物は、Ａｇａｒｉｃｕｓ属に属する真菌類、例えば、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、アスペルギルス属に属する真菌類、例えば、麹菌、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．フミガーツス、Ｕｓｔｉｌａｇｏ属に属する真菌類、例えば、Ｕ．ｍａｙｄｉｓ、ロドバクテリア属に属する細菌、例えば、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属に属する酵母、例えば、Ｒ．ｒｕｂｒａであってよい。
【００３０】
好適には、該Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、微生物において、該微生物に固有ではない該酵素をコードする核酸から発現させる。
【００３１】
好ましくは、４−クマロイル−ＣｏＡは、ＡＴＰとＣｏＡが基質であり、かつＡＤＰが産物である酵素触媒反応で形成され、好適には、４−クマロイル−ＣｏＡは４−クマレート−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で形成される。
【００３２】
前記４−クマレート−ＣｏＡリガーゼは、植物、微生物又は線虫に由来する４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．１２）であってよい。植物は、Ａｂｉｅｓ属、例えば、Ａ．ｂｅｓｈａｎｚｕｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍａ、Ｂ．ｈｏｌｏｐｈｙｌｌａ、シロイヌナズナ属に属する植物、例えば、シロイヌナズナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ属に属する植物、例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ、シトラス属に属する植物、例えば、Ｃ．シネンシス、Ｌａｒｉｘ属に属する植物、例えば、Ｌ．ｄｅｃｉｄｕａ、Ｌ．ｇｍｅｌｉｎｉｉ、Ｌ．ｇｒｉｆｆｉｔｈｉａｎａ、Ｌ．ｈｉｍａｌａｉｃａ、Ｌ．ｋａｅｍｐｆｅｒｉ、Ｌ．ｌａｒｉｃｉｎａ、Ｌ．ｍａｓｔｅｒｓｉａｎａ、Ｌ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｌ．ｐｏｔａｎｉｎｉｉ、Ｌ．ｓｉｂｉｒｉｃａ、Ｌ．ｓｐｅｃｉｏｓａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ａｃｕｔｉｆｏｌｉｕｓ、Ｐ．ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ、パイナス属に属する植物、例えば、Ｐ．ａｒｍａｎｄｉｉ、Ｐ．ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐ．パイナスター、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ、Ｐ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、ナス属に属する植物、例えば、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、ヴィティス属に属する植物、例えば、ヴィティス ヴィニヘラ、ズィー属に属する植物、例えば、Ｚ．メイス又は他の植物属、例えば、Ａｇａｓｔａｃｈｅ属、アモルファ属、Ｃａｔｈａｙａ属、Ｃｅｄｒｕｓ属、クロッカス属、ウシノケグサ属、グリシン属、Ｊｕｇｌａｎｓ属、Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ属、リソスパーマム・オフィシナーレ属、Ｌｏｌｉｕｍ属、ハス属、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属、マリュス属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マツバギク属、タバコ属、Ｎｏｔｈｏｔｓｕｇａ属、オリザ属、ペラルゴニウム属、ペトロセリウム属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｐｉｃｅａ属、プラナス属、Ｐｓｅｕｄｏｌａｒｉｘ属、Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ属、ローザ属、キイチゴ属、Ｒｙｚａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｓｕａｅｄａ属、Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ属、コムギ属、Ｔｓｕｇａ属に属してよい。微生物は、アスペルギルス属に属する糸状菌、例えば、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、麹菌、Ａ．フミガーツス、アカパンカビ属に属する糸状菌、例えば、アカパンカビ、Ｙａｒｒｏｗｉａ属に属する真菌類、例えば、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ属に属する真菌類、例えば、Ｍ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、マイコバクテリウム属に属する細菌、例えば、ウシ型結核菌、ハンセン菌、ヒト型結核菌、ナイセリア属に属する細菌、例えば、髄膜炎菌、ストレプトミセス属に属する細菌、例えば、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、ロドバクテリア属に属する細菌、例えば、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、鉤虫属に属する線虫類、例えば、Ａ．ｃｅｙｌａｎｉｃｕｍ、シノラブディス属に属する線虫類、例えば、Ｃ．エレガンス、捻転胃虫属に属する線虫類、例えば、Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ、Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ属に属する線虫類、例えば、Ｌ．ｒｕｂｅｌｌｕｓ、Ｍｅｉｌｏｄｏｇｙｎｅ属に属する線虫類、例えば、Ｍ．ｈａｐｌａ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｕｓ属に属する線虫類、例えば、Ｓ．ｒａｔｔｉｉ、糞線虫、Ｐｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ属に属する線虫類、例えば、Ｐ．ｐａｃｉｆｉｃｕｓであってよい。
【００３３】
任意に、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）は組換えで微生物に導入されている。これは非植物微生物に導入された植物ＣＰＲであってよい。あるいは、天然のＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が該微生物で過剰発現している。
【００３４】
上記段落で言及されたものを含む好ましい実施態様において、前記ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼは、シロイヌナズナ属に属する植物、例えば、シロイヌナズナ、シトラス属に属する植物、例えば、Ｃ．シネンシス、Ｃ．ｘ ｐａｒａｄｉｓｉ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ヴァガリス、パイナス属に属する植物、例えば、Ｐ．ｔａｅｄａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、ナス属に属する植物、例えば、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、ヴィティス属に属する植物、例えば、ヴィティス ヴィニヘラ、ズィー属に属する植物、例えば、Ｚ．メイス又は他の植物属、例えば、Ａｍｍｉ属、Ａｖｉｃｅｎｎｉａ属、カメリア属、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、グリシン属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、ハス属、マツバギク属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｒｕｔａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属に由来するＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．４）である。
【００３５】
微生物が天然に存在するものであってよい一方で、該代謝経路の各酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが該微生物に組換えで導入されているのが好ましい。
【００３６】
該酵素をコードするコード配列の導入に加えて、又はその代わりに、該生物体中の該コード配列に天然では関連しないプロモーター配列等の１つ以上の発現シグナルを提供してよい。したがって、任意に、チロシンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、該生物中の該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結され、及び／又はＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、該生物中の該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結される。
【００３７】
任意に、シンナメート４−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結される。
【００３８】
任意に、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結される。
【００３９】
任意に、リスベラトロールシンターゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結される。
【００４０】
発現シグナルとして、コード配列の上流（５’−非コード配列）、その内部又はその下流（３’−非コード配列）に配置され、かつ関連するコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシング又は安定性、又は翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列が挙げられる。そのような配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン及びポリアデニル化認識配列が挙げられよう。
【００４１】
ある態様において、本発明は、第１酵素により触媒され、かつその反応工程がアンモニアを作る反応により第１代謝産物が第２代謝産物に変換され、酸素が基質であり、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨが補因子であり、ＮＡＤＰ＋又はＮＡＤ＋が生成物である第２酵素により触媒される反応で該第２代謝産物が第３代謝物に変換され、ＡＴＰ及びＣｏＡが基質であり、ＡＤＰが生成物である第３酵素により触媒される反応で第３代謝産物が第４代謝産物に変換され、内在性マロニル−ＣｏＡが基質である第４酵素により触媒される反応で第４代謝産物が第５代謝産物に変換される作動性代謝経路を有する代謝改変微生物を提供する。
【００４２】
さらに、本発明は、第１酵素により触媒され、かつその反応工程が第２酵素の関与なしにアンモニアを作る反応により、第１代謝産物が第３代謝産物に変換され、ＡＴＰ及びＣｏＡが基質であり、ＡＤＰが生成物である第３酵素により触媒される反応で第３代謝産物が第４代謝産物に変換され、内在性マロニル−ＣｏＡが基質である第４酵素により触媒される反応で第４代謝産物が第５代謝産物に変換される作動性代謝経路を有する代謝改変微生物を提供する。
【００４３】
上記微生物として、発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたシンナメート−４−ヒドロキシラーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する微生物が挙げられる。
【００４４】
それら微生物として、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ活性を欠如し、発現シグナルに作動可能に連結されたチロシンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する微生物も挙げられる。
【００４５】
現在の文脈において、「微生物」は、細菌等の微生物、酵母等の微細菌に関する。
【００４６】
さらに具体的には、微生物は真菌であってよく、さらに具体的には、アスペルギルス属に属する糸状菌、例えば、黒色アスペルギルス、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、麹菌、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母、例えば、Ｓ．セレヴィシエ、Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｓｅｖａｚｚｉ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、カンジダ属に属する酵母、例えば、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、ピチア属に属する酵母、例えば、Ｐ．ｓｔｉｐｉｄｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｓｏｒｂｉｔｏｐｈｉｌａ、又は他の酵母属、例えば、クリプトコッカス属、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、ピチア属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属又はシゾサッカロミセス属であってよい。他の微生物に関して、ペニシリウム属、クモノスカビ属、フサリウム属、Ｆｕｓｉｄｉｕｍ属、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ属、ケカビ属、モルティエラ属、トリコデルマ属に属する種等の好適な糸状菌の非網羅的なリストが提供される。
【００４７】
