リポソームを製造する方法
【課題】本発明は、油相（Ｏ）として揮発性の炭化水素系有機溶媒を用いて二段階乳化法を行う場合においても、薬剤の内包率が高く、サイズか小さく、かつ粒度分布がシャープな単胞リポソームを製造する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、（１）脂質成分（Ｆ１）を揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に溶解または分散した揮発性の油相液（Ｏ）と、内包対象薬剤（Ｄ）を水性溶媒（ｗ１）に溶解して得られる水相液（Ｗ１）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程；（２）上記工程（１）を経て得られたＷ１／Ｏエマルションと、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程；（３）上記工程（２）を経て得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから炭化水素系有機溶媒（ｏ）を除去することによりリポソーム分散液を調製する溶媒除去工程；（４）上記工程（３）を経て得られたリポソーム分散液から水相液（Ｗ２）を除去し、水相液（Ｗ３）を添加して、リポソーム製剤を調製する水相置換工程を含む、平均粒径５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の単胞リポソームを製造する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、（１）脂質成分（Ｆ１）を揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に溶解または分散した揮発性の油相液（Ｏ）と、内包対象薬剤（Ｄ）を水性溶媒（ｗ１）に溶解して得られる水相液（Ｗ１）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程；（２）上記工程（１）を経て得られたＷ１／Ｏエマルションと、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程；（３）上記工程（２）を経て得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから炭化水素系有機溶媒（ｏ）を除去することによりリポソーム分散液を調製する溶媒除去工程；（４）上記工程（３）を経て得られたリポソーム分散液から水相液（Ｗ２）を除去し、水相液（Ｗ３）を添加して、リポソーム製剤を調製する水相置換工程を含む、平均粒径５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の単胞リポソームを製造する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、化粧品、食品などの分野で用いられるリポソームを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ、医薬、食品、化粧品、塗料等の技術分野において、マイクロカプセルや微粒子と呼ばれる複合型微粒子が幅広く利用されている。複合型微粒子は、その作製に乳化剤として脂質を用いた場合、脂質複合型微粒子と呼ばれている。
【０００３】
これらの微粒子のうち、リポソームは、単層または複数層の脂質二重膜からなる閉鎖小胞体であり、内水相および脂質二重膜内部にそれぞれ水溶性および疎水性の薬剤類を保持できることが知られている。また、リポソームの脂質二重膜は生体膜に類似しているため生体内での安全性が高いことなどから、たとえばＤＤＳ（ドラック・デリバリー・システム）用の医薬品などの、各種用途が注目され、研究開発が進められている。
【０００４】
特にＤＤＳが必要とされているのが遺伝子治療であり、２００１年から革新技術として大きく注目され続けているのがＲＮＡ干渉（Ribonucleic Acid Interference）である。ＲＮＡ干渉とは、遺伝子変異が起こったＲＮＡの一部分を鋳型ＲＮＡによってブロックすることにより、有害なタンパク質を作らせない方法である。ＲＮＡ干渉は遺伝子治療に応用することができ、遺伝子レベルにおいて病気を治療することができる。遺伝子治療を実現するには、まず鋳型ＲＮＡ [siRNA（Small Interfering RNA）]を細胞内に導入しなければならない。しかしながら、細胞には細胞膜が存在しているので、鋳型ＲＮＡを導入する際には細胞膜といったバリヤを乗り越えなければならない。ＤＮＡ（Deoxyribonucleic Acid）やＲＮＡ（Ribonucleic Acid）を利用した遺伝子治療法もＲＮＡ干渉と同様に遺伝子治療の機能を発現するために、まずＤＮＡやＲＮＡを細胞内に導入させなければならない。近年、レトロウイルス等のウイルスをベクターとして使用するあるいは安全性の高い脂質ベシクル（リポソーム）を使用することが有望との認識が広がっている。
【０００５】
ところで、複合型微粒子および脂質複合型微粒子は、その膜厚によりダブルエマルションとベシクルとに分類されている。
このうち、ダブルエマルションとして、Ｗ／Ｏ／ＷエマルションおよびＯ／Ｗ／Ｏエマルション等が挙げられる。たとえば水の中に均一に散らばっている小さい油滴の中に、さらに小さい水滴が均一に散らばっている状態、つまり水滴粒子を内部に閉じこめた油滴粒子が水中に分散している状態のものが、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション（Ｗａｔｅｒ−ｉｎ−Ｏｉｌ−ｉｎ−Ｗａｔｅｒ）である。一分子膜と一分子膜の間に油相が存在するために膜厚はその分厚いのが特徴である。ダブルエマルションの製造は、古典的な機械的乳化法あるいはＳＰＧ （Shirasu Porous Glass）膜乳化法を利用した「二段階乳化法」を用いるのが一般的である。さらに最近では、特許文献１に記載されているように、マイクロ流路に交互に流れる混合しない2種類の流体（ＷとＯ）を別の流体に押し出すことで、Ｗ／Ｏ／ＷエマルションあるいはＯ／Ｗ／Ｏエマルションを作成する方法が知られている。
【０００６】
ところで、Ｗ／Ｏ／Ｗの作成が容易に進行するのは、Ｏ相がオリーブ油やデカンといった沸点の高い油の場合であることが知られており、上記特許文献１においても実施例で示されているＯ相はデカンやヘキサデカンである。一方、水より沸点の低い有機溶媒をＯ相に用いる場合はＷ／Ｏ／Ｗの作成は容易ではなく、これは有機溶媒の表面張力が低いために粒子の球形を維持する力が足りないため、と解釈されている。
【０００７】
一方、ベシクルとは、両親媒性化合物の二分子膜がシェル（殻）状に並んで閉じられた球体物質であり、一分子膜と一分子膜の間になにも存在しないために膜厚は薄いのが特徴である。ここで、リポソームはベシクルに分類される脂質複合型微粒子であり、上記Ｗ／Ｏ／ＷエマルションからＯ相を除去した構造体にあたる。したがって、もし、水より沸点の低い有機溶媒をＯ相に用いるなら、このようなＯ相を除去するのは容易であり、目的のリポソームを得ることができるが、水より沸点の高い有機溶媒をＯ相に用いる場合はこれを除去するのは事実上困難である。「二段階乳化法」によりリポソームを作成するためには、Ｏ相として、除去が容易な沸点の低い有機溶媒を選択する必要があるのだが、その場合にはＷ／Ｏ／Ｗの作成に困難が伴い、他方、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを作成することが容易な沸点の高い有機溶媒を選択すると、Ｏ相の除去が困難であるためにリポソームへの変換が不可能になる、というジレンマに陥り達成困難な課題となっている。実際、リポソームの、内水相および脂質二重膜内部にそれぞれ水溶性および疎水性の薬剤類を保持する技術としては、疎水性の薬剤類を保持することは比較的容易に達成されて医薬品として上市された例があるのに対し、水溶性の薬剤類を保持することは困難であり先の遺伝子治療薬のリポソームも完成の域には達していない。
【０００８】
このようなジレンマを解消するリポソームの製造方法の一つとして、二段階の乳化工程によりＷ／Ｏ／Ｗエマルションを調製した後、その油相（Ｏ）を除去することによりリポソームを形成させる方法（マイクロカプセル化法ないし二段階乳化法と呼ばれる。）が知られている（非特許文献１）。しかしながら、内包する薬剤としてはカルセインと言う色素を例示しているのみであり、薬剤汎用性については十分とはいえない。
【０００９】
また、特許文献２には、二段階の乳化工程によりＷ／Ｏ／Ｗエマルションを調製する方法として、ベシクル脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤の外水相液を用いてマイクロチャネル乳化法により二次乳化を行う方法が開示されており、これに関連して、乳化剤やマイクロチャネルについて検討を行った研究も種々なされてきている。
【００１０】
ここで、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを調製するにあたり、油相（Ｏ）として非揮発性のオリーブオイルなどを用いた作成例・応用例は多く、広く一般的に知られている。また、油相（Ｏ）として揮発性の有機溶媒を用いてＷ／Ｏ／Ｗエマルションを得る場合についても、二次乳化をマイクロチャンネルを用いて行った場合には、内水相への薬剤・化合物の封じ込めを達成できており、このことは本発明者らにより先に出願され、国際公開された特許文献３に記載されている。しかし、二次乳化を攪拌乳化によって行うことにより、同様の内水相への薬剤・化合物の封じ込めを実現することは依然として困難である。したがって、油相（Ｏ）として揮発性の有機溶媒を用いる二段階乳化法について、さらなる開発が求められている。
【００１１】
ところで、二段階乳化法を用いてＷ／Ｏ／Ｗエマルションを得る場合、公知の二段階乳化では、結晶状態の脂質を完全に有機溶媒に溶解して一次乳化を実施している。ところが、ヘキサンなどの炭化水素系有機溶媒（Ｏ）に対しては、結晶状態の脂質を完全に溶解しないため、脂質が充分に分散しない不均一な状態で二段階乳化を実施せざるを得ず、得られるリポソームにおいて薬剤の内包率が向上しない等良好な結果が得られないという問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００６−２７２１９６号公報
【特許文献２】特開２００９−２８０５２５号公報
【特許文献３】国際公開２０１０／１１０１１６号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ishii et al., J. Dispers. Sci. Technol.. vol.9, No.1, pp.1-15, 1988.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者は、ヘキサン溶媒（ｏ）に対しては、結晶状態の脂質よりも非結晶性の脂質の方が分散性がよく、完全に溶解するに到らないまでも、二段階乳化をスムーズに進行させることができるとの知見を得、本発明を行うに到った。
【００１５】
そこで、本発明は、油相（Ｏ）として揮発性の炭化水素系有機溶媒を用いて二段階乳化法を行う場合においても、薬剤の内包率が高く、サイズか小さく、かつ粒度分布がシャープな単胞リポソームを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、二段階乳化法によりリポソームを製造する際に、二次乳化工程の外水相に非結晶性の脂質成分を添加することにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［９］に係る単胞リポソームを製造する方法を提供する。
［１］下記工程（１）〜（４）を含む、体積平均粒径５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の単胞リポソームを製造する方法
（１）脂質成分（Ｆ１）を揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に溶解または分散した油相液（Ｏ）と、内包対象薬剤（Ｄ）を水性溶媒（ｗ１）に溶解して得られる水相液（Ｗ１）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程；
（２）前記工程（１）を経て得られたＷ１／Ｏエマルションと、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程；
（３）前記工程（２）を経て得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから前記揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）を除去することによりリポソーム分散液を調製する溶媒除去工程；
（４）前記工程（３）を経て得られたリポソーム分散液から水相液（Ｗ２）を除去し、当該除去した水相液（Ｗ２）よりも少量の水相液（Ｗ３）を添加して、リポソーム製剤を調製する水相置換工程。
【００１８】
［２］前記工程（１）において脂質成分（Ｆ１）の代わりに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いるか、あるいは、
前記工程（２）において前記混合乳化の前にＷ１／Ｏエマルションに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加する、
前記［１］記載の方法。
【００１９】
［３］前記工程（２）における二次乳化を下記式（ｅ１）の条件を満たす撹拌乳化により実施する、前記［１］または［２］記載の方法：
0.02385 <ｒ×ｎ／Ｌ' < 0.1431 （ｅ１）
上記式（ｅ１）において、ｒは攪拌子の半径［ｍ］，Ｌ'はＷ１／Ｏエマルションの粒径［ｎｍ］，ｎは攪拌子の毎分回転数［rpm］を表す。
【００２０】
［４］前記工程（４）を経て得られるリポソーム含有製剤が、リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）に対する該内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）が0.05以上であるものである、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
【００２１】
［５］前記リポソーム含有製剤における前記重量比（Ｄ／Ｆ）が0.5以上である前記［４］記載の方法。
【００２２】
［６］前記工程（１）において、水性溶媒（ｗ１）に上記内包対象薬剤（Ｄ）が過飽和状態で溶解した水相液（Ｗ１）を用いる、前記［４］および［５］のいずれかに記載の方法。
【００２３】
［７］前記工程（２）において、乳化剤（Ｒ）が溶解した水相液（Ｗ２）を用いる、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
【００２４】
［８］前記工程（１）〜（４）のすべての工程を５〜１０℃の範囲の温度で実施する、前記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
【００２５】
［９］前記工程（１）における混合乳化をパルス超音波で実施する、前記［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る単胞リポソームを製造する方法によれば、薬剤の内包率が高く、サイズか小さく、かつ粒度分布がシャープな単胞リポソームを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】二段階乳化法によるリポソーム生成および、本発明における脂質とエマルションとの関係を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
〔製造原料〕
脂質成分（Ｆ１）・（Ｆ２）
一次乳化工程で有機溶媒（ｏ）に溶解する脂質成分（Ｆ１）は主としてリポソームの脂質二重膜の内膜を構成し、場合によっては外膜の構成にも寄与する。一方、必要に応じて二次乳化工程で添加する脂質成分（Ｆ２）は主としてリポソームの外膜を構成する。脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）は、同一の組成であっても、異なる組成であってもよい。
【００２９】
これらの脂質成分の配合組成は特に限定されるものではなく、公知のリポソームの配合組成に準じたものとすることができる。一般的には、リン脂質（動植物由来のレシチン；ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸またはそれらの脂肪酸エステルであるグリセロリン脂質；スフィンゴリン脂質；これらの誘導体等）と、脂質膜の安定化に寄与するステロール類（コレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、これらの誘導体等）とを中心に構成され、さらに糖脂質、グリコール、脂肪族アミン、長鎖脂肪酸（オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸等）、その他各種の機能性を賦与する化合物が配合されていてもよい。また、脂質成分（Ｆ２）には、たとえばＰＥＧ化リン脂質のような、リポソーム表面を修飾して各種の機能性を賦与するための脂質を配合することも可能である。これらの化合物の脂質成分中の配合比も、脂質膜の安定性やリポソームの生体内での挙動などの性状を考慮しながら、用途に応じて適切に調整すればよい。
【００３０】
本発明においては、このような脂質成分（Ｆ１）、（Ｆ２）ともに、単一の脂質からなるものであってもよいし、複数の脂質からなるもの（混合脂質成分）であってもよい。
