リポソームの製造方法、該方法によって製造されるリポソーム組成物、及び該リポソーム組成物の使用方法
【課題】栄養補助剤又は医薬品として使用されるリポソームの製造方法を提供する。
【解決手段】少なくとも約１８ｗ／ｗ％のベシクル形成脂質を約１〜１２ｗ／ｗ％の水性溶媒又は水混和性溶媒に室温で可溶化して脂質溶液を形成し、前記薬剤を０．００５〜０．０１ｗ／ｗ％のＥＤＴＡに室温で可溶化して薬剤含有溶液を形成し、前記薬剤含有溶液をろ過し、前記脂質溶液を前記薬剤含有溶液に攪拌しながら注入し、得られる脂質及び薬剤含有溶液を頻回攪拌しながら少なくとも１時間水和させ、リポソームを製造する。
【解決手段】少なくとも約１８ｗ／ｗ％のベシクル形成脂質を約１〜１２ｗ／ｗ％の水性溶媒又は水混和性溶媒に室温で可溶化して脂質溶液を形成し、前記薬剤を０．００５〜０．０１ｗ／ｗ％のＥＤＴＡに室温で可溶化して薬剤含有溶液を形成し、前記薬剤含有溶液をろ過し、前記脂質溶液を前記薬剤含有溶液に攪拌しながら注入し、得られる脂質及び薬剤含有溶液を頻回攪拌しながら少なくとも１時間水和させ、リポソームを製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性薬剤又は所望の物質をリポソーム封入形態で含むリポソームの製造方法、及び該リポソーム組成物の使用方法に関する。なお、本出願は、２０１１年１月５日に出願された米国仮出願６１／４３０，０２４号に基づく優先権を伴う出願であり、当該米国仮出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、両親媒性脂質で構成される球状に閉じた（self-enclosed）ベシクルである。リポソームは広く研究されており、薬剤、組成物及び化合物のin vivo投与の担体として使用されている。リポソームは、その内部に水相を有する少なくとも１つの閉じた脂質二重膜を含む。従来、水溶性薬剤をリポソーム内部水相に封入することにより、及び／又は、水に不溶の薬剤を脂質二重層に封入することにより、リポソームは薬物送達の目的で使用されてきた。リポソームは、１つの脂質二重層を有する単層リポソームである場合もあるし、同心円状に配置された２又はそれ以上の二重層を有する多層リポソームである場合もある。
【０００３】
様々なリポソーム調製方法及びリポソームへの治療薬の封入方法が知られている（例えば、米国特許第３,９３２,６５７号（特許文献１），第４,３１１,７１２号（特許文献２）及び第５,０１３,５５６号（特許文献３）。これら全ては参照により本明細書に組み込まれる。）。公知の方法としては、例えば、米国特許第４,２３５,８７１号（特許文献４，当該文献は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような逆相蒸発法が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第３,９３２,６５７号
【特許文献２】米国特許第４,３１１,７１２号
【特許文献３】米国特許第５,０１３,５５６号
【特許文献４】米国特許第４,２３５,８７１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
数多くの公知のリポソーム製剤の調製方法は、一般的に経口デリバリーが意図される、栄養価を高めたリポソーム製剤にとっては、あまり望ましいものではない。その理由の一つは、リポソーム製剤における非食品等級の成分の使用にある。さらに、数多くの公知の方法では、加熱工程、例えば、脂質溶液の温度を上昇させる、脂質の可溶化のための加熱工程が採用される。そのような工程は、薬剤、化合物又は組成物、特に熱及び／又は酸化に対する感受性の高いものの性能又は効能に影響を与える場合がある。
したがって、栄養補助剤又は医薬品として使用されるリポソームの新規な調製方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以下の態様及びその実施形態は、本発明の説明のための例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。関連技術の制約は、本明細書に基づき、当業者に明らかであろう。
【０００７】
本発明の一態様では、薬剤が封入されたリポソームを製造する方法が提供される。一般的には、適当な量のベシクル形成脂質を水性溶媒又は水混和性溶媒に室温又はその付近の温度で可溶化して脂質溶液を形成する。それとは別に、封入すべき薬剤を水性溶媒又は水混和性溶媒に室温又はその付近の温度で可溶化して薬剤含有溶液を形成する。脂質及び封入薬剤を可溶化するための水性溶媒又は水混和性溶媒は同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【０００８】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、少なくとも約１８ｗ／ｗ％のベシクル形成脂質を約１〜１２ｗ／ｗ％の水性溶媒又は水混和性溶媒（例えばアルコール）に室温で可溶化して脂質溶液を形成する。
【０００９】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、所定量の薬剤を０．００５〜０．０１ｗ／ｗ％の水性溶媒（例えばＥＤＴＡ）又は水混和性溶媒に室温で可溶化して薬剤含有溶液を形成する。薬剤がアスコルビン酸又はその塩もしくはエステルである実施形態では、好ましくは、０．００５〜０．１ｗ／ｗ％の水性溶媒（例えばＥＤＴＡ）又は水混和性溶媒に室温で可溶化して薬剤含有溶液を形成する。
【００１０】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、水混和性溶媒（例えば、脂質溶液を形成するための水混和性溶媒）はアルコールを含む。
【００１１】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、水性溶媒（例えば、薬剤含有溶液を形成するための水性溶媒）はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。
【００１２】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、薬剤含有溶液をろ過する。
【００１３】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、脂質溶液及び薬剤含有溶液を混合する。ある実施形態では、脂質溶液を薬剤含有溶液に攪拌しながら注入する。
【００１４】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、得られる溶液（脂質及び薬剤含有溶液）を適当な時間水和させる。ある実施形態では、頻回攪拌しながら溶液を少なくとも１時間水和させる。
【００１５】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、追加の脂質及び／又は増粘剤を加えてゲルを形成させる。ある実施形態では、追加の脂質及び／又は増粘剤を水和工程の後に加える。
【００１６】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、ベシクル形成脂質が少なくとも約４５〜５０％のホスファチジルコリンを含む。ある実施形態では、ホスファチジルコリンが卵又は大豆に由来する。
【００１７】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、薬剤は、アスコルビン酸又はその塩もしくはエステル、ＧＳＨ及びＡＬＡから選択される。
【００１８】
本発明の別の態様では、活性薬剤の投与のためのリポソーム組成物が提供される。好ましい実施形態では、リポソーム組成物は低温法によって形成される。ある実施形態では、低温法は、室温で、すなわち、加熱及び／又は加熱工程なしで、実施される。ある実施形態では、活性薬剤は栄養補助食品、サプリメント（dietary supplement）又は医薬品である。別の実施形態では、活性薬剤はアスコルビン酸又はその塩（例えばアスコルビン酸ナトリウム）もしくはエステル、ＧＳＨ及びＡＬＡから選択される。さらに別の実施形態では、活性薬剤がアスコルビン酸又はその塩であって、少なくとも約２２ｗ／ｗ％のアスコルビン酸又はその塩がリポソームに封入されている。
【００１９】
本発明のリポソーム組成物の一実施形態では、リポソーム組成物のリポソームは、約２００〜５００ｎｍの平均粒径（直径）を有する。
【００２０】
本発明のリポソーム組成物の一実施形態では、リポソーム組成物のリポソームは、少なくとも約１８ｗ／ｗ％のベシクル形成脂質を含む。
【００２１】
本発明のリポソーム組成物の一実施形態では、リポソーム組成物のリポソームは、０．００５〜０．１ｗ／ｗ％のＥＤＴＡを含む。
【００２２】
本発明のリポソーム組成物の一実施形態では、リポソーム組成物のリポソームは、１０〜１２ｗ／ｗ％のアルコールを含む。
【００２３】
本発明のリポソーム組成物の一実施形態では、ベシクル形成脂質は少なくとも約４５〜５０％のホスファチジルコリンを含む。ある実施形態では、ホスファチジルコリンは、大豆又は卵に由来する。別の実施形態では、ホスファチジルコリンは高純度のホスファチジルコリンである。さらに別の実施形態では、リポソーム組成物は、増粘剤及び／又は乳化剤を含む。ある実施形態では、増粘剤及び／又は乳化剤は、キサンタンガム又はＴｗｅｅｎTM８０を含む。ある実施形態では、０〜０．６ｗ／ｗ％のキサンタンガムを含む。別の実施形態では、０．４ｗ／ｗ％のＴｗｅｅｎTM８０を含む。
【００２４】
本発明の別の態様では、単位用量パッケージと該パッケージ中に含まれるリポソーム組成物とを含む単位用量製剤（剤形）が提供される。ある実施形態では、Ｎ2のガスフラッシュの下、リポソーム組成物がパッケージ中に密封されている。
【００２５】
本発明のさらに別の態様では、対象における壊血病、心臓血管疾患、脳血管疾患、癌、加齢性黄斑変性症、白内障、痛風、重金属毒性又は糖尿病を、リポソームに封入したアスコルビン酸又はその塩で処置する方法が提供される。ある実施形態では、高用量のリポソーム組成物が投与される。
【００２６】
本発明のさらに別の態様では、対象における癌、肝機能障害、悪性腫瘍、ＡＩＤＳ、外傷（trauma）、熱傷、敗血症、肺疾患、パーキンソン病、糖尿病、アルツハイマー病、統合失調症、嚢胞性線維症、心臓麻痺及び心臓発作、痙攣（癲癇）、鎌状赤血球貧血、躁鬱病（bipolarism）、慢性疲労症候群、自閉症又は関連免疫疾患を、リポソームに封入したＧＳＨで処置する方法が提供される。ある実施形態では、高用量のリポソーム組成物が投与される。
【００２７】
本発明のさらに別の態様では、対象における酸化的ストレスもしくはダメージ、糖尿病、肝疾患、炎症、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病）、心臓血管疾患、末梢神経損傷、統合失調症、肥満、癌又は高血圧を、リポソームに封入したＡＬＡを用いて治療又は予防する方法が提供される。ある実施形態では、高用量のリポソーム組成物が投与される。
【００２８】
上記した例示的な態様及び実施形態に加え、さらなる態様及び実施形態が以下の記載を参照することにより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１ＡはＬ−アスコルビン酸の化学構造を示す図であり、図１ＢはＬ−アスコルビン酸ナトリウムの化学構造を示す図である。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、例示的な容器の平面図及び側面図である。
【図３】図３は、室温（実線）又は５０℃（点線）で保存（日数）した場合のビタミンＣの重量％の経時変化によって、リポソームに封入されたアスコルビン酸ナトリウムの安定性を示す図である。
【図４】図４は、本発明の方法の一実施形態によって調製したリポソームをバイアル中、５０℃で保存した場合（実線）、市販品のリポソーム封入アスコルビン酸ナトリウム（LivOn Lypo-SphericTM Vitamin C）をバイアル中、５０℃で保存した場合（点線）、ならびに、市販品のリポソーム封入アスコルビン酸ナトリウム（LivOn Lypo-SphericTM Vitamin C）をオリジナルパッケージ中、５０℃で保存した場合（破線）の安定性を、１９日間にわたるビタミンＣの重量％の経時変化によって示す図である。
【図５】図５は、本発明の方法の一実施形態によって調製したリポソームをバイアル中、５０℃で保存した場合（図中の黒ひし形）、市販品のリポソーム封入アスコルビン酸ナトリウム（LivOn Lypo-SphericTM Vitamin C）をバイアル中、５０℃で保存した場合（図中の黒四角）、ならびに、市販品のリポソーム封入アスコルビン酸ナトリウム（LivOn Lypo-SphericTM Vitamin C）をオリジナルパッケージ中、５０℃で保存した場合（図中の黒三角）の安定性を、９０日間にわたるビタミンＣの重量％の経時変化によって示す図である。
【図６】図６は、本発明の方法の一実施形態によって調製したリポソームをバイアル中、２５℃（実線）又は４０℃（点線）で保存した場合の安定性を、アスコルビン酸ナトリウムの重量％の経時変化によって示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．定義
「活性薬剤」、「活性化合物」及び「化合物」という用語は、リポソームによる封入に適した組成物又は化合物を意味する。これらの用語には、栄養補助食品、サプリメント（dietary supplement）及び医薬品が含まれる。本発明の方法及び組成物での使用が意図される薬剤は広範にわたり、治療適応及び診断適応に適した薬剤が含まれる。
【００３１】
「栄養補助食品」という用語は、健康上及び／又は医学上の利点を提供する食物又は食品を意味する。そのような利点は、生理学的、治療的、予防的又は診断的な利点であり得る。栄養補助食品としては、特に限定されるわけではないが、例えば、ハーブ、サプリメント（dietary supplement）等の食品が挙げられる。
【００３２】
「サプリメント（dietary supplement）」という用語は、食事を補う又は栄養素を提供する化合物又は組成物を意味する。サプリメントとしては、特に限定されるわけではないが、例えば、ビタミン、ミネラル、ハーブ及びその他の植物製品、ファイバー、脂肪酸及びアミノ酸又はペプチドが挙げられる。
【００３３】
「医薬」又は「医薬品」という用語は、疾患の医学的な診断、療養、治療又は予防での使用が意図される化学物質又は組成物を意味する。
【００３４】
「リポソーム組成物」という用語は、少なくとも一部が水性相及び／又は脂質二重層に封入された薬剤、化合物又は組成物を含むリポソームを意味する。
【００３５】
「ベシクル形成脂質」という用語は、安定なリポソーム組成物を形成し得る脂質を意味する。そのような脂質には、典型的には、１もしくは２つの疎水性アシル炭化水素鎖又はステロイド基が含まれ、また、化学反応性官能基、例えば、アミン、酸、エステル、アルデヒド又はアルコールをその極性頭部基として含んでいてもよい。炭化水素鎖は、典型的には、約１４〜２２個の炭素原子の鎖長を有し、様々な程度の不飽和度を有していてもよい。
【００３６】
「高用量（high-dose）」及び「メガドーズ（mega-dose）」という用語は、活性薬剤又は化合物の用量が、公式に推奨されている用量よりも大きいことを意味する。ある実施形態では、「高用量」及び「メガドーズ」は、公式に推奨されている用量（例えば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、英国保健省及び欧州連合等の政府機関によって推奨されている用量）よりも約５〜５００倍大きい用量を意味する。他の実施形態では、「高用量」及び「メガドーズ」は、公式に推奨されている用量よりも約１０〜１０００倍、約１０〜５００倍、約１０〜２５０倍、約１０〜１００倍又は約１０〜５０倍大きい用量を意味する。
【００３７】
「処置」、「処置する」等の用語は、一般的に、疾患の症状の軽減及び／又は疾患の重症度の低減に有効なリポソーム組成物の投与によって、所望の薬理作用及び／又は生理作用を得ることを意味する。そのような作用は、疾患又はその症状を完全又は部分的に予防するという点で予防的なものであってもよいし、疾患及び／又は該疾患に起因する悪影響を完全又は部分的に治すという点で治療的なものであってもよいし、両者を兼ね備えたものであってもよい。
【００３８】
「処置」という用語には、哺乳動物（特にヒト）の疾患又は症状に対するいかなる処置も含まれ、例えば、ある疾患を発症する可能性が高いが未だ発症していると診断されていない対象に対して、当該疾患の発症を予防すること、当該疾患を抑制すること（すなわち、その進行を停止させること）、又は当該疾患を緩和すること（すなわち、当該疾患を退行（regression）させること）が含まれる。アスコルビン酸ナトリウムに関する具体例を挙げれば、「処置」には、壊血病、心臓血管疾患、脳血管疾患、癌、加齢性黄斑変性症、白内障、痛風、重金属（鉛、ヒ素等）毒性及び糖尿病に罹患する対象に対して、検出可能で有益な治療効果を提供することが含まれる。
【００３９】
「有効量」、「有効な量」又は「治療的に有効な量」という用語は、当該用語がリポソーム封入薬剤の量について用いられる場合、治療効能に十分なリポソーム組成物の量又は用量（例えば、疾患又は障害の症状を予防、治療又は緩和するのに十分な量）を意味する。
【００４０】
「薬学的に許容可能な」という用語は、例えば、その他の製剤成分と混合可能な担体、希釈剤又は賦形剤であって、レシピエントに一般的に安全に投与可能なもの、あるいは、投与によって望ましくない有害な身体的反応を引き起こさないものを意味する。
【００４１】
「室温」という用語は、約１０℃〜３７．７８℃、好ましくは約１５．５℃〜２７℃、さらに好ましくは約１８．３℃〜２６．７℃の範囲の温度を意味する。「室温」の好ましい範囲は、約２０℃〜３０℃である。特定の実施形態では、「室温」は約１５．５℃、１８．３℃、１８．９℃、１９．４℃、２０℃、２０．６℃、２１．１℃、２１．７℃、２２．２℃、２２．８℃、２３．３℃、２３．９℃、２４．４℃、２５℃、２５．６℃、２６．１℃、２６．１℃、２６．７℃、２７．２℃、２７．８℃、２７．８℃、２８．３℃、２８．９℃、２９．４℃、３０℃、３０．６℃、３１．１℃、３１．７℃及び３２．２℃であり得る。
【００４２】
「高温」という用語は、室温よりも高い温度を意味する。非限定的な実施形態では、「高温」は約２５℃〜約６０℃である。その他の非限定的な実施形態では、「高温」は約２５℃〜約５０℃である。特定の非限定的な実施形態では、「高温」は４０℃又は５０℃であり得る。
【００４３】
本発明の組成物は、単独で、又は慣用の賦形剤（例えば、薬学的又は生理学的に許容可能な有機又は無機担体物質であって、本発明で用いる組成物との有害な反応を生じず、経口、腸内又は非経口（経静脈）投与に適したもの）との混合物として投与することができる。薬学的に許容可能な担体の好適な例としては、水、塩溶液（例えば、リンガー溶液）、アルコール、油、ゼラチン及び炭水化物（糖質）、具体的には、ラクトース、アミロース、でんぷん、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース及びポリビニルピロリドンが挙げられる。そのような調製物は滅菌し得るし、所望により、本発明の方法で用いる組成物との有害な反応を生じない助剤、例えば、滑剤、保存料（防腐剤）、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調節可能な塩、緩衝液、着色剤及び／又は芳香剤と混合し得る。また、そのような調製物は、所望により、代謝低下（metabolic degradation）を低減するその他の活性物質と組み合わせることもできる。
【００４４】
「対象」という用語は、その通常の意味で用いられ、霊長類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類等）、実験動物（例えば、マウス、ラット等の齧歯動物）、家畜動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ等）及び愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ等）が含まれる。封入化ビタミンＣを含むリポソーム組成物の「対象」は、一般的には、アスコルビン酸を合成できない動物を意味する。アスコルビン酸を合成できない哺乳動物としては、霊長類の直鼻猿亜目（Suborder Haplorrhini）（例えば、ヒト、サル、類人猿等）が挙げられる。
【００４５】
「ビタミンＣ」という用語は、Ｌ−アスコルビン酸又はＬ−アスコルビン酸塩、あるいは、アスコルビン酸の無機塩又はエステルを意味する。
【００４６】
「ＧＳＨ」という用語は、グルタチオン、すなわち、(２Ｓ)−２−アミノ−４−｛[(１Ｒ)−１−[(カルボキシメチル)カルバモイル]−２−スルファニルエチル]カルバモイル｝ブタン酸を意味する。
【００４７】
「ＡＬＡ」という用語は、アルファリポ酸、２種類のエナンチオマー（Ｒ−(＋)−リポ酸（ＲＬＡ）及びＳ−(−)−リポ酸（ＳＬＡ））のラセミ混合物、活性エナンチオマーＲＬＡ又はＡＬＡの無機塩を意味する。
【００４８】
「ＡＴＰ」という用語は、アデノシン−５'−三リン酸エステル又はＡＴＰの無機塩を意味する。
【００４９】
「関連する」という用語は、単に、両方の事象が存在することを意味するのであり、一方が他方と因果的関係を有するという意味に解釈されるべきではない。
【００５０】
ＩＩ．リポソーム組成物の調製方法
リポソームを調製する典型的な方法は、脂質又はリポソーム組成物を加熱する少なくとも一工程、一般的には二工程を含む。まず、一般的には、脂質−溶媒組成物を高温まで加熱し、溶媒への脂質の溶解を促進する。リポソーム組成物を製造するための脂質は、一般的には、ワックス状材料（waxy material）の顆粒（granule）又は塊（chunk）として供給され、溶媒に加えられる熱は、一般的には、脂質を可溶化するために必要である。次いで、慣用のリポソーム調製方法は、活性薬剤の封入のために、及び／又は、リポソームのサイジングのために、均質化（homogenization）、超音波処理又は微少溶液操作（microfluidization）の工程を必要とする。均質化工程（場合によっては、超音波処理工程又は微少溶液操作工程）において、脂質−活性薬剤組成物を、強制的に、高速ホモジナイザーの相互作用チャンバー（interaction chamber）を通過させることにより、熱が発生し、その結果、脂質−活性薬剤混合物が高温まで加熱される。組成物は、ホモジナイザーチャンバー外で冷却されるが、組成物の大部分は、均質化工程の後、長期間、上昇した温度を維持する。多くの活性薬剤、脂質及び化合物、例えば、ビタミン及びその他の栄養補助剤（ビタミンＣ、グルタチオン、ＡＬＡ等）は、酸化に対して感受性が高く、酸化は高温で促進される。例えば、ビタミンＣは、熱、光及び酸素に対して感受性が高く、したがって、均質化工程及びリポソーム封入工程での加熱によって生じる高温状態で直ちに品質が低下する。このように、リポソーム封入薬剤の調製方法では熱を利用するため、その過程で薬剤の大部分の品質が低下する。
【００５１】
本発明の低温法の一実施形態では、室温又は室温付近の温度（約２０〜２５℃）下及び／又は非加熱下で、小さなサイズのリポソームを一工程で形成させることにより、この問題を解決する。好ましい実施形態では、「低温法」とは、非加熱下及び／又は加熱工程の不存在下でリポソームを形成する方法を意味する。別の実施形態では、「低温法」とは、室温又は室温付近の温度でリポソームを形成する方法を意味する。この実施形態では、「低温法」は「室温」と同義である。その他の実施形態では、本発明の方法は、非加熱下でリポソームを調製する工程を含む。別の実施形態では、本発明の方法は、１又は２以上の溶媒の加熱等の加熱工程の不存在下でリポソームを調製する工程を含む。
【００５２】
この一工程プロセスは、活性薬剤をリポソームベシクルに封入するために、又は、リポソームをサイジングするために、さらに別の工程（例えば、均質化、超音波処理又は微少溶液操作）を含まないか、又は必要としない。したがって、本発明の低温法で製造したリポソーム組成物中の薬剤は、従来の方法で製造したリポソームに封入された薬剤と比較して、品質低下及び／又は活性喪失が有意に抑えられている。
【００５３】
本発明の低温法において、脂質は、好ましくは、完全に又は大部分が水性溶媒又は水と混合可能な溶媒（例えば、大部分のアルコール）に可溶化される。リポソーム組成物が経口投与用である場合、水性溶媒は、好ましくは、摂取に適したものである。低温法で用いる溶媒がアルコールである実施形態では、最終産物中の最終アルコール含量は、最終産物の重量を基準として約１０〜１２重量％未満であることが好ましい。アルコールは、安定なリポソーム産物を形成するために必須ではないが、透明（translucent）なゲルを製造するのに役立つと思われる。アルコールは、さらに、効果的な保存料として役立つという利点を有している。また、アルコールの使用は、約２００〜５００ｎｍの範囲のサイズの小さなリポソームを形成するのに適しているか、又は有効である。その他の好適な水性溶媒は当業者に公知である。しかしながら、幾つかの溶媒を用いる場合には、アルコールを用いて製造した組成物よりも不透明な外観となり得る。
【００５４】
本発明の低温法の幾つかの実施形態では、アルコールへの脂質の溶解を上昇した温度（室温よりも高温）下で行い、脂質の溶媒への溶解を促進することができる。しかしながら、脂質の可溶化のために加熱する場合、脂質溶液は、活性薬剤の水溶液で水和する前に、より低い温度（例えば室温）まで冷却される（この際、例えば、標準的な手段又は大規模処理工程用の熱交換器が用いられる）。この工程は、脂質と活性薬剤（溶液）の両方が加熱される上記のような「典型的な」リポソーム製造工程とは根本的に異なる。
【００５５】
活性薬剤の溶液に関して、ある実施形態では、活性薬剤を含有する水溶液が室温で調製される。所望により、溶液の特性を向上させるための、又は活性薬剤の水への溶解を促進するためのその他の化合物、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有していてもよい。水は、任意の適当な方法、例えば、特に限定されるわけではないが、逆浸透、脱イオン化、ろ過等によって精製することができる。可溶化の後、薬剤を含有する溶液をさらにろ過して混入物質を除去してもよい。ある適当なフィルターは、０．２μｍ膜（例えば、Pall Life Sciencesから市販されている０．２μｍ膜であるMini Capsule Sterile Filter）である。膜のサイズは溶液から除去されるべき混入物質のサイズに応じて調節することができる。適当なサイズのフィルターの選択は、当業者が適宜行うことができる。適当なフィルターのサイズは、特に限定されるわけではないが、例えば、０．５μｍ、０．４μｍ、０．４５μｍ、０．３μｍ、０．２μｍ、０．１５μｍ及び０．１μｍである。
【００５６】
次いで、本発明の低温法において、脂質溶液は、例えば、活性薬剤水溶液への注入（injecting又はpouring）により、活性薬剤水溶液に加えられ、必要に応じて攪拌される。攪拌は、例えば攪拌器による機械攪拌、手動混合又は攪拌等の任意の適当な方法によって行うことができる。脂質溶液を活性薬剤溶液に加えた後、脂質の水和が少なくとも約１／２時間又は１時間、頻回攪拌しながら行われる。その工程の終了時に、脂質組成物は好ましくは滑らかな液体となる。