細菌に関して、好適な細菌の非網羅的なリストは以下の通り与えられる：バシラス属に属する種、エシェリキア属に属する種、乳酸菌属に属する種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する種、コリネバクテリア属に属する種、アセトバクター属に属する種、アシネトバクター属に属する種、シュードモナス属に属する種等。
【００４８】
本発明の好ましい微生物は、Ｓ．セレヴィシエ、黒色アスペルギルス、麹菌、大腸菌、乳酸連鎖球菌又は枯草菌であってよい。
【００４９】
構築され、改変された微生物は、ケモスタット培養、バッチ培養、流加バッチ培養等の一般に知られている方法を用いて培養することができる。
【００５０】
例えば、本発明は、非植物細胞を炭素基質に４−クマル酸の外部源の実質的な非存在下で接触させる工程を含むリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法であって、該細胞が該条件下でリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を作る能力を有し、該微生物が真菌及び細菌、特に酵母からなる群より選択することができる。
【００５１】
前記炭素基質は、単糖類、小糖類及び多糖類、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、マンノース、スクロース、ラクトース、エリトロース、スレオース及び／又はリボースからなる発酵性炭素基質の群より任意に選択される。該炭素基質は、さらに又は代わりに、エタノール、アセテート、グリセロール及び／又はラクテート等の非発酵性炭素基質からなる群より選択してもよい。該非発酵性炭素基質は、さらに又は代わりに、アミノ酸からなる群より選択してよく、フェニルアラニン及び／又はチロシンであってよい。
【００５２】
別の態様において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ、４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼ及びリスベラトロールシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現によるリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法、さらにチロシンアンモニアリアーゼ、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ及びリスベラトロールシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現によるリスベラトロールの製造方法を含む。
【００５３】
そのように生成されるリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体は乳製品又はビール等の飲み物中の栄養補助食品として用いることができる。
【００５４】
本発明にしたがって生成されるリスベラトロールはシス−リスベラトロール又はトランス−リスベラトロールであってよいが、トランス型が通常は優勢であると予想できる。
【００５５】
本発明は更に以下の形態を含む。
［１］少なくとも１種類の酵素活性を含む操作的な代謝経路を有する微生物において、前記経路が４−クマル酸を生産し、かつそれからリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を生産することを特徴とする微生物。
［２］前記リスベラトロールが、内在性のマロニル−ＣｏＡが基質である酵素により触媒される反応で生成されることを特徴とする上記［１］に記載の微生物。
［３］前記リスベラトロールが４−クマロイル−ＣｏＡから生成されることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載の微生物。
［４］前記リスベラトロールが、４−クマロイル−ＣｏＡからリスベラトロールシンターゼにより生成されることを特徴とする上記［３］に記載の微生物。
［５］前記リスベラトロールシンターゼが、前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現することを特徴とする上記［４］に記載の微生物。
【００５６】
［６］前記リスベラトロールシンターゼが、Ａｒａｃｈｉｓ属に属する植物、Ｒｈｅｕｍ属に属する植物、ヴィティス属に属する植物、又はパイナス属、Ｐｉｃｅｅａ属、ユリ属、ユーカリ属、Ｐａｒｔｈｅｎｏｃｉｓｓｕｓ属、ジッサス属、カロコルタス属、タデ属、Ｇｎｅｔｕｍ属、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ属、Ｎｏｔｈｏｆａｇｕｓ属、フェニックス属、ウシノケグサ属、スゲ属、シュロソウ属、ハカマカズラ又はＰｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ属のいずれか１種類に由来するリスベラトロールシンターゼ（ＥＣ２．３．１．９５）であることを特徴とする上記［５］に記載の微生物。
［７］前記４−クマル酸が、トランス−ケイヒ酸から生成されることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［８］前記４−クマル酸が、酸素が基質であり、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが補因子であり、ＮＡＤ又はＮＡＤＰが産物である酵素により触媒される反応で前記酵素によりトランス−ケイヒ酸から生成されることを特徴とする上記［７］に記載の微生物。
［９］前記４−クマル酸が、トランス−ケイヒ酸からシンナメート４−ヒドロキシラーゼにより生成されることを特徴とする上記［８］に記載の微生物。
［１０］前記シンナメート４−ヒドロキシラーゼが、微生物において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現することを特徴とする上記［９］に記載の微生物。
【００５７】
［１１］前記シンナメート−４−ヒドロキシラーゼが、シロイヌナズナ属に属する植物、シトラス属に属する植物、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、パイナス属に属する植物、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、ナス属に属する植物、ヴィティス属に属する植物、ズィー属に属する植物、又はＡｍｍｉ属、Ａｖｉｃｅｎｎｉａ属、カメリア属、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、グリシン属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、ハス属、マツバギク属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｒｕｔａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属のいずれか１種類、及びアスペルギルス属に属する真菌類に由来するシンナメート−４−ヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１３．１１）であることを特徴とする上記［１０］に記載の微生物。
［１２］前記４−クマル酸が、アンモニアが生成される酵素触媒反応でチロシンから生成されることを特徴とする上記［１］〜［６］のいずれかに記載の微生物。
［１３］前記４−クマル酸が、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ又はチロシンアンモニアリアーゼによりチロシンから生成されることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれかに記載の微生物。
［１４］前記４−クマル酸が、酵母又は細菌に由来するチロシンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．５）により生成されることを特徴とする上記［１３］に記載の微生物。
［１５］前記チロシンアンモニアリアーゼが、酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ又は細菌ロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに由来することを特徴とする上記［１４］に記載の微生物。
［１６］前記チロシンアンモニアリアーゼが、微生物において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現することを特徴とする上記［１２］〜［１５］のいずれかに記載の微生物。
［１７］前記トランス−ケイヒ酸が、アンモニアが生成される酵素触媒反応でＬ−フェニルアラニンから生成されることを特徴とする上記［９］〜［１１］のいずれかに記載の微生物。
［１８］前記トランス−ケイヒ酸が、Ｌ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼにより形成されることを特徴とする上記［１７］に記載の微生物。
［１９］前記トランス−ケイヒ酸が、シロイヌナズナ属に属する植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ属に属する植物、シトラス属に属する植物、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、パイナス属に属する植物、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、ナス属に属する植物、プラナス属に属する植物、ヴィティス属に属する植物、ズィー属に属する植物、又はＡｇａｓｔａｃｈｅ属、Ａｎａｎａｓ属、Ａｓｐａｒａｇｕｓ属、Ｂｒｏｍｈｅａｄｉａ属、Ｂａｍｂｕｓａ属、Ｂｅｔａ属、Ｂｅｔｕｌａ属、Ｃｕｃｕｍｉｓ属、カメリア属、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属、Ｃａｓｓｉａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、Ｃｉｃｅｒ属、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ属、Ｃｏｆｆｅａ属、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｄａｕｃｕｓ属、Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ属、Ｄｉａｎｔｈｕｓ属、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ属、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ属、ユーカリ属、Ｇａｌｌｕｓ属、Ｇｉｎｋｇｏ属、グリシン属、Ｈｏｒｄｅｕｍ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｉｐｏｍｏｅａ属、Ｌａｃｔｕｃａ属、リソスパーマム・オフィシナーレ属、ハス属、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マリュス属、Ｍａｎｉｈｏｔ属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マツバギク属、タバコ属、Ｏｌｅａ属、オリザ属、Ｐｉｓｕｍ属、Ｐｅｒｓｅａ属、ペトロセリウム属、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ属、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｐｉｃｅａ属、Ｐｙｒｕｓ属、Ｑｕｅｒｃｕｓ属、Ｒａｐｈａｎｕｓ属、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ属、キイチゴ属、Ｓｏｒｇｈｕｍ属、Ｓｐｈｅｎｏｓｔｙｌｉｓ属、Ｓｔｅｌｌａｒｉａ属、Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｅｓ属、コムギ属、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ属、コムギ属、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属又はＺｉｎｎｉａ属のいずれかに属する植物、又はアスペルギルス属に属する真菌類に由来するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．５）によりＬ−フェニルアラニンから形成されることを特徴とする上記［１８］に記載の微生物。
［２０］前記Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼが、微生物において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現することを特徴とする上記［１８］又は［１９］に記載の微生物。
【００５８】
［２１］４−クマロイル−ＣｏＡが、ＡＴＰとＣｏＡが基質であり、ＡＤＰが産物である酵素により触媒される反応で形成されることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［２２］４−クマロイル−ＣｏＡが、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で形成されることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［２３］前記４−クマレート−ＣｏＡリガーゼが、Ａｂｉｅｓ属に属する植物、シロイヌナズナ属に属する植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ属に属する植物、シトラス属に属する植物、Ｌａｒｉｘ属に属する植物、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、パイナス属に属する植物、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、ナス属に属する植物、ヴィティス属に属する植物、ズィー属に属する植物、又はＡｇａｓｔａｃｈｅ属、アモルファ属、Ｃａｔｈａｙａ属、Ｃｅｄｒｕｓ属、クロッカス属、ウシノケグサ属、グリシン属、Ｊｕｇｌａｎｓ属、Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ属、リソスパーマム・オフィシナーレ属、Ｌｏｌｉｕｍ属、ハス属、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属、マリュス属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マツバギク属、タバコ属、Ｎｏｔｈｏｔｓｕｇａ属、オリザ属、ペラルゴニウム属、ペトロセリウム属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｐｉｃｅａ属、プラナス属、Ｐｓｅｕｄｏｌａｒｉｘ属、Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ属、ローザ属、キイチゴ属、Ｒｙｚａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｓｕａｅｄａ属、Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ属、コムギ属又はＴｓｕｇａ属のいずれかに属する植物、アスペルギルス属に属する糸状菌、アカパンカビ属に属する糸状菌、Ｙａｒｒｏｗｉａ属に属する真菌類、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ属に属する真菌類、マイコバクテリウム属に属する細菌、ナイセリア属に属する細菌、ストレプトミセス属に属する細菌、ロドバクテリア属に属する細菌、鉤虫属に属する線虫類、シノラブディス属に属する線虫類、捻転胃虫属に属する線虫類、Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ属に属する線虫類、Ｍｅｉｌｏｄｏｇｙｎｅ属に属する線虫類、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｕｓ属に属する線虫類、又はＰｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ属に属する線虫類に由来する４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．１２）であることを特徴とする上記［２２］に記載の微生物。
