リボソームタンパク質抽出物（ＲＰＥ）及び場合によってＴｈ１促進アジュバントを含むワクチン
本発明は、寄生虫疾患を治療又は予防するための医薬品を調製するための、ＲＰＥ及び場合によってＴｈ１促進アジュバントを含む組成物及びその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生虫疾患を治療又は予防するための医薬品を調製するための、リボソームタンパク質抽出物（ＲＰＥ）及び場合によってＴｈ１促進アジュバントを含む組成物及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リーシュマニア症は、ヒト及びイヌを含めたさまざまな哺乳動物のマクロファージに主に感染する、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）に属する細胞内寄生原虫によって引き起こされるいくつかの疾患を含む。寄生虫の種及びヒト宿主の免疫能力の状態に主として応じて、疾患のスペクトルは、自然治癒する皮膚リーシュマニア症（ＣＬ）から致命的な内臓リーシュマニア症（ＶＬ）又はカラアザールに及ぶ（１８）。幼児リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ）及びシャーガスリーシュマニア（Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ）によって引き起こされるイヌ・内臓皮膚リーシュマニア症（ＶＣＬ）は、地中海沿岸地方周辺、中東及びラテンアメリカの諸国で発見された重要な新興の動物原性感染症であり（１６）、イヌがこれらの寄生虫の主要な保有宿主であり、サシチョウバエによるヒトへの伝染において中心的な役割を果たす（４７）。感染の結果は、宿主の免疫系と種々の寄生種との相互作用によって決まり、今までのところリーシュマニア症の発症機序は不明のままであり、ヒト及びイヌにおける、リーシュマニアに対する免疫応答に関わるメカニズムについての知見は依然として限られている。大抵の場合、防御免疫は、Ｔ細胞由来のサイトカインによるマクロファージの活性化を誘導する古典的な細胞性免疫応答に関連付けられ、一方非治癒性の疾患は、強力な体液性応答の生成に関連付けられる（１５、２６）。寄生虫粗画分又は定義済みの寄生虫抗原をベースとする第２世代のワクチンを開発するための研究において取り組まれたのは、多種多様なアジュバントを用いたいくつかの実験モデルにおいてワクチン候補として試験された種々の寄生虫表面分子又は分泌分子の同定であった（１、１７、２２、４６、４８、４９、５２、５４）。感染した動物又はヒト由来の血清を用いた発現ライブラリーのスクリーニングによっても、候補ワクチンとして数個の抗原を選択することができた（（９）に総説がある）。その中で、感染したマウス又はヒト患者の細胞において、その細胞の位置に無関係に、主としてＴｈ１型の免疫応答を引き出す抗原が、種々の動物モデルにおいて防御応答の生成に関連している（５１、５５、５６）。一方、単離された抗原の一部は、ＶＬに罹患しているヒト又はイヌにおける体液性応答、又は実験的に感染させたマウスにおけるＴｈ２媒介体液性応答を優勢的に刺激する、細胞内に保存されているタンパク質である（３、３６、３８、４０、４２）。リーシュマニア症に罹患しているイヌにおいて、それらの抗原に対して誘導される不十分な体液性応答により、主に免疫複合体が有害作用を有するため、免疫病変、特にブドウ膜炎（１３）、中枢神経系における損傷（１４）又は腎炎（２３、２４、３３、３４）が生じると考えられている。また、ＶＬを生じたヒトにおいて、ＩｇＧ免疫複合体が存在することが、感染を消散できないことと相関があることが最近示され、感染した宿主に対して免疫複合体が悪影響を及ぼし得ることを実証している（３０）。
【０００３】
最初は良好なワクチン候補であるとみなされなかったにもかかわらず、感染プロセスの間に高度な体液性応答を誘導するタンパク質が、防御応答の誘導に関連している。例えば、寄生虫のチューブリン及びヒストンＨ２Ｂは、免疫ドナー由来のＴ細胞クローンによって認識され（３９）、ｒＫ３９は、免疫マウス由来のＴ細胞によって増殖及びＩＦＮ−γ産生を引き起こす（２５）。寄生虫のＨ２Ｂ遺伝子、Ｈ３遺伝子及びＨ４遺伝子を用いた遺伝子による免疫によって、マウスの内臓リーシュマニア症モデルにおいて防御が誘導されることも示されている（２７）。また、Ｔｈ１促進アジュバントと共に投与される活性化Ｃキナーゼ（ＬＡＣＫ）（３２）、一部の寄生虫システインプロテイナーゼ（３８、４１）又は寄生虫ヌクレオソーム形成ヒストン（１１、２０）に対する受容体を免疫することにより、マウスモデルにおいて皮膚リーシュマニア症に対する防御に相関する免疫応答が生成する。
【０００４】
進化的に保存されたリーシュマニアの抗原の中で、いくつかの証拠により、リボソームタンパク質が、リーシュマニア感染の間、免疫学的に関連する分子であることが示唆されている。一部の例では、リボソームの構成要素は、感染の間に細胞活性及びサイトカインの放出を調節するその能力を通して宿主の免疫系の機能不全に寄与し得る。したがって、大形リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）のリボソームタンパク質Ｓ３ａをＢＡＬＢ／ｃマウスに注射することにより、Ｂ細胞クローンのポリクローナル増大が誘導され、Ｔ細胞の増殖が阻害された（１０）。また、推定６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３１をコードするＤＮＡワクチンを用いた遺伝子による免疫により、マウスモデルにおいて、ＩＬ−１０及びＴｈ２サイトカインが誘導されることによって疾患が悪化する（４４、５３）。さらに、寄生虫の酸性Ｐタンパク質などの一部の寄生虫のリボソームタンパク質は、リーシュマニア症に罹患しているイヌ及びヒトにおける強力な体液性応答の生成に関連している（（４２）に総説がある）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今まで試みられているにも関わらず、依然としてリーシュマニア症などの寄生虫疾患に対して有益なワクチンはない。したがって、そのようなワクチンが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本研究において、我々は、ＲＰＥ、特にリーシュマニアＲＰＥ（ＬＲＰＥ）が、幼児リーシュマニアに自然感染したイヌにおいて、及び大形リーシュマニアに実験的に感染させたマウスにおいて免疫応答の標的であることを示している。我々はさらに、ＬＲＰＥをＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）などのＴｈ１促進アジュバントと同時投与した際に、強力なＴｈ１防御免疫応答が誘導されることを実証している。そのような組成物（Ｔｈ１促進アジュバントと組み合わせたＬＲＰＥ）は、ワクチンとして使用することが非常に魅力的である。本発明を以下さらに説明する。
【０００７】
使用
本発明の第１の態様において、対象において寄生虫疾患を治療又は予防するための医薬品を調製するための、ＲＰＥ及び場合によってＴｈ１促進アジュバントの使用が提供される。
【０００８】
好ましい実施形態において、ＲＰＥは、対象内に存在すると寄生虫疾患を引き起こす寄生虫細胞を用いて、
ａ．寄生虫細胞を溶解緩衝液と混合するステップと、
ｂ．得られた混合物を遠心分離してサイトゾル抽出物を得るステップと、
ｃ．得られたサイトゾル抽出物からＲＰＥを調製するステップと
を行うことにより得られる。
【０００９】
ステップａにおいて、寄生虫は原生動物を指すことが好ましい。好ましい寄生虫は本明細書において後で定義する。原生動物のステージは前鞭毛型であることがより好ましい。所望の量のＲＰＥを調製するためにおよそ必要な寄生虫細胞の量は当業者には公知であろう。一般には、およそ５００マイクログラムのＲＰＥを調製するために、およそ３．１０９個の寄生虫細胞を使用する。溶解緩衝液は、寄生虫細胞の少なくとも一部を壊す緩衝液である。好ましい溶解緩衝液は、非イオン界面活性剤を含む。非イオン界面活性剤としてＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ４０）を用いると良い結果が得られた。しかし、他の非イオン界面活性剤を使用してもよい。下記の溶解緩衝液を使用することが好ましい（緩衝液Ａ）：１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５％のＮＰ４０（Ｒｏｃｈｅ）、並びにＰＭＳＦ １ｍＭ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ ８μｇ／ｍｌ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ ４μｇ／ｍｌ及びＰｅｎｔａｔｉｎ ８μｇ／ｍｌなどのプロテアーゼ阻害剤を補充することが好ましい。適当量の寄生虫細胞（およそ細胞１０９個／緩衝液Ａ１ｍｌ）を、一般には、エッペンドルフピペットを用いて溶解緩衝液と穏やかに混合する。
【００１０】
ステップｂにおいて、ステップａで得られた混合物に対し、遠心分離を４℃で少なくとも１ステップ行う。通常、第１の遠心分離ステップはおよそ３，０００ｇでおよそ２分行う。得られた上澄みを、４℃で、およそ１３，０００ｇでおよそ１５分、１回又は２回再度遠心分離することが好ましい。
【００１１】
ステップｃにおいて、得られた上澄みを（４５）に記載の通りＲＰＥを調製するために使用する。簡単に述べると、得られた上澄みを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬ１００．３ローターを用いて、４℃、およそ９０，０００ｒｐｍでおよそ３０分の高速遠心分離にかける。得られたペレットは粗製のリボソームペレットであり、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＡｃＮＨ４、１００ｍＭのＭｇＣＬ２、５ｍＭのβ−メルカプトエタエノール）に再懸濁させ、緩衝液Ａ中、不連続なショ糖勾配（２０／４０％）で、ＴＬ１００．３ローターを用いて、４℃、およそ９０，０００ｒｐｍで遠心分離する。得られたペレットはリボソームを含む。このペレットを、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に溶解させ、超音波処理し、−７０℃で保存することが好ましい。
【００１２】
リボソームタンパク質は、よく保存されたサイトゾルタンパク質である。したがって、本明細書で定義するＲＰＥは、植物であろうと動物であろうと、哺乳動物、爬虫類、魚類、昆虫類であろうと原生生物などの染色体を持つ他の任意の生物であろうと、任意の真核生物から調製することができる。ＲＰＥは、疾患に近い生物、好ましくは系統樹内の寄生虫疾患を引き起こす生物から得ることが好ましい。したがって、寄生虫疾患の治療に使用されるＲＰＥ源として特に興味深いものは、原生動物、例えばプラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、特にトリパノソーマ科のメンバー、より特定するとトリパノソーマ科の原生生物リーシュマニアの種々の種である。リーシュマニアには２０を超える公知の種があり、大形リーシュマニアを含めた大形リーシュマニアコンプレックス、シャーガスリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）及び幼児リーシュマニアを含めたドノバンリーシュマニアコンプレックス、アマゾンリーシュマニア（Ｌ．ａｍａｚｏｎｅｓｉｓ）及びメキシコリーシュマニア（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）を含めたメキシコリーシュマニアコンプレックスを含むリーシュマニア亜属の種、並びにブラジルリーシュマニア（Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）及びペルーリーシュマニア（Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎａ）を含めたブラジルリーシュマニアコンプレックス及びガイアナリーシュマニア（Ｌ．ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）及びパナマリーシュマニア（Ｌ．ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）を含めたガイアナリーシュマニアコンプレックスを含むビアンニア（Ｖｉａｎｎｉａ）亜種が含まれる。特に興味深いプラスモジウム属の種は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）及び三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）である。好ましい実施形態において、ＲＰＥは、リーシュマニア属の各種から得られ、大形リーシュマニア及び／又は幼児リーシュマニアから得ることが好ましい。他の好ましい実施形態において、ＲＰＥは、プラスモジウム属の各種から得られる。ＲＰＥは、本明細書で確認したいくつかの異なる生物由来のＲＰＥを混合することにより調製してもよいことは当業者に理解されよう。所定のタンパク質を使用する代わりにＲＰＥをワクチンに使用することは、ＲＰＥが異なる抗原を数多く含有するので、非常に魅力的である。これらの抗原はそれぞれ、治療される対象において免疫防御応答を潜在的に誘導し得る。さらに、抗原Ａには応答するが、抗原Ｂには応答しない対象、及びその逆の対象がある。したがって、本明細書で定義するワクチンは、異なる抗原を数多く含有するので、広範囲の対象集団に対して使用することを企図している。好ましい実施形態において、ＲＰＥは、少なくとも１種のリボソームタンパク質及び／又は少なくとも１種のリボソームタンパク質抗原及び／又は少なくとも１種のリボソームタンパク質のタンパク質断片を含む。より好ましい実施形態において、ＲＰＥは、少なくとも２種のリボソームタンパク質及び／又は少なくとも２種のリボソームタンパク質抗原及び／又は少なくとも２種のリボソームタンパク質断片を含む。本明細書で定義するタンパク質断片は、少なくとも２、３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０個又はそれ以上の、リボソームタンパク質に対応する隣接アミノ酸を含むことが好ましい。一実施形態において、本明細書で定義するＲＰＥは、幼児リーシュマニアの酸性リボソームタンパク質Ｐ０及び／又はブラジルリーシュマニア由来のリボソーム抗原ＬｂｅＦ４Ａを含まない、又はそれらからなるものではない。
【００１３】
Ｔｈ１促進アジュバント（例えばＣｐＧ ＯＤＮモチーフを含むアジュバント）は文献（Ｌｉｕ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（２００３），Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８７−６９３）において、所定の抗原（ここではＲＰＥ）と一緒に用いた際に所与の抗原に対するＴｈ１免疫応答を促進又は誘発することができ、その抗原と一緒に培養した際に処理した対象の脾細胞の上澄みから検出されるアジュバントとして定義されている。対照として、抗原及びアジュバントで処理していない、又は抗原でのみで処理した、同一対象の脾細胞集団において、Ｔｈ１免疫応答の促進又は誘発について評価する。Ｔｈ１免疫応答の誘発又は促進は、抗原を用いて処理した対象の脾細胞を培養すること、及び／又は抗原特異的ＩｇＧ２ａ免疫グロブリンの産生を誘導することによって検出されるＩＦＮγの誘導によって定義することが好ましい。このサイトカインの誘導についての評価は、実施例に記載の通り、脾細胞についてのＥＬＩＳＡによって行うことが好ましい。ＩｇＧ２ａの誘導についての評価は、実施例に記載の通り、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットによって行うことが好ましい。脾細胞をＲＰＥ及びアジュバントで刺激するとＩＦＮγ及び／又はＩｇＧ２ａが誘導されることにより、アジュバントがＴｈ１促進アジュバントであると認定されたことが示されることが好ましい。
【００１４】
上記のＴｈ１免疫応答の誘発又は促進についての最初の定義の代わりに、又はそれと組み合わせて、Ｔｈ１免疫応答の誘発又は促進はさらに、Ｔｈ２免疫応答の欠如（又は誘導の欠如）によって定義することができる。Ｔｈ２免疫応答は、非処理の脾細胞と比べて、ＩＬ−４、ＩＬ−１０の誘導が検出可能に増加すること、及び／又は検出可能なＩｇＧ１免疫グロブリンが産生されることを特徴とする。ＩＬ−４及び／又はＩＬ−１０の誘導についての評価は、実施例に記載の通り、脾細胞についてのＥＬＩＳＡによって行うことが好ましい。ＩｇＧ１の誘導についての評価は、実施例に記載の通り、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットによって行うことが好ましい。
【００１５】
上記のＴｈ１免疫応答の誘発又は促進についての最初の２つの定義の代わりに、又はそれと組み合わせて、Ｔｈ１免疫応答の誘発又は促進はさらに、定義済みの抗原、この場合はＲＰＥに対するＩＮＦγ／ＩＬ−１０比及び／又はＩＮＦγ／ＩＬ−４比の増加、及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の減少が生じることによって定義することができる。好ましい実施形態において、これらの３つ以上の比のいずれかが変化する（上記のように増加又は減少する）ことにより、アジュバントがＴｈ１の性質を有することが示される。言及した各サイトカインの誘導についての評価は、実施例に記載の通り、脾細胞についてのＥＬＩＳＡによって行うことが好ましい。免疫グロブリンＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａの誘導についての評価は、実施例に記載の通り、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットによって行うことが好ましい。
【００１６】
好ましい実施形態において、Ｔｈ１促進アジュバントは、オリゴデオキシヌクレオチドである、又はオリゴデオキシヌクレオチドを含む、又はオリゴデオキシヌクレオチドからなる。オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、Ｃがメチル化されていないＣｐＧを含む、又はＣがメチル化されていないＣｐＧからなることがより好ましい（ＣｐＧ ＯＤＮ）：３’プリン−ＣｐＧ−５’ピリミジン。好ましいオリゴデオキシヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾されたＯＤＮ配列を含む、又はホスホロチオエート修飾されたＯＤＮ配列からなる。そのような修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドを使用することは、それゆえに使用されるオリゴデオキシヌクレオチドの方が、修飾されていないオリゴヌクレオチドよりも安定しており、血液系に入っても容易に分解されないので、有利である。好ましいＴｈ１促進アジュバントは、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は少なくとも３つのＣｐＧモチーフからなる、又はそれを含む。免疫刺激ＯＤＮの好ましい配列（５’→３’）は、ＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡ及びＧＣＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴであった。当業者は、本明細書に明示した配列に制限されない。当業者は、他の配列を設計し、引き続いて、その配列について、本明細書で前に定義したＴｈ１を促進する性質について試験することができる。この好ましい同定アジュバントＣｐＧ ＯＤＮは、実施例において、ＬＲＰＥをこのＴｈ１促進アジュバントと一緒に接種することにより、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス及びＣ５７ＢＬ／６系マウスの両方で、大形リーシュマニア寄生虫によるチャレンジに対する防御が誘導されることが実証されたので、非常に魅力的である。どちらのモデルでも、防御はＩＦＮ−γの特異的な産生に相関している。ＢＡＬＢ／ｃでは、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生に対する制限も検出された。
【００１７】
本発明の一つの利点は、広範なスペクトルの寄生虫疾患を治療するための医薬品、すなわち、異種間に特異的な医薬品の調製を可能にすることである。多くの寄生虫疾患において、特定の種に対して作製されたワクチンは、その特定の種に対してしか働かない。その一事例である寄生虫疾患は、リーシュマニア症である。現在のところ、この疾患は薬物により制御されているが、薬物治療では疾患の伝播を予防できず、強い効果がない場合が多い。好ましい実施形態において、寄生虫疾患はリーシュマニア症又はマラリアである。寄生虫疾患が、リーシュマニア属の各種によって、又はプラスモジウム属の各種によって引き起こされるものであることがより好ましい。別の好ましい実施形態において、寄生虫疾患は、ＲＰＥを得る種とは異なる種により引き起こされる。特に、リーシュマニア属の一種により引き起こされるリーシュマニア症は、リーシュマニア属の他の種由来のＲＰＥをベースとする組成物を用いて治療することができる。一実施形態において、大形リーシュマニアにより引き起こされるリーシュマニア症は、幼児リーシュマニア由来のＲＰＥを含む組成物で首尾よく治療される。或いは、マラリアなどの他の寄生虫疾患は、他種のＲＰＥをベースとする組成物、例えば、幼児リーシュマニアのＲＰＥをベースとする組成物で首尾よく治療され得る。
【００１８】
本発明に照らして、対象はヒト又は動物を意味する。本発明の範囲に包含される動物としては、哺乳動物、特にイヌが挙げられる。
【００１９】
