説明

リボスイッチ、リボスイッチによる、構造を基礎とする化合物設計、ならびにリボスイッチの使用方法およびリボスイッチを伴う組成物

リボスイッチおよびリボスイッチの改変型を、特異的エフェクター化合物により制御されるデザイナー遺伝スイッチとして使用できる。リボスイッチを活性化するこのようなエフェクター化合物を、本明細書においてトリガー分子と称する。天然スイッチは、抗生物質およびその他の小分子療法の標的である。さらに、リボスイッチの構造は、天然スイッチの実際の断片が、新たな非免疫原性遺伝的制御エレメントの構築に使用される事を可能にする。例えば、新たな認識ドメインが、ユーザーの規定したエフェクター化合物によって遺伝調節を惹起するよう、アプタマー(分子認識)ドメインを他の非天然アプタマーに交換(またはそれ以外の態様で修飾)することができる。変化したスイッチは治療計画の一部となり、蛋白合成を始動、停止または調節する。新たに構築された遺伝調節ネットワークは、生体バイオセンサー、生物の代謝改変のような領域に、そして遺伝子治療処置の先進形態に応用できる。化合物は、リボスイッチを刺激、活性化、阻害、および/または不活性化するのに利用できる。リボスイッチの原子構造は、リボスイッチを刺激、活性化、阻害、および/または不活性化する新たな化合物の設計に利用できる。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
図6に示した原子構造を含む天然グアニン応答性リボスイッチの原子構造。
【請求項2】
原子構造の原子座標が、図6に記載の原子について表6に列挙した原子座標を含む、請求項1に記載の原子構造。
【請求項3】
原子構造の原子座標が表6に列挙した原子座標を含む、請求項1に記載の原子構造。
【請求項4】
(a) 被検化合物を伴う請求項1の原子構造をモデル作製し;そして
(b) その被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかを決定する、
事を含む、リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法。
【請求項5】
被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかの決定が、リボスイッチのモデル中の被検化合物について予測された最小相互作用エネルギー、予測された結合定数、予測された解離定数、または組み合わせを決定することを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項6】
被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかの決定が、被検化合物とリボスイッチとの、1もしくはそれ以上の予測された結合、1もしくはそれ以上の予測された相互作用、または組み合わせを決定することを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項7】
リボスイッチがグアニンリボスイッチである、請求項4に記載の方法。
【請求項8】
グアニンリボスイッチが表5のリボスイッチである、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
原子の接触を工程(b)で決定し、それにより、被検化合物とリボスイッチの相互作用を決定する、請求項4に記載の方法。
【請求項10】
(c) 被検化合物の類似体を特定し;
(d) 被検化合物の類似体がリボスイッチと相互作用するかどうかを決定する、
という工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
化合物がヒポキサンチンである、請求項10に記載の方法。
【請求項12】
細菌を、請求項10に記載の方法により特定した類似体と接触させることを含む、細菌を殺滅する方法。
【請求項13】
細菌を、請求項4に記載の方法により特定した類似体と接触させることを含む、細菌を殺滅する方法。
【請求項14】
被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかを決定するためにゲル型検定を利用する、請求項4に記載の方法。
【請求項15】
被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかを決定するためにチップ型検定を利用する、請求項4に記載の方法。
【請求項16】
被検化合物が、ファン・デル・ワールス相互作用、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用、または組み合わせによって相互作用する、請求項4に記載の方法。
【請求項17】
リボスイッチがRNA開裂性リボザイムを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項18】
消光部分を含む核酸が開裂する時に蛍光シグナルが生成する、請求項4に記載の方法。
【請求項19】
蛍光シグナルの生成に分子ビーコン技術を利用する、請求項4に記載の方法。
【請求項20】
該方法を高スループットスクリーニングを用いて実施する、請求項4に記載の方法。
【請求項21】
リボスイッチを被検化合物と接触させる[ここで、リボスイッチが被検化合物と相互作用する時、蛍光シグナルが生成する]事を含む、リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法。
【請求項22】
(a) リボスイッチの結晶構造を特定し:
(b) 被検化合物を伴うそのリボスイッチのモデル作製を行い;そして、
(c) 被検化合物がそのリボスイッチと相互作用するかどうかを決定する、
事を含む、リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法。
【請求項23】
リボスイッチがグアニンリボスイッチである、請求項22に記載の方法。
【請求項24】
グアニンリボスイッチが表5のリボスイッチである、請求項23に記載の方法。
【請求項25】
コード領域と機能的に結合したリボスイッチを含むRNAをコードしている核酸分子を含む、調節可能な遺伝子発現構築物であって、このリボスイッチが表5のリボスイッチであり、このリボスイッチが該RNAの発現を調節し、このリボスイッチおよびコード領域が異種である、構築物。
【請求項26】
リボスイッチがトリガー分子によって活性化され、トリガー分子により活性化される時このリボスイッチがシグナルを生成する、請求項25に記載の遺伝子発現構築物。
【請求項27】
試料およびリボスイッチを接触させる事を含む、目的化合物を検出する方法であって、リボスイッチは表5のリボスイッチであり、リボスイッチは目的化合物により活性化され、リボスイッチは目的化合物により活性化された時にシグナルを生成し、リボスイッチは試料が目的化合物を含有する時にシグナルを生成する、方法。
【請求項28】
目的化合物により活性化された時にリボスイッチがコンホメーションを変化させ、そのコンホメーションの変化がコンホメーション依存性標識を介してシグナルを生成する、請求項27に記載の方法。
【請求項29】
目的化合物により活性化された時にリボスイッチがコンホメーションを変化させ、そのコンホメーションの変化が、リボスイッチに結合したRNAの発現に変化を惹起し、その発現の変化がシグナルを生成する、請求項27に記載の方法。
【請求項30】
シグナルが、リボスイッチに結合したRNAから発現されるレポーター蛋白により生成される、請求項29に記載の方法。
【請求項31】
(a) 化合物および細胞を接触させるステップ、
を含む方法であって、
(b) 該化合物は、式I:
【化1】