［２４］前記代謝経路の各酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物に組換えで導入されていることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［２５］天然のＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物で過剰発現していることを特徴とする上記［２４］に記載の微生物。
【００５９】
［２６］ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物に組換えで導入されていることを特徴とする上記［２４］に記載の微生物。
［２７］前記ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼが、シロイヌナズナを含むＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに属する植物、Ｃ．シネンシス、Ｃ．ｘ ｐａｒａｄｉｓｉを含むＣｉｔｒｕｓに属する植物、Ｐ．ヴァガリスを含むＰｈａｓｅｏｌｕｓに属する植物、Ｐ．ｔａｅｄａを含むＰｉｎｕｓに属する植物、Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａを含むＰｏｐｕｌｕｓに属する植物、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍを含むＳｏｌａｎｕｍに属する植物、ヴィティス ヴィニヘラを含むヴィティスに属する植物、Ｚ．メイスを含むＺｅａに属する植物、又はＡｍｍｉ属、Ａｖｉｃｅｎｎｉａ属、カメリア属、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、グリシン属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、ハス属、マツバギク属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｒｕｔａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属を含む他の植物属に由来するＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．４）であることを特徴とする上記［２６］に記載の微生物。
［２８］チロシンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［２９］フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［３０］シンナメート４−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記生物において前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していること特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
【００６０】
［３１］４−クマレート−ＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記生物において前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［３２］リスベラトロールシンターゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記生物において前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［３３］真菌であることを特徴とする前記いずれかの一項に記載の微生物。
［３４］糸状菌であることを特徴とする上記［３３］に記載の微生物。
［３５］アスペルギルス属に属する微生物であることを特徴とする上記［３４］に記載の微生物。
【００６１】
［３６］菌株アスペルギルス ｎｉｇｅｒ又は麹菌であることを特徴とする上記［３５］に記載の微生物。
［３７］酵母であることを特徴とする上記［３３］に記載の微生物。
［３８］Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、カンジダ属、ピチア属、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属又はシゾサッカロミセス属に属する微生物であることを特徴とする上記［３７］に記載の微生物。
［３９］サッカロマイセス・セレヴィシエ、Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｓｅｖａｚｚｉ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ、Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｄｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｓｏｒｂｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ又はシゾサッカロミセス・ポンベの菌株であることを特徴とする上記［３８］に記載の微生物。
［４０］細菌であることを特徴とする［１］〜［３２］に記載の微生物。
【００６２】
［４１］エシェリキア属又はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物であることを特徴とする上記［４０］に記載の微生物。
［４２］大腸菌又は乳酸連鎖球菌の菌株であることを特徴とする上記［４１］に記載の微生物。
［４３］発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたシンナメート−４−ヒドロキシラーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有することを特徴とする上記［１］に記載の微生物。
［４４］シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ活性を欠如し、発現シグナルに作動可能に連結されたチロシンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する上記［１］に記載の微生物。
［４５］適当なリスベラトロール産生代謝経路を有する非植物細胞を炭素基質に４−クマル酸の外部源の実質的な非存在下において接触させる工程を含むことを特徴とする、リスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法。
【００６３】
［４６］前記非植物細胞が、真菌及び細菌からなる群より選択されることを特徴とする上記［４５］に記載の方法。
［４７］前記非植物細胞が、酵母からなる群より選択される真菌であることを特徴とする上記［４６］に記載の方法。
［４８］前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｅｓ種から選択されることを特徴とする上記［４７］に記載の方法。
［４９］前記非植物細胞が、上記［１］〜［４４］に記載の微生物の細胞であることを特徴とする上記［４５］〜［４８］に記載の方法。
［５０］前記炭素基質が、単糖類、小糖類及び多糖類からなる発酵性炭素基質の群より選択されることを特徴とする上記［４５］〜［４９］のいずれかに記載の方法。
【００６４】
［５１］前記発酵性炭素基質が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、マンノース、スクロース、ラクトース、エリトロース、スレオース、リボースであることを特徴とする上記［５０］に記載の方法。
［５２］前記炭素基質が、非発酵性炭素基質からなる群より選択されることを特徴とする上記［４５］〜［４９］のいずれかに記載の方法。
［５３］前記非発酵性炭素基質が、エタノール、アセテート、グリセロール、ラクテートであることを特徴とする上記［５２］に記載の方法。
［５４］前記非発酵性炭素基質が、アミノ酸からなる群より選択されることを特徴とする上記［５２］に記載の方法。
［５５］前記非発酵性炭素基質が、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選択されることを特徴とする上記［５４］に記載の方法。
【００６５】
［５６］フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ、４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼ及びリスベラトロールシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現によるリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法。
［５７］チロシンアンモニアリアーゼ、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ及びリスベラトロールシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現によるリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法。
［５８］さらに、生産されたリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を乳製品又は飲み物中の栄養補助食品として使用することを含む上記［４５］〜［５７］のいずれかに記載の方法。
［５９］前記リスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体をビール中の栄養補助食品として使用することを特徴とする上記［５８］に記載の方法。
【００６６】
本発明の上記説明の容易な理解を助けるために、添付の図面を参照されたい。
【００６７】
以下の限定されない実施例により本発明をさらに説明し、例示する。
【００６８】
（実施例１）
ＰＡＬ、ＴＡＬ、Ｃ４Ｈ、ＣＰＲ、４ＣＬ及びＶＳＴをコードする遺伝子の単離
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）（Ｃｏｃｈｒａｎｅら、２００４年；配列番号１、配列番号２）、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）（Ｍｉｚｕｔａｎｉら、１９９７年；配列番号３、配列番号４）及び４−クマレート：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ１）（ハンバーガー及びハルブロック（Hamberger and Hahlbrock）、２００４年；エルチングら（Ehlting et al.）、１９９９年；配列番号５、配列番号６）を、ＰＣＲにより、表１のプライマーを用いて、シロイヌナズナのｃＤＮＡ（バイオキャット社（BioCat）、ハイデルベルグ、ドイツ）からＰＣＲにより単離した。コハク酸とクマロイル−ＣｏＡのそれぞれに対する好ましい速度パラメーターのために、幾つかのシロイヌナズナ相同体のうち、ＰＡＬ２と４ＣＬ１を選択した（コクレンら（Cochrane et al.）、２００４年；ハンバーガー及びハルブロック（Hamberger and Hahlbrock）、２００４年；エルチングら（Ehlting et al.）、１９９９年）。
【００６９】
Ｒｈｅｕｍ ｔａｔａｒｉｃｕｍに由来するリスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）のコード配列（サマピトら（Samappito et al）、２００３年；配列番号７、配列番号８）及びロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに由来するチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）（キンドら（Kyndt et al.）、２００２年；配列番号１１、配列番号１２）は、Ｓ．セレヴィシエでの発現のために、ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍのオンラインサービスバックトランスレーションツールを用いてコドン最適化を行って、それぞれ配列番号９と１０及び配列番号１３と１４を得た。合成遺伝子組立てのためのオリゴはＭＷＧバイオテック社（MWG Biotech）で構築され、合成遺伝子は、以下に説明するマーチンら（Martin et al.）（２００３年）の若干改良された方法プロトコールを用いて、ＰＣＲにより組み立てられた。
【００７０】
【表１】
【００７１】
合成遺伝子の組立てのためにＭＷＧ社のプライマーをミリＱ水に１００ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度に溶解した。各プライマーの５μｌのアリコートをトータルミックス中で一緒にし、次にミリＱ水で１０倍希釈した。遺伝子は、融合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）のために５０μｌあたり鋳型として５μｌの希釈トータルミックスを用いたＰＣＲにより組み立てた。ＰＣＲプログラムは以下の通りである。最初に９８℃で３０秒間、次に、１０００塩基対あたり、９８℃で１０秒間、４０℃で１分間及び７２℃で１分間の３０サイクル、及び最後に７２℃で５分間とした。得られたＰＣＲ反応物から、２０μｌ