好ましい実施形態において、本明細書で定義した医薬品は、感染及び／又は疾患、より好ましくは寄生虫による感染及び／又は寄生虫疾患と戦うための、ヒト又は動物の免疫系の能力を高めるために使用される。特に、ヒト又は動物の対象に投与するために使用され得る。本明細書で定義した医薬品は好ましくは、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、動脈内又は病巣内という経路での注射又は点滴によって投与される。好ましい投与形態は、皮下である。医薬品は、当技術分野で公知の従来技法によって、薬学的に許容される培地又は送達ビヒクルと組み合わせることができる。例えば、ＲＰＥ及び場合によってＴｈ１促進アジュバントをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させることができる。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｄ．ＡＲ Ｇｅｎｎａｒｏ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＰＡ，ＵＳＡを含めたさまざまなソースに、より詳細が記載されている。医薬品は、治療有効用量、すなわち、本明細書で定義した感染及び／又は疾患と戦うために、ヒト又は動物の免疫系の能力を高める用量を投与することが好ましい。治療有効用量の本発明の医薬品により、真皮損傷の発生が予防及び／若しくは遅延され、かつ／又は耳及び／若しくは流入領域リンパ節（ＤＬＮ）における寄生虫負荷量の有意な縮小が誘導されることが好ましい。真皮損傷の存在についての評価は、図６の説明文に記載している。寄生虫負荷量についての評価は、実施例に記載している。治療有効用量の本発明の医薬品により、最初に本発明の組成物を用いた１回のワクチン接種、続いて逐次的な１回の寄生虫による感染、及びおよそ±６週間の待機時間を含む期間の後に、真皮損傷の発生が予防されることが好ましく、及び／又は耳において寄生虫負荷量のおよそ３桁の縮小及び／又はＤＬＮにおいて寄生虫負荷量のおよそ同様の桁の縮小が誘導されることが好ましい。好ましい実施形態において、本明細書で定義した医薬品はワクチンである。より好ましい実施形態において、少なくとも１２μｇのＲＰＥがワクチンに使用される。さらに好ましい実施形態において、免疫応答をもたらすために少なくとも１２〜２０μｇのＲＰＥを、場合によって少なくとも５０μｇの、例えばＣｐＧ ＯＤＮなどのＴｈ１促進アジュバントと組み合わせて使用する必要がある。本明細書で定義したワクチンは、予防ワクチン又は治療ワクチンであってよい。溶解させることができるＲＰＥ及び場合によってＴｈ１促進アジュバントの体積は１００〜５００マイクロリットルで変動してよい。
【００２０】
組成物
別の態様において、ＲＰＥ及び場合によってＴｈ１促進アジュバントを含む組成物が提供される。ＲＰＥ及びＴｈ１促進アジュバントは、本明細書ですでに定義した。好ましい実施形態において、組成物は、ＲＰＥ及びＴｈ１促進アジュバントからなる。好ましいＴｈ１促進アジュバントはＣｐＧ ＯＤＮである。好ましい組成物は、ＰＢＳに溶解させたＲＰＥ及び場合によってＴｈ１促進アジュバントを含む、又はそれらからなる。別の好ましい実施形態において、ＲＰＥ及びＴｈ１促進アジュバントを逐次的に投与することも本発明に包含される。したがって、その両方が対象に投与される限り、両成分が物理的に１つの単一組成物中に存在する必要はない。
【００２１】
そのような組成物は、薬学的に許容できるアジュバント及び／又は担体をさらに含む。
【００２２】
そのような組成物は、医薬品用であることが好ましい。その医薬品は、ワクチンであることが好ましい。医薬品及びワクチンは、本明細書ですでに広範に定義した。
【００２３】
方法
他の態様において、本発明は、全て本明細書で定義した、寄生虫疾患を予防及び／若しくは治療し、かつ／又は寄生虫疾患の進行を遅延させ、かつ／又は真皮損傷の発生を予防及び／又は遅延させ、かつ／又は耳及び／若しくは流入領域リンパ節（ＤＬＮ）において寄生虫負荷量の有意な縮小を誘導する方法を提供する。本方法において、本発明のワクチンは治療ワクチンとして機能する。一般には、感染と疾患発症の間には期間がある。この場合、ワクチンは、宿主において感染の病理学的影響を中和する免疫応答を引き出すことにより、疾患を予防及び／若しくは治療し、かつ／又は疾患の進行を遅延させる薬理学的免疫産物として作用する。治療ワクチンは、すでに感染又は疾患発症している患者において防御を誘導するという点において、予防ワクチンとは異なる。
【００２４】
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む」という動詞及びその活用は、その言葉に続く項目が含まれるが、特に言及していない項目が除外されるのではないことを指す非限定的な意味で使用している。さらに「からなる」という動詞は、「から本質的になる」と置き換えることができ、本明細書で定義した産物又は組成物又は保存混合物が、特に言及した成分と違う追加の成分（単数又は複数）を含んでよく、前記追加の成分（単数又は複数）は、本発明の独特な特性を変化させないことを意味する。
【００２５】
さらに、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」により要素を参照することは、前後関係からその要素が唯一であることが明らかに必要とされているのでなければ、その要素が２つ以上存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は通常「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ（少なくとも１つの）」を意味する。
【００２６】
本明細書に引用した全ての特許文献及び非特許文献は、参照により全体として本明細書に完全に組み込まれている。
【００２７】
本発明を以下の実施例によりさらに例証し、それにより本発明の範囲が限定されると解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】（Ａ）幼児リーシュマニアのリボソームタンパク質を、直線的な１０〜１４％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ニトロセルロースブロットに転写し、健康なイヌの血清（レーン１〜３）及びＶＣＬに罹患しているイヌ由来の血清（レーン４〜１３）と一緒にインキュベートした。血清は２００倍希釈で利用した。二次試薬として、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗イヌＩｇＧ抗体を使用した（Ｂ〜Ｅ）。ＢＡＬＢ／ｃマウス４匹について、大形リーシュマニアの静止期前鞭毛型５×１０４個を左足蹠において皮下感染させ、チャレンジの８週間後に血清を得た。Ｃ５７ＢＬ／６マウス４匹について、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型３００個を耳真皮において皮内感染させ、チャレンジの１４週間後に血清を得た。両系統の感染前の結成についても、寄生虫によるチャレンジの前に得た。（Ｂ）大形リーシュマニアのリボソームタンパク質を、直線的な１０〜１４％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ニトロセルロースブロットに転写し、感染させたＢＡＬＢ／ｃマウス又はＣ５７ＢＬ／６マウス由来の保存血清と一緒にインキュベートした。血清は２００倍希釈で利用した。感染前の血清でＬＲＰに対する反応性を示したものはなかった（示さず）（Ｃ）両系統のマウスにおけるＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２ａ抗体のＬＲＰに対する抗体価をＥＬＩＳＡによって個々に決定した。（Ｄ）感染の８週間後にＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させ、その膝窩部ＤＬＮ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、大形リーシュマニアＬＲＰ１２μｇ／ｍｌの存在下で又は培地のみで４８時間培養した。培養物の上澄みについてＥＬＩＳＡを行い、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０のレベルを評価した。（Ｅ）感染の１４週間後にＣ５７ＢＬ／６マウスを安楽死させ、その上顎後方のＤＬＮをＤと同様に処理した。
【図２】（Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて誘導される特異的な体液性応答の分析。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり６匹）について、大形リーシュマニアのリボソームタンパク質単独（ＬＲＰ）、又はそれにＣｐＧ ＯＤＮアジュバントを加えたもの（ＬＲＰ＋ＣｐＧ）を用いて、ＣｐＧ ＯＤＮアジュバント単独（ＣｐＧ）を用いて、又はＰＢＳ（生理食塩水）を用いて、右足蹠において３回皮下免疫した。３回目の免疫の１４週間後、マウスから血を抜き、血清についてＥＬＩＳＡを行い、ＩｇＧ１アイソタイプ（黒い棒線）及びＩｇＧ２ａアイソタイプ（白い棒線）の両方の特異的な抗ＬＲＰ抗体応答について評価した。免疫前の血清で反応性を示したものはなかった。（Ｂ〜Ｄ）ワクチン接種の４週間後、マウスを安楽死させ、その脾臓を得、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ＬＲＰの存在下で（灰色の棒線）又は培地のみで（黒い棒線）４８時間培養した。培養物の上澄みについてＥＬＩＳＡを行い、ＩＦＮ−γ（Ｂ）、ＩＬ−４（Ｃ）及びＩＬ−１０（Ｄ）のレベルを評価した。
【図３】（Ａ）ワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける大形リーシュマニア感染の経過。マウス（１群当たり６匹）を、図２に示したように皮下免疫した。最後の免疫の１カ月後、動物について、大形リーシュマニアの静止期前鞭毛型５×１０４個を左後部足蹠において感染させた。足蹠の腫大は、感染した足蹠と感染していない反対側の足蹠との厚さの違いとして得られる。結果は、２つの独立した実験についての平均及び標準偏差を表す。＊ チャレンジの８週間後の、ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウス群における炎症対ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウス群における炎症のＰ＜０．００１の有意差。（Ｂ）感染の８週間後、感染させた脚の膝窩部ＤＬＮ及び脾臓における生存可能な寄生虫の数を、個々に限界希釈法により決定した。結果は、２つの独立した実験についての平均及び標準偏差を表す。＊ チャレンジの８週間後の、ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウス群における寄生虫の体内総量対ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウス群における寄生虫の体内総量のＰ＜０．００１の有意差。（Ｃ〜Ｄ）ワクチン接種したマウス及び感染させたマウスにおけるサイトカイン産生を、大形リーシュマニアによるチャレンジの８週間後に決定した。感染した脚の膝窩部ＤＬＮを得、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ＳＬＡの存在下で（白い棒線）、ＬＲＰの存在下で（灰色の棒線）又は培地単独で（黒い棒線）４８時間培養した。培養物の上澄みについてＥＬＩＳＡを行い、ＩＬ−４（Ｃ）、ＩＬ−１０（Ｄ）、及びＩＦＮγ（Ｅ）のレベルを試験した。この実験では同様の結果が繰り返された。（Ｆ）ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種によって与えられた防御に付随するＩＦＮγ産生におけるＩＬ−１２及びＴ細胞の関与の分析。大形リーシュマニアの静止期前鞭毛型５×１０４個でチャレンジした８週間後、ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種したマウス（黒い棒線）及びＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種したマウス（白い棒線）の膝窩部ＬＮを得、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体のいずれか、及び対照モノクローナル抗体の存在下で、ＬＲＰを用いて培養して刺激した。７８時間インキュベーションした後、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγのレベルを評価した。抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いた処理と対照抗体を用いた処理とにおけるＩＦＮγ産生の差は、統計学的に有意であった（＊Ｐ＜０．０５）。データは、同様の結果であった２つの独立した実験の代表的な実験に対応する。
【図４】ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ極性化の分析。（Ａ）チャレンジの８週間後、血清試料を得、ＬＲＰに対するＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２ａ抗体の抗体価を、個々にＥＬＩＳＡにより決定した。ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種したマウスと他の３群とにおけるＩｇＧ１抗体価の差は、統計学的に有意であった（＊Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）大形リーシュマニアのＬＲＰを、直線的な１０〜１４％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロースブロットに転写し、表示したマウス群由来の２００倍希釈した保存血清と一緒にインキュベートした。ＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ２ａアイソタイプ両方の抗体応答を示す。（Ｃ）同じ血清を利用して、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのＳＬＡに対する抗体価を決定した。ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種したマウスと他の３群とにおけるＩｇＧ１抗体価の差は、統計学的に有意であった（＊Ｐ＜０．０２）。
【図５】ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹について、図３に示したように左足蹠においてＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種し、感染させた。最初の寄生虫によるチャレンジの１８週間後、マウスについて、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型３００個を用いて耳の皮内に再感染させた。対照として、無処置のマウス６匹についても耳の皮内にチャレンジした。（Ａ）防御させ、再感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける大形リーシュマニアの感染経過。値は、平均損傷直径＋標準偏差（ＳＤ）を表す。＊ チャレンジの７週間後の、再感染させたマウスにおける炎症対対照の感染させたマウスにおける炎症のＰ＜０．０００１の有意差。（Ｂ）再感染の７週間後、マウスを安楽死させ、耳真皮、脾臓及び局所ＤＬＮにおける寄生虫の生体内総量を、個々に定量化した。結果は、１２匹分の耳及びＤＬＮの平均±ＳＤとして表す。＊ 再感染させたマウス対感染させた対照マウスのＰ＜０．００１の有意な減少。（Ｃ）安楽死させた後、対照マウス由来（黒い棒線）及び再感染させたマウス由来（白い棒線）の上顎後方のＤＬＮを得、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ＳＬＡの存在下で、ＬＲＰの存在下で又は培地単独で４８時間培養した。培養液の上澄みについてＥＬＩＳＡを行うことにより、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、及びＩＬ−１０のレベルを評価した。（Ｄ〜Ｅ）再チャレンジした７週間後、血清試料を得、ＬＲＰ（Ｄ）及びＳＬＡ（Ｅ）に対するＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２ａ抗体の抗体価を、個々にＥＬＩＳＡにより決定した。
【図６】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける大形リーシュマニアの感染に対する防御。マウス（１群当たり６匹）について、ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを３回用いて、及びＣｐＧ ＯＤＮを単独で用いて、右足蹠において皮下免疫した。（Ａ）ワクチン接種したＣ５７ＢＬ７６マウスの脾細胞によるＩＮＦ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生。ＣｐＧ ＯＤＮ（黒い棒線）又はＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮ（白い棒線）を用いてワクチン接種した４週間後、マウスを安楽死させ、その脾臓を得てｉｎ ｖｉｔｒｏ、ＬＲＰの存在下又は培地単独で４８時間培養した。培養物の上澄みについてＥＬＩＳＡを行うことにより、サイトカインのレベルを評価した。（Ｂ）ワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける大形リーシュマニアの感染経過。１群当たり１２匹のマウスを上記の通り免疫し、最後の接種の４週間後、マウスについて、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型３００個を耳の皮内に接種することにより感染させた。値は、平均損傷直径＋標準偏差（ＳＤ）を表す。＊ ２つのマウス群間の炎症のＰ＜０．００１の有意な減少。（Ｃ）感染の５週間後（１群当たり６匹）及び感染の１３週間後（１群当たり６匹）に定量した、ＣｐＧ ＯＤＮ（黒い棒線）又はＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮ（白い棒線）を用いてワクチン接種したマウス由来の耳真皮及び局所ＤＬＮにおける、寄生虫の生体内総量。結果は、１２匹分の耳及びＤＬＮの平均±ＳＤを表す。＊ 両マウス群間のＰ＜０．０１の有意な減少。（Ｄ〜Ｅ）ＣｐＧ（黒い棒線）又はＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮ（白い棒線）を用いてワクチン接種したマウスにおけるＩＦＮ−γの産生。感染させた５週間後、上顎後方の細胞を得、ＳＬＡの存在下で、ＬＲＰの存在下で及び培地単独（Ｄ）で培養し刺激した、又は抗ＩＬ−１２抗体、抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体及び対照のモノクローナル抗体の存在下でＬＲＰを用いて刺激した。７８時間インキュベーションした後、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γのレベルを評価した。抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いた処理と対照抗体を用いた処理とにおけるＩＦＮ−γ産生の差は、統計学的に有意であった（＊Ｐ＜０．０１）。（Ｆ）チャレンジした５週間後及び１３週間後に血清試料を得、ＬＲＰに対するＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２ａ抗体の抗体価を、個々にＥＬＩＳＡにより決定した。（Ｇ）ＣｐＧ ＯＤＮ（黒い棒線）又はＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮ（白い棒線）を用いてワクチン接種したマウスにおけるＩＬ−１０産生。感染させた５週間後、上顎後方の細胞を得、ＳＬＡの存在下で、ＬＲＰの存在下で又は培地単独で培養し刺激した。７８時間インキュベーションした後、ＩＬ−１０のレベルをＥＬＩＳＡにより評価した。
【実施例】
【００２９】
材料と方法
マウス系及び寄生虫
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは実験開始時に６〜８週齢であり、Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ Ｓ．Ａ．（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）から購入した。大形リーシュマニア寄生虫（クローンＷＨＯＭ／ＩＲ／−１７３）及びクローンＶ１（ＭＨＯＭ／ＩＬ／８０（Ｆｒｉｅｄｌｉｎ）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスで継代することにより毒性の状態に保った。大形リーシュマニアの無鞭毛型を膝窩部流入領域リンパ節（ＤＬＮ）から得、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したシュナイダー培地（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）中、２６℃で、それらが後期静止期に達するまで培養することにより、前鞭毛型に変換させた。両方のクローンの前鞭毛型を、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したシュナイダー培地（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）中、２６℃で培養した。大形リーシュマニア（クローンＶ１）の感染性ステージの前鞭毛型（発育終末）を、ピーナッツ凝集素（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ．）を用いたネガティブ選択によって静置培地から単離した。幼児リーシュマニア（ＭＣＡＮ／ＥＳ／９６／ＢＣＮ／１５０，ＭＯＮ−１）の前鞭毛型を、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）中、２６℃で培養した。
【００３０】
ＣｐＧ ＯＤＮ及びリーシュマニア抗原