非結晶性の脂質成分（ＦＮ）
本発明においては、二段階乳化を円滑に進めるために、二次乳化工程において非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が用いられる。
【００３１】
図１上部に示すように、リン脂質などの脂質成分は、Ｗ１／Ｏエマルション及びＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおいて水相と油相との界面に配列しており、油相を構成する有機溶媒の除去により内包対象薬剤（図１では「薬剤」と記載。）を内包するリポソームの膜を構成する。ここで、油相がヘキサンなどの揮発性の炭化水素系有機溶媒である場合、図１下部に示すように、一部の脂質成分がＷ１／Ｏエマルション及びＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの形成に用いられずに残ることがある。これを解決する第1の策は脂質成分を溶かしやすい溶媒たとえばクロル系溶媒を用いることである。しかしながら、多くの水溶性薬剤類はクロル系溶媒に一部分が溶けこむ傾向にあり、炭化水素系有機溶媒には溶けにくいという性質を有するため、内水相における水溶性薬剤類の存在比を高めて、内包率の高いリポソーム製造を実現するためには炭化水素系有機溶媒を選択する方が汎用性の高い製造法の実現に近付ける。また、医薬品は安全性を重んじるため、クロル系溶媒を避けられればより高い安全性が確保できる。そこで、炭化水素系有機溶媒を用いる点はそのままにして、課題を解決する必要があった。
【００３２】
上記脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）として用いられる脂質成分は、通常は、容易に入手できる結晶状脂質であるであることから、このような脂質成分がＷ１／Ｏエマルション及びＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの形成に用いられるためには、(i) 結晶状態の脂質から脂質分子が分離し、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に溶解または分散するプロセスと、(ii) 前記(i) で生じた有機溶媒性混合液と水相との接触により、有機溶媒性混合液に存在している脂質分子が水／油界面に再配列して、Ｗ１／ＯエマルションまたはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの膜を形成するプロセスとを経る必要がある。ところが、脂質成分は概して揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）との親和性が充分高くない上、結晶状態の脂質から脂質分子が分離するには、結晶内の脂質分子間に働く水素結合、分子間力その他の比較的強い相互作用に打ち克つ必要があり、さらに揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）との接触面積も小さいため、結晶状態からの脂質分子の再配列には時間がかかる傾向にある。したがって、結晶状態の脂質成分を用いた場合、Ｗ１／ＯエマルションまたはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの生成が円滑には進みにくい傾向がある。このことは、脂質成分の多くが、Ｗ１／ＯエマルションまたはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの生成に用いられずに残ることを意味する。
【００３３】
一方、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）では、結晶状態の脂質成分の場合ほど脂質分子が相互に強固に結合していないことから、固体状態の脂質から脂質分子が分離しやすく、脂質分子の再配列がより有利に行われる傾向にある。特に多孔質構造の脂質成分（ＦＮ）の場合、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）や水との接触面積が大きくなることから、この点でも、固体状態の脂質から脂質分子が分離する上で有利となる。したがって、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いると、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの形成が円滑に行われることになり、その結果、リポソームの形で内包しようとする物質の内包率も向上することになる。特に、図１下部のように、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が外水相に含まれていると（すなわち、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）を用いる場合には）、二次乳化に際して水相と油相との界面に脂質分子が速やかに再配列し、リポソームを好適に生成することができる。
【００３４】
本発明で用いられる非結晶性の脂質成分（ＦＮ）として、例えば、ラメラ構造の脂質成分が挙げられる。ここで、「ラメラ構造」とは、液体と固体の中間にある物質を示す液晶状態の中の一つとして知られており、水・脂質・水・脂質・・・のように水相と脂質相とが交互に繰り返してなる層状構造をいう。リン脂質などの両親媒性化合物は一つの分子内に水相と脂質相とが共存するため、こうした化合物が一列に並ぶことでこのような層状構造をとることで安定状態に落ち着いている。リン脂質の層状構造は、バンガム法による古典的なリポソーム製造法のプロセスの一部で得ることができ、脂質フィルム層構造がその例である。細密充填により結晶格子を形成して安定状態に落ち着いている結晶性の脂質と比較して、層状構造は弱い相互作用で繰り返し配列しただけの状態なので、溶媒分子などの外部要因で容易にその配列を解列し、また再配列することができることが特徴である。
【００３５】
ここで、そのような「ラメラ構造」の脂質の一形態として、フィルム状脂質も挙げられる。フィルム状脂質は、例えば、結晶状脂質をクロロフォルムに完全溶解してナスフラスコ（「ナスコル」とも呼ばれる。）に入れ、エバポレーターでゆっくりとクロロフォルムを留去し、ナスフラスコ壁面に配列した脂質膜を回収することで用意できることが知られている。このような回収方法は、古典的リポソーム製造法であるバンガム法の一工程として知られている。
【００３６】
その他、本発明では、「非結晶性の脂質成分（ＦＮ）」が、ラメラ構造を有していない通常の多孔質構造を有していてもよい。
このような非結晶性の脂質成分（ＦＮ）の配合組成としては、非結晶性の成分を用いることを除いては、いずれも上記脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）の場合と同様の配合組成を適用することができる。例えば、特公平６−７４２０５号公報に記載されている方法により得られる混合脂質を用いることができる。したがって、本発明においては、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が、単一の脂質からなるものであってもよいし、複数の脂質からなるもの（混合脂質成分）であってもよい。
【００３７】
なお、本明細書において、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）、並びに上述した脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）を包含する、リポソームを構成する脂質成分全体を指す概念として、「リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）」という語を用いる場合がある。
【００３８】
水相液（Ｗ１）・（Ｗ２）・（Ｗ３）
一次乳化工程（１）で用いられる水相液（Ｗ１）はＷ１／Ｏエマルションの水相を構成し、二次乳化工程（２）で用いられる水相液（Ｗ２）はＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの外水相を構成し、水相置換工程で用いられる水相液（Ｗ３）は、最終的なリポソーム含有製剤（リポソーム分散液）の外水相を構成する。
【００３９】
水相液（Ｗ１）は、公知のリポソームの製造方法（特に二段階乳化法）と同様、水、または水にｐＨ調整のための酸および塩を添加して得られる緩衝液に、内包対象薬剤（Ｄ）および脂質成分（Ｆ１）を溶解することにより調製されるものであり。たとえば、ｐＨ調整のための酸および塩を純水に溶解して得られる緩衝液が一般的に用いられ、必要に応じて、水と相溶する他の溶媒、浸透圧調整のための塩類・糖類などをさらに溶解させてもよい。本明細書において、水相液（Ｗ１）から内包対象薬剤（Ｄ）を除く、水または緩衝液、あるいは、内包対象薬剤（Ｄ）以外の成分が溶解した水溶液等を、水性溶媒（ｗ１）と称することがある。
【００４０】
水相液（Ｗ２）は、公知のリポソームの製造方法（特に二段階乳化法）と同様、一般的には水または上記のような緩衝液であり、必要に応じて上記のような成分や、その他の機能性成分（本発明ではたとえば乳化剤（Ｒ））をさらに溶解させてもよい。本明細書において、水相液（Ｗ２）から乳化剤（Ｒ）を除く、水または緩衝液、あるいは、乳化剤（Ｒ）以外の成分が溶解した水溶液等を、水性溶媒（ｗ２）と称することがある。
【００４１】
また、水相液（Ｗ３）としては、リポソームの安定性などの観点から、水相液（Ｗ１）を構成する水性溶媒（ｗ１）と同じ浸透圧を有する水性溶媒、典型的には水性溶媒（ｗ１）と同一の水性溶媒が用いることが好適であるが、本発明の作用効果を阻害しない範囲で、水性溶媒（ｗ１）と異なる水性溶媒を用いることも可能である。本明細書においては、このような水性溶媒を「水性溶媒（ｗ３）」と称することがある。このように、水相液（Ｗ３）は、水性溶媒（ｗ１）と同一の、あるいは本発明の作用効果を阻害しない範囲で水性溶媒（ｗ１）とは異なる水性溶媒（ｗ３）からなるものである。ここで、水相置換工程（４）において水相液（Ｗ３）として用いられる水性溶媒（ｗ３）は、緩衝液としての組成などその他の条件において水性溶媒（ｗ１）と同一であればよく、水相液（Ｗ３）には内包対象薬剤（Ｄ）を溶解させる必要はない。
【００４２】
油相液（Ｏ）
二次乳化工程で用いられる油相液（Ｏ）はＷ１／Ｏエマルションの油相を構成する。本発明において、この油相液（Ｏ）を構成する溶媒として、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）が用いられる。ここで、油相液（Ｏ）は、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）のみからなるものでもよいし、必要に応じて揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に脂質成分（ｆ２）等を溶解することにより調製されたものでもよい。
【００４３】
本発明において、油相液（Ｏ）を構成する有機溶媒として揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）を用いるのは、これらが水と混和しにくい有機溶媒であり、且つＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションからリポソームを製造する工程において除去が容易であるからである。なお、本発明において、「揮発性」とは水よりも沸点が低いことをいい、具体的には、大気圧において１００℃未満の沸点を有することをいう。
【００４４】
ただ、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）の沸点が低いと、後述する「溶媒除去工程」において水相液（Ｗ１）および（Ｗ２）が凍結し、後述する内包対象薬剤（Ｄ）が変性する場合がある。この観点からは、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）の沸点が４℃以上であることが好ましい。したがって、本発明で用いられる揮発性の炭化水素系有機溶媒（Ｏ）は、４℃以上１００℃未満の沸点を有していることが好ましい。特に、本発明においては、リポソームの安定性（膜透過性の高い薬剤の内包率向上）を考慮すると、溶媒除去工程（３）も含めた、リポソーム含有製剤の製造方法におけるすべての工程を５〜１０℃で行うことが好ましいので、その場合揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）としては、必要に応じて減圧や撹拌を用いることにより５〜１０℃で揮発するものが好ましい。ここで、膜透過性とは、薬剤類分子がリポソームの脂質二分子膜を通過しやすいかどうかという指標である。薬剤類の分子構造によってはその脂溶性構造部位の影響で脂質二分子膜内部に局在する脂溶性の脂肪鎖構造部分を通過しやすくなるため、高水溶性薬剤であってもまったく脂肪鎖構造部分を通過できないというわけではない。この指標はたとえば、リポソーム含有製剤をある温度で静置して、一度内包した薬剤類が経時的に外水相に移行しているかどうかを、内水相と外水相の薬剤濃度を測定して知ることができる。たとえば、膜透過性の高い薬剤として、抗がん剤のシタラビンをあげられる。また、脂肪鎖構造部分を通過しやすいかどうかは、化合物の構造による影響も重要なファクターであるが、一般的に温度上昇によって脂質分子の運動エネルギーが上昇し、このエネルギーが脂肪鎖構造部分同士の疎水性相互作用に拮抗して構造強度が弱まってわずかな隙間が生じることから、多くの薬剤は温度上昇によって膜透過性が増すことも周知の事実である。
【００４５】
揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）としては、たとえばヘキサン（ｎ−ヘキサン：沸点６９℃）、シクロヘキサン（沸点８０．７℃）、ペンタン（沸点３６℃）などが挙げられる。これらの溶媒は、いずれか１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４６】
内包対象薬剤（Ｄ）
本発明における、リポソームに内包させる物質（「内包対象薬剤」と称する。）は特に限定されるものではなく、リポソームの用途に応じて医薬品、化粧品、食品などの分野で知られている各種の物質を用いることができる。本発明においては、内包対象薬剤（Ｄ）として、水溶性の物質（「水溶性薬剤類」と称する。）」が好適に用いられる。ここで、本発明で用いられる上記各種脂質成分が水溶性を有する場合もありうるが、本明細書にいう「水溶性薬剤類」には、そのような各種脂質成分は包含されない。
【００４７】
水溶性薬剤類のうち、医療用のリポソームなどに用いられるものとしては、たとえば、造影剤（Ｘ線造影用の非イオン性ヨード化合物、ＭＲＩ造影用のガドリニウムとキレート化剤とからなる錯体等）、抗がん剤（アドリアマイシン、ビラルビシン、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、マイトマイシン、５−フルオロウラシル、イリノテカン、エストラサイト、エピルビシン、カルボプラチン、イントロン、ジェムザール、メソトレキセート、シタラビンアイソボリン、テガフール、シスプラチン、エトポシド、トポテシン、ビラルビシン、ネダプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド、テスパミン、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバチン、エノシタビン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、ダウノマイシン、アクラルビシン、イビルビシン、アムルビシン、アクチノマイシン、タキソテール、トラスツブマブ、リツキシマブ、ゲムツズマブ、レンチナン、シゾフィラン、インターフェロン、インターロイキン、アスパラギナーゼ、ホスフェストロール、ブスルファン、ボルテゾミブ、アリムタ、ベバシズマブ、ネララビン、セツキシマブ等）、抗菌剤（マクロライド系抗生物質、ケトライド系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、オキサセフェム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、ベータラクタマーゼ配合剤、アミノグリコシド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、カルバペネム系抗生物質、ペネム系抗生物質）、MRSA・VRE・PRSP感染症治療剤、ポリエン系抗真菌剤、ピリミジン系抗真菌剤、アゾール系抗真菌剤、キャンディン系抗真菌剤、ニューキノロン系合成抗菌剤、抗酸化性剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進性剤、保湿剤、ホルモン剤、ビタミン類、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、タンパク質（酵素、抗体、ペプチド等）、ワクチン製剤（破傷風などのトキソイドを抗原とするもの；ジフテリア、日本脳炎、ポリオ、風疹、おたふくかぜ、肝炎などのウイルスを抗原とするもの；DNAまたはRNAワクチン等）などの薬理的作用を有する物質や、色素・蛍光色素、キレート化剤、安定化剤、保存剤などの製薬助剤が挙げられる。
【００４８】
薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）
リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）に対する内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）は大きい方が好ましい、つまり、より少量の脂質成分（Ｆ）を用いてより多量の内包対象薬剤（Ｄ）をリポソームに内包させることが好ましい。
【００４９】
内包対象薬剤（Ｄ）の薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）（以下、「薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）」または単に「薬剤重量比」と称する場合がある。）は、次式により算出される：
薬剤重量比＝リポソームに内包されている内包対象薬剤（Ｄ）の質量／リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）の質量。
【００５０】
この薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、好ましくは０．０５以上、より好ましくは０．５以上に設定することができる。なお、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）の上限値は、リポソームの粒径（粒径が大きいほどリポソームを構成する脂質成分（Ｆ）の量は少なくなる）と、内包対象薬剤（Ｄ）の水に対する溶解度や内包率（これらが高いほどリポソームに内包される内包対象薬剤（Ｄ）の量は大きくなる）によって変動し、一概に設定できるものではない。
【００５１】
後述する水相置換工程（４）において上記のような薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）の条件を満たすリポソームを調製するためには、所望の重量比（Ｄ／Ｆ）の条件を満たす量の内包対象薬剤（Ｄ）および脂質成分（Ｆ）を用い、内包対象薬剤（Ｄ）については水性溶媒（ｗ１）に、脂質成分（Ｆ）のうち脂質成分（Ｆ１）については揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に、脂質成分（Ｆ）のうち非結晶性の脂質成分（ＦＮ）については水相液（Ｗ２）及び所要によりＷ１／Ｏエマルションに、脂質成分（Ｆ）のうち脂質成分（Ｆ２）については水相液（Ｗ２）及び／またはＷ１／Ｏエマルションに、それぞれ、溶解すればよい。
【００５２】
以下、内包対象薬剤（Ｄ）および脂質成分（Ｆ）の必要量の計算例（薬剤重量比を0.5〜5とする場合）を示す。
水溶性薬剤を内包させる目的は、水溶性薬剤を内水相としての水相液（Ｗ１）に溶解することによって達成される。したがって水溶性の高い薬剤類は、水相液（Ｗ１）に高濃度で溶解すれば、内包される絶対量は増やすことができる。一方、水相液（Ｗ１）の量は適宜変えることができ、所定の粒径の粒子(Ｗ１／Ｏ)を作成しようとすれば、それに必要な脂質の量(個数)は計算できる。たとえば、100 nm のＷ１／Ｏエマルション(粒子体積0.0005 μm3)を形成する場合、水相液（Ｗ１）(内水相) 1.0 mLで製造すれば2.0 x1015個のW1/O粒子が生成する計算である。一方、100 nm のＷ１／Ｏナノエマルション(粒子表面積2500 nm2)はリン脂質分子(レシチン表面積0.7 nm2) 0.4 x105個で構成されている、と計算される。したがって、薬液 1.0 mL の一次乳化に必要な脂質量は、2.0 x1015個ｘ0.4 x105個＝0.8 x1020個、すなわち0.132 mmolである。レシチン以外の脂質分子も、その表面積はおおよそ0.7 nm2として差し支えないため、脂質類の総量として0.132 mmolが100 nm のW1/Oナノエマルションを作成するのに必要最少量と考えられる。リポソームを作成するには、その倍の0.264 mmolが必要であり、代表的なリン脂質のDPPCで分子量換算すると193 mgが必要である。
【００５３】
そこで、薬剤を1.0 mLに溶解し、100 nmのリポソームを作成する場合を考えると、薬局法記載の通りシタラビンは0.1〜1.0 g溶解するので、薬剤重量比0.1 g/0.193 g〜1.0 g/0.193 g、イオヘキソール(造影剤)は1.0 g以上溶解するので、薬剤重量比1.0 g/0.193 g以上である。これは、脂質量を低減して効率的に薬剤を内包できることを意味し、脂質の投与量を減らすことができる点、臨床上有意義であり、本手法により薬剤重量比0.5〜5が達成できる。さらに、より多くの薬剤を溶解すると、一般的に飽和状態に近づき粘度が上昇する。本手法により、内水相の粘度として１０mPa・sまで内包可能である。
【００５４】
また、100 nmより大きい粒子を製造する場合には、脂質の必要量はそれより少なくて済むので、より効率的ということになる。
水溶性の高い薬剤類を内包対象薬剤（Ｄ）として高濃度で溶解した水相液（Ｗ１）を得る工夫は、薬剤が過飽和状態で溶解した水相液（Ｗ１）を用意することでも実現できる。この方法で、内包される薬剤の絶対量をさらに増やすことができる。アモルファス状態の薬剤を用意して溶解する、ナノ粒子状結晶薬剤を用意して溶解するあるいは溶解助剤を添加する、と言った方法で過飽和状態を実現できる。ただし、過飽和状態からの薬剤結晶の析出は容易に進行するので、過飽和状態での実験作業は数時間以内に限られるのが一般的である。しかしながら、析出のメカニズムの研究が進むにつれ、過飽和技術も進歩して工業化に耐えうるようになってきたので、長時間に及ぶ実験作業も現実味を帯びてきている。すなわち、析出のメカニズムとしては、溶液中で析出が起こるバルク析出機構（bulk precipitation mechanism: BPM)と固体表面で析出が起こる表面析出機構（surface precipitation mechanism: SPM)の2種類が提唱されており、内包対象薬剤（Ｄ）がどちらに属するかを判別して、適切な過飽和化を実現できるようになってきている。実際に、結晶化の刺激となる埃などの要因を排除すれば、実験作業は半日以上問題ないケースもある。
【００５５】
リポソームおよびその水性分散液
本発明のリポソーム、典型的には以下に説明するような本発明の製造方法により得られるリポソームは、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が添加されている水相液（Ｗ２）を外水相とするものであり、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が添加されていない水相液（Ｗ２）を外水相とするものに比べてＷ／Ｏ／Ｗエマルション形成をより円滑に進めることができる。
【００５６】
なお、本発明において、「単胞リポソーム」（ULV、単核リポソームと同義である）は、単一の内水相を有するリポソーム構造物を指し、体積平均粒径はナノメートルの範囲、通常は２０〜５００ｎｍ程度である。これに対して、「多胞リポソーム」（MVL: multivesicular liposomes）は、複数の非同心円状の内水相を包囲する脂質膜を含んでなるリポソーム構造物を指し、また「多重膜リポソーム」（MLV）は、複数の「タマネギの皮」のような同心円状の膜を有し、その間に殻様の同心円状の水系コンパートメントがあるリポソーム構造物を指す。多胞リポソームおよび多重膜リポソームの体積平均粒径はマイクロメートルの範囲、通常は０．５〜２５μｍ程度である。
【００５７】
本発明のリポソームは、典型的には以下に説明するような本発明の製造方法により、水相液（Ｗ２：外水相）中に懸濁した状態で得られる。このようなリポソームの水性分散液が各種の用途に供されるが、使用されるまでの間、たとえば凍結乾燥法などにより粉末状態のリポソームとして保存することもできる。使用の際には、粉末状態のリポソームを水性溶媒に添加し、再度懸濁させればよい。
【００５８】
本発明のリポソームのサイズは、体積平均粒子径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるので、毛細血管を閉塞するおそれがほとんどなく、またがん組織近辺の血管にできる間隙を通過することもできるため、医薬品等として人体に投与して使用する上で好都合である。
【００５９】
なお、本発明における、リポソームおよびエマルションの体積平均粒子径は、動的光散乱法により測定されるものであり、たとえば、リポソームの水性懸濁液をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて粒度分布や体積平均粒子径を算出することができる。
【００６０】
〔リポソームの製造方法〕
本発明のリポソームの製造方法は、少なくとも下記工程（１）〜（４）を含み、必要に応じてその他の工程をさらに含むことができるものである。そして、これらの工程を得ることで、平均粒径５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の単胞リポソームが得られるのである。
【００６１】
（１）一次乳化工程
一次乳化工程は、脂質成分（Ｆ１）を揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に溶解または分散した油相液（Ｏ）と、内包対象薬剤（Ｄ）を水性溶媒（ｗ１）に溶解して得られる水相液（Ｗ１）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏエマルションを調製する工程である。
【００６２】
この一次乳化工程において、脂質成分（Ｆ１）の代わりに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いることができる。この場合、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）は、水相液（Ｗ１）中に溶解または分散した形で用いることができる。水相液（Ｗ１）に非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が添加されていると、結晶状態の脂質成分を添加したときと比べて小さなリポソーム粒子を得ることができ、且つその粒度分布もシャープになるので好ましい。
【００６３】
Ｗ１／Ｏエマルションを調製するための方法は特に限定されるものではなく、従来のリポソームの製造方法でも用いられているような方法を採用することができる。たとえば、超音波乳化機、撹拌乳化機、膜乳化機、高圧ホモジナイザーなどの装置を用いた乳化方法が挙げられるが、平均粒径を広い範囲で制御でき、かつ得られるＷ１／Ｏエマルションが単分散性となるような方法が好ましい。ここで、超音波乳化機を用いる場合、パルス状に発振される超音波（以下、「パルス超音波」と呼ぶ。）を適用して一次乳化を行うことが好ましい。かかる方法によれば、一次乳化に伴って生じる発熱を抑えることができるので、本発明で用いられる工程（１）〜（４）を含む全ての工程を低温（例えば、５〜１０℃）で行うことも可能となる。また、かかる方法を用いる場合、発振された超音波が乳化を行う系において局所に集中することを回避できることから、均一なＷ１／Ｏエマルションの形成が速やかに進行すると推測しており、これによって、粒度分布の狭いリポソーム粒子を得ることができると考えられる。
【００６４】
水相液（Ｗ１）のｐＨは、通常３〜１０の範囲で調節され、たとえば、脂質成分にオレイン酸を用いる場合、ｐＨは６〜８．５とすることが好ましい。ｐＨを調整するためには適切な緩衝液を用いればよい。
【００６５】
一次乳化工程におけるその他の条件、たとえば、脂質成分（Ｆ１）の量（油相液（Ｏ）を構成する揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に対する割合）、油相液（Ｏ）と水相液（Ｗ１）の体積比、Ｗ１／Ｏエマルションの平均粒径などは、公知のリポソームの製造方法（一次乳化工程）に準じて、続く二次乳化工程の条件や最終的に調製するリポソームの態様などを考慮しながら、適宜調節することができる。通常、脂質成分（Ｆ１）の量は油相液（Ｏ）に対して１〜５０質量％の割合であり、油相液（Ｏ）と水相液（Ｗ１）との体積比は１００：１〜１：２である。Ｗ１／Ｏエマルションの体積平均粒径は、好ましくは５０〜１，０００ｎｍであり、より好ましくは５０〜２００ｎｍである。
【００６６】
本発明では、リポソームに内包対象薬剤（Ｄ）として水溶性薬剤類を内包させるために、一次乳化工程（１）の際に、水溶性薬剤類を添加してある水相液（Ｗ１）を用いてＷ１／Ｏエマルションを得てから、後述する二次乳化工程（２）および溶媒除去工程（３）を行うことにより、二次乳化工程終了時点で当該水溶性薬剤類を内包するリポソームが得られるようにする方法を用いることもできる。
【００６７】
ここで、内包対象薬剤（Ｄ）を水性溶媒（Ｗ１）に溶解して得られる含薬剤水溶液において、内包対象薬剤として用いられる薬剤類が過飽和状態で溶解していてもよい。この場合、後述する水相置換工程（４）において、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）が大きいリポソーム含有製剤、例えば、この重量比（Ｄ／Ｆ）が０．０５以上、好ましくは０．５以上のリポソーム含有製剤を調製する上で有利となることがある。
【００６８】
なお、必要であれば、内包対象薬剤（Ｄ）として脂溶性の物質（脂溶性薬剤類）を、本発明のリポソームの脂質膜内に内包させることも可能である。その場合は、脂溶性薬剤類を、一次乳化工程（１）の際に油相液（Ｏ）に溶解させた状態で添加すればよい。
【００６９】
（２）二次乳化工程
二次乳化工程は、上記一次乳化工程（１）により得られたＷ１／Ｏエマルションと、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する工程である。本発明では、水相液（Ｗ２）中に非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が添加されているので、結晶状態の脂質成分が添加されている場合と比べて、リポソームに内包される内包対象薬剤（Ｄ）の内包率が向上する利点がある。これは、脂質の配列速度が向上し、目的の構造体が早く得られるため、配列途中の構造体が崩壊する速度に勝っていることが要因と考察できる。
【００７０】
ここで、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）は、水相液（Ｗ２）に添加された形で用いることができるとともに、混合乳化の前に予めＷ１／Ｏエマルションにも添加された形で用いることもできる。この場合、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）は、Ｗ１／Ｏエマルションに溶解または分散した形で添加することができる。
【００７１】
Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製するための方法は特に限定されるものではなく、従来のＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造方法でも用いられているような方法を採用することができる。
【００７２】
たとえば、乳化操作時の液滴の崩壊および液滴からの内包物質の漏出を抑えるため、乳化処理に大きな機械的剪断力を必要としないマイクロチャネル乳化法を用いることが好適である。マイクロチャネル乳化法では、たとえば、シリコン製マイクロチャンネル基板およびこの基板上部を覆うガラス板から構成される、マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用する。上記基板およびガラス板により形成される溝型マイクロチャネルの出口側、あるいは上記基板上に加工された貫通型マイクロチャネルの出口側には、外水相をなす水相液（Ｗ２）を満たしておき、マイクロチャネルの入口側からＷ１／Ｏエマルションを圧入することで、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを形成できる。上記基板としては、デッドエンド型、クロスフロー型、貫通孔型など、種々の形態のものを用いることができる。
【００７３】
また、Ｗ１／Ｏエマルションを乳化膜に通過させて水相液（Ｗ２）中に液滴として分散させることによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する、膜乳化法を用いることもできる。特に、直径０．１〜５．０μｍ程度の微細な細孔を有するＳＰＧ（Shirasu Porous Glass：シラス多孔質ガラス）で形成された乳化膜を用いる膜乳化法が好適であり、コストが安く処理量が多い、工業的に有利な方法とすることができる。
【００７４】
なお、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの平均粒径の単分散性を向上させるために、上記のような方法または他の方法による膜乳化でＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを得た後、さらに１回ないし複数回、当該膜乳化で用いた膜と同じ膜またはそれとは異なる膜にＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションによる膜処理を行ってもよい。特に、膜乳化に用いる膜よりも小さな細孔径を有する膜を用いて膜処理を行うようにした場合、膜処理を行うことなく１回の膜乳化でＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する場合に較べて、膜乳化および膜処理それぞれの膜への負荷（エマルションを膜に通過させるために必要な圧力）を小さくすることができ、それにより膜の長寿命化や二次乳化工程に要する処理時間の短縮を図ることができ、リポソームの生産性の向上および低コスト化にも有利である。
