リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性癌抗原ペプチド
配列番号：１に記載のリビンのアミノ酸配列における連続する８〜１１アミノ酸からなる部分ペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識されるペプチド、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ペプチドやポリヌクレオチドを含む癌ワクチン等を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性癌抗原ペプチドに関する。
【背景技術】
生体による癌（腫瘍）の排除には、免疫系、特にＴ細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。実際、ヒトの癌局所には癌細胞に対して傷害活性を示すリンパ球の浸潤が認められ（Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．，１２６：ｐ２００（１９９０））、メラノーマからは自己の癌細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（以下ＣＴＬ）が比較的容易に分離されている（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，８：ｐ３８５（１９８７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：ｐ９８９（１９８７）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５２：ｐ５２（１９９２））。また、該ＣＴＬの移入によるメラノーマ治療の臨床結果からも、癌排除におけるＴ細胞の重要性が示唆されている（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８６：ｐ１１５９（１９９４））。
自己の癌細胞を攻撃するＣＴＬが標的とする分子については長い間不明であったが、最近の免疫学および分子生物学の進歩により次第に明らかになってきた。すなわちＣＴＬは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、癌抗原ペプチドと呼ばれるペプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原、ＨＬＡ抗原とも呼ばれる）との複合体を認識することにより、自己の癌細胞を攻撃していることが明らかとなった。
癌抗原ペプチドは、癌に特有のタンパク質、すなわち癌抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアソームにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された癌抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を抗原特異的なＣＴＬが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を示す。このような一連の作用の解明に伴い、癌抗原タンパク質または癌抗原ペプチドをいわゆる癌ワクチンとして利用することにより、癌患者の体内の癌特異的ＣＴＬを増強させる治療法が可能となった。
癌抗原タンパク質としては、１９９１年にＴ．Ｂｏｏｎらが初めてＭＡＧＥと名付けたタンパク質をヒトメラノーマ細胞から同定した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：ｐ１６４３（１９９１））。その後、いくつかの癌抗原タンパク質が、主にメラノーマ細胞から同定されている。メラノーマ抗原としては、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼなどのメラノソームタンパク質、メラノーマだけでなく各種癌細胞と正常精巣細胞に発現するＭＡＧＥ関連タンパク質群、癌特異的なアミノ酸変異を持つβ−カテニン、ＣＤＫ４などが同定されている。また、メラノーマ以外の癌抗原タンパク質としては、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ５３（変異型）などの癌遺伝子産物、ＣＥＡ、ＰＳＡなどの癌マーカー、ＨＰＶ、ＥＢＶなどのウイルスタンパク質などが同定されている。これらについては、総説（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１８：ｐ２６７（１９９７）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：ｐ７２５（１９９６）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：ｐ６２８（１９９６））の記述に詳しい。
リビンはアポトーシス阻害タンパク（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＩＡＰ）のファミリーに属する分子として同定された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：ｐ３２３８（２００１））。リビンは２８０アミノ酸よりなり、バキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）と呼ばれるＩＡＰに特徴的な約７０アミノ酸からなるユニークな繰り返し配列を１個持っている。同時期にメラノーマに高発現するＩＡＰとして同定されたＭＬ−ＩＡＰ（ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）もリビンと同一のアミノ酸配列の分子である（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：ｐ１３５９（２０００））。
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のメラノーマ患者の転移巣から回収したＴ細胞はＭＬ−ＩＡＰ由来のペプチドを認識して細胞傷害活性を示した報告があり、リビンが癌抗原タンパク質として細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の標的になっていると考えられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：ｐ３３９８（２００３））。しかしながら当該リビンが、多数存在するＨＬＡ抗原のうちＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合性の癌抗原ペプチド部分を有しているか否かは明らかにされていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性癌抗原ペプチド、および当該ペプチドの癌ワクチンとしての使用などを提供することにある。
本発明者らは、癌免疫療法において癌ワクチンとして使用できるリビン由来の抗原ペプチドにつき鋭意検討を行った。その結果、リビンには、多数存在するＨＬＡ抗原サブクラスのうち、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識される癌抗原ペプチド部分が存在していることを初めて見出した。そしてこの知見により、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の癌患者に対してリビン特異的ＣＴＬを誘導することのできる新たな癌ワクチン療法が可能となった。
とりわけ配列番号：８に記載の癌抗原ペプチドは、陽性コントロールに比して格段に高いＨＬＡ−Ａ２４抗原結合性を示し、また良好なＣＴＬ誘導活性を有し、臨床適応可能な癌抗原ペプチドとして本発明者により見出されたものである。
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、
（１） 配列番号：１に記載のリビンのアミノ酸配列における連続する８〜１１アミノ酸からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
（２） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、前記（１）記載のペプチド、
（３） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、前記（２）記載のペプチド、
（４） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、前記（２）記載のペプチド、
（５） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、前記（４）記載のペプチド、
（６） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有する、前記（４）記載のペプチド、
（７） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる、前記（６）記載のペプチド、
（８） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
（９） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、前記（８）記載のペプチド、
（１０） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、前記（８）記載のペプチド、
（１１） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、前記（１０）記載のペプチド、
（１２） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、前記（１０）記載のペプチド、
（１３） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、前記（１２）記載のペプチド、
（１４） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列（配列番号：６３、ただし配列番号：８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含有する、前記（１２）記載のペプチド、
（１５） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列（配列番号：６３、ただし配列番号：８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）からなる、前記（１４）記載のペプチド、
（１６） 前記（１）〜（１５）いずれか記載のペプチドを含有するエピトープペプチド、
（１７） 前記（１）〜（１６）いずれか記載のペプチドのうちシステイン残基を含有するペプチドの単量体がジスルフィド結合により結合してなる、二量化ペプチド、
（１８） 配列番号：７〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる、前記（１７）記載の二量化ペプチド、
（１９） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するペプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる、前記（１８）記載の二量化ペプチド、
（２０） 前記（１）〜（１６）いずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２１） 前記（２０）記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
（２２） 前記（２１）記載の発現ベクターを含有する細胞、
（２３） 前記（２２）記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチドの製造方法、
（２４） 前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体、
（２５） 前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、
（２６） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、前記（２５）記載の抗原提示細胞、
（２７） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、前記（２６）記載の抗原提示細胞、
（２８） 前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ、
（２９） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、前記（２８）記載のＣＴＬ、
（３０） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、前記（２９）記載のＣＴＬ、
（３１） 前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチド、前記（２１）記載の発現ベクター、前記（２２）記載の細胞、前記（２５）〜（２７）いずれか記載の抗原提示細胞、あるいは前記（２８）〜（３０）いずれか記載のＣＴＬと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
（３２） ＣＴＬの誘導剤として使用される、前記（３１）記載の医薬組成物、
（３３） 癌ワクチンとして使用される、前記（３１）記載の医薬組成物、
（３４） 前記（２４）記載の抗体を含有する癌の診断薬、
（３５） 前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー、
（３６） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有する、前記（３５）記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー、
（３７） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有する、前記（３６）記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー、
（３８） 前記（３５）〜（３７）いずれか記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを成分として含有する、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４抗原結合性癌抗原ペプチド特異的なＣＴＬの検出用試薬、ならびに
（３９） 癌ワクチンの効果の診断のために用いられる、前記（３８）記載の試薬、に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、リビン由来の８種類のペプチドおよび陽性コントロールであるＥＢウイルス由来ペプチド（ＥＢＶ）のＨＬＡ−Ａ＊２４０２への結合親和性を示したグラフである。図中、縦軸は平均蛍光強度（結合親和性）を示す（実施例１）。
図２は、リビン由来ペプチド（ペプチド７）によるヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からのＣＴＬ誘導活性を、５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した結果を示したグラフである。ＨＬＡ−Ａ２４陽性の肺癌患者より得たＰＢＭＣを用いた。図中、縦軸はＣＴＬによる細胞傷害活性を示す。また、図中の標的細胞で、ＬＮＹ−１は、リビン陽性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性、ＬＮＹ−１Ａ２４はリビン陽性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性、Ｋ５６２はリビン陰性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性である（実施例２）。
図３は、図２と同じ実験をＨＬＡ−Ａ２４陽性の別の肺癌患者のＰＢＭＣを用いて行った結果を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、配列番号：１に記載のリビンのアミノ酸配列における連続する８〜１１アミノ酸からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドを提供する。
本発明のペプチドは、前記のように配列番号：１に記載のアミノ酸配列の一部よりなるペプチドであるが、そのＮ末端アミノ酸残基及び／又はＣ末端のアミノ酸残基が修飾されていても良い。またシステイン残基を含有するペプチドに関しては、その単量体がジスルフィド結合により結合してなる二量化ペプチドの形態であっても良い。
ここで配列番号：１に記載のヒト・リビンのアミノ酸配列は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２３８，２００１、ＮＣＢＩデータベースＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＧ３３６２２に記載された公知の配列である。
本発明のペプチドは、配列番号：１に記載のヒト・リビンのアミノ酸配列における連続する８〜１１アミノ酸からなるペプチドである。ここで「８〜１１アミノ酸」との定義は、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合性を有するペプチドが、一般的に８〜１１アミノ酸からなることに基づくものである（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８−２２８（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：４３０７−４３１２（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９１３−３９２４（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９０４−３９１２（１９９４）、）。好ましくは、配列番号：１に記載のヒト・リビンのアミノ酸配列における連続する９〜１１アミノ酸からなるペプチドが挙げられ、さらに好ましくは９〜１０アミノ酸からなるペプチドが挙げられる。
前記本発明のペプチドは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における連続する８〜１１アミノ酸からなる部分ペプチド（候補ペプチド）を合成し、該ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるか否かをアッセイすることにより、同定することができる。
ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
前記において「ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識される」とは癌抗原ペプチドとしての活性を有することを意味するものであり、「ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬを誘導する（ＣＴＬ誘導活性を有する）」こと、「ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬを活性化する（ＣＴＬ活性化活性を有する）」ことと同義語である。よって本発明においては「ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識される」ことを、「癌抗原ペプチドとしての活性を有する」若しくは「ＣＴＬ誘導活性を有する」と称することもある。
候補ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されることは、例えばＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９，１６１１，２００２に記載の方法により調べることができる。
すなわちまず、ＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性のヒトから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離・培養する。培養後、非接着性の細胞を回収して培養し、ＣＴＬを含むＴ細胞集団（ＣＤ８陽性Ｔ細胞）を抗ＣＤ８抗体結合マグネチックビーズなどで分離する。また別途、抗原提示用細胞調製のために接着性の細胞を培養し、候補ペプチドを添加（パルス）してさらに培養する。
次に、前記ペプチドパルスした抗原提示細胞とＣＴＬを含むＴ細胞集団とを混合培養する。このペプチドパルスした抗原提示細胞による刺激を数回繰り返してペプチド特異的なＣＴＬを増やした後、当該ＣＴＬによる細胞傷害活性を、例えば５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：ｐ３１７，１９９４）などにより測定する。アッセイにおいて使用する標的細胞としては、５１Ｃｒでラベルしたリビン陽性かつＨＬＡ−Ａ２４陽性の細胞が、挙げられる。具体的には、例えばリビン陽性およびＨＬＡ−Ａ２４陰性であるメラノーマ由来細胞株や肺癌由来細胞株にＨＬＡ−Ａ２４の一種であるＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：４２４８−４２５２（１９９５）、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ６４７４０）を導入した５１Ｃｒラベル化細胞などが挙げられる。