リーシュマニアのリボソームタンパク質抽出物（ＬＲＰ）を調製するために、大形リーシュマニア及び幼児リーシュマニアの前鞭毛型を採取し、予備冷却したＰＢＳで２回洗浄し、ＮＰ４０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＧｍｂＨ，Ｍａｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎ．１１３３２４７３００１）１ｍｌを含む溶解緩衝液（１０ｍＭのトリスＣｌＨ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５％ＮＰ４０、ＰＭＳＦ １ｍＭ、Ｌｅｏｐｅｐｔｉｎ ８μｇ／ｍｌ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ ４μｇ／ｍｌ及びＰｅｎｔａｔｉｎ ８μｇ／ｍｌ）に再懸濁させ、１０回上下にピペッティングした。溶解後、試料を４℃、３，０００×ｇで２分微量遠心し、核をペレット化した。上澄みを２回、４℃、１３，０００×ｇで１５分微量遠心し、（４５）に記載の通りサイトゾル上澄みからリボソームを調製した。簡単に述べると、サイトゾルを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬ１００．３ローターを用いて、４℃、９０，０００ｒｐｍで３０分の高速遠心分離にかけた。粗製のリボソームペレットを緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＡｃＮＨ４、１００ｍＭのＭｇＣＬ２、５ｍＭのβ−メルカプトエタエノール）に再懸濁させ、緩衝液Ａ中、不連続なショ糖勾配（２０／４０％）で、ＴＬ１００．３ローターを用いて、４℃、９０，０００ｒｐｍで遠心分離した。洗浄したリボソームのペレットをＰＢＳに溶解させ、超音波処理し、−７０℃で保管した。
【００３１】
大形リーシュマニアの全タンパク質（可溶性リーシュマニア抗原［ＳＬＡ］）を、ＰＢＳに懸濁させた大形リーシュマニアの静止期前鞭毛型を冷凍し解凍するサイクルを３回行うことにより調製した。細胞の溶解後、微量遠心を用いて１２，０００ｇで１５分遠心分離することにより、可溶性抗原を不溶性画分から分離し、−７０℃で保管した。ＣｐＧモチーフを含むホスホロチオエート修飾されたＯＤＮ配列（ＣｐＧ ＯＤＮ）を、Ｉｓｏｇｅｎ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により合成した。免疫賦活性ＯＤＮの配列（５’→３’）は、ＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡ及びＧＣＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴであった。
【００３２】
免疫化及び寄生虫チャレンジ
ＢＡＬＢ／ｃマウスについて、大形リーシュマニア１２μｇを単独で、又は大形リーシュマニア１２μｇとＣｐＧ ＯＤＮ５０μｇ（各免疫賦活性ＯＤＮを２５μｇずつ）を、ＣｐＧ ＯＤＮ（５０μｇ）アジュバントを単独で、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を、右足蹠において皮下（ｓ．ｃ．）接種した。各群について、同じレジメンを用いて２週間後及び４週間後に追加免疫した。最初の寄生虫によるチャレンジは、最後の接種の４週間後に、大形リーシュマニアの静止期前鞭毛型（クローンＷＨＯＭ／ＩＲ／−１７３）５×１０４個を、左の（未処置の）足蹠に皮下接種することにより行った。感染の進行を、決定用カリパスを用いて厚さを測定することにより追跡した。各動物の反対側の足蹠が対照値を表し、腫大を以下の通り計算した：左足蹠の厚さ−右足蹠の厚さ。損傷が壊死性になった時に動物を安楽死させた。再感染させるために、ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹について、上記の通りワクチン接種し感染させた。１８週間後、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型（クローンＶ１）３００個を各マウスの両耳真皮に注射した。感染の進展を、決定用カリパスを用いて耳の損傷の硬結の直径を測定することによりモニターした。対照として、無処置のＢＡＬＢ／ｃマウス６匹の群についても、耳真皮において感染させた。
【００３３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスについて、大形リーシュマニアＬＲＰ１２μｇ＋ＣｐＧ ＯＤＮ５０μｇ（各免疫賦活性ＯＤＮを２５μｇずつ）、及びＣｐＧ ＯＤＮ（５０μｇ）アジュバント５０μｇを単独で、足蹠に皮下注射した。これらのマウスについて、同じ免疫化レジメンを用いて２週間後及び４週間後に追加免疫した。最後の接種の４週間後に、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型（クローンＶ１）３００個を、マウスの両耳真皮に皮内（ｉ．ｄ．）接種することによって感染を行った。感染の進展を、決定用カリパスを用いて耳の損傷の硬結の直径を測定することによりモニターした。
【００３４】
寄生虫の量子化
耳において、限界希釈アッセイ（６）により寄生虫の数を決定した。簡単に述べると、感染させたマウスから耳を回収した。感染させた耳の腹側及び背側のシートを分離した。耳のシートを、Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＣＩ酵素ブレンド（５０μｇ／ｍｌ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）に沈着させた。３７℃で２時間インキュベートした後、組織を小片に切断し、ホモジナイズし、細胞ろ過器（孔サイズ７０μｍ）を用いてろ過した。ホモジナイズした組織を、２０％ＦＣＳを加えたシュナイダー培地（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）を含有する９６ウェルの平底マイクロタイタープレート中に連続的に希釈した。生存可能な寄生虫の数を、前鞭毛型が２６℃でインキュベートして最大７日まで成長でき得る最大希釈から決定した。寄生虫の数は、感染させた耳（上顎後方）及び足蹠（膝窩部）の局所流入領域リンパ節（ＤＬＮ）において、及び脾臓においても決定した。器官を回収し、機械的に切り離し、次いで上記の通り連続的に希釈した。寄生虫の負荷量は、全器官における寄生虫の数として表される。
【００３５】
上澄み中のサイトカインの測定
脾臓及び対応する局所ＤＬＮを無菌的に取り出し、機械的に切り離し、完全なＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、及び１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０）に播種した。ＬＲＰ（１２μｇ／ｍｌ）又はＳＬＡ（１２μｇ／ｍｌ）の存在下、３７℃で４８時間の間に、４８ウェルプレートに細胞５×１０６個／ｍｌを播種した。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）により、脾細胞及びＤＬＮ細胞の上澄みについて、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０及びＩＬ−４の放出を測定した。一部の例では、ＬＲＰ１２μ／ｍｌで刺激したＤＬＮ細胞を、マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）、マウスＩＬ−１２（Ｃ１７．８）、マウスＣＤ８（５３−６．７）のいずれかに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１０μｇ／ｍｌの存在下でインキュベートした。適切なアイソタイプ整合対照についてもこのアッセイで分析した。抗体（ｎｏ ａｚｉｄｅ／ｌｏｗ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ（商標））は、ＢＤ）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）から購入した。
【００３６】
体液性応答の分析
ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにより、ＬＲＰ又はＳＬＡに対する特異的な抗体について血清試料を分析した。簡単に述べると、標準のＥＬＩＳＡプレートを、１００μｌのＬＲＰ（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）又はＳＬＡ（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）を用いて室温で一晩コーティングした。抗体価を、血清を連続的に希釈することにより決定し、吸光度＞０．２を生じる最大の血清希釈力価の逆数として定義した。アイソタイプ特異的な分析を、以下の西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗マウス免疫グロブリン（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）：抗ＩｇＧ１（１／１０００）及び抗ＩｇＧ２ａ（１／５００）を用いて行った。オルトフェニレンジアミンジヒドロクロライド−ＯＰＤ−（Ｄａｋｏ，Ａ／Ｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）をＥＬＩＳＡアッセイのペルオキシダーゼの基質として使用した。１５分後、１ＭのＨ２ＳＯ４１００μｌを加えることにより反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【００３７】
ウェスタンブロット分析のために、幼児リーシュマニア及び大形リーシュマニアのリボソームタンパク質を得、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）に転写した。対照のイヌ、ＶＣＬリーシュマニア症に罹患しているイヌの血清、又は本研究において示した希釈で利用した種々のマウス群由来の血清を用いてブロットを探索した。二次抗体として、Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした、抗マウス抗ＩｇＧ（１／１０００）、抗ＩｇＧ１（１／１０００）、抗ＩｇＧ２ａ（１／５００）免疫グロブリン、及び抗イヌ抗ＩｇＧ（１／２０００）を使用した。
【００３８】
統計分析
統計分析はスチューデントｔ検定により行った。Ｐ＜０．０５である場合に有意差があるとみなした。
【００３９】
結果
感染の間のＬＲＰの抗原性
リーシュマニアのリボソームタンパク質（ＬＲＰ）の抗原性を分析するために、幼児リーシュマニアに自然感染したイヌ由来の血清の幼児リーシュマニアＬＲＰに対する応答性を、ウェスタンブロットによりアッセイした。活動性疾患に罹患しているイヌ由来の血清が、ＬＲＰ抽出物中の多数のタンパク質バンドを認識したことが観察された（図１Ａ）。大形リーシュマニアに実験的に感染させたＣ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃマウス由来の血清も、大形リーシュマニアＬＲＰ中の多くのタンパク質バンドを認識し、ＢＡＬＢ／ｃ感受性マウス由来の血清に存在するＩｇＧ抗体によって認識されるリボソームタンパク質の数の方が、Ｃ５７ＢＬ／６耐性マウスの血清中のＩｇＧ抗体によって認識されるタンパク質の数よりも多い（図１Ｂ）。
【００４０】
ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体の誘導は、Ｔｈ２型免疫応答及びＴｈ１型免疫応答のマーカーとして使用することができるので（８）、我々は、大形リーシュマニアに感染させたマウスにおいてＬＲＰに対するＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ極性化の分析を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、抗ＬＲＰ応答はＩｇＧ１アイソタイプが優勢であったのに対し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、抗ＬＲＰ応答はＩｇＧ２ａアイソタイプが優勢であった（図１Ｃ）。両方のマウス系統において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＲＰを用いてＤＬＮ細胞を刺激した後のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生についても決定した。ＣＬに罹患しているＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＬＲＰ特異的なＩＦＮ−γの産生が検出されたが、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生も強力に刺激され、ＩＮＦ−γ／ＩＬ−４比は約２．４、ＩＮＦ−γ／ＩＬ−１０比は約１．４になっている（図１Ｄ）。一方、治癒したＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＤＬＮ細胞をＬＲＰで刺激した場合、ＩＬ−４は検出されず（＜７．５ｐｇ／ｍｌ）、高ＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０比（約１５）が得られた（図１Ｅ）。
【００４１】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬＲＰの免疫原性
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、リボソームタンパク質をＣｐＧ ＯＤＮの非存在下及び存在下で投与した後のＬＲＰに対する免疫応答を調べた。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種後、抗ＬＲＰＥ体液性応答はＩｇＧ２ａアイソタイプが優勢であったのに対し、ＬＲＰＥ単独で免疫したマウス由来の血清では検出されたＩｇＧ１アイソタイプの抗体の抗体価は低かった（図２Ａ）。ＬＲＰＥ＋ＧｐＧ ＯＤＮで免疫したマウス由来の脾臓細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＲＰＥを用いて刺激した後、その細胞から分泌されたＩＦＮ−γのレベルは、対照マウス由来の脾臓細胞及びＬＲＰＥ単独で免疫したマウス由来の脾臓細胞から分泌されたものよりも高かった（図２Ｂ）。いずれの群においても、ＬＲＰＥによる刺激後にＩＬ−４産生の増加は見られなかった（図２Ｃ）。著しいことに、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種した脾臓から確立した培養物の上澄みにおいて、特異的なＩＬ−１０が検出され、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０比は約４０であった（図２Ｄ）。全体として、これらの結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、アジュバント無しで投与したＬＲＰＥからは、これらの抗体に対してほんの弱いＩｇＧ１体液性応答しか誘導されないが、ＣｐＧ ＯＤＮと同時投与すると、これらの抗原に対してＴｈ１様応答が増強されることを実証している。
【００４２】
ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種は大形リーシュマニアのチャレンジからＢＡＬＢ／ｃマウスを防御する
抗原に関連した疾患に誘導されるＴｈ２応答をＴｈ１応答に転送することは、リーシュマニアに対するワクチンを開発するための有望なアプローチ法であると考えられているので（７）、我々は、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種によって大形リーシュマニア感染に対する防御を誘導することができるかどうかを分析した。図３Ａは、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＮＤをワクチン接種したマウスの足蹠の腫大が、対照マウス及びＬＲＰＥ単独でワクチン接種したマウスの足蹠の腫大（平均値約５．５ｍｍ）と比較して縮小されているので（８週目の平均値０．７ｍｍ）、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＮＤによって効果的な防御が誘導されることを示している。我々は次に、マウスの４群について、膝窩部ＤＬＮ及び脾臓における寄生虫の負荷量を分析した。ＬＲＰＥ−ＣｐＧで免疫したマウス由来のＤＬＮでは、他の群と比べて、約３ｌｏｇの寄生虫の生体内総量の縮小が見られた。さらに、対照マウス及びＬＲＰＥ単独で免疫したマウスの脾臓では同様の寄生虫の負荷量が見られた一方、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウスの脾臓では寄生虫が検出できなかった（図３Ｂ）。
【００４３】
ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮに誘導される防御に関連する免疫学的パラメーターを決定するために、ＳＬＡ主導又はＬＲＰＥ主導のＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの産生をアッセイした。ＳＬＡ特異的又はＬＲＰＥ特異的に誘導されたＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生は、対照マウス（生理食塩水及びＣｐＧ）由来のＤＬＮ細胞及びＬＲＰＥ単独で免疫したマウス由来のＤＬＮ細胞において検出された（図３Ｃ〜Ｄ）。一方、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いて免疫したマウス由来のＤＬＮ細胞が産生したＩＦＮ−γの量は、他の３群で検出されたＩＦＮ−γの量よりも多かった（図３Ｅ）。ＬＲＰＥに特異的なＩＦＮ−γ産生に対するＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の寄与及びＩＬ−１２への依存についても分析した。図３Ｆに示されるように、ＩＦＮ−γの産生は、抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体又は抗ＣＤ４モノクローナル抗体により完全に阻害された。ＤＬＮ細胞培養物への抗ＣＤ８抗体の添加により、上澄み中のサイトカインの量が一部だけ縮小した。
【００４４】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、疾患の進行に付随してＩＬ−４に依存した高抗体価の抗体が産生されることから、我々は、感染の８週間後に、ＬＲＰＥに対して引き出される体液性応答をＥＬＩＳＡによって分析した。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いて免疫したマウスにおいて寄生虫のチャレンジによって引き出された、ＬＲＰＥに対する抗体は、主にＩｇＧ２ａアイソタイプであった。また、防御マウスの血清に存在するＩｇＧ１アイソタイプの抗ＬＲＰＥ抗体の抗体価は、ＬＲＰＥ単独で免疫したマウス及び２つの対照群と比較して低かった（図４Ａ）。ＬＲＰＥに対するＩｇＧ１抗体価の縮小は、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウスの血清由来のＩｇＧ１抗体に認識されるリボソームタンパク質バンドの数の減少と相関した。図４Ｂに示されるように、ＬＲＰＥウェスタンブロットにおいて、生理食塩水、ＣｐＧ又はＬＲＰＥ単独で免疫したマウスの血清由来のＩｇＧ１アイソタイプ抗体によって多くの数のタンパク質バンドが認識されたのに対して、防御マウスのＩｇＧ１抗体によって認識されたバンドはわずかであった。ウェスタンブロット分析により、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウス由来の血清中のＩｇＧ２ａ抗体によって認識されるタンパク質バンドの数は、他の３群と比較して増加しなかったことも示された（図４Ｂ）。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種によって、大形リーシュマニアの感染によって誘導される広域の抗リーシュマニア体液性応答も調整された。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いて免疫したマウスにおいて寄生虫のチャレンジによって引き出されたＳＬＡに対する抗体は、主にＩｇＧ２ａアイソタイプであり、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体の抗ＳＬＡ抗体価は、他の３群において検出されたものより有意に低かった（図４Ｃ）。
【００４５】
ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種し、感染させたマウスは耳真皮における大形リーシュマニアの再感染に対して耐性である
ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種し、感染させたマウスが、２回目の寄生虫によるチャレンジを制御できるかどうかを決定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹について、上記の通り足蹠においてワクチン接種し、感染させた。これらのマウス群の足蹠の腫大は、１８週間の間＜０．７ｍｍであった（データは示さず）。次に、これらの防御マウスについて、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型３００個を用いて、耳真皮において再感染させた。無処置のマウス６匹の対照群についても感染させた。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種し、再感染させたマウスでは病変が見られなかったのに対し、対照マウスでは、７週目に開存性の耳損傷が発生したので、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種し、再感染させたマウスは真皮損傷の発生を防御することが観察された（図５Ａ）。耳真皮及び上顎後方のＤＬＮにおける寄生虫の負荷量も、２群間で有意差があった（図５Ｂ）。ワクチン接種し、再感染させたマウスの耳及びＤＬＮにおける寄生虫の負荷量の低さは、脾臓に寄生虫が存在しないことと相関する。再感染後に起こる細胞性応答について知るために、ＬＲＰＥ又はＳＬＡを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激後の上顎後方のＤＬＮ細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、及びＩＬ−１０の分泌について分析した（図５Ｃ）。対照マウスでは、マウスを足蹠において感染させた際にも起こるのと同様（３Ｃ〜Ｅ）、ＩＦＮ−γの特異的産生が検出されたが、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生も強力に刺激された。一方、ワクチン接種し、再感染させたマウスのＤＬＮ細胞は、特異的ＩＦＮ−γを多量に産生し、ＩＬ−４及びＩＬ−１０はほとんど検出されなかった（図５Ｃ）。これに一致して、ＬＲＰＥ（図５Ｄ）及びＳＬＡ（図５Ｅ）に対するＩｇＧ体液性応答は、ＩｇＧ２ａアイソタイプによるものであった。