【００７５】
また、本発明では、二次乳化工程（２）における混合乳化を、機械的剪断力の生じる可能性のある撹拌乳化によって行うことによっても、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを得ることができる。
【００７６】
撹拌乳化については二液以上の流体を混合するために用いられる方法・装置を用いることができる。たとえば攪拌装置にはいろいろな形状の物が存在する。単に棒・板・プロペラ状の攪拌子を槽内で一定速度・一方向に回転させるものが多いが、攪拌子を間欠回転させたり逆回転させる場合もある。特殊な状況では複数の攪拌子を並べ交互に逆回転させたり、槽側に攪拌子と組合された突起あるいは板を取り付けて攪拌子が発生するせん断応力を増強させるなどの様々な工夫がなされる。攪拌子への動力伝達方法も様々であり、回転軸を介して攪拌子を回転させるものが殆どであるが、磁石を封入しテフロン（登録商標）等でコーティングした攪拌子を容器の外部から回転する磁界で動力を伝達するマグネチックスターラーも存在する。
【００７７】
本発明では、上記一次乳化工程（１）により得られたＷ１／Ｏエマルションと、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水性溶媒（Ｗ２）とを混合乳化する際に、下記式（ｅ１）の条件を満たす撹拌乳化により実施することが好ましい。
【００７８】
0.02385 <ｒ×ｎ／Ｌ' < 0.1431 （ｅ１）
上記式（ｅ１）において、ｒは攪拌子の半径［ｍ］，Ｌ'はＷ１／Ｏエマルションの粒径［ｎｍ］，ｎは攪拌子の毎分回転数［rpm］を表す。
【００７９】
ここで、上記式（ｅ１）は、流体の移動に伴う運動量を表したニュートン則のひとつである、
τ (せん断力) ＝ μ (粘度) x ｖ(速度)/ Ｌ (長さ) （ｅ２）
および以下に示すいくつかの仮説に基づいて考案し、実験により確からしさを検証したものである。
【００８０】
先に示した通り二次乳化工程（２）における混合乳化は、撹拌によるせん断現象によっても進行するし、マイクロチャネルにおけるちぎれ現象によって進行する。このちぎれ現象は流体の表面張力という力が働いて起こる現象ととらえられ、その力の大きさはたとえばSugiura, Langmuir 2001,5562によって測定されている。すなわち、マイクロチャネルにおけるオリーブ油液滴形成の実測表面張力が4.5 mN/mであった。ところで、流体力学の基礎方程式(オイラー方程式)のさまざまな展開が研究者によって進められ、流体に働く力の近似式がすでに提示されている。慣性力、重力、粘性力、界面張力などが流体に働く力として知られており、界面張力は次の式で近似される。
【００８１】
表面張力＝界面張力（単位長さあたりの表面張力）× 系の代表長さ= ρ x L
液滴が直径17.8μｍで生成していることからSugiuraらの系での界面張力は、2.5×102 [Pa]と算出される。
【００８２】
4.5 x 10-3 [N/m] /17.8 x 10-6 [m] ＝ 2.5×102 [Pa]
流体に働く力として界面張力が支配的なマイクロチャネルの乳化条件と、せん断力が支配的な撹拌の乳化条件を同列の扱うことには無理があり、次の仮説を数学的に検証することは困難ではあるが、最終的には実験的な検証から式（ｅ１）の妥当性が判明した。その仮説とは、この界面張力を同等の力を、攪拌におけるせん断力として与えることにより同様のちぎれ現象が起こるとの仮定である。すなわち、せん断力をτ＝2.5×102 [Pa]と仮定し、粘度μについて、水とヘキサンの中間の値としてμ＝0.0005（＝0.5×10-3） [PaS]と仮定し、ＬがＷ１／Ｏエマルション粒径の10倍であると仮定すると、上記式（ｅ２）は、攪拌子の半径ｒ［ｍ］，Ｗ１／Ｏエマルションの粒径Ｌ'［ｎｍ］，攪拌子の毎分回転数ｎ［rpm］を用いて、
2.5×102 ＝ 0.0005×（2π×ｒ×ｎ／60）／（10×Ｌ'×10?9） （ｅ２’）
と表すことができる。ここで、ＬをＷ１／Ｏエマルションの10倍と仮定したのは、Ｗ１／Ｏエマルション粒径の10倍程度の粒径を有する粒子をせん断する力であれば、Ｗ１／Ｏエマルションはせん断されないと推定したからである。
【００８３】
上記（ｅ２’）をさらに変換すると、
ｒ×ｎ／Ｌ' ＝ （2.5×102）×（10×10?9）／（0.0005×２π）×60 ≒ 0.0478
と算出される。
【００８４】
ここで、界面張力と同程度という仮定を、界面張力の0.5倍から３倍程度としますと、これに対応してｒ×ｎ／Ｌ'もまた、0.0478の0.5倍から３倍程度となり、
0.0478×0.5 <ｒ×ｎ／Ｌ' < 0.0478×３
すなわち、
0.02385 <ｒ×ｎ／Ｌ' < 0.1431 （ｅ１）
と導き出される。
【００８５】
本発明においては、上記攪拌子の毎分回転数ｎが１００〜１００００であると、攪拌操作の取り扱いの面から好ましい。
さらに、小型観賞用水槽のエアレーション装置や工業用スプレードライ装置等、粘度の低い流体では攪拌子を使わずに、槽の流体や外気を槽外に設置したポンプで加圧して槽内にいきよい良く吹き込むことで槽内を攪拌する装置も存在する。また、ミルと呼ばれる粉砕機としてハンマーミル、ピンミル、オングミル、コボルミル、アスペックミル、ボールミル、ジェットミル、ロールミル、コロイドミル、ディスパーミルなどがあるが、これらは、圧縮力・圧搾力・膨張力・せん断力・衝撃力・キャビテーション力などの機械的な力の作用により流体を混合するものである。したがって、本発明においては、攪拌子による攪拌の代わりに、これらの装置を用いて攪拌を行っても良い。さらに、こうした機械的な方法以外にも、電気的な撹拌方法を使用することもできる。
【００８６】
二次乳化工程におけるその他の条件、たとえば、Ｗ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）の体積比、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの平均粒径などは、公知のリポソームの製造方法（二次乳化工程）に準じて、最終的に調製するリポソームの用途などを考慮しながら適宜調節することができる。
【００８７】
また、二次乳化工程（２）においては、必要に応じて脂質成分（Ｆ２）が、水相液（Ｗ２）およびＷ１／Ｏエマルションのうちの少なくとも何れか一方に添加されていても良い。
【００８８】
さらに、二次乳化工程（２）では、水相液（Ｗ２）に乳化剤（Ｒ）を添加してもよい。本発明において必要に応じて水相液（Ｗ２）に添加される乳化剤（Ｒ）は、図１に示すように、分散剤として機能することができる。
【００８９】
本願で用いることのできる乳化剤（Ｒ）として、リポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤（ｒ）が挙げられる。界面化学の分野では多くの乳化剤が知られており、代表的には、タンパク質、多糖類、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤などが、水溶性乳化剤として乳化・分散プロセスに用いられている。
【００９０】
上記タンパク質としては、ゼラチン（コラーゲンを加熱により変性させた可溶性のタンパク質）、アルブミンやトリプシンなどが挙げられる。ゼラチンは通常、数千〜数百万の分子量分布を有するが、たとえば重量平均分子量が１,０００〜１００,０００であるものが好ましい。医療用ないし食品用として市販されているゼラチンを用いることができる。アルブミンには、卵アルブミン（分子量約４５,０００）、血清アルブミン（分子量約６６,０００…ウシ血清アルブミン）、乳アルブミン（分子量約１４,０００…α−ラクトアルブミン）などが含まれ、たとえば卵アルブミンである乾燥脱糖卵白が好ましい。
【００９１】
上記多糖類としては、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、ペクチン、キトサン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、グァーガム、マルトトリオース、アミロース、プルラン、ヘパリン、デキストリンなどが挙げられ、たとえば重量平均分子量が１,０００〜１００,０００のデキストランが好ましい。
【００９２】
上記イオン性界面活性剤としては、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。
上記非イオン性界面活性剤としては、オクチルグルコシド等のアルキルグリコシド、ポリアルキレンオキサイド系の化合物、たとえば「Tween 80」（東京化成工業株式会社，ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート，分子量1309.68）や「プルロニック F-68」（BASF、ポリオキシエチレン（160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600）の製品や、重量平均分子量が1000〜100000のポリエチレングリコール類などが挙げられる。ポリエチレングリコール(PEG)類は、製品として「ユニルーブ」（日油株式会社）、GL4-400NP、GL4-800NP（日油株式会社）、PEG200,000(和光純薬)、マクロゴール（三洋化成工業株式会社）などが挙げられる。
【００９３】
分子量は、小さすぎると脂質膜中に混入しやすくなってリポソームの形成を阻害するおそれがあり、逆に大きすぎるとＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの外水相中への分散や界面への配向の速度が遅れてリポソームの合一や多胞リポソームの形成につながるおそれがある。そのため、水溶性乳化剤の重量平均分子量は１，０００〜１００，０００の範囲内にあることが好ましい。また、この範囲の重量平均分子量であると、リポソームの薬剤の内包率が良い。
【００９４】
上記のようにして脂質成分（Ｆ２）および／または水溶性乳化剤（ｒ）を用いる場合の各種の条件、たとえば、それらの量や、水相液（Ｗ２）およびＷ１／Ｏエマルションとの混合態様（添加順序等）は特に限定されるものではなく、公知のリポソームの製造方法に準じて、適切なものとすればよい。たとえば脂質成分（Ｆ２）が主として水溶性脂質からなる場合、あらかじめそのような脂質成分（Ｆ２）および／または水溶性乳化剤（ｒ）をＷ２に添加しておき、それにＷ１／Ｏエマルションを添加して乳化処理を行うことができる。一方、脂質成分（Ｆ２）が主として脂溶性脂質からなる場合、あらかじめ（Ｗ１／Ｏエマルション調製後）そのような脂質成分（Ｆ２）をＷ１／Ｏエマルションの油相に添加しておき、それを、必要に応じて水溶性乳化剤（ｒ）が添加されている水相液（Ｗ２）に添加して乳化処理を行うことができる。
【００９５】
（３）溶媒除去工程
溶媒除去工程は、上記二次乳化工程（２）を経て得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから有機溶媒、具体的には揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）（以下、単に「有機溶媒（ｏ）」と称する場合がある。）を除去することによりリポソーム分散液を調製する工程である。これにより、脂質成分（Ｆ１）（および必要に応じて添加される（Ｆ２））からなる脂質膜を内水相の周囲に形成し、リポソームを得ることができる。有機溶媒の除去の進行につれて、リポソームを構成する脂質の水和が進み、多胞リポソームが解けて単胞のリポソーム状態にばらけるか、またはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの界面に近い位置から単胞のリポソームがちぎれて形成されるものと考えられる。
【００９６】
溶媒除去工程は、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを回収し、開放容器内に移し静置あるいは撹拌することで、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒（ｏ）を蒸発除去することによって好適に行うことができる。
【００９７】
上記のような方法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションからの溶媒除去は、定法に従い、必要に応じて加温、減圧、撹拌を用いながら行えばよい。
溶媒除去は、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを開放容器内に静置したままでも行うことができるが、撹拌すればより均一に溶媒除去が進み、気液界面が広がることで溶媒除去にかかる時間も短縮される。二次乳化工程（２）において撹拌乳化法によりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製した場合は、その後さらに撹拌を継続して溶媒を除去するといったように、二次乳化工程（２）と溶媒除去工程（３）とを連続的に行うことも可能である。
【００９８】
温度条件は、有機溶媒（ｏ）として用いる化合物の種類に応じて、突沸することなくそれを蒸発させることのできる範囲で調整すればよいが、０〜６０℃の範囲が好ましく、０〜２５℃がより好ましく、５〜１０℃が特に好ましい。
【００９９】
また、減圧条件は、有機溶媒（ｏ）の飽和蒸気圧〜大気圧の範囲内に設定されることが好ましく、有機溶媒（ｏ）の飽和蒸気圧の＋１％〜１０％の範囲内に設定されることがより好ましい。２種以上の揮発性の炭化水素系有機溶媒からなる混合溶媒を有機溶媒（ｏ）として用いる場合、より飽和蒸気圧の高い溶媒種に合わせた条件が好ましい。これらの除去条件は、溶媒が突沸しない範囲で組み合わせてもよく、例えば、熱に弱い薬剤を使用する際は、より低温側でかつ減圧条件で溶媒を溜去することが好ましい。
【０１００】
なお、上記のような製造方法により得られるリポソームには、製法の工程上、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルション由来の多胞リポソームがある程度の割合含まれることがあるが、これを減じるために、撹拌、減圧、またはそれらの組み合わせを行うことが効果的である。たとえば、溶媒の大半が抜ける時間より長く減圧および撹拌を行なうことにより、リポソームを構成する脂質の水和が進み、内包物の漏出を起こさないまま、多胞リポソームが解けて単胞のリポソーム状態にばらけることが可能である。また、本法で副生する、あるいは残存する多胞リポソームはその内部がＷ１／Ｏ由来の５０〜２００ｎｍ程度の水滴を多く含む構造であるので、Ｗ１／Ｏの粒子径よりもわずかに大きな孔径のフィルターを通過させることで、５０〜２００ｎｍ程度の単胞リポソームへ変換することも可能である。このような操作をしても残った多胞リポソームがある場合には、フィルターにより除去することもできる。
【０１０１】
（４）水相置換工程
水相置換工程は、上記溶媒除去工程（３）を経て得られたリポソーム分散液から水相液（Ｗ２）を除去し、水相液（Ｗ３）を添加して、リポソーム製剤を調製する工程である。この水相置換工程は、水相液（Ｗ２）に含まれることがある乳化剤（Ｒ）を除去することを主な目的としている。ただ、本発明では、この水相置換工程において、除去する水相液（Ｗ２）の量よりも、添加する水相液（Ｗ３）の量を少なくする場合がある。そのような場合、この水相置換工程は、実質的に濃縮工程としての性格をも有する。
【０１０２】
ここで、水相液（Ｗ２）の除去は、リポソームが破壊されない限り特に方法のいかんを問うものではないが、例えば、上記工程（３）を経て得られたリポソーム分散液を超遠心分離に付すあるいは限外濾過に付すことにより行うことができる。少量製造の場合には超遠心分離が、大量製造の場合には限外濾過が有効と考えられる。
【０１０３】
また、水相液（Ｗ３）は、上記「水相液（Ｗ１）・（Ｗ２）・（Ｗ３）」の項で上述したように、水性溶媒（ｗ１）と同一の、あるいは本発明の作用効果を阻害しない範囲で水性溶媒（ｗ１）とは異なる水性溶媒（ｗ３）からなる。ここで、水相液（Ｗ３）として用いられる水性溶媒（ｗ３）は、緩衝液としての組成などその他の条件において水性溶媒（ｗ１）と同一であればよく、水相液（Ｗ３）には内包対象薬剤（Ｄ）を溶解させる必要はない。
【０１０４】
水性溶媒（ｗ３）の添加量は、目的とするリポソーム含有製剤の薬剤濃度に応じて調整することができる。薬剤濃度を高めたい場合には、水性溶媒（ｗ３）の添加量を極力少なくすればよい。実質的には、内水相Ｗ１を含む微粒子リポソームが分散状態になるために必要最小限の水性溶媒（ｗ３）の添加が必要となり、その添加量はＷ１の量と等しいかそれ以上と考えられる。したがって、本工程で得られるリポソーム含有製剤の薬剤濃度は、内水相Ｗ１に含まれる薬剤濃度の半分あるいはそれ以下になると考えられる。
【０１０５】
この水相置換工程（４）を経て得られるリポソーム含有製剤は、内包対象薬剤（Ｄ）を内包するリポソームが水性溶媒（ｗ１）中に分散した形態をとる。実質的に全ての内包対象薬剤（Ｄ）はリポソームに内包された状態にある。
【０１０６】
以上の工程（１）〜（４）を含む本発明に係る単胞リポソームを製造する方法によれば、医療用のリポソーム製剤として好適に使用可能な体積平均粒径５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の単胞リポソームを得ることができる。ここで、本発明においては、水相置換工程（４）を得て得られるリポソーム含有製剤が、リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）に対する内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）が大きいものとすることができ、例えば、この重量比（Ｄ／Ｆ）が０．０５以上、好ましくは０．５以上のリポソーム含有製剤を調製することが可能である。