以上のようなアッセイにより、ＣＴＬが標的細胞を傷害した場合は、候補ペプチドが「ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識される」という本発明の活性を有すると判断する。
さらに、ＷＯ０２／４７４７４号公報およびＩｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述されたＨＬＡ−Ａ２４モデルマウスを用いることにより、候補ペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで「ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識される」という本発明の活性を有することを確認することができる。
ＨＬＡ分子には多くのサブタイプが存在し、結合できる抗原ペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在することが知られている。ＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフとしては、８〜１１アミノ酸からなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）であり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）またはメチオニン（Ｍｅｔ）となることが知られている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８−２２８（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：４３０７−４３１２（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９１３−３９２４（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９０４−３９１２（１９９４）、）。また、これら規則性に係わるアミノ酸残基に類似するアミノ酸残基も許容され得る。
さらに近年、これらの規則性に基づき、ＨＬＡ抗原に結合可能と予想されるペプチド配列を、インターネット上、ＮＩＨのＢＩＭＡＳのソフトを使用することにより検索することができる（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）。
本発明は、リビン（配列番号：１）が、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識される抗原ペプチド部分を有していることを初めて見出したものであるが、当該リビンのアミノ酸配列のうち、前記ＢＩＭＡＳソフトを用いた検索により同定される９アミノ酸若しくは１０アミノ酸からなる推定上のＨＬＡ−Ａ２４結合配列としては、配列番号：２〜配列番号：５９に記載のリビンの部分アミノ酸配列が挙げられる。
すなわち本発明のペプチドの具体的な態様として、本発明は、配列番号：２〜５９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有し、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドを提供する。
当該ペプチドは、配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するリビンの部分ペプチドであり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識される活性を有する限り、その長さは特に限定されない。しかしながらＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合性を有するペプチドは、一般的に８〜１１アミノ酸からなることが知られている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８−２２８（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：４３０７−４３１２（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９１３−３９２４（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９０４−３９１２（１９９４）。従って前記配列番号に係る本発明のペプチドは、９〜１１アミノ酸からなるペプチドであることが好ましく、９〜１０アミノ酸からなるペプチドであることがより好ましい。
すなわち本発明のペプチドのより好ましい形態として、本発明は、配列番号：２〜５９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸（好ましくは９〜１０アミノ酸）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドを提供する。
また、さらに好ましい形態として、本発明は、配列番号：２〜５９のいずれかに記載のアミノ酸からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドを提供する。
前記配列番号で示される本発明のペプチドのうち好ましいのは配列番号：６〜９に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドであり、特に好ましいのは配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドである。当該配列番号：８に記載の癌抗原ペプチドは、陽性コントロールに比して格段に高いＨＬＡ−Ａ２４抗原結合性を示し、また良好なＣＴＬ誘導活性を有するペプチドとして本発明者により見出されたものである。
ペプチドの長さとしては９〜１１アミノ酸が好ましく、９〜１０アミノ酸がさらに好ましい。また配列番号：６〜９に記載のアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましく、配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが特に好ましい。
前記本発明のペプチドは、活性を保持する範囲内で、適宜改変されていても良い。ここでアミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数および位置は、癌抗原ペプチドとしての活性を有する限り任意であるが、前記したように通常、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合するペプチドの長さが８〜１１アミノ酸程度であることから、１個から数個の範囲が好ましい。
当該置換に係るアミノ酸残基の改変においては、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に対する結合モチーフ構造を有するペプチドにおける第２位及び／又はＣ末端のアミノ酸残基の置換が好ましい。
このような本発明の置換に係るペプチドの具体的な態様としては、配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸（好ましくは９〜１０アミノ酸）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが挙げられる。
このうち配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが好ましい。
前記置換においては、ＨＬＡ−Ａ２４抗原の結合モチーフ構造を保持するアミノ酸残基への置換が好ましい。すなわち本発明の置換に係るペプチドの好ましい態様としては、配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸（好ましくは９〜１０アミノ酸）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが挙げられる。
このうち、配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドがより好ましい。
前記置換に係る本発明のペプチドのうち、より好ましいのは、配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸（好ましくは９〜１０アミノ酸）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドである。
このうち、配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドがより好ましい。
前記置換に係る本発明のペプチドのうち、特に好ましいのは、配列番号：８に記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列（配列番号：６３、ただし配列番号：８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含有する９〜１１アミノ酸（好ましくは９〜１０アミノ酸）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドである。
このうち、配列番号：８に記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列（配列番号：６３、ただし配列番号：８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドがより好ましい。
前記第２位及び／又はＣ末端のアミノ酸残基の改変（好ましくは置換）は、例えば前記に示したリビンの部分配列からなる本発明の天然型の癌抗原ペプチドにおいて、そのＨＬＡ−Ａ２４抗原への結合性を高める、若しくは活性を増強する目的で行うことができる。置換を施した第２位および／またはＣ末端アミノ酸以外の部分は、天然型の配列のまま（すなわちリビンのアミノ酸配列のまま）であっても良く、また活性を保持する限りさらなる改変を施しても良い。当該改変とは、具体的には、システイン残基の他のアミノ酸残基（例えばセリン、アラニン、α−アミノ酪酸）への置換が挙げられる。より具体的には、例えば配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチドにおいて、その第６位のシステインが他のアミノ酸残基（例えばセリン、アラニン、α−アミノ酪酸）に置換されたペプチドが例示される。また、例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチド（例えば配列番号：６３に記載のアミノ酸配列よりなるペプチド）において、その第６位のシステインが他のアミノ酸残基（例えばセリン、アラニン、α−アミノ酪酸）に置換されたペプチドが例示される。また、例えば配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチドにおいて、その第７位のシステインが他のアミノ酸残基（例えばセリン、アラニン、α−アミノ酪酸）に置換されたペプチドが例示される。
本発明はまた、前記本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチド）とヘルパーペプチド若しくは他の癌抗原ペプチドとを含有するペプチド（いわゆる「エピトープペプチド」）を提供する。
近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したペプチド（エピトープペプチド）が、効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９８，１６１：３１８６−３１９４には、癌抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２，−Ａ３，−Ａ１１，Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープを連結した約３０ｍｅｒのペプチドが、イン・ビボでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。
またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたペプチド（エピトープペプチド）により、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。ここでヘルパーエピトープとはＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる作用を有するペプチドを指すものであり（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．，１：７５１，１９９４）、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが知られている。当該ヘルパーエピトープにより活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＴＬの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどのエフェクター活性化などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要であると考えられている。このようなヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープとを連列したペプチドの具体例として、例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９９，１６２：３９１５−３９２５には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープより構成されるペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。また実際に、ＣＴＬエピトープ（メラノーマ抗原ｇｐ１００の第２８０位〜２８８位からなる癌抗原ペプチド）とヘルパーエピトープ（破傷風毒素由来Ｔヘルパーエピトープ）とを連結したペプチドが臨床試験に供されている（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）。
従って、前記本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチド）を含む複数のエピトープを連結させたＣＴＬ誘導活性を有するエピトープペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
ここで、本発明の癌抗原ペプチドに連結させるエピトープがＣＴＬエピトープ（癌抗原ペプチド）の場合、用いるＣＴＬエピトープとしては、リビン由来のＨＬＡ−Ａ０２０１，−Ａ０２０４，−Ａ０２０５，−Ａ０２０６，−Ａ０２０７に拘束性のＣＴＬエピトープが挙げられる。これらＣＴＬエピトープは複数個連結することが可能であり、１つのＣＴＬエピトープの長さとしては、各種ＨＬＡ分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８，１９９５）、８〜１４アミノ酸程度を挙げることができる。
また本発明の癌抗原ペプチドに連結させるエピトープがヘルパーエピトープの場合、用いるヘルパーエピトープとしては、前述のようなＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープの長さとしては、１３〜３０アミノ酸程度、好ましくは１３〜１７アミノ酸程度を挙げることができる。
本発明のエピトープペプチドとして、具体的には、例えば配列番号：２〜５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドの１種または２種以上とヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドを挙げることができる。
より具体的には、例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドと破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばＰｈｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ；配列番号：６１）とを連結させたエピトープペプチドや、配列番号：８に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドとＡｌａ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ（配列番号：６２、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）とを連結させたエピトープペプチドなどが挙げられる。
このような複数のエピトープを連結させたペプチド（エピトープペプチド）は、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のＤＮＡ合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８３）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ（１９８５））や後述の方法などに準じて行うことができる。
以上のようにして製造された複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを前述の５１ＣｒリリースアッセイやＷＯ ０２／４７４７４号公報およびＩｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述のヒトモデル動物に供すること等により、ＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
以上に示した本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチドおよびエピトープペプチド）のＮ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基は、修飾されていても良い。すなわち、当該Ｎ末端のアミノ酸残基及び／又はＣ末端のアミノ酸残基が修飾されたペプチドも、本発明のペプチドの範疇に含まれる。
ここでＮ末端アミノ酸のアミノ基の修飾基としては、例えば１〜３個の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、シクロアルキル基、アシル基が挙げられ、アシル基の具体例としては炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基、炭素数２から６のアルコキシカルボニル基、フェニル基で置換されたアルコキシカルボニル基、炭素数５から７のシクロアルコキシで置換されたカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体およびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル、炭素数５から７のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数１から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
また、以上に示した本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチドおよびエピトープペプチド）のうちシステイン残基を含有するペプチドに関しては、そのペプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる二量化ペプチドの形態であっても良い。当該二量化は、ペプチド単量体を合成後、酸化状態に置くことにより作製することができる。
具体的には、例えば配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチドの二量化ペプチドが例示される。また、例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチド（例えば配列番号：６３に記載のアミノ酸配列よりなるペプチド）の二量化ペプチドが例示される。また、例えば配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチドの二量化ペプチドが例示される。
本発明はまた、前記本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチドまたはエピトープペプチド）をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるＤＮＡの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のＤＮＡ合成やＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。
具体的には、例えば配列番号：２〜５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドの１種または２種以上とヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