を１％アガロースゲルで精製した。その結果はＰＣＲスメアであり、欲する大きさの周囲の領域をアガロースゲルから切り取り、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社（Qiagen））を用いて精製した。表１の（ＴＡＬ及びＶＳＴ用の）外側のプライマーによる最終的なＰＣＲは、要求されたＴＡＬ遺伝子とＶＳＴ遺伝子を与えた。Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発ＩＩキット（ストラタジン社（Stratagene）、ラホーヤ、カリフォルニア州）を用いるか、又は幾つかの異なる大腸菌サブクローンに由来するオーバーラップエラーフリーＤＮＡストレッチからＰＣＲを用いて点突然変異を補正した。
【００７２】
シロイヌナズナ（ＡＲ２）に由来するＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）（ミズタニ及びオータ（Mizutani and Ohta）、１９９８年；配列番号１７、配列番号１８）及びＳ．セレヴィシエ（ＣＰＲ１）に由来するＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ１）（アオヤマら（Aoyama et al.）、１９７８年；配列番号１５、配列番号１６）は、表１のプライマーを用いて、シロイヌナズナのｃＤＮＡ（バイオキャット社（BioCat）、ハイデルベルグ、ドイツ）及びＳ．セレヴィシエのゲノムＤＮＡからそれぞれ単離した。
【００７３】
（実施例２）
ＰＡＬ発現用の酵母ベクターの構築
実施例１に記載のように単離されたＰＡＬをコードする遺伝子を、ＥｃｏＲ１とＳｐｅ１の制限部位（表１）を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いるＰＣＲにより再増幅した。増幅されたＰＡＬ ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１／Ｓｐｅ１により消化し、ＥｃｏＲ１／Ｓｐｅ１で消化されたｐＥＳＣ−ＵＲＡベクター（ストラタジン社（Stratagene））に連結して、ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬを得た。遺伝子の配列は２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７４】
（実施例３）
ＰＡＬ及びＣ４Ｈ発現用の酵母ベクターの構築
実施例１に記載のように単離されたＣ４Ｈをコードする遺伝子を、Ｘｈｏ１とＫｐｎ１の制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。増幅されたＣ４Ｈ ＰＣＲ産物をＸｈｏ１／Ｋｐｎ１により消化し、同様に消化されたｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬベクターに連結した。得られたプラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈは、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターの制御下にＰＡＬとＣ４Ｈをコードする遺伝子を含有した。Ｃ４Ｈをコードする遺伝子の配列は２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７５】
（実施例４）
４ＣＬ発現用酵母ベクターの構築
４ＣＬをコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅された４ＣＬ ＰＣＲ産物をＸｂａ１／ＢａｍＨ１により消化し、Ｓｐｅ１／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＥＳＣ−ＴＲＰベクター（ストラタジン社（Stratagene））に連結して、ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬを得た。ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬの２つの異なるクローンの配列を決定して、クローニングされた遺伝子の配列を検証した。
【００７６】
（実施例５）
４ＣＬ及びＶＳＴ発現用の酵母ベクターの構築
ＶＳＴをコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅された合成ＶＳＴ遺伝子をＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１により消化し、ＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１で消化されたｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ（実施例４）に連結した。得られたプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴは、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターの制御下に４ＣＬとＶＳＴをコードする遺伝子を含んでいた。ＶＳＴをコードする遺伝子の配列はｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴの２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７７】
（実施例６）
ＴＡＬ発現用酵母ベクターの構築
ＴＡＬをコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅された合成ＴＡＬ遺伝子をＥｃｏＲ１／Ｓｐｅ１により消化し、ＥｃｏＲ１／Ｓｐｅ１で消化されたｐＥＳＣ−ＵＲＡベクターに連結した。得られたプラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬは、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターの制御下にＴＡＬをコードする遺伝子を含有した。その配列はｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬの２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７８】
（実施例７）
Ｓ．セレヴィシエ内在性ＣＰＲの過剰発現用酵母ベクターの構築
Ｓ．セレヴィシエに由来するＣＰＲ（ＣＰＲ１）をコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅されたＣＰＲ１遺伝子をＸｈｏ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｘｈｏ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＥＳＣ−ＬＥＵベクター（ストラタジン社（Stratagene））に連結して、ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＣＰＲ１を得た。その配列はｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＣＰＲ１の２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７９】
（実施例８）
シロイヌナズナ ＣＰＲ（ＡＲ２）の過剰発現用酵母ベクターの構築
シロイヌナズナに由来するＣＰＲ（ＡＲ２）をコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅されたＡＲ２遺伝子をＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１で消化し、ＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１で消化されたｐＥＳＣ−ＬＥＵベクター（ストラタジン社（Stratagene））に連結して、ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＡＲ２を得た。その配列はｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＡＲ２の２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００８０】
（実施例９）
酵母Ｓ．セレヴィシエにおいてＰＡＬ、Ｃ４Ｈ、４ＣＬ及びＶＳＴを用いてリスベラトロールを導く経路の発現
適当な遺伝子マーカーを含む酵母菌株を実施例２、実施例３、実施例４、実施例５、実施例６、実施例７及び実施例８で記載したベクターにより別々に、又は組合せて形質転換した。酵母細胞の形質転換は、当分野で公知の方法にしたがって、例えば、コンピテント細胞又は電気穿孔法を用いて実施した（例えば、サムブルックら（Sambrook et al.）（１９８９年）を参照）。形質転換体は、ウラシル及び／又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【００８１】
Ｓ．セレヴィシエ菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（ＭＡＴａ ｕｒａ３）をベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ（実施例２）で形質転換して、ＦＳＳＣ−ＰＡＬ菌株を得て、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）で形質転換して、ＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ菌株を得た。Ｓ．セレヴィシエ菌株ＦＳ０１２６７（ＭＡＴａ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）はｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ及びｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ（実施例４）により同時形質転換し、形質転換された菌株をＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬと命名した。同菌株は、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ及びｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）によっても同時形質転換して、ＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴ菌株を得た。
【００８２】
（実施例１０）
Ｓ．セレヴィシエにおいてＴＡＬ、４ＣＬ及びＶＳＴを用いてリスベラトロールを導く経路の発現
Ｓ．セレヴィシエ菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（ＭＡＴａ ｕｒａ３）をベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬ（実施例６）で別に形質転換して、ＦＳＳＣ−ＴＡＬ菌株を得た。Ｓ．セレヴィシエ菌株ＦＳ０１２６７（ＭＡＴａ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）をｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬ（実施例６）及びｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ（実施例４）で同時形質転換し、形質転換された菌株をＦＳＳＣ−ＴＡＬ４ＣＬと命名した。同菌株は、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬとｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）とによっても同時形質転換して、ＦＳＳＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株を得た。形質転換体は、ウラシル及び／又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【００８３】
（実施例１１）
Ｓ．セレヴィシエにおける過剰発現内在性ＣＰＲによるリスベラトロールを導く経路の発現
Ｓ．セレヴィシエ菌株ＦＳ０１２７７（ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１）を、ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）、ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ（実施例４）及びベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＣＰＲ１（実施例７）により同時形質転換した。形質転換された菌株をＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴＣＰＲと命名した。形質転換体は、ウラシル及び／又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【００８４】
（実施例１２）
Ｓ．セレヴィシエにおける過剰発現シロイヌナズナ ＣＰＲ（ＡＲ２）によるリスベラトロールを導く経路の発現
Ｓ．セレヴィシエ菌株ＦＳ０１２７７（ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１）を、ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）、ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ（実施例４）及びベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＡＲ２（実施例８）により同時形質転換した。形質転換された菌株をＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴＡＲ２と命名した。形質転換体は、ウラシル及び／又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【００８５】
（実施例１３）
振盪フラスコによる組換え酵母菌株による発酵