【０１０７】
（５）その他の工程
上記工程（１）〜（４）のほか、本発明において必要に応じて行われるその他の工程としては、たとえば分離工程、整粒工程や乾燥粉末化工程が挙げられる。
【０１０８】
分離工程は、乳化剤とリポソームとを分離し、リポソーム分散液中から乳化剤を除去するための工程であり、所要により、前記溶媒除去工程（３）の後水相置換工程（４）の前に行われる。たとえば、精密濾過膜（ＭＦ膜，孔径５０ｎｍ〜１０μｍ程度）または限外濾過膜（ＵＦ膜，孔径２〜２００ｎｍ程度）を用いれば、リポソームと自己による分子集合体（たとえば体積平均粒径１０ｎｍ以下）を形成した乳化剤とを効率よく分離することができる。なお、製品の用途に鑑みて、乳化剤とリポソームとを分離しなくとも問題がない場合には、この分離工程は設けなくともよい。
【０１０９】
整粒工程により、調製されたリポソームの粒径を所望の範囲に調整することができる。たとえば、孔径０．１〜０．４μｍのポリカーボネート膜またはセルロース膜をフィルターとして装着した静圧式押出し装置（日油リポソーム社製「エクストルーダー」、野村マイクロサイエンス社製「リポナイザー」など）を用いることにより、中心粒径が５０〜２００ｎｍ程度のリポソームが効率よく得られる。上記「エクストルーダー」等を用いれば、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる。
【０１１０】
また、リポソームの分散液を凍結乾燥などにより乾燥粉末化し、使用するまでの間の保管に適した形態にすることも望ましい。凍結乾燥は従来のリポソームを製造する場合と同様の手段や装置を用いて行うことができる。たとえば、間接加熱凍結方法、冷媒直膨方法、熱媒循環方法、三重熱交換方法、重複冷凍方法などに従い、適切な条件下（温度：−１２０〜−２０℃、圧力：１〜１５Pa、時間：１６〜２６時間など）で凍結乾燥を行えばよい。このようにして得られた凍結乾燥物を水中に投入すれば、再びリポソームの分散液を調製することができる。
【０１１１】
なお、本発明の好適な態様においては、上記工程（１）〜（５）に記載したすべての工程を５−１０℃で実施することができる。このような態様の下では、蛋白質など熱に弱い物質を内包対象薬剤（Ｄ）として用いたリポソームを製造することも可能となる。特に製造管理の厳しい医薬品グレードの製造では、内包する薬剤の劣化はわずかであっても問題視されるので、低温での製造は劣化防止の有効な対策になりえる。
【実施例】
【０１１２】
（Ｗ１／Ｏエマルションおよびリポソームの粒度分布の測定方法）
Ｗ１／Ｏエマルションはヘキサン／ジクロロメタン混合有機溶媒（体積比：１／１）で１０倍に希釈した後、一方リポソーム分散液はそのまま、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて粒度分布を測定した。その結果に基づき、Ｗ１／Ｏエマルションまたはリポソームの体積平均粒径を算出した。
【０１１３】
（内包率の算出）
各実施例および比較例において、W1に溶解している水溶性薬剤（シタラビン、ｓｉＲＮＡ）を以下のように定量した。すなわち、一次乳化工程で得られたＷ１／ＯエマルジョンにおいてＷ１に溶解している薬剤、二次乳化工程で得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルジョンにおいてＷ1に溶解している薬剤、および溶媒除去工程で得られたリポソームの内水相Ｗ1に溶解している薬剤は、超遠心装置を用いてＯ相と分離されたＷ１相、Ｗ２相と分離されたＷ１／Ｏエマルジョン、および外水相（上澄）と分離されたリポソーム（固形分）をそれぞれ分析してその量を決定した。
【０１１４】
水溶性薬剤（Ｄ）がシタラビンの場合にはＨＰＬＣ（カラム：VarianPolaris C18-A（3μm, 2x40mm））を用いて定量し、ｓｉＲＮＡの場合にはＨＰＬＣ（カラム：Develosil ODS-UG-5(6x150mm)）を用いて定量した。
【０１１５】
各粒子のＷ１相に存在している水溶性薬剤の量（ａ）および水溶性薬剤の仕込み量（ｂ）から、計算式a／ｂ×１００［％］により算出される値を、上記各水溶性薬剤の内包率とした。
【０１１６】
なお、以下の記載において、「水相液」および「油相液」を、それぞれ「水分散相」および「有機溶媒層」と呼ぶ場合がある。例えば、下記の記載にいう「水分散相（Ｗ１）」は、「水相液（Ｗ１）」に相当する。
【０１１７】
≪非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加する効果≫
以下の比較例１−１，１−２および１−３並びに実施例１−１および１−２により、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が添加された水相液を水相液（Ｗ２）として用いる効果について検討した。ここで、実施例１−２においては、非結晶性の脂質成分としてフィルム状脂質を用いている。
【０１１８】
［比較例１−１］
本比較例では、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いることなく、脂質成分（Ｆ１）を用いてリポソームの製造を行った。
【０１１９】
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ, 日油株式会社）０．３ｇ、コレステロール（Chol, 日油株式会社）０．１５２ｇおよびオレイン酸（OA）０．１０８ｇを含むヘキサン１５ｍＬを油相液（Ｏ）とし、シタラビン（０．４ｍＭ：分子量２４３．２２）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水相液（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径２０ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２５℃にて１５分間超音波を照射し（出力５．５）、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１６８ｎｍの単分散Ｗ１／Ｏエマルションであることが確認された。このＷ１／Ｏエマルションにおけるシタラビンの内包率は５５％であった。
【０１２０】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
続いて、半径１６ｍｍの攪拌子を用いたマグネチックスターラーにより、0.1％プルロニックを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）である水相液（Ｗ２）を強く撹拌しているところに（回転数１０００ｒｐｍ）、上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションの一部を供給し、Ｗ１／ＯとＷ２の容積比が１：３となる比率で混合撹拌してＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。その結果、微細で粒度分布が正規分布を示すリポソーム粒子の分散液が得られ、この粒子内にはシタラビンが含まれていることが確認された。このＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおけるシタラビンの内包率は４８％であった。
【０１２１】
（溶媒除去工程によるリポソームの製造）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間、攪拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。溶媒除去後のシタラビンの内包率は４６％であった。
【０１２２】
（水相置換工程によるリポソーム製剤の調製）
得られたリポソーム溶液を超遠心分離に付し、上澄みの水相液（Ｗ２）を除去しながら、水相液（Ｗ３）としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加して、水相液（Ｗ２）に含まれるシタラビンを排除した。最終的に内水相用の水相液（Ｗ１）５ｍＬの倍の体積である、10 mLのリポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１６５ｎｍであった。
【０１２３】
この製剤中にシタラビンは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのシタラビンの４６％（０．４ｍＭ×５ｍＬ×２４３．２２×０．４６×１．００＝０．２２ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、０．２２［ｍｇ］／（３００＋１５２＋１０８）［ｍｇ］＝０．２２／５６０＝０．０００４である。
【０１２４】
超遠心分離時に、白い結晶が沈降していることが確認され、添加したが未溶解状態であったホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ, 日油株式会社）およびコレステロール（Chol）の結晶であることが確認された。
【０１２５】
［比較例１−２］
本比較例では、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いることなく、脂質成分（Ｆ１）および脂質成分（Ｆ２）を用いてリポソーム製剤の調製を行った。
【０１２６】
具体的には、上記ホスファチジルコリンおよび上記コレステロールの添加量をそれぞれ半量の０．１５ｇおよび０．０７５ｇとし、且つ、
外水相用の水相液（Ｗ２）として、上記ホスファチジルコリンおよび上記コレステロールの添加量をそれぞれ半量の０．１５ｇおよび０．０７５ｇをさらに添加したものを用いたことを除いて、上記比較例１−１で行った方法と同じ条件を用いて、一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造、溶媒除去工程によるリポソームの製造、および、水相置換工程によるリポソーム製剤の調製の各工程を行うことにより、リポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１６９ｎｍであった。
【０１２７】
ここで、シタラビンの内包率は、Ｗ１／Ｏエマルションにおいては５５％であり、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおいては４８％であり、溶媒除去後においては４５％であった。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１６０ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。超遠心分離後の製剤中にシタラビンは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのシタラビンの４５％（０．４ｍＭ×５ｍＬ×２４３．２２×０．４５×１．００＝０．２２ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、０．２２［ｍｇ］／（３００＋１５２＋１０８）［ｍｇ］＝０．２２／５６０＝０．０００４である。
【０１２８】
［実施例１−１］
本実施例では、脂質成分（Ｆ２）に代えて非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いるとともに、脂質成分（Ｆ１）も用いてリポソーム製剤の調製を行った。
【０１２９】
すなわち、上記ホスファチジルコリンおよび上記コレステロールの添加量をそれぞれ半量の０．１５ｇおよび０．０７５ｇとし、
外水相用の水相液（Ｗ２）として、特開平２−１６７２１８号公報記載の方法に従ってホスファチジルコリンおよびコレステロールがそれぞれ０．１５ｇおよび０．０７５ｇ含まれるように調製された多孔質状の脂質をさらに添加したものを用いたことを除いて、上記比較例１−１で行った方法と同じ条件を用いて、一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造、溶媒除去工程によるリポソームの製造、および、水相置換工程によるリポソーム製剤の調製の各工程を行うことにより、リポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１５４ｎｍであった。
【０１３０】
ここで、シタラビンの内包率は、Ｗ１／Ｏエマルションにおいては５５％であり、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおいては５５％であり、溶媒除去後においては５５％であった。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１６０ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。超遠心分離後の製剤中にシタラビンは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのシタラビンの５５％（０．４ｍＭ×５ｍＬ×２４３．２２×０．５５×１．００＝０．２６ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、０．２６［ｍｇ］／（（１５０＋７５＋１０８）＋（１５０＋７５））［ｍｇ］＝０．２２／５５８＝０．０００４である。
【０１３１】
超遠心分離時に、白い結晶の沈降は認められなかった。
なお、実施例１−１および比較例１−１における二次乳化工程を撹拌乳化に代えてSPG膜乳化で実施した場合にも同様の結果が得られた。
【０１３２】
［実施例１−２］
本実施例では、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）として、多孔質状の脂質に代えてフィルム状脂質を用いてリポソームの製造を行った。ここで、本実施例では、シタラビンに代えてｓｉＲＮＡを内包対象薬剤として用いている。
【０１３３】
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ｓｉＲＮＡ（ランダム配列：分子量１３０００）１０ｍｇを等張ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ溶解させて内水相用の水相液（Ｗ１）とし、DPPC（ジパルミトイルホスファチジルコリン、「MC-6060」、日油株式会社）５０ｍｇ、およびDPPG（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、「COATSOME MG-6060LA」、日油株式会社）１０ｍｇを含むヘキサン１．２５ｍＬを油相液（Ｏ）とした。３．５ｍＬのサンプル瓶にこれらの混合液を入れ、φ７ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２０℃にて１５分間超音波を照射し乳化処理を行うことにより、Ｗ１／Ｏエマルションを得た。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１０２ｎｍの単分散Ｗ１／Ｏエマルションであることが確認された。このＷ１／ＯエマルションにおけるｓｉＲＮＡの内包率は６７％であった。
【０１３４】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
あらかじめDPPCおよびDPPGがそれぞれ25 mgおよび5 mg含まれるように調製しておいたフィルム状脂質および０．１％のプルロニックＦ６８を含む等張ＰＢＳ溶液を水相液（Ｗ２）として用いた。この水相液（Ｗ２）１５ｍＬ中に、上記一次乳化工程によって得られたＷ１／Ｏエマルションを供給しながら、半径１６ｍｍ（すなわち、０．０１６ｍ）の攪拌子を用いて回転数１０００ｒｐｍで１５分間撹拌して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。このＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおけるｓｉＲＮＡの内包率は６７％であった。
【０１３５】
なお、フィルム状脂質は、DPPCおよびDPPGそれぞれ25 mgおよび5 mgをクロロフォルムに完全溶解してナスコルに入れ、エバポレーターでゆっくりとクロロフォルムを留去し、ナスコル壁面に配列した脂質膜を回収することで用意した。この回収方法は古典的リポソーム製造法であるバンガム法の一工程として知られている。
【０１３６】
（溶媒除去工程によるリポソームの製造）
得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、２０℃・５００ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間攪拌し、次いで２０℃・１８０ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間撹拌し、段階的に溶媒を揮発させた。得られたリポソーム分散液は半透明の黄色であり、この粒子内にはｓｉＲＮＡが含まれていることが確認された。リポソームのｓｉＲＮＡの内包率は66％であった。
【０１３７】
（水相置換工程によるリポソーム製剤の調製）
得られたリポソーム溶液を超遠心分離に付し、上澄みの水相液（Ｗ２）を除去しながら、水相液（Ｗ３）として等張ＰＢＳ溶液を添加した。最終的に内水相用の水相液（Ｗ１）０．２５ｍＬの４倍の体積である、１．０mLのリポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１１０ｎｍであった。