好ましくは、例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドと破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばＰｈｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ；配列番号：６１）とを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。また配列番号：８に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドとＡｌａ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ（配列番号：６２、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）とを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
前記で作製された本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な（ペプチドの発現可能な）条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のポリペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明のペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良い。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドに特異的に結合する抗体を挙げることができる。好ましくは、配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列よりなるペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられ、より好ましくは、配列番号：８に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．１２〜１１．１３、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｌａｎｅ，Ｈ，Ｄ．ら編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ出版Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９）。
具体的には、本発明のペプチドを免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明のペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４〜１１．１１）。
本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、リビン遺伝子が発現している癌、すなわち肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の診断において有効である。
本発明は、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞を提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激によりＣＴＬ誘導活性が認められたが、これは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されたことを示すものである。このような、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞は、後述する細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
本発明の抗原提示細胞は、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞であれば良く、具体的には、例えば配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。好ましくは、配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞が挙げられ、より好ましくは、配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。
細胞療法（ＤＣ療法）において用いられる抗原提示細胞は、癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明のペプチドを体外でパルスするか、または本発明のポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターを細胞内に導入して、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示可能なＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、本発明のペプチドであっても良いし、また本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターであっても良い。
本発明の抗原提示細胞は、例えば癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチド（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）を体外でパルスし、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を作製することにより得られる（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４６：８２，１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：ｐ１７９６，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９：ｐ１１８４，１９９９）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、癌患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド）あるいはそれを含有する発現ベクターを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合はＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６：ｐ５６７２，１９９６やＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：ｐ５６０７，１９９８などを参考にして行うことができる。また、ＤＮＡのみならずＲＮＡの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができ、この場合は、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：ｐ４６５，１９９６などを参考できる。
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬを提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激によりＣＴＬ誘導活性が認められた。これは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されたことを示すものである。このような、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬは、後述する養子免疫療法において有効に用いられる。
本発明のＣＴＬは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するものであれば良いが、具体的には、例えば配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するＣＴＬを挙げることができる。好ましくは、配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するＣＴＬが挙げられ、より好ましくは、配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するＣＴＬを挙げることができる。
養子免疫療法において用いられるＣＴＬは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを本発明のペプチド（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）、あるいは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド）やそれを含有する発現ベクターでイン・ビトロで刺激する等により作製される（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９９，１９０：１６６９）。
以上に記載した本発明のペプチド、本発明の発現ベクター、本発明の細胞、本発明の抗原提示細胞、および本発明のＣＴＬは、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、ＣＴＬの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効成分とすることができる。以下、具体的に説明する。
（１）本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチン
本発明のペプチドは、ＣＴＬの誘導能を有するものであり、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従って本発明のペプチドは、癌の治療または予防のための癌ワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明の癌ワクチンをＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリビン陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ−Ａ２４抗原にペプチド（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）が提示され、提示されたＨＬＡ−Ａ２４抗原複合体を特異的に認識するＣＴＬが増殖して癌細胞を破壊することができ、従って、癌の治療または予防が可能となる。本発明の癌ワクチンは、リビン遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
よって、本発明は別の態様として、本発明の癌ワクチンの有効量をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリビン陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、単一のＣＴＬエピトープ（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（ＣＴＬエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したエピトープペプチドを有効成分とするものであっても良い。すなわち近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドが、イン・ビボで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９８，１６１：３１８６−３１９４には、癌抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２，−Ａ３，−Ａ１１，Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約３０ｍｅｒのエピトープペプチドが、イン・ビボでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドにより、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。このようなエピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。このようにして癌の治療または予防が達成される。
また本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７：２７７−２８９，１９９４）に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、海洋生物由来成分、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルジョン製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
（２）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチン
前記本発明のペプチドのみならず、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターもまた、癌の治療または予防のためのＤＮＡワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。また、本発明は別の態様として、本発明のＤＮＡワクチンの有効量をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリビン陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｖｏで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９９，１６２：３９１５−３９２５には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。
従って、本発明のエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込むことにより、癌ワクチンの有効成分とすることができる。
本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを癌ワクチン（ＤＮＡワクチン）の有効成分として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
本発明のポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレオチドを直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外でＤＮＡを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等）。ｉｎ ｖｉｖｏ法がより好ましい。
ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
以上のような本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターの癌患者への投与により、抗原提示細胞内で当該ポリヌクレオチドに対応するポリペプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の癌抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体を特異的に認識するＣＴＬが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。以上のようにして、癌の治療または予防が達成される。本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分とする癌ワクチンは、リビン遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
（３）本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンを提供する。
近年、癌患者の末梢血からリンパ球を分離し、その中から樹状細胞を誘導し、イン・ビトロでペプチド等をパルスして調製した抗原提示細胞を皮下投与などにより患者に戻す細胞療法（ＤＣ療法）が報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４６：８２，１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：ｐ１７９６，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９：ｐ１１８４，１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６：ｐ５６７２，１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：ｐ５６０７，１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：ｐ４６５，１９９６）。従って前記本発明の抗原提示細胞を、細胞療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリビン陽性の患者の体内で効率良く特異的なＣＴＬが誘導され、癌を治療または予防することができる。本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、リビン遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
（４）本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明のＣＴＬは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
メラノーマにおいて、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養し、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８６：１１５９，１９９４）。またマウスのメラノーマでは、脾細胞をイン・ビトロで癌抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、癌抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５：４５３，１９９７）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のペプチドあるいは本発明のポリヌクレオチドや発現ベクターを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して癌特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。従って前記本発明のＣＴＬを、養子免疫療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンは、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリビン陽性の患者の体内でＣＴＬによる癌細胞の傷害作用が促進され、癌細胞を破壊することにより、癌を治療することができる。本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンは、リビン遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
本発明は、本発明の抗体を含有する癌の診断薬を提供する。
本発明の抗体を含有する癌の診断薬を用いることにより、癌の免疫学的診断を行うことができる。当該免疫学的診断を行うには、まず本発明の抗体を必要に応じて適宜標識し、これを用いて癌が疑われる患者から得た試料（例えば血液、癌組織など）中の抗原（リビン）若しくは抗原ペプチド（リビン由来抗原ペプチド）の存在を検出することにより、癌の有無を診断することができる。具体的にはイムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等により行うことができる。
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを提供する。
癌免疫療法において、治療前に癌抗原（癌抗原ペプチド）に対するＣＴＬ前駆細胞の頻度や量を予め調べることや、癌抗原（癌抗原ペプチド）による治療実施中の患者におけるＣＴＬの頻度や量を調べることは、当該癌抗原（癌抗原ペプチド）に対する応答性が高い患者の選択や、治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定などにおいて重要な指標となる。癌抗原ペプチドとＨＬＡ抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーおよびＨＬＡペンタマーは、抗原（抗原ペプチド）特異的ＣＴＬの検出、すなわち当該ＣＴＬの頻度や量を測定するための試薬として有用である。
ここでＨＬＡテトラマーとは、ＨＬＡ抗原のα鎖とβ２ミクログロブリンをペプチド（抗原ペプチド）と会合させた複合体（ＨＬＡモノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを指す（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３−２１０６（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４−９６（１９９６））。