で示される構造を有し、
この化合物がグアニン応答性リボスイッチと結合する時、R1およびR2は水素結合ドナーとして働き、R7は水素結合アクセプターとして働き、R9は水素結合ドナーとして働き、R10は水素結合アクセプターとして働き、
【化2】

は、各々独立して単結合または二重結合を表し、
この化合物はグアニン、ヒポキサンチンまたはキサンチンではなく、
細胞は、グアニン応答性リボスイッチを含むRNAをコードしている遺伝子を含み、
ここで、この化合物は、グアニン応答性リボスイッチと結合することにより該遺伝子の発現を阻害する、
ことを含む、遺伝子発現を阻害する方法。
【請求項32】
R3が水素結合アクセプターである、請求項31に記載の方法。
【請求項33】
R1、R2、R9または組み合わせが、独立して、-NR11-、-CHR11-、=CR11-、および-C(=NR11)- [式中、R11は-H、-NH2、-OH、 -SH、-CO2H、置換または非置換アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、またはベンジルオキシ、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、-NHC(O)NH2、-NH-NH2、-NH-NHアルキル、-NH-NHアルコキシ、-NH-SO2アルキル、-NH-SO2-R12、NHCO2CH2-R12、-NH-OR12、-N+H2-R12、-NH-NH-R12、および-NH-NH-CH2-R12[式中、R12 は、
【化3】

[式中、nは1ないし5であり、そしてR13は、-H、-NH2、-OH、アルコキシ、-N-モルホリノまたはハライドのうち1またはそれ以上である]
である]
である]
である、請求項31に記載の方法。
【請求項34】
R8およびR7が合してCH=N-、-CH2-O-、-CH2-S-、または-CH2SO2-を表し得る、請求項31に記載の方法。
【請求項35】
R10が、-OH、-SH、-NH2、-CO2H、-アルコキシ、-アリールオキシ、-ベンジルオキシ、-ハライド、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、-NHCO2CH2-R12、-NHC(O)NH2、-NH-NH2、-NH-NHアルキル、-NH-NHアルコキシ、-SO2アルキル、-SO2アリール、-NH-SO2アルキル、-NH-SO2-R12、-NH-OR12、-NH-R12、-NH-NH-R12、-NH-NH-CH2-R12、または-NH-CH2-R12[式中、R12 は、
【化4】