【０１３８】
超遠心分離処理後の製剤中にｓｉＲＮＡは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのｓｉＲＮＡの６６％（１０ｍｇ×０．６６×１．００＝６．６ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、６．６［ｍｇ］／（（５０＋１０）＋（２５＋５））［ｍｇ］＝６．６／９０＝０．０７３である。
【０１３９】
［比較例１−３］
本比較例では、上記実施例１−２に対応する比較例として、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いることなく、脂質成分（Ｆ１）のみを脂質成分として用いてリポソームの製造を行った。
【０１４０】
すなわち、二次乳化工程においてフィルム状脂質を用いなかったことを除いては、実施例１−２と同じ方法と条件を用いて一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造、溶媒除去工程によるリポソームの製造、および、水相置換工程によるリポソーム製剤の調製の各工程を行うことにより、リポソーム製剤を調製した。すなわち、本比較例においては、得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、９５ｎｍであった。
【０１４１】
ここで、ｓｉＲＮＡの内包率は、Ｗ１／Ｏエマルションにおいては６７％であり、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおいては５９％であり、溶媒除去後においては５１％であった。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約９９ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。
【０１４２】
超遠心分離処理後の製剤中にｓｉＲＮＡは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのｓｉＲＮＡの５１％（１０ｍｇ×０．５１×１．００＝５．１ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、５．１［ｍｇ］／（５０＋１０）［ｍｇ］＝５．１／６０＝０．０８５である。
【０１４３】
［実施例１−１および１−２、並びに比較例１−１、１−２および１−３の結果からの考察］
以上の実施例１−１及び比較例１−１の結果から、添加したが未溶解状態であったホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ, 日油株式会社）およびコレステロール（Chol）は、膜形成に関与していないことが推測され、混合した脂質成分の比率どおりに膜構成脂質の比率が形成されていない可能性が高いことが示唆される。
【０１４４】
また、内包率については、Ｗ１／Ｏエマルションの内包率を比較した場合には、実施例１−１、比較例１−１及び比較例１−２のいずれの場合でも変化が認められなかった。一方、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションおよび溶媒除去後のリポソーム分散液を比較した場合には、比較例１−１及び比較例１−２では内包率が低下していたのに対して、実施例１−１では内包率が維持されていた。これは、二次乳化のプロセスで結晶状態の脂質が悪影響し、内包率が低下していることを意味している。内包率におけるこのような違いは、実施例１−２とこれに対応する比較例１−３との間にも同様に認められた。ここで注目すべきことは、実施例１−１と比較例１−２では、ともに水相液（Ｗ２）に脂質成分を添加している点で共通するにもかかわらず、溶媒除去後のリポソーム分散液における内包率に違いが生じていることである。このことは、本発明の製造方法において内包率が維持されるという効果は、単に水相液（Ｗ２）に脂質成分を添加したことによるものではなく、水相液（Ｗ２）に添加する脂質成分として非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いたことによることを示唆している。
【０１４５】
また、比較例１−１において、一次乳化の内水相用の水相液（Ｗ１）に多孔質状の脂質を添加し、外水相用の水相液（Ｗ２）に結晶状脂質を添加した場合には、内包率が低下し、超遠心分離時に、白い結晶の沈降が認められた。このことから、多孔質状の脂質は外水相用の水相液（Ｗ２）に加えることで効果があることが分かった。一次乳化でも結晶状態の脂質が速やかになくなるわけではないので、結晶状態の脂質が一次乳化のプロセスでも悪影響を起こすことは容易に想定できるが、そのような悪影響を窺わせるような現象は見られなかった。
【０１４６】
≪攪拌乳化における攪拌子の半径と回転数による効果≫
上記実施例１−１及び、下記に示す実施例２から４−２および比較例２−１から３−２により、攪拌乳化における攪拌子の半径と回転数による二次乳化への効果について検討した。
【０１４７】
［実施例２］
本実施例では、一次乳化の内水相用の水相液（Ｗ１）および外水相用の水相液（Ｗ２）のそれぞれに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加して、リポソーム製剤の調製を行った。
【０１４８】
具体的には、一次乳化の内水相用の水相液（Ｗ１）に添加する脂質を上記多孔質状の脂質に変更するするとともに、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造の際に、半径３ｍｍ（すなわち、０．００３ｍ）の攪拌子を用いて回転数１０００ｒｐｍで攪拌を行ったことを除いて、実施例１−１と同じ条件でリポソーム製剤を調製した。
【０１４９】
溶媒除去後のシタラビンの内包率は４４％であり、溶媒除去後の粒度分布は正規分布であることが確認された。また、一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約６９ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。このＷ１／Ｏエマルションの体積平均粒径は、外水相用の水相液（Ｗ２）にのみ非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した上記実施例１−１で得られたＷ１／Ｏエマルションの体積平均粒径（約１６８ｎｍ）と比べて小さい。
【０１５０】
非結晶性脂質を一次乳化の内水相用の水相液（Ｗ１）のみに添加した場合に、内包率が低下するというデメリットについては上記考察で述べたとおりである。しかしながら、その場合でもＷ１／Ｏエマルションの体積平均粒径が小さくできるのに伴い、最終的に得られるリポソームの体積平均粒径を小さくすることができた。非結晶性脂質を一次乳化の内水相用の水相液（Ｗ１）に添加した場合に、体積平均粒径が小さくできる効果は、Ｗ１／Ｏエマルションの生成速度が速くなってエネルギーが効率的に使用された結果であり、それは脂質分子の炭化水素系有機溶媒中での分散性・溶解性が高いことに由来すると考えられる。
【０１５１】
［実施例３−１〜３−２，比較例３−１〜３−２］
実施例３−１〜３−２，および比較例３−１〜３−２については、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造において、攪拌子の半径および攪拌時の回転数を表１に示す値としたこと、および、製造容器を相似形として適宜製造スケールを上下させたことを除き、上記実施例１−１と同様の反応条件でリポソーム製剤を調製した。
【０１５２】
［実施例４−１〜４−２，比較例２−１〜２−２］
実施例４−１〜４−２，および比較例２−１〜２−２については、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造において、攪拌子の半径および攪拌時の回転数を表１に示す値としたこと、および、製造容器を相似形として適宜製造スケールを上下させたことを除き、上記実施例２と同様の反応条件でリポソーム製剤を調製した。
【０１５３】
また、実施例３−１、４−２における１５分間超音波照射（出力５．５）による一次乳化について、超音波を１５分間連続して照射する代わりに、１分間の照射と1分間の非照射とを交互に繰り返すパルス超音波を照射するように変更して実験したところ、溶媒除去後の内包率及び粒度分布は同等の結果が得られ、さらに粒度分布の幅はシャープになる傾向が見られた。
【０１５４】
【表１】
≪脂質成分（Ｆ）に対する内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）が０．５以上のリポソーム製剤の製造≫
以下の実施例５−１及び５−２として、脂質成分（Ｆ）に対する内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）が０．５以上のリポソーム製剤の製造を行った。ここで、実施例５−２は、水相液（Ｗ１）として、内包対象薬剤（Ｄ）を過飽和状態で溶解させたものを用いた場合に該当する。
【０１５５】
［実施例５−１］
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ｓｉＲＮＡ（ランダム配列）４０ｍｇを等張ＰＢＳ溶液０．１２５ｍＬ溶解させて内水相（Ｗ１）とし、DPPC（ジパルミトイルホスファチジルコリン、「MC-6060」、日油株式会社）２５ｍｇ、およびDPPG（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、「COATSOME MG-6060LA」、日油株式会社）５ｍｇを含むヘキサン１．２５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とした。３．５ｍＬのサンプル瓶にこれらの混合液を入れ、φ７ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２０℃にて１５分間超音波を照射し乳化処理を行うことにより、Ｗ１／Ｏエマルションを得た。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１３１ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。このＷ１／ＯエマルションにおけるｓｉＲＮＡの内包率は７１％であった。
【０１５６】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
あらかじめDPPCおよびDPPGがそれぞれ１2.5 mgおよび2.5 mg含まれるように調製しておいた多孔質脂質(日本精化社製)および０．１％のプルロニックＦ６８を含む等張ＰＢＳ溶液を水相液（Ｗ２）として用いた。この水相液（Ｗ２）１５ｍＬ中に、上記一次乳化工程によって得られたＷ１／Ｏエマルションを供給しながら、半径１６ｍｍ（すなわち、０．０１６ｍ）の攪拌子を用いて回転数１０００ｒｐｍで室温下１５分間撹拌して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。このＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおけるｓｉＲＮＡの内包率は７１％であった。
【０１５７】
（溶媒除去工程によるリポソームの製造）
得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、２０℃・５００ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間攪拌し、次いで２０℃・１８０ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間撹拌し、段階的に溶媒を揮発させた。得られたリポソーム分散液は半透明の黄色であり、この粒子内にはsiRNAが含まれていることが確認された。リポソームのｓｉＲＮＡの内包率は７０％であった。
【０１５８】
（水相置換工程によるリポソーム製剤の調製）
得られたリポソーム溶液を室温下超遠心分離に付し、上澄みの水相液（Ｗ２）を除去しながら、水相液（Ｗ３）として等張ＰＢＳ溶液を添加した。最終的に内水相用の水相液（Ｗ１）０．１２５ｍＬの４倍の体積である、1.0mLのリポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１３３ｎｍであった。
【０１５９】
超遠心分離処理後の製剤中にｓｉＲＮＡは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのｓｉＲＮＡの７０％（４０ｍｇ×０．７０×１．００＝２８ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、２８［ｍｇ］／（（２５＋５）＋（１２．５＋２．５））［ｍｇ］＝６．６／４５＝０．６２である。
【０１６０】
［実施例５−２］
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
シタラビン（１０００ｍM）の等張ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬを内水相（Ｗ１）とし、DPPC（ジパルミトイルホスファチジルコリン、「MC-6060」、日油株式会社）２５ｍｇ、コレステロール（Chol, 日油株式会社）７．３ｍｇおよびDSPE-PEG2000（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール、日油株式会社）１１ｍｇを含むヘキサン１．２５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とした。３．５ｍＬのサンプル瓶にこれらの混合液を入れ、φ７ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２０℃にて１５分間超音波を照射し乳化処理を行うことにより、Ｗ１／Ｏエマルションを得た。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１１２ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。このＷ１／Ｏエマルションにおけるシタラビンの内包率は５８％であった。
【０１６１】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
あらかじめDPPCおよびコレステロールがそれぞれ１２．５ｍｇおよび３．７ｍｇ含まれるように調製しておいた多孔質脂質および０．１％のプルロニックＦ６８を含む等張ＰＢＳ溶液を水相液（Ｗ２）として用いた。この水相液（Ｗ２）１５ｍＬ中に、上記一次乳化工程によって得られたＷ１／Ｏエマルションを供給しながら、半径１６ｍｍ（すなわち、０．０１６ｍ）の攪拌子を用いて回転数１０００ｒｐｍで１５分間撹拌して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。このＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおけるシタラビンの内包率は５８％であった。
【０１６２】
（溶媒除去工程によるリポソームの製造）
得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、２０℃・５００ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間攪拌し、次いで２０℃・１８０ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間撹拌し、段階的に溶媒を揮発させた。得られたリポソーム分散液は半透明の黄色であり、この粒子内にはシタラビンが含まれていることが確認された。リポソームのシタラビンの内包率は５５％であった。
【０１６３】
（水相置換工程によるリポソーム製剤の調製）
得られたリポソーム溶液を超遠心分離に付し、上澄みの水相液（Ｗ２）を除去しながら、水相液（Ｗ３）として等張ＰＢＳ溶液を添加した。最終的に内水相用の水相液（Ｗ１）０．２５ｍＬの４倍の体積である、1.0mLのリポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１０３ｎｍであった。
【０１６４】
超遠心分離処理後の製剤中にシタラビンは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのシタラビンの５５％（１０００ｍＭ×０．２５ｍＬ×２４３．２２×０．５５×１．００＝３３．４ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、３３．４［ｍｇ］／（（２５＋７．３＋１１）＋（１２．５＋３．７））［ｍｇ］＝３３．４／５９．５＝０．５６である。
【０１６５】
［実施例５−３］
一次乳化工程、二次乳化工程、溶媒除去工程および水相置換工程の全てを低温で行うことができるかどうかを確認するため、上記実施例５−１に示した製造方法を低温で実施した。
【０１６６】
具体的には、上記実施例５−１の一次乳化工程において、２０℃にて１５分間超音波を照射し乳化処理を５〜１０℃に変更して実施し、二次乳化工程において室温下１５分間撹拌する部分を５〜１０℃に変更して実施し、溶媒除去工程において２０℃の減圧条件下で攪拌する部分を５〜１０℃に変更して実施し、水相液（Ｗ２）の除去において室温下超遠心分離に付している部分を５〜１０℃に変更して実施した。すなわち、すべての工程を５〜１０℃で実施した。