ＨＬＡモノマーとは前記ＨＬＡテトラマーの製造において用いられる、ＨＬＡ抗原α鎖、β２ミクログロブリン、抗原ペプチドの会合体をビオチン化したもの（単量体）を指す。
ＨＬＡダイマーとはＨＬＡ抗原α鎖とＩｇ（イムノグロブリン、例えばＩｇＧ１）とを融合させ、これにβ２ミクログロブリン、抗原ペプチドを結合させたものを指す（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６６７１−６６７５（１９９３））。ＨＬＡダイマーに結合した抗原ペプチド特異的ＣＴＬは、例えば標識抗ＩｇＧ１抗体をＩｇＧ１に結合させることなどにより、検出することができる。
ＨＬＡペンタマーとは近年開発された技術であり、ＨＬＡ抗原と抗原ペプチドとの複合体５分子がＣｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌドメインを介して重合した５量体を指す。ＨＬＡ抗原−抗原ペプチドの複合体を蛍光色素等で標識することができるため、ＨＬＡテトラマー法と同様にフローサイトメーター等で解析することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ．ｃｏ．ｕｋ／参照）。
以上に述べたＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーはいずれも受託合成可能であり、例えばＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社やＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社などに委託することにより合成することができる。また現在では種々の抗原ペプチドを含有するＨＬＡテトラマーなども市販されている（（株）医学生物学研究所等）。
本発明のＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーとして具体的には、例えば配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーが挙げられる。このうちＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを用いることが好ましく、ＨＬＡテトラマーを用いることがより好ましい。中でも配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーが好ましく、特に配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーが好ましい。このうちＨＬＡテトラマーがより好ましい。
当該ＨＬＡモノマー、ＨＬＡテトラマーおよびＨＬＡペンタマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の公知の検出手段により結合したＣＴＬを容易に選別または検出することが出来るように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）などにより標識されたＨＬＡモノマー、ＨＬＡテトラマーおよびＨＬＡペンタマーが挙げられる。
本発明のＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーの成分であるＨＬＡ−Ａ２４抗原（ＨＬＡ−Ａ２４抗原のα鎖）は、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：４２４８−４２５２（１９９５）およびＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ６４７４０に開示されているＨＬＡ−Ａ２４０２の公知の塩基配列の情報に基づき、ＰＣＲ法等の常法により容易にクローニングすることができる。
本発明のＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーの成分であるβ２ミクログロブリンは、ヒト由来のβ２ミクログロブリンが好ましい。当該ヒトβ２ミクログロブリンはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＢ０２１２８８に開示されているヒトβ２ミクログロブリンの公知の塩基配列情報に基づき、ＰＣＲ法等の常法により容易にクローニングすることができる。
ＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマー作製法については、前記各文献により周知であるが、具体的にＨＬＡテトラマーの作製法につき簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４α鎖発現ベクターおよびβ２ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例えばＢＬ２１）を用いることが好ましい。得られた単量体ＨＬＡ−Ａ２４複合体と本発明ペプチドとを混合し、可溶性のＨＬＡ−ペプチド複合体を形成させる。次にＨＬＡ−ペプチド複合体におけるＨＬＡ−Ａ２４α鎖のＣ末端部位の配列をＢｉｒＡ酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたＨＬＡ−ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを４：１のモル比で混合することにより、ＨＬＡテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
前記本発明のＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーは、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性癌抗原ペプチド特異的なＣＴＬの検出用試薬として有効に用いられる。
本発明のＣＴＬ検出用試薬は、例えば以下の目的に使用することができる：
１）本発明の癌抗原ペプチドによる治療開始前に、本発明の癌抗原ペプチドに対するＣＴＬ前駆細胞の頻度や量を調べる。これにより、当該癌抗原ペプチドに対する患者の応答性を判断することができる。
２）本発明の癌抗原ペプチド（癌ワクチン）による治療実施中の患者におけるＣＴＬの頻度や量を調べる。これにより治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定、治療が順調に進んでいることの確認などを行うことができる。
ＣＴＬの検出法としては、具体的には、被験患者よりＣＴＬを含む生体試料（例えばＰＢＭＣ）を単離し、本発明のＨＬＡテトラマー等と前記生体試料とを接触させ、ＨＬＡテトラマー等に結合した本発明ペプチド特異的なＣＴＬの存在頻度または量を、フローサイトメーター等で測定する。
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
［実施例１］
ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊２４０２への結合親和性の検討
リビンのアミノ酸配列（ＮＣＢＩのデータベースＥｎｔｒｅｚのＡＡＧ３３６２２）よりＨＬＡ−Ａ＊２４０２（ＨＬＡ−Ａ２４の１種）に結合する可能性のあるペプチドを８種類合成した。それぞれペプチドの配列は、リビンの第４７位から５５位に相当するペプチド１（Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｉｌｅ；配列番号：２）、第４７位から５６位に相当するペプチド２（Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ；配列番号：３）、第８０位から８９位に相当するペプチド３（Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ；配列番号：４）、第８３位から第９１位に相当するペプチド４（Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ；配列番号：５）、第１４０位から第１４８位に相当するペプチド５（Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｐｈｅ；配列番号：６）、第１４６位から１５４位に相当するペプチド６（Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ；配列番号：７）、第１４６位から１５５位に相当するペプチド７（Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ；配列番号：８）および第１４５位から１５４位に相当するペプチド８（Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ：配列番号：９）である。リビン由来の前述のペプチドおよびＥＢウイルス由来のペプチド（Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ；配列番号：６０）はアミノ酸合成機を用いてＦ−ｍｏｃ法で合成した。
これらのペプチドのＨＬＡ−Ａ＊２４０２への結合親和性の測定は、文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２５６５，２０００）に記載の方法と同様に実施した。ＭＨＣクラスＩ分子を発現していないマウスリンパ腫由来の細胞株ＲＭＡ−ＳにＨＬＡ−Ａ＊２４０２とＨ−２ＫｂのキメラＭＨＣの遺伝子を安定的に導入した細胞株ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２細胞（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４，２５６５−２５７４（２０００））を２６℃で１８時間培養した。ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２細胞をＰＢＳ溶液で洗浄後、３μＬ／ｍＬのヒトβ２−ミクログロブリンと１００μＬ／ｍＬの各種ペプチドを含有する培養液ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁して２６℃で３時間、３７℃で３時間培養した。この細胞をＰＢＳ溶液で洗浄後、抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体により４℃で３０分間処理した。さらに細胞をＰＢＳ溶液で洗浄後、ＰＥ標識した抗マウスＩｇＧ抗体により４℃で３０分間処理した。細胞を洗浄後、１％ホルマリンを含むＰＢＳ溶液１ｍＬに懸濁して固定した。細胞はフローサイトメーター装置ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤバイオサイエンス社）で測定し、平均蛍光強度によりペプチドの結合親和性を求めた。上記の８種類のペプチドの結合親和性を測定した結果を図１に示す。
文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３３２５，１９９７）でＨＬＡ−Ａ＊２４０２に結合することが報告されているＥＢウイルス由来のペプチドは強い結合能を示した。試験した８種類のペプチドの中で、ペプチド５、６、７および８はＨＬＡ−Ａ＊２４０２に良好に結合することが示された。特にペプチド７は陽性コントロール（ＥＢＶ）より高い結合性を示した。
［実施例２］
リビン由来ペプチドによるヒト末梢血単核球からのＣＴＬ誘導
実施例１でＨＬＡ−Ａ＊２４０２への強い結合能が認められたペプチド７（配列番号：８）について、文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１６１１，２００２）と同様の方法により、末梢血単核球からのＣＴＬ誘導を行った。ＨＬＡ−Ａ２４陽性の肺癌患者からインフォームドコンセントを得て末梢血を採血し、比重遠心法により単核球を分離し、ＡＩＭ−Ｖ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて培養した。２４時間後、非接着性の細胞を回収して、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含んだＡＩＭ−Ｖを用いて培養した。抗原提示用細胞調製のため、接着性の細胞は、１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４と１０００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含むＡＩＭ−Ｖ培養液で５日間培養した後、１０μＭのペプチド７を添加して１日間培養し、さらに１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦと１０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−αを加えて培養した。非接着性の細胞からＣＤ８陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ８抗体結合マグネチックビーズで分離し、上記のペプチドをパルスした抗原提示用細胞ととも培養した。
ＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離した残りの非接着性細胞は、１μｇ／ｍＬのＰＨＡと１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖ培地で３日間培養した後、ＰＨＡを除いた培地で４日間培養し、２回目、３回目のペプチド刺激用の抗原提示細胞としてストックした。ペプチド刺激をしたＣＤ８陽性Ｔ細胞に対しては、１回目のペプチド刺激から７日後と１４日後に、ストックの抗原提示細胞にペプチド７を２時間パルスし、５０００ｒａｄでＸ線照射した細胞を添加して２回目、３回目のペプチド刺激を行った。３回目の刺激から１週間後のＴ細胞の細胞傷害活性を５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した。標的細胞としてリビン陽性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性であるＬＮＹ−１細胞（肺癌由来細胞株）、ＬＮＹ−１細胞にＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を安定的に導入したＬＮＹ−１Ａ２４細胞、ＮＫ細胞に対して感受性を示すリビン陰性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性の慢性骨髄性白血病由来細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−２４３）を用いた。標的細胞は、１００μＣｉの５１Ｃｒで１時間ラベルした。５×１０３個の標的細胞に対して、１０倍のエフェクター細胞（ペプチド刺激したＴ細胞）を添加し、４時間培養して細胞傷害活性を測定した。癌患者検体２例の結果を図２および図３に示す。
ペプチド７で刺激したＴ細胞は、リビン陽性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性のＬＮＹ−１Ａ２４細胞を傷害したが、リビン陽性ではあるがＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性のＬＮＹ−１細胞やリビン陰性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性のＫ５６２は傷害しなかった。リビン由来のペプチド７により誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性にリビン発現細胞を特異的に傷害したことから、ペプチド７はＨＬＡ−Ａ２４結合性の癌抗原ペプチドであることが示された。
【産業上の利用可能性】
本発明により、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性癌抗原ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらペプチドやポリヌクレオチドを含むＣＴＬの誘導剤などが提供される。本発明のＣＴＬの誘導剤は癌ワクチンとして有用である。本発明の癌ワクチンは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の多くの癌患者に適用可能である。
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配列番号：６３に記載のアミノ酸配列の第２番目のＸａａアミノ酸残基はフェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）、チロシン残基（Ｔｙｒ）、メチオニン残基（Ｍｅｔ）またはトリプトファン残基（Ｔｒｐ）であり、第１０番目のＸａａアミノ酸残基はフェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）、ロイシン残基（Ｌｅｕ）、イソロイシン残基（Ｉｌｅ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）またはメチオニン残基（Ｍｅｔ）である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【技術分野】
本発明は、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性癌抗原ペプチドに関する。
【背景技術】
生体による癌（腫瘍）の排除には、免疫系、特にＴ細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。実際、ヒトの癌局所には癌細胞に対して傷害活性を示すリンパ球の浸潤が認められ（Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．，１２６：ｐ２００（１９９０））、メラノーマからは自己の癌細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（以下ＣＴＬ）が比較的容易に分離されている（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，８：ｐ３８５（１９８７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：ｐ９８９（１９８７）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５２：ｐ５２（１９９２））。また、該ＣＴＬの移入によるメラノーマ治療の臨床結果からも、癌排除におけるＴ細胞の重要性が示唆されている（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８６：ｐ１１５９（１９９４））。
自己の癌細胞を攻撃するＣＴＬが標的とする分子については長い間不明であったが、最近の免疫学および分子生物学の進歩により次第に明らかになってきた。すなわちＣＴＬは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、癌抗原ペプチドと呼ばれるペプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原、ＨＬＡ抗原とも呼ばれる）との複合体を認識することにより、自己の癌細胞を攻撃していることが明らかとなった。
癌抗原ペプチドは、癌に特有のタンパク質、すなわち癌抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアソームにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された癌抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を抗原特異的なＣＴＬが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を示す。このような一連の作用の解明に伴い、癌抗原タンパク質または癌抗原ペプチドをいわゆる癌ワクチンとして利用することにより、癌患者の体内の癌特異的ＣＴＬを増強させる治療法が可能となった。
癌抗原タンパク質としては、１９９１年にＴ．Ｂｏｏｎらが初めてＭＡＧＥと名付けたタンパク質をヒトメラノーマ細胞から同定した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：ｐ１６４３（１９９１））。その後、いくつかの癌抗原タンパク質が、主にメラノーマ細胞から同定されている。メラノーマ抗原としては、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼなどのメラノソームタンパク質、メラノーマだけでなく各種癌細胞と正常精巣細胞に発現するＭＡＧＥ関連タンパク質群、癌特異的なアミノ酸変異を持つβ−カテニン、ＣＤＫ４などが同定されている。また、メラノーマ以外の癌抗原タンパク質としては、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ５３（変異型）などの癌遺伝子産物、ＣＥＡ、ＰＳＡなどの癌マーカー、ＨＰＶ、ＥＢＶなどのウイルスタンパク質などが同定されている。これらについては、総説（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１８：ｐ２６７（１９９７）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：ｐ７２５（１９９６）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：ｐ６２８（１９９６））の記述に詳しい。