【００４６】
ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける大形リーシュマニアのチャレンジに起因する真皮の病変に対する防御を付与する
ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種すると、大形リーシュマニアの感染に対し、ＬＲＰＥに対するＴｈ２免疫応答がＴｈ１免疫応答へ転送されることにより防御が起こることから、我々は、このワクチンを、リーシュマニア抗原に対して自然にＴｈ１応答を生じるモデルであるＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した効果を分析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群を、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮで３回免疫し、対照マウスはＣｐＧ ＯＤＮアジュバントのみを受けさせた。接種により、ＬＲＰＥを用いて刺激した脾臓細胞培養物の上澄みにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−γ産生によって実証されたＴｈ１応答が誘導された。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウスから確立した脾臓細胞培養物の上澄みにおいて、特異的なＩＬ−１０の存在も検出されたのに対し、刺激後に特異的なＩＬ−４産生は観察されなかった（図６Ａ）。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウスは、病変がほとんど又は全く観察されなかったので、真皮損傷の発生を防御した（図６Ｂ）。ＣｐＧ ＯＤＮで免疫したマウスでは損傷が発生し、７週目でピークに達し、１３週目にほとんど完全に治癒した。このモデルでは、感染部位における寄生虫の数が、損傷の発生の直前にピークに達するので（５）、我々は、５週目に耳及び局所ＤＬＮ（上顎後方）における寄生虫の負荷量を決定した。ワクチン接種したマウスの耳真皮における寄生虫の数は、約３００分の１に（ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮマウスでは寄生虫１．０×１０４個、ＣｐＧ−ＯＤＮで免疫したマウスでは寄生虫３．０×１０６個）及びＤＬＮマウスでは約４０分の１に（ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮマウスでは寄生虫５．０×１０４個、ＣｐＧ ＯＤＮマウスでは寄生虫２．０×１０４個）縮小した。治癒後、対照マウスでは（チャレンジの１３週間後）、全ての群において寄生虫の数の縮小が観察された。
【００４７】
防御に関連する免疫学的パラメーターを決定するために、抗原主導のＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの産生をアッセイした。チャレンジの５週間後、ＤＬＮ細胞の培養物を確立し、ＬＲＰＥ又はＳＬＡを用いて刺激した。図６Ｄに示される通り、ワクチン接種したマウス由来の細胞の方が、対照マウス由来の細胞よりも多くのＳＬＡ特異的及びＬＲＰＥ特異的なＩＦＮ−γを産生した。ＬＲＰＥに特異的なＩＦＮ−γ産生に対するＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の寄与及びＩＬ−１２への依存についても分析した。ＩＦＮ−γの分泌は、抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体又は抗ＣＤ４モノクローナル抗体により完全に阻害された。抗ＣＤ８抗体での処理では、このサイトカインの量は一部だけ縮小した。これらのデータにより、Ｃ５７ＢＬ／６において、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種により、ＬＲＰＥに対する早期の特異的Ｔｈ１応答の誘導と相関する、皮膚及び局所ＤＬＮにおける病変及び寄生虫の生体内総量の縮小が誘導されることが実証された。これに一致して、対照マウスに対してワクチン接種したマウスにおいてＩｇＧ２ａ特異的な抗ＬＲＰＥ抗体が早く、高抗体価で検出された（図６Ｆ）。我々は、ＳＬＡ抗原特異的又はＬＲＰＥ抗原特異的なＩＬ−１０産生も検出し、それはワクチン接種したマウスと対照マウスとの間に統計的な差はなかった。
【００４８】
考察
本研究において、我々は、多くの寄生虫リボソームタンパク質と反応する抗体が、ＶＣＬを生じたイヌ由来の血清、及び大形リーシュマニアに感染させたマウスにおいて観察されることを示し、そのことは、リーシュマニアの自然感染及び実験的感染の間、寄生虫のリボソームタンパク質が強力な抗原であることを示している。抗ＬＲＰＥ抗体応答はＩｇＧ１アイソタイプによるものが優勢であったので、感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスのＬＲＰＥに対する応答はＴｈ２型のものであった。この知見は、ＬＲＰＥを用いて感染させたマウス由来のＤＬＮ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後に、培養物の上澄み中で多量のＩＬ−４が検出されたという事実により補強される。ＬＲＰＥは、ＩＮＦ−γのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生にも関係したが、匹敵するレベルの、寄生虫を破壊するための活性化シグナルに対して、感染したマクロファージを無反応性にする多面的な抗炎症サイトカインＩＬ−１０が検出された（３１）。さらに、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける疾患の促進におけるＩＬ−４及びＩＬ−１０の影響は、相加的だと思われることから（（３７）に総説がある）、これらのサイトカインのＬＲＰＥによる刺激は、リボソーム抗原に対する宿主の応答が、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて寄生虫が拡大及び持続するのに好都合であることを示しているとみなすことができる。リーシュマニアによる感染後早期に、宿主の免疫系が寄生虫の細胞溶解によって放出される豊富なＬＲＰＥにより感作され、その後で、寄生虫の増殖の結果、追加免疫され得ると考えることができる。したがって、ＬＲＰＥの強力な免疫原性及びその病原抗原的な役割は、おそらくその豊富さ及び抗原特異性（その進化的に保存された特性にもかかわらず）に依存している。一方、ＬＲＰＥに対して応答するＣ５７ＢＬ／６マウスはＴｈ１型のものであり、ＩｇＧ２ａ特異的抗体の生成及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの高レベルの特異的ＩＮＦ−γ産生を伴い、ＩＬ−４レベルは検出不可能であった。また、我々は、感染の１４週間後に、ＬＲＰＥに特異的なＩＬ−１０産生を見出した。ＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０比が、ＳＬＡを用いて細胞を刺激した場合（データは示さず）に得られたものと同様であったことから、我々は、これらの抗原によって誘導されるＩＬ−１０産生は、このモデルにおいて見られる、寄生虫が持続するのに好都合である調節性の応答に関連する可能性があることを示唆する（４）。我々のデータは、ＬＲＰＥに対する応答が、感受性宿主の病変に関連したＴｈ２に媒介される体液性応答及び耐性宿主におけるＴｈ１に関連する防御応答の誘導に向かうバイアスに一致することを示している。
【００４９】
いくつかのリーシュマニアのエピトープに対して誘導されるＴｈ２応答のＴｈ１応答への転送は、大形リーシュマニアの感染に対する防御を誘導するための有望な戦略になる可能性が高いので（７）、我々はまず、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、異なるリーシュマニア抗原を用いて免疫した際のＴｈ１に関連する長期免疫及び防御を与え（４３）、さらにマウスにおいていくつかの寄生虫特異的Ｔｈ２応答を抑制し得る（１２、５７）アジュバントであるＣｐＧ ＯＤＮと同時投与したＬＲＰＥの免疫原性について分析することを決めた。図２に示されるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて発生する免疫応答は、ＬＲＰＥを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後、免疫したマウスがＩｇＧ２ａアイソタイプの抗ＬＲＰＥ抗体を発生し、ワクチン接種したマウス由来の脾細胞が多量のＩＦＮ−γを産生し、ＩＬ−４は産生しないので、Ｔｈ１型であることが分かった。同様の特異的免疫応答が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いて免疫した場合に生じた（図６Ａ）。どちらのマウス系統においても、免疫した後にＬＲＰＥ主導のＩＬ−１０産生も観察された。
【００５０】
Ｌ３１をコードする遺伝子ワクチンを用いたワクチン接種が、遺伝子ワクチン接種後の特異的ＩＬ−１０産生に関係し得ることが報告されているにもかかわらず（４４）、我々は、ＩＬ−１０産生は、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮの投与後に起こるＴｈ１応答のホメオスタティックコントロールの方に関連している可能性があると考えている。事実、ＩＮＦ−γを産生するＴｈ１細胞は、フィードバック制御の機構としてＩＬ−１０の産生にも関与している可能性があることが最近報告されている（２）。さらに、得られた高ＩＮＦ−γ／ＩＬ−１０比の値により、ワクチンの結果について良好な予測が得られ得る（４４）。
【００５１】
ここで示したデータは、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮの同時投与により、実験的な皮膚リーシュマニア症の２つの異なるモデル、ＢＡＬＢ／ｃマウス（皮膚リーシュマニア症ワクチンのアッセイに広く用いられている）の足蹠における高接種量モデル、及びＣ５７ＢＬ／６マウス（経路及び感染用量に関して、ヒト疾患をより厳密に再現するモデル）の耳における低接種量モデルにおいて防御が誘導されることを示している。ワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスでは膝窩部ＤＬＮにおける寄生虫の生体内総量が縮小しており、脾臓への寄生虫転移はなかった。また、非常に弱い炎症が感染した足蹠において検出された。ワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスでは、耳真皮の損傷が防御され、皮膚及びＤＬＮにおいて寄生虫の生体内総量が縮小したことが示された。この防御は、熱殺菌されたリーシュマニア抗原とＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスによって示された防御に匹敵し、また、このモデルにおいて、ＬＡＣＫ、ＬｍＳＴＩ１及びＴＳＡを含む多成分ワクチンについても試験した（２８、２９、４３）。
【００５２】
重要なことに、どちらの系統における防御も、ＬＲＰＥに対するＴｈ１特異的免疫応答の生成に相関している。細胞性応答についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは感染の８週間後、及びＣ５７ＢＬ／６マウスでは５週間後（寄生虫の負荷量のピークに一致する（４））に測定した。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種した両マウス系統由来のＤＬＮ細胞は、ＬＲＰＥを用いて刺激した際、それぞれの対応する対照群よりも高いレベルのＩＦＮ−γを分泌した。ＩＦＮ−γ応答は、ＩＬ−１２依存性であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞により産生され、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する寄与は少ないことが分かった。予想通り、両系統の防御マウスについて、ＳＬＡ特異的ＩＦＮ−γ産生は高度であった。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、防御マウスにおけるＴｈ１応答の生成は、ＬＲＰＥに対する優勢なＩｇＧ２ａ特異的抗体の生成と相関する（図４Ａ）。ＩＬ−１０のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、系統間で、多少の違いが観察された。我々のデータは、ＬＲＰＥ及びＳＬＡの両方を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後、防御ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、対照マウスよりも有意に低いレベルのＩＬ−１０が産生されたことを示し、これは、このサイトカインがこのモデルの感受性に関与していることと一致している（３５）。一方、対照マウス及びワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスのどちらのＬＮＣにおいても、ＬＲＰＥ又はＳＬＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後、感染の急性期の間ＩＬ−１０が産生された（図６Ｆ）。ＩＦＮ−γについて起こったように、ＩＬ−１０レベルは、細胞を、ＳＬＡを用いて刺激した場合よりも、ＬＲＰＥを用いて刺激した場合の方が高かった。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０の産生は同様のプロファイルに従ったという事実は、ワクチン接種後のＩＬ−１０産生が、宿主において強力なＴｈ１によって引き起こされる有害な影響を制御するホメオスタティック機構を反映しているとみなすことができる（４）。驚くべきことに、我々は、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種した後にＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて見られる防御が、ＬＲＰＥ又はＳＬＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後のＩＬ−４主導の抗原産生が有意に縮小したことにも関連していることを見出した。これらの細胞性応答は、ｉｎ ｖｉｖｏで、リボソームタンパク質に対するＴｈ２に媒介される抗体応答の転換に相関する。したがって、防御ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の血清は、抗体価、特にＬＲＰＥ特異的なＩｇＧ１抗体によって認識される抗原の数について有意な減少を示した。さらに、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫も、大形リーシュマニアの感染によってマウスにおいて誘発される広範な体液性応答に対して明らかに影響した（図５Ｃ）。したがって、ワクチン接種したマウスを感染させると、ＩｇＧ１抗リーシュマニア特異的抗体の誘導が制限されるのに対して、他のアッセイした対照マウス群では、体液性応答が高度に誘導され、Ｔｈ２型の抗体（すなわち、ＩｇＧ１アイソタイプ）が優勢であった。全体として、どちらの系統のマウス由来のワクチン接種したマウスにおいて観察される防御も、ＬＲＰＥに対するＴｈ１応答の生成に相関し、またその結果、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴｈ２主導のＩＬ−４及びＳＬＡに対するＩＬ−１０応答が下向き調節される。
【００５３】
我々のデータは、防御ＢＡＬＢ／ｃマウスが、追加的な感染に抵抗できる能力を彼らに付与する免疫学的状況（寄生虫への再曝露が極めて頻繁に起こり得る流行地域において利用され得るワクチンに魅力的な特徴）を獲得したことを示している。耳真皮における再チャレンジの後、これらのマウスは、大形リーシュマニアの感染に対して強固な防御を示した。真皮損傷の発生は非常に少なく（一部の例では、真皮損傷が完全にないことが検出された）、感染した耳及びＤＬＮにおいて寄生虫数に相当な縮小がみられた。防御マウス由来のＤＬＮ細胞は、対照よりも大量のＩＦＮ−γを産生しないが（感染の７週間後に測定）、ＬＲＰＥ及びＳＬＡに対するＩｇＧ２ａ抗体の抗体価は、これらのマウスが二次的なチャレンジ後に特異的なＴｈ１防御応答を高めたとみなすことができる。驚くべきことに、これらのマウスにおける疾患関連サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−１０の特異的な産生は、非常に少なかった。これらのデータは、最初の寄生虫によるチャレンジの後に生成した免疫状態が非常に有力であり、再感染した部位からの寄生虫の迅速かつ効率的な排除を導くことを示している。
【００５４】
ここで示したデータは、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種が、耐性マウスと感受性マウスの両方において、リーシュマニアによる感染時に、免疫系の決定に直接影響を及ぼすことを実証している。我々の考えでは、リーシュマニアのような複雑な寄生虫に対するワクチンの生成は、ワクチン製剤中に種々の標的抗原を組み込み、これらの抗原が必要な免疫性を導く（主にＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＩＦＮ−γ媒介応答）ことを利用し、病変をもたらす病原抗原主導の免疫応答（ＩＬ−４ Ｔｈ２主導及びＩＬ−１０不活性化応答）をＴｈ１バイアスに転送することにより最適化され得る。それにもかかわらず、大形リーシュマニアのメタ１抗原で起こるように、これらの抗原の一部に対するＴｈ２応答は、通常のＴｈ１誘導剤によって転送されない場合があることを考慮しなければならない（５０）。
（参考文献）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生虫疾患を治療又は予防するための医薬品を調製するための、リボソームタンパク質抽出物（ＲＰＥ）及び場合によってＴｈ１促進アジュバントを含む組成物及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リーシュマニア症は、ヒト及びイヌを含めたさまざまな哺乳動物のマクロファージに主に感染する、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）に属する細胞内寄生原虫によって引き起こされるいくつかの疾患を含む。寄生虫の種及びヒト宿主の免疫能力の状態に主として応じて、疾患のスペクトルは、自然治癒する皮膚リーシュマニア症（ＣＬ）から致命的な内臓リーシュマニア症（ＶＬ）又はカラアザールに及ぶ（１８）。幼児リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ）及びシャーガスリーシュマニア（Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ）によって引き起こされるイヌ・内臓皮膚リーシュマニア症（ＶＣＬ）は、地中海沿岸地方周辺、中東及びラテンアメリカの諸国で発見された重要な新興の動物原性感染症であり（１６）、イヌがこれらの寄生虫の主要な保有宿主であり、サシチョウバエによるヒトへの伝染において中心的な役割を果たす（４７）。感染の結果は、宿主の免疫系と種々の寄生種との相互作用によって決まり、今までのところリーシュマニア症の発症機序は不明のままであり、ヒト及びイヌにおける、リーシュマニアに対する免疫応答に関わるメカニズムについての知見は依然として限られている。大抵の場合、防御免疫は、Ｔ細胞由来のサイトカインによるマクロファージの活性化を誘導する古典的な細胞性免疫応答に関連付けられ、一方非治癒性の疾患は、強力な体液性応答の生成に関連付けられる（１５、２６）。寄生虫粗画分又は定義済みの寄生虫抗原をベースとする第２世代のワクチンを開発するための研究において取り組まれたのは、多種多様なアジュバントを用いたいくつかの実験モデルにおいてワクチン候補として試験された種々の寄生虫表面分子又は分泌分子の同定であった（１、１７、２２、４６、４８、４９、５２、５４）。感染した動物又はヒト由来の血清を用いた発現ライブラリーのスクリーニングによっても、候補ワクチンとして数個の抗原を選択することができた（（９）に総説がある）。その中で、感染したマウス又はヒト患者の細胞において、その細胞の位置に無関係に、主としてＴｈ１型の免疫応答を引き出す抗原が、種々の動物モデルにおいて防御応答の生成に関連している（５１、５５、５６）。一方、単離された抗原の一部は、ＶＬに罹患しているヒト又はイヌにおける体液性応答、又は実験的に感染させたマウスにおけるＴｈ２媒介体液性応答を優勢的に刺激する、細胞内に保存されているタンパク質である（３、３６、３８、４０、４２）。リーシュマニア症に罹患しているイヌにおいて、それらの抗原に対して誘導される不十分な体液性応答により、主に免疫複合体が有害作用を有するため、免疫病変、特にブドウ膜炎（１３）、中枢神経系における損傷（１４）又は腎炎（２３、２４、３３、３４）が生じると考えられている。また、ＶＬを生じたヒトにおいて、ＩｇＧ免疫複合体が存在することが、感染を消散できないことと相関があることが最近示され、感染した宿主に対して免疫複合体が悪影響を及ぼし得ることを実証している（３０）。
【０００３】