前記組換え酵母菌株を滅菌した接種用ループにより寒天プレートに接種し、ビタミン類、微量元素、５ｇ／ｌのグルコース及び４０ｇ／ｌ又は１００ｇ／ｌのガラクトースを含有する２００ｍｌの合成無機培地（ベルダインら（Verduyn et al.）、１９９２年）で増殖させた。５００ｍｌのコック付き振盪フラスコを３日間、３０℃、１６０ｒｐｍでインキュベートした。
【００８６】
（実施例１４）
リスベラトロールの抽出
５０００ｇで５分間の遠心により細胞を回収した。５０ｍｌの上清アリコートを２０ｍｌの酢酸エチルで一回抽出した。この酢酸エチルを凍結乾燥し、乾燥生成物を０．７ｍｌメタノールで再溶解し、ろ過してＨＰＬＣバイアルに入れた。
【００８７】
２００ｍｌ培地から得られた細胞ペレットを１〜２ｍｌの水に溶解し、３本の迅速調製チューブに分割し、ガラス玉で砕いた。これらの３チューブからの粗製抽出物を、５０ｍｌの縫工チューブ中の１０ｍｌの１００％メタノール中にプールし、４℃の冷暗部屋でロータリーチャンバーにより４８時間抽出した。４８時間後、細胞デブリスを遠心により５分間、５０００ｇで除去し、該メタノールを一晩の凍結乾燥により除去した。乾燥残留物を１ｍｌのリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）に再溶解し、アーモンドに由来する１０単位のベータ−グルコシダーゼ（シグマ社（Sigma）製）を加えて、推定上グルコシド結合とされる構造物からリスベラトロールを遊離させた。混合物を３時間、３７℃でインキュベートし、次に、１ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。一緒にした酢酸エチルを凍結乾燥し、乾燥残留物を０．７ｍｌのメタノールに再溶解し、ろ過してＨＰＬＣバイアルに入れた。
【００８８】
（実施例１５）
リスベラトロールの分析
（薄層クロマトグラフィー）
同一のＴＬＣプレートによるケイヒ酸、クマル酸及びリスベラトロールの迅速な分離を可能とする薄層クロマトグラフィーに基づく方法を迅速なスクリーニング分析のために開発した。細胞と上清の両方を含む１ｍｌの培養物アリコートを５００マイクロリットルの酢酸エチルで抽出し、微小遠心機により１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。該酢酸エチルを乾燥し、メタノールに再溶解した。抽出物を、蛍光指示薬を含むシリカＧプレート（０．２ｍｍ Ａｌｕｇｒａｍ ＳＩＬ Ｇ／ＵＶ２５４、マシュレ・ナーゲル社（Macherey-Nagel）製）により分析した。移動相はクロロホルム、酢酸エチル及び蟻酸の混合物（２５：１０：１）であった。
【００８９】
（ＨＰＬＣ）
ケイヒ酸、クマル酸及びリスベラトロールの定量的分析のために、試料を、λ＝３０６ｎｍのＵＶダイオードアレイ検出前に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アジレント（Agilent）シリーズ１１００システム（ヒューレットパッカード社（Hewlett Packard）製）による分離に供した。フェノメネックス社（Phenomenex）（トランス、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）製Ｌｕｎａ３マイクロメートルＣ１８（１００×２．００ｍｍ）カラムを４０℃で用いた。移動相として、アセトニトリルとミリＱ水（両方とも５０ｐｐｍのトリフルオロ酢酸を含む）のグラジエントを０．４ｍｌ／分の流速で用いた。グラジエントのプロフィールは２０分間にわたる１５％アセトニトリルから１００％アセトニトリルへのリニアであった。溶出時間はクマル酸で約３．４分、遊離トランス−リスベラトロールで５．５分、ケイヒ酸で６．８分であった。
【００９０】
純粋なリスベラトロールスタンダードはケーマンケミカル社（Cayman chemical company）から購入し、純粋なクマル酸スタンダードとケイヒ酸スタンダードはシグマ社（Sigma）から購入した。
【００９１】
（結果）
ＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴ菌株とＦＳＳＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株を実施例１３に記載のように１００ｇ／ｌのガラクトースで培養し、実施例１４と実施例１５にしたがって細胞内リスベラトロールの含量を分析した。さらに、空のベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ及びｐＥＳＣ−ＴＲＰのみを含むコントロール菌株のＦＳＳＣコントロールを含めた。ＨＰＬＣ分析は、ＦＳＳＣ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴ菌株とＦＳＳＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株がトランス−リスベラトロールと同じ５．５分の保持時間を有する成分を含むことを示した（図４）。この結果は、約３０６ｎｍのλｍａｘを有する純粋なトランス−リスベラトロールの吸収スペクトルに類似するＵＶ吸収スペクトル（図５）によっても確認された。
【００９２】
したがって、これらの結果は、トランス−リスベラトロールのインビボ生産を導くＳ．セレヴィシエの活性フェニル−プロパノイド経路の存在を示した。明確な増殖条件下にバッチ培養及び連続培養で菌株を培養し、及び／又は個々の酵素の発現／活性を最適化することによってリスベラトロールの生産が最も高い可能性で向上できるだろう。
【００９３】
（実施例１６）
大腸菌におけるＴＡＬ発現用細菌ベクターの構築
実施例１に記載したように単離されたＴＡＬをコードする遺伝子を、フォワードプライマー５’−ＣＣＧ ＣＴＣＧＡＧ ＣＧＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＡＡ Ｇ−３’（配列番号３３）とリバースプライマー５’−ＧＣ ＧＧＡＴＣＣ ＴＴＡ ＡＧＣ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＧＣ Ｔ−３’（配列番号３４）（制限酵素部位ＸｈｏＩとＢａｍＨＩをそれぞれ有する５’突出を有する）を用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬ（実施例６）から、ＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物のＸｈｏＩとＢａｍＨＩとで消化したｐＥＴ１６ｂベクター（ノバゲン社（Novagen）製）への連結が可能となり、ｐＥＴ１６ｂ−ＴＡＬが得られた。ｐＥＴ１６ｂベクターはアンピシリン耐性遺伝子とＴ７プロモーターの両方を含んでいた。よって、上記手順は、Ｔ７プロモーターの制御下にＴＡＬをコードする遺伝子を含み、抗生物質選択マーカーを有するベクターをもたらした。ＴＡＬをコードする遺伝子の配列はｐＥＴ１６ｂ−ＴＡＬの１つのクローンの配列決定により検証した。
【００９４】
（実施例１７）
大腸菌における４ＣＬとＶＳＴの発現用細菌ベクターの構築
実施例１に記載したように単離されたＶＳＴをコードする遺伝子を、制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩとにより４ＣＬとＶＳＴをコードする遺伝子を含む消化プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）から切り出した。カナマイシン耐性遺伝子を含有し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したｐＥＴ２６ｂベクター（ノバゲン社（Novagen）製）にこのＶＳＴ遺伝子を連結してｐＥＴ２６ｂ−ＶＳＴを得た。制限酵素ＸｈｏＩとＳａｌＩは適合性末端を有し、適当な連結を可能とした。ｐＥＴ２６ｂベクターはカナマイシン耐性遺伝子とＴ７プロモーターの両方を含んでいた。よって、上記手順は、Ｔ７プロモーターの制御下にＶＳＴをコードする遺伝子を含み、抗生物質選択マーカーを有するベクターをもたらした。
【００９５】
実施例１に記載したように単離された４ＣＬをコードする遺伝子を、フォワードプライマー５’−ＴＧ ＣＣＡＴＧＧ ＣＡ ＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣ ＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣ ＡＧＴＴＴ−３’（配列番号３５）とリバースプライマー５’−ＧＣ ＧＧＡＴＣＣ ＣＣＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＴＴ ＴＧＣ ＴＡＧ ＴＴＴ ＴＧＣＣ−３’（配列番号３６）（制限酵素部位ＮｃｏＩとＢａｍＨＩをそれぞれ有する５’突出を有する）を用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）から、ＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物のＮｃｏＩとＢａｍＨＩとで消化したｐＥＴ１６ｂベクター（ノバゲン社（Novagen）製）への連結を可能とした。得られたプラスミドｐＥＴｌ６ｂ−４ＣＬは、Ｔ７プロモーターの制御下に４ＣＬをコードする遺伝子を含んでいた。Ｔ７プロモーターと４ＣＬをコードする遺伝子との両方を、フォワードプライマー５’−ＴＴ ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＡＡＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＣＣ ＣＧＣ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＣＧ−３’（配列番号３７）とリバースプライマー５’−ＣＧ ＣＴＣＧＡＧ ＣＣＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＴＴ ＴＧＣ ＴＡＧ ＴＴＴ ＴＧＣＣ−３’（配列番号３８）（制限酵素部位ＮｏｔＩとＸｈｏＩをそれぞれ有する５’突出を有する）を用いて、プラスミドｐＥＴｌ６ｂ−４ＣＬから、ＰＣＲにより１つの断片として再増幅した。ＤＮＡ断片の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、連結前にＮｏｔＩＸｈｏＩとで消化したプラスミドｐＥＴ２６ｂ−ＶＳＴへの制限ＰＣＲ産物の連結を可能とした。得られたプラスミドｐＥＴ２６ｂ−ＶＳＴ−４ＣＬは、それぞれが個々のＴ７プロモーターの制御下にある２つの遺伝子（４ＣＬ及びＶＳＴ）を含んでいた。
【００９６】
（実施例１８）
大腸菌において、ＴＡＬ、４ＣＬ及びＶＳＴを用いてリスベラトロールを導く経路の発現
細菌細胞の形質転換を当分野で公知の方法にしたがって、例えば、コンピテント細胞又は電気穿孔法を用いて実施した（例えば、サムブルックら（Sambrook et al.）（１９８９年）を参照）。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバゲン社（Novagen）製）を２種類のベクターｐＥＴ１６ｂ−ＴＡＬ（実施例１６）とｐＥＴ２６ｂ−ＶＳＴ−４ＣＬ（実施例１７）とにより同時形質転換して、ＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株を得た。さらに、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、２種類の空のベクターｐＥＴ１６ｂ（ノバゲン社（Novagen）製）とｐＥＴ２６ｂ（ノバゲン社（Novagen）製）とで同時形質転換して、コントロール菌株として用いられるＦＳＥＣコントロール菌株を得た。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地により選択した。
【００９７】
（実施例１９）
振盪フラスコでの組換え大腸菌株による発酵
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の前培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む７ｍｌのＬＢ培地で、１６０ｒｐｍ、３７℃にてガラス管中で増殖させた。指数関数的に成長する前培養物を、５０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、８０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを追加した２００ｍｌのＬＢ培地を含む５００ｍｌバッフル付き振盪フラスコの接種に用いて、１６０ｒｐｍ、３７℃でインキュベートした。５時間後、３遺伝子（ＴＡＬ、４ＣＬ及びＶＳＴ）のそれぞれの上流に存在するＴ７プロモーターの誘導因子として、イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度で加えた。３７℃での４８時間のインキュベーション時間の後、細胞を採取し、抽出手順に供し、産生したリスベラトロールの有無を分析した。
【００９８】
（実施例２０）
大腸菌のリスベラトロールの抽出と分析
抽出及び分析は、実施例１４と実施例１５に記載の方法を用いて実施した。
【００９９】
（結果）
菌株ＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ及びＦＳＥＣコントロールを、実施例１９に記載のように５０ｇ／ｌグルコースで培養し、実施例１４と実施例１５にしたがって細胞内リスベラトロールの含量を分析した。ＨＰＬＣ分析は、ＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴ菌株が、クマル酸と同じ３．４分の保持時間を有するかなりの量の成分を含むことを示した（図６）。しかし、その抽出物はトランス−リスベラトロールと同じ時間で溶出する成分を含んでいなかった。したがって、この結果は、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）は実際に活性はあるが、検出可能な量のリスベラトロールの生産を導くことはないことを示した。しかし、リスベラトロール形成の欠如は、ｉ）非機能性クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、ｉｉ）非機能性リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）、ｉｉｉ）非最適培養条件又はＴＡＬの非最適発現／活性により引き起こされるか、又はクマル酸の他の産物への分岐により引き起こされる非常に低いレベルのクマル酸との結果でありうるだろう。この仮説を評価するために、実施例１９に記載の類似の培地を用いたが、ここでは２０ｍｇ／ｌのクマル酸の存在下で菌株を増殖させた。ＦＳＥＣ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴの抽出物の引き続くＨＰＬＣ分析は、トランス−リスベラトロールと同じ保持時間あたりに一群のピークを実際に示し、これはＦＳコントロールの抽出物には観察されなかった（図６）。実際、５．５分の保持時間を有するピークのＵＶ吸収スペクトルは純粋なリスベラトロールのスペクトルに類似したが（図７）、そのようなスペクトルはコントロール菌株でのピークでは得られなかった。したがって、これらの結果は、リスベラトロールの生産を導きうる大腸菌の活性フェニルプロパノイド経路の存在を強く示唆する。明確な増殖条件下にバッチ培養及び連続培養で菌株を培養し、及び／又は個々の酵素の発現／活性を最適化することによって、クマル酸添加なしのリスベラトロールの生産が最も高い可能性で達成できるだろう。