その結果、上記実施例５−１と同等の結果を得ることができた。
【０１６７】
［実施例５−４］
プルロニックＦ６８以外の乳化剤を用いることができるかどうかを確認するため、上記実施例５−２の二次乳化工程においてプルロニックＦ６８(分子量９６００)を添加する代わりに、ゼラチン(新田ゼラチン、コラーゲンペプチド2000、分子量2000)を０．５％濃度で添加したことを除き、実施例５−２に示した通りの製造方法を実施した。
その結果、上記実施例５−２と同等の結果を得ることができた。
【０１６８】
［実施例５−５］
プルロニックＦ６８以外の乳化剤を用いることができるかどうかを確認するもう一つの実施例として、上記実施例５−２の二次乳化工程においてプルロニックＦ６８(分子量９６００)を添加する代わりに、デキストラン60000(和光純薬、分子量60000)を3％濃度で添加したことを除き、実施例５−２に示した通りの製造方法を実施した。
その結果、上記実施例５−２と同等の結果を得ることができた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、化粧品、食品などの分野で用いられるリポソームを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ、医薬、食品、化粧品、塗料等の技術分野において、マイクロカプセルや微粒子と呼ばれる複合型微粒子が幅広く利用されている。複合型微粒子は、その作製に乳化剤として脂質を用いた場合、脂質複合型微粒子と呼ばれている。
【０００３】
これらの微粒子のうち、リポソームは、単層または複数層の脂質二重膜からなる閉鎖小胞体であり、内水相および脂質二重膜内部にそれぞれ水溶性および疎水性の薬剤類を保持できることが知られている。また、リポソームの脂質二重膜は生体膜に類似しているため生体内での安全性が高いことなどから、たとえばＤＤＳ（ドラック・デリバリー・システム）用の医薬品などの、各種用途が注目され、研究開発が進められている。
【０００４】
特にＤＤＳが必要とされているのが遺伝子治療であり、２００１年から革新技術として大きく注目され続けているのがＲＮＡ干渉（Ribonucleic Acid Interference）である。ＲＮＡ干渉とは、遺伝子変異が起こったＲＮＡの一部分を鋳型ＲＮＡによってブロックすることにより、有害なタンパク質を作らせない方法である。ＲＮＡ干渉は遺伝子治療に応用することができ、遺伝子レベルにおいて病気を治療することができる。遺伝子治療を実現するには、まず鋳型ＲＮＡ [siRNA（Small Interfering RNA）]を細胞内に導入しなければならない。しかしながら、細胞には細胞膜が存在しているので、鋳型ＲＮＡを導入する際には細胞膜といったバリヤを乗り越えなければならない。ＤＮＡ（Deoxyribonucleic Acid）やＲＮＡ（Ribonucleic Acid）を利用した遺伝子治療法もＲＮＡ干渉と同様に遺伝子治療の機能を発現するために、まずＤＮＡやＲＮＡを細胞内に導入させなければならない。近年、レトロウイルス等のウイルスをベクターとして使用するあるいは安全性の高い脂質ベシクル（リポソーム）を使用することが有望との認識が広がっている。
【０００５】
ところで、複合型微粒子および脂質複合型微粒子は、その膜厚によりダブルエマルションとベシクルとに分類されている。
このうち、ダブルエマルションとして、Ｗ／Ｏ／ＷエマルションおよびＯ／Ｗ／Ｏエマルション等が挙げられる。たとえば水の中に均一に散らばっている小さい油滴の中に、さらに小さい水滴が均一に散らばっている状態、つまり水滴粒子を内部に閉じこめた油滴粒子が水中に分散している状態のものが、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション（Ｗａｔｅｒ−ｉｎ−Ｏｉｌ−ｉｎ−Ｗａｔｅｒ）である。一分子膜と一分子膜の間に油相が存在するために膜厚はその分厚いのが特徴である。ダブルエマルションの製造は、古典的な機械的乳化法あるいはＳＰＧ （Shirasu Porous Glass）膜乳化法を利用した「二段階乳化法」を用いるのが一般的である。さらに最近では、特許文献１に記載されているように、マイクロ流路に交互に流れる混合しない2種類の流体（ＷとＯ）を別の流体に押し出すことで、Ｗ／Ｏ／ＷエマルションあるいはＯ／Ｗ／Ｏエマルションを作成する方法が知られている。
【０００６】
ところで、Ｗ／Ｏ／Ｗの作成が容易に進行するのは、Ｏ相がオリーブ油やデカンといった沸点の高い油の場合であることが知られており、上記特許文献１においても実施例で示されているＯ相はデカンやヘキサデカンである。一方、水より沸点の低い有機溶媒をＯ相に用いる場合はＷ／Ｏ／Ｗの作成は容易ではなく、これは有機溶媒の表面張力が低いために粒子の球形を維持する力が足りないため、と解釈されている。
【０００７】
一方、ベシクルとは、両親媒性化合物の二分子膜がシェル（殻）状に並んで閉じられた球体物質であり、一分子膜と一分子膜の間になにも存在しないために膜厚は薄いのが特徴である。ここで、リポソームはベシクルに分類される脂質複合型微粒子であり、上記Ｗ／Ｏ／ＷエマルションからＯ相を除去した構造体にあたる。したがって、もし、水より沸点の低い有機溶媒をＯ相に用いるなら、このようなＯ相を除去するのは容易であり、目的のリポソームを得ることができるが、水より沸点の高い有機溶媒をＯ相に用いる場合はこれを除去するのは事実上困難である。「二段階乳化法」によりリポソームを作成するためには、Ｏ相として、除去が容易な沸点の低い有機溶媒を選択する必要があるのだが、その場合にはＷ／Ｏ／Ｗの作成に困難が伴い、他方、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを作成することが容易な沸点の高い有機溶媒を選択すると、Ｏ相の除去が困難であるためにリポソームへの変換が不可能になる、というジレンマに陥り達成困難な課題となっている。実際、リポソームの、内水相および脂質二重膜内部にそれぞれ水溶性および疎水性の薬剤類を保持する技術としては、疎水性の薬剤類を保持することは比較的容易に達成されて医薬品として上市された例があるのに対し、水溶性の薬剤類を保持することは困難であり先の遺伝子治療薬のリポソームも完成の域には達していない。
【０００８】
このようなジレンマを解消するリポソームの製造方法の一つとして、二段階の乳化工程によりＷ／Ｏ／Ｗエマルションを調製した後、その油相（Ｏ）を除去することによりリポソームを形成させる方法（マイクロカプセル化法ないし二段階乳化法と呼ばれる。）が知られている（非特許文献１）。しかしながら、内包する薬剤としてはカルセインと言う色素を例示しているのみであり、薬剤汎用性については十分とはいえない。
【０００９】
また、特許文献２には、二段階の乳化工程によりＷ／Ｏ／Ｗエマルションを調製する方法として、ベシクル脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤の外水相液を用いてマイクロチャネル乳化法により二次乳化を行う方法が開示されており、これに関連して、乳化剤やマイクロチャネルについて検討を行った研究も種々なされてきている。
【００１０】
ここで、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを調製するにあたり、油相（Ｏ）として非揮発性のオリーブオイルなどを用いた作成例・応用例は多く、広く一般的に知られている。また、油相（Ｏ）として揮発性の有機溶媒を用いてＷ／Ｏ／Ｗエマルションを得る場合についても、二次乳化をマイクロチャンネルを用いて行った場合には、内水相への薬剤・化合物の封じ込めを達成できており、このことは本発明者らにより先に出願され、国際公開された特許文献３に記載されている。しかし、二次乳化を攪拌乳化によって行うことにより、同様の内水相への薬剤・化合物の封じ込めを実現することは依然として困難である。したがって、油相（Ｏ）として揮発性の有機溶媒を用いる二段階乳化法について、さらなる開発が求められている。
【００１１】
ところで、二段階乳化法を用いてＷ／Ｏ／Ｗエマルションを得る場合、公知の二段階乳化では、結晶状態の脂質を完全に有機溶媒に溶解して一次乳化を実施している。ところが、ヘキサンなどの炭化水素系有機溶媒（Ｏ）に対しては、結晶状態の脂質を完全に溶解しないため、脂質が充分に分散しない不均一な状態で二段階乳化を実施せざるを得ず、得られるリポソームにおいて薬剤の内包率が向上しない等良好な結果が得られないという問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００６−２７２１９６号公報
【特許文献２】特開２００９−２８０５２５号公報
【特許文献３】国際公開２０１０／１１０１１６号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ishii et al., J. Dispers. Sci. Technol.. vol.9, No.1, pp.1-15, 1988.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者は、ヘキサン溶媒（ｏ）に対しては、結晶状態の脂質よりも非結晶性の脂質の方が分散性がよく、完全に溶解するに到らないまでも、二段階乳化をスムーズに進行させることができるとの知見を得、本発明を行うに到った。
【００１５】
そこで、本発明は、油相（Ｏ）として揮発性の炭化水素系有機溶媒を用いて二段階乳化法を行う場合においても、薬剤の内包率が高く、サイズか小さく、かつ粒度分布がシャープな単胞リポソームを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、二段階乳化法によりリポソームを製造する際に、二次乳化工程の外水相に非結晶性の脂質成分を添加することにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［９］に係る単胞リポソームを製造する方法を提供する。
［１］下記工程（１）〜（４）を含む、体積平均粒径５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の単胞リポソームを製造する方法
（１）脂質成分（Ｆ１）を揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に溶解または分散した油相液（Ｏ）と、内包対象薬剤（Ｄ）を水性溶媒（ｗ１）に溶解して得られる水相液（Ｗ１）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程；
（２）前記工程（１）を経て得られたＷ１／Ｏエマルションと、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程；
（３）前記工程（２）を経て得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから前記揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）を除去することによりリポソーム分散液を調製する溶媒除去工程；
（４）前記工程（３）を経て得られたリポソーム分散液から水相液（Ｗ２）を除去し、当該除去した水相液（Ｗ２）よりも少量の水相液（Ｗ３）を添加して、リポソーム製剤を調製する水相置換工程。
【００１８】
［２］前記工程（１）において脂質成分（Ｆ１）の代わりに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いるか、あるいは、
前記工程（２）において前記混合乳化の前にＷ１／Ｏエマルションに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加する、
前記［１］記載の方法。
【００１９】
［３］前記工程（２）における二次乳化を下記式（ｅ１）の条件を満たす撹拌乳化により実施する、前記［１］または［２］記載の方法：
0.02385 <ｒ×ｎ／Ｌ' < 0.1431 （ｅ１）
上記式（ｅ１）において、ｒは攪拌子の半径［ｍ］，Ｌ'はＷ１／Ｏエマルションの粒径［ｎｍ］，ｎは攪拌子の毎分回転数［rpm］を表す。
【００２０】
［４］前記工程（４）を経て得られるリポソーム含有製剤が、リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）に対する該内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）が0.05以上であるものである、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
【００２１】
［５］前記リポソーム含有製剤における前記重量比（Ｄ／Ｆ）が0.5以上である前記［４］記載の方法。
【００２２】
［６］前記工程（１）において、水性溶媒（ｗ１）に上記内包対象薬剤（Ｄ）が過飽和状態で溶解した水相液（Ｗ１）を用いる、前記［４］および［５］のいずれかに記載の方法。
【００２３】
［７］前記工程（２）において、乳化剤（Ｒ）が溶解した水相液（Ｗ２）を用いる、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
【００２４】
［８］前記工程（１）〜（４）のすべての工程を５〜１０℃の範囲の温度で実施する、前記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
【００２５】
［９］前記工程（１）における混合乳化をパルス超音波で実施する、前記［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る単胞リポソームを製造する方法によれば、薬剤の内包率が高く、サイズか小さく、かつ粒度分布がシャープな単胞リポソームを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】二段階乳化法によるリポソーム生成および、本発明における脂質とエマルションとの関係を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
〔製造原料〕
脂質成分（Ｆ１）・（Ｆ２）
一次乳化工程で有機溶媒（ｏ）に溶解する脂質成分（Ｆ１）は主としてリポソームの脂質二重膜の内膜を構成し、場合によっては外膜の構成にも寄与する。一方、必要に応じて二次乳化工程で添加する脂質成分（Ｆ２）は主としてリポソームの外膜を構成する。脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）は、同一の組成であっても、異なる組成であってもよい。
【００２９】
これらの脂質成分の配合組成は特に限定されるものではなく、公知のリポソームの配合組成に準じたものとすることができる。一般的には、リン脂質（動植物由来のレシチン；ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸またはそれらの脂肪酸エステルであるグリセロリン脂質；スフィンゴリン脂質；これらの誘導体等）と、脂質膜の安定化に寄与するステロール類（コレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、これらの誘導体等）とを中心に構成され、さらに糖脂質、グリコール、脂肪族アミン、長鎖脂肪酸（オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸等）、その他各種の機能性を賦与する化合物が配合されていてもよい。また、脂質成分（Ｆ２）には、たとえばＰＥＧ化リン脂質のような、リポソーム表面を修飾して各種の機能性を賦与するための脂質を配合することも可能である。これらの化合物の脂質成分中の配合比も、脂質膜の安定性やリポソームの生体内での挙動などの性状を考慮しながら、用途に応じて適切に調整すればよい。
【００３０】
本発明においては、このような脂質成分（Ｆ１）、（Ｆ２）ともに、単一の脂質からなるものであってもよいし、複数の脂質からなるもの（混合脂質成分）であってもよい。
非結晶性の脂質成分（ＦＮ）
本発明においては、二段階乳化を円滑に進めるために、二次乳化工程において非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が用いられる。
【００３１】
図１上部に示すように、リン脂質などの脂質成分は、Ｗ１／Ｏエマルション及びＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおいて水相と油相との界面に配列しており、油相を構成する有機溶媒の除去により内包対象薬剤（図１では「薬剤」と記載。）を内包するリポソームの膜を構成する。ここで、油相がヘキサンなどの揮発性の炭化水素系有機溶媒である場合、図１下部に示すように、一部の脂質成分がＷ１／Ｏエマルション及びＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの形成に用いられずに残ることがある。これを解決する第1の策は脂質成分を溶かしやすい溶媒たとえばクロル系溶媒を用いることである。しかしながら、多くの水溶性薬剤類はクロル系溶媒に一部分が溶けこむ傾向にあり、炭化水素系有機溶媒には溶けにくいという性質を有するため、内水相における水溶性薬剤類の存在比を高めて、内包率の高いリポソーム製造を実現するためには炭化水素系有機溶媒を選択する方が汎用性の高い製造法の実現に近付ける。また、医薬品は安全性を重んじるため、クロル系溶媒を避けられればより高い安全性が確保できる。そこで、炭化水素系有機溶媒を用いる点はそのままにして、課題を解決する必要があった。
【００３２】