[式中、nは1ないし5であり、そしてR13は、-H、-NH2、-OH、アルコキシ、-N-モルホリノまたはハライドのうち1またはそれ以上である]
である]
である、請求項31に記載の方法。
【請求項36】
R10が、NR14[式中、R14は、-H、-NH2、-OH、-SH、-CO2H、- CO2アルキル、-CO2アリール、-C(O)NH2、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシ、アルコキシ、アリールオキシ、またはベンジルオキシ、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、-NHC(O)NH2、-SO2アルキル、-SO2アリール、-NH-SO2アルキル、-NH-SO2-R12、-NH-OR12、-NH-R12、または-NH-CH2-R12
[式中、R12 は、
【化5】

[式中、nは1ないし5であり、そしてR13は、-H、-NH2、-OH、アルコキシ、-N-モルホリノまたはハライドのうち1またはそれ以上である]
である]
である]
である、請求項31に記載の方法。
【請求項37】
化合物が式II:
【化6】

[式中、
R7は、NまたはCHであり;
R10は、=O、=S、=NH、=NOH、=Nアルキル、=Nアルコキシル、=N-アリール、=Nアリールオキシ、=N-ベンジル、-Nベンジルオキシ、=N-NH2、=N-NHOH、=N-NHアルキル、=N-NHアルコキシ、=N-NHアリール、=N-NHアリールオキシ、=N-NHベンジル、=N-NHベンジルオキシ、=N-NH-(p-アミノ-フェニル)、=N-NH- (p-メトキシフェニル)、=N-NH-(p-N-モルホリノ-フェニル)であり;そして、
R2は、=CR15-[式中、R15は、-NH2、-NHNH2、-NHOH、-NHアルキル、-NHアルコキシ、- NHアリール、-NHアリールオキシ、-NHベンジル、-NHベンジルオキシ、-N+H2アリール、-N+H2-(p-N-モルホリノ-フェニル)、-N+H2-(p-アミノフェニル)、-N+H2-(p-メトキシフェニル)、-NHCO2アルキル、- NHCO2ベンジル、-NHNHアルキル、-NHNHアリール、-NHNHベンジル、または-NHC(O)アルキルである]
で示される構造を有する、請求項31に記載の方法。
【請求項38】
化合物が式III:
【化7】

[式中、
R7は、NまたはCHであり;
R10は、-H、-OH、-SH、-アルコキシ、ハライド、-NH2、-NHOH、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHアリール、-NHアリールオキシ、-NHベンジル、-NHベンジルオキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、NHCO2ベンジル、-NHNH2、-NHNHアルキル、-NHNHアリール、または-NHNHベンジルであり;そして、
R2は、=CR15-[式中、R15は、-NH2、-NHNH2、-NHOH、-NHアルキル、-NHアルコキシ、- NHアリール、-NHアリールオキシ、-NHベンジル、-NHベンジルオキシ、-N+H2アリール、-N+H2-(p-N-モルホリノ-フェニル)、-N+H2-(p-アミノフェニル)、-N+H2-(p-メトキシフェニル)、-NHCO2アルキル、- NHCO2ベンジル、-NHNHアルキル、-NHNHアリール、-NHNHベンジル、または-NHC(O)アルキルである]
である]
で示される構造を有する、請求項31に記載の方法。
【請求項39】
(a) リボスイッチを含むRNAをコードしている遺伝子の発現の阻害について或る化合物を試験し[ここで、リボスイッチは表5のリボスイッチであり、その阻害はリボスイッチを介している]、(b) 細胞と、工程(a)で遺伝子発現を阻害した化合物を接触させることにより遺伝子発現を阻害する
[ここで、その細胞は、リボスイッチを含むRNAをコードしている遺伝子を含み、その化合物は、リボスイッチに結合することにより遺伝子の発現を阻害する]、
ステップを含む方法。

【図1A】
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【図1B】
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【図1C】
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【図2A】
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【図2B】
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【図2C】
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【図3A】
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【図3B】
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【図3C】
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【図4A】
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【図4B】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12A】
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【図12B】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【公表番号】特表2008−518630(P2008−518630A)
【公表日】平成20年6月5日(2008.6.5)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−540181(P2007−540181)
【出願日】平成17年11月8日(2005.11.8)
【国際出願番号】PCT/US2005/040487
【国際公開番号】WO2006/055351
【国際公開日】平成18年5月26日(2006.5.26)
【出願人】(392019352)イェール ユニバーシティ (38)
【氏名又は名称原語表記】YALE UNIVERSITY
【出願人】(505466664)ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド (5)
【Fターム(参考)】