【００５７】
適当かつ容易な取り扱いが可能なリポソーム組成物を製造するために、ある実施形態では、リポソーム栄養補助剤又は組成物が一定の稠度（consistency）のゲルに製剤化される。ある実施形態では、追加の脂質が組成物に加えられ、リポソーム組成物の粘度をゲル様粘度まで増加させる。別の実施形態では、増粘剤及び／又は乳化剤が、組成物をゲルにするために、追加の脂質とともに、又は追加の脂質なしで加えられる。適当な増粘剤及び／又は乳化剤としては、例えば、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ＴｗｅｅｎTM８０（ポリソルベート８０）、ＴｗｅｅｎTM２０（ポリソルベート２０）、ＴｗｅｅｎTM４０（ポリソルベート４０）、ＴｗｅｅｎTM６０（ポリソルベート６０）、レシチン、乳化ろう、セテアリルアルコール及びセテアレス２０が挙げられる。さらなる適当な増粘剤については、ウエブサイトen.wikipedia.org/wiki/Category:Edible_thickening_agentsに記載されている。増粘剤及び／又は乳化剤は、ゲルを調製するために必要とされる脂質の量を減少させるために用いることができる。また、脂質の量は、増粘剤及び／又は乳化剤の不存在下で、ゲル様稠度を有するリポソーム組成物を製造するために、リポソームを形成するのに必要な量から３０〜３５％まで増加させることができる。ゲル組成物を調製するために過剰の脂質を用いると、活性薬剤の封入効率がより高くなる。追加の脂質と増粘剤及び／又は乳化剤との組み合わせは、ゲル組成物を調製するために用いることができる。また、過剰の脂質、増粘剤及び／又は乳化剤の添加には、経口用にさらに適したゲルを製造できるという利点がある。そのような組成物は、オレンジ色又は褐色（その他の方法で形成される組成物の色）というよりもむしろ蜂蜜のような色を有するかもしれない。また、本発明の方法で形成された組成物は、好ましくは、部分的に又は全体的に透明である。
【００５８】
活性薬剤がアスコルビン酸ナトリウムである場合のリポソーム製剤の例を表１に示す。表１の処方は、例示のみのために提供されるものである。製剤はこれに限定されるものではなく、その他の成分を含んでいてもよいし、異なる範囲を有していてもよい。活性薬剤の割合（％）は活性薬剤の性質に基づいて変更してもよい。
【００５９】
【表１】
【００６０】
ＩＩＩ．リポソーム組成物
ある態様では、薬剤、組成物又は化合物がリポソームに封入される。
活性薬剤、化合物又は組成物を封入して、多様なリポソーム組成物とすることができる。薬剤の形態（例えば、ビタミンＣに関して、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、無機塩、エステル等）、投与方法等を考慮して、リポソーム組成物の構成及びその比率を選択することは、当業者に公知である。
【００６１】
リポソーム組成物の形成に使用される脂質としては、例えば、２つの炭化水素鎖（典型的にはアシル鎖）と極性頭部基とを有するベシクル形成脂質が挙げられる。このような種類の脂質には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）等のリン脂質が挙げられ、２つの炭化水素鎖は典型的には約１４〜２２個の炭素原子の鎖長を有し、様々な不飽和度を有する。好ましい実施形態では、脂質は、比較的不飽和であるリン脂質（炭化水素鎖中に１、２又は３個の二重結合を有する）。特に好ましい実施形態では、脂質はホスファチジルコリンである。ホスファチジルコリンは、頭部基としてコリンが組み込まれ、グリセロリン酸を２つの脂肪酸と結合させたリン脂質である。ＰＣは、生体膜の主要成分であり、卵黄、大豆等から公知の方法で抽出することができる。ある実施形態では、脂質は、大豆由来のホスファチジルコリンである。別の実施形態では、脂質は、卵黄由来のホスファチジルコリンである。適当なホスファチジルコリン脂質としては、特に限定されるわけではないが、例えば、American Lecithin Company（Oxford, CT）から市販されているPhospholipon 50IP及びAlcolec PC 50が挙げられる。リポソーム組成物を調製する際、２種以上の脂質を使用してもよい。脂質の選択及び比率は、所望の流動性又は剛性を得るために、安定性を制御するために、及び／又は封入薬剤の放出速度を制御するために、変化させることができる。リポソーム組成物を調製する際に２種以上の脂質を使用する場合、安定なリポソームを形成させるために、比較的不飽和の脂質（例えばＰＣ）の好適量が用いられるべきである。ある実施形態では、調製物に用いられる脂質のうち少なくとも４５〜５０モル％がＰＣである。また、リポソームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含んでいてもよい。好適な親水性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミド及び親水性ペプチド配列が挙げられる。親水性ポリマーで誘導体化された脂質を調製する方法は公知である（例えば、米国特許第５,３９５,６１９号参照。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。）。
【００６２】
リポソームは、ゼラチンカプセル、軟質ゲルカプセル等の公知のカプセルで投与してもよい。
【００６３】
実施例４、５及び９に記載されるように、本発明のリポソーム組成物は高い安定性を有する。さらに示されているように、本発明のリポソーム組成物は、高温（室温よりも高い温度）で保存された場合にも高い安定性を有する。「安定性」という用語は、保存の間又は後に、封入薬剤の大部分が保持される調製物を意味する。非限定的な実施形態では、リポソームは、少なくとも約６ヶ月又は１年の保存の後に安定性を維持する。その他の非限定的な実施形態では、リポソームは、少なくとも約１〜１２ヶ月の保存の後に安定性を維持する。その他の非限定的な実施形態では、少なくとも約１，２，３，４，５，６もしくは９ヶ月又はそれを超える保存の後に安定性を維持する。ある実施形態では、少なくとも約６５〜１００％又はそれを超える封入薬剤が、保存の後にリポソーム内に保持される。好ましくは、少なくとも約６５％，７０％，８０％，９０％，９５％，９７％，９８％もしくは９９％又はそれを超える、あるいは１００％の封入薬剤が、保存の後にリポソーム内に保持される。リポソームを高温（室温を超える温度、例えば２５〜６０℃、好ましくは約５０℃）で保存する場合、好ましくは少なくとも約６５％の封入薬剤が保存の後にリポソーム内に保持される。
【００６４】
ある実施形態では、本発明のリポソームは、２００〜６００ｎｍ、好ましくは約２００〜５００ｎｍ又は約３００〜５００ｎｍの粒径を有する。実施例３に示されるように、本発明の低温法で形成されたリポソームは、市販の経口用リポソームよりも実質的に小さな粒径を有する。リポソームの粒径が小さいほど、一般的に、経口投与に適する。したがって、本発明の方法で形成されたリポソームは、市販の経口用リポソームよりも経口投与に適する。ある実施形態では、本発明の方法で形成されたリポソームは、その他の方法で形成されたリポソーム（例えば市販のリポソーム等）よりも、２５〜７５％小さい平均粒度分布を有する。非限定的な実施形態では、本発明のリポソームは、その他の方法で形成されたリポソーム（例えば市販のリポソーム等）よりも、２５％，３５％，４０％，４５％，６０％，６５％又は７５％小さい平均粒度分布を有する。
【００６５】
ＩＶ．封入薬剤
本発明の方法及びリポソーム組成物での使用が意図される薬剤、化合物及び組成物は多種多様であるが、例えば、サプリメント等の栄養補助剤及び医薬品が挙げられる。
【００６６】
Ａ．栄養補助剤
１．アスコルビン酸及びその塩
アスコルビン酸は、抗酸化特性を有する水溶性糖酸である。その抗酸化特性ゆえ、アスコルビン酸ならびにそのナトリウム塩、カリウム塩及びカルシウム塩は、一般に、食品添加物として用いられる。同様に、長鎖脂肪酸を有するアスコルビン酸の脂溶性エステル（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル等）は、一般に、脂質の酸化を防止するために用いられる。アスコルビン酸のＬ−エナンチオマー（ビタミンＣ又はＬ−アスコルビン酸として、その塩であるＬ−アスコルビン酸塩とともに知られている）は、ヒト及びその他の数種類の哺乳動物では合成されないため、それらの必須栄養素である。ビタミンＣの欠乏によって、ヒトで壊血病が生じる。また、ビタミンＣは、コラーゲン、Ｌ−カルニチン及びある種の神経伝達物質（例えばノルエピネフリン）の合成でも必要である。さらに、ビタミンＣは、タンパク質代謝に関連するとともに、非常に有効な抗酸化物質である。
【００６７】
ビタミンＣは、食事で十分なビタミンＣを摂取できない大勢の人たちに、栄養補助剤として利用されている。国民健康栄養調査（National Health and Nutrition Examination Survey）の１９９９年から２０００年のデータによると、約３５％の成人が総合ビタミン剤を摂取しており、総合ビタミン剤には、通常、ビタミンＣが含まれる。また、同データによると、１２％の成人が別のビタミンＣ栄養剤を摂取している（Radimer等, Am. J. Epidemiol., (2004), 160:339-49）。ビタミンＣは、最も広く摂取されている栄養補助剤である。ビタミンＣは、錠剤の形態で経口用として用いられるとともに、静脈内投与もされている。経口用の剤形としては、カプレット、錠剤、カプセル、ドリンクミックスパケット（drink mix packet）、マルチビタミン製剤、抗酸化物質の複合剤及び結晶性粉末が挙げられる。しかしながら、経口投与によって大量投与すると腸過敏症及び下痢が生じるため、一般的には、約２〜３グラム／日に制限される。腸の許容レベル（bowel tolerance level）を超える量のビタミンＣを摂取した場合、下痢を引き起こす可能性があることが知られている（Cathcart, Medical Hypothesis （1981）, 7:1359-1376）。ビタミンＣの腸の許容範囲は個人ごとに異なり、１日あたり５ｍｇから１日あたり数千ｍｇまでの範囲をとり得る。
【００６８】
ビタミンＣの使用、例えば高用量又はメガドーズでの使用は、従来、様々な疾患及び疾病、例えば心臓血管疾患、癌、白内障、痛風、重金属毒性（例えば鉛、ヒ素等）等の処置として推奨されてきた。高用量又はメガドーズのビタミンＣは、経口投与による副作用を避けるために、及び血漿中濃度を増加させて経口投与による通常の血漿中濃度よりも高くするために、通常、静脈内投与される。ビタミンＣの腸内吸収は、一般的には、少なくとも１種の特定の用量依存性の能動輸送体によって制御され、これによってビタミンＣの吸収量が制限されると考えられている（Jacob等, Nutr. Clin. Care, (2002), 5:66-74）。４時間ごとにアスコルビン酸３ｇという用量が経口で摂取された場合、ピーク血漿濃度は２２０μモル／Ｌにしか達しないことが薬動力学モデルで予測された（Padayatty等, Ann. Intern. Med. (2004) 140:533-7）。
【００６９】
経口投与における吸収の増大及び副作用の低減のために、ビタミンＣは経口投与用リポソームに封入されてきた。Lipoflowによって、脂質代謝疾患及びアテローム性動脈硬化症に対するリポソームビタミンＣが提供されている。大さじ（テーブルスプーン）１杯の栄養補助剤は、大豆レシチン由来の必須リン脂質に封入されたビタミンＣを１０００ｍｇ含有する。LivOn Laboratoriesによって提供される栄養補助剤は、必須リン脂質１０００ｍｇに封入されたビタミンＣを１０００ｍｇ含むリポソームを含有する。従来のビタミンＣのリポソーム製剤は、直径の大きな（約８００〜１０００ｎｍ）リポソームを含み、このため経口投与に適さない。リポソームのサイズのせいで、従来のリポソーム製剤は、不透明である。したがって、より経口投与に好適であって、安定な経口用リポソーム製剤が求められている。
【００７０】
ある態様では、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ-アスコルビン酸塩、又はアスコルビン酸の無機塩もしくはエステルを含む栄養補助剤又は組成物が、リポソーム組成物として提供される。ある実施形態では、栄養補助剤又は組成物は、Ｌ−アスコルビン酸のアルカリ金属塩を含む。好適な無機塩としては、特に限定されるわけではないが、例えば、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸マグネシウム、アスコルビン酸亜鉛、アスコルビン酸モリブデン、アスコルビン酸クロム及びアスコルビン酸マンガンが挙げられる。無機塩の緩衝化作用によって、アスコルビン酸の無機塩はアスコルビン酸よりも摂取時に刺激が少ない。アスコルビン酸の無機塩を組み合わせて使用してもよい。このような使用は、無機塩の推奨摂取量の範囲内で又はその付近で、そのカチオンの推奨摂取量を維持できるように、高用量又はメガドーズを投与する場合に重要となるかもしれない。別の実施形態では、栄養補助剤又は組成物は、脂溶性剤形とするために、飽和脂肪酸にエステル化されたアスコルビン酸を含む。好適な脂肪酸の例は、パルミチン酸アスコルビルを形成するパルミチン酸である。Ｌ−アスコルビン酸又はその無機塩もしくはエステルは、好ましくはリポソーム中に封入されている。
【００７１】
ａ．高用量
別の態様では、Ｌ−アスコルビン酸又はその無機塩もしくはエステルを含む栄養補助剤又は組成物を含有する、高用量又はメガドーズのリポソーム組成物が提供される。ビタミンＣの食事摂取基準（the Institute of Medicine's Food and Nutrition Boardによる基準）は、未成年及び成人１人あたり４５〜１２０ｍｇ／日の範囲である。喫煙者には、それに追加して３５ｍｇ／日を摂取することが推奨されている。１日あたりの推奨摂取量（ＲＤＩ）（ＦＤＡによって推奨される２００９年の基準）は、１日あたり６０ｍｇである（www fda.gov）。一般的に、「高用量」及び「メガドーズ」とは、１日あたり約１００〜１００００ｍｇの用量を意味する。また、「高用量」及び「メガドーズ」は、「腸の許容用量（bowel tolerance dosage）」でもあってもよく、それは、対象が下痢を引き起こす用量よりも少ない用量である。（「腸の許容用量」を決定するための例示的な方法については、Cathcart, Medical Hypotheses, 7:1359-1376, 1981を参照のこと。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。）。好ましい実施形態では、「メガドーズ」とは、アスコルビン酸又はその塩の用量として、２０００ｍｇ／日又はそれを越える用量を意味する。別の実施形態では、ビタミンＣを含むリポソーム組成物の高用量は、全米科学アカデミーによる推奨摂取量（２０００年における推奨摂取量は９０ｍｇ／日）、食品栄養委員会（Food and Nutrition Board）による推奨摂取量（７５〜１２０ｍｇ／日）、あるいはＵＳＤＡ又はその他の政府規制機関による推奨摂取量を上回るビタミンＣの用量を含む。ある実施形態では、約１００〜１００００ｍｇの用量が１日あたりに投与される。別の実施形態では、１日あたりの用量は、約２００〜２０００ｍｇ／日，２００〜５０００ｍｇ／日，２００〜１００００ｍｇ／日，４００〜１００００ｍｇ／日，４００〜８０００ｍｇ／日，４００〜６０００ｍｇ／日，４００〜５０００ｍｇ／日，４００〜４０００ｍｇ／日，４００〜３０００ｍｇ／日，４００〜２０００ｍｇ／日，５００〜１００００ｍｇ／日，５００〜８０００ｍｇ／日，５００〜６０００ｍｇ／日，５００〜５０００ｍｇ／日，５００〜４０００ｍｇ／日，５００〜３０００ｍｇ／日，５００〜２０００ｍｇ／日，５００〜１０００ｍｇ／日，１０００〜１００００ｍｇ／日，１０００〜８０００ｍｇ／日，１０００〜６０００ｍｇ／日，１０００〜５０００ｍｇ／日，１０００〜４０００ｍｇ／日，１０００〜２０００ｍｇ／日，２０００〜１００００ｍｇ／日，２０００〜６０００ｍｇ／日，２０００〜５０００ｍｇ／日，２０００〜４０００ｍｇ／日，４０００〜１００００ｍｇ／日，４０００〜８０００ｍｇ／日，４０００〜６０００ｍｇ／日，４０００〜５０００ｍｇ／日又は５０００〜１００００ｍｇ／日である。ヒトにおける用量はＬＤ５０よりも低くすべきである。経口でのＬＤ５０は、ラット群において体重１ｋｇあたり１１９００ｍｇであり（アスコルビン酸に関する製品安全データシート）、マウスの場合にはそれよりも低い（３３６７ｍｇ／ｋｇ）。用量は１日あたり１回又は数回投与され得る。１０００ｍｇを超える用量が１日あたり２回以上投与される場合、投与間隔は少なくとも３０分間であることが好ましい。
【００７２】
幾つかの研究によって、経口でのビタミンＣの血清濃度は約２００〜２４０ｍｇの用量で飽和に達することが示唆されているが、これらの研究は、一般的に、１２又は２４時間後の血漿濃度の測定結果を基準としている。ビタミンＣの半減期は３０分であるので、実際の血清飽和濃度はもっと高いはずであり、高用量又はメガドーズのビタミンＣの投与が実現可能であるはずである。米国農務省（ＵＳＤＡ）の人間栄養研究センター（Human Nutrition Research Center）が１９９１年に実施した研究によって、２０００ｍｇ／日のビタミンＣを摂取する高齢者では、１４８ｍｇ／日のビタミンＣを摂取する高齢者と比較して、眼のビタミンＣ濃度がより高いことが報告されており、それは、より高用量のビタミンＣが組織に吸収され、分布することを示している（Taylor等, Current Eye Research, 1991, 10(8):751-759）。３０〜１８０ｍｇ／日の用量において、約７０〜９０％の経口摂取ビタミンＣが吸収される（ビタミンＣに関する報告書（Fact Sheet at ods.od.nih.gov））。しかしながら、用量が増加するほど、吸収は減少する。高濃度のビタミンＣは、白血球、眼、副腎、下垂体及び脳で観察される最も高濃度を有する細胞及び組織で維持される（ビタミンＣに関する報告書（Fact Sheet at ods.od.nih.gov））。
【００７３】
ビタミンＣは水溶性であるので（３３ｇ／１００ｍＬ）、体内に蓄積されず、高用量又はメガドーズであってもビタミンＣの毒性は極めて稀である。ビタミンＣを大量に摂取すると、消化不良を引き起こし得る。特に空腹時に大量に摂取すると、下痢を引き起こし得る（news-medical.net/Vitamin-C-Side-Effects.aspx）。１９３６年の試験では、アスコルビン酸を６ｇ以下の用量で１４００日以上にわたり、２９人の幼児、未就学年齢及び就学年齢の９３人の子供、並びに２０人の成人に与えた。高用量では、中毒症状が５人の成人及び４人の幼児で観察された。成人における兆候及び症状は悪心、嘔吐、下痢、顔面紅潮、頭痛、倦怠感及び睡眠障害であった。幼児における主要な中毒反応は、皮膚発疹であった（Widenbauer, Klin. Wschr, 33:1157, 1936）。別の研究では、３年までの期間、毎日、ビタミンＣを１００００ｍｇまでの用量で摂取しても安全であることが報告されている（Bendich等, J. Am. College Nutr., 1995, 14（2）:124-136）。
【００７４】
ｂ．リポソーム組成物
栄養補助剤又は組成物を様々なリポソーム組成物に封入することができる。ビタミンＣの形態（アスコルビン酸、アスコルベート、無機塩、エステル等）、投与方法等の検討事項に応じて、リポソーム組成物の構成及び比率を選択することは、当業者の技術常識の範囲内にある。ある実施形態では、リポソーム封入薬剤はＬ−アスコルビン酸又はその無機塩もしくはエステルである。
【００７５】
本発明のリポソーム組成物は、安定性が高いことが証明されている。さらに、高温で保存した場合にも本発明のリポソーム組成物の安定性が高いことが証明されている。このことは、熱に対する感受性が高く、熱によってその分子の酸化が加速されるビタミンＣにとって特に有益である。「安定性」とは、ビタミンＣの大部分を保持する製剤を意味する。好ましくは、少なくとも約６５％，７０％，８０％，９０％，９５％，９７％，９８％もしくは９９％又はそれを超える、あるいは１００％のビタミンＣがリポソーム中に保持される。リポソームが高温（例えば約５０℃）で保存される場合、好ましくは、少なくとも約６５％のビタミンＣがリポソーム中に保持される。実施例のリポソーム組成物は、アスコルビン酸ナトリウム（１８．４重量％）をAlcolec PC 50脂質を含むリポソーム中に封入することにより調製された（実施例１及び４参照）。実施例４に記載されるように、リポソーム組成物は、Ｎ2下で密閉された２ｍＬのバイアル中、室温（２５℃）又は高温（５０℃）で保存された。４，５，７（２つのバイアルを測定した），８及び３８日目に、アスコルビン酸の重量％をＨＰＬＣで測定した。図３に示すように、室温で保存されたバイアルにおけるアスコルビン酸（重量％）は、保存期間全体にわたり安定性が高かった。３８日目では、４日目に存在していたアスコルビン酸の９９．８％が、依然としてサンプル中に存在していた。このことは、２５℃で３８日間保存した後、ビタミンＣがほとんど又は全く分解されていないことを示す。好ましくは、アスコルビン酸の大部分が少なくとも約１週間，２週間，３週間，１ヶ月間，２ヶ月間，３ヶ月間，６ヶ月間又は１年間、リポソーム中に保持される。
【００７６】
高温下でさえ、リポソーム組成物中のビタミンＣ含有量は高度に安定である。図３に示すように、５０℃で２０日間の保存後、ビタミンＣの出発量の約９６％が安定に保持されていた。４２日間の保存後であっても、アスコルビン酸の８０．８重量％が依然としてリポソーム組成物中に存在していた。さらに、図６に示すように、封入アスコルビン酸ナトリウムの重量％は、室温（２５℃）及び高温（４０℃）の保存後（１２０日間の保存後でさえも）、安定性を維持していた。
【００７７】
この安定性は、現在利用されているビタミンＣ組成物に少なくとも匹敵する。実施例１に記載されるように非ＧＭＯ脂質を用いて調製された本発明のリポソーム組成物の保存安定性は、実施例５に記載されるように、市販のビタミンＣリポソーム製剤（LivOn Laboratoriesの市販品であるLypo-SphericTM ビタミンＣリポソーム）に匹敵した。本発明のリポソーム組成物及びLypo-SphericTM ビタミンＣリポソームは、Ｎ2下で密閉された２ｍＬのバイアル中、高温（５０℃）で保存された。比較として、Lypo-SphericTM ビタミンＣリポソームについて、オリジナルパッケージ中で保存した場合のリポソーム安定性についてもモニタリングした。アスコルビン酸の重量％を０，４，１３及び１９日目に測定した。図４に示されるように、４日後、出発量の約９２％のビタミンＣが安定性を維持しており、１３日後、出発量の約９７％のビタミンＣが安定性を維持しており、１９日後、約８９％のリポソームが安定性を維持していた。これは、１９日間にわたってアスコルビン酸の約９９〜９０％がリポソーム中に保持されるLypo-SphericTM ビタミンＣリポソームと匹敵する。
【００７８】
図４に示されるように、Lypo-SphericTM ビタミンＣリポソームの安定性は、オリジナルパッケージ中で保存した場合（Ｎ2下で密閉）に、より大きく、１９日後にアスコルビン酸の９９．５重量％が保持される。本発明のリポソーム組成物の安定性はLypo-SphericTM ビタミンＣリポソームに匹敵するので、本発明のリポソームを同様にＮ2密閉フラッシュパッケージ中で保存すれば、同様の安定性が得られるであろう。
【００７９】
図５は、様々なロットの本発明のリポソーム及びLypo-SphericTM ビタミンＣリポソームについて、９０日間にわたるリポソームの安定性を比較した図である。図５に示すように、出発量の約６５％のアスコルビン酸が、５０℃で３ヶ月の保存後に活性を維持していた。これは、Lypo-SphericTM ビタミンＣリポソームと比較して、非常に高い安定性である。図５に示すように、 Lypo-SphericTM ビタミンＣリポソーム中のアスコルベートは、本発明のリポソームよりも速く安定性を失った。
【００８０】
ｃ．使用方法
別の態様では、本発明の方法で調製したリポソーム組成物の使用方法が意図される。もちろん、使用方法又は処置方法は、封入された化合物に依存する。以下に、使用方法の幾つかの例を示すが、それが単なる例示であることが当業者に理解されるであろう。
【００８１】
ある態様では、リポソーム封入ビタミンＣの投与により、壊血病、心臓血管疾患、脳血管疾患、癌、加齢性黄斑変性症、白内障、痛風、重金属毒性（例えば鉛、ヒ素、カドミウム、銅、水銀等）又は糖尿病を治療又は予防する方法が提供される。ある実施形態では、その用量は、高用量又はメガドーズのリポソーム封入ビタミンＣである。ビタミンＣは、抗酸化物質であるとともに、少なくとも８種類の酵素反応の補因子である。また、ビタミンＣは、血管、靱帯及び骨の重要な構成成分であるコラーゲン合成で必要とされる。また、ビタミンＣは、神経伝達物質であるノルエピネフリンの合成において重要な役割を果たす。さらに、ビタミンＣは、血中コレステロール濃度に影響を与える、胆汁酸へのコレステロール代謝に関連する（Simon等, Arch. Intern. Med., 2000, 160(7):931-936）。何人かの個人及び幾つかの機関によって、様々な疾病及び疾患を処置するために、ビタミンＣの大量投与が推奨されている（Linus Pauling Institute at lpi.oregonstate.edu/infocenter/vitamins/vitaminC/index.html）。ビタミンＣが、壊血病の治療及び予防に加え、心臓血管疾患、脳血管疾患、癌、加齢性黄斑変性症、白内障、痛風、重金属毒性（例えば鉛、銅（Mahajan等, Asian J. of Microbiology, Biotech. & Env. Sci., 2001, 3(1-2):95-100）、水銀（Mahajan等）、カドミウム（Borane等, J. Aquatic Biology, 2006, 21（2）:244-248）、ヒ素（Karasawas等, Blood, 2005, 105(10):4004-4012）等）及び糖尿病の治療又は予防に有効であることが、調査によって示されている。
【００８２】
心臓血管疾患
心臓血管疾患は、心臓又は血管に関連する一群の疾患である。心臓血管疾患としては、特に限定されるわけではないが、例えば、高血圧、冠動脈性心疾患（例えば心筋梗塞、狭心症等）、脳卒中及び心不全が挙げられる。冠動脈性心疾患は、コレステロール等の脂肪物質の蓄積による冠状動脈の狭窄であるアテローム性動脈硬化によって引き起こされる。冠動脈性心疾患は米国における主要な死因の一つである（American heart.org）。
【００８３】
ビタミンＣが、単球の内皮細胞への接着を低減させ、内皮細胞依存的な酸化窒素産生及び血管拡張を促進させ、血管平滑筋細胞のアポトーシスを低減させることが示されている（Honarbakhsh等, Br. J. Nutr., 2008, 1-19）。ランダム化二重盲検プラセボ対照試験によって、ビタミンＣでの処理の結果、冠動脈性心疾患に罹患する被験者、あるいは狭心症、鬱血性心不全、高コレステロール又は高血圧に罹患する被験者における血管拡張が促進したことが示されている（Gokce, Circulation, 1999, 99（25）:3234-3240; Versari等, Br. J. Pharmacol., 2009, 157（4）:527-536; 及び Frikke-Schmidt等, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2009, 104（6）:419-433）。
