ある種の天然ｍＲＮＡは代謝産物感受性遺伝子スイッチとして役立つ、ということが発見されたが、この場合、ＲＮＡは小有機分子と直接結合する。この結合過程はｍＲＮＡの立体配座を変え、これが種々の異なるメカニズムにより遺伝子発現の変化を引き起こす。これらの天然「リボスイッチ」の修飾バージョン（種々の核酸工学処理戦略を用いて作製される）は、特定のエフェクター化合物により制御されるデザイナー遺伝子スイッチとして用いられ得る。リボスイッチを活性化するこのようなエフェクター化合物は、本明細書中ではトリガー分子と呼ばれる。天然スイッチは、抗生物質およびその他の小分子療法のための標的である。さらにリボスイッチの構成は、天然スイッチの実際の小片を新規の非免疫原性遺伝子制御素子を構築するために用いさせ、例えばアプタマー（分子認識）ドメインは、新規の認識ドメインがユーザー定義エフェクター化合物による遺伝子変調を引き起こすよう、他の非天然アプタマーと交換され得る（またはそうでなければ修飾される）。変更スイッチは、治療レジメンの一部となる（タンパク質合成を開始させるかまたは停止し、あるいは調節する）。新規構築遺伝子調節ネットワークは、生体バイオセンサー、生物体の代謝工学処理のような領域に、ならびに改良型の遺伝子療法治療に適用され得る。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
コード領域と操作可能的に連結されるリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む調節可能遺伝子発現構築物であって、当該リボスイッチがＲＮＡの発現を調節し、かつ、当該リボスイッチとコード領域が非相同である構築物。
【請求項２】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項１記載の構築物。
【請求項３】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、アプタマードメインがＰ１ステムを含み、Ｐ１ステムがアプタマー鎖および制御鎖を含み、発現プラットフォームドメインが調節鎖を含み、調節鎖、制御鎖またはその両方がステム構造を形成するよう設計されている、請求項１記載の構築物。
【請求項４】
天然リボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチ。
【請求項５】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項４記載のリボスイッチ。
【請求項６】
前記リボスイッチが天然グアニン応答リボスイッチ、アデニン応答リボスイッチ、リジン応答リボスイッチ、チアミンピロホスフェート応答リボスイッチ、アデノシルコバラミン応答リボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド応答リボスイッチまたはＳ−アデノシルメチオニン応答リボスイッチから得られる、請求項４記載のリボスイッチ。
【請求項７】
トリガー分子により活性化され、トリガー分子により活性化されるとシグナルを生じる、請求項４記載のリボスイッチ。
【請求項８】
試料およびリボスイッチを接触させることを包含する当該化合物の検出方法であって、当該化合物により活性化されるとリボスイッチがシグナルを生じ、試料が当該化合物を含有する場合にリボスイッチがシグナルを生じる前記方法。
【請求項９】
前記化合物により活性化されるとリボスイッチが立体配座を変え、立体配座の変化が立体配座依存性標識によりシグナルを生じる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物により活性化されるとリボスイッチが立体配座を変え、立体配座の変化がリボスイッチに連結されたＲＮＡの発現の変化を引き起こし、発現の変化がシグナルを生じる、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記リボスイッチに連結されたＲＮＡから発現されるレポータータンパク質によりシグナルが生成される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子発現の抑制方法であって、化合物および細胞を接触させる方法であり、この場合、当該化合物が以下の構造：
【化１】

｛式中、化合物がグアニン応答リボスイッチに結合される場合、Ｒ₇は水素結合受容体として役立ち、Ｒ₁₀は水素結合供与体として役立ち、Ｒ₁₁は水素結合受容体として役立ち、Ｒ₁₂は水素結合供与体として役立ち、
Ｒ₁₃はＨ、Ｈ₂であるかまたは存在せず、
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₈およびＲ₉は、各々独立して、Ｃ、Ｎ、ＯまたはＳであり、
【化２】

は、各々独立して、一重または二重結合を表す。｝
を有し、
当該化合物はグアニン、ヒポキサンチンまたはキサンチンではなく、
当該細胞がグアニン応答リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、当該化合物がグアニン応答リボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。
【請求項１３】
遺伝子発現の抑制方法であって、化合物および細胞を接触させる方法であり、この場合、当該化合物が以下の構造：
【化３】

｛式中、化合物がアデニン応答リボスイッチに結合される場合、Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₇は水素結合受容体として役立ち、そしてＲ₁₀およびＲ₁₁は水素結合供与体として役立ち、
Ｒ₁₃はＨ、Ｈ₂であるかまたは存在せず、
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₈およびＲ₉は、各々独立して、Ｃ、Ｎ、ＯまたはＳであり、
【化４】

は、各々独立して、一重または二重結合を表す。｝
を有し、
当該化合物はアデニン、２，６−ジアミノプリンまたは２−アミノプリンではなく、
当該細胞がアデニン応答リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、当該化合物がアデニン応答リボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。
【請求項１４】
遺伝子発現の抑制方法であって、化合物および細胞を接触させる方法であり、この場合、当該化合物が以下の構造：
【化５】

｛式中、Ｒ₂およびＲ₃は各々正に荷電され、
Ｒ₁は負に荷電され、
Ｒ₄はＣ、Ｎ、ＯまたはＳであり、
【化６】

は、各々独立して、一重または二重結合を表す。｝
を有し、
当該化合物がリジンではなく、
当該細胞がリジン応答リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、当該化合物がリジン応答リボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。
【請求項１５】
Ｒ₂およびＲ₃が各々ＮＨ₃⁺であり、そしてＲ₁がＯ^-である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子発現の抑制方法であって、化合物および細胞を接触させる方法であり、この場合、当該化合物が以下の構造：
【化７】

｛式中、Ｒ₁は正に荷電され、
Ｒ₂およびＲ₃は、各々独立して、Ｃ、ＯまたはＳであり、
Ｒ₄はＣＨ₃、ＮＨ₂、ＯＨ、ＳＨ、Ｈであるかまたは存在せず、
Ｒ₅はＣＨ₃、ＮＨ₂、ＯＨ、ＳＨまたはＨであり、
Ｒ₆はＣまたはＮであり、
【化８】

は、各々独立して、一重または二重結合を表す。｝
を有し、
当該化合物がＴＰＰ、ＴＰまたはチアミンではなく、
当該細胞がチアミンピロリン酸応答リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、当該化合物がチアミンピロリン酸応答リボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。
【請求項１７】
Ｒ₁がホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
以下のステップ：
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現を抑制するための化合物を試験し、この場合、抑制はリボスイッチにより、
（ｂ）細胞と、過程（ａ）における遺伝子発現を抑制した化合物とを接触させることにより遺伝子発現を抑制する
を含む方法であって、上記細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、上記化合物がリボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。
【請求項１９】
リボスイッチの同定方法であって、以下のステップ：
化合物の存在および不存在下でＲＮＡ分子の直列自発的切断を査定する
を含み、
上記ＲＮＡ分子が当該化合物により調節された遺伝子によりコードされ、
上記ＲＮＡ分子の直列自発的切断のパターンの変化がリボスイッチを示す前記方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１−１】




【図４１−５】



















【図４１−２４】



【図４１−２７】


【図４１−２９】



















【図４１−４８】

【公表番号】特表２００６−５０００３０（Ｐ２００６−５０００３０Ａ）
【公表日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３８２８１（Ｐ２００４−５３８２８１）
【出願日】平成１５年９月２２日（２００３．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２９５８９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２７０３５
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（３９２０１９３５２）イェール　ユニバーシティ (38)
【氏名又は名称原語表記】ＹＡＬＥ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】