【０１００】
（実施例２１）
乳酸連鎖球菌におけるＰＡＬとＣ４Ｈの発現用細菌ベクターの構築
下記実施例に使用されるプラスミドｐＳＨ７１とその誘導体は、大腸菌と乳酸連鎖球菌に由来する複数の複製開始点を有する二機能性シャトルベクターである。それによって、宿主域特異性は大腸菌及び他の種の乳酸菌にわたる。したがって、乳酸連鎖球菌の形質転換は通常は問題なく進むが、他の種の乳酸菌の推定上の困難な形質転換は組換えプラスミドの構築のための中間ホストとして大腸菌を用いることにより克服することができる。プラスミドは１つ以上のマーカー遺伝子を持っており、それらを持つ微生物を、それらを持たない微生物から選択することができる。乳酸連鎖球菌に用いられる選択システムは、優性マーカー、例えば、エリスロマイシンとクロラムフェニコールに対する耐性に基づくが、糖質代謝に関与する遺伝子、ペプチダーゼ及び食品用マーカーに基づくシステムも記載されてきた。さらに、プラスミドは、組換え遺伝子の発現を可能とするプロモーター配列とターミネーター配列を含む。好適なプロモーターは、乳酸連鎖球菌の遺伝子、例えば、ｌａｃＡから取られる。さらに、プラスミドはＤＮＡ断片のクローニングとそれに引き続く組換え体の同定を容易にする好適な独自の制限部位を含む。
【０１０１】
下記の実施例において、プラスミドは、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒと呼ばれるエリスロマイシン耐性遺伝子又はｐＳＨ７１−ＣＭｒと呼ばれるクロラムフェニコール耐性遺伝子のいずれかを含む。
【０１０２】
実施例１に記載のように単離されたＰＡＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）からＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を乳酸連鎖球菌に由来するｌａｃＡプロモーターを含む消化ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬは、乳酸連鎖球菌由来のｌａｃＡプロモーターの制御下にＰＡＬをコードする遺伝子を含有する。
【０１０３】
実施例１に記載のように単離されたＣ４Ｈをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）からＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＳＨ７１−ＣＭｒベクターに連結して、ｐＳＨ７１−ＣＭｒ−Ｃ４Ｈを得ることができる。ｌａｃＡプロモーターとＣ４Ｈをコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＳＨ７１−ＣＭｒ−Ｃ４ＨからＰＣＲにより１つの断片として再増幅する。ＤＮＡ断片の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化プラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈは、個々のｌａｃＡプロモーターの制御下にＰＡＬとＣ４Ｈをそれぞれコードする遺伝子を含む。ＰＡＬとＣ４Ｈをコードする遺伝子の配列を、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１０４】
（実施例２２）
乳酸連鎖球菌におけるＴＡＬ発現用細菌ベクターの構築
実施例１に記載のように単離されたＴＡＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてプラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬ（実施例６）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＴＡＬは、乳酸連鎖球菌に由来するｌａｃＡプロモーターの制御下にＴＡＬをコードする遺伝子を含む。ＴＡＬをコードする遺伝子の配列を、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＴＡＬの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１０５】
（実施例２３）
乳酸連鎖球菌における４ＣＬとＶＳＴの発現用細菌ベクターの構築
実施例１に記載のように単離された４ＣＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＳＨ７１−ＣＭｒベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬは、乳酸桿菌（Lactobacillus lactis）由来のｌａｃＡプロモーターの制御下に４ＣＬをコードする遺伝子を含有する。
【０１０６】
実施例１に記載のように単離されたＶＳＴをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）からＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＶＳＴは、乳酸連鎖球菌に由来するｌａｃＡプロモーターの制御下にＶＳＴをコードする遺伝子を含む。ｌａｃＡプロモーターと、ＶＳＴをコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＶＳＴからＰＣＲにより１つの断片として再増幅する。ＤＮＡ断片の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化プラスミドｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ−ＶＳＴは、個々のｌａｃＡプロモーターの制御下に４ＣＬ及びＶＳＴをそれぞれコードする遺伝子を含む。４ＣＬとＶＳＴをコードする遺伝子の配列を、ｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ−ＶＳＴの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１０７】
（実施例２４）
乳酸連鎖球菌においてリスベラトロールを導く経路の発現
乳酸連鎖球菌株を、実施例２１、実施例２２及び実施例２３に記載されたベクターで別々に、又は組合せて形質転換する。細菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、コンピテント細胞又は電気穿孔法を用いて実施した（例えば、サムブルックら（Sambrook et al.）（１９８９年）を参照）。形質転換体は、抗生物質のエリスロマイシンとクロラムフェニコールとを含有する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【０１０８】
別に、乳酸連鎖球菌株ＭＧ１３６３をベクターｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＴＡＬ（実施例２２）により形質転換して、菌株ＦＳＬＬ−ＴＡＬを得て、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例２１）により菌株ＦＳＬＬ−ＰＡＬＣ４Ｈを得て、ｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２３）により菌株ＦＳＬＬ−４ＣＬＶＳＴを得る。さらに、乳酸連鎖球菌株ＭＧ１３６３を、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＴＡＬ（実施例２２）及びｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２３）により同時形質転換し、この形質転換された菌株をＦＳＬＬ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴと命名する。同菌株をｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例２１）とｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２３）によっても同時形質転換して、菌株ＦＳＬＬ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴを得る。
【０１０９】
（実施例２５）
発酵槽での組換え乳酸連鎖球菌株による発酵
組換え酵母菌株は、バッチ培養、流加バッチ培養又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。
【０１１０】
（バッチ培養と流加バッチ培養）
微生物を、１．５リットルの有効容積のバッフル付きバイオリアクターで、嫌気的、好気的又は微好気的条件で増殖させる。すべての培養物を３０℃で、３５０ｒｐｍにてインキュベートする。ｐＨ６．６で一定になるように１０ＭのＫＯＨの自動添加により維持する。細胞を、以下の成分を補充した合成ＭＳ１０培地中でラクトースにより増殖させて好気的条件下の増殖を可能とする：ＭｎＳＯ４（１．２５×１０−５ｇ／ｌ）、チアミン（１ｍｇ／ｌ）及びＤＬ−６，８−チオクト酸（２．５ｍｇ／ｌ）。ラクトース濃度は、例えば、５０ｇ／ｌである。３倍高い濃度のＫ２ＨＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４で緩衝化した上記培地により、振盪フラスコ内、３０℃で増殖させた前培養物の細胞をバイオリアクターに接種する。接種前にＮ２（純度９９．９９８％）を培地に流すことにより、かつ培養中にバイオリアクターの上部空間にＮ２５０ｍｌ／分の定速を維持することにより好気的条件を確保する。微好気的条件及び好気的培養のために用いられるバイオリアクターは、空気（ＤＯＴ、１００％）及びＮ２（ＤＯＴ、０％）で較正されたポーラログラフィー酸素センサーを備える。好気的条件はバイオリアクターに空気を１ｖｖｍの速度で拡散させてＤＯＴが８０％を超えることを確保することで得られる。微好気的実験中、Ｎ２と大気の空気の混合物からなる気体を０．２５ｖｖｍの速度でリアクターに拡散することによりＤＯＴが５％の一定に保たれる。
【０１１１】
（ケモスタット培養物）
ケモスタット培養物において、細胞は例えば１Ｌの有効容積のアプリコン（Applikon）実験室用発酵槽で、３０℃、３５０ｒｐｍで増殖させることができる。希釈率（Ｄ）は、異なった値、例えば、０．０５０ｈ−１、０．１０ｈ−１、０．１５ｈ−１又は０．２０ｈ−１に設定することができる。消泡剤（５０μｌ／ｌ）を追加した上記成長培地を用いて、５ＭのＫＯＨの自動追加によりｐＨを一定、例えば６．６に保つ。ラクトースの濃度を異なる値、例えば、３．０ｇ／ｌ、６．０ｇ／ｌ、１２．０ｇ／ｌ、１５．０ｇ／ｌ又は１８．０ｇ／ｌに設定することができる。バイオリアクターに１ｍｇ／ｌの初期バイオマス濃度で接種し、指数増殖期の終わりにフィードポンプを作動させる。
【０１１２】
嫌気的定常状態は５０ｍｌ／分のＮ２（純度９９．９９８％）をバイオリアクターの上部空間に導入することにより得る。異なる無酸素性定常状態は、Ｎ２（純度９９．９９８％）と大気の空気とから多様な比率で構成される２５０ｍｌ／分のガスをリアクターに拡散させることにより得ることができる。バイオリアクターに空気（１００％ＤＯＴ）とＮ２（０％ＤＯＴ）を拡散させることにより酸素電極を較正する。
【０１１３】
すべての条件で、ガスはバイオリアクターに導入する前に滅菌ろ過する。オフガスは、−８℃未満に冷却した冷却器を経て、アコースティックガスアナライザーによりそのＣＯ２とＯ２の体積含量が分析される。
【０１１４】
少なくとも５滞留時間後、及びバイオマスと発酵最終生成物の濃度が最後の少なくとも２滞留時間にわたって変化しない（５％相対偏差未満）の場合、培養は定常状態にあると考えられる。
【０１１５】
（実施例２６）
乳酸連鎖球菌におけるリスベラトロールの抽出と分析
抽出と分析は実施例１４と実施例１５に記載された方法を用いて実施する。
【０１１６】
（実施例２７）
アスペルギルス属に属する種におけるＰＡＬとＣ４Ｈの発現用真菌ベクターの構築
下記実施例で使用されるプラスミドは、黒色アスペルギルスと麹菌で自己プラスミド複製も維持する、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のＡＭＡ１開始複製配列を含有するｐＡＲｐ１から得られる（ゲムスら（Gems et al.）、１９９１年）。さらに、プラスミドは大腸菌の複製配列を含むシャトルベクターであるので、黒色アスペルギルス及び麹菌での固有の困難な形質転換が、組換えプラスミドの構築のために中間ホストとして大腸菌を用いることにより克服することができる。プラスミドは１つ以上のマーカー遺伝子を持っており、それらを持つ微生物を、それらを持たない微生物から選択することを可能とする。選択システムは、優性マーカー、例えば、ハイグロマイシンＢ、フレオマイシン及びブレオマイシンに対する耐性、又は異種マーカー、例えば、アミノ酸及びｐｙｒＧ遺伝子に基づくことができる。さらに、プラスミドは組換え遺伝子の発現を可能とするプロモーター配列とターミネーター配列を含む。好適なプロモーターは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓの遺伝子、例えば、ａｌｃＡ、ｇｌａＡ、ａｍｙ、ｎｉａＤ及びｇｐｄＡから得られる。さらに、プラスミドはＤＮＡ断片のクローニング及びその後の組換え体の同定を容易にする好適な独自の制限部位を含む。
【０１１７】
下記の実施例で用いられるプラスミドは強力な構成的ｇｐｄＡプロモーターと栄養要求性マーカーを含み、これらすべてがアスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓを起源とする。メチオニン生合成に関与する遺伝子ｍｅｔｈＧを含むプラスミドをｐＡＭＡ１−ＭＥＴと命名する。ヒスチジン生合成に関与する遺伝子ｈｉｓＡを含むプラスミドをｐＡＭＡ１−ＨＩＳと命名する。
【０１１８】
実施例１に記載のように単離されたＰＡＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含
む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物をアスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓに由来するｇｐｄＡプロモーターを含む消化ｐＡＭＡ１−ＭＥＴベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｇｐｄＡプロモーターの制御下にＰＡＬをコードする遺伝子を含有する。