最初は良好なワクチン候補であるとみなされなかったにもかかわらず、感染プロセスの間に高度な体液性応答を誘導するタンパク質が、防御応答の誘導に関連している。例えば、寄生虫のチューブリン及びヒストンＨ２Ｂは、免疫ドナー由来のＴ細胞クローンによって認識され（３９）、ｒＫ３９は、免疫マウス由来のＴ細胞によって増殖及びＩＦＮ−γ産生を引き起こす（２５）。寄生虫のＨ２Ｂ遺伝子、Ｈ３遺伝子及びＨ４遺伝子を用いた遺伝子による免疫によって、マウスの内臓リーシュマニア症モデルにおいて防御が誘導されることも示されている（２７）。また、Ｔｈ１促進アジュバントと共に投与される活性化Ｃキナーゼ（ＬＡＣＫ）（３２）、一部の寄生虫システインプロテイナーゼ（３８、４１）又は寄生虫ヌクレオソーム形成ヒストン（１１、２０）に対する受容体を免疫することにより、マウスモデルにおいて皮膚リーシュマニア症に対する防御に相関する免疫応答が生成する。
【０００４】
進化的に保存されたリーシュマニアの抗原の中で、いくつかの証拠により、リボソームタンパク質が、リーシュマニア感染の間、免疫学的に関連する分子であることが示唆されている。一部の例では、リボソームの構成要素は、感染の間に細胞活性及びサイトカインの放出を調節するその能力を通して宿主の免疫系の機能不全に寄与し得る。したがって、大形リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）のリボソームタンパク質Ｓ３ａをＢＡＬＢ／ｃマウスに注射することにより、Ｂ細胞クローンのポリクローナル増大が誘導され、Ｔ細胞の増殖が阻害された（１０）。また、推定６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３１をコードするＤＮＡワクチンを用いた遺伝子による免疫により、マウスモデルにおいて、ＩＬ−１０及びＴｈ２サイトカインが誘導されることによって疾患が悪化する（４４、５３）。さらに、寄生虫の酸性Ｐタンパク質などの一部の寄生虫のリボソームタンパク質は、リーシュマニア症に罹患しているイヌ及びヒトにおける強力な体液性応答の生成に関連している（（４２）に総説がある）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今まで試みられているにも関わらず、依然としてリーシュマニア症などの寄生虫疾患に対して有益なワクチンはない。したがって、そのようなワクチンが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本研究において、我々は、ＲＰＥ、特にリーシュマニアＲＰＥ（ＬＲＰＥ）が、幼児リーシュマニアに自然感染したイヌにおいて、及び大形リーシュマニアに実験的に感染させたマウスにおいて免疫応答の標的であることを示している。我々はさらに、ＬＲＰＥをＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）などのＴｈ１促進アジュバントと同時投与した際に、強力なＴｈ１防御免疫応答が誘導されることを実証している。そのような組成物（Ｔｈ１促進アジュバントと組み合わせたＬＲＰＥ）は、ワクチンとして使用することが非常に魅力的である。本発明を以下さらに説明する。
【０００７】
使用
本発明の第１の態様において、対象において寄生虫疾患を治療又は予防するための医薬品を調製するための、ＲＰＥ及び場合によってＴｈ１促進アジュバントの使用が提供される。
【０００８】
好ましい実施形態において、ＲＰＥは、対象内に存在すると寄生虫疾患を引き起こす寄生虫細胞を用いて、
ａ．寄生虫細胞を溶解緩衝液と混合するステップと、
ｂ．得られた混合物を遠心分離してサイトゾル抽出物を得るステップと、
ｃ．得られたサイトゾル抽出物からＲＰＥを調製するステップと
を行うことにより得られる。
【０００９】
ステップａにおいて、寄生虫は原生動物を指すことが好ましい。好ましい寄生虫は本明細書において後で定義する。原生動物のステージは前鞭毛型であることがより好ましい。所望の量のＲＰＥを調製するためにおよそ必要な寄生虫細胞の量は当業者には公知であろう。一般には、およそ５００マイクログラムのＲＰＥを調製するために、およそ３．１０９個の寄生虫細胞を使用する。溶解緩衝液は、寄生虫細胞の少なくとも一部を壊す緩衝液である。好ましい溶解緩衝液は、非イオン界面活性剤を含む。非イオン界面活性剤としてＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ４０）を用いると良い結果が得られた。しかし、他の非イオン界面活性剤を使用してもよい。下記の溶解緩衝液を使用することが好ましい（緩衝液Ａ）：１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５％のＮＰ４０（Ｒｏｃｈｅ）、並びにＰＭＳＦ １ｍＭ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ ８μｇ／ｍｌ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ ４μｇ／ｍｌ及びＰｅｎｔａｔｉｎ ８μｇ／ｍｌなどのプロテアーゼ阻害剤を補充することが好ましい。適当量の寄生虫細胞（およそ細胞１０９個／緩衝液Ａ１ｍｌ）を、一般には、エッペンドルフピペットを用いて溶解緩衝液と穏やかに混合する。
【００１０】
ステップｂにおいて、ステップａで得られた混合物に対し、遠心分離を４℃で少なくとも１ステップ行う。通常、第１の遠心分離ステップはおよそ３，０００ｇでおよそ２分行う。得られた上澄みを、４℃で、およそ１３，０００ｇでおよそ１５分、１回又は２回再度遠心分離することが好ましい。
【００１１】
ステップｃにおいて、得られた上澄みを（４５）に記載の通りＲＰＥを調製するために使用する。簡単に述べると、得られた上澄みを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬ１００．３ローターを用いて、４℃、およそ９０，０００ｒｐｍでおよそ３０分の高速遠心分離にかける。得られたペレットは粗製のリボソームペレットであり、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＡｃＮＨ４、１００ｍＭのＭｇＣＬ２、５ｍＭのβ−メルカプトエタエノール）に再懸濁させ、緩衝液Ａ中、不連続なショ糖勾配（２０／４０％）で、ＴＬ１００．３ローターを用いて、４℃、およそ９０，０００ｒｐｍで遠心分離する。得られたペレットはリボソームを含む。このペレットを、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に溶解させ、超音波処理し、−７０℃で保存することが好ましい。
【００１２】
リボソームタンパク質は、よく保存されたサイトゾルタンパク質である。したがって、本明細書で定義するＲＰＥは、植物であろうと動物であろうと、哺乳動物、爬虫類、魚類、昆虫類であろうと原生生物などの染色体を持つ他の任意の生物であろうと、任意の真核生物から調製することができる。ＲＰＥは、疾患に近い生物、好ましくは系統樹内の寄生虫疾患を引き起こす生物から得ることが好ましい。したがって、寄生虫疾患の治療に使用されるＲＰＥ源として特に興味深いものは、原生動物、例えばプラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、特にトリパノソーマ科のメンバー、より特定するとトリパノソーマ科の原生生物リーシュマニアの種々の種である。リーシュマニアには２０を超える公知の種があり、大形リーシュマニアを含めた大形リーシュマニアコンプレックス、シャーガスリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）及び幼児リーシュマニアを含めたドノバンリーシュマニアコンプレックス、アマゾンリーシュマニア（Ｌ．ａｍａｚｏｎｅｓｉｓ）及びメキシコリーシュマニア（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）を含めたメキシコリーシュマニアコンプレックスを含むリーシュマニア亜属の種、並びにブラジルリーシュマニア（Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）及びペルーリーシュマニア（Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎａ）を含めたブラジルリーシュマニアコンプレックス及びガイアナリーシュマニア（Ｌ．ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）及びパナマリーシュマニア（Ｌ．ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）を含めたガイアナリーシュマニアコンプレックスを含むビアンニア（Ｖｉａｎｎｉａ）亜種が含まれる。特に興味深いプラスモジウム属の種は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）及び三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）である。好ましい実施形態において、ＲＰＥは、リーシュマニア属の各種から得られ、大形リーシュマニア及び／又は幼児リーシュマニアから得ることが好ましい。他の好ましい実施形態において、ＲＰＥは、プラスモジウム属の各種から得られる。ＲＰＥは、本明細書で確認したいくつかの異なる生物由来のＲＰＥを混合することにより調製してもよいことは当業者に理解されよう。所定のタンパク質を使用する代わりにＲＰＥをワクチンに使用することは、ＲＰＥが異なる抗原を数多く含有するので、非常に魅力的である。これらの抗原はそれぞれ、治療される対象において免疫防御応答を潜在的に誘導し得る。さらに、抗原Ａには応答するが、抗原Ｂには応答しない対象、及びその逆の対象がある。したがって、本明細書で定義するワクチンは、異なる抗原を数多く含有するので、広範囲の対象集団に対して使用することを企図している。好ましい実施形態において、ＲＰＥは、少なくとも１種のリボソームタンパク質及び／又は少なくとも１種のリボソームタンパク質抗原及び／又は少なくとも１種のリボソームタンパク質のタンパク質断片を含む。より好ましい実施形態において、ＲＰＥは、少なくとも２種のリボソームタンパク質及び／又は少なくとも２種のリボソームタンパク質抗原及び／又は少なくとも２種のリボソームタンパク質断片を含む。本明細書で定義するタンパク質断片は、少なくとも２、３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０個又はそれ以上の、リボソームタンパク質に対応する隣接アミノ酸を含むことが好ましい。一実施形態において、本明細書で定義するＲＰＥは、幼児リーシュマニアの酸性リボソームタンパク質Ｐ０及び／又はブラジルリーシュマニア由来のリボソーム抗原ＬｂｅＦ４Ａを含まない、又はそれらからなるものではない。
【００１３】
Ｔｈ１促進アジュバント（例えばＣｐＧ ＯＤＮモチーフを含むアジュバント）は文献（Ｌｉｕ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（２００３），Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８７−６９３）において、所定の抗原（ここではＲＰＥ）と一緒に用いた際に所与の抗原に対するＴｈ１免疫応答を促進又は誘発することができ、その抗原と一緒に培養した際に処理した対象の脾細胞の上澄みから検出されるアジュバントとして定義されている。対照として、抗原及びアジュバントで処理していない、又は抗原でのみで処理した、同一対象の脾細胞集団において、Ｔｈ１免疫応答の促進又は誘発について評価する。Ｔｈ１免疫応答の誘発又は促進は、抗原を用いて処理した対象の脾細胞を培養すること、及び／又は抗原特異的ＩｇＧ２ａ免疫グロブリンの産生を誘導することによって検出されるＩＦＮγの誘導によって定義することが好ましい。このサイトカインの誘導についての評価は、実施例に記載の通り、脾細胞についてのＥＬＩＳＡによって行うことが好ましい。ＩｇＧ２ａの誘導についての評価は、実施例に記載の通り、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットによって行うことが好ましい。脾細胞をＲＰＥ及びアジュバントで刺激するとＩＦＮγ及び／又はＩｇＧ２ａが誘導されることにより、アジュバントがＴｈ１促進アジュバントであると認定されたことが示されることが好ましい。
【００１４】
上記のＴｈ１免疫応答の誘発又は促進についての最初の定義の代わりに、又はそれと組み合わせて、Ｔｈ１免疫応答の誘発又は促進はさらに、Ｔｈ２免疫応答の欠如（又は誘導の欠如）によって定義することができる。Ｔｈ２免疫応答は、非処理の脾細胞と比べて、ＩＬ−４、ＩＬ−１０の誘導が検出可能に増加すること、及び／又は検出可能なＩｇＧ１免疫グロブリンが産生されることを特徴とする。ＩＬ−４及び／又はＩＬ−１０の誘導についての評価は、実施例に記載の通り、脾細胞についてのＥＬＩＳＡによって行うことが好ましい。ＩｇＧ１の誘導についての評価は、実施例に記載の通り、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットによって行うことが好ましい。
【００１５】
上記のＴｈ１免疫応答の誘発又は促進についての最初の２つの定義の代わりに、又はそれと組み合わせて、Ｔｈ１免疫応答の誘発又は促進はさらに、定義済みの抗原、この場合はＲＰＥに対するＩＮＦγ／ＩＬ−１０比及び／又はＩＮＦγ／ＩＬ−４比の増加、及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の減少が生じることによって定義することができる。好ましい実施形態において、これらの３つ以上の比のいずれかが変化する（上記のように増加又は減少する）ことにより、アジュバントがＴｈ１の性質を有することが示される。言及した各サイトカインの誘導についての評価は、実施例に記載の通り、脾細胞についてのＥＬＩＳＡによって行うことが好ましい。免疫グロブリンＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａの誘導についての評価は、実施例に記載の通り、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットによって行うことが好ましい。
【００１６】
好ましい実施形態において、Ｔｈ１促進アジュバントは、オリゴデオキシヌクレオチドである、又はオリゴデオキシヌクレオチドを含む、又はオリゴデオキシヌクレオチドからなる。オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、Ｃがメチル化されていないＣｐＧを含む、又はＣがメチル化されていないＣｐＧからなることがより好ましい（ＣｐＧ ＯＤＮ）：３’プリン−ＣｐＧ−５’ピリミジン。好ましいオリゴデオキシヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾されたＯＤＮ配列を含む、又はホスホロチオエート修飾されたＯＤＮ配列からなる。そのような修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドを使用することは、それゆえに使用されるオリゴデオキシヌクレオチドの方が、修飾されていないオリゴヌクレオチドよりも安定しており、血液系に入っても容易に分解されないので、有利である。好ましいＴｈ１促進アジュバントは、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は少なくとも３つのＣｐＧモチーフからなる、又はそれを含む。免疫刺激ＯＤＮの好ましい配列（５’→３’）は、ＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡ及びＧＣＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴであった。当業者は、本明細書に明示した配列に制限されない。当業者は、他の配列を設計し、引き続いて、その配列について、本明細書で前に定義したＴｈ１を促進する性質について試験することができる。この好ましい同定アジュバントＣｐＧ ＯＤＮは、実施例において、ＬＲＰＥをこのＴｈ１促進アジュバントと一緒に接種することにより、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス及びＣ５７ＢＬ／６系マウスの両方で、大形リーシュマニア寄生虫によるチャレンジに対する防御が誘導されることが実証されたので、非常に魅力的である。どちらのモデルでも、防御はＩＦＮ−γの特異的な産生に相関している。ＢＡＬＢ／ｃでは、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生に対する制限も検出された。
【００１７】
本発明の一つの利点は、広範なスペクトルの寄生虫疾患を治療するための医薬品、すなわち、異種間に特異的な医薬品の調製を可能にすることである。多くの寄生虫疾患において、特定の種に対して作製されたワクチンは、その特定の種に対してしか働かない。その一事例である寄生虫疾患は、リーシュマニア症である。現在のところ、この疾患は薬物により制御されているが、薬物治療では疾患の伝播を予防できず、強い効果がない場合が多い。好ましい実施形態において、寄生虫疾患はリーシュマニア症又はマラリアである。寄生虫疾患が、リーシュマニア属の各種によって、又はプラスモジウム属の各種によって引き起こされるものであることがより好ましい。別の好ましい実施形態において、寄生虫疾患は、ＲＰＥを得る種とは異なる種により引き起こされる。特に、リーシュマニア属の一種により引き起こされるリーシュマニア症は、リーシュマニア属の他の種由来のＲＰＥをベースとする組成物を用いて治療することができる。一実施形態において、大形リーシュマニアにより引き起こされるリーシュマニア症は、幼児リーシュマニア由来のＲＰＥを含む組成物で首尾よく治療される。或いは、マラリアなどの他の寄生虫疾患は、他種のＲＰＥをベースとする組成物、例えば、幼児リーシュマニアのＲＰＥをベースとする組成物で首尾よく治療され得る。
【００１８】
本発明に照らして、対象はヒト又は動物を意味する。本発明の範囲に包含される動物としては、哺乳動物、特にイヌが挙げられる。
【００１９】
好ましい実施形態において、本明細書で定義した医薬品は、感染及び／又は疾患、より好ましくは寄生虫による感染及び／又は寄生虫疾患と戦うための、ヒト又は動物の免疫系の能力を高めるために使用される。特に、ヒト又は動物の対象に投与するために使用され得る。本明細書で定義した医薬品は好ましくは、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、動脈内又は病巣内という経路での注射又は点滴によって投与される。好ましい投与形態は、皮下である。医薬品は、当技術分野で公知の従来技法によって、薬学的に許容される培地又は送達ビヒクルと組み合わせることができる。例えば、ＲＰＥ及び場合によってＴｈ１促進アジュバントをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させることができる。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｄ．ＡＲ Ｇｅｎｎａｒｏ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＰＡ，ＵＳＡを含めたさまざまなソースに、より詳細が記載されている。医薬品は、治療有効用量、すなわち、本明細書で定義した感染及び／又は疾患と戦うために、ヒト又は動物の免疫系の能力を高める用量を投与することが好ましい。治療有効用量の本発明の医薬品により、真皮損傷の発生が予防及び／若しくは遅延され、かつ／又は耳及び／若しくは流入領域リンパ節（ＤＬＮ）における寄生虫負荷量の有意な縮小が誘導されることが好ましい。真皮損傷の存在についての評価は、図６の説明文に記載している。寄生虫負荷量についての評価は、実施例に記載している。治療有効用量の本発明の医薬品により、最初に本発明の組成物を用いた１回のワクチン接種、続いて逐次的な１回の寄生虫による感染、及びおよそ±６週間の待機時間を含む期間の後に、真皮損傷の発生が予防されることが好ましく、及び／又は耳において寄生虫負荷量のおよそ３桁の縮小及び／又はＤＬＮにおいて寄生虫負荷量のおよそ同様の桁の縮小が誘導されることが好ましい。好ましい実施形態において、本明細書で定義した医薬品はワクチンである。より好ましい実施形態において、少なくとも１２μｇのＲＰＥがワクチンに使用される。さらに好ましい実施形態において、免疫応答をもたらすために少なくとも１２〜２０μｇのＲＰＥを、場合によって少なくとも５０μｇの、例えばＣｐＧ ＯＤＮなどのＴｈ１促進アジュバントと組み合わせて使用する必要がある。本明細書で定義したワクチンは、予防ワクチン又は治療ワクチンであってよい。溶解させることができるＲＰＥ及び場合によってＴｈ１促進アジュバントの体積は１００〜５００マイクロリットルで変動してよい。
【００２０】
組成物
別の態様において、ＲＰＥ及び場合によってＴｈ１促進アジュバントを含む組成物が提供される。ＲＰＥ及びＴｈ１促進アジュバントは、本明細書ですでに定義した。好ましい実施形態において、組成物は、ＲＰＥ及びＴｈ１促進アジュバントからなる。好ましいＴｈ１促進アジュバントはＣｐＧ ＯＤＮである。好ましい組成物は、ＰＢＳに溶解させたＲＰＥ及び場合によってＴｈ１促進アジュバントを含む、又はそれらからなる。別の好ましい実施形態において、ＲＰＥ及びＴｈ１促進アジュバントを逐次的に投与することも本発明に包含される。したがって、その両方が対象に投与される限り、両成分が物理的に１つの単一組成物中に存在する必要はない。
【００２１】
そのような組成物は、薬学的に許容できるアジュバント及び／又は担体をさらに含む。
【００２２】
そのような組成物は、医薬品用であることが好ましい。その医薬品は、ワクチンであることが好ましい。医薬品及びワクチンは、本明細書ですでに広範に定義した。
【００２３】
方法
他の態様において、本発明は、全て本明細書で定義した、寄生虫疾患を予防及び／若しくは治療し、かつ／又は寄生虫疾患の進行を遅延させ、かつ／又は真皮損傷の発生を予防及び／又は遅延させ、かつ／又は耳及び／若しくは流入領域リンパ節（ＤＬＮ）において寄生虫負荷量の有意な縮小を誘導する方法を提供する。本方法において、本発明のワクチンは治療ワクチンとして機能する。一般には、感染と疾患発症の間には期間がある。この場合、ワクチンは、宿主において感染の病理学的影響を中和する免疫応答を引き出すことにより、疾患を予防及び／若しくは治療し、かつ／又は疾患の進行を遅延させる薬理学的免疫産物として作用する。治療ワクチンは、すでに感染又は疾患発症している患者において防御を誘導するという点において、予防ワクチンとは異なる。