リビンはアポトーシス阻害タンパク（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＩＡＰ）のファミリーに属する分子として同定された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：ｐ３２３８（２００１））。リビンは２８０アミノ酸よりなり、バキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）と呼ばれるＩＡＰに特徴的な約７０アミノ酸からなるユニークな繰り返し配列を１個持っている。同時期にメラノーマに高発現するＩＡＰとして同定されたＭＬ−ＩＡＰ（ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）もリビンと同一のアミノ酸配列の分子である（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：ｐ１３５９（２０００））。
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のメラノーマ患者の転移巣から回収したＴ細胞はＭＬ−ＩＡＰ由来のペプチドを認識して細胞傷害活性を示した報告があり、リビンが癌抗原タンパク質として細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の標的になっていると考えられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：ｐ３３９８（２００３））。しかしながら当該リビンが、多数存在するＨＬＡ抗原のうちＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合性の癌抗原ペプチド部分を有しているか否かは明らかにされていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性癌抗原ペプチド、および当該ペプチドの癌ワクチンとしての使用などを提供することにある。
本発明者らは、癌免疫療法において癌ワクチンとして使用できるリビン由来の抗原ペプチドにつき鋭意検討を行った。その結果、リビンには、多数存在するＨＬＡ抗原サブクラスのうち、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識される癌抗原ペプチド部分が存在していることを初めて見出した。そしてこの知見により、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の癌患者に対してリビン特異的ＣＴＬを誘導することのできる新たな癌ワクチン療法が可能となった。
とりわけ配列番号：８に記載の癌抗原ペプチドは、陽性コントロールに比して格段に高いＨＬＡ−Ａ２４抗原結合性を示し、また良好なＣＴＬ誘導活性を有し、臨床適応可能な癌抗原ペプチドとして本発明者により見出されたものである。
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、
（１） 配列番号：１に記載のリビンのアミノ酸配列における連続する８〜１１アミノ酸からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
（２） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、前記（１）記載のペプチド、
（３） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、前記（２）記載のペプチド、
（４） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、前記（２）記載のペプチド、
（５） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、前記（４）記載のペプチド、
（６） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有する、前記（４）記載のペプチド、
（７） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる、前記（６）記載のペプチド、
（８） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
（９） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、前記（８）記載のペプチド、
（１０） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、前記（８）記載のペプチド、
（１１） 配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、前記（１０）記載のペプチド、
（１２） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、前記（１０）記載のペプチド、
（１３） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、前記（１２）記載のペプチド、
（１４） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列（配列番号：６３、ただし配列番号：８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含有する、前記（１２）記載のペプチド、
（１５） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列（配列番号：６３、ただし配列番号：８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）からなる、前記（１４）記載のペプチド、
（１６） 前記（１）〜（１５）いずれか記載のペプチドを含有するエピトープペプチド、
（１７） 前記（１）〜（１６）いずれか記載のペプチドのうちシステイン残基を含有するペプチドの単量体がジスルフィド結合により結合してなる、二量化ペプチド、
（１８） 配列番号：７〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる、前記（１７）記載の二量化ペプチド、
（１９） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するペプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる、前記（１８）記載の二量化ペプチド、
（２０） 前記（１）〜（１６）いずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２１） 前記（２０）記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
（２２） 前記（２１）記載の発現ベクターを含有する細胞、
（２３） 前記（２２）記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチドの製造方法、
（２４） 前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体、
（２５） 前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、
（２６） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、前記（２５）記載の抗原提示細胞、
（２７） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、前記（２６）記載の抗原提示細胞、
（２８） 前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ、
（２９） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、前記（２８）記載のＣＴＬ、
（３０） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、前記（２９）記載のＣＴＬ、
（３１） 前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチド、前記（２１）記載の発現ベクター、前記（２２）記載の細胞、前記（２５）〜（２７）いずれか記載の抗原提示細胞、あるいは前記（２８）〜（３０）いずれか記載のＣＴＬと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
（３２） ＣＴＬの誘導剤として使用される、前記（３１）記載の医薬組成物、
（３３） 癌ワクチンとして使用される、前記（３１）記載の医薬組成物、
（３４） 前記（２４）記載の抗体を含有する癌の診断薬、
（３５） 前記（１）〜（１９）いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー、
（３６） 配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有する、前記（３５）記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー、
（３７） 配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有する、前記（３６）記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー、
（３８） 前記（３５）〜（３７）いずれか記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを成分として含有する、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４抗原結合性癌抗原ペプチド特異的なＣＴＬの検出用試薬、ならびに
（３９） 癌ワクチンの効果の診断のために用いられる、前記（３８）記載の試薬、に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、リビン由来の８種類のペプチドおよび陽性コントロールであるＥＢウイルス由来ペプチド（ＥＢＶ）のＨＬＡ−Ａ＊２４０２への結合親和性を示したグラフである。図中、縦軸は平均蛍光強度（結合親和性）を示す（実施例１）。
図２は、リビン由来ペプチド（ペプチド７）によるヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からのＣＴＬ誘導活性を、５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した結果を示したグラフである。ＨＬＡ−Ａ２４陽性の肺癌患者より得たＰＢＭＣを用いた。図中、縦軸はＣＴＬによる細胞傷害活性を示す。また、図中の標的細胞で、ＬＮＹ−１は、リビン陽性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性、ＬＮＹ−１Ａ２４はリビン陽性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性、Ｋ５６２はリビン陰性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性である（実施例２）。
図３は、図２と同じ実験をＨＬＡ−Ａ２４陽性の別の肺癌患者のＰＢＭＣを用いて行った結果を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、配列番号：１に記載のリビンのアミノ酸配列における連続する８〜１１アミノ酸からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドを提供する。
本発明のペプチドは、前記のように配列番号：１に記載のアミノ酸配列の一部よりなるペプチドであるが、そのＮ末端アミノ酸残基及び／又はＣ末端のアミノ酸残基が修飾されていても良い。またシステイン残基を含有するペプチドに関しては、その単量体がジスルフィド結合により結合してなる二量化ペプチドの形態であっても良い。
ここで配列番号：１に記載のヒト・リビンのアミノ酸配列は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２３８，２００１、ＮＣＢＩデータベースＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＧ３３６２２に記載された公知の配列である。
本発明のペプチドは、配列番号：１に記載のヒト・リビンのアミノ酸配列における連続する８〜１１アミノ酸からなるペプチドである。ここで「８〜１１アミノ酸」との定義は、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合性を有するペプチドが、一般的に８〜１１アミノ酸からなることに基づくものである（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８−２２８（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：４３０７−４３１２（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９１３−３９２４（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９０４−３９１２（１９９４）、）。好ましくは、配列番号：１に記載のヒト・リビンのアミノ酸配列における連続する９〜１１アミノ酸からなるペプチドが挙げられ、さらに好ましくは９〜１０アミノ酸からなるペプチドが挙げられる。
前記本発明のペプチドは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における連続する８〜１１アミノ酸からなる部分ペプチド（候補ペプチド）を合成し、該ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるか否かをアッセイすることにより、同定することができる。
ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
前記において「ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識される」とは癌抗原ペプチドとしての活性を有することを意味するものであり、「ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬを誘導する（ＣＴＬ誘導活性を有する）」こと、「ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬを活性化する（ＣＴＬ活性化活性を有する）」ことと同義語である。よって本発明においては「ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識される」ことを、「癌抗原ペプチドとしての活性を有する」若しくは「ＣＴＬ誘導活性を有する」と称することもある。
候補ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されることは、例えばＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９，１６１１，２００２に記載の方法により調べることができる。
すなわちまず、ＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性のヒトから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離・培養する。培養後、非接着性の細胞を回収して培養し、ＣＴＬを含むＴ細胞集団（ＣＤ８陽性Ｔ細胞）を抗ＣＤ８抗体結合マグネチックビーズなどで分離する。また別途、抗原提示用細胞調製のために接着性の細胞を培養し、候補ペプチドを添加（パルス）してさらに培養する。
次に、前記ペプチドパルスした抗原提示細胞とＣＴＬを含むＴ細胞集団とを混合培養する。このペプチドパルスした抗原提示細胞による刺激を数回繰り返してペプチド特異的なＣＴＬを増やした後、当該ＣＴＬによる細胞傷害活性を、例えば５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：ｐ３１７，１９９４）などにより測定する。アッセイにおいて使用する標的細胞としては、５１Ｃｒでラベルしたリビン陽性かつＨＬＡ−Ａ２４陽性の細胞が、挙げられる。具体的には、例えばリビン陽性およびＨＬＡ−Ａ２４陰性であるメラノーマ由来細胞株や肺癌由来細胞株にＨＬＡ−Ａ２４の一種であるＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：４２４８−４２５２（１９９５）、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ６４７４０）を導入した５１Ｃｒラベル化細胞などが挙げられる。
以上のようなアッセイにより、ＣＴＬが標的細胞を傷害した場合は、候補ペプチドが「ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識される」という本発明の活性を有すると判断する。
さらに、ＷＯ０２／４７４７４号公報およびＩｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述されたＨＬＡ−Ａ２４モデルマウスを用いることにより、候補ペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで「ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識される」という本発明の活性を有することを確認することができる。
ＨＬＡ分子には多くのサブタイプが存在し、結合できる抗原ペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在することが知られている。ＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフとしては、８〜１１アミノ酸からなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）であり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）またはメチオニン（Ｍｅｔ）となることが知られている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８−２２８（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：４３０７−４３１２（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９１３−３９２４（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９０４−３９１２（１９９４）、）。また、これら規則性に係わるアミノ酸残基に類似するアミノ酸残基も許容され得る。
さらに近年、これらの規則性に基づき、ＨＬＡ抗原に結合可能と予想されるペプチド配列を、インターネット上、ＮＩＨのＢＩＭＡＳのソフトを使用することにより検索することができる（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）。
本発明は、リビン（配列番号：１）が、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識される抗原ペプチド部分を有していることを初めて見出したものであるが、当該リビンのアミノ酸配列のうち、前記ＢＩＭＡＳソフトを用いた検索により同定される９アミノ酸若しくは１０アミノ酸からなる推定上のＨＬＡ−Ａ２４結合配列としては、配列番号：２〜配列番号：５９に記載のリビンの部分アミノ酸配列が挙げられる。
すなわち本発明のペプチドの具体的な態様として、本発明は、配列番号：２〜５９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有し、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドを提供する。
当該ペプチドは、配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するリビンの部分ペプチドであり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識される活性を有する限り、その長さは特に限定されない。しかしながらＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合性を有するペプチドは、一般的に８〜１１アミノ酸からなることが知られている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８−２２８（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：４３０７−４３１２（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９１３−３９２４（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３９０４−３９１２（１９９４）。従って前記配列番号に係る本発明のペプチドは、９〜１１アミノ酸からなるペプチドであることが好ましく、９〜１０アミノ酸からなるペプチドであることがより好ましい。
すなわち本発明のペプチドのより好ましい形態として、本発明は、配列番号：２〜５９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸（好ましくは９〜１０アミノ酸）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドを提供する。