【０１１９】
実施例１に記載のように単離されたＣ４Ｈをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例３）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＡＭＡ１−ＨＩＳベクターに連結してｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−Ｃ４Ｈを得ることができる。ｇｐｄＡプロモーターと、Ｃ４Ｈをコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−Ｃ４ＨからＰＣＲにより１つの断片として再増幅する。ＤＮＡ断片の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化プラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓに由来する個々のｐｇｄＡプロモーターの制御下にＰＡＬとＣ４Ｈをそれぞれコードする遺伝子を含む。ＰＡＬとＣ４Ｈをコードする遺伝子の配列をｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１２０】
（実施例２８）
アスペルギルス属に属する種におけるＴＡＬの発現用真菌ベクターの構築
実施例１に記載のように単離されたＴＡＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＴＡＬ（実施例６）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＡＭＡ１−ＭＥＴベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＴＡＬは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓに由来するｇｐｄＡプロモーターの制御下にＴＡＬをコードする遺伝子を含む。ＴＡＬをコードする遺伝子の配列をｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＴＡＬの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１２１】
（実施例２９）
アスペルギルス属に属する種における４ＣＬとＶＳＴの発現用真菌ベクターの構築
実施例１に記載のように単離された４ＣＬをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｇｐｄＡプロモーターを含む消化ｐＡＭＡ１−ＨＩＳベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓに由来するｇｐｄＡプロモーターの制御下に４ＣＬをコードする遺伝子を含む。
【０１２２】
実施例１に記載のように単離されたＶＳＴをコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例５）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＡＭＡ１−ＭＥＴベクターに連結してｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＶＳＴを得ることができる。ｇｐｄＡプロモーターと、ＶＳＴをコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む５’突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＶＳＴからＰＣＲにより１つの断片として再増幅する。ＤＮＡ断片の５’末端と３’末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化プラスミドｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ−ＶＳＴは、アスペルギルス ｎｉｄｕｌａｎｓに由来する個々のｐｇｄＡプロモーターの制御下にＣ４ＬとＶＳＴをそれぞれコードする遺伝子を含む。４ＣＬとＶＳＴをコードする遺伝子の配列をｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ−ＶＳＴの２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１２３】
（実施例３０）
黒色アスペルギルスにおいてリスベラトロールを導く経路の発現
黒色アスペルギルス菌株を、実施例２７、実施例２８及び実施例２９に記載されたベクターで、別々に、又は組合せて形質転換する。細菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、電気穿孔法又は接合を用いて実施する（例えば、サムブルックら（Sambrook et al.）（１９８９年）を参照）。形質転換体は、メチオニン及び／又はヒスチジンを欠く最小培地により選択する。
【０１２４】
ヒスチジンとメチオニンに対して栄養要求性のあるアスペルギルス ｎｉｇｅｒの菌株、例えば、別々にＦＧＳＣ Ａ９１９菌株（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔを参照）をベクターｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＴＡＬ（実施例２８）により形質転換して菌株ＦＳＡＮ−ＴＡＬを得て、ｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例２７）により菌株ＦＳＡＮ−ＰＡＬＣ４Ｈを得て、ｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２９）により菌株ＦＳＡＮ−４ＣＬＶＳＴを得る。さらに、黒色アスペルギルス菌株ＦＧＳＣ Ａ９１９をｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＴＡＬ（実施例２８）とｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２９）とで同時形質転換して、形質転換菌株をＦＳＡＮ−ＴＡＬ４ＣＬＶＳＴと名付ける。また、同菌株をｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ（実施例２７）及びｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ−ＶＳＴ（実施例２９）によっても同時形質転換して菌株ＦＳＡＮ−ＰＡＬＣ４Ｈ４ＣＬＶＳＴを得る。
【０１２５】
（実施例３１）
麹菌においてリスベラトロールを導く経路の発現
ＰＡＬ、Ｃ４Ｈ及び４ＣＬをコードする天然の遺伝子組を含有する麹菌の菌株（非特許文献１８）であって、メチオニンに対して栄養要求性のある菌株をベクターｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＶＳＴ（実施例２９）により形質転換して、菌株ＦＳＡＯ−ＶＳＴを得る。真菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、電気穿孔法又は接合を用いて実施する（例えば、サムブルックら（Sambrook et al.）（１９８９年）を参照）。形質転換体はメチオニンを欠く培地により選択する。
【０１２６】
（実施例３２）
培養槽における黒色アスペルギルス及び麹菌の組換え菌株による発酵
組換え酵母菌株は、バッチ培養、流加バッチ培養又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。
【０１２７】
（バッチ培養及び流加バッチ培養）
微生物は、好気的条件下で、１．５リットルの有効容積のバッフル付きバイオリアクターで増殖させる。すべての培養物を３０℃で、５００ｒｐｍにてインキュベートする。ｐＨ６．０で一定となるように１０ＭのＫＯＨの自動添加により維持し、好気的条件は空気を１ｖｖｍの速度でバイオリアクターに拡散させてＤＯＴが８０％を超えることを確保することで得られる。以下の成分からなる合成培地中で細胞をグルコースで増殖させてバッチ培養で増殖させる：７．３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．１ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｌ／ｌのシグマ社製の消泡剤、７．２ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．５ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ及び６．９ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。グルコース濃度は、例えば、１０ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ、３０ｇ／ｌ、４０ｇ／ｌ又は５０ｇ／ｌである。流加バッチ培養で細胞を増殖させるために、培地は、バッチ相中の７．３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１．９ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．１０ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｌ／ｌのシグマ社製の消泡剤、７．２ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．５ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ及び６．９ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・Ｈ２Ｏからなる。次に、リアクターに、例えば、２８５ｇ／ｋｇのグルコースと４２ｇ／ｋｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４を供給する。
【０１２８】
前バッチからの遊離した菌糸体を用いて、バッチ培養物及び流加バッチ培養物に接種する。２．１０９／ｌ濃度の胞子を用いて、ｐＨ２．５の前バッチ培養物に接種する。以下の成分が添加された２９ｇの米により凍結乾燥胞子を増殖させて胞子を得る：６ｍｌの１５ｇ／ｌのスクロース、２．３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５０ｇ／ｌのＮａＣｌ、１４．３ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｍｇ／ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５０ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ及び１３．８ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。これらの胞子は、３０℃で、７〜１４日間増殖して米粒上に胞子の黒い層を生じ、滅菌水中の１００ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えることにより胞子を回収する。すべての条件に関して、ガスはバイオリアクターに導入する前に滅菌ろ過する。オフガスは−８℃未満に冷却した冷却器を経て、アコースティックガスアナライザーによりそのＣＯ２とＯ２の体積含量を分析する。
【０１２９】
ケモスタット培養
ケモスタット培養では、例えば１．５リットルの有効容積のバッフル付きバイオスタットＢ実験室用発酵槽で、３０℃、５００ｒｐｍで細胞を増殖させることができる。ｐＨ６．６で一定になるように１０ＭのＫＯＨの自動添加により維持し、好気的条件は、空気を１ｖｖｍの速度でバイオリアクターに拡散して、確実にＤＯＴが８０％を超えさせることにより得られる。希釈率（Ｄ）は、異なる値、例えば、０．０５０ｈ−１、０．１０ｈ−１、０．１５ｈ−１又は０．２０ｈ−１に設定できる。以下の成分を有する最小成長培地を用いて、１０Ｍの自動追加によりｐＨを一定、例えば、６．６に保持する：２．５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．１ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｌ／ｌのシグマ社製消泡剤、７．２ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．５ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ及び６．９ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。グルコースの濃度は異なる値、例えば、３．０ｇ／ｌ、６．０ｇ／ｌ、１２．０ｇ／ｌ、１５．０ｇ／ｌ又は１８．０ｇ／ｌに設定することができる。バイオリアクターには上記のように前バッチ培養物からの遊離菌糸体が接種され、指数増殖期の終わりにフィードポンプを作動させる。
【０１３０】
すべての条件について、ガスはバイオリアクターに導入する前に滅菌ろ過する。オフガスは−８℃未満に冷却した冷却器を経て、アコースティックガスアナライザーによりそのＣＯ２とＯ２の体積含量を分析する。
【０１３１】
少なくとも５滞留時間後、及びバイオマスグルコースとオフガスの組成が最後の２滞留時間にわたって変化しない（５％相対偏差未満）の場合、培養は定常状態にあると考えられる。
【０１３２】
（実施例３３）
黒色アスペルギルス及び麹菌におけるリスベラトロールの抽出と分析
抽出と分析は実施例１４と実施例１５に記載された方法を用いて実施する。
【０１３３】
参考文献
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米国特許出願公開第２００１０５３８４７号
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【０１４５】
Ｓｃｈｏｐｐｎｅｒ，Ａ．；Ｋｉｎｄｌ，Ｈ．（１９８４）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｓｔｉｌｂｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，６８０６−６８１１．
Ｓｅｓｈｉｍｅ，Ｙ．，Ｊｕｖｖａｄｉ，Ｐ．Ｒ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｉ．ａｎｄ Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ．（２００５）．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３３７，７４７−５１．