【００２４】
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む」という動詞及びその活用は、その言葉に続く項目が含まれるが、特に言及していない項目が除外されるのではないことを指す非限定的な意味で使用している。さらに「からなる」という動詞は、「から本質的になる」と置き換えることができ、本明細書で定義した産物又は組成物又は保存混合物が、特に言及した成分と違う追加の成分（単数又は複数）を含んでよく、前記追加の成分（単数又は複数）は、本発明の独特な特性を変化させないことを意味する。
【００２５】
さらに、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」により要素を参照することは、前後関係からその要素が唯一であることが明らかに必要とされているのでなければ、その要素が２つ以上存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は通常「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ（少なくとも１つの）」を意味する。
【００２６】
本明細書に引用した全ての特許文献及び非特許文献は、参照により全体として本明細書に完全に組み込まれている。
【００２７】
本発明を以下の実施例によりさらに例証し、それにより本発明の範囲が限定されると解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】（Ａ）幼児リーシュマニアのリボソームタンパク質を、直線的な１０〜１４％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ニトロセルロースブロットに転写し、健康なイヌの血清（レーン１〜３）及びＶＣＬに罹患しているイヌ由来の血清（レーン４〜１３）と一緒にインキュベートした。血清は２００倍希釈で利用した。二次試薬として、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗イヌＩｇＧ抗体を使用した（Ｂ〜Ｅ）。ＢＡＬＢ／ｃマウス４匹について、大形リーシュマニアの静止期前鞭毛型５×１０４個を左足蹠において皮下感染させ、チャレンジの８週間後に血清を得た。Ｃ５７ＢＬ／６マウス４匹について、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型３００個を耳真皮において皮内感染させ、チャレンジの１４週間後に血清を得た。両系統の感染前の結成についても、寄生虫によるチャレンジの前に得た。（Ｂ）大形リーシュマニアのリボソームタンパク質を、直線的な１０〜１４％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ニトロセルロースブロットに転写し、感染させたＢＡＬＢ／ｃマウス又はＣ５７ＢＬ／６マウス由来の保存血清と一緒にインキュベートした。血清は２００倍希釈で利用した。感染前の血清でＬＲＰに対する反応性を示したものはなかった（示さず）（Ｃ）両系統のマウスにおけるＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２ａ抗体のＬＲＰに対する抗体価をＥＬＩＳＡによって個々に決定した。（Ｄ）感染の８週間後にＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させ、その膝窩部ＤＬＮ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、大形リーシュマニアＬＲＰ１２μｇ／ｍｌの存在下で又は培地のみで４８時間培養した。培養物の上澄みについてＥＬＩＳＡを行い、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０のレベルを評価した。（Ｅ）感染の１４週間後にＣ５７ＢＬ／６マウスを安楽死させ、その上顎後方のＤＬＮをＤと同様に処理した。
【図２】（Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて誘導される特異的な体液性応答の分析。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり６匹）について、大形リーシュマニアのリボソームタンパク質単独（ＬＲＰ）、又はそれにＣｐＧ ＯＤＮアジュバントを加えたもの（ＬＲＰ＋ＣｐＧ）を用いて、ＣｐＧ ＯＤＮアジュバント単独（ＣｐＧ）を用いて、又はＰＢＳ（生理食塩水）を用いて、右足蹠において３回皮下免疫した。３回目の免疫の１４週間後、マウスから血を抜き、血清についてＥＬＩＳＡを行い、ＩｇＧ１アイソタイプ（黒い棒線）及びＩｇＧ２ａアイソタイプ（白い棒線）の両方の特異的な抗ＬＲＰ抗体応答について評価した。免疫前の血清で反応性を示したものはなかった。（Ｂ〜Ｄ）ワクチン接種の４週間後、マウスを安楽死させ、その脾臓を得、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ＬＲＰの存在下で（灰色の棒線）又は培地のみで（黒い棒線）４８時間培養した。培養物の上澄みについてＥＬＩＳＡを行い、ＩＦＮ−γ（Ｂ）、ＩＬ−４（Ｃ）及びＩＬ−１０（Ｄ）のレベルを評価した。
【図３】（Ａ）ワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける大形リーシュマニア感染の経過。マウス（１群当たり６匹）を、図２に示したように皮下免疫した。最後の免疫の１カ月後、動物について、大形リーシュマニアの静止期前鞭毛型５×１０４個を左後部足蹠において感染させた。足蹠の腫大は、感染した足蹠と感染していない反対側の足蹠との厚さの違いとして得られる。結果は、２つの独立した実験についての平均及び標準偏差を表す。＊ チャレンジの８週間後の、ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウス群における炎症対ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウス群における炎症のＰ＜０．００１の有意差。（Ｂ）感染の８週間後、感染させた脚の膝窩部ＤＬＮ及び脾臓における生存可能な寄生虫の数を、個々に限界希釈法により決定した。結果は、２つの独立した実験についての平均及び標準偏差を表す。＊ チャレンジの８週間後の、ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウス群における寄生虫の体内総量対ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウス群における寄生虫の体内総量のＰ＜０．００１の有意差。（Ｃ〜Ｄ）ワクチン接種したマウス及び感染させたマウスにおけるサイトカイン産生を、大形リーシュマニアによるチャレンジの８週間後に決定した。感染した脚の膝窩部ＤＬＮを得、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ＳＬＡの存在下で（白い棒線）、ＬＲＰの存在下で（灰色の棒線）又は培地単独で（黒い棒線）４８時間培養した。培養物の上澄みについてＥＬＩＳＡを行い、ＩＬ−４（Ｃ）、ＩＬ−１０（Ｄ）、及びＩＦＮγ（Ｅ）のレベルを試験した。この実験では同様の結果が繰り返された。（Ｆ）ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種によって与えられた防御に付随するＩＦＮγ産生におけるＩＬ−１２及びＴ細胞の関与の分析。大形リーシュマニアの静止期前鞭毛型５×１０４個でチャレンジした８週間後、ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種したマウス（黒い棒線）及びＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種したマウス（白い棒線）の膝窩部ＬＮを得、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体のいずれか、及び対照モノクローナル抗体の存在下で、ＬＲＰを用いて培養して刺激した。７８時間インキュベーションした後、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγのレベルを評価した。抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いた処理と対照抗体を用いた処理とにおけるＩＦＮγ産生の差は、統計学的に有意であった（＊Ｐ＜０．０５）。データは、同様の結果であった２つの独立した実験の代表的な実験に対応する。
【図４】ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ極性化の分析。（Ａ）チャレンジの８週間後、血清試料を得、ＬＲＰに対するＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２ａ抗体の抗体価を、個々にＥＬＩＳＡにより決定した。ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種したマウスと他の３群とにおけるＩｇＧ１抗体価の差は、統計学的に有意であった（＊Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）大形リーシュマニアのＬＲＰを、直線的な１０〜１４％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロースブロットに転写し、表示したマウス群由来の２００倍希釈した保存血清と一緒にインキュベートした。ＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ２ａアイソタイプ両方の抗体応答を示す。（Ｃ）同じ血清を利用して、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのＳＬＡに対する抗体価を決定した。ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種したマウスと他の３群とにおけるＩｇＧ１抗体価の差は、統計学的に有意であった（＊Ｐ＜０．０２）。
【図５】ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹について、図３に示したように左足蹠においてＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種し、感染させた。最初の寄生虫によるチャレンジの１８週間後、マウスについて、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型３００個を用いて耳の皮内に再感染させた。対照として、無処置のマウス６匹についても耳の皮内にチャレンジした。（Ａ）防御させ、再感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける大形リーシュマニアの感染経過。値は、平均損傷直径＋標準偏差（ＳＤ）を表す。＊ チャレンジの７週間後の、再感染させたマウスにおける炎症対対照の感染させたマウスにおける炎症のＰ＜０．０００１の有意差。（Ｂ）再感染の７週間後、マウスを安楽死させ、耳真皮、脾臓及び局所ＤＬＮにおける寄生虫の生体内総量を、個々に定量化した。結果は、１２匹分の耳及びＤＬＮの平均±ＳＤとして表す。＊ 再感染させたマウス対感染させた対照マウスのＰ＜０．００１の有意な減少。（Ｃ）安楽死させた後、対照マウス由来（黒い棒線）及び再感染させたマウス由来（白い棒線）の上顎後方のＤＬＮを得、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ＳＬＡの存在下で、ＬＲＰの存在下で又は培地単独で４８時間培養した。培養液の上澄みについてＥＬＩＳＡを行うことにより、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、及びＩＬ−１０のレベルを評価した。（Ｄ〜Ｅ）再チャレンジした７週間後、血清試料を得、ＬＲＰ（Ｄ）及びＳＬＡ（Ｅ）に対するＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２ａ抗体の抗体価を、個々にＥＬＩＳＡにより決定した。
【図６】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける大形リーシュマニアの感染に対する防御。マウス（１群当たり６匹）について、ＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮを３回用いて、及びＣｐＧ ＯＤＮを単独で用いて、右足蹠において皮下免疫した。（Ａ）ワクチン接種したＣ５７ＢＬ７６マウスの脾細胞によるＩＮＦ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生。ＣｐＧ ＯＤＮ（黒い棒線）又はＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮ（白い棒線）を用いてワクチン接種した４週間後、マウスを安楽死させ、その脾臓を得てｉｎ ｖｉｔｒｏ、ＬＲＰの存在下又は培地単独で４８時間培養した。培養物の上澄みについてＥＬＩＳＡを行うことにより、サイトカインのレベルを評価した。（Ｂ）ワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける大形リーシュマニアの感染経過。１群当たり１２匹のマウスを上記の通り免疫し、最後の接種の４週間後、マウスについて、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型３００個を耳の皮内に接種することにより感染させた。値は、平均損傷直径＋標準偏差（ＳＤ）を表す。＊ ２つのマウス群間の炎症のＰ＜０．００１の有意な減少。（Ｃ）感染の５週間後（１群当たり６匹）及び感染の１３週間後（１群当たり６匹）に定量した、ＣｐＧ ＯＤＮ（黒い棒線）又はＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮ（白い棒線）を用いてワクチン接種したマウス由来の耳真皮及び局所ＤＬＮにおける、寄生虫の生体内総量。結果は、１２匹分の耳及びＤＬＮの平均±ＳＤを表す。＊ 両マウス群間のＰ＜０．０１の有意な減少。（Ｄ〜Ｅ）ＣｐＧ（黒い棒線）又はＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮ（白い棒線）を用いてワクチン接種したマウスにおけるＩＦＮ−γの産生。感染させた５週間後、上顎後方の細胞を得、ＳＬＡの存在下で、ＬＲＰの存在下で及び培地単独（Ｄ）で培養し刺激した、又は抗ＩＬ−１２抗体、抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体及び対照のモノクローナル抗体の存在下でＬＲＰを用いて刺激した。７８時間インキュベーションした後、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γのレベルを評価した。抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いた処理と対照抗体を用いた処理とにおけるＩＦＮ−γ産生の差は、統計学的に有意であった（＊Ｐ＜０．０１）。（Ｆ）チャレンジした５週間後及び１３週間後に血清試料を得、ＬＲＰに対するＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２ａ抗体の抗体価を、個々にＥＬＩＳＡにより決定した。（Ｇ）ＣｐＧ ＯＤＮ（黒い棒線）又はＬＲＰ＋ＣｐＧ ＯＤＮ（白い棒線）を用いてワクチン接種したマウスにおけるＩＬ−１０産生。感染させた５週間後、上顎後方の細胞を得、ＳＬＡの存在下で、ＬＲＰの存在下で又は培地単独で培養し刺激した。７８時間インキュベーションした後、ＩＬ−１０のレベルをＥＬＩＳＡにより評価した。
【実施例】
【００２９】
材料と方法
マウス系及び寄生虫
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは実験開始時に６〜８週齢であり、Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ Ｓ．Ａ．（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）から購入した。大形リーシュマニア寄生虫（クローンＷＨＯＭ／ＩＲ／−１７３）及びクローンＶ１（ＭＨＯＭ／ＩＬ／８０（Ｆｒｉｅｄｌｉｎ）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスで継代することにより毒性の状態に保った。大形リーシュマニアの無鞭毛型を膝窩部流入領域リンパ節（ＤＬＮ）から得、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したシュナイダー培地（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）中、２６℃で、それらが後期静止期に達するまで培養することにより、前鞭毛型に変換させた。両方のクローンの前鞭毛型を、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したシュナイダー培地（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）中、２６℃で培養した。大形リーシュマニア（クローンＶ１）の感染性ステージの前鞭毛型（発育終末）を、ピーナッツ凝集素（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ．）を用いたネガティブ選択によって静置培地から単離した。幼児リーシュマニア（ＭＣＡＮ／ＥＳ／９６／ＢＣＮ／１５０，ＭＯＮ−１）の前鞭毛型を、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）中、２６℃で培養した。
【００３０】
ＣｐＧ ＯＤＮ及びリーシュマニア抗原
リーシュマニアのリボソームタンパク質抽出物（ＬＲＰ）を調製するために、大形リーシュマニア及び幼児リーシュマニアの前鞭毛型を採取し、予備冷却したＰＢＳで２回洗浄し、ＮＰ４０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＧｍｂＨ，Ｍａｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎ．１１３３２４７３００１）１ｍｌを含む溶解緩衝液（１０ｍＭのトリスＣｌＨ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５％ＮＰ４０、ＰＭＳＦ １ｍＭ、Ｌｅｏｐｅｐｔｉｎ ８μｇ／ｍｌ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ ４μｇ／ｍｌ及びＰｅｎｔａｔｉｎ ８μｇ／ｍｌ）に再懸濁させ、１０回上下にピペッティングした。溶解後、試料を４℃、３，０００×ｇで２分微量遠心し、核をペレット化した。上澄みを２回、４℃、１３，０００×ｇで１５分微量遠心し、（４５）に記載の通りサイトゾル上澄みからリボソームを調製した。簡単に述べると、サイトゾルを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬ１００．３ローターを用いて、４℃、９０，０００ｒｐｍで３０分の高速遠心分離にかけた。粗製のリボソームペレットを緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＡｃＮＨ４、１００ｍＭのＭｇＣＬ２、５ｍＭのβ−メルカプトエタエノール）に再懸濁させ、緩衝液Ａ中、不連続なショ糖勾配（２０／４０％）で、ＴＬ１００．３ローターを用いて、４℃、９０，０００ｒｐｍで遠心分離した。洗浄したリボソームのペレットをＰＢＳに溶解させ、超音波処理し、−７０℃で保管した。
【００３１】
大形リーシュマニアの全タンパク質（可溶性リーシュマニア抗原［ＳＬＡ］）を、ＰＢＳに懸濁させた大形リーシュマニアの静止期前鞭毛型を冷凍し解凍するサイクルを３回行うことにより調製した。細胞の溶解後、微量遠心を用いて１２，０００ｇで１５分遠心分離することにより、可溶性抗原を不溶性画分から分離し、−７０℃で保管した。ＣｐＧモチーフを含むホスホロチオエート修飾されたＯＤＮ配列（ＣｐＧ ＯＤＮ）を、Ｉｓｏｇｅｎ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により合成した。免疫賦活性ＯＤＮの配列（５’→３’）は、ＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡ及びＧＣＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴであった。
【００３２】
免疫化及び寄生虫チャレンジ
ＢＡＬＢ／ｃマウスについて、大形リーシュマニア１２μｇを単独で、又は大形リーシュマニア１２μｇとＣｐＧ ＯＤＮ５０μｇ（各免疫賦活性ＯＤＮを２５μｇずつ）を、ＣｐＧ ＯＤＮ（５０μｇ）アジュバントを単独で、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を、右足蹠において皮下（ｓ．ｃ．）接種した。各群について、同じレジメンを用いて２週間後及び４週間後に追加免疫した。最初の寄生虫によるチャレンジは、最後の接種の４週間後に、大形リーシュマニアの静止期前鞭毛型（クローンＷＨＯＭ／ＩＲ／−１７３）５×１０４個を、左の（未処置の）足蹠に皮下接種することにより行った。感染の進行を、決定用カリパスを用いて厚さを測定することにより追跡した。各動物の反対側の足蹠が対照値を表し、腫大を以下の通り計算した：左足蹠の厚さ−右足蹠の厚さ。損傷が壊死性になった時に動物を安楽死させた。再感染させるために、ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹について、上記の通りワクチン接種し感染させた。１８週間後、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型（クローンＶ１）３００個を各マウスの両耳真皮に注射した。感染の進展を、決定用カリパスを用いて耳の損傷の硬結の直径を測定することによりモニターした。対照として、無処置のＢＡＬＢ／ｃマウス６匹の群についても、耳真皮において感染させた。