また、さらに好ましい形態として、本発明は、配列番号：２〜５９のいずれかに記載のアミノ酸からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドを提供する。
前記配列番号で示される本発明のペプチドのうち好ましいのは配列番号：６〜９に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドであり、特に好ましいのは配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドである。当該配列番号：８に記載の癌抗原ペプチドは、陽性コントロールに比して格段に高いＨＬＡ−Ａ２４抗原結合性を示し、また良好なＣＴＬ誘導活性を有するペプチドとして本発明者により見出されたものである。
ペプチドの長さとしては９〜１１アミノ酸が好ましく、９〜１０アミノ酸がさらに好ましい。また配列番号：６〜９に記載のアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましく、配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが特に好ましい。
前記本発明のペプチドは、活性を保持する範囲内で、適宜改変されていても良い。ここでアミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数および位置は、癌抗原ペプチドとしての活性を有する限り任意であるが、前記したように通常、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合するペプチドの長さが８〜１１アミノ酸程度であることから、１個から数個の範囲が好ましい。
当該置換に係るアミノ酸残基の改変においては、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に対する結合モチーフ構造を有するペプチドにおける第２位及び／又はＣ末端のアミノ酸残基の置換が好ましい。
このような本発明の置換に係るペプチドの具体的な態様としては、配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸（好ましくは９〜１０アミノ酸）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが挙げられる。
このうち配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが好ましい。
前記置換においては、ＨＬＡ−Ａ２４抗原の結合モチーフ構造を保持するアミノ酸残基への置換が好ましい。すなわち本発明の置換に係るペプチドの好ましい態様としては、配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸（好ましくは９〜１０アミノ酸）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが挙げられる。
このうち、配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドがより好ましい。
前記置換に係る本発明のペプチドのうち、より好ましいのは、配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸（好ましくは９〜１０アミノ酸）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドである。
このうち、配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドがより好ましい。
前記置換に係る本発明のペプチドのうち、特に好ましいのは、配列番号：８に記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列（配列番号：６３、ただし配列番号：８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含有する９〜１１アミノ酸（好ましくは９〜１０アミノ酸）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドである。
このうち、配列番号：８に記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列（配列番号：６３、ただし配列番号：８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドがより好ましい。
前記第２位及び／又はＣ末端のアミノ酸残基の改変（好ましくは置換）は、例えば前記に示したリビンの部分配列からなる本発明の天然型の癌抗原ペプチドにおいて、そのＨＬＡ−Ａ２４抗原への結合性を高める、若しくは活性を増強する目的で行うことができる。置換を施した第２位および／またはＣ末端アミノ酸以外の部分は、天然型の配列のまま（すなわちリビンのアミノ酸配列のまま）であっても良く、また活性を保持する限りさらなる改変を施しても良い。当該改変とは、具体的には、システイン残基の他のアミノ酸残基（例えばセリン、アラニン、α−アミノ酪酸）への置換が挙げられる。より具体的には、例えば配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチドにおいて、その第６位のシステインが他のアミノ酸残基（例えばセリン、アラニン、α−アミノ酪酸）に置換されたペプチドが例示される。また、例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチド（例えば配列番号：６３に記載のアミノ酸配列よりなるペプチド）において、その第６位のシステインが他のアミノ酸残基（例えばセリン、アラニン、α−アミノ酪酸）に置換されたペプチドが例示される。また、例えば配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチドにおいて、その第７位のシステインが他のアミノ酸残基（例えばセリン、アラニン、α−アミノ酪酸）に置換されたペプチドが例示される。
本発明はまた、前記本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチド）とヘルパーペプチド若しくは他の癌抗原ペプチドとを含有するペプチド（いわゆる「エピトープペプチド」）を提供する。
近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したペプチド（エピトープペプチド）が、効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９８，１６１：３１８６−３１９４には、癌抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２，−Ａ３，−Ａ１１，Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープを連結した約３０ｍｅｒのペプチドが、イン・ビボでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。
またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたペプチド（エピトープペプチド）により、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。ここでヘルパーエピトープとはＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる作用を有するペプチドを指すものであり（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．，１：７５１，１９９４）、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが知られている。当該ヘルパーエピトープにより活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＴＬの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどのエフェクター活性化などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要であると考えられている。このようなヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープとを連列したペプチドの具体例として、例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９９，１６２：３９１５−３９２５には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープより構成されるペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。また実際に、ＣＴＬエピトープ（メラノーマ抗原ｇｐ１００の第２８０位〜２８８位からなる癌抗原ペプチド）とヘルパーエピトープ（破傷風毒素由来Ｔヘルパーエピトープ）とを連結したペプチドが臨床試験に供されている（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）。
従って、前記本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチド）を含む複数のエピトープを連結させたＣＴＬ誘導活性を有するエピトープペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
ここで、本発明の癌抗原ペプチドに連結させるエピトープがＣＴＬエピトープ（癌抗原ペプチド）の場合、用いるＣＴＬエピトープとしては、リビン由来のＨＬＡ−Ａ０２０１，−Ａ０２０４，−Ａ０２０５，−Ａ０２０６，−Ａ０２０７に拘束性のＣＴＬエピトープが挙げられる。これらＣＴＬエピトープは複数個連結することが可能であり、１つのＣＴＬエピトープの長さとしては、各種ＨＬＡ分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８，１９９５）、８〜１４アミノ酸程度を挙げることができる。
また本発明の癌抗原ペプチドに連結させるエピトープがヘルパーエピトープの場合、用いるヘルパーエピトープとしては、前述のようなＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープの長さとしては、１３〜３０アミノ酸程度、好ましくは１３〜１７アミノ酸程度を挙げることができる。
本発明のエピトープペプチドとして、具体的には、例えば配列番号：２〜５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドの１種または２種以上とヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドを挙げることができる。
より具体的には、例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドと破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばＰｈｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ；配列番号：６１）とを連結させたエピトープペプチドや、配列番号：８に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドとＡｌａ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ（配列番号：６２、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）とを連結させたエピトープペプチドなどが挙げられる。
このような複数のエピトープを連結させたペプチド（エピトープペプチド）は、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のＤＮＡ合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８３）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ（１９８５））や後述の方法などに準じて行うことができる。
以上のようにして製造された複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを前述の５１ＣｒリリースアッセイやＷＯ ０２／４７４７４号公報およびＩｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述のヒトモデル動物に供すること等により、ＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
以上に示した本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチドおよびエピトープペプチド）のＮ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基は、修飾されていても良い。すなわち、当該Ｎ末端のアミノ酸残基及び／又はＣ末端のアミノ酸残基が修飾されたペプチドも、本発明のペプチドの範疇に含まれる。
ここでＮ末端アミノ酸のアミノ基の修飾基としては、例えば１〜３個の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、シクロアルキル基、アシル基が挙げられ、アシル基の具体例としては炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基、炭素数２から６のアルコキシカルボニル基、フェニル基で置換されたアルコキシカルボニル基、炭素数５から７のシクロアルコキシで置換されたカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体およびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル、炭素数５から７のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数１から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
また、以上に示した本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチドおよびエピトープペプチド）のうちシステイン残基を含有するペプチドに関しては、そのペプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる二量化ペプチドの形態であっても良い。当該二量化は、ペプチド単量体を合成後、酸化状態に置くことにより作製することができる。
具体的には、例えば配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチドの二量化ペプチドが例示される。また、例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチド（例えば配列番号：６３に記載のアミノ酸配列よりなるペプチド）の二量化ペプチドが例示される。また、例えば配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第２位及び／又はＣ末端アミノ酸の置換型ペプチドの二量化ペプチドが例示される。
本発明はまた、前記本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチドまたはエピトープペプチド）をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるＤＮＡの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のＤＮＡ合成やＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。
具体的には、例えば配列番号：２〜５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドの１種または２種以上とヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
好ましくは、例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドと破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばＰｈｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ；配列番号：６１）とを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。また配列番号：８に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドとＡｌａ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ（配列番号：６２、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）とを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
前記で作製された本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な（ペプチドの発現可能な）条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のポリペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明のペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良い。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドに特異的に結合する抗体を挙げることができる。好ましくは、配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列よりなるペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられ、より好ましくは、配列番号：８に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．１２〜１１．１３、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｌａｎｅ，Ｈ，Ｄ．ら編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ出版Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９）。
具体的には、本発明のペプチドを免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明のペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４〜１１．１１）。
本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、リビン遺伝子が発現している癌、すなわち肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の診断において有効である。
本発明は、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞を提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激によりＣＴＬ誘導活性が認められたが、これは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されたことを示すものである。このような、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞は、後述する細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
本発明の抗原提示細胞は、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞であれば良く、具体的には、例えば配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。好ましくは、配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞が挙げられ、より好ましくは、配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。
細胞療法（ＤＣ療法）において用いられる抗原提示細胞は、癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明のペプチドを体外でパルスするか、または本発明のポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターを細胞内に導入して、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示可能なＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、本発明のペプチドであっても良いし、また本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターであっても良い。