Ｕｒｂａｎ Ｐ．，Ｍｉｇｎｏｔｔｅ，Ｃ，Ｋａｚｍａｉｅｒ Ｍ．，Ｄｅｌｏｒｍｅ Ｆ．Ａｎｄ Ｐｏｍｐｏｎ Ｄ．（１９９７）．Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｙｅａｓｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ Ｔｗｏ Ｄｉｓｔａｎｔｌｙ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ４５０ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ ｗｉｔｈ Ｐ４５０ ＣＹＰ７３Ａ５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１９１
７６−１９１８６．
【０１４６】
Ｗａｔｔｓ，Ｋ．Ｔ．，Ｌｅｅ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ，Ｃ．（２００４）．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ５，５００−５０７．
【０１４７】
以下は本明細書に現れるヌクレオチド配列とアミノ酸配列の概要である。
配列番号１は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）をコードするシロイヌナズナ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、配列番号１によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号３は、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）をコードするシロイヌナズナ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、配列番号３によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５は、４−クマレート：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ１）をコードするシロイヌナズナ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号６は、配列番号５によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号７は、リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）をコードするＲｈｅｕｍ ｔａｔａｒｉｃｕｍ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号８は、配列番号７によりコードされるアミノ酸配列である。
【０１４８】
配列番号９は、Ｓ．セレヴィシエでの発現のためにコドン最適化されたリスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ）をコードするＲｈｅｕｍ ｔａｔａｒｉｃｕｍ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、配列番号９によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１１は、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）をコードするロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、配列番号１１によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１３は、Ｓ．セレヴィシエでの発現のためにコドン最適化されたチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）をコードするロドバクテリア ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、配列番号１３によりコードされるアミノ酸配列である。
【０１４９】
配列番号１５は、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ１）をコードするＳ．セレヴィシエ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１６は、配列番号１５によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１７は、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＡＲ２）をコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎｕｓ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１８は、配列番号１７によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１９〜３２は、表１に現れる実施例１のプライマー配列である。
配列番号３３〜３４は、実施例１６に現れるプライマー配列である。
配列番号３５〜３８は、実施例１７に現れるプライマー配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−クマル酸を生産し、さらに当該４−クマル酸からリスベラトロール又は当該リスベラトロールのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を生産する操作的な代謝経路を有する微生物において、
前記代謝経路において、前記４−クマル酸は、
当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ及びシンナメート４−ヒドロキシラーゼの作用によってＬ−フェニルアラニンから、又は、
当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ又はチロシンアンモニアリアーゼの作用によってチロシンから生成し、
４−クマロイル−ＣｏＡが、当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現する４−クマレート−ＣｏＡリガーゼによる酵素反応で前記４−クマル酸から生成し、
そして前記リスベラトロールが、当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するリスベラトロールシンターゼによって内在性マロニル−ＣｏＡを基質とする反応で前記４−クマロイル−ＣｏＡから生成することを特徴とする微生物。
【請求項２】
天然のＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物で過剰発現している、又は、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物に組換えで導入されていることを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
チロシンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
真菌又は細菌であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたシンナメート−４−ヒドロキシラーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有することを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項７】
シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ活性を欠如し、発現シグナルに作動可能に連結されたチロシンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する請求項１に記載の微生物。
【請求項８】
４−クマル酸の外部源の実質的な非存在下において、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の微生物を炭素基質に接触させる工程を含むことを特徴とする、リスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記炭素基質が、単糖類、小糖類及び多糖類からなる発酵性炭素基質の群より選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記炭素基質が、エタノール、アセテート、グリセロール、ラクテート、及びアミノ酸で構成される非発酵性炭素基質からなる群より選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記非発酵性炭素基質が、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、生産されたリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を乳製品又は飲み物中の栄養補助食品として使用することを含む請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
４−クマル酸を生産し、さらに当該４−クマル酸からリスベラトロール又は当該リスベラトロールのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を生産する操作的な代謝経路を有する微生物において、
前記代謝経路において、前記４−クマル酸は、
当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ及びシンナメート４−ヒドロキシラーゼの作用によってＬ−フェニルアラニンから、又は、
当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ又はチロシンアンモニアリアーゼの作用によってチロシンから生成し、
４−クマロイル−ＣｏＡが、当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現する４−クマレート−ＣｏＡリガーゼによる酵素反応で前記４−クマル酸から生成し、
そして前記リスベラトロールが、当該微生物に固有でない酵素をコードする核酸から、当該微生物中で発現するリスベラトロールシンターゼによって内在性マロニル−ＣｏＡを基質とする反応で前記４−クマロイル−ＣｏＡから生成することを特徴とする微生物。
【請求項２】
天然のＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物で過剰発現している、又は、ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が、前記微生物に組換えで導入されていることを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
チロシンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
真菌又は細菌であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたシンナメート−４−ヒドロキシラーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有することを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項７】
シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ活性を欠如し、発現シグナルに作動可能に連結されたチロシンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する請求項１に記載の微生物。
【請求項８】
４−クマル酸の外部源の実質的な非存在下において、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の微生物を炭素基質に接触させる工程を含むことを特徴とする、リスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記炭素基質が、単糖類、小糖類及び多糖類からなる発酵性炭素基質の群より選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記炭素基質が、エタノール、アセテート、グリセロール、ラクテート、及びアミノ酸で構成される非発酵性炭素基質からなる群より選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記非発酵性炭素基質が、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、生産されたリスベラトロール又はそのオリゴマー誘導体又はグリコシド結合誘導体を乳製品又は飲み物中の栄養補助食品として使用することを含む請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１３−７８３３７（Ｐ２０１３−７８３３７Ａ）
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２８８２０６（Ｐ２０１２−２８８２０６）
【出願日】平成２４年１２月２８日（２０１２．１２．２８）
【分割の表示】特願２００７−５５５６３９（Ｐ２００７−５５５６３９）の分割
【原出願日】平成１８年２月２１日（２００６．２．２１）
【出願人】（５１３０００４０３）
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｌｖａ ＳＡ
【住所又は居所原語表記】Ｄｕｇｇｉｎｇｅｒｓｔｒａｓｓｅ ２３， ＣＨ−４１２３ Ｒｅｉｎａｃｈ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１２月２８日（２０１２．１２．２８）
【分割の表示】特願２００７−５５５６３９（Ｐ２００７−５５５６３９）の分割
【原出願日】平成１８年２月２１日（２００６．２．２１）
【出願人】（５１３０００４０３）
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｌｖａ ＳＡ
【住所又は居所原語表記】Ｄｕｇｇｉｎｇｅｒｓｔｒａｓｓｅ ２３， ＣＨ−４１２３ Ｒｅｉｎａｃｈ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
【Ｆターム（参考）】
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