【００８４】
幾つかの研究によって、心臓血管疾患に対するビタミンＣ補給の効果が示されている。脳卒中既往歴のない４０〜７９歳の男女２０６４９人の前向き研究において、血漿ビタミンＣ濃度が、脳卒中との関連でモニタリングされた。血漿ビタミンＣのベースライン濃度が最上位の四分位数にある被験者は、最下位の四分位数にある被験者よりも、脳卒中のリスクが４２％低かった（Myint等, Am. J. Cling. Nutr., 2008, 87(1):64-69）。Linxian試験では、５〜６年間、毎日、ビタミンＣ（１２０ｍｇ）及びモリブデンを補給したところ、脳血管疾患による死亡リスクが８％減少したことが、補給中断後１０年間の追跡調査で示された（Qiao等, J. Natl. Cancer Inst., 2009, 101(7):507-518）。９つの研究の統合分析によって、≧７００ｍｇ／日のビタミンＣを摂取した人々は、冠動脈性心疾患のリスクが２５％低かったことが示された（Knekt等, Am. J. Clin. Nutr., 2004, 80(6):1508-1520）。
【００８５】
癌
疫学的証拠によって、果物及び野菜の摂取量が大きいほど、大部分のタイプの癌のリスクが低くなるという関連性が示唆されており、それは、おそらく部分的には、それらのビタミンＣ含有量が大きいことに起因する（Li等, J. Nutr., 2007,137:2171-84）。多数の症例対照研究によって、食事によるビタミンＣ摂取と、肺癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、胃癌、口腔癌、喉頭癌、咽頭癌及び食道癌との間の逆相関が示されている（Jacob等, Nutr. Clin. Care, 2002, 5:66-74）。また、血漿ビタミンＣ濃度は、対照よりも癌患者の方が低い（Carr等, Am. J. Clin. Nutr., 1999, 69:1086-107）。
【００８６】
ビタミンＣの静脈内投与によって、血漿濃度が２６０００μモル／Ｌに達することが示されている（Padayatty等, CMAJ 2006, 174:937-942）。この濃度は、in vitroで、腫瘍細胞に対する選択的な細胞傷害性を示す（Li等, J Nutr 2007, 137:2171-84; 及びShekelle等, Evidence Report/Technology Assessment No. 83 AHRQ Publication No. 03-E043. Rockville, MD: Agency for Healthcare Research and Quality, 2003）。マウスでの研究において、薬理学的量のビタミンＣの静脈内投与が、それ以外では治療が困難な腫瘍に対する治療効果が期待されることが示唆されている（Chen等, Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105:11105-11109）。高濃度のビタミンＣは、酸化促進剤として機能し、癌細胞に対して選択的な細胞傷害性を示す過酸化水素を発生させ得る（Chen等, 2009; Chen等, Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102:13604-13609; 及び Chen等, Proc Natl Acad Sci U S A, 2007,104:8749-8754）。また、高用量のビタミンＣを静脈内投与した後に、進行癌の患者の生存期間が顕著に延長したという、幾つかの症例報告がある（Levine等, Free Radic, Biol. Med., 2009, 47:27-29）。
【００８７】
糖尿病
糖尿病は、身体におけるインスリン産生能力及び／又は利用能力の異常によって生じる高血糖レベルで特徴付けられる一群の疾患である。米国のみで、２３．６百万人もの人たちが、１型糖尿病、２型糖尿病及び妊娠性糖尿病のうちの１種の糖尿病に罹患している（diabetes.org）。
【００８８】
１型糖尿病は、通常、子供及び若年成人に見られ、インスリン産生不能によって特徴づけられる。１型糖尿病の治療は、通常、インスリン療法を必要とする。１９９３年に行われた１型糖尿病患者の研究において、ビタミンＣの静脈内投与により、インスリンに関する二峰性（bimodal）の血漿濃度曲線が得られることが示されている（Kodama等, In Vivo, 1993, 7(6A):535-542）。これらの結果は、ビタミンＣが、インスリンのメカニズムを刺激することにより糖尿病の治療に有効であることを示唆する。さらに、ビタミンＣは、グルコース調節に異常がある糖尿病患者で生じる血管損傷を予防又は低減するために用いることができる。
【００８９】
２型糖尿病は、最も一般的な糖尿病の形態である。２型糖尿病は、十分なインスリンを産生する身体能力の低下（不能）又はインスリンを効率的に利用する細胞能力の低下（不能）によって特徴付けられる。２型糖尿病の患者に関する研究（Yazd Diabetes Research Center）において、１日あたり１０００ｍｇのビタミンＣ補給剤を摂取した患者では、１日あたり５００ｍｇのビタミンＣ補給剤を摂取した患者と比較して、４２日後には、空腹時血糖、トリグリセリド、低比重リポタンパク、糖化ヘモグロビン及び血清インスリン濃度が有意に減少したことが示されている（Afkhami-Ardekani等, Indian J. Med. Res., 2007, 126(5):471-474）。空腹時血糖の平均濃度は、１６９．３３ｍｇ／ｄｌから１４４．８０ｍｇ／ｄｌまで減少した。平均ＨｂＡ1Ｃは、８．８２％から７．６６％まで減少した。平均ＬＤＬは、１３０．９５ｍｇ／ｄｌから１２５．９１ｍｇ／ｄｌまで減少した。インスリン濃度は、１６．９１μユニット／ｍＬから８．７７μユニット／ｍＬまで減少した。これらの結果は、少なくとも約１０００ｍｇのビタミンＣ補給剤の毎日の摂取が、２型糖尿病の患者における血糖及び血中脂質を減少させるのに有効であることを示す。
【００９０】
加齢性黄斑変性症及び白内障
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）及び白内障は、高齢者における失明の主要な２つの原因である。ＡＭＤは、黄斑に影響を与え、その結果、中心視野（sharp, central vision）が徐々に失われる。滲出型（wet type）のＡＭＤは、網膜の後ろの異常血管が黄斑下で増殖し、黄斑にダメージを与えることにより発症する。萎縮型（dry type）のＡＭＤは、黄斑内の感光性細胞がゆっくりと破壊され、中央視野のぼやけを引き起こされることにより発症する。白内障は、眼の水晶体又はその膜において進行する混濁である。重症の白内障に対する現在の治療は、レンズを取り替える外科手術である。
【００９１】
酸化的ストレスはＡＭＤ及び白内障の両方の病因となり得るので、ビタミンＣ等の抗酸化物質がこれらの疾患を治療又は予防するために用いることができる。研究によって、ビタミンＣがＡＭＤの進行を遅らせ得ることが示されている（Evans, Cochrane Database Syst. Rev., 2006, (2):CD000254）。さらに、前向き研究によって、食事によるビタミンＣ摂取が、中高年の日本人女性において、加齢に関連した白内障のリスクを低減したことが示されている（Yoshida等, Eur. J. Nutr., 2007, 46:118-124; 及び Rautiainen等, Am. J. Clin. Nutr., 2010, 19(2):487-493）。
【００９２】
ビタミンＣは、よく知られた抗酸化物質であるので、ある態様において、リポソーム封入ビタミンＣによって治療又は予防される疾患又は症状は、抗酸化物質によって治療又は予防が可能である任意の疾患又は症状が意図される。
【００９３】
２．グルタチオン
グルタチオン（ＧＳＨ）は、アミノ酸であるシステイン、グルタミン酸及びグリシンから合成されるトリペプチドである。ＧＳＨは、システインのアミン基と、グルタミン酸の側鎖のカルボキシル基との間のペプチド結合を含む。ＧＳＨは、細菌及び哺乳動物細胞に１〜１０ミリモル濃度で存在し、還元状態において細胞タンパク質のシステイン残基を維持するスルフヒドリル緩衝剤として機能する（米国特許第７,７８５,９００号）。ＧＳＨは、２種類の基本的な形態で存在する。抗酸化物質である「還元型」グルタチオントリペプチドは、一般的に、「グルタチオン」又は「ＧＳＨ」と呼ばれる形態であり、酸化型形態は、硫黄−硫黄結合を有する化合物であり、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）として知られている。ＧＳＨは、細胞によって産生される主要な内因性抗酸化物質であり、フリーラジカル及び活性酸素化合物の中和に直接的に関与するとともに、ビタミンＣ、Ｅ等の外因性抗酸化物質をその還元型（活性）形態に維持する。ＧＳＨは、抗酸化物質、抗毒素及び赤血球保護物質として機能するので、免疫系において非常に重要である（米国特許ＲＥ４０８４９）。ＧＳＨは、フリーラジカルを中和し、それによるダメージを最小限にするので、細胞恒常性において重要である。哺乳動物細胞における還元型ＧＳＨ濃度は、様々な病態生理学的状態、例えば、癌、肝機能異常、悪性腫瘍、ＡＩＤＳ、外傷（trauma）、熱傷、敗血症、肺疾患、パーキンソン病、糖尿病、アルツハイマー病、統合失調症、嚢胞性線維症、心臓麻痺及び心臓発作、痙攣（癲癇）、鎌状赤血球貧血、躁鬱病（bipolarism）、慢性疲労症候群、自閉症又は関連免疫疾患及び生理学的症状と関連する（例えば、Kidd, Alternative Medicine Review, 1997, 2(3): 156-176）。
【００９４】
経口されたＧＳＨは消化管で十分に吸収されないため、ＧＳＨの直接的な補給は困難である（Witschi等 (1992), European Journal of Clinical Pharmacology, 43(6):667-669）。米国特許第７,４４６,０９６号には、リン脂質に共有結合したＰＥＧにグルタチオンを共有結合させて、リポソーム担体に挿入するというデリバリーシステムが記載されている。さらに、肺に投与された場合のリポソーム封入ＧＳＨの分布に関する研究によって、ＧＳＨは肺にとどまったことが示されている（Romet等, Int. J. Pharma., 63(3):227-235）。LipoceuticalTM グルタチオンは経口用液体であり、現在市販されているリポソーム封入グルタチオンである。小さじ一杯（５ｍＬ）には４２２．７ｍｇのグルタチオンが含まれる（成分リスト）。
【００９５】
ＧＳＨに関する推奨食事許容量（ＲＤＡ）は存在しないが、その補給について有害な副作用は知られていない（website at vitaminstuff.com/glutathione.html）。ある実施形態では、リポソーム封入ＧＳＨの有効量が投与される。治療又は予防に要する正確な用量は、試験用量の投与及び臨床反応の観察に基づいて決定することができる。一般的に、投与されるべき有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲内にある。別の実施形態では、１日あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２５ｍｇ／ｋｇ体重が投与される。さらに別の実施形態では、１日あたり約５０〜１０００，５０〜２０００，５０〜３０００，５０〜４０００，５０〜５０００ｍｇ又は５０〜１００００ｍｇが投与される。好ましくは、１日あたり約５０〜５００ｍｇが投与される。
【００９６】
ａ．リポソーム封入グルタチオンの使用方法
癌
ある態様では、リポソーム封入ＧＳＨが、癌の症状の予防、治療又は改善のために投与される。多くの癌が、細胞ＤＮＡに対するダメージによって進行し、その結果、ダメージを受けた細胞の無制御かつ自律的な成長及び増殖が生じる。ある理論によれば、細胞ＤＮＡに対するダメージは、フリーラジカルへの曝露によってたびたび引き起こされる。抗酸化物質であるＧＳＨは、フリーラジカルと反応し、フリーラジカルとＤＮＡとの接触を防止することにより、癌を引き起こすダメージを防止する。
【００９７】
最近の研究の予備結果において、グルタチオンが実験室で成長させた単離細胞における活性酸素種レベルを変化させ、癌の進行を低減させ得ることが示されている（Park, Oncology Reports, 2009, 385-391）。１９９３年に行われた動物実験において、ＧＳＨが口腔発癌の進行を抑制したことが示されている。ＤＭＢＡへの曝露後にＧＳＨが経口で補給された動物は、未処理対照群よりも、腫瘍の数及び大きさが有意に減少したことが示されている（Yance等, Herbal Medicine, Healing and Cancer, Keats Publishing, 1999）。別の研究において、化学療法（シスプラチン）で処置するとともに、グルタチオンを静脈内投与した卵巣癌女性は、化学療法による副作用をほとんど示さず、処置サイクル数の増加に忍容性を示し、全生存率が向上したことが示されている（Yance等）。
【００９８】
ＧＳＨの投与を、癌の処置のための慣用の放射線療法及び化学療法とともに行うと、予後が改善することが示されている。結腸直腸癌において、ＧＳＨの投与を、オキサリプラチン（oxaliplatin）／５−フルオロウラシル／ロイコボリン療法とともに行うと、当該療法の単独投与と比較して神経毒性が減少したことが示されている（Milla等, 2009, Anticancer Drugs, 20(5):396-402）。ある実施形態では、リポソーム封入ＧＳＨが、化学療法剤と併用投与（化学療法剤の投与前、投与後、又は化学療法剤の投与と同時）され、化学療法剤の有毒作用が低減、防止又は改善される。ＧＳＨと併用投与し得る化学療法剤としては、特に限定されるわけではないが、例えば、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）、タキソール（パクリタキセル）及びその誘導体（例えば、タキソテール）、アントラサイクリン、及び白金製剤（例えばシスプラチン）（米国特許第５,６１８,８２３号，当該文献は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９９】
ＡＩＤＳ
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）レトロウイルスへの曝露によって引き起こされる免疫系のダメージの結果として生じる様々な感染症及び症状である。症状が進行すると、罹患患者における日和見感染症及び腫瘍増殖のリスクが増大する。さらに、ＨＩＶ感染患者は、非感染者よりも、酸化的ストレス、内皮機能不全及び心臓血管疾患の発症率が高い（Kline等, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2008, 294(6):H2792-H2804）。ＨＩＶ−１ラットモデルを用いた研究において、ＧＳＨ前駆物質の投与によってグルタチオンレベルが回復すると、スーパーオキシド、ＮＯ及び血管弛緩に対するＨＩＶ−１タンパク質媒介作用が逆転することが示されている（Kline等）。また、ＧＳＨの投与は、免疫系を亢進し、日和見感染を予防することにより、ＡＩＤＳを治療することができる。ＨＩＶ感染患者から単離された血球をＧＳＨ前駆物質で処理すると、M.tuberculosisの細胞内感染のコントロールが改善したことが示されている（Venketaraman等, 2006, AIDS Res. Ther., 3:5）。また、ＧＳＨは、ウイルス複製後期における抗ウイルス効果を有することが示されている（Garaci等, 1997, J. Leukoc. Biol., 62(1):54-59）。ＨＩＶ患者の低ＧＳＨレベルに基づき、それ以外では区別できないＨＩＶ感染患者の低生存率が予測されたことが示されている（Garaci等）。ある実施形態では、リポソーム封入ＧＳＨがＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの治療又は予防のために投与される。別の実施形態では、リポソーム封入ＧＳＨが日和見感染ならびにＨＩＶ及びＡＩＤＳ関連疾患の治療又は予防のために投与される。
【０１００】
熱傷
熱傷は皮膚の損傷であり、例えば、熱、電気、化学品、光、放射線、摩擦又は低温への曝露によって引き起こされる。熱傷は、ショック、感染症及び呼吸困難を伴う場合もある。熱傷は、一般的に、第一度、第二度、第三度、第四度、第五度又は第六度に分類される。第一度熱傷は、通常、表皮の浅い損傷に限定される。第二度熱傷は、真皮表層（真皮乳頭層）の損傷を含み、真皮深層（真皮網状層）の損傷も含む場合がある。また、第二度熱傷は、神経損傷も含む場合がある。第三度熱傷は、皮下組織に対する表皮損傷又は障害を含む。第四度熱傷は、真皮破壊及び筋肉損傷を含む。第五度熱傷は、表皮、真皮及び皮下組織の破壊を含む。第六度熱傷は、表皮、真皮、皮下組織及び筋肉の破壊を含む。これらの熱傷は、骨の炭化（charring）も含む場合がある。最新の分類では、熱傷を厚さ（表層（superficial），中間層（partial））及び深さ（表層（superficial），中間層（partial））で分類する。免疫系に対する効能に加え、ＧＳＨの使用は、熱傷治療の目標の一つである血流の停滞（zone of stasis）の治療に有効である（Zor等, 2005, Burns, 31（8）:972-976.）。ある実施形態では、リポソーム封入ＧＳＨが熱傷の処置のために投与される。
【０１０１】
３．アルファリポ酸
アルファリポ酸（ＡＬＡ）は、体内に存在する抗酸化物質である。水溶性又は脂溶性のいずれかでしかない他の抗酸化物質と異なり、ＡＬＡは水溶性及び脂溶性を兼ね備える。また、ＡＬＡが他の抗酸化物質を再生させる能力を有することを示唆する証拠が示されている（Jones等, Free Radic Biol Med., 2002, 33(1):83-93.）。
【０１０２】
ＡＬＡのＣ６炭素原子はキラルであるので、ＡＬＡ分子はＲ及びＳエナンチオマーとして存在する。Ｒ−(＋)−リポ酸（Ｒ−ＬＡ）は、エネルギー産生ならびにアルファ−ケト酸及びアミノ酸の異化（分解）に関連した重要な反応を触媒する幾つかのミトコンドリア酵素複合体の必須の補因子である（Bustamante等, Free Radic Biol Med. 1998, 24(6):1023-1039）。Ｒ／Ｓラセミ混合物（Ｒ／Ｓ−ＬＡ）及びＲ−ＬＡは、米国において、カプセル剤、錠剤及び水性液剤の剤形のＯＴＣ（over-the-counter）栄養補助剤として広く利用されている。さらに、リポソームＡＬＡ皮膚クリームも利用されている（Reviva Labs）。ＡＬＡは様々な食物中に存在するが、食物からのＡＬＡの摂取によって、ヒト血漿又は細胞における遊離ＡＬＡが検出可能に増加することは未だ示されていない（Hermann等, Eur J Pharm Sci. 1996, 4:167-174）。これとは対照的に、高用量（５０ｍｇ又はそれを超える）の遊離ＡＬＡの経口摂取によって、血漿及び細胞における遊離ＡＬＡが、有意ではあるが一時的に増加することが示されている（lpi.oregonstate.edu/infocenter/othernuts/la/）。ヒトでの薬物動態学的研究において、Ｒ−ＬＡの経口投与量の約３０〜４０％が吸収されることが示されている（Hermann等）。アルファリポ酸は、３０〜１００ｍg用量の錠剤として購入可能である。
【０１０３】
ＡＬＡに関するＲＤＡは存在しないが、一定量（labeled dose）の補給による有害な副作用は知られていない。高用量では、胃のむかつき、悪心、下痢及び鼓腸が生じる場合がある（nutritional-supplements-health-guide.com/alpha-lipoic-acid-side-effects.html）。ある実施形態では、有効量のリポソーム封入ＡＬＡが投与される。ある実施形態では、リポソーム組成物は、ＡＬＡのＲ−エナンチオマーを含む。別の実施形態では、リポソーム組成物は、ＡＬＡのラセミ混合物を含む。治療又は予防に要する正確な用量は、試験用量の投与及び臨床反応の観察に基づいて決定することができる。ある実施形態では、１日あたり約１０〜１００００ｍｇが投与される。別の実施形態では、１日あたり約１０〜５０，１０〜１００，１０〜５００，１０〜１０００，２０〜１００，２０〜５００，２０〜１００，５０〜１００，５０〜２００，５０〜３００，５０〜４００，５０〜６００，５０〜８００，５０〜９００，５０〜１０００，５０〜２０００，５０〜３０００，５０〜４０００，５０〜５０００又は５０〜１００００ｍｇが投与される。好ましくは、１日あたり約５０〜５００ｍｇが投与される。一般的な抗酸化物質の効能を得るために、ある実施形態では、１日あたり２０〜５０ｍｇが投与される。用量は、分割して１日あたり２回又はそれ以上投与してもよい。
【０１０４】
ある非限定的な実施形態では、リポソームは約２．５〜１０重量％のＡＬＡ（Ｎａ ＡＬＡ又はＮａ Ｒ−ＡＬＡ）を含む。別の実施形態では、リポソームは少なくとも約２．５〜５重量％のＡＬＡを含む。相分離を防止又は低減させるために、約７．５％よりも少ない重量％を含むことが好ましい場合もある。実施例９に記載されるように、リポソームは高い安定性を示し、室温又は高温（４０℃）で５０日間保存した後に、封入ＡＬＡの９０％がリポソーム内に保持された。非限定的な実施形態では、ＡＬＡ封入リポソームは、少なくとも約１〜３ヶ月安定である。好ましい実施形態では、ＡＬＡ封入リポソームは少なくとも約３ヶ月安定である。
【０１０５】
ａ．リポソーム封入ＡＬＡの使用方法
ある実施形態では、ＡＬＡは、酸化的ストレス又はダメージ（Toklu等, J. Spinal. Cord Med., 2010, 33(4):401-409）、糖尿病、肝臓疾患、炎症（Odabasoglu等, Br. J. Nutr., 2010, Nov. 15:1-12）、アルツハイマー病等の神経変性疾患（Zara等, Exp. Gerontol., 2010, Nov. 8）、心臓血管疾患、末梢神経損傷（Ranieri等, J. Brachial. Plex. Peripher. Nerve Inj., 2010, 5:15）、統合失調症（Seybolt, Med. Hypotheses, 2010, 75(6):572-575）、肥満（Carbonelli等, Curr. Pharm., Des., 2010, 16(7):840-846）、癌（Schwartz, Oncol., Rep., 2010, 23(5):1407-1416）及び高血圧（Kizhakekuttu等, Cardiovasc., Ther., 2010, 28(4):e20-e32）を治療又は予防するために使用される。
【０１０６】
糖尿病
複数の研究において、高用量のＡＬＡが２型糖尿病患者におけるグルコース利用を改善し得ることが示されている。１３人の２型糖尿病患者の臨床試験において、１０００ｍｇのラセミＡＬＡを単回静脈内注入したところ、偽薬注入と比較して、インスリン刺激性の糖処理（インスリン感受性）が５０％改善したことが示されている（Jacob等, Arzneimittelforschung. 1995, 45(8):872-874）。７２人の２型糖尿病患者における別のプラセボ対照比較試験において、ラセミＡＬＡを６００ｍｇ／日，１２００ｍｇ／日又は１８００ｍｇ／日の用量で経口投与したところ、処理４週間後、インスリン感受性が２５％改善したことが示されている（Jacob等, Biofactors, 1999, 10(2-3):169-174）。この試験において、ＡＬＡの３種類の用量に有意な差がないことが示されており、６００ｍｇ／日が最大有効用量となり得ることが示唆される（Ziegler等, Treat Endocrinol., 2004, 3(3):173-189）。さらに、ＡＬＡは、糖尿病患者の血糖レベルを低減し得ることが示されている（Melhem等, J Am Soc Nephrol., 2002, 13:108-116）。
【０１０７】
ＡＬＡのフリーラジカル消去能は、糖尿病により神経損傷（末梢神経障害）が生じた患者において、痛み、灼熱感（burning）、かゆみ、うずき（tingling）及びしびれ（numbness）を低減するのに有効である（Androne等, In Vivo, 2000, 14(2):327-330）。ＡＬＡは、欧州で数年間、末梢神経障害の治療に使用されている。
【０１０８】
別の実施形態では、リポソームＡＬＡは、糖尿病に関連する又は糖尿病に伴う血管疾患の処置に使用される。血管の内壁（内皮細胞）は、血管疾患を予防する上で重要な役割を果たす。内皮機能は、糖尿病患者において損なわれている場合が多く、そのような患者は、血管疾患リスクが高い（Schalkwijk等, Clin Sci (Lond)., 2005,109(2):143-159）。ラセミＬＡの動脈内注入により、糖尿病患者では、内皮細胞依存性の血管拡張が改善するが、健常対照ではしないことが示されている（Heitzer等, Free Radic Biol Med., 2001, 31(1):53-61）。
【０１０９】
また、ＡＬＡは、糖尿病に関連する症状である自律神経障害の処置に使用され、心臓に分布する神経に作用する。ある研究において、７３人の自律神経障害患者が８００ｍｇのアルファリポ酸を経口摂取したところ、プラセボと比較して自律神経障害が改善したことが示されている（umm.edu/altmed/articles/alpha-lipoic-000285.htm）。
【０１１０】
ある実施形態では、１日あたり少なくとも約６００〜８００ｍｇのリポソーム封入ＡＬＡが、糖尿病、糖尿病性神経障害及び／又は糖尿病に起因する血管合併症に罹患した患者に投与される。
【０１１１】
肝臓疾患
ＡＬＡは、Ｃ型肝炎の処置において、シリマリン及びセレンと組み合わせて使用されている（Berkson, Med Klin, 1999, 94（Suppl. 3）:84-89）。この研究において、慢性Ｃ型肝炎感染症に続発する肝硬変、門脈圧亢進症及び食道静脈瘤に罹患した３人の患者をＡＬＡで処置したところ、臨床検査値が改善したことが示されている。ある実施形態では、リポソーム封入ＡＬＡが、肝臓疾患及び／又は肝炎の処置のために投与される。
【０１１２】
脳卒中
アルファリポ酸は脳内に容易に進入できるので、脳及び神経組織に対する保護作用を有する。ＡＬＡは、脳卒中、及びフリーラジカルによるダメージに関連するその他の脳疾患に対する治療の可能性について研究されている。例えば、アルファリポ酸で処置した動物では、生じる脳のダメージが減少し、脳卒中後の生存率が、アルファリポ酸を摂取していない動物よりも４倍高かったことが示されている（Panigrahi等, Brain Res., 1996, 717(1-2):184-188）。ある実施形態では、リポソーム封入ＡＬＡが脳卒中の処置のために投与される。
【０１１３】
ＨＩＶ／ＡＩＤＳ
ＡＬＡの補給は、血中総ＧＳＨレベルを回復させ、リンパ球のＴ細胞マイトジェンに対する反応性を改善することにより、ＨＩＶ及びＡＩＤＳ患者に対してプラスの影響を与える（Jariwalla等, 2008, J. Altern. Complement Med., 14（2）:139-146）。ある実施形態では、リポソーム封入ＡＬＡがＨＩＶ及びＡＩＤＳの処置のために投与される。