本発明の抗原提示細胞は、例えば癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチド（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）を体外でパルスし、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を作製することにより得られる（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４６：８２，１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：ｐ１７９６，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９：ｐ１１８４，１９９９）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、癌患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド）あるいはそれを含有する発現ベクターを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合はＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６：ｐ５６７２，１９９６やＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：ｐ５６０７，１９９８などを参考にして行うことができる。また、ＤＮＡのみならずＲＮＡの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができ、この場合は、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：ｐ４６５，１９９６などを参考できる。
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬを提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激によりＣＴＬ誘導活性が認められた。これは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されたことを示すものである。このような、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬは、後述する養子免疫療法において有効に用いられる。
本発明のＣＴＬは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するものであれば良いが、具体的には、例えば配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するＣＴＬを挙げることができる。好ましくは、配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するＣＴＬが挙げられ、より好ましくは、配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するＣＴＬを挙げることができる。
養子免疫療法において用いられるＣＴＬは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを本発明のペプチド（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）、あるいは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド）やそれを含有する発現ベクターでイン・ビトロで刺激する等により作製される（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９９，１９０：１６６９）。
以上に記載した本発明のペプチド、本発明の発現ベクター、本発明の細胞、本発明の抗原提示細胞、および本発明のＣＴＬは、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、ＣＴＬの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効成分とすることができる。以下、具体的に説明する。
（１）本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチン
本発明のペプチドは、ＣＴＬの誘導能を有するものであり、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従って本発明のペプチドは、癌の治療または予防のための癌ワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明の癌ワクチンをＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリビン陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ−Ａ２４抗原にペプチド（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）が提示され、提示されたＨＬＡ−Ａ２４抗原複合体を特異的に認識するＣＴＬが増殖して癌細胞を破壊することができ、従って、癌の治療または予防が可能となる。本発明の癌ワクチンは、リビン遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
よって、本発明は別の態様として、本発明の癌ワクチンの有効量をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリビン陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、単一のＣＴＬエピトープ（例えば配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（ＣＴＬエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したエピトープペプチドを有効成分とするものであっても良い。すなわち近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドが、イン・ビボで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９８，１６１：３１８６−３１９４には、癌抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２，−Ａ３，−Ａ１１，Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約３０ｍｅｒのエピトープペプチドが、イン・ビボでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドにより、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。このようなエピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。このようにして癌の治療または予防が達成される。
また本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７：２７７−２８９，１９９４）に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、海洋生物由来成分、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルジョン製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
（２）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチン
前記本発明のペプチドのみならず、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターもまた、癌の治療または予防のためのＤＮＡワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。また、本発明は別の態様として、本発明のＤＮＡワクチンの有効量をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリビン陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｖｏで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９９，１６２：３９１５−３９２５には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。
従って、本発明のエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込むことにより、癌ワクチンの有効成分とすることができる。
本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを癌ワクチン（ＤＮＡワクチン）の有効成分として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
本発明のポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレオチドを直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外でＤＮＡを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等）。ｉｎ ｖｉｖｏ法がより好ましい。
ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
以上のような本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターの癌患者への投与により、抗原提示細胞内で当該ポリヌクレオチドに対応するポリペプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の癌抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体を特異的に認識するＣＴＬが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。以上のようにして、癌の治療または予防が達成される。本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分とする癌ワクチンは、リビン遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
（３）本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンを提供する。
近年、癌患者の末梢血からリンパ球を分離し、その中から樹状細胞を誘導し、イン・ビトロでペプチド等をパルスして調製した抗原提示細胞を皮下投与などにより患者に戻す細胞療法（ＤＣ療法）が報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４６：８２，１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：ｐ１７９６，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９：ｐ１１８４，１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６：ｐ５６７２，１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：ｐ５６０７，１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：ｐ４６５，１９９６）。従って前記本発明の抗原提示細胞を、細胞療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリビン陽性の患者の体内で効率良く特異的なＣＴＬが誘導され、癌を治療または予防することができる。本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、リビン遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
（４）本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明のＣＴＬは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
メラノーマにおいて、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養し、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８６：１１５９，１９９４）。またマウスのメラノーマでは、脾細胞をイン・ビトロで癌抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、癌抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５：４５３，１９９７）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のペプチドあるいは本発明のポリヌクレオチドや発現ベクターを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して癌特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。従って前記本発明のＣＴＬを、養子免疫療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンは、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリビン陽性の患者の体内でＣＴＬによる癌細胞の傷害作用が促進され、癌細胞を破壊することにより、癌を治療することができる。本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンは、リビン遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
本発明は、本発明の抗体を含有する癌の診断薬を提供する。
本発明の抗体を含有する癌の診断薬を用いることにより、癌の免疫学的診断を行うことができる。当該免疫学的診断を行うには、まず本発明の抗体を必要に応じて適宜標識し、これを用いて癌が疑われる患者から得た試料（例えば血液、癌組織など）中の抗原（リビン）若しくは抗原ペプチド（リビン由来抗原ペプチド）の存在を検出することにより、癌の有無を診断することができる。具体的にはイムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等により行うことができる。
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを提供する。
癌免疫療法において、治療前に癌抗原（癌抗原ペプチド）に対するＣＴＬ前駆細胞の頻度や量を予め調べることや、癌抗原（癌抗原ペプチド）による治療実施中の患者におけるＣＴＬの頻度や量を調べることは、当該癌抗原（癌抗原ペプチド）に対する応答性が高い患者の選択や、治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定などにおいて重要な指標となる。癌抗原ペプチドとＨＬＡ抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーおよびＨＬＡペンタマーは、抗原（抗原ペプチド）特異的ＣＴＬの検出、すなわち当該ＣＴＬの頻度や量を測定するための試薬として有用である。
ここでＨＬＡテトラマーとは、ＨＬＡ抗原のα鎖とβ２ミクログロブリンをペプチド（抗原ペプチド）と会合させた複合体（ＨＬＡモノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを指す（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３−２１０６（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４−９６（１９９６））。
ＨＬＡモノマーとは前記ＨＬＡテトラマーの製造において用いられる、ＨＬＡ抗原α鎖、β２ミクログロブリン、抗原ペプチドの会合体をビオチン化したもの（単量体）を指す。
ＨＬＡダイマーとはＨＬＡ抗原α鎖とＩｇ（イムノグロブリン、例えばＩｇＧ１）とを融合させ、これにβ２ミクログロブリン、抗原ペプチドを結合させたものを指す（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６６７１−６６７５（１９９３））。ＨＬＡダイマーに結合した抗原ペプチド特異的ＣＴＬは、例えば標識抗ＩｇＧ１抗体をＩｇＧ１に結合させることなどにより、検出することができる。
ＨＬＡペンタマーとは近年開発された技術であり、ＨＬＡ抗原と抗原ペプチドとの複合体５分子がＣｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌドメインを介して重合した５量体を指す。ＨＬＡ抗原−抗原ペプチドの複合体を蛍光色素等で標識することができるため、ＨＬＡテトラマー法と同様にフローサイトメーター等で解析することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ．ｃｏ．ｕｋ／参照）。
以上に述べたＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーはいずれも受託合成可能であり、例えばＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社やＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社などに委託することにより合成することができる。また現在では種々の抗原ペプチドを含有するＨＬＡテトラマーなども市販されている（（株）医学生物学研究所等）。
本発明のＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーとして具体的には、例えば配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合してＣＴＬにより認識されるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーが挙げられる。このうちＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを用いることが好ましく、ＨＬＡテトラマーを用いることがより好ましい。中でも配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーが好ましく、特に配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーが好ましい。このうちＨＬＡテトラマーがより好ましい。
当該ＨＬＡモノマー、ＨＬＡテトラマーおよびＨＬＡペンタマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の公知の検出手段により結合したＣＴＬを容易に選別または検出することが出来るように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）などにより標識されたＨＬＡモノマー、ＨＬＡテトラマーおよびＨＬＡペンタマーが挙げられる。
本発明のＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーの成分であるＨＬＡ−Ａ２４抗原（ＨＬＡ−Ａ２４抗原のα鎖）は、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：４２４８−４２５２（１９９５）およびＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ６４７４０に開示されているＨＬＡ−Ａ２４０２の公知の塩基配列の情報に基づき、ＰＣＲ法等の常法により容易にクローニングすることができる。
本発明のＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーの成分であるβ２ミクログロブリンは、ヒト由来のβ２ミクログロブリンが好ましい。当該ヒトβ２ミクログロブリンはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＢ０２１２８８に開示されているヒトβ２ミクログロブリンの公知の塩基配列情報に基づき、ＰＣＲ法等の常法により容易にクローニングすることができる。
ＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマー作製法については、前記各文献により周知であるが、具体的にＨＬＡテトラマーの作製法につき簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４α鎖発現ベクターおよびβ２ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例えばＢＬ２１）を用いることが好ましい。得られた単量体ＨＬＡ−Ａ２４複合体と本発明ペプチドとを混合し、可溶性のＨＬＡ−ペプチド複合体を形成させる。次にＨＬＡ−ペプチド複合体におけるＨＬＡ−Ａ２４α鎖のＣ末端部位の配列をＢｉｒＡ酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたＨＬＡ−ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを４：１のモル比で混合することにより、ＨＬＡテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