上記脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）として用いられる脂質成分は、通常は、容易に入手できる結晶状脂質であるであることから、このような脂質成分がＷ１／Ｏエマルション及びＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの形成に用いられるためには、(i) 結晶状態の脂質から脂質分子が分離し、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に溶解または分散するプロセスと、(ii) 前記(i) で生じた有機溶媒性混合液と水相との接触により、有機溶媒性混合液に存在している脂質分子が水／油界面に再配列して、Ｗ１／ＯエマルションまたはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの膜を形成するプロセスとを経る必要がある。ところが、脂質成分は概して揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）との親和性が充分高くない上、結晶状態の脂質から脂質分子が分離するには、結晶内の脂質分子間に働く水素結合、分子間力その他の比較的強い相互作用に打ち克つ必要があり、さらに揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）との接触面積も小さいため、結晶状態からの脂質分子の再配列には時間がかかる傾向にある。したがって、結晶状態の脂質成分を用いた場合、Ｗ１／ＯエマルションまたはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの生成が円滑には進みにくい傾向がある。このことは、脂質成分の多くが、Ｗ１／ＯエマルションまたはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの生成に用いられずに残ることを意味する。
【００３３】
一方、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）では、結晶状態の脂質成分の場合ほど脂質分子が相互に強固に結合していないことから、固体状態の脂質から脂質分子が分離しやすく、脂質分子の再配列がより有利に行われる傾向にある。特に多孔質構造の脂質成分（ＦＮ）の場合、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）や水との接触面積が大きくなることから、この点でも、固体状態の脂質から脂質分子が分離する上で有利となる。したがって、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いると、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの形成が円滑に行われることになり、その結果、リポソームの形で内包しようとする物質の内包率も向上することになる。特に、図１下部のように、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が外水相に含まれていると（すなわち、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）を用いる場合には）、二次乳化に際して水相と油相との界面に脂質分子が速やかに再配列し、リポソームを好適に生成することができる。
【００３４】
本発明で用いられる非結晶性の脂質成分（ＦＮ）として、例えば、ラメラ構造の脂質成分が挙げられる。ここで、「ラメラ構造」とは、液体と固体の中間にある物質を示す液晶状態の中の一つとして知られており、水・脂質・水・脂質・・・のように水相と脂質相とが交互に繰り返してなる層状構造をいう。リン脂質などの両親媒性化合物は一つの分子内に水相と脂質相とが共存するため、こうした化合物が一列に並ぶことでこのような層状構造をとることで安定状態に落ち着いている。リン脂質の層状構造は、バンガム法による古典的なリポソーム製造法のプロセスの一部で得ることができ、脂質フィルム層構造がその例である。細密充填により結晶格子を形成して安定状態に落ち着いている結晶性の脂質と比較して、層状構造は弱い相互作用で繰り返し配列しただけの状態なので、溶媒分子などの外部要因で容易にその配列を解列し、また再配列することができることが特徴である。
【００３５】
ここで、そのような「ラメラ構造」の脂質の一形態として、フィルム状脂質も挙げられる。フィルム状脂質は、例えば、結晶状脂質をクロロフォルムに完全溶解してナスフラスコ（「ナスコル」とも呼ばれる。）に入れ、エバポレーターでゆっくりとクロロフォルムを留去し、ナスフラスコ壁面に配列した脂質膜を回収することで用意できることが知られている。このような回収方法は、古典的リポソーム製造法であるバンガム法の一工程として知られている。
【００３６】
その他、本発明では、「非結晶性の脂質成分（ＦＮ）」が、ラメラ構造を有していない通常の多孔質構造を有していてもよい。
このような非結晶性の脂質成分（ＦＮ）の配合組成としては、非結晶性の成分を用いることを除いては、いずれも上記脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）の場合と同様の配合組成を適用することができる。例えば、特公平６−７４２０５号公報に記載されている方法により得られる混合脂質を用いることができる。したがって、本発明においては、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が、単一の脂質からなるものであってもよいし、複数の脂質からなるもの（混合脂質成分）であってもよい。
【００３７】
なお、本明細書において、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）、並びに上述した脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）を包含する、リポソームを構成する脂質成分全体を指す概念として、「リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）」という語を用いる場合がある。
【００３８】
水相液（Ｗ１）・（Ｗ２）・（Ｗ３）
一次乳化工程（１）で用いられる水相液（Ｗ１）はＷ１／Ｏエマルションの水相を構成し、二次乳化工程（２）で用いられる水相液（Ｗ２）はＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの外水相を構成し、水相置換工程で用いられる水相液（Ｗ３）は、最終的なリポソーム含有製剤（リポソーム分散液）の外水相を構成する。
【００３９】
水相液（Ｗ１）は、公知のリポソームの製造方法（特に二段階乳化法）と同様、水、または水にｐＨ調整のための酸および塩を添加して得られる緩衝液に、内包対象薬剤（Ｄ）および脂質成分（Ｆ１）を溶解することにより調製されるものであり。たとえば、ｐＨ調整のための酸および塩を純水に溶解して得られる緩衝液が一般的に用いられ、必要に応じて、水と相溶する他の溶媒、浸透圧調整のための塩類・糖類などをさらに溶解させてもよい。本明細書において、水相液（Ｗ１）から内包対象薬剤（Ｄ）を除く、水または緩衝液、あるいは、内包対象薬剤（Ｄ）以外の成分が溶解した水溶液等を、水性溶媒（ｗ１）と称することがある。
【００４０】
水相液（Ｗ２）は、公知のリポソームの製造方法（特に二段階乳化法）と同様、一般的には水または上記のような緩衝液であり、必要に応じて上記のような成分や、その他の機能性成分（本発明ではたとえば乳化剤（Ｒ））をさらに溶解させてもよい。本明細書において、水相液（Ｗ２）から乳化剤（Ｒ）を除く、水または緩衝液、あるいは、乳化剤（Ｒ）以外の成分が溶解した水溶液等を、水性溶媒（ｗ２）と称することがある。
【００４１】
また、水相液（Ｗ３）としては、リポソームの安定性などの観点から、水相液（Ｗ１）を構成する水性溶媒（ｗ１）と同じ浸透圧を有する水性溶媒、典型的には水性溶媒（ｗ１）と同一の水性溶媒が用いることが好適であるが、本発明の作用効果を阻害しない範囲で、水性溶媒（ｗ１）と異なる水性溶媒を用いることも可能である。本明細書においては、このような水性溶媒を「水性溶媒（ｗ３）」と称することがある。このように、水相液（Ｗ３）は、水性溶媒（ｗ１）と同一の、あるいは本発明の作用効果を阻害しない範囲で水性溶媒（ｗ１）とは異なる水性溶媒（ｗ３）からなるものである。ここで、水相置換工程（４）において水相液（Ｗ３）として用いられる水性溶媒（ｗ３）は、緩衝液としての組成などその他の条件において水性溶媒（ｗ１）と同一であればよく、水相液（Ｗ３）には内包対象薬剤（Ｄ）を溶解させる必要はない。
【００４２】
油相液（Ｏ）
二次乳化工程で用いられる油相液（Ｏ）はＷ１／Ｏエマルションの油相を構成する。本発明において、この油相液（Ｏ）を構成する溶媒として、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）が用いられる。ここで、油相液（Ｏ）は、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）のみからなるものでもよいし、必要に応じて揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に脂質成分（ｆ２）等を溶解することにより調製されたものでもよい。
【００４３】
本発明において、油相液（Ｏ）を構成する有機溶媒として揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）を用いるのは、これらが水と混和しにくい有機溶媒であり、且つＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションからリポソームを製造する工程において除去が容易であるからである。なお、本発明において、「揮発性」とは水よりも沸点が低いことをいい、具体的には、大気圧において１００℃未満の沸点を有することをいう。
【００４４】
ただ、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）の沸点が低いと、後述する「溶媒除去工程」において水相液（Ｗ１）および（Ｗ２）が凍結し、後述する内包対象薬剤（Ｄ）が変性する場合がある。この観点からは、揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）の沸点が４℃以上であることが好ましい。したがって、本発明で用いられる揮発性の炭化水素系有機溶媒（Ｏ）は、４℃以上１００℃未満の沸点を有していることが好ましい。特に、本発明においては、リポソームの安定性（膜透過性の高い薬剤の内包率向上）を考慮すると、溶媒除去工程（３）も含めた、リポソーム含有製剤の製造方法におけるすべての工程を５〜１０℃で行うことが好ましいので、その場合揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）としては、必要に応じて減圧や撹拌を用いることにより５〜１０℃で揮発するものが好ましい。ここで、膜透過性とは、薬剤類分子がリポソームの脂質二分子膜を通過しやすいかどうかという指標である。薬剤類の分子構造によってはその脂溶性構造部位の影響で脂質二分子膜内部に局在する脂溶性の脂肪鎖構造部分を通過しやすくなるため、高水溶性薬剤であってもまったく脂肪鎖構造部分を通過できないというわけではない。この指標はたとえば、リポソーム含有製剤をある温度で静置して、一度内包した薬剤類が経時的に外水相に移行しているかどうかを、内水相と外水相の薬剤濃度を測定して知ることができる。たとえば、膜透過性の高い薬剤として、抗がん剤のシタラビンをあげられる。また、脂肪鎖構造部分を通過しやすいかどうかは、化合物の構造による影響も重要なファクターであるが、一般的に温度上昇によって脂質分子の運動エネルギーが上昇し、このエネルギーが脂肪鎖構造部分同士の疎水性相互作用に拮抗して構造強度が弱まってわずかな隙間が生じることから、多くの薬剤は温度上昇によって膜透過性が増すことも周知の事実である。
【００４５】
揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）としては、たとえばヘキサン（ｎ−ヘキサン：沸点６９℃）、シクロヘキサン（沸点８０．７℃）、ペンタン（沸点３６℃）などが挙げられる。これらの溶媒は、いずれか１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４６】
内包対象薬剤（Ｄ）
本発明における、リポソームに内包させる物質（「内包対象薬剤」と称する。）は特に限定されるものではなく、リポソームの用途に応じて医薬品、化粧品、食品などの分野で知られている各種の物質を用いることができる。本発明においては、内包対象薬剤（Ｄ）として、水溶性の物質（「水溶性薬剤類」と称する。）」が好適に用いられる。ここで、本発明で用いられる上記各種脂質成分が水溶性を有する場合もありうるが、本明細書にいう「水溶性薬剤類」には、そのような各種脂質成分は包含されない。
【００４７】
水溶性薬剤類のうち、医療用のリポソームなどに用いられるものとしては、たとえば、造影剤（Ｘ線造影用の非イオン性ヨード化合物、ＭＲＩ造影用のガドリニウムとキレート化剤とからなる錯体等）、抗がん剤（アドリアマイシン、ビラルビシン、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、マイトマイシン、５−フルオロウラシル、イリノテカン、エストラサイト、エピルビシン、カルボプラチン、イントロン、ジェムザール、メソトレキセート、シタラビンアイソボリン、テガフール、シスプラチン、エトポシド、トポテシン、ビラルビシン、ネダプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド、テスパミン、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバチン、エノシタビン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、ダウノマイシン、アクラルビシン、イビルビシン、アムルビシン、アクチノマイシン、タキソテール、トラスツブマブ、リツキシマブ、ゲムツズマブ、レンチナン、シゾフィラン、インターフェロン、インターロイキン、アスパラギナーゼ、ホスフェストロール、ブスルファン、ボルテゾミブ、アリムタ、ベバシズマブ、ネララビン、セツキシマブ等）、抗菌剤（マクロライド系抗生物質、ケトライド系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、オキサセフェム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、ベータラクタマーゼ配合剤、アミノグリコシド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、カルバペネム系抗生物質、ペネム系抗生物質）、MRSA・VRE・PRSP感染症治療剤、ポリエン系抗真菌剤、ピリミジン系抗真菌剤、アゾール系抗真菌剤、キャンディン系抗真菌剤、ニューキノロン系合成抗菌剤、抗酸化性剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進性剤、保湿剤、ホルモン剤、ビタミン類、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、タンパク質（酵素、抗体、ペプチド等）、ワクチン製剤（破傷風などのトキソイドを抗原とするもの；ジフテリア、日本脳炎、ポリオ、風疹、おたふくかぜ、肝炎などのウイルスを抗原とするもの；DNAまたはRNAワクチン等）などの薬理的作用を有する物質や、色素・蛍光色素、キレート化剤、安定化剤、保存剤などの製薬助剤が挙げられる。
【００４８】
薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）
リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）に対する内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）は大きい方が好ましい、つまり、より少量の脂質成分（Ｆ）を用いてより多量の内包対象薬剤（Ｄ）をリポソームに内包させることが好ましい。
【００４９】
内包対象薬剤（Ｄ）の薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）（以下、「薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）」または単に「薬剤重量比」と称する場合がある。）は、次式により算出される：
薬剤重量比＝リポソームに内包されている内包対象薬剤（Ｄ）の質量／リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）の質量。
【００５０】
この薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、好ましくは０．０５以上、より好ましくは０．５以上に設定することができる。なお、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）の上限値は、リポソームの粒径（粒径が大きいほどリポソームを構成する脂質成分（Ｆ）の量は少なくなる）と、内包対象薬剤（Ｄ）の水に対する溶解度や内包率（これらが高いほどリポソームに内包される内包対象薬剤（Ｄ）の量は大きくなる）によって変動し、一概に設定できるものではない。
【００５１】
後述する水相置換工程（４）において上記のような薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）の条件を満たすリポソームを調製するためには