【００３３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスについて、大形リーシュマニアＬＲＰ１２μｇ＋ＣｐＧ ＯＤＮ５０μｇ（各免疫賦活性ＯＤＮを２５μｇずつ）、及びＣｐＧ ＯＤＮ（５０μｇ）アジュバント５０μｇを単独で、足蹠に皮下注射した。これらのマウスについて、同じ免疫化レジメンを用いて２週間後及び４週間後に追加免疫した。最後の接種の４週間後に、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型（クローンＶ１）３００個を、マウスの両耳真皮に皮内（ｉ．ｄ．）接種することによって感染を行った。感染の進展を、決定用カリパスを用いて耳の損傷の硬結の直径を測定することによりモニターした。
【００３４】
寄生虫の量子化
耳において、限界希釈アッセイ（６）により寄生虫の数を決定した。簡単に述べると、感染させたマウスから耳を回収した。感染させた耳の腹側及び背側のシートを分離した。耳のシートを、Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＣＩ酵素ブレンド（５０μｇ／ｍｌ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）に沈着させた。３７℃で２時間インキュベートした後、組織を小片に切断し、ホモジナイズし、細胞ろ過器（孔サイズ７０μｍ）を用いてろ過した。ホモジナイズした組織を、２０％ＦＣＳを加えたシュナイダー培地（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）を含有する９６ウェルの平底マイクロタイタープレート中に連続的に希釈した。生存可能な寄生虫の数を、前鞭毛型が２６℃でインキュベートして最大７日まで成長でき得る最大希釈から決定した。寄生虫の数は、感染させた耳（上顎後方）及び足蹠（膝窩部）の局所流入領域リンパ節（ＤＬＮ）において、及び脾臓においても決定した。器官を回収し、機械的に切り離し、次いで上記の通り連続的に希釈した。寄生虫の負荷量は、全器官における寄生虫の数として表される。
【００３５】
上澄み中のサイトカインの測定
脾臓及び対応する局所ＤＬＮを無菌的に取り出し、機械的に切り離し、完全なＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、及び１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０）に播種した。ＬＲＰ（１２μｇ／ｍｌ）又はＳＬＡ（１２μｇ／ｍｌ）の存在下、３７℃で４８時間の間に、４８ウェルプレートに細胞５×１０６個／ｍｌを播種した。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）により、脾細胞及びＤＬＮ細胞の上澄みについて、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０及びＩＬ−４の放出を測定した。一部の例では、ＬＲＰ１２μ／ｍｌで刺激したＤＬＮ細胞を、マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）、マウスＩＬ−１２（Ｃ１７．８）、マウスＣＤ８（５３−６．７）のいずれかに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１０μｇ／ｍｌの存在下でインキュベートした。適切なアイソタイプ整合対照についてもこのアッセイで分析した。抗体（ｎｏ ａｚｉｄｅ／ｌｏｗ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ（商標））は、ＢＤ）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）から購入した。
【００３６】
体液性応答の分析
ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにより、ＬＲＰ又はＳＬＡに対する特異的な抗体について血清試料を分析した。簡単に述べると、標準のＥＬＩＳＡプレートを、１００μｌのＬＲＰ（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）又はＳＬＡ（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）を用いて室温で一晩コーティングした。抗体価を、血清を連続的に希釈することにより決定し、吸光度＞０．２を生じる最大の血清希釈力価の逆数として定義した。アイソタイプ特異的な分析を、以下の西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗マウス免疫グロブリン（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）：抗ＩｇＧ１（１／１０００）及び抗ＩｇＧ２ａ（１／５００）を用いて行った。オルトフェニレンジアミンジヒドロクロライド−ＯＰＤ−（Ｄａｋｏ，Ａ／Ｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）をＥＬＩＳＡアッセイのペルオキシダーゼの基質として使用した。１５分後、１ＭのＨ２ＳＯ４１００μｌを加えることにより反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【００３７】
ウェスタンブロット分析のために、幼児リーシュマニア及び大形リーシュマニアのリボソームタンパク質を得、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）に転写した。対照のイヌ、ＶＣＬリーシュマニア症に罹患しているイヌの血清、又は本研究において示した希釈で利用した種々のマウス群由来の血清を用いてブロットを探索した。二次抗体として、Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした、抗マウス抗ＩｇＧ（１／１０００）、抗ＩｇＧ１（１／１０００）、抗ＩｇＧ２ａ（１／５００）免疫グロブリン、及び抗イヌ抗ＩｇＧ（１／２０００）を使用した。
【００３８】
統計分析
統計分析はスチューデントｔ検定により行った。Ｐ＜０．０５である場合に有意差があるとみなした。
【００３９】
結果
感染の間のＬＲＰの抗原性
リーシュマニアのリボソームタンパク質（ＬＲＰ）の抗原性を分析するために、幼児リーシュマニアに自然感染したイヌ由来の血清の幼児リーシュマニアＬＲＰに対する応答性を、ウェスタンブロットによりアッセイした。活動性疾患に罹患しているイヌ由来の血清が、ＬＲＰ抽出物中の多数のタンパク質バンドを認識したことが観察された（図１Ａ）。大形リーシュマニアに実験的に感染させたＣ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃマウス由来の血清も、大形リーシュマニアＬＲＰ中の多くのタンパク質バンドを認識し、ＢＡＬＢ／ｃ感受性マウス由来の血清に存在するＩｇＧ抗体によって認識されるリボソームタンパク質の数の方が、Ｃ５７ＢＬ／６耐性マウスの血清中のＩｇＧ抗体によって認識されるタンパク質の数よりも多い（図１Ｂ）。
【００４０】
ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体の誘導は、Ｔｈ２型免疫応答及びＴｈ１型免疫応答のマーカーとして使用することができるので（８）、我々は、大形リーシュマニアに感染させたマウスにおいてＬＲＰに対するＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ極性化の分析を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、抗ＬＲＰ応答はＩｇＧ１アイソタイプが優勢であったのに対し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、抗ＬＲＰ応答はＩｇＧ２ａアイソタイプが優勢であった（図１Ｃ）。両方のマウス系統において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＲＰを用いてＤＬＮ細胞を刺激した後のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生についても決定した。ＣＬに罹患しているＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＬＲＰ特異的なＩＦＮ−γの産生が検出されたが、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生も強力に刺激され、ＩＮＦ−γ／ＩＬ−４比は約２．４、ＩＮＦ−γ／ＩＬ−１０比は約１．４になっている（図１Ｄ）。一方、治癒したＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＤＬＮ細胞をＬＲＰで刺激した場合、ＩＬ−４は検出されず（＜７．５ｐｇ／ｍｌ）、高ＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０比（約１５）が得られた（図１Ｅ）。
【００４１】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬＲＰの免疫原性
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、リボソームタンパク質をＣｐＧ ＯＤＮの非存在下及び存在下で投与した後のＬＲＰに対する免疫応答を調べた。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種後、抗ＬＲＰＥ体液性応答はＩｇＧ２ａアイソタイプが優勢であったのに対し、ＬＲＰＥ単独で免疫したマウス由来の血清では検出されたＩｇＧ１アイソタイプの抗体の抗体価は低かった（図２Ａ）。ＬＲＰＥ＋ＧｐＧ ＯＤＮで免疫したマウス由来の脾臓細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＲＰＥを用いて刺激した後、その細胞から分泌されたＩＦＮ−γのレベルは、対照マウス由来の脾臓細胞及びＬＲＰＥ単独で免疫したマウス由来の脾臓細胞から分泌されたものよりも高かった（図２Ｂ）。いずれの群においても、ＬＲＰＥによる刺激後にＩＬ−４産生の増加は見られなかった（図２Ｃ）。著しいことに、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種した脾臓から確立した培養物の上澄みにおいて、特異的なＩＬ−１０が検出され、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０比は約４０であった（図２Ｄ）。全体として、これらの結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、アジュバント無しで投与したＬＲＰＥからは、これらの抗体に対してほんの弱いＩｇＧ１体液性応答しか誘導されないが、ＣｐＧ ＯＤＮと同時投与すると、これらの抗原に対してＴｈ１様応答が増強されることを実証している。
【００４２】
ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種は大形リーシュマニアのチャレンジからＢＡＬＢ／ｃマウスを防御する
抗原に関連した疾患に誘導されるＴｈ２応答をＴｈ１応答に転送することは、リーシュマニアに対するワクチンを開発するための有望なアプローチ法であると考えられているので（７）、我々は、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種によって大形リーシュマニア感染に対する防御を誘導することができるかどうかを分析した。図３Ａは、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＮＤをワクチン接種したマウスの足蹠の腫大が、対照マウス及びＬＲＰＥ単独でワクチン接種したマウスの足蹠の腫大（平均値約５．５ｍｍ）と比較して縮小されているので（８週目の平均値０．７ｍｍ）、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＮＤによって効果的な防御が誘導されることを示している。我々は次に、マウスの４群について、膝窩部ＤＬＮ及び脾臓における寄生虫の負荷量を分析した。ＬＲＰＥ−ＣｐＧで免疫したマウス由来のＤＬＮでは、他の群と比べて、約３ｌｏｇの寄生虫の生体内総量の縮小が見られた。さらに、対照マウス及びＬＲＰＥ単独で免疫したマウスの脾臓では同様の寄生虫の負荷量が見られた一方、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウスの脾臓では寄生虫が検出できなかった（図３Ｂ）。
【００４３】
ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮに誘導される防御に関連する免疫学的パラメーターを決定するために、ＳＬＡ主導又はＬＲＰＥ主導のＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの産生をアッセイした。ＳＬＡ特異的又はＬＲＰＥ特異的に誘導されたＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生は、対照マウス（生理食塩水及びＣｐＧ）由来のＤＬＮ細胞及びＬＲＰＥ単独で免疫したマウス由来のＤＬＮ細胞において検出された（図３Ｃ〜Ｄ）。一方、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いて免疫したマウス由来のＤＬＮ細胞が産生したＩＦＮ−γの量は、他の３群で検出されたＩＦＮ−γの量よりも多かった（図３Ｅ）。ＬＲＰＥに特異的なＩＦＮ−γ産生に対するＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の寄与及びＩＬ−１２への依存についても分析した。図３Ｆに示されるように、ＩＦＮ−γの産生は、抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体又は抗ＣＤ４モノクローナル抗体により完全に阻害された。ＤＬＮ細胞培養物への抗ＣＤ８抗体の添加により、上澄み中のサイトカインの量が一部だけ縮小した。
【００４４】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、疾患の進行に付随してＩＬ−４に依存した高抗体価の抗体が産生されることから、我々は、感染の８週間後に、ＬＲＰＥに対して引き出される体液性応答をＥＬＩＳＡによって分析した。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いて免疫したマウスにおいて寄生虫のチャレンジによって引き出された、ＬＲＰＥに対する抗体は、主にＩｇＧ２ａアイソタイプであった。また、防御マウスの血清に存在するＩｇＧ１アイソタイプの抗ＬＲＰＥ抗体の抗体価は、ＬＲＰＥ単独で免疫したマウス及び２つの対照群と比較して低かった（図４Ａ）。ＬＲＰＥに対するＩｇＧ１抗体価の縮小は、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウスの血清由来のＩｇＧ１抗体に認識されるリボソームタンパク質バンドの数の減少と相関した。図４Ｂに示されるように、ＬＲＰＥウェスタンブロットにおいて、生理食塩水、ＣｐＧ又はＬＲＰＥ単独で免疫したマウスの血清由来のＩｇＧ１アイソタイプ抗体によって多くの数のタンパク質バンドが認識されたのに対して、防御マウスのＩｇＧ１抗体によって認識されたバンドはわずかであった。ウェスタンブロット分析により、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウス由来の血清中のＩｇＧ２ａ抗体によって認識されるタンパク質バンドの数は、他の３群と比較して増加しなかったことも示された（図４Ｂ）。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種によって、大形リーシュマニアの感染によって誘導される広域の抗リーシュマニア体液性応答も調整された。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いて免疫したマウスにおいて寄生虫のチャレンジによって引き出されたＳＬＡに対する抗体は、主にＩｇＧ２ａアイソタイプであり、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体の抗ＳＬＡ抗体価は、他の３群において検出されたものより有意に低かった（図４Ｃ）。
【００４５】
ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種し、感染させたマウスは耳真皮における大形リーシュマニアの再感染に対して耐性である
ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種し、感染させたマウスが、２回目の寄生虫によるチャレンジを制御できるかどうかを決定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹について、上記の通り足蹠においてワクチン接種し、感染させた。これらのマウス群の足蹠の腫大は、１８週間の間＜０．７ｍｍであった（データは示さず）。次に、これらの防御マウスについて、大形リーシュマニアの発育終末前鞭毛型３００個を用いて、耳真皮において再感染させた。無処置のマウス６匹の対照群についても感染させた。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種し、再感染させたマウスでは病変が見られなかったのに対し、対照マウスでは、７週目に開存性の耳損傷が発生したので、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種し、再感染させたマウスは真皮損傷の発生を防御することが観察された（図５Ａ）。耳真皮及び上顎後方のＤＬＮにおける寄生虫の負荷量も、２群間で有意差があった（図５Ｂ）。ワクチン接種し、再感染させたマウスの耳及びＤＬＮにおける寄生虫の負荷量の低さは、脾臓に寄生虫が存在しないことと相関する。再感染後に起こる細胞性応答について知るために、ＬＲＰＥ又はＳＬＡを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激後の上顎後方のＤＬＮ細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、及びＩＬ−１０の分泌について分析した（図５Ｃ）。対照マウスでは、マウスを足蹠において感染させた際にも起こるのと同様（３Ｃ〜Ｅ）、ＩＦＮ−γの特異的産生が検出されたが、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の産生も強力に刺激された。一方、ワクチン接種し、再感染させたマウスのＤＬＮ細胞は、特異的ＩＦＮ−γを多量に産生し、ＩＬ−４及びＩＬ−１０はほとんど検出されなかった（図５Ｃ）。これに一致して、ＬＲＰＥ（図５Ｄ）及びＳＬＡ（図５Ｅ）に対するＩｇＧ体液性応答は、ＩｇＧ２ａアイソタイプによるものであった。
【００４６】
ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける大形リーシュマニアのチャレンジに起因する真皮の病変に対する防御を付与する
ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種すると、大形リーシュマニアの感染に対し、ＬＲＰＥに対するＴｈ２免疫応答がＴｈ１免疫応答へ転送されることにより防御が起こることから、我々は、このワクチンを、リーシュマニア抗原に対して自然にＴｈ１応答を生じるモデルであるＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した効果を分析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群を、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮで３回免疫し、対照マウスはＣｐＧ ＯＤＮアジュバントのみを受けさせた。接種により、ＬＲＰＥを用いて刺激した脾臓細胞培養物の上澄みにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−γ産生によって実証されたＴｈ１応答が誘導された。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウスから確立した脾臓細胞培養物の上澄みにおいて、特異的なＩＬ−１０の存在も検出されたのに対し、刺激後に特異的なＩＬ−４産生は観察されなかった（図６Ａ）。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮをワクチン接種したマウスは、病変がほとんど又は全く観察されなかったので、真皮損傷の発生を防御した（図６Ｂ）。ＣｐＧ ＯＤＮで免疫したマウスでは損傷が発生し、７週目でピークに達し、１３週目にほとんど完全に治癒した。このモデルでは、感染部位における寄生虫の数が、損傷の発生の直前にピークに達するので（５）、我々は、５週目に耳及び局所ＤＬＮ（上顎後方）における寄生虫の負荷量を決定した。ワクチン接種したマウスの耳真皮における寄生虫の数は、約３００分の１に（ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮマウスでは寄生虫１．０×１０４個、ＣｐＧ−ＯＤＮで免疫したマウスでは寄生虫３．０×１０６個）及びＤＬＮマウスでは約４０分の１に（ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮマウスでは寄生虫５．０×１０４個、ＣｐＧ ＯＤＮマウスでは寄生虫２．０×１０４個）縮小した。治癒後、対照マウスでは（チャレンジの１３週間後）、全ての群において寄生虫の数の縮小が観察された。
【００４７】