前記本発明のＨＬＡモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーは、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性癌抗原ペプチド特異的なＣＴＬの検出用試薬として有効に用いられる。
本発明のＣＴＬ検出用試薬は、例えば以下の目的に使用することができる：
１）本発明の癌抗原ペプチドによる治療開始前に、本発明の癌抗原ペプチドに対するＣＴＬ前駆細胞の頻度や量を調べる。これにより、当該癌抗原ペプチドに対する患者の応答性を判断することができる。
２）本発明の癌抗原ペプチド（癌ワクチン）による治療実施中の患者におけるＣＴＬの頻度や量を調べる。これにより治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定、治療が順調に進んでいることの確認などを行うことができる。
ＣＴＬの検出法としては、具体的には、被験患者よりＣＴＬを含む生体試料（例えばＰＢＭＣ）を単離し、本発明のＨＬＡテトラマー等と前記生体試料とを接触させ、ＨＬＡテトラマー等に結合した本発明ペプチド特異的なＣＴＬの存在頻度または量を、フローサイトメーター等で測定する。
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
［実施例１］
ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊２４０２への結合親和性の検討
リビンのアミノ酸配列（ＮＣＢＩのデータベースＥｎｔｒｅｚのＡＡＧ３３６２２）よりＨＬＡ−Ａ＊２４０２（ＨＬＡ−Ａ２４の１種）に結合する可能性のあるペプチドを８種類合成した。それぞれペプチドの配列は、リビンの第４７位から５５位に相当するペプチド１（Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｉｌｅ；配列番号：２）、第４７位から５６位に相当するペプチド２（Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ；配列番号：３）、第８０位から８９位に相当するペプチド３（Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ；配列番号：４）、第８３位から第９１位に相当するペプチド４（Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ；配列番号：５）、第１４０位から第１４８位に相当するペプチド５（Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｐｈｅ；配列番号：６）、第１４６位から１５４位に相当するペプチド６（Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ；配列番号：７）、第１４６位から１５５位に相当するペプチド７（Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ；配列番号：８）および第１４５位から１５４位に相当するペプチド８（Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ：配列番号：９）である。リビン由来の前述のペプチドおよびＥＢウイルス由来のペプチド（Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ；配列番号：６０）はアミノ酸合成機を用いてＦ−ｍｏｃ法で合成した。
これらのペプチドのＨＬＡ−Ａ＊２４０２への結合親和性の測定は、文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２５６５，２０００）に記載の方法と同様に実施した。ＭＨＣクラスＩ分子を発現していないマウスリンパ腫由来の細胞株ＲＭＡ−ＳにＨＬＡ−Ａ＊２４０２とＨ−２ＫｂのキメラＭＨＣの遺伝子を安定的に導入した細胞株ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２細胞（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４，２５６５−２５７４（２０００））を２６℃で１８時間培養した。ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２細胞をＰＢＳ溶液で洗浄後、３μＬ／ｍＬのヒトβ２−ミクログロブリンと１００μＬ／ｍＬの各種ペプチドを含有する培養液ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁して２６℃で３時間、３７℃で３時間培養した。この細胞をＰＢＳ溶液で洗浄後、抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体により４℃で３０分間処理した。さらに細胞をＰＢＳ溶液で洗浄後、ＰＥ標識した抗マウスＩｇＧ抗体により４℃で３０分間処理した。細胞を洗浄後、１％ホルマリンを含むＰＢＳ溶液１ｍＬに懸濁して固定した。細胞はフローサイトメーター装置ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤバイオサイエンス社）で測定し、平均蛍光強度によりペプチドの結合親和性を求めた。上記の８種類のペプチドの結合親和性を測定した結果を図１に示す。
文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３３２５，１９９７）でＨＬＡ−Ａ＊２４０２に結合することが報告されているＥＢウイルス由来のペプチドは強い結合能を示した。試験した８種類のペプチドの中で、ペプチド５、６、７および８はＨＬＡ−Ａ＊２４０２に良好に結合することが示された。特にペプチド７は陽性コントロール（ＥＢＶ）より高い結合性を示した。
［実施例２］
リビン由来ペプチドによるヒト末梢血単核球からのＣＴＬ誘導
実施例１でＨＬＡ−Ａ＊２４０２への強い結合能が認められたペプチド７（配列番号：８）について、文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１６１１，２００２）と同様の方法により、末梢血単核球からのＣＴＬ誘導を行った。ＨＬＡ−Ａ２４陽性の肺癌患者からインフォームドコンセントを得て末梢血を採血し、比重遠心法により単核球を分離し、ＡＩＭ−Ｖ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて培養した。２４時間後、非接着性の細胞を回収して、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含んだＡＩＭ−Ｖを用いて培養した。抗原提示用細胞調製のため、接着性の細胞は、１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４と１０００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含むＡＩＭ−Ｖ培養液で５日間培養した後、１０μＭのペプチド７を添加して１日間培養し、さらに１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦと１０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−αを加えて培養した。非接着性の細胞からＣＤ８陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ８抗体結合マグネチックビーズで分離し、上記のペプチドをパルスした抗原提示用細胞ととも培養した。
ＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離した残りの非接着性細胞は、１μｇ／ｍＬのＰＨＡと１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖ培地で３日間培養した後、ＰＨＡを除いた培地で４日間培養し、２回目、３回目のペプチド刺激用の抗原提示細胞としてストックした。ペプチド刺激をしたＣＤ８陽性Ｔ細胞に対しては、１回目のペプチド刺激から７日後と１４日後に、ストックの抗原提示細胞にペプチド７を２時間パルスし、５０００ｒａｄでＸ線照射した細胞を添加して２回目、３回目のペプチド刺激を行った。３回目の刺激から１週間後のＴ細胞の細胞傷害活性を５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した。標的細胞としてリビン陽性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性であるＬＮＹ−１細胞（肺癌由来細胞株）、ＬＮＹ−１細胞にＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を安定的に導入したＬＮＹ−１Ａ２４細胞、ＮＫ細胞に対して感受性を示すリビン陰性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性の慢性骨髄性白血病由来細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−２４３）を用いた。標的細胞は、１００μＣｉの５１Ｃｒで１時間ラベルした。５×１０３個の標的細胞に対して、１０倍のエフェクター細胞（ペプチド刺激したＴ細胞）を添加し、４時間培養して細胞傷害活性を測定した。癌患者検体２例の結果を図２および図３に示す。
ペプチド７で刺激したＴ細胞は、リビン陽性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性のＬＮＹ−１Ａ２４細胞を傷害したが、リビン陽性ではあるがＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性のＬＮＹ−１細胞やリビン陰性およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性のＫ５６２は傷害しなかった。リビン由来のペプチド７により誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性にリビン発現細胞を特異的に傷害したことから、ペプチド７はＨＬＡ−Ａ２４結合性の癌抗原ペプチドであることが示された。
【産業上の利用可能性】
本発明により、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性癌抗原ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらペプチドやポリヌクレオチドを含むＣＴＬの誘導剤などが提供される。本発明のＣＴＬの誘導剤は癌ワクチンとして有用である。本発明の癌ワクチンは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の多くの癌患者に適用可能である。
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配列番号：６３に記載のアミノ酸配列の第２番目のＸａａアミノ酸残基はフェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）、チロシン残基（Ｔｙｒ）、メチオニン残基（Ｍｅｔ）またはトリプトファン残基（Ｔｒｐ）であり、第１０番目のＸａａアミノ酸残基はフェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）、ロイシン残基（Ｌｅｕ）、イソロイシン残基（Ｉｌｅ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）またはメチオニン残基（Ｍｅｔ）である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に記載のリビンのアミノ酸配列における連続する８〜１１アミノ酸からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識されるペプチド。
【請求項２】
配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド。
【請求項５】
配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか記載のペプチドを含有するエピトープペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか記載のペプチドのうちシステイン残基を含有するペプチドの単量体がジスルフィド結合により結合してなる、二量化ペプチド。
【請求項９】
配列番号：７〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる、請求項８記載の二量化ペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜７いずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現ベクターを含有する細胞。
【請求項１３】
請求項１２記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、請求項１〜９いずれか記載のペプチドの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜９いずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１５】
請求項１〜９いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞。
【請求項１６】
配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、請求項１５記載の抗原提示細胞。
【請求項１７】
請求項１〜９いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ。
【請求項１８】
配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、請求項１７記載のＣＴＬ。
【請求項１９】
請求項１〜９いずれか記載のペプチド、請求項１１記載の発現ベクター、請求項１２記載の細胞、請求項１５または１６記載の抗原提示細胞、あるいは請求項１７または１８記載のＣＴＬと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項２０】
ＣＴＬの誘導剤として使用される、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
癌ワクチンとして使用される、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１４記載の抗体を含有する癌の診断薬。
【請求項２３】
請求項１〜９いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー。
【請求項２４】
配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有する、請求項２３記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー。
【請求項２５】
請求項２３または２４記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを成分として含有する、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４抗原結合性癌抗原ペプチド特異的なＣＴＬの検出用試薬。
【請求項２６】
癌ワクチンの効果の診断のために用いられる、請求項２５記載の試薬。
【請求項１】
配列番号：１に記載のリビンのアミノ酸配列における連続する８〜１１アミノ酸からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識されるペプチド。
【請求項２】
配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する９〜１１アミノ酸からなるペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド。
【請求項５】
配列番号：２〜配列番号：５９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が、
第２位：チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
Ｃ末端：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか記載のペプチドを含有するエピトープペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか記載のペプチドのうちシステイン残基を含有するペプチドの単量体がジスルフィド結合により結合してなる、二量化ペプチド。
【請求項９】
配列番号：７〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる、請求項８記載の二量化ペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜７いずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現ベクターを含有する細胞。
【請求項１３】
請求項１２記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、請求項１〜９いずれか記載のペプチドの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜９いずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１５】
請求項１〜９いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞。
【請求項１６】
配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、請求項１５記載の抗原提示細胞。
【請求項１７】
請求項１〜９いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ。
【請求項１８】
配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、請求項１７記載のＣＴＬ。
【請求項１９】
請求項１〜９いずれか記載のペプチド、請求項１１記載の発現ベクター、請求項１２記載の細胞、請求項１５または１６記載の抗原提示細胞、あるいは請求項１７または１８記載のＣＴＬと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項２０】
ＣＴＬの誘導剤として使用される、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
癌ワクチンとして使用される、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１４記載の抗体を含有する癌の診断薬。
【請求項２３】
請求項１〜９いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー。
【請求項２４】
配列番号：６〜配列番号：９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有する、請求項２３記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー。
【請求項２５】
請求項２３または２４記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを成分として含有する、リビン由来のＨＬＡ−Ａ２４抗原結合性癌抗原ペプチド特異的なＣＴＬの検出用試薬。
【請求項２６】
癌ワクチンの効果の診断のために用いられる、請求項２５記載の試薬。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００５６３１
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【発行日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１１５７４（Ｐ２００５−５１１５７４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１０００８
【国際出願日】平成１６年７月７日（２００４．７．７）
【出願人】（５０２３５１２２４）
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【発行日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１０００８
【国際出願日】平成１６年７月７日（２００４．７．７）
【出願人】（５０２３５１２２４）
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
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