【０１１４】
Ｂ．医薬品
本発明の低温法を用いてリポソーム中に封入するのに適した医薬品としては、例えば、以下の治療活性を有する天然及び合成の化合物が挙げられる：抗関節炎薬，抗不整脈薬，抗菌剤，抗コリン作用薬，抗凝血剤，抗利尿薬，解毒剤，抗てんかん薬，抗真菌薬，抗炎症薬，代謝拮抗薬，抗片頭痛薬，抗腫瘍薬，抗寄生虫薬，解熱薬，抗けいれん薬，抗血清，鎮痙薬，鎮痛薬，麻酔薬，β遮断薬，生物反応修飾薬，骨代謝調節薬，心臓脈管薬，利尿薬，酵素薬，排卵誘発薬，成長促進薬，止血薬，ホルモン薬，ホルモン抑制薬，高カルシウム血症改善薬，低カルシウム血症改善薬，低血糖改善薬，高血糖改善薬，免疫抑制薬，免疫増強薬，筋弛緩薬，神経伝達物質，副交感神経作用薬，交感神経作用薬，血漿増量薬，血漿増補液，向精神薬，血栓溶解薬及び血管拡張薬。ある実施形態では、医薬品は細胞毒性薬又は物質であり、以下の具体例が挙げられる。アントラサイクリン系抗生物質、例えば、ドキソルビシン，ダウノルビシン，エピルビシン及びイダルビシン；白金化合物、例えば、特に限定されるわけではないが、シスプラチン，カルボプラチン，オルマプラチン，オキサリプラチン，ゼニプラチン，エンロプラチン，ロバプラチン，スピロプラチン，（(−)−(Ｒ)−２−アミノメチルピロリジン（１,１−シクロブタン ジカルボキシラト)白金）（ＤＷＡ２１１４Ｒ），（ＳＰ−４−３(Ｒ)−１,１−シクロブタン−ジカルボキシラト(２−)−(２−メチル−１,４−ブタンジアミン−Ｎ,Ｎ')白金）（ＣＩ−９７３），ネダプラチン（２５４−Ｓ）及び（ビス−アセタト(acetato)−アンミン(ammine)−ジクロロ−シクロヘキシルアミン−白金(ＩＶ)）；トポイソメラーゼ１阻害物質、例えば、特に限定されるわけではないが、トポテカン，イリノテカン，（７−(４−メチルピペラジノ−メチレン)−１０,１１−エチレンジオキシ−２０(Ｓ)−カンプトセシン），７−(２−(Ｎ−イソプロピルアミノ)エチル)−(２０Ｓ)−カンプトセシン，９−アミノカンプトテシン及び９−ニトロカンプトテシン；ビンカアルカロイド、例えば、特に限定されるわけではないが、ビンクリスチン，ビンブラスチン，ビンロイロシン（vinleurosine），ビンロジシン（vinrodisine），ビノレルビン（vinorelbine）及びビンデシン（vindesine）；血管形成阻害薬、特に限定されるわけではないが、例えば、アンギオスタチン，エンドスタチン及びＴＮＦ−α；ならびにＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸。
【０１１５】
Ｖ．単位用量
ある実施形態では、リポソーム封入栄養補助剤又は組成物が、適当な容器中の単位用量として提供される。好ましくは、容器は、単位用量を収容するのに適当なサイズ袋状（pouch）又はパック状（packet）容器である。容器は、紙（コーティング紙又は非コーティング紙）、ホイル、ポリマー、金属、プラスチック、耐穿刺性ナイロンフィルム又はそれらの任意の組み合わせで形成されていてもよい。ある実施形態では、ホイル−ラミネート，ヒートシールラミネート又はストリップ包装で形成される。容器は、適当な材料からなる１又は２以上の層で形成されてもよい。また、容器は異なる適当な材料からなる層で形成されてもよい。ある実施形態では、容器は、適当な材料からなる１又は２以上のシートで形成される。例えば、栄養補助剤又は組成物と接触する内層は、栄養補助剤又は組成物の成分と反応しない不活性物質で形成することができる。また、内層は、水分（湿気）、空気又は光を通さない材料で形成することができる。外層は、ラベリングに適当な材料で形成することができる。ある実施形態では、容器は、多層ラミネートで形成される。この実施形態では、内層は、防湿バリアーとなり、組成物の消散を防止し、及び／又はＵＶ及びその他の光源による分解を防止する材料で形成することができる。ある実施形態では、内層は、アルミニウム等の金属で形成される。別の実施形態では、容器は、１また２以上の熱可塑性ポリマーシートで形成される。好適な熱可塑性ポリマーとしては、特に限定されるわけではないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアミド又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１１６】
容器が１又は複数の材料からなる単一部材で形成される場合、好ましくは、少なくとも２つの縁部（edge）によって単位用量を充填するための開口部が形成されるように、単一部材は折り畳まれ、シールされる。容器が１又は複数の材料からなる２又はそれ以上の部材で形成される場合、単位用量を充填するための開口部が形成されるように、３方向の面が任意の適当な方法でシールされる。このように、容器は、開口部と、開口部を通じて単位用量を充填できる内部部分を有する。
【０１１７】
例示的な容器を図２Ａ−２Ｂに示す。図２Ａに示すように、容器１０は、対向する２つのシートで形成されており、シートの内側部分１４はシールされていないが、シートの周縁部１２はシールされている。図２Ｂに示すように、最初は、周縁部のうち、ある縁部はシールされておらず、リポソーム組成物等の製品を収容可能な充填可能領域１６が形成されている。容器の充填後、この未シール縁部はシールされる。
【０１１８】
適当な用量のリポソーム組成物が、容器の内部部分に収容される。リポソーム組成物が容器に収容されると、開口部が存在する面はシールされる。容器は、Ｎ2等の不活性ガス下でシール（密封）することができる。不活性ガス下で容器をシールすることによって、ビタミンＣ等の封入薬剤の安定性を向上させることができる。容器の面は、熱シール、適当な接着剤の使用等の任意の適当な方法でシールすることができる。容器の面は、容器を形成する材料の少なくとも一部が少なくとも部分的に溶融するのに十分な熱量を加えることにより、熱シールすることができる。このように、容器の面はラミネートされる。別の実施形態では、容器は、超音波溶接で熱シールされる。別の実施形態では、容器は、適当な接着剤でシールされる。適当な接着剤としては、特に限定されるわけではないが、例えば、アクリルポリマー及びコポリマー、天然ラテックスゴム及び酢酸ビニルが挙げられる。また、容器は、ジッパーでシールしてもよい。また、容器は、密封容器が容易に開封できるように剥離可能な部分を有していてもよい。
【実施例】
【０１１９】
以下の実施例は例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］
アスコルビン酸ナトリウム封入リポソームの調製
９７ｇのホスホリポン（phospholipon）５０ＩＰ（Lipoidから市販されている非遺伝子組換え（non-GMO）ベシクル形成脂質ホスファチジルコリン）を、５６．３ｇのアルコール（200 proof）に室温で可溶化した。全ての脂質が完全に可溶化し、溶解せずに残存する脂質が存在しないように注意した。１０９．５ｇのアスコルビン酸ナトリウム及び２６．４ｍｇのＥＤＴＡを別々に２５１ｇの逆浸透処理水に室温で標準攪拌しながら可溶化した。アスコルビン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ溶液のｐＨを６．３に調節した。アスコルビン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ溶液を０．２μｍフィルターでろ過し、塵埃粒子及びその他の混入物質を除去した。攪拌器で継続的に攪拌しながら、脂質溶液をゆっくりとビタミン溶液（アスコルビン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ溶液）に注入した。全ての脂質溶液を添加した後、頻回攪拌しながら、脂質の水和を約１５分間継続した。この時点で、滑らかな半透明の液体中にリポソームが形成された。
【０１２０】
２．２ｇのキサンタンガム（Sigma-Aldrich社の市販品）及び１．３８ｇのＴｗｅｅｎTM８０（Sigma-Aldrich社の市販品）を加え、溶液の粘性を高め、ゲル化した。得られたリポソーム溶液は透明な蜂蜜色（honey-like color）であった。
【０１２１】
［実施例２］
EmpiricalリポソームとLivOnリポソームの比較
幾つかのバッチ数のLypo-SphericTM ビタミンＣリポソームをLivOn Laboratories社から入手した。製品成分表の通り、５．７ｍＬ容量（packet）の各Lypo-SphericTMビタミンＣリポソームは、１０００ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム及び１．０ｇの必須リン脂質を含有する。Lypo-SphericTMビタミンＣリポソーム製品の色は、淡オレンジ色から褐色であった。第２の市販品として、リポソームビタミンＣ製剤をEmpirical Laboratories社から入手した。製品成分表の通り、４ｍＬ分量（serving size）のEmpiricalリポソームビタミンＣ製剤は、１０００ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム及び４００ｍｇのホスファチジルコリンを含有する。
【０１２２】
LivOn及びEmpiricalリポソーム製剤間のアスコルビン酸ナトリウム量、粒径、乾燥材料（dry material）量及び脂質量（推測量）を比較した結果を表２に示す。Empiricalリポソームは、LivOnリポソームと比較して希釈されているようであった。Empiricalリポソームは、比較的短時間（＜１時間）作業台に放置しておくと、２層に分離した。分離したEmpiricalリポソームを遠心すると、下層は総容量の約７０〜８０％を占めた。Empiricalリポソームの両層は褐色で比較的透明であった。下層は液状（water-like）であり、上層はゲル状であった。Empiricalリポソームは、手を震わせて攪拌すると、不透明となり、粘性が増加した。
【０１２３】
リポソーム中のアスコルビン酸ナトリウム量をＨＰＬＣで測定した。遠心ろ過法によって遊離のアスコルビン酸ナトリウムを分離して、アスコルビン酸ナトリウム封入量（封入率）を測定した。２００μgの製品を計量し、１０ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液で希釈した。混合物を攪拌し、リポソームを緩衝液中に完全に分散させた。この溶液を、さらに８０／２０％のエタノール/水で１０倍希釈し、透明な溶液を得、ＨＰＬＣによって総アスコルビン酸ナトリウム濃度を分析した。遊離のアスコルビン酸ナトリウム量を測定するために、小容量（約０．５〜１ｍＬ）の溶液を遠心濃縮器（Nanosep（登録商標）10K OMEGA p/n OD010C34（Pall社の市販品）又はMillipore's Biomax UFV5BTK25 30K）にかけ、１〜２時間遠心した。フィルターは、遊離（非封入）アスコルビン酸ナトリウムを含有する水性溶液だけを通過させることができる細孔を有し、リポソームは滞留する。次いで、ろ過物（filtrant）を８０／２０％ エタノール／水で１０倍希釈した。ろ過物中のアスコルビン酸ナトリウム濃度をＨＰＬＣで測定し、総アスコルビン酸ナトリウム濃度と比較し、封入効率を決定した。
【０１２４】
リポソーム中の乾燥材料量を評価するために、大量の製品を凍結乾燥器で２〜３日間乾燥させた。真空乾燥後の重量変化を測定した。
【０１２５】
粒径は、食塩水（saline）に希釈した後、動的光散乱（NICOMP 370）によって測定した。溶液を攪拌し、リポソームを完全に分散させた。Empiricalリポソームについて３回の測定を行なった結果、平均粒径は６２０〜７６０ｎｍ、標準偏差は４６０〜６１５ｎｍであった。２つの別々のバッチのLivOnリポソームについて粒径を測定した。バッチL0809（新しいバッチ）の平均粒径は約１２００ｎｍであり、バッチL1208（古いバッチ）よりも広範な分布を示した（ＳＤ ７６０ｎｍ）。バッチL1208の平均粒径は約８００ｎｍであり、標準偏差（ＳＤ）は４５０ｎｍであった。これに対して、本発明の低温法で調製したリポソームの粒径は、典型的には３００〜５００ｎｍの範囲である。
【０１２６】
別の実験において、５バッチのLivOnリポソームのうちの１７コンテナについて、粒径を測定した。粒径（直径）は８５０ｎｍ未満から１２００ｎｍを超える範囲であり、平均粒径は１０３０±１００ｎｍであった。試験したバッチ間で粒径に関する統計学的差異はなかった。粒径ピークの幅は、平均して約７４０±６０ｎｍであり、バッチ間で統計学的差異はなかった。
【０１２７】
ｐＨを測定するために、少量の製品をMilliQ水で希釈した。混合物を攪拌し、リポソームを完全に分散させた。標準的な実験用ｐＨメーターを用いてｐＨを測定した。
【０１２８】
Empiricalリポソーム及びLivOnリポソームを顕微鏡下で観察した。顕微鏡で観察したところ、Empiricalリポソームは、非常に大きな油滴を多数含んでいた。油滴は、粒径測定機器のレーザービームを透過するので、表２に示される粒径の測定結果は、油滴の作用効果を説明するものではない。Empiricalリポソームの製品成分リストには、オリーブオイル、ビタミンＥ及び香味料が挙げられている。これらのいずれか１つが、製品中に見られる巨大な油滴を説明し得るかもしれない。また、Empiricalリポソームの製造時にグレードの低い脂質が用いられているならば、油滴は脂質原材料に由来するものかもしれない。希釈されたEmpiricalリポソーム溶液は、顕微鏡観察下、LivOn溶液よりも均質性が低いようであった。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
［実施例３］
低温法リポソームとLivOn Laboratoriesリポソームの比較
低温法リポソームを実質的に実施例１に記載したように調製した。Lypo-SphericTMビタミンＣリポソームをLivOn Laboratories社から入手した。リポソーム製剤の様々な特性を測定した結果を表３に示す。
【０１３１】
リポソーム製剤中のアスコルビン酸の重量％は、ＨＰＬＣによって測定した。アルコール含量は、ガスクロマトグラフィーによって測定した。平均粒径は、動的光散乱によって測定した。アスコルビン酸ナトリウム封入量（封入率）は、実施例２に記載したようなろ過及びＨＰＬＣによって測定した。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
［実施例４］
室温及び高温におけるリポソームの安定性
低温法で調製したリポソームの保存安定性を試験した。リポソームは、non-GMO脂質ではなくAlcolec PC50 脂質（American Lecithin Companyから市販されているGMO ホスファチジルコリン脂質）を使用した点を除き、本質的に実施例１に記載したように調製した。２．０ｍＬのプラスチックバイアルをリポソームで満たし、Ｎ2下、ネジ蓋で密閉した（各蓋はゴム製Ｏリングによって完全に密閉できる）。バイアルを室温（２５℃）又は高温（５０℃）で保存した。室温で保存したリポソームに関しては、４日目、５日日、７日目（２回測定）、８日目及び３８日目に、アスコルビン酸含量（重量％）をＨＰＬＣで測定した。高温で保存したリポソームに関しては、０日目、５日目、６日目（２回測定）、１１日目、２０日目及び４２日目に、アスコルビン酸含量（重量％）をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
［実施例５］
５０℃で保存した場合のリポソーム安定性の比較
５０℃で保存した後の低温法リポソーム及びLivOnリポソームの安定性を試験した。低温法リポソームは本質的に実施例１に記載したように調製した。Lypo-SphericTMビタミンＣリポソームはLivOn Laboratories社から入手した。低温法リポソームはＮ2でフラッシュした後、２．０ｍＬプラスチックバイアル中で保存した。LivOnリポソームは、オリジナルパッケージ中で保存するか、あるいは、該パッケージから取り出し、Ｎ2をフラッシュした後、２．０ｍＬプラスチックバイアル中で保存した。アスコルビン酸の重量％はＨＰＬＣによって測定した。リポソームは次いで５０℃で保存した。４日後、１３日後又は１９日後に、リポソーム組成物を取り出し、アスコルビン酸の重量％をＨＰＬＣによって測定した。結果を表５に示す。図４は、１９日間にわたり、低温法で調製したリポソーム及びLypo-SphericTMビタミンＣリポソーム（LivOn Laboratories社の市販品）の安定性を比較したグラフである。
【０１３６】
【表５】
【０１３７】
低温法で調製したリポソームアスコルビン酸塩の安定性を評価するために、大量のバッチ（１４ｋｇ）のリポソーム封入アスコルビン酸ナトリウムを製造した。成分重量を測定したところ、アスコルビン酸ナトリウム量は２２．１重量％であった。製造法は、脂質及びビタミンＣ可溶化のために大きな容器（５ガロン容器）を用いた点を除き、実施例１記載の方法と同様である。工業用ホモジナイザー/ブレンダーを用いて、リポソームを混合した。最終産物の外観は実施例１で製造したものと類似していた。最終産物のリポソームアスコルビン酸塩を、市販品であるLypo-SphericTMビタミンＣリポソームの包装と同様、LivOn Labsの小袋（sachet）あたり５．５ｇ充填した。アスコルビン酸塩の安定性を２５℃及び４０℃でモニタリングした。ＨＰＬＣアッセイの結果を表６に示す。
【０１３８】
［実施例６］
還元型グルタチオン封入リポソームの調製
８０ｇ Alcolec PC50を４８ｇのアルコール（200 proof）に室温で可溶化した。全ての脂質が完全に可溶化し、溶解せずに残留する脂質がないように注意した。８０ｇの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を、標準攪拌しながら、０．９％ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＰＯ4（ｐＨ３．９）に室温で可溶化した。１２０ｍｇのＥＤＴＡをＧＳＨ溶液に加え、完全に溶解させた。ＧＳＨ封入リポソームを製造するために、高速ブレンダーで継続的に混合しながら、エタノール脂質溶液をゆっくりとＧＳＨ溶液に注入した。全ての脂質溶液を加えた後、頻回攪拌しながら、脂質の水和を約３０〜６０分間継続した。この時点で、リポソームが滑らかな黄色の混濁液中に形成された。動的光散乱機器（ZetaPALS（Brookhaven））によって粒径を測定したところ、典型的には２００〜６００ｎｍの範囲であった。
【０１３９】
リポソームの粘性を高めてゲル化するために、１．６ｇのキサンタンガム（Sigma-Aldrich社の市販品）を、攪拌しながら、リポソームに混合し、次いで、２．０ｇのＴｗｅｅｎ８０（Sigma-Aldrich社の市販品）を混合した。最終産物は、高粘性の透明なゲルであり、蜂蜜色（honey-like color）であった。最終産物のＧＳＨ濃度（理論値）は２０．０重量％であった。
【０１４０】
［実施例７］
リポソーム中の還元型グルタチオンのＨＰＬＣ測定
実施例６で調製したリポソームＧＳＨ製剤中の還元型グルタチオン濃度を、公知の方法（Raggi等, 1997, Chromatographia, vol. 46, 17-22）に基づき、ＨＰＬＣアッセイによって測定した。測定されたＧＳＨ濃度は１８．４±０．３重量％であり、これは、理論値である２０重量％に非常に近似しており、出発物質のＧＳＨのうち９２％近くが製剤過程で安定したままであったことを示している。
【０１４１】
［実施例８］
アルファリポ酸封入リポソームの調製
２０ｇの脂質AlcolecTM PC50を１２ｇのエタノール（200 proof アルコール）に室温で可溶化した。全ての脂質が完全に可溶化し、溶解せずに残留する脂質がないように注意した。５．０、７．５もしくは１０．０ｇのアルファリポ酸ナトリウム塩（Ｎａ ＡＬＡ）又は５．０、７．５もしくは１０ｇのＲ−ＡＬＡナトリウム塩を別々に、標準攪拌しながら０．３％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）含有水に室温で可溶化した。Ｎａ Ｒ−ＡＬＡ封入リポソームを製造するために、高速ブレンダーで継続的に攪拌しながら、エタノール脂質溶液をゆっくりとＮａ Ｒ−ＡＬＡ溶液に加えた。全ての脂質溶液を加えた後、頻回攪拌しながら、脂質の水和を約３０〜６０分間継続した。この時点で、リポソームが滑らかな黄色の混濁液中に形成した。
【０１４２】
リポソームの粘性を高めてゲル化するために、攪拌しながら、リポソームに０．４ｇのキサンタンガムを混合し、次いで、０．３ｇのＴｗｅｅｎ８０を混合した。最終産物は、高粘性の不透明な黄色のゲルであった。最終産物のＮａ ＡＬＡ又はＲ−ＡＬＡ濃度（理論値）は５、７．５又は１０．０重量％であった。
【０１４３】
［実施例９］
リポ酸リポソームの有効性及び安定性のＨＰＬＣ測定
実施例８記載のように調製したＮａ−ＡＬＡ及びＲ−ＡＬＡリポソームの安定性を調べた。安定性のモニタリングは、ガラス製バイアルの上端まで（すなわち、曝気を最小限にするためにバイアル上部に空隙がないように）リポソーム製剤を満たし、ネジ蓋で密閉した。サンプルを室温又は４０℃で保存した。数日で１０％ Ｎａ−ＡＬＡ及び１０％ Ｎａ Ｒ−ＡＬＡ製剤にいくつかの相分離が生じ、容器の下部に透明な溶液が分離した。また、７．５％ Ｎａ ＡＬＡ及びＮａ−Ｒ−ＡＬＡにも明らかではあるが、より軽度な相分離が生じた一方、５重量％製剤は少なくとも８週間均一のままであった。
【０１４４】
５重量％ Ｎａ−ＡＬＡ及び５重量％ Ｒ−ＡＬＡ含有製剤におけるリポ酸の有効性を、公知の方法（GeroNova Research Inc web site （geronova.com/sites/default/files/LA_HPLC_Mod_USP.pdf）で公開された“Analysis of Lipoic Acid Salts for Quality Assurance”）に基づき、ＨＰＬＣ法で測定した。アッセイの結果を表６に示す。表６に示されるように、低温法で製造されたリポソームに封入されたＡＬＡは非常に安定であった。また、インキュベーション（室温又は４０℃で５０日間）後のＡＬＡ又はＲ−ＡＬＡ有効性の減少は１０％未満であった。
【０１４５】
【表６】
【０１４６】
別の試験のために、実施例８に従って、３つのＮａ−ＡＬＡリポソーム製剤（２．５、５．０又は７．５重量％のＮａ−ＡＬＡを含有）を調製した。安定性のモニタリングのために、ガラス製バイアスの上端まで（バイアス上部に空隙がないように）リポソームを満たし、ネジ蓋で密閉した。ここでも、７．５重量％ ＡＬＡ及び７．５重量％ Ｒ−ＡＬＡ製剤において相分離が生じた。５．０重量％及び２．５重量％製剤は試験を通じて均一のままであった。サンプルを室温又は４０℃で保存し、ＡＬＡ濃度をＨＰＬＣで測定した。結果を表７に示す。表７に示すように、低温法で製造したリポソームに封入されたＡＬＡは、少なくとも３ヶ月間、非常に安定であった。また、１ヶ月目の末から３ヶ月目の末までのＡＬＡ有効性の減少は、全てのケースで（４０℃で保存した場合でさえ）１０％未満であった。ＨＰＬＣで測定した値のうち、２つの７．５％製剤に関するものは、製剤の相分離のためにサンプリングが不均一となってしまったため、正確性が劣るものだった。これらの製剤が調製された時点でＨＰＬＣ法が確立されていなかったため、Ｔ＝０の時点の値はない。
【０１４７】
【表７】
【０１４８】
多数の例示的な態様及び実施形態を上述したが、当業者は、それらに対する修正、置換、付加又はサブコンビネーションを認識するであろう。したがって、本発明の範囲にはそのような全ての修正、置換、付加及びサブコンビネーションを含むと解釈されるべきである。本明細書で引用された全ての特許文献及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性薬剤又は所望の物質をリポソーム封入形態で含むリポソームの製造方法、及び該リポソーム組成物の使用方法に関する。なお、本出願は、２０１１年１月５日に出願された米国仮出願６１／４３０，０２４号に基づく優先権を伴う出願であり、当該米国仮出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、両親媒性脂質で構成される球状に閉じた（self-enclosed）ベシクルである。リポソームは広く研究されており、薬剤、組成物及び化合物のin vivo投与の担体として使用されている。リポソームは、その内部に水相を有する少なくとも１つの閉じた脂質二重膜を含む。従来、水溶性薬剤をリポソーム内部水相に封入することにより、及び／又は、水に不溶の薬剤を脂質二重層に封入することにより、リポソームは薬物送達の目的で使用されてきた。リポソームは、１つの脂質二重層を有する単層リポソームである場合もあるし、同心円状に配置された２又はそれ以上の二重層を有する多層リポソームである場合もある。
【０００３】
様々なリポソーム調製方法及びリポソームへの治療薬の封入方法が知られている（例えば、米国特許第３,９３２,６５７号（特許文献１），第４,３１１,７１２号（特許文献２）及び第５,０１３,５５６号（特許文献３）。これら全ては参照により本明細書に組み込まれる。）。公知の方法としては、例えば、米国特許第４,２３５,８７１号（特許文献４，当該文献は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような逆相蒸発法が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第３,９３２,６５７号
【特許文献２】米国特許第４,３１１,７１２号
【特許文献３】米国特許第５,０１３,５５６号
【特許文献４】米国特許第４,２３５,８７１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
数多くの公知のリポソーム製剤の調製方法は、一般的に経口デリバリーが意図される、栄養価を高めたリポソーム製剤にとっては、あまり望ましいものではない。その理由の一つは、リポソーム製剤における非食品等級の成分の使用にある。さらに、数多くの公知の方法では、加熱工程、例えば、脂質溶液の温度を上昇させる、脂質の可溶化のための加熱工程が採用される。そのような工程は、薬剤、化合物又は組成物、特に熱及び／又は酸化に対する感受性の高いものの性能又は効能に影響を与える場合がある。
したがって、栄養補助剤又は医薬品として使用されるリポソームの新規な調製方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以下の態様及びその実施形態は、本発明の説明のための例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。関連技術の制約は、本明細書に基づき、当業者に明らかであろう。
【０００７】
本発明の一態様では、薬剤が封入されたリポソームを製造する方法が提供される。一般的には、適当な量のベシクル形成脂質を水性溶媒又は水混和性溶媒に室温又はその付近の温度で可溶化して脂質溶液を形成する。それとは別に、封入すべき薬剤を水性溶媒又は水混和性溶媒に室温又はその付近の温度で可溶化して薬剤含有溶液を形成する。脂質及び封入薬剤を可溶化するための水性溶媒又は水混和性溶媒は同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【０００８】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、少なくとも約１８ｗ／ｗ％のベシクル形成脂質を約１〜１２ｗ／ｗ％の水性溶媒又は水混和性溶媒（例えばアルコール）に室温で可溶化して脂質溶液を形成する。
【０００９】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、所定量の薬剤を０．００５〜０．０１ｗ／ｗ％の水性溶媒（例えばＥＤＴＡ）又は水混和性溶媒に室温で可溶化して薬剤含有溶液を形成する。薬剤がアスコルビン酸又はその塩もしくはエステルである実施形態では、好ましくは、０．００５〜０．１ｗ／ｗ％の水性溶媒（例えばＥＤＴＡ）又は水混和性溶媒に室温で可溶化して薬剤含有溶液を形成する。
【００１０】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、水混和性溶媒（例えば、脂質溶液を形成するための水混和性溶媒）はアルコールを含む。
【００１１】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、水性溶媒（例えば、薬剤含有溶液を形成するための水性溶媒）はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。
【００１２】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、薬剤含有溶液をろ過する。
【００１３】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、脂質溶液及び薬剤含有溶液を混合する。ある実施形態では、脂質溶液を薬剤含有溶液に攪拌しながら注入する。
【００１４】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、得られる溶液（脂質及び薬剤含有溶液）を適当な時間水和させる。ある実施形態では、頻回攪拌しながら溶液を少なくとも１時間水和させる。
【００１５】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、追加の脂質及び／又は増粘剤を加えてゲルを形成させる。ある実施形態では、追加の脂質及び／又は増粘剤を水和工程の後に加える。
【００１６】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、ベシクル形成脂質が少なくとも約４５〜５０％のホスファチジルコリンを含む。ある実施形態では、ホスファチジルコリンが卵又は大豆に由来する。
【００１７】
本発明のリポソーム製造方法の一実施形態では、薬剤は、アスコルビン酸又はその塩もしくはエステル、ＧＳＨ及びＡＬＡから選択される。
【００１８】
本発明の別の態様では、活性薬剤の投与のためのリポソーム組成物が提供される。好ましい実施形態では、リポソーム組成物は低温法によって形成される。ある実施形態では、低温法は、室温で、すなわち、加熱及び／又は加熱工程なしで、実施される。ある実施形態では、活性薬剤は栄養補助食品、サプリメント（dietary supplement）又は医薬品である。別の実施形態では、活性薬剤はアスコルビン酸又はその塩（例えばアスコルビン酸ナトリウム）もしくはエステル、ＧＳＨ及びＡＬＡから選択される。さらに別の実施形態では、活性薬剤がアスコルビン酸又はその塩であって、少なくとも約２２ｗ／ｗ％のアスコルビン酸又はその塩がリポソームに封入されている。
【００１９】
本発明のリポソーム組成物の一実施形態では、リポソーム組成物のリポソームは、約２００〜５００ｎｍの平均粒径（直径）を有する。
【００２０】
本発明のリポソーム組成物の一実施形態では、リポソーム組成物のリポソームは、少なくとも約１８ｗ／ｗ％のベシクル形成脂質を含む。
【００２１】
本発明のリポソーム組成物の一実施形態では、リポソーム組成物のリポソームは、０．００５〜０．１ｗ／ｗ％のＥＤＴＡを含む。
【００２２】
本発明のリポソーム組成物の一実施形態では、リポソーム組成物のリポソームは、１０〜１２ｗ／ｗ％のアルコールを含む。
【００２３】
本発明のリポソーム組成物の一実施形態では、ベシクル形成脂質は少なくとも約４５〜５０％のホスファチジルコリンを含む。ある実施形態では、ホスファチジルコリンは、大豆又は卵に由来する。別の実施形態では、ホスファチジルコリンは高純度のホスファチジルコリンである。さらに別の実施形態では、リポソーム組成物は、増粘剤及び／又は乳化剤を含む。ある実施形態では、増粘剤及び／又は乳化剤は、キサンタンガム又はＴｗｅｅｎTM８０を含む。ある実施形態では、０〜０．６ｗ／ｗ％のキサンタンガムを含む。別の実施形態では、０．４ｗ／ｗ％のＴｗｅｅｎTM８０を含む。
【００２４】
本発明の別の態様では、単位用量パッケージと該パッケージ中に含まれるリポソーム組成物とを含む単位用量製剤（剤形）が提供される。ある実施形態では、Ｎ2のガスフラッシュの下、リポソーム組成物がパッケージ中に密封されている。
【００２５】
本発明のさらに別の態様では、対象における壊血病、心臓血管疾患、脳血管疾患、癌、加齢性黄斑変性症、白内障、痛風、重金属毒性又は糖尿病を、リポソームに封入したアスコルビン酸又はその塩で処置する方法が提供される。ある実施形態では、高用量のリポソーム組成物が投与される。
【００２６】
本発明のさらに別の態様では、対象における癌、肝機能障害、悪性腫瘍、ＡＩＤＳ、外傷（trauma）、熱傷、敗血症、肺疾患、パーキンソン病、糖尿病、アルツハイマー病、統合失調症、嚢胞性線維症、心臓麻痺及び心臓発作、痙攣（癲癇）、鎌状赤血球貧血、躁鬱病（bipolarism）、慢性疲労症候群、自閉症又は関連免疫疾患を、リポソームに封入したＧＳＨで処置する方法が提供される。ある実施形態では、高用量のリポソーム組成物が投与される。
【００２７】
本発明のさらに別の態様では、対象における酸化的ストレスもしくはダメージ、糖尿病、肝疾患、炎症、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病）、心臓血管疾患、末梢神経損傷、統合失調症、肥満、癌又は高血圧を、リポソームに封入したＡＬＡを用いて治療又は予防する方法が提供される。ある実施形態では、高用量のリポソーム組成物が投与される。
【００２８】
上記した例示的な態様及び実施形態に加え、さらなる態様及び実施形態が以下の記載を参照することにより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１ＡはＬ−アスコルビン酸の化学構造を示す図であり、図１ＢはＬ−アスコルビン酸ナトリウムの化学構造を示す図である。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、例示的な容器の平面図及び側面図である。
【図３】図３は、室温（実線）又は５０℃（点線）で保存（日数）した場合のビタミンＣの重量％の経時変化によって、リポソームに封入されたアスコルビン酸ナトリウムの安定性を示す図である。
【図４】図４は、本発明の方法の一実施形態によって調製したリポソームをバイアル中、５０℃で保存した場合（実線）、市販品のリポソーム封入アスコルビン酸ナトリウム（LivOn Lypo-SphericTM Vitamin C）をバイアル中、５０℃で保存した場合（点線）、ならびに、市販品のリポソーム封入アスコルビン酸ナトリウム（LivOn Lypo-SphericTM Vitamin C）をオリジナルパッケージ中、５０℃で保存した場合（破線）の安定性を、１９日間にわたるビタミンＣの重量％の経時変化によって示す図である。
【図５】図５は、本発明の方法の一実施形態によって調製したリポソームをバイアル中、５０℃で保存した場合（図中の黒ひし形）、市販品のリポソーム封入アスコルビン酸ナトリウム（LivOn Lypo-SphericTM Vitamin C）をバイアル中、５０℃で保存した場合（図中の黒四角）、ならびに、市販品のリポソーム封入アスコルビン酸ナトリウム（LivOn Lypo-SphericTM Vitamin C）をオリジナルパッケージ中、５０℃で保存した場合（図中の黒三角）の安定性を、９０日間にわたるビタミンＣの重量％の経時変化によって示す図である。
【図６】図６は、本発明の方法の一実施形態によって調製したリポソームをバイアル中、２５℃（実線）又は４０℃（点線）で保存した場合の安定性を、アスコルビン酸ナトリウムの重量％の経時変化によって示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．定義
「活性薬剤」、「活性化合物」及び「化合物」という用語は、リポソームによる封入に適した組成物又は化合物を意味する。これらの用語には、栄養補助食品、サプリメント（dietary supplement）及び医薬品が含まれる。本発明の方法及び組成物での使用が意図される薬剤は広範にわたり、治療適応及び診断適応に適した薬剤が含まれる。
【００３１】
「栄養補助食品」という用語は、健康上及び／又は医学上の利点を提供する食物又は食品を意味する。そのような利点は、生理学的、治療的、予防的又は診断的な利点であり得る。栄養補助食品としては、特に限定されるわけではないが、例えば、ハーブ、サプリメント（dietary supplement）等の食品が挙げられる。
【００３２】
「サプリメント（dietary supplement）」という用語は、食事を補う又は栄養素を提供する化合物又は組成物を意味する。サプリメントとしては、特に限定されるわけではないが、例えば、ビタミン、ミネラル、ハーブ及びその他の植物製品、ファイバー、脂肪酸及びアミノ酸又はペプチドが挙げられる。
【００３３】
「医薬」又は「医薬品」という用語は、疾患の医学的な診断、療養、治療又は予防での使用が意図される化学物質又は組成物を意味する。
【００３４】
「リポソーム組成物」という用語は、少なくとも一部が水性相及び／又は脂質二重層に封入された薬剤、化合物又は組成物を含むリポソームを意味する。
【００３５】
「ベシクル形成脂質」という用語は、安定なリポソーム組成物を形成し得る脂質を意味する。そのような脂質には、典型的には、１もしくは２つの疎水性アシル炭化水素鎖又はステロイド基が含まれ、また、化学反応性官能基、例えば、アミン、酸、エステル、アルデヒド又はアルコールをその極性頭部基として含んでいてもよい。炭化水素鎖は、典型的には、約１４〜２２個の炭素原子の鎖長を有し、様々な程度の不飽和度を有していてもよい。
【００３６】
「高用量（high-dose）」及び「メガドーズ（mega-dose）」という用語は、活性薬剤又は化合物の用量が、公式に推奨されている用量よりも大きいことを意味する。ある実施形態では、「高用量」及び「メガドーズ」は、公式に推奨されている用量（例えば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、英国保健省及び欧州連合等の政府機関によって推奨されている用量）よりも約５〜５００倍大きい用量を意味する。他の実施形態では、「高用量」及び「メガドーズ」は、公式に推奨されている用量よりも約１０〜１０００倍、約１０〜５００倍、約１０〜２５０倍、約１０〜１００倍又は約１０〜５０倍大きい用量を意味する。
【００３７】
「処置」、「処置する」等の用語は、一般的に、疾患の症状の軽減及び／又は疾患の重症度の低減に有効なリポソーム組成物の投与によって、所望の薬理作用及び／又は生理作用を得ることを意味する。そのような作用は、疾患又はその症状を完全又は部分的に予防するという点で予防的なものであってもよいし、疾患及び／又は該疾患に起因する悪影響を完全又は部分的に治すという点で治療的なものであってもよいし、両者を兼ね備えたものであってもよい。
【００３８】
「処置」という用語には、哺乳動物（特にヒト）の疾患又は症状に対するいかなる処置も含まれ、例えば、ある疾患を発症する可能性が高いが未だ発症していると診断されていない対象に対して、当該疾患の発症を予防すること、当該疾患を抑制すること（すなわち、その進行を停止させること）、又は当該疾患を緩和すること（すなわち、当該疾患を退行（regression）させること）が含まれる。アスコルビン酸ナトリウムに関する具体例を挙げれば、「処置」には、壊血病、心臓血管疾患、脳血管疾患、癌、加齢性黄斑変性症、白内障、痛風、重金属（鉛、ヒ素等）毒性及び糖尿病に罹患する対象に対して、検出可能で有益な治療効果を提供することが含まれる。
【００３９】
「有効量」、「有効な量」又は「治療的に有効な量」という用語は、当該用語がリポソーム封入薬剤の量について用いられる場合、治療効能に十分なリポソーム組成物の量又は用量（例えば、疾患又は障害の症状を予防、治療又は緩和するのに十分な量）を意味する。
【００４０】
「薬学的に許容可能な」という用語は、例えば、その他の製剤成分と混合可能な担体、希釈剤又は賦形剤であって、レシピエントに一般的に安全に投与可能なもの、あるいは、投与によって望ましくない有害な身体的反応を引き起こさないものを意味する。
【００４１】
「室温」という用語は、約１０℃〜３７．７８℃、好ましくは約１５．５℃〜２７℃、さらに好ましくは約１８．３℃〜２６．７℃の範囲の温度を意味する。「室温」の好ましい範囲は、約２０℃〜３０℃である。特定の実施形態では、「室温」は約１５．５℃、１８．３℃、１８．９℃、１９．４℃、２０℃、２０．６℃、２１．１℃、２１．７℃、２２．２℃、２２．８℃、２３．３℃、２３．９℃、２４．４℃、２５℃、２５．６℃、２６．１℃、２６．１℃、２６．７℃、２７．２℃、２７．８℃、２７．８℃、２８．３℃、２８．９℃、２９．４℃、３０℃、３０．６℃、３１．１℃、３１．７℃及び３２．２℃であり得る。
【００４２】
「高温」という用語は、室温よりも高い温度を意味する。非限定的な実施形態では、「高温」は約２５℃〜約６０℃である。その他の非限定的な実施形態では、「高温」は約２５℃〜約５０℃である。特定の非限定的な実施形態では、「高温」は４０℃又は５０℃であり得る。
【００４３】
本発明の組成物は、単独で、又は慣用の賦形剤（例えば、薬学的又は生理学的に許容可能な有機又は無機担体物質であって、本発明で用いる組成物との有害な反応を生じず、経口、腸内又は非経口（経静脈）投与に適したもの）との混合物として投与することができる。薬学的に許容可能な担体の好適な例としては、水、塩溶液（例えば、リンガー溶液）、アルコール、油、ゼラチン及び炭水化物（糖質）、具体的には、ラクトース、アミロース、でんぷん、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース及びポリビニルピロリドンが挙げられる。そのような調製物は滅菌し得るし、所望により、本発明の方法で用いる組成物との有害な反応を生じない助剤、例えば、滑剤、保存料（防腐剤）、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調節可能な塩、緩衝液、着色剤及び／又は芳香剤と混合し得る。また、そのような調製物は、所望により、代謝低下（metabolic degradation）を低減するその他の活性物質と組み合わせることもできる。
【００４４】
「対象」という用語は、その通常の意味で用いられ、霊長類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類等）、実験動物（例えば、マウス、ラット等の齧歯動物）、家畜動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ等）及び愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ等）が含まれる。封入化ビタミンＣを含むリポソーム組成物の「対象」は、一般的には、アスコルビン酸を合成できない動物を意味する。アスコルビン酸を合成できない哺乳動物としては、霊長類の直鼻猿亜目（Suborder Haplorrhini）（例えば、ヒト、サル、類人猿等）が挙げられる。
【００４５】
「ビタミンＣ」という用語は、Ｌ−アスコルビン酸又はＬ−アスコルビン酸塩、あるいは、アスコルビン酸の無機塩又はエステルを意味する。
【００４６】
「ＧＳＨ」という用語は、グルタチオン、すなわち、(２Ｓ)−２−アミノ−４−｛[(１Ｒ)−１−[(カルボキシメチル)カルバモイル]−２−スルファニルエチル]カルバモイル｝ブタン酸を意味する。
【００４７】
「ＡＬＡ」という用語は、アルファリポ酸、２種類のエナンチオマー（Ｒ−(＋)−リポ酸（ＲＬＡ）及びＳ−(−)−リポ酸（ＳＬＡ））のラセミ混合物、活性エナンチオマーＲＬＡ又はＡＬＡの無機塩を意味する。
【００４８】
「ＡＴＰ」という用語は、アデノシン−５'−三リン酸エステル又はＡＴＰの無機塩を意味する。
【００４９】
「関連する」という用語は、単に、両方の事象が存在することを意味するのであり、一方が他方と因果的関係を有するという意味に解釈されるべきではない。
【００５０】
ＩＩ．リポソーム組成物の調製方法
リポソームを調製する典型的な方法は、脂質又はリポソーム組成物を加熱する少なくとも一工程、一般的には二工程を含む。まず、一般的には、脂質−溶媒組成物を高温まで加熱し、溶媒への脂質の溶解を促進する。リポソーム組成物を製造するための脂質は、一般的には、ワックス状材料（waxy material）の顆粒（granule）又は塊（chunk）として供給され、溶媒に加えられる熱は、一般的には、脂質を可溶化するために必要である。次いで、慣用のリポソーム調製方法は、活性薬剤の封入のために、及び／又は、リポソームのサイジングのために、均質化（homogenization）、超音波処理又は微少溶液操作（microfluidization）の工程を必要とする。均質化工程（場合によっては、超音波処理工程又は微少溶液操作工程）において、脂質−活性薬剤組成物を、強制的に、高速ホモジナイザーの相互作用チャンバー（interaction chamber）を通過させることにより、熱が発生し、その結果、脂質−活性薬剤混合物が高温まで加熱される。組成物は、ホモジナイザーチャンバー外で冷却されるが、組成物の大部分は、均質化工程の後、長期間、上昇した温度を維持する。多くの活性薬剤、脂質及び化合物、例えば、ビタミン及びその他の栄養補助剤（ビタミンＣ、グルタチオン、ＡＬＡ等）は、酸化に対して感受性が高く、酸化は高温で促進される。例えば、ビタミンＣは、熱、光及び酸素に対して感受性が高く、したがって、均質化工程及びリポソーム封入工程での加熱によって生じる高温状態で直ちに品質が低下する。このように、リポソーム封入薬剤の調製方法では熱を利用するため、その過程で薬剤の大部分の品質が低下する。
【００５１】
本発明の低温法の一実施形態では、室温又は室温付近の温度（約２０〜２５℃）下及び／又は非加熱下で、小さなサイズのリポソームを一工程で形成させることにより、この問題を解決する。好ましい実施形態では、「低温法」とは、非加熱下及び／又は加熱工程の不存在下でリポソームを形成する方法を意味する。別の実施形態では、「低温法」とは、室温又は室温付近の温度でリポソームを形成する方法を意味する。この実施形態では、「低温法」は「室温」と同義である。その他の実施形態では、本発明の方法は、非加熱下でリポソームを調製する工程を含む。別の実施形態では、本発明の方法は、１又は２以上の溶媒の加熱等の加熱工程の不存在下でリポソームを調製する工程を含む。
【００５２】
この一工程プロセスは、活性薬剤をリポソームベシクルに封入するために、又は、リポソームをサイジングするために、さらに別の工程（例えば、均質化、超音波処理又は微少溶液操作）を含まないか、又は必要としない。したがって、本発明の低温法で製造したリポソーム組成物中の薬剤は、従来の方法で製造したリポソームに封入された薬剤と比較して、品質低下及び／又は活性喪失が有意に抑えられている。
【００５３】
本発明の低温法において、脂質は、好ましくは、完全に又は大部分が水性溶媒又は水と混合可能な溶媒（例えば、大部分のアルコール）に可溶化される。リポソーム組成物が経口投与用である場合、水性溶媒は、好ましくは、摂取に適したものである。低温法で用いる溶媒がアルコールである実施形態では、最終産物中の最終アルコール含量は、最終産物の重量を基準として約１０〜１２重量％未満であることが好ましい。アルコールは、安定なリポソーム産物を形成するために必須ではないが、透明（translucent）なゲルを製造するのに役立つと思われる。アルコールは、さらに、効果的な保存料として役立つという利点を有している。また、アルコールの使用は、約２００〜５００ｎｍの範囲のサイズの小さなリポソームを形成するのに適しているか、又は有効である。その他の好適な水性溶媒は当業者に公知である。しかしながら、幾つかの溶媒を用いる場合には、アルコールを用いて製造した組成物よりも不透明な外観となり得る。
【００５４】
本発明の低温法の幾つかの実施形態では、アルコールへの脂質の溶解を上昇した温度（室温よりも高温）下で行い、脂質の溶媒への溶解を促進することができる。しかしながら、脂質の可溶化のために加熱する場合、脂質溶液は、活性薬剤の水溶液で水和する前に、より低い温度（例えば室温）まで冷却される（この際、例えば、標準的な手段又は大規模処理工程用の熱交換器が用いられる）。この工程は、脂質と活性薬剤（溶液）の両方が加熱される上記のような「典型的な」リポソーム製造工程とは根本的に異なる。
【００５５】
活性薬剤の溶液に関して、ある実施形態では、活性薬剤を含有する水溶液が室温で調製される。所望により、溶液の特性を向上させるための、又は活性薬剤の水への溶解を促進するためのその他の化合物、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有していてもよい。水は、任意の適当な方法、例えば、特に限定されるわけではないが、逆浸透、脱イオン化、ろ過等によって精製することができる。可溶化の後、薬剤を含有する溶液をさらにろ過して混入物質を除去してもよい。ある適当なフィルターは、０．２μｍ膜（例えば、Pall Life Sciencesから市販されている０．２μｍ膜であるMini Capsule Sterile Filter）である。膜のサイズは溶液から除去されるべき混入物質のサイズに応じて調節することができる。適当なサイズのフィルターの選択は、当業者が適宜行うことができる。適当なフィルターのサイズは、特に限定されるわけではないが、例えば、０．５μｍ、０．４μｍ、０．４５μｍ、０．３μｍ、０．２μｍ、０．１５μｍ及び０．１μｍである。
【００５６】
次いで、本発明の低温法において、脂質溶液は、例えば、活性薬剤水溶液への注入（injecting又はpouring）により、活性薬剤水溶液に加えられ、必要に応じて攪拌される。攪拌は、例えば攪拌器による機械攪拌、手動混合又は攪拌等の任意の適当な方法によって行うことができる。脂質溶液を活性薬剤溶液に加えた後、脂質の水和が少なくとも約１／２時間又は１時間、頻回攪拌しながら行われる。その工程の終了時に、脂質組成物は好ましくは滑らかな液体となる。
【００５７】
適当かつ容易な取り扱いが可能なリポソーム組成物を製造するために、ある実施形態では、リポソーム栄養補助剤又は組成物が一定の稠度（consistency）のゲルに製剤化される。ある実施形態では、追加の脂質が組成物に加えられ、リポソーム組成物の粘度をゲル様粘度まで増加させる。別の実施形態では、増粘剤及び／又は乳化剤が、組成物をゲルにするために、追加の脂質とともに、又は追加の脂質なしで加えられる。適当な増粘剤及び／又は乳化剤としては、例えば、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ＴｗｅｅｎTM８０（ポリソルベート８０）、ＴｗｅｅｎTM２０（ポリソルベート２０）、ＴｗｅｅｎTM４０（ポリソルベート４０）、ＴｗｅｅｎTM６０（ポリソルベート６０）、レシチン、乳化ろう、セテアリルアルコール及びセテアレス２０が挙げられる。さらなる適当な増粘剤については、ウエブサイトen.wikipedia.org/wiki/Category:Edible_thickening_agentsに記載されている。増粘剤及び／又は乳化剤は、ゲルを調製するために必要とされる脂質の量を減少させるために用いることができる。また、脂質の量は、増粘剤及び／又は乳化剤の不存在下で、ゲル様稠度を有するリポソーム組成物を製造するために、リポソームを形成するのに必要な量から３０〜３５％まで増加させることができる。ゲル組成物を調製するために過剰の脂質を用いると、活性薬剤の封入効率がより高くなる。追加の脂質と増粘剤及び／又は乳化剤との組み合わせは、ゲル組成物を調製するために用いることができる。また、過剰の脂質、増粘剤及び／又は乳化剤の添加には、経口用にさらに適したゲルを製造できるという利点がある。そのような組成物は、オレンジ色又は褐色（その他の方法で形成される組成物の色）というよりもむしろ蜂蜜のような色を有するかもしれない。また、本発明の方法で形成された組成物は、好ましくは、部分的に又は全体的に透明である。
【００５８】
活性薬剤がアスコルビン酸ナトリウムである場合のリポソーム製剤の例を表１に示す。表１の処方は、例示のみのために提供されるものである。製剤はこれに限定されるものではなく、その他の成分を含んでいてもよいし、異なる範囲を有していてもよい。活性薬剤の割合（％）は活性薬剤の性質に基づいて変更してもよい。
【００５９】
【表１】
【００６０】
ＩＩＩ．リポソーム組成物
ある態様では、薬剤、組成物又は化合物がリポソームに封入される。
活性薬剤、化合物又は組成物を封入して、多様なリポソーム組成物とすることができる。薬剤の形態（例えば、ビタミンＣに関して、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、無機塩、エステル等）、投与方法等を考慮して、リポソーム組成物の構成及びその比率を選択することは、当業者に公知である。
【００６１】
リポソーム組成物の形成に使用される脂質としては、例えば、２つの炭化水素鎖（典型的にはアシル鎖）と極性頭部基とを有するベシクル形成脂質が挙げられる。このような種類の脂質には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）等のリン脂質が挙げられ、２つの炭化水素鎖は典型的には約１４〜２２個の炭素原子の鎖長を有し、様々な不飽和度を有する。好ましい実施形態では、脂質は、比較的不飽和であるリン脂質（炭化水素鎖中に１、２又は３個の二重結合を有する）。特に好ましい実施形態では、脂質はホスファチジルコリンである。ホスファチジルコリンは、頭部基としてコリンが組み込まれ、グリセロリン酸を２つの脂肪酸と結合させたリン脂質である。ＰＣは、生体膜の主要成分であり、卵黄、大豆等から公知の方法で抽出することができる。ある実施形態では、脂質は、大豆由来のホスファチジルコリンである。別の実施形態では、脂質は、卵黄由来のホスファチジルコリンである。適当なホスファチジルコリン脂質としては、特に限定されるわけではないが、例えば、American Lecithin Company（Oxford, CT）から市販されているPhospholipon 50IP及びAlcolec PC 50が挙げられる。リポソーム組成物を調製する際、２種以上の脂質を使用してもよい。脂質の選択及び比率は、所望の流動性又は剛性を得るために、安定性を制御するために、及び／又は封入薬剤の放出速度を制御するために、変化させることができる。リポソーム組成物を調製する際に２種以上の脂質を使用する場合、安定なリポソームを形成させるために、比較的不飽和の脂質（例えばＰＣ）の好適量が用いられるべきである。ある実施形態では、調製物に用いられる脂質のうち少なくとも４５〜５０モル％がＰＣである。また、リポソームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含んでいてもよい。好適な親水性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミド及び親水性ペプチド配列が挙げられる。親水性ポリマーで誘導体化された脂質を調製する方法は公知である（例えば、米国特許第５,３９５,６１９号参照。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。）。
【００６２】
リポソームは、ゼラチンカプセル、軟質ゲルカプセル等の公知のカプセルで投与してもよい。
【００６３】
実施例４、５及び９に記載されるように、本発明のリポソーム組成物は高い安定性を有する。さらに示されているように、本発明のリポソーム組成物は、高温（室温よりも高い温度）で保存された場合にも高い安定性を有する。「安定性」という用語は、保存の間又は後に、封入薬剤の大部分が保持される調製物を意味する。非限定的な実施形態では、リポソームは、少なくとも約６ヶ月又は１年の保存の後に安定性を維持する。その他の非限定的な実施形態では、リポソームは、少なくとも約１〜１２ヶ月の保存の後に安定性を維持する。その他の非限定的な実施形態では、少なくとも約１，２，３，４，５，６もしくは９ヶ月又はそれを超える保存の後に安定性を維持する。ある実施形態では、少なくとも約６５〜１００％又はそれを超える封入薬剤が、保存の後にリポソーム内に保持される。好ましくは、少なくとも約６５％，７０％，８０％，９０％，９５％，９７％，９８％もしくは９９％又はそれを超える、あるいは１００％の封入薬剤が、保存の後にリポソーム内に保持される。リポソームを高温（室温を超える温度、例えば２５〜６０℃、好ましくは約５０℃）で保存する場合、好ましくは少なくとも約６５％の封入薬剤が保存の後にリポソーム内に保持される。
【００６４】
ある実施形態では、本発明のリポソームは、２００〜６００ｎｍ、好ましくは約２００〜５００ｎｍ又は約３００〜５００ｎｍの粒径を有する。実施例３に示されるように、本発明の低温法で形成されたリポソームは、市販の経口用リポソームよりも実質的に小さな粒径を有する。リポソームの粒径が小さいほど、一般的に、経口投与に適する。したがって、本発明の方法で形成されたリポソームは、市販の経口用リポソームよりも経口投与に適する。ある実施形態では、本発明の方法で形成されたリポソームは、その他の方法で形成されたリポソーム（例えば市販のリポソーム等）よりも、２５〜７５％小さい平均粒度分布を有する。非限定的な実施形態では、本発明のリポソームは、その他の方法で形成されたリポソーム（例えば市販のリポソーム等）よりも、２５％，３５％，４０％，４５％，６０％，６５％又は７５％小さい平均粒度分布を有する。
【００６５】
ＩＶ．封入薬剤
本発明の方法及びリポソーム組成物での使用が意図される薬剤、化合物及び組成物は多種多様であるが、例えば、サプリメント等の栄養補助剤及び医薬品が挙げられる。
【００６６】
Ａ．栄養補助剤
１．アスコルビン酸及びその塩
アスコルビン酸は、抗酸化特性を有する水溶性糖酸である。その抗酸化特性ゆえ、アスコルビン酸ならびにそのナトリウム塩、カリウム塩及びカルシウム塩は、一般に、食品添加物として用いられる。同様に、長鎖脂肪酸を有するアスコルビン酸の脂溶性エステル（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル等）は、一般に、脂質の酸化を防止するために用いられる。アスコルビン酸のＬ−エナンチオマー（ビタミンＣ又はＬ−アスコルビン酸として、その塩であるＬ−アスコルビン酸塩とともに知られている）は、ヒト及びその他の数種類の哺乳動物では合成されないため、それらの必須栄養素である。ビタミンＣの欠乏によって、ヒトで壊血病が生じる。また、ビタミンＣは、コラーゲン、Ｌ−カルニチン及びある種の神経伝達物質（例えばノルエピネフリン）の合成でも必要である。さらに、ビタミンＣは、タンパク質代謝に関連するとともに、非常に有効な抗酸化物質である。
【００６７】
ビタミンＣは、食事で十分なビタミンＣを摂取できない大勢の人たちに、栄養補助剤として利用されている。国民健康栄養調査（National Health and Nutrition Examination Survey）の１９９９年から２０００年のデータによると、約３５％の成人が総合ビタミン剤を摂取しており、総合ビタミン剤には、通常、ビタミンＣが含まれる。また、同データによると、１２％の成人が別のビタミンＣ栄養剤を摂取している（Radimer等, Am. J. Epidemiol., (2004), 160:339-49）。ビタミンＣは、最も広く摂取されている栄養補助剤である。ビタミンＣは、錠剤の形態で経口用として用いられるとともに、静脈内投与もされている。経口用の剤形としては、カプレット、錠剤、カプセル、ドリンクミックスパケット（drink mix packet）、マルチビタミン製剤、抗酸化物質の複合剤及び結晶性粉末が挙げられる。しかしながら、経口投与によって大量投与すると腸過敏症及び下痢が生じるため、一般的には、約２〜３グラム／日に制限される。腸の許容レベル（bowel tolerance level）を超える量のビタミンＣを摂取した場合、下痢を引き起こす可能性があることが知られている（Cathcart, Medical Hypothesis （1981）, 7:1359-1376）。ビタミンＣの腸の許容範囲は個人ごとに異なり、１日あたり５ｍｇから１日あたり数千ｍｇまでの範囲をとり得る。
【００６８】
ビタミンＣの使用、例えば高用量又はメガドーズでの使用は、従来、様々な疾患及び疾病、例えば心臓血管疾患、癌、白内障、痛風、重金属毒性（例えば鉛、ヒ素等）等の処置として推奨されてきた。高用量又はメガドーズのビタミンＣは、経口投与による副作用を避けるために、及び血漿中濃度を増加させて経口投与による通常の血漿中濃度よりも高くするために、通常、静脈内投与される。ビタミンＣの腸内吸収は、一般的には、少なくとも１種の特定の用量依存性の能動輸送体によって制御され、これによってビタミンＣの吸収量が制限されると考えられている（Jacob等, Nutr. Clin. Care, (2002), 5:66-74）。４時間ごとにアスコルビン酸３ｇという用量が経口で摂取された場合、ピーク血漿濃度は２２０μモル／Ｌにしか達しないことが薬動力学モデルで予測された（Padayatty等, Ann. Intern. Med. (2004) 140:533-7）。
【００６９】
経口投与における吸収の増大及び副作用の低減のために、ビタミンＣは経口投与用リポソームに封入されてきた。Lipoflowによって、脂質代謝疾患及びアテローム性動脈硬化症に対するリポソームビタミンＣが提供されている。大さじ（テーブルスプーン）１杯の栄養補助剤は、大豆レシチン由来の必須リン脂質に封入されたビタミンＣを１０００ｍｇ含有する。LivOn Laboratoriesによって提供される栄養補助剤は、必須リン脂質１０００ｍｇに封入されたビタミンＣを１０００ｍｇ含むリポソームを含有する。従来のビタミンＣのリポソーム製剤は、直径の大きな（約８００〜１０００ｎｍ）リポソームを含み、このため経口投与に適さない。リポソームのサイズのせいで、従来のリポソーム製剤は、不透明である。したがって、より経口投与に好適であって、安定な経口用リポソーム製剤が求められている。
【００７０】
ある態様では、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ-アスコルビン酸塩、又はアスコルビン酸の無機塩もしくはエステルを含む栄養補助剤又は組成物が、リポソーム組成物として提供される。ある実施形態では、栄養補助剤又は組成物は、Ｌ−アスコルビン酸のアルカリ金属塩を含む。好適な無機塩としては、特に限定されるわけではないが、例えば、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸マグネシウム、アスコルビン酸亜鉛、アスコルビン酸モリブデン、アスコルビン酸クロム及びアスコルビン酸マンガンが挙げられる。無機塩の緩衝化作用によって、アスコルビン酸の無機塩はアスコルビン酸よりも摂取時に刺激が少ない。アスコルビン酸の無機塩を組み合わせて使用してもよい。このような使用は、無機塩の推奨摂取量の範囲内で又はその付近で、そのカチオンの推奨摂取量を維持できるように、高用量又はメガドーズを投与する場合に重要となるかもしれない。別の実施形態では、栄養補助剤又は組成物は、脂溶性剤形とするために、飽和脂肪酸にエステル化されたアスコルビン酸を含む。好適な脂肪酸の例は、パルミチン酸アスコルビルを形成するパルミチン酸である。Ｌ−アスコルビン酸又はその無機塩もしくはエステルは、好ましくはリポソーム中に封入されている。
【００７１】
ａ．高用量
別の態様では、Ｌ−アスコルビン酸又はその無機塩もしくはエステルを含む栄養補助剤又は組成物を含有する、高用量又はメガドーズのリポソーム組成物が提供される。ビタミンＣの食事摂取基準（the Institute of Medicine's Food and Nutrition Boardによる基準）は、未成年及び成人１人あたり４５〜１２０ｍｇ／日の範囲である。喫煙者には、それに追加して３５ｍｇ／日を摂取することが推奨されている。１日あたりの推奨摂取量（ＲＤＩ）（ＦＤＡによって推奨される２００９年の基準）は、１日あたり６０ｍｇである（www fda.gov）。一般的に、「高用量」及び「メガドーズ」とは、１日あたり約１００〜１００００ｍｇの用量を意味する。また、「高用量」及び「メガドーズ」は、「腸の許容用量（bowel tolerance dosage）」でもあってもよく、それは、対象が下痢を引き起こす用量よりも少ない用量である。（「腸の許容用量」を決定するための例示的な方法については、Cathcart, Medical Hypotheses, 7:1359-1376, 1981を参照のこと。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。）。好ましい実施形態では、「メガドーズ」とは、アスコルビン酸又はその塩の用量として、２０００ｍｇ／日又はそれを越える用量を意味する。別の実施形態では、ビタミンＣを含むリポソーム組成物の高用量は、全米科学アカデミーによる推奨摂取量（２０００年における推奨摂取量は９０ｍｇ／日）、食品栄養委員会（Food and Nutrition Board）による推奨摂取量（７５〜１２０ｍｇ／日）、あるいはＵＳＤＡ又はその他の政府規制機関による推奨摂取量を上回るビタミンＣの用量を含む。ある実施形態では、約１００〜１００００ｍｇの用量が１日あたりに投与される。別の実施形態では、１日あたりの用量は、約２００〜２０００ｍｇ／日，２００〜５０００ｍｇ／日，２００〜１００００ｍｇ／日，４００〜１００００ｍｇ／日，４００〜８０００ｍｇ／日，４００〜６０００ｍｇ／日，４００〜５０００ｍｇ／日，４００〜４０００ｍｇ／日，４００〜３０００ｍｇ／日，４００〜２０００ｍｇ／日，５００〜１００００ｍｇ／日，５００〜８０００ｍｇ／日，５００〜６０００ｍｇ／日，５００〜５０００ｍｇ／日，５００〜４０００ｍｇ／日，５００〜３０００ｍｇ／日，５００〜２０００ｍｇ／日，５００〜１０００ｍｇ／日，１０００〜１００００ｍｇ／日，１０００〜８０００ｍｇ／日，１０００〜６０００ｍｇ／日，１０００〜５０００ｍｇ／日，１０００〜４０００ｍｇ／日，１０００〜２０００ｍｇ／日，２０００〜１００００ｍｇ／日，２０００〜６０００ｍｇ／日，２０００〜５０００ｍｇ／日，２０００〜４０００ｍｇ／日，４０００〜１００００ｍｇ／日，４０００〜８０００ｍｇ／日，４０００〜６０００ｍｇ／日，４０００〜５０００ｍｇ／日又は５０００〜１００００ｍｇ／日である。ヒトにおける用量はＬＤ５０よりも低くすべきである。経口でのＬＤ５０は、ラット群において体重１ｋｇあたり１１９００ｍｇであり（アスコルビン酸に関する製品安全データシート）、マウスの場合にはそれよりも低い（３３６７ｍｇ／ｋｇ）。用量は１日あたり１回又は数回投与され得る。１０００ｍｇを超える用量が１日あたり２回以上投与される場合、投与間隔は少なくとも３０分間であることが好ましい。
【００７２】
幾つかの研究によって、経口でのビタミンＣの血清濃度は約２００〜２４０ｍｇの用量で飽和に達することが示唆されているが、これらの研究は、一般的に、１２又は２４時間後の血漿濃度の測定結果を基準としている。ビタミンＣの半減期は３０分であるので、実際の血清飽和濃度はもっと高いはずであり、高用量又はメガドーズのビタミンＣの投与が実現可能であるはずである。米国農務省（ＵＳＤＡ）の人間栄養研究センター（Human Nutrition Research Center）が１９９１年に実施した研究によって、２０００ｍｇ／日のビタミンＣを摂取する高齢者では、１４８ｍｇ／日のビタミンＣを摂取する高齢者と比較して、眼のビタミンＣ濃度がより高いことが報告されており、それは、より高用量のビタミンＣが組織に吸収され、分布することを示している（Taylor等, Current Eye Research, 1991, 10(8):751-759）。３０〜１８０ｍｇ／日の用量において、約７０〜９０％の経口摂取ビタミンＣが吸収される（ビタミンＣに関する報告書（Fact Sheet at ods.od.nih.gov））。しかしながら、用量が増加するほど、吸収は減少する。高濃度のビタミンＣは、白血球、眼、副腎、下垂体及び脳で観察される最も高濃度を有する細胞及び組織で維持される（ビタミンＣに関する報告書（Fact Sheet at ods.od.nih.gov））。
【００７３】
ビタミンＣは水溶性であるので（３３ｇ／１００ｍＬ）、体内に蓄積されず、高用量又はメガドーズであってもビタミンＣの毒性は極めて稀である。ビタミンＣを大量に摂取すると、消化不良を引き起こし得る。特に空腹時に大量に摂取すると、下痢を引き起こし得る（news-medical.net/Vitamin-C-Side-Effects.aspx）。１９３６年の試験では、アスコルビン酸を６ｇ以下の用量で１４００日以上にわたり、２９人の幼児、未就学年齢及び就学年齢の９３人の子供、並びに２０人の成人に与えた。高用量では、中毒症状が５人の成人及び４人の幼児で観察された。成人における兆候及び症状は悪心、嘔吐、下痢、顔面紅潮、頭痛、倦怠感及び睡眠障害であった。幼児における主要な中毒反応は、皮膚発疹であった（Widenbauer, Klin. Wschr, 33:1157, 1936）。別の研究では、３年までの期間、毎日、ビタミンＣを１００００ｍｇまでの用量で摂取しても安全であることが報告されている（Bendich等, J. Am. College Nutr., 1995, 14（2）:124-136）。
【００７４】
ｂ．リポソーム組成物
栄養補助剤又は組成物を様々なリポソーム組成物に封入することができる。ビタミンＣの形態（アスコルビン酸、アスコルベート、無機塩、エステル等）、投与方法等の検討事項に応じて、リポソーム組成物の構成及び比率を選択することは、当業者の技術常識の範囲内にある。ある実施形態では、リポソーム封入薬剤はＬ−アスコルビン酸又はその無機塩もしくはエステルである。
【００７５】
本発明のリポソーム組成物は、安定性が高いことが証明されている。さらに、高温で保存した場合にも本発明のリポソーム組成物の安定性が高いことが証明されている。このことは、熱に対する感受性が高く、熱によってその分子の酸化が加速されるビタミンＣにとって特に有益である。「安定性」とは、ビタミンＣの大部分を保持する製剤を意味する。好ましくは、少なくとも約６５％，７０％，８０％，９０％，９５％，９７％，９８％もしくは９９％又はそれを超える、あるいは１００％のビタミンＣがリポソーム中に保持される。リポソームが高温（例えば約５０℃）で保存される場合、好ましくは、少なくとも約６５％のビタミンＣがリポソーム中に保持される。実施例のリポソーム組成物は、アスコルビン酸ナトリウム（１８．４重量％）をAlcolec PC 50脂質を含むリポソーム中に封入することにより調製された（実施例１及び４参照）。実施例４に記載されるように、リポソーム組成物は、Ｎ2下で密閉された２ｍＬのバイアル中、室温（２５℃）又は高温（５０℃）で保存された。４，５，７（２つのバイアルを測定した），８及び３８日目に、アスコルビン酸の重量％をＨＰＬＣで測定した。図３に示すように、室温で保存されたバイアルにおけるアスコルビン酸（重量％）は、保存期間全体にわたり安定性が高かった。３８日目では、４日目に存在していたアスコルビン酸の９９．８％が、依然としてサンプル中に存在していた。このことは、２５℃で３８日間保存した後、ビタミンＣがほとんど又は全く分解されていないことを示す。好ましくは、アスコルビン酸の大部分が少なくとも約１週間，２週間，３週間，１ヶ月間，２ヶ月間，３ヶ月間，６ヶ月間又は１年間、リポソーム中に保持される。
【００７６】
高温下でさえ、リポソーム組成物中のビタミンＣ含有量は高度に安定である。図３に示すように、５０℃で２０日間の保存後、ビタミンＣの出発量の約９６％が安定に保持されていた。４２日間の保存後であっても、アスコルビン酸の８０．８重量％が依然としてリポソーム組成物中に存在していた。さらに、図６に示すように、封入アスコルビン酸ナトリウムの重量％は、室温（２５℃）及び高温（４０℃）の保存後（１２０日間の保存後でさえも）、安定性を維持していた。
【００７７】
この安定性は、現在利用されているビタミンＣ組成物に少なくとも匹敵する。実施例１に記載されるように非ＧＭＯ脂質を用いて調製された本発明のリポソーム組成物の保存安定性は、実施例５に記載されるように、市販のビタミンＣリポソーム製剤（LivOn Laboratoriesの市販品であるLypo-SphericTM ビタミンＣリポソーム）に匹敵した。本発明のリポソーム組成物及びLypo-SphericTM ビタミンＣリポソームは、Ｎ2下で密閉された２ｍＬのバイアル中、高温（５０℃）で保存された。比較として、Lypo-SphericTM ビタミンＣリポソームについて、オリジナルパッケージ中で保存した場合のリポソーム安定性についてもモニタリングした。アスコルビン酸の重量％を０，４，１３及び１９日目に測定した。図４に示されるように、４日後、出発量の約９２％のビタミンＣが安定性を維持しており、１３日後、出発量の約９７％のビタミンＣが安定性を維持しており、１９日後、約８９％のリポソームが安定性を維持していた。これは、１９日間にわたってアスコルビン酸の約９９〜９０％がリポソーム中に保持されるLypo-SphericTM ビタミンＣリポソームと匹敵する。
【００７８】
図４に示されるように、Lypo-SphericTM ビタミンＣリポソームの安定性は、オリジナルパッケージ中で保存した場合（Ｎ2下で密閉）に、より大きく、１９日後にアスコルビン酸の９９．５重量％が保持される。本発明のリポソーム組成物の安定性はLypo-SphericTM ビタミンＣリポソームに匹敵するので、本発明のリポソームを同様にＮ2密閉フラッシュパッケージ中で保存すれば、同様の安定性が得られるであろう。
【００７９】
図５は、様々なロットの本発明のリポソーム及びLypo-SphericTM ビタミンＣリポソームについて、９０日間にわたるリポソームの安定性を比較した図である。図５に示すように、出発量の約６５％のアスコルビン酸が、５０℃で３ヶ月の保存後に活性を維持していた。これは、Lypo-SphericTM ビタミンＣリポソームと比較して、非常に高い安定性である。図５に示すように、 Lypo-SphericTM ビタミンＣリポソーム中のアスコルベートは、本発明のリポソームよりも速く安定性を失った。
【００８０】
ｃ．使用方法
別の態様では、本発明の方法で調製したリポソーム組成物の使用方法が意図される。もちろん、使用方法又は処置方法は、封入された化合物に依存する。以下に、使用方法の幾つかの例を示すが、それが単なる例示であることが当業者に理解されるであろう。
【００８１】
ある態様では、リポソーム封入ビタミンＣの投与により、壊血病、心臓血管疾患、脳血管疾患、癌、加齢性黄斑変性症、白内障、痛風、重金属毒性（例えば鉛、ヒ素、カドミウム、銅、水銀等）又は糖尿病を治療又は予防する方法が提供される。ある実施形態では、その用量は、高用量又はメガドーズのリポソーム封入ビタミンＣである。ビタミンＣは、抗酸化物質であるとともに、少なくとも８種類の酵素反応の補因子である。また、ビタミンＣは、血管、靱帯及び骨の重要な構成成分であるコラーゲン合成で必要とされる。また、ビタミンＣは、神経伝達物質であるノルエピネフリンの合成において重要な役割を果たす。さらに、ビタミンＣは、血中コレステロール濃度に影響を与える、胆汁酸へのコレステロール代謝に関連する（Simon等, Arch. Intern. Med., 2000, 160(7):931-936）。何人かの個人及び幾つかの機関によって、様々な疾病及び疾患を処置するために、ビタミンＣの大量投与が推奨されている（Linus Pauling Institute at lpi.oregonstate.edu/infocenter/vitamins/vitaminC/index.html）。ビタミンＣが、壊血病の治療及び予防に加え、心臓血管疾患、脳血管疾患、癌、加齢性黄斑変性症、白内障、痛風、重金属毒性（例えば鉛、銅（Mahajan等, Asian J. of Microbiology, Biotech. & Env. Sci., 2001, 3(1-2):95-100）、水銀（Mahajan等）、カドミウム（Borane等, J. Aquatic Biology, 2006, 21（2）:244-248）、ヒ素（Karasawas等, Blood, 2005, 105(10):4004-4012）等）及び糖尿病の治療又は予防に有効であることが、調査によって示されている。
【００８２】
心臓血管疾患
心臓血管疾患は、心臓又は血管に関連する一群の疾患である。心臓血管疾患としては、特に限定されるわけではないが、例えば、高血圧、冠動脈性心疾患（例えば心筋梗塞、狭心症等）、脳卒中及び心不全が挙げられる。冠動脈性心疾患は、コレステロール等の脂肪物質の蓄積による冠状動脈の狭窄であるアテローム性動脈硬化によって引き起こされる。冠動脈性心疾患は米国における主要な死因の一つである（American heart.org）。
【００８３】
ビタミンＣが、単球の内皮細胞への接着を低減させ、内皮細胞依存的な酸化窒素産生及び血管拡張を促進させ、血管平滑筋細胞のアポトーシスを低減させることが示されている（Honarbakhsh等, Br. J. Nutr., 2008, 1-19）。ランダム化二重盲検プラセボ対照試験によって、ビタミンＣでの処理の結果、冠動脈性心疾患に罹患する被験者、あるいは狭心症、鬱血性心不全、高コレステロール又は高血圧に罹患する被験者における血管拡張が促進したことが示されている（Gokce, Circulation, 1999, 99（25）:3234-3240; Versari等, Br. J. Pharmacol., 2009, 157（4）:527-536; 及び Frikke-Schmidt等, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2009, 104（6）:419-433）。
【００８４】
幾つかの研究によって、心臓血管疾患に対するビタミンＣ補給の効果が示されている。脳卒中既往歴のない４０〜７９歳の男女２０６４９人の前向き研究において、血漿ビタミンＣ濃度が、脳卒中との関連でモニタリングされた。血漿ビタミンＣのベースライン濃度が最上位の四分位数にある被験者は、最下位の四分位数にある被験者よりも、脳卒中のリスクが４２％低かった（Myint等, Am. J. Cling. Nutr., 2008, 87(1):64-69）。Linxian試験では、５〜６年間、毎日、ビタミンＣ（１２０ｍｇ）及びモリブデンを補給したところ、脳血管疾患による死亡リスクが８％減少したことが、補給中断後１０年間の追跡調査で示された（Qiao等, J. Natl. Cancer Inst., 2009, 101(7):507-518）。９つの研究の統合分析によって、≧７００ｍｇ／日のビタミンＣを摂取した人々は、冠動脈性心疾患のリスクが２５％低かったことが示された（Knekt等, Am. J. Clin. Nutr., 2004, 80(6):1508-1520）。
【００８５】
癌
疫学的証拠によって、果物及び野菜の摂取量が大きいほど、大部分のタイプの癌のリスクが低くなるという関連性が示唆されており、それは、おそらく部分的には、それらのビタミンＣ含有量が大きいことに起因する（Li等, J. Nutr., 2007,137:2171-84）。多数の症例対照研究によって、食事によるビタミンＣ摂取と、肺癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、胃癌、口腔癌、喉頭癌、咽頭癌及び食道癌との間の逆相関が示されている（Jacob等, Nutr. Clin. Care, 2002, 5:66-74）。また、血漿ビタミンＣ濃度は、対照よりも癌患者の方が低い（Carr等, Am. J. Clin. Nutr., 1999, 69:1086-107）。
【００８６】
ビタミンＣの静脈内投与によって、血漿濃度が２６０００μモル／Ｌに達することが示されている（Padayatty等, CMAJ 2006, 174:937-942）。この濃度は、in vitroで、腫瘍細胞に対する選択的な細胞傷害性を示す（Li等, J Nutr 2007, 137:2171-84; 及びShekelle等, Evidence Report/Technology Assessment No. 83 AHRQ Publication No. 03-E043. Rockville, MD: Agency for Healthcare Research and Quality, 2003）。マウスでの研究において、薬理学的量のビタミンＣの静脈内投与が、それ以外では治療が困難な腫瘍に対する治療効果が期待されることが示唆されている（Chen等, Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105:11105-11109）。高濃度のビタミンＣは、酸化促進剤として機能し、癌細胞に対して選択的な細胞傷害性を示す過酸化水素を発生させ得る（Chen等, 2009; Chen等, Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102:13604-13609; 及び Chen等, Proc Natl Acad Sci U S A, 2007,104:8749-8754）。また、高用量のビタミンＣを静脈内投与した後に、進行癌の患者の生存期間が顕著に延長したという、幾つかの症例報告がある（Levine等, Free Radic, Biol. Med., 2009, 47:27-29）。
【００８７】
糖尿病
糖尿病は、身体におけるインスリン産生能力及び／又は利用能力の異常によって生じる高血糖レベルで特徴付けられる一群の疾患である。米国のみで、２３．６百万人もの人たちが、１型糖尿病、２型糖尿病及び妊娠性糖尿病のうちの１種の糖尿病に罹患している（diabetes.org）。
【００８８】
１型糖尿病は、通常、子供及び若年成人に見られ、インスリン産生不能によって特徴づけられる。１型糖尿病の治療は、通常、インスリン療法を必要とする。１９９３年に行われた１型糖尿病患者の研究において、ビタミンＣの静脈内投与により、インスリンに関する二峰性（bimodal）の血漿濃度曲線が得られることが示されている（Kodama等, In Vivo, 1993, 7(6A):535-542）。これらの結果は、ビタミンＣが、インスリンのメカニズムを刺激することにより糖尿病の治療に有効であることを示唆する。さらに、ビタミンＣは、グルコース調節に異常がある糖尿病患者で生じる血管損傷を予防又は低減するために用いることができる。
【００８９】
２型糖尿病は、最も一般的な糖尿病の形態である。２型糖尿病は、十分なインスリンを産生する身体能力の低下（不能）又はインスリンを効率的に利用する細胞能力の低下（不能）によって特徴付けられる。２型糖尿病の患者に関する研究（Yazd Diabetes Research Center）において、１日あたり１０００ｍｇのビタミンＣ補給剤を摂取した患者では、１日あたり５００ｍｇのビタミンＣ補給剤を摂取した患者と比較して、４２日後には、空腹時血糖、トリグリセリド、低比重リポタンパク、糖化ヘモグロビン及び血清インスリン濃度が有意に減少したことが示されている（Afkhami-Ardekani等, Indian J. Med. Res., 2007, 126(5):471-474）。空腹時血糖の平均濃度は、１６９．３３ｍｇ／ｄｌから１４４．８０ｍｇ／ｄｌまで減少した。平均ＨｂＡ1Ｃは、８．８２％から７．６６％まで減少した。平均ＬＤＬは、１３０．９５ｍｇ／ｄｌから１２５．９１ｍｇ／ｄｌまで減少した。インスリン濃度は、１６．９１μユニット／ｍＬから８．７７μユニット／ｍＬまで減少した。これらの結果は、少なくとも約１０００ｍｇのビタミンＣ補給剤の毎日の摂取が、２型糖尿病の患者における血糖及び血中脂質を減少させるのに有効であることを示す。
【００９０】
加齢性黄斑変性症及び白内障
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）及び白内障は、高齢者における失明の主要な２つの原因である。ＡＭＤは、黄斑に影響を与え、その結果、中心視野（sharp, central vision）が徐々に失われる。滲出型（wet type）のＡＭＤは、網膜の後ろの異常血管が黄斑下で増殖し、黄斑にダメージを与えることにより発症する。萎縮型（dry type）のＡＭＤは、黄斑内の感光性細胞がゆっくりと破壊され、中央視野のぼやけを引き起こされることにより発症する。白内障は、眼の水晶体又はその膜において進行する混濁である。重症の白内障に対する現在の治療は、レンズを取り替える外科手術である。
【００９１】
酸化的ストレスはＡＭＤ及び白内障の両方の病因となり得るので、ビタミンＣ等の抗酸化物質がこれらの疾患を治療又は予防するために用いることができる。研究によって、ビタミンＣがＡＭＤの進行を遅らせ得ることが示されている（Evans, Cochrane Database Syst. Rev., 2006, (2):CD000254）。さらに、前向き研究によって、食事によるビタミンＣ摂取が、中高年の日本人女性において、加齢に関連した白内障のリスクを低減したことが示されている（Yoshida等, Eur. J. Nutr., 2007, 46:118-124; 及び Rautiainen等, Am. J. Clin. Nutr., 2010, 19(2):487-493）。
【００９２】
ビタミンＣは、よく知られた抗酸化物質であるので、ある態様において、リポソーム封入ビタミンＣによって治療又は予防される疾患又は症状は、抗酸化物質によって治療又は予防が可能である任意の疾患又は症状が意図される。
【００９３】
２．グルタチオン
グルタチオン（ＧＳＨ）は、アミノ酸であるシステイン、グルタミン酸及びグリシンから合成されるトリペプチドである。ＧＳＨは、システインのアミン基と、グルタミン酸の側鎖のカルボキシル基との間のペプチド結合を含む。ＧＳＨは、細菌及び哺乳動物細胞に１〜１０ミリモル濃度で存在し、還元状態において細胞タンパク質のシステイン残基を維持するスルフヒドリル緩衝剤として機能する（米国特許第７,７８５,９００号）。ＧＳＨは、２種類の基本的な形態で存在する。抗酸化物質である「還元型」グルタチオントリペプチドは、一般的に、「グルタチオン」又は「ＧＳＨ」と呼ばれる形態であり、酸化型形態は、硫黄−硫黄結合を有する化合物であり、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）として知られている。ＧＳＨは、細胞によって産生される主要な内因性抗酸化物質であり、フリーラジカル及び活性酸素化合物の中和に直接的に関与するとともに、ビタミンＣ、Ｅ等の外因性抗酸化物質をその還元型（活性）形態に維持する。ＧＳＨは、抗酸化物質、抗毒素及び赤血球保護物質として機能するので、免疫系において非常に重要である（米国特許ＲＥ４０８４９）。ＧＳＨは、フリーラジカルを中和し、それによるダメージを最小限にするので、細胞恒常性において重要である。哺乳動物細胞における還元型ＧＳＨ濃度は、様々な病態生理学的状態、例えば、癌、肝機能異常、悪性腫瘍、ＡＩＤＳ、外傷（trauma）、熱傷、敗血症、肺疾患、パーキンソン病、糖尿病、アルツハイマー病、統合失調症、嚢胞性線維症、心臓麻痺及び心臓発作、痙攣（癲癇）、鎌状赤血球貧血、躁鬱病（bipolarism）、慢性疲労症候群、自閉症又は関連免疫疾患及び生理学的症状と関連する（例えば、Kidd, Alternative Medicine Review, 1997, 2(3): 156-176）。
【００９４】
経口されたＧＳＨは消化管で十分に吸収されないため、ＧＳＨの直接的な補給は困難である（Witschi等 (1992), European Journal of Clinical Pharmacology, 43(6):667-669）。米国特許第７,４４６,０９６号には、リン脂質に共有結合したＰＥＧにグルタチオンを共有結合させて、リポソーム担体に挿入するというデリバリーシステムが記載されている。さらに、肺に投与された場合のリポソーム封入ＧＳＨの分布に関する研究によって、ＧＳＨは肺にとどまったことが示されている（Romet等, Int. J. Pharma., 63(3):227-235）。LipoceuticalTM グルタチオンは経口用液体であり、現在市販されているリポソーム封入グルタチオンである。小さじ一杯（５ｍＬ）には４２２．７ｍｇのグルタチオンが含まれる（成分リスト）。
【００９５】
ＧＳＨに関する推奨食事許容量（ＲＤＡ）は存在しないが、その補給について有害な副作用は知られていない（website at vitaminstuff.com/glutathione.html）。ある実施形態では、リポソーム封入ＧＳＨの有効量が投与される。治療又は予防に要する正確な用量は、試験用量の投与及び臨床反応の観察に基づいて決定することができる。一般的に、投与されるべき有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲内にある。別の実施形態では、１日あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２５ｍｇ／ｋｇ体重が投与される。さらに別の実施形態では、１日あたり約５０〜１０００，５０〜２０００，５０〜３０００，５０〜４０００，５０〜５０００ｍｇ又は５０〜１００００ｍｇが投与される。好ましくは、１日あたり約５０〜５００ｍｇが投与される。
【００９６】
ａ．リポソーム封入グルタチオンの使用方法
癌
ある態様では、リポソーム封入ＧＳＨが、癌の症状の予防、治療又は改善のために投与される。多くの癌が、細胞ＤＮＡに対するダメージによって進行し、その結果、ダメージを受けた細胞の無制御かつ自律的な成長及び増殖が生じる。ある理論によれば、細胞ＤＮＡに対するダメージは、フリーラジカルへの曝露によってたびたび引き起こされる。抗酸化物質であるＧＳＨは、フリーラジカルと反応し、フリーラジカルとＤＮＡとの接触を防止することにより、癌を引き起こすダメージを防止する。
【００９７】
最近の研究の予備結果において、グルタチオンが実験室で成長させた単離細胞における活性酸素種レベルを変化させ、癌の進行を低減させ得ることが示されている（Park, Oncology Reports, 2009, 385-391）。１９９３年に行われた動物実験において、ＧＳＨが口腔発癌の進行を抑制したことが示されている。ＤＭＢＡへの曝露後にＧＳＨが経口で補給された動物は、未処理対照群よりも、腫瘍の数及び大きさが有意に減少したことが示されている（Yance等, Herbal Medicine, Healing and Cancer, Keats Publishing, 1999）。別の研究において、化学療法（シスプラチン）で処置するとともに、グルタチオンを静脈内投与した卵巣癌女性は、化学療法による副作用をほとんど示さず、処置サイクル数の増加に忍容性を示し、全生存率が向上したことが示されている（Yance等）。
【００９８】
ＧＳＨの投与を、癌の処置のための慣用の放射線療法及び化学療法とともに行うと、予後が改善することが示されている。結腸直腸癌において、ＧＳＨの投与を、オキサリプラチン（oxaliplatin）／５−フルオロウラシル／ロイコボリン療法とともに行うと、当該療法の単独投与と比較して神経毒性が減少したことが示されている（Milla等, 2009, Anticancer Drugs, 20(5):396-402）。ある実施形態では、リポソーム封入ＧＳＨが、化学療法剤と併用投与（化学療法剤の投与前、投与後、又は化学療法剤の投与と同時）され、化学療法剤の有毒作用が低減、防止又は改善される。ＧＳＨと併用投与し得る化学療法剤としては、特に限定されるわけではないが、例えば、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）、タキソール（パクリタキセル）及びその誘導体（例えば、タキソテール）、アントラサイクリン、及び白金製剤（例えばシスプラチン）（米国特許第５,６１８,８２３号，当該文献は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９９】
ＡＩＤＳ
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）レトロウイルスへの曝露によって引き起こされる免疫系のダメージの結果として生じる様々な感染症及び症状である。症状が進行すると、罹患患者における日和見感染症及び腫瘍増殖のリスクが増大する。さらに、ＨＩＶ感染患者は、非感染者よりも、酸化的ストレス、内皮機能不全及び心臓血管疾患の発症率が高い（Kline等, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2008, 294(6):H2792-H2804）。ＨＩＶ−１ラットモデルを用いた研究において、ＧＳＨ前駆物質の投与によってグルタチオンレベルが回復すると、スーパーオキシド、ＮＯ及び血管弛緩に対するＨＩＶ−１タンパク質媒介作用が逆転することが示されている（Kline等）。また、ＧＳＨの投与は、免疫系を亢進し、日和見感染を予防することにより、ＡＩＤＳを治療することができる。ＨＩＶ感染患者から単離された血球をＧＳＨ前駆物質で処理すると、M.tuberculosisの細胞内感染のコントロールが改善したことが示されている（Venketaraman等, 2006, AIDS Res. Ther., 3:5）。また、ＧＳＨは、ウイルス複製後期における抗ウイルス効果を有することが示されている（Garaci等, 1997, J. Leukoc. Biol., 62(1):54-59）。ＨＩＶ患者の低ＧＳＨレベルに基づき、それ以外では区別できないＨＩＶ感染患者の低生存率が予測されたことが示されている（Garaci等）。ある実施形態では、リポソーム封入ＧＳＨがＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの治療又は予防のために投与される。別の実施形態では、リポソーム封入ＧＳＨが日和見感染ならびにＨＩＶ及びＡＩＤＳ関連疾患の治療又は予防のために投与される。
【０１００】
熱傷
熱傷は皮膚の損傷であり、例えば、熱、電気、化学品、光、放射線、摩擦又は低温への曝露によって引き起こされる。熱傷は、ショック、感染症及び呼吸困難を伴う場合もある。熱傷は、一般的に、第一度、第二度、第三度、第四度、第五度又は第六度に分類される。第一度熱傷は、通常、表皮の浅い損傷に限定される。第二度熱傷は、真皮表層（真皮乳頭層）の損傷を含み、真皮深層（真皮網状層）の損傷も含む場合がある。また、第二度熱傷は、神経損傷も含む場合がある。第三度熱傷は、皮下組織に対する表皮損傷又は障害を含む。第四度熱傷は、真皮破壊及び筋肉損傷を含む。第五度熱傷は、表皮、真皮及び皮下組織の破壊を含む。第六度熱傷は、表皮、真皮、皮下組織及び筋肉の破壊を含む。これらの熱傷は、骨の炭化（charring）も含む場合がある。最新の分類では、熱傷を厚さ（表層（superficial），中間層（partial））及び深さ（表層（superficial），中間層（partial））で分類する。免疫系に対する効能に加え、ＧＳＨの使用は、熱傷治療の目標の一つである血流の停滞（zone of stasis）の治療に有効である（Zor等, 2005, Burns, 31（8）:972-976.）。ある実施形態では、リポソーム封入ＧＳＨが熱傷の処置のために投与される。
【０１０１】
３．アルファリポ酸
アルファリポ酸（ＡＬＡ）は、体内に存在する抗酸化物質である。水溶性又は脂溶性のいずれかでしかない他の抗酸化物質と異なり、ＡＬＡは水溶性及び脂溶性を兼ね備える。また、ＡＬＡが他の抗酸化物質を再生させる能力を有することを示唆する証拠が示されている（Jones等, Free Radic Biol Med., 2002, 33(1):83-93.）。
【０１０２】
ＡＬＡのＣ６炭素原子はキラルであるので、ＡＬＡ分子はＲ及びＳエナンチオマーとして存在する。Ｒ−(＋)−リポ酸（Ｒ−ＬＡ）は、エネルギー産生ならびにアルファ−ケト酸及びアミノ酸の異化（分解）に関連した重要な反応を触媒する幾つかのミトコンドリア酵素複合体の必須の補因子である（Bustamante等, Free Radic Biol Med. 1998, 24(6):1023-1039）。Ｒ／Ｓラセミ混合物（Ｒ／Ｓ−ＬＡ）及びＲ−ＬＡは、米国において、カプセル剤、錠剤及び水性液剤の剤形のＯＴＣ（over-the-counter）栄養補助剤として広く利用されている。さらに、リポソームＡＬＡ皮膚クリームも利用されている（Reviva Labs）。ＡＬＡは様々な食物中に存在するが、食物からのＡＬＡの摂取によって、ヒト血漿又は細胞における遊離ＡＬＡが検出可能に増加することは未だ示されていない（Hermann等, Eur J Pharm Sci. 1996, 4:167-174）。これとは対照的に、高用量（５０ｍｇ又はそれを超える）の遊離ＡＬＡの経口摂取によって、血漿及び細胞における遊離ＡＬＡが、有意ではあるが一時的に増加することが示されている（lpi.oregonstate.edu/infocenter/othernuts/la/）。ヒトでの薬物動態学的研究において、Ｒ−ＬＡの経口投与量の約３０〜４０％が吸収されることが示されている（Hermann等）。アルファリポ酸は、３０〜１００ｍg用量の錠剤として購入可能である。
【０１０３】
ＡＬＡに関するＲＤＡは存在しないが、一定量（labeled dose）の補給による有害な副作用は知られていない。高用量では、胃のむかつき、悪心、下痢及び鼓腸が生じる場合がある（nutritional-supplements-health-guide.com/alpha-lipoic-acid-side-effects.html）。ある実施形態では、有効量のリポソーム封入ＡＬＡが投与される。ある実施形態では、リポソーム組成物は、ＡＬＡのＲ−エナンチオマーを含む。別の実施形態では、リポソーム組成物は、ＡＬＡのラセミ混合物を含む。治療又は予防に要する正確な用量は、試験用量の投与及び臨床反応の観察に基づいて決定することができる。ある実施形態では、１日あたり約１０〜１００００ｍｇが投与される。別の実施形態では、１日あたり約１０〜５０，１０〜１００，１０〜５００，１０〜１０００，２０〜１００，２０〜５００，２０〜１００，５０〜１００，５０〜２００，５０〜３００，５０〜４００，５０〜６００，５０〜８００，５０〜９００，５０〜１０００，５０〜２０００，５０〜３０００，５０〜４０００，５０〜５０００又は５０〜１００００ｍｇが投与される。好ましくは、１日あたり約５０〜５００ｍｇが投与される。一般的な抗酸化物質の効能を得るために、ある実施形態では、１日あたり２０〜５０ｍｇが投与される。用量は、分割して１日あたり２回又はそれ以上投与してもよい。
【０１０４】
ある非限定的な実施形態では、リポソームは約２．５〜１０重量％のＡＬＡ（Ｎａ ＡＬＡ又はＮａ Ｒ−ＡＬＡ）を含む。別の実施形態では、リポソームは少なくとも約２．５〜５重量％のＡＬＡを含む。相分離を防止又は低減させるために、約７．５％よりも少ない重量％を含むことが好ましい場合もある。実施例９に記載されるように、リポソームは高い安定性を示し、室温又は高温（４０℃）で５０日間保存した後に、封入ＡＬＡの９０％がリポソーム内に保持された。非限定的な実施形態では、ＡＬＡ封入リポソームは、少なくとも約１〜３ヶ月安定である。好ましい実施形態では、ＡＬＡ封入リポソームは少なくとも約３ヶ月安定である。
【０１０５】
ａ．リポソーム封入ＡＬＡの使用方法
ある実施形態では、ＡＬＡは、酸化的ストレス又はダメージ（Toklu等, J. Spinal. Cord Med., 2010, 33(4):401-409）、糖尿病、肝臓疾患、炎症（Odabasoglu等, Br. J. Nutr., 2010, Nov. 15:1-12）、アルツハイマー病等の神経変性疾患（Zara等, Exp. Gerontol., 2010, Nov. 8）、心臓血管疾患、末梢神経損傷（Ranieri等, J. Brachial. Plex. Peripher. Nerve Inj., 2010, 5:15）、統合失調症（Seybolt, Med. Hypotheses, 2010, 75(6):572-575）、肥満（Carbonelli等, Curr. Pharm., Des., 2010, 16(7):840-846）、癌（Schwartz, Oncol., Rep., 2010, 23(5):1407-1416）及び高血圧（Kizhakekuttu等, Cardiovasc., Ther., 2010, 28(4):e20-e32）を治療又は予防するために使用される。
【０１０６】
糖尿病
複数の研究において、高用量のＡＬＡが２型糖尿病患者におけるグルコース利用を改善し得ることが示されている。１３人の２型糖尿病患者の臨床試験において、１０００ｍｇのラセミＡＬＡを単回静脈内注入したところ、偽薬注入と比較して、インスリン刺激性の糖処理（インスリン感受性）が５０％改善したことが示されている（Jacob等, Arzneimittelforschung. 1995, 45(8):872-874）。７２人の２型糖尿病患者における別のプラセボ対照比較試験において、ラセミＡＬＡを６００ｍｇ／日，１２００ｍｇ／日又は１８００ｍｇ／日の用量で経口投与したところ、処理４週間後、インスリン感受性が２５％改善したことが示されている（Jacob等, Biofactors, 1999, 10(2-3):169-174）。この試験において、ＡＬＡの３種類の用量に有意な差がないことが示されており、６００ｍｇ／日が最大有効用量となり得ることが示唆される（Ziegler等, Treat Endocrinol., 2004, 3(3):173-189）。さらに、ＡＬＡは、糖尿病患者の血糖レベルを低減し得ることが示されている（Melhem等, J Am Soc Nephrol., 2002, 13:108-116）。
【０１０７】
ＡＬＡのフリーラジカル消去能は、糖尿病により神経損傷（末梢神経障害）が生じた患者において、痛み、灼熱感（burning）、かゆみ、うずき（tingling）及びしびれ（numbness）を低減するのに有効である（Androne等, In Vivo, 2000, 14(2):327-330）。ＡＬＡは、欧州で数年間、末梢神経障害の治療に使用されている。
【０１０８】
別の実施形態では、リポソームＡＬＡは、糖尿病に関連する又は糖尿病に伴う血管疾患の処置に使用される。血管の内壁（内皮細胞）は、血管疾患を予防する上で重要な役割を果たす。内皮機能は、糖尿病患者において損なわれている場合が多く、そのような患者は、血管疾患リスクが高い（Schalkwijk等, Clin Sci (Lond)., 2005,109(2):143-159）。ラセミＬＡの動脈内注入により、糖尿病患者では、内皮細胞依存性の血管拡張が改善するが、健常対照ではしないことが示されている（Heitzer等, Free Radic Biol Med., 2001, 31(1):53-61）。
【０１０９】
また、ＡＬＡは、糖尿病に関連する症状である自律神経障害の処置に使用され、心臓に分布する神経に作用する。ある研究において、７３人の自律神経障害患者が８００ｍｇのアルファリポ酸を経口摂取したところ、プラセボと比較して自律神経障害が改善したことが示されている（umm.edu/altmed/articles/alpha-lipoic-000285.htm）。
【０１１０】
ある実施形態では、１日あたり少なくとも約６００〜８００ｍｇのリポソーム封入ＡＬＡが、糖尿病、糖尿病性神経障害及び／又は糖尿病に起因する血管合併症に罹患した患者に投与される。
【０１１１】
肝臓疾患
ＡＬＡは、Ｃ型肝炎の処置において、シリマリン及びセレンと組み合わせて使用されている（Berkson, Med Klin, 1999, 94（Suppl. 3）:84-89）。この研究において、慢性Ｃ型肝炎感染症に続発する肝硬変、門脈圧亢進症及び食道静脈瘤に罹患した３人の患者をＡＬＡで処置したところ、臨床検査値が改善したことが示されている。ある実施形態では、リポソーム封入ＡＬＡが、肝臓疾患及び／又は肝炎の処置のために投与される。
【０１１２】
脳卒中
アルファリポ酸は脳内に容易に進入できるので、脳及び神経組織に対する保護作用を有する。ＡＬＡは、脳卒中、及びフリーラジカルによるダメージに関連するその他の脳疾患に対する治療の可能性について研究されている。例えば、アルファリポ酸で処置した動物では、生じる脳のダメージが減少し、脳卒中後の生存率が、アルファリポ酸を摂取していない動物よりも４倍高かったことが示されている（Panigrahi等, Brain Res., 1996, 717(1-2):184-188）。ある実施形態では、リポソーム封入ＡＬＡが脳卒中の処置のために投与される。
【０１１３】
ＨＩＶ／ＡＩＤＳ
ＡＬＡの補給は、血中総ＧＳＨレベルを回復させ、リンパ球のＴ細胞マイトジェンに対する反応性を改善することにより、ＨＩＶ及びＡＩＤＳ患者に対してプラスの影響を与える（Jariwalla等, 2008, J. Altern. Complement Med., 14（2）:139-146）。ある実施形態では、リポソーム封入ＡＬＡがＨＩＶ及びＡＩＤＳの処置のために投与される。
【０１１４】
Ｂ．医薬品
本発明の低温法を用いてリポソーム中に封入するのに適した医薬品としては、例えば、以下の治療活性を有する天然及び合成の化合物が挙げられる：抗関節炎薬，抗不整脈薬，抗菌剤，抗コリン作用薬，抗凝血剤，抗利尿薬，解毒剤，抗てんかん薬，抗真菌薬，抗炎症薬，代謝拮抗薬，抗片頭痛薬，抗腫瘍薬，抗寄生虫薬，解熱薬，抗けいれん薬，抗血清，鎮痙薬，鎮痛薬，麻酔薬，β遮断薬，生物反応修飾薬，骨代謝調節薬，心臓脈管薬，利尿薬，酵素薬，排卵誘発薬，成長促進薬，止血薬，ホルモン薬，ホルモン抑制薬，高カルシウム血症改善薬，低カルシウム血症改善薬，低血糖改善薬，高血糖改善薬，免疫抑制薬，免疫増強薬，筋弛緩薬，神経伝達物質，副交感神経作用薬，交感神経作用薬，血漿増量薬，血漿増補液，向精神薬，血栓溶解薬及び血管拡張薬。ある実施形態では、医薬品は細胞毒性薬又は物質であり、以下の具体例が挙げられる。アントラサイクリン系抗生物質、例えば、ドキソルビシン，ダウノルビシン，エピルビシン及びイダルビシン；白金化合物、例えば、特に限定されるわけではないが、シスプラチン，カルボプラチン，オルマプラチン，オキサリプラチン，ゼニプラチン，エンロプラチン，ロバプラチン，スピロプラチン，（(−)−(Ｒ)−２−アミノメチルピロリジン（１,１−シクロブタン ジカルボキシラト)白金）（ＤＷＡ２１１４Ｒ），（ＳＰ−４−３(Ｒ)−１,１−シクロブタン−ジカルボキシラト(２−)−(２−メチル−１,４−ブタンジアミン−Ｎ,Ｎ')白金）（ＣＩ−９７３），ネダプラチン（２５４−Ｓ）及び（ビス−アセタト(acetato)−アンミン(ammine)−ジクロロ−シクロヘキシルアミン−白金(ＩＶ)）；トポイソメラーゼ１阻害物質、例えば、特に限定されるわけではないが、トポテカン，イリノテカン，（７−(４−メチルピペラジノ−メチレン)−１０,１１−エチレンジオキシ−２０(Ｓ)−カンプトセシン），７−(２−(Ｎ−イソプロピルアミノ)エチル)−(２０Ｓ)−カンプトセシン，９−アミノカンプトテシン及び９−ニトロカンプトテシン；ビンカアルカロイド、例えば、特に限定されるわけではないが、ビンクリスチン，ビンブラスチン，ビンロイロシン（vinleurosine），ビンロジシン（vinrodisine），ビノレルビン（vinorelbine）及びビンデシン（vindesine）；血管形成阻害薬、特に限定されるわけではないが、例えば、アンギオスタチン，エンドスタチン及びＴＮＦ−α；ならびにＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸。
【０１１５】
Ｖ．単位用量
ある実施形態では、リポソーム封入栄養補助剤又は組成物が、適当な容器中の単位用量として提供される。好ましくは、容器は、単位用量を収容するのに適当なサイズ袋状（pouch）又はパック状（packet）容器である。容器は、紙（コーティング紙又は非コーティング紙）、ホイル、ポリマー、金属、プラスチック、耐穿刺性ナイロンフィルム又はそれらの任意の組み合わせで形成されていてもよい。ある実施形態では、ホイル−ラミネート，ヒートシールラミネート又はストリップ包装で形成される。容器は、適当な材料からなる１又は２以上の層で形成されてもよい。また、容器は異なる適当な材料からなる層で形成されてもよい。ある実施形態では、容器は、適当な材料からなる１又は２以上のシートで形成される。例えば、栄養補助剤又は組成物と接触する内層は、栄養補助剤又は組成物の成分と反応しない不活性物質で形成することができる。また、内層は、水分（湿気）、空気又は光を通さない材料で形成することができる。外層は、ラベリングに適当な材料で形成することができる。ある実施形態では、容器は、多層ラミネートで形成される。この実施形態では、内層は、防湿バリアーとなり、組成物の消散を防止し、及び／又はＵＶ及びその他の光源による分解を防止する材料で形成することができる。ある実施形態では、内層は、アルミニウム等の金属で形成される。別の実施形態では、容器は、１また２以上の熱可塑性ポリマーシートで形成される。好適な熱可塑性ポリマーとしては、特に限定されるわけではないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアミド又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１１６】
容器が１又は複数の材料からなる単一部材で形成される場合、好ましくは、少なくとも２つの縁部（edge）によって単位用量を充填するための開口部が形成されるように、単一部材は折り畳まれ、シールされる。容器が１又は複数の材料からなる２又はそれ以上の部材で形成される場合、単位用量を充填するための開口部が形成されるように、３方向の面が任意の適当な方法でシールされる。このように、容器は、開口部と、開口部を通じて単位用量を充填できる内部部分を有する。
【０１１７】
例示的な容器を図２Ａ−２Ｂに示す。図２Ａに示すように、容器１０は、対向する２つのシートで形成されており、シートの内側部分１４はシールされていないが、シートの周縁部１２はシールされている。図２Ｂに示すように、最初は、周縁部のうち、ある縁部はシールされておらず、リポソーム組成物等の製品を収容可能な充填可能領域１６が形成されている。容器の充填後、この未シール縁部はシールされる。
【０１１８】
適当な用量のリポソーム組成物が、容器の内部部分に収容される。リポソーム組成物が容器に収容されると、開口部が存在する面はシールされる。容器は、Ｎ2等の不活性ガス下でシール（密封）することができる。不活性ガス下で容器をシールすることによって、ビタミンＣ等の封入薬剤の安定性を向上させることができる。容器の面は、熱シール、適当な接着剤の使用等の任意の適当な方法でシールすることができる。容器の面は、容器を形成する材料の少なくとも一部が少なくとも部分的に溶融するのに十分な熱量を加えることにより、熱シールすることができる。このように、容器の面はラミネートされる。別の実施形態では、容器は、超音波溶接で熱シールされる。別の実施形態では、容器は、適当な接着剤でシールされる。適当な接着剤としては、特に限定されるわけではないが、例えば、アクリルポリマー及びコポリマー、天然ラテックスゴム及び酢酸ビニルが挙げられる。また、容器は、ジッパーでシールしてもよい。また、容器は、密封容器が容易に開封できるように剥離可能な部分を有していてもよい。
【実施例】
【０１１９】
以下の実施例は例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］
アスコルビン酸ナトリウム封入リポソームの調製
９７ｇのホスホリポン（phospholipon）５０ＩＰ（Lipoidから市販されている非遺伝子組換え（non-GMO）ベシクル形成脂質ホスファチジルコリン）を、５６．３ｇのアルコール（200 proof）に室温で可溶化した。全ての脂質が完全に可溶化し、溶解せずに残存する脂質が存在しないように注意した。１０９．５ｇのアスコルビン酸ナトリウム及び２６．４ｍｇのＥＤＴＡを別々に２５１ｇの逆浸透処理水に室温で標準攪拌しながら可溶化した。アスコルビン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ溶液のｐＨを６．３に調節した。アスコルビン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ溶液を０．２μｍフィルターでろ過し、塵埃粒子及びその他の混入物質を除去した。攪拌器で継続的に攪拌しながら、脂質溶液をゆっくりとビタミン溶液（アスコルビン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ溶液）に注入した。全ての脂質溶液を添加した後、頻回攪拌しながら、脂質の水和を約１５分間継続した。この時点で、滑らかな半透明の液体中にリポソームが形成された。
【０１２０】
２．２ｇのキサンタンガム（Sigma-Aldrich社の市販品）及び１．３８ｇのＴｗｅｅｎTM８０（Sigma-Aldrich社の市販品）を加え、溶液の粘性を高め、ゲル化した。得られたリポソーム溶液は透明な蜂蜜色（honey-like color）であった。
【０１２１】
［実施例２］
EmpiricalリポソームとLivOnリポソームの比較
幾つかのバッチ数のLypo-SphericTM ビタミンＣリポソームをLivOn Laboratories社から入手した。製品成分表の通り、５．７ｍＬ容量（packet）の各Lypo-SphericTMビタミンＣリポソームは、１０００ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム及び１．０ｇの必須リン脂質を含有する。Lypo-SphericTMビタミンＣリポソーム製品の色は、淡オレンジ色から褐色であった。第２の市販品として、リポソームビタミンＣ製剤をEmpirical Laboratories社から入手した。製品成分表の通り、４ｍＬ分量（serving size）のEmpiricalリポソームビタミンＣ製剤は、１０００ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム及び４００ｍｇのホスファチジルコリンを含有する。
【０１２２】
LivOn及びEmpiricalリポソーム製剤間のアスコルビン酸ナトリウム量、粒径、乾燥材料（dry material）量及び脂質量（推測量）を比較した結果を表２に示す。Empiricalリポソームは、LivOnリポソームと比較して希釈されているようであった。Empiricalリポソームは、比較的短時間（＜１時間）作業台に放置しておくと、２層に分離した。分離したEmpiricalリポソームを遠心すると、下層は総容量の約７０〜８０％を占めた。Empiricalリポソームの両層は褐色で比較的透明であった。下層は液状（water-like）であり、上層はゲル状であった。Empiricalリポソームは、手を震わせて攪拌すると、不透明となり、粘性が増加した。
【０１２３】
リポソーム中のアスコルビン酸ナトリウム量をＨＰＬＣで測定した。遠心ろ過法によって遊離のアスコルビン酸ナトリウムを分離して、アスコルビン酸ナトリウム封入量（封入率）を測定した。２００μgの製品を計量し、１０ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液で希釈した。混合物を攪拌し、リポソームを緩衝液中に完全に分散させた。この溶液を、さらに８０／２０％のエタノール/水で１０倍希釈し、透明な溶液を得、ＨＰＬＣによって総アスコルビン酸ナトリウム濃度を分析した。遊離のアスコルビン酸ナトリウム量を測定するために、小容量（約０．５〜１ｍＬ）の溶液を遠心濃縮器（Nanosep（登録商標）10K OMEGA p/n OD010C34（Pall社の市販品）又はMillipore's Biomax UFV5BTK25 30K）にかけ、１〜２時間遠心した。フィルターは、遊離（非封入）アスコルビン酸ナトリウムを含有する水性溶液だけを通過させることができる細孔を有し、リポソームは滞留する。次いで、ろ過物（filtrant）を８０／２０％ エタノール／水で１０倍希釈した。ろ過物中のアスコルビン酸ナトリウム濃度をＨＰＬＣで測定し、総アスコルビン酸ナトリウム濃度と比較し、封入効率を決定した。
【０１２４】
リポソーム中の乾燥材料量を評価するために、大量の製品を凍結乾燥器で２〜３日間乾燥させた。真空乾燥後の重量変化を測定した。
【０１２５】
粒径は、食塩水（saline）に希釈した後、動的光散乱（NICOMP 370）によって測定した。溶液を攪拌し、リポソームを完全に分散させた。Empiricalリポソームについて３回の測定を行なった結果、平均粒径は６２０〜７６０ｎｍ、標準偏差は４６０〜６１５ｎｍであった。２つの別々のバッチのLivOnリポソームについて粒径を測定した。バッチL0809（新しいバッチ）の平均粒径は約１２００ｎｍであり、バッチL1208（古いバッチ）よりも広範な分布を示した（ＳＤ ７６０ｎｍ）。バッチL1208の平均粒径は約８００ｎｍであり、標準偏差（ＳＤ）は４５０ｎｍであった。これに対して、本発明の低温法で調製したリポソームの粒径は、典型的には３００〜５００ｎｍの範囲である。
【０１２６】
別の実験において、５バッチのLivOnリポソームのうちの１７コンテナについて、粒径を測定した。粒径（直径）は８５０ｎｍ未満から１２００ｎｍを超える範囲であり、平均粒径は１０３０±１００ｎｍであった。試験したバッチ間で粒径に関する統計学的差異はなかった。粒径ピークの幅は、平均して約７４０±６０ｎｍであり、バッチ間で統計学的差異はなかった。
【０１２７】
ｐＨを測定するために、少量の製品をMilliQ水で希釈した。混合物を攪拌し、リポソームを完全に分散させた。標準的な実験用ｐＨメーターを用いてｐＨを測定した。
【０１２８】
Empiricalリポソーム及びLivOnリポソームを顕微鏡下で観察した。顕微鏡で観察したところ、Empiricalリポソームは、非常に大きな油滴を多数含んでいた。油滴は、粒径測定機器のレーザービームを透過するので、表２に示される粒径の測定結果は、油滴の作用効果を説明するものではない。Empiricalリポソームの製品成分リストには、オリーブオイル、ビタミンＥ及び香味料が挙げられている。これらのいずれか１つが、製品中に見られる巨大な油滴を説明し得るかもしれない。また、Empiricalリポソームの製造時にグレードの低い脂質が用いられているならば、油滴は脂質原材料に由来するものかもしれない。希釈されたEmpiricalリポソーム溶液は、顕微鏡観察下、LivOn溶液よりも均質性が低いようであった。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
［実施例３］
低温法リポソームとLivOn Laboratoriesリポソームの比較
低温法リポソームを実質的に実施例１に記載したように調製した。Lypo-SphericTMビタミンＣリポソームをLivOn Laboratories社から入手した。リポソーム製剤の様々な特性を測定した結果を表３に示す。
【０１３１】
リポソーム製剤中のアスコルビン酸の重量％は、ＨＰＬＣによって測定した。アルコール含量は、ガスクロマトグラフィーによって測定した。平均粒径は、動的光散乱によって測定した。アスコルビン酸ナトリウム封入量（封入率）は、実施例２に記載したようなろ過及びＨＰＬＣによって測定した。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
［実施例４］
室温及び高温におけるリポソームの安定性
低温法で調製したリポソームの保存安定性を試験した。リポソームは、non-GMO脂質ではなくAlcolec PC50 脂質（American Lecithin Companyから市販されているGMO ホスファチジルコリン脂質）を使用した点を除き、本質的に実施例１に記載したように調製した。２．０ｍＬのプラスチックバイアルをリポソームで満たし、Ｎ2下、ネジ蓋で密閉した（各蓋はゴム製Ｏリングによって完全に密閉できる）。バイアルを室温（２５℃）又は高温（５０℃）で保存した。室温で保存したリポソームに関しては、４日目、５日日、７日目（２回測定）、８日目及び３８日目に、アスコルビン酸含量（重量％）をＨＰＬＣで測定した。高温で保存したリポソームに関しては、０日目、５日目、６日目（２回測定）、１１日目、２０日目及び４２日目に、アスコルビン酸含量（重量％）をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
［実施例５］
５０℃で保存した場合のリポソーム安定性の比較
５０℃で保存した後の低温法リポソーム及びLivOnリポソームの安定性を試験した。低温法リポソームは本質的に実施例１に記載したように調製した。Lypo-SphericTMビタミンＣリポソームはLivOn Laboratories社から入手した。低温法リポソームはＮ2でフラッシュした後、２．０ｍＬプラスチックバイアル中で保存した。LivOnリポソームは、オリジナルパッケージ中で保存するか、あるいは、該パッケージから取り出し、Ｎ2をフラッシュした後、２．０ｍＬプラスチックバイアル中で保存した。アスコルビン酸の重量％はＨＰＬＣによって測定した。リポソームは次いで５０℃で保存した。４日後、１３日後又は１９日後に、リポソーム組成物を取り出し、アスコルビン酸の重量％をＨＰＬＣによって測定した。結果を表５に示す。図４は、１９日間にわたり、低温法で調製したリポソーム及びLypo-SphericTMビタミンＣリポソーム（LivOn Laboratories社の市販品）の安定性を比較したグラフである。
【０１３６】
【表５】
【０１３７】
低温法で調製したリポソームアスコルビン酸塩の安定性を評価するために、大量のバッチ（１４ｋｇ）のリポソーム封入アスコルビン酸ナトリウムを製造した。成分重量を測定したところ、アスコルビン酸ナトリウム量は２２．１重量％であった。製造法は、脂質及びビタミンＣ可溶化のために大きな容器（５ガロン容器）を用いた点を除き、実施例１記載の方法と同様である。工業用ホモジナイザー/ブレンダーを用いて、リポソームを混合した。最終産物の外観は実施例１で製造したものと類似していた。最終産物のリポソームアスコルビン酸塩を、市販品であるLypo-SphericTMビタミンＣリポソームの包装と同様、LivOn Labsの小袋（sachet）あたり５．５ｇ充填した。アスコルビン酸塩の安定性を２５℃及び４０℃でモニタリングした。ＨＰＬＣアッセイの結果を表６に示す。
【０１３８】
［実施例６］
還元型グルタチオン封入リポソームの調製
８０ｇ Alcolec PC50を４８ｇのアルコール（200 proof）に室温で可溶化した。全ての脂質が完全に可溶化し、溶解せずに残留する脂質がないように注意した。８０ｇの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を、標準攪拌しながら、０．９％ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＰＯ4（ｐＨ３．９）に室温で可溶化した。１２０ｍｇのＥＤＴＡをＧＳＨ溶液に加え、完全に溶解させた。ＧＳＨ封入リポソームを製造するために、高速ブレンダーで継続的に混合しながら、エタノール脂質溶液をゆっくりとＧＳＨ溶液に注入した。全ての脂質溶液を加えた後、頻回攪拌しながら、脂質の水和を約３０〜６０分間継続した。この時点で、リポソームが滑らかな黄色の混濁液中に形成された。動的光散乱機器（ZetaPALS（Brookhaven））によって粒径を測定したところ、典型的には２００〜６００ｎｍの範囲であった。
【０１３９】
リポソームの粘性を高めてゲル化するために、１．６ｇのキサンタンガム（Sigma-Aldrich社の市販品）を、攪拌しながら、リポソームに混合し、次いで、２．０ｇのＴｗｅｅｎ８０（Sigma-Aldrich社の市販品）を混合した。最終産物は、高粘性の透明なゲルであり、蜂蜜色（honey-like color）であった。最終産物のＧＳＨ濃度（理論値）は２０．０重量％であった。
【０１４０】
［実施例７］
リポソーム中の還元型グルタチオンのＨＰＬＣ測定
実施例６で調製したリポソームＧＳＨ製剤中の還元型グルタチオン濃度を、公知の方法（Raggi等, 1997, Chromatographia, vol. 46, 17-22）に基づき、ＨＰＬＣアッセイによって測定した。測定されたＧＳＨ濃度は１８．４±０．３重量％であり、これは、理論値である２０重量％に非常に近似しており、出発物質のＧＳＨのうち９２％近くが製剤過程で安定したままであったことを示している。
【０１４１】
［実施例８］
アルファリポ酸封入リポソームの調製
２０ｇの脂質AlcolecTM PC50を１２ｇのエタノール（200 proof アルコール）に室温で可溶化した。全ての脂質が完全に可溶化し、溶解せずに残留する脂質がないように注意した。５．０、７．５もしくは１０．０ｇのアルファリポ酸ナトリウム塩（Ｎａ ＡＬＡ）又は５．０、７．５もしくは１０ｇのＲ−ＡＬＡナトリウム塩を別々に、標準攪拌しながら０．３％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）含有水に室温で可溶化した。Ｎａ Ｒ−ＡＬＡ封入リポソームを製造するために、高速ブレンダーで継続的に攪拌しながら、エタノール脂質溶液をゆっくりとＮａ Ｒ−ＡＬＡ溶液に加えた。全ての脂質溶液を加えた後、頻回攪拌しながら、脂質の水和を約３０〜６０分間継続した。この時点で、リポソームが滑らかな黄色の混濁液中に形成した。
【０１４２】
リポソームの粘性を高めてゲル化するために、攪拌しながら、リポソームに０．４ｇのキサンタンガムを混合し、次いで、０．３ｇのＴｗｅｅｎ８０を混合した。最終産物は、高粘性の不透明な黄色のゲルであった。最終産物のＮａ ＡＬＡ又はＲ−ＡＬＡ濃度（理論値）は５、７．５又は１０．０重量％であった。
【０１４３】
［実施例９］
リポ酸リポソームの有効性及び安定性のＨＰＬＣ測定
実施例８記載のように調製したＮａ−ＡＬＡ及びＲ−ＡＬＡリポソームの安定性を調べた。安定性のモニタリングは、ガラス製バイアルの上端まで（すなわち、曝気を最小限にするためにバイアル上部に空隙がないように）リポソーム製剤を満たし、ネジ蓋で密閉した。サンプルを室温又は４０℃で保存した。数日で１０％ Ｎａ−ＡＬＡ及び１０％ Ｎａ Ｒ−ＡＬＡ製剤にいくつかの相分離が生じ、容器の下部に透明な溶液が分離した。また、７．５％ Ｎａ ＡＬＡ及びＮａ−Ｒ−ＡＬＡにも明らかではあるが、より軽度な相分離が生じた一方、５重量％製剤は少なくとも８週間均一のままであった。
【０１４４】
５重量％ Ｎａ−ＡＬＡ及び５重量％ Ｒ−ＡＬＡ含有製剤におけるリポ酸の有効性を、公知の方法（GeroNova Research Inc web site （geronova.com/sites/default/files/LA_HPLC_Mod_USP.pdf）で公開された“Analysis of Lipoic Acid Salts for Quality Assurance”）に基づき、ＨＰＬＣ法で測定した。アッセイの結果を表６に示す。表６に示されるように、低温法で製造されたリポソームに封入されたＡＬＡは非常に安定であった。また、インキュベーション（室温又は４０℃で５０日間）後のＡＬＡ又はＲ−ＡＬＡ有効性の減少は１０％未満であった。
【０１４５】
【表６】
【０１４６】
別の試験のために、実施例８に従って、３つのＮａ−ＡＬＡリポソーム製剤（２．５、５．０又は７．５重量％のＮａ−ＡＬＡを含有）を調製した。安定性のモニタリングのために、ガラス製バイアスの上端まで（バイアス上部に空隙がないように）リポソームを満たし、ネジ蓋で密閉した。ここでも、７．５重量％ ＡＬＡ及び７．５重量％ Ｒ−ＡＬＡ製剤において相分離が生じた。５．０重量％及び２．５重量％製剤は試験を通じて均一のままであった。サンプルを室温又は４０℃で保存し、ＡＬＡ濃度をＨＰＬＣで測定した。結果を表７に示す。表７に示すように、低温法で製造したリポソームに封入されたＡＬＡは、少なくとも３ヶ月間、非常に安定であった。また、１ヶ月目の末から３ヶ月目の末までのＡＬＡ有効性の減少は、全てのケースで（４０℃で保存した場合でさえ）１０％未満であった。ＨＰＬＣで測定した値のうち、２つの７．５％製剤に関するものは、製剤の相分離のためにサンプリングが不均一となってしまったため、正確性が劣るものだった。これらの製剤が調製された時点でＨＰＬＣ法が確立されていなかったため、Ｔ＝０の時点の値はない。
【０１４７】
【表７】
【０１４８】
多数の例示的な態様及び実施形態を上述したが、当業者は、それらに対する修正、置換、付加又はサブコンビネーションを認識するであろう。したがって、本発明の範囲にはそのような全ての修正、置換、付加及びサブコンビネーションを含むと解釈されるべきである。本明細書で引用された全ての特許文献及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤が封入されたリポソームを製造する方法であって、
少なくとも約１８ｗ／ｗ％のベシクル形成脂質を約１〜１２ｗ／ｗ％の水性溶媒又は水混和性溶媒に室温で可溶化して脂質溶液を形成すること、
所定量の前記薬剤を０．００５〜０．０１ｗ／ｗ％のＥＤＴＡに室温で可溶化して薬剤含有溶液を形成すること、
前記薬剤含有溶液をろ過すること、
前記脂質溶液を前記薬剤含有溶液に攪拌しながら注入すること、並びに
得られる脂質及び薬剤含有溶液を頻回攪拌しながら少なくとも１時間水和させることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記水混和性溶媒がアルコールである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記水和の後、追加の脂質又は増粘剤を加えてゲルを形成させることを含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ベシクル形成脂質が少なくとも約４５〜５０％のホスファチジルコリンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ホスファチジルコリンが卵又は大豆に由来する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤がアスコルビン酸又はその塩である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤がグルタチオンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤がアルファリポ酸である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
アスコルビン酸又はその塩の投与のための、請求項６記載の方法によって形成されたリポソーム組成物。
【請求項１０】
少なくとも約１８ｗ／ｗ％のベシクル形成脂質、
０．００５〜０．１ｗ／ｗ％のＥＤＴＡ、及び
１０〜１２ｗ／ｗ％のアルコールを含む、請求項９記載のリポソーム組成物であって、
前記リポソームが２００〜５００ｎｍの平均粒径（直径）を有し、
少なくとも約２２ｗ／ｗ％のアスコルビン酸又はその塩が前記リポソームに封入されている、前記組成物。
【請求項１１】
前記ベシクル形成脂質の少なくとも約４５〜５０％がホスファチジルコリンである、請求項９又は１０記載の組成物。
【請求項１２】
前記ホスファチジルコリンが大豆ホスファチジルコリンである、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
０〜０．６ｗ／ｗ％のキサンタンガムをさらに含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
０．４ｗ／ｗ％のＴｗｅｅｎ８０をさらに含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アスコルビン酸又はその塩がアスコルビン酸ナトリウムである、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
単位用量パッケージと、該パッケージ中に含まれる請求項９〜１５のいずれか１項に記載のリポソーム組成物とを含む単位用量製剤。
【請求項１７】
Ｎ2のガスフラッシュの下、前記リポソーム組成物が前記パッケージ中に密封されている、請求項１６記載の単位用量製剤。
【請求項１８】
対象における壊血病、心臓血管疾患、脳血管疾患、癌、加齢性黄斑変性症、白内障、痛風、重金属毒性又は糖尿病を、リポソームに封入したアスコルビン酸又はその塩で処置する方法であって、
請求項９〜１５のいずれか１項に記載のリポソーム組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記リポソーム組成物を高用量で投与することを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項１】
薬剤が封入されたリポソームを製造する方法であって、
少なくとも約１８ｗ／ｗ％のベシクル形成脂質を約１〜１２ｗ／ｗ％の水性溶媒又は水混和性溶媒に室温で可溶化して脂質溶液を形成すること、
所定量の前記薬剤を０．００５〜０．０１ｗ／ｗ％のＥＤＴＡに室温で可溶化して薬剤含有溶液を形成すること、
前記薬剤含有溶液をろ過すること、
前記脂質溶液を前記薬剤含有溶液に攪拌しながら注入すること、並びに
得られる脂質及び薬剤含有溶液を頻回攪拌しながら少なくとも１時間水和させることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記水混和性溶媒がアルコールである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記水和の後、追加の脂質又は増粘剤を加えてゲルを形成させることを含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ベシクル形成脂質が少なくとも約４５〜５０％のホスファチジルコリンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ホスファチジルコリンが卵又は大豆に由来する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤がアスコルビン酸又はその塩である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤がグルタチオンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤がアルファリポ酸である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
アスコルビン酸又はその塩の投与のための、請求項６記載の方法によって形成されたリポソーム組成物。
【請求項１０】
少なくとも約１８ｗ／ｗ％のベシクル形成脂質、
０．００５〜０．１ｗ／ｗ％のＥＤＴＡ、及び
１０〜１２ｗ／ｗ％のアルコールを含む、請求項９記載のリポソーム組成物であって、
前記リポソームが２００〜５００ｎｍの平均粒径（直径）を有し、
少なくとも約２２ｗ／ｗ％のアスコルビン酸又はその塩が前記リポソームに封入されている、前記組成物。
【請求項１１】
前記ベシクル形成脂質の少なくとも約４５〜５０％がホスファチジルコリンである、請求項９又は１０記載の組成物。
【請求項１２】
前記ホスファチジルコリンが大豆ホスファチジルコリンである、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
０〜０．６ｗ／ｗ％のキサンタンガムをさらに含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
０．４ｗ／ｗ％のＴｗｅｅｎ８０をさらに含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アスコルビン酸又はその塩がアスコルビン酸ナトリウムである、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
単位用量パッケージと、該パッケージ中に含まれる請求項９〜１５のいずれか１項に記載のリポソーム組成物とを含む単位用量製剤。
【請求項１７】
Ｎ2のガスフラッシュの下、前記リポソーム組成物が前記パッケージ中に密封されている、請求項１６記載の単位用量製剤。
【請求項１８】
対象における壊血病、心臓血管疾患、脳血管疾患、癌、加齢性黄斑変性症、白内障、痛風、重金属毒性又は糖尿病を、リポソームに封入したアスコルビン酸又はその塩で処置する方法であって、
請求項９〜１５のいずれか１項に記載のリポソーム組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記リポソーム組成物を高用量で投与することを含む、請求項１８記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１４０３９５（Ｐ２０１２−１４０３９５Ａ）
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５９５４２（Ｐ２０１１−５９５４２）
【出願日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５１１０７０１９０）リブオン ラボラトリーズ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５１１０７０１９０）リブオン ラボラトリーズ (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]