防御に関連する免疫学的パラメーターを決定するために、抗原主導のＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの産生をアッセイした。チャレンジの５週間後、ＤＬＮ細胞の培養物を確立し、ＬＲＰＥ又はＳＬＡを用いて刺激した。図６Ｄに示される通り、ワクチン接種したマウス由来の細胞の方が、対照マウス由来の細胞よりも多くのＳＬＡ特異的及びＬＲＰＥ特異的なＩＦＮ−γを産生した。ＬＲＰＥに特異的なＩＦＮ−γ産生に対するＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の寄与及びＩＬ−１２への依存についても分析した。ＩＦＮ−γの分泌は、抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体又は抗ＣＤ４モノクローナル抗体により完全に阻害された。抗ＣＤ８抗体での処理では、このサイトカインの量は一部だけ縮小した。これらのデータにより、Ｃ５７ＢＬ／６において、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種により、ＬＲＰＥに対する早期の特異的Ｔｈ１応答の誘導と相関する、皮膚及び局所ＤＬＮにおける病変及び寄生虫の生体内総量の縮小が誘導されることが実証された。これに一致して、対照マウスに対してワクチン接種したマウスにおいてＩｇＧ２ａ特異的な抗ＬＲＰＥ抗体が早く、高抗体価で検出された（図６Ｆ）。我々は、ＳＬＡ抗原特異的又はＬＲＰＥ抗原特異的なＩＬ−１０産生も検出し、それはワクチン接種したマウスと対照マウスとの間に統計的な差はなかった。
【００４８】
考察
本研究において、我々は、多くの寄生虫リボソームタンパク質と反応する抗体が、ＶＣＬを生じたイヌ由来の血清、及び大形リーシュマニアに感染させたマウスにおいて観察されることを示し、そのことは、リーシュマニアの自然感染及び実験的感染の間、寄生虫のリボソームタンパク質が強力な抗原であることを示している。抗ＬＲＰＥ抗体応答はＩｇＧ１アイソタイプによるものが優勢であったので、感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスのＬＲＰＥに対する応答はＴｈ２型のものであった。この知見は、ＬＲＰＥを用いて感染させたマウス由来のＤＬＮ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後に、培養物の上澄み中で多量のＩＬ−４が検出されたという事実により補強される。ＬＲＰＥは、ＩＮＦ−γのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生にも関係したが、匹敵するレベルの、寄生虫を破壊するための活性化シグナルに対して、感染したマクロファージを無反応性にする多面的な抗炎症サイトカインＩＬ−１０が検出された（３１）。さらに、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける疾患の促進におけるＩＬ−４及びＩＬ−１０の影響は、相加的だと思われることから（（３７）に総説がある）、これらのサイトカインのＬＲＰＥによる刺激は、リボソーム抗原に対する宿主の応答が、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて寄生虫が拡大及び持続するのに好都合であることを示しているとみなすことができる。リーシュマニアによる感染後早期に、宿主の免疫系が寄生虫の細胞溶解によって放出される豊富なＬＲＰＥにより感作され、その後で、寄生虫の増殖の結果、追加免疫され得ると考えることができる。したがって、ＬＲＰＥの強力な免疫原性及びその病原抗原的な役割は、おそらくその豊富さ及び抗原特異性（その進化的に保存された特性にもかかわらず）に依存している。一方、ＬＲＰＥに対して応答するＣ５７ＢＬ／６マウスはＴｈ１型のものであり、ＩｇＧ２ａ特異的抗体の生成及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの高レベルの特異的ＩＮＦ−γ産生を伴い、ＩＬ−４レベルは検出不可能であった。また、我々は、感染の１４週間後に、ＬＲＰＥに特異的なＩＬ−１０産生を見出した。ＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０比が、ＳＬＡを用いて細胞を刺激した場合（データは示さず）に得られたものと同様であったことから、我々は、これらの抗原によって誘導されるＩＬ−１０産生は、このモデルにおいて見られる、寄生虫が持続するのに好都合である調節性の応答に関連する可能性があることを示唆する（４）。我々のデータは、ＬＲＰＥに対する応答が、感受性宿主の病変に関連したＴｈ２に媒介される体液性応答及び耐性宿主におけるＴｈ１に関連する防御応答の誘導に向かうバイアスに一致することを示している。
【００４９】
いくつかのリーシュマニアのエピトープに対して誘導されるＴｈ２応答のＴｈ１応答への転送は、大形リーシュマニアの感染に対する防御を誘導するための有望な戦略になる可能性が高いので（７）、我々はまず、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、異なるリーシュマニア抗原を用いて免疫した際のＴｈ１に関連する長期免疫及び防御を与え（４３）、さらにマウスにおいていくつかの寄生虫特異的Ｔｈ２応答を抑制し得る（１２、５７）アジュバントであるＣｐＧ ＯＤＮと同時投与したＬＲＰＥの免疫原性について分析することを決めた。図２に示されるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて発生する免疫応答は、ＬＲＰＥを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後、免疫したマウスがＩｇＧ２ａアイソタイプの抗ＬＲＰＥ抗体を発生し、ワクチン接種したマウス由来の脾細胞が多量のＩＦＮ−γを産生し、ＩＬ−４は産生しないので、Ｔｈ１型であることが分かった。同様の特異的免疫応答が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いて免疫した場合に生じた（図６Ａ）。どちらのマウス系統においても、免疫した後にＬＲＰＥ主導のＩＬ−１０産生も観察された。
【００５０】
Ｌ３１をコードする遺伝子ワクチンを用いたワクチン接種が、遺伝子ワクチン接種後の特異的ＩＬ−１０産生に関係し得ることが報告されているにもかかわらず（４４）、我々は、ＩＬ−１０産生は、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮの投与後に起こるＴｈ１応答のホメオスタティックコントロールの方に関連している可能性があると考えている。事実、ＩＮＦ−γを産生するＴｈ１細胞は、フィードバック制御の機構としてＩＬ−１０の産生にも関与している可能性があることが最近報告されている（２）。さらに、得られた高ＩＮＦ−γ／ＩＬ−１０比の値により、ワクチンの結果について良好な予測が得られ得る（４４）。
【００５１】
ここで示したデータは、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮの同時投与により、実験的な皮膚リーシュマニア症の２つの異なるモデル、ＢＡＬＢ／ｃマウス（皮膚リーシュマニア症ワクチンのアッセイに広く用いられている）の足蹠における高接種量モデル、及びＣ５７ＢＬ／６マウス（経路及び感染用量に関して、ヒト疾患をより厳密に再現するモデル）の耳における低接種量モデルにおいて防御が誘導されることを示している。ワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスでは膝窩部ＤＬＮにおける寄生虫の生体内総量が縮小しており、脾臓への寄生虫転移はなかった。また、非常に弱い炎症が感染した足蹠において検出された。ワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスでは、耳真皮の損傷が防御され、皮膚及びＤＬＮにおいて寄生虫の生体内総量が縮小したことが示された。この防御は、熱殺菌されたリーシュマニア抗原とＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスによって示された防御に匹敵し、また、このモデルにおいて、ＬＡＣＫ、ＬｍＳＴＩ１及びＴＳＡを含む多成分ワクチンについても試験した（２８、２９、４３）。
【００５２】
重要なことに、どちらの系統における防御も、ＬＲＰＥに対するＴｈ１特異的免疫応答の生成に相関している。細胞性応答についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは感染の８週間後、及びＣ５７ＢＬ／６マウスでは５週間後（寄生虫の負荷量のピークに一致する（４））に測定した。ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種した両マウス系統由来のＤＬＮ細胞は、ＬＲＰＥを用いて刺激した際、それぞれの対応する対照群よりも高いレベルのＩＦＮ−γを分泌した。ＩＦＮ−γ応答は、ＩＬ−１２依存性であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞により産生され、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する寄与は少ないことが分かった。予想通り、両系統の防御マウスについて、ＳＬＡ特異的ＩＦＮ−γ産生は高度であった。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、防御マウスにおけるＴｈ１応答の生成は、ＬＲＰＥに対する優勢なＩｇＧ２ａ特異的抗体の生成と相関する（図４Ａ）。ＩＬ−１０のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、系統間で、多少の違いが観察された。我々のデータは、ＬＲＰＥ及びＳＬＡの両方を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後、防御ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、対照マウスよりも有意に低いレベルのＩＬ−１０が産生されたことを示し、これは、このサイトカインがこのモデルの感受性に関与していることと一致している（３５）。一方、対照マウス及びワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスのどちらのＬＮＣにおいても、ＬＲＰＥ又はＳＬＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後、感染の急性期の間ＩＬ−１０が産生された（図６Ｆ）。ＩＦＮ−γについて起こったように、ＩＬ−１０レベルは、細胞を、ＳＬＡを用いて刺激した場合よりも、ＬＲＰＥを用いて刺激した場合の方が高かった。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０の産生は同様のプロファイルに従ったという事実は、ワクチン接種後のＩＬ−１０産生が、宿主において強力なＴｈ１によって引き起こされる有害な影響を制御するホメオスタティック機構を反映しているとみなすことができる（４）。驚くべきことに、我々は、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いてワクチン接種した後にＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて見られる防御が、ＬＲＰＥ又はＳＬＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後のＩＬ−４主導の抗原産生が有意に縮小したことにも関連していることを見出した。これらの細胞性応答は、ｉｎ ｖｉｖｏで、リボソームタンパク質に対するＴｈ２に媒介される抗体応答の転換に相関する。したがって、防御ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の血清は、抗体価、特にＬＲＰＥ特異的なＩｇＧ１抗体によって認識される抗原の数について有意な減少を示した。さらに、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫も、大形リーシュマニアの感染によってマウスにおいて誘発される広範な体液性応答に対して明らかに影響した（図５Ｃ）。したがって、ワクチン接種したマウスを感染させると、ＩｇＧ１抗リーシュマニア特異的抗体の誘導が制限されるのに対して、他のアッセイした対照マウス群では、体液性応答が高度に誘導され、Ｔｈ２型の抗体（すなわち、ＩｇＧ１アイソタイプ）が優勢であった。全体として、どちらの系統のマウス由来のワクチン接種したマウスにおいて観察される防御も、ＬＲＰＥに対するＴｈ１応答の生成に相関し、またその結果、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴｈ２主導のＩＬ−４及びＳＬＡに対するＩＬ−１０応答が下向き調節される。
【００５３】
我々のデータは、防御ＢＡＬＢ／ｃマウスが、追加的な感染に抵抗できる能力を彼らに付与する免疫学的状況（寄生虫への再曝露が極めて頻繁に起こり得る流行地域において利用され得るワクチンに魅力的な特徴）を獲得したことを示している。耳真皮における再チャレンジの後、これらのマウスは、大形リーシュマニアの感染に対して強固な防御を示した。真皮損傷の発生は非常に少なく（一部の例では、真皮損傷が完全にないことが検出された）、感染した耳及びＤＬＮにおいて寄生虫数に相当な縮小がみられた。防御マウス由来のＤＬＮ細胞は、対照よりも大量のＩＦＮ−γを産生しないが（感染の７週間後に測定）、ＬＲＰＥ及びＳＬＡに対するＩｇＧ２ａ抗体の抗体価は、これらのマウスが二次的なチャレンジ後に特異的なＴｈ１防御応答を高めたとみなすことができる。驚くべきことに、これらのマウスにおける疾患関連サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−１０の特異的な産生は、非常に少なかった。これらのデータは、最初の寄生虫によるチャレンジの後に生成した免疫状態が非常に有力であり、再感染した部位からの寄生虫の迅速かつ効率的な排除を導くことを示している。
【００５４】
ここで示したデータは、ＬＲＰＥ＋ＣｐＧ ＯＤＮを用いたワクチン接種が、耐性マウスと感受性マウスの両方において、リーシュマニアによる感染時に、免疫系の決定に直接影響を及ぼすことを実証している。我々の考えでは、リーシュマニアのような複雑な寄生虫に対するワクチンの生成は、ワクチン製剤中に種々の標的抗原を組み込み、これらの抗原が必要な免疫性を導く（主にＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＩＦＮ−γ媒介応答）ことを利用し、病変をもたらす病原抗原主導の免疫応答（ＩＬ−４ Ｔｈ２主導及びＩＬ−１０不活性化応答）をＴｈ１バイアスに転送することにより最適化され得る。それにもかかわらず、大形リーシュマニアのメタ１抗原で起こるように、これらの抗原の一部に対するＴｈ２応答は、通常のＴｈ１誘導剤によって転送されない場合があることを考慮しなければならない（５０）。
（参考文献）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において寄生虫疾患を治療又は予防するための医薬品を調製するための、リボソームタンパク質抽出物及び場合によってＴｈ１促進アジュバントの使用。
【請求項２】
前記医薬品がワクチンである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記リボソームタンパク質抽出物が、対象内に存在すると寄生虫疾患を引き起こす寄生虫細胞を用いて、
ａ．寄生虫細胞を溶解緩衝液と混合するステップと、
ｂ．得られた混合物を遠心分離してサイトゾル抽出物を得るステップと、
ｃ．得られたサイトゾル抽出物からリボソームタンパク質抽出物を調製するステップと
を行うことにより得られる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記リボソームタンパク質抽出物が、リーシュマニア属の各種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、好ましくは大形リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）から得られる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記Ｔｈ１促進アジュバントがＣｐＧ ＯＤＮである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記寄生虫疾患がリーシュマニア症又はマラリアである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記寄生虫疾患が、リーシュマニア属の各種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）又はプラスモディウム属の各種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）によって引き起こされる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記寄生虫疾患が、リボソームタンパク質抽出物を得る種とは異なる種によって引き起こされる、請求項１から７までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
リボソームタンパク質抽出物及び場合によってＴｈ１促進アジュバントを含む組成物。
【請求項１０】
リボソームタンパク質抽出物及びＴｈ１促進アジュバントからなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記Ｔｈ１促進アジュバントがＣｐＧ ＯＤＮである、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体をさらに含む、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
医薬品として使用するための、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記医薬品がワクチンである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１】
対象において寄生虫疾患を治療又は予防するための医薬品を調製するための、リボソームタンパク質抽出物及び場合によってＴｈ１促進アジュバントの使用。
【請求項２】
前記医薬品がワクチンである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記リボソームタンパク質抽出物が、対象内に存在すると寄生虫疾患を引き起こす寄生虫細胞を用いて、
ａ．寄生虫細胞を溶解緩衝液と混合するステップと、
ｂ．得られた混合物を遠心分離してサイトゾル抽出物を得るステップと、
ｃ．得られたサイトゾル抽出物からリボソームタンパク質抽出物を調製するステップと
を行うことにより得られる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記リボソームタンパク質抽出物が、リーシュマニア属の各種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、好ましくは大形リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）から得られる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記Ｔｈ１促進アジュバントがＣｐＧ ＯＤＮである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記寄生虫疾患がリーシュマニア症又はマラリアである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記寄生虫疾患が、リーシュマニア属の各種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）又はプラスモディウム属の各種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）によって引き起こされる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記寄生虫疾患が、リボソームタンパク質抽出物を得る種とは異なる種によって引き起こされる、請求項１から７までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
リボソームタンパク質抽出物及び場合によってＴｈ１促進アジュバントを含む組成物。
【請求項１０】
リボソームタンパク質抽出物及びＴｈ１促進アジュバントからなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記Ｔｈ１促進アジュバントがＣｐＧ ＯＤＮである、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体をさらに含む、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
医薬品として使用するための、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記医薬品がワクチンである、請求項１２に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【公表番号】特表２０１１−５０９９６８（Ｐ２０１１−５０９９６８Ａ）
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４２６１１（Ｐ２０１０−５４２６１１）
【出願日】平成２１年１月１４日（２００９．１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３３４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９０１７５
【国際公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願人】（５１０１９７０７０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月１４日（２００９．１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３３４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９０１７５
【国際公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願人】（５１０１９７０７０）
【Ｆターム（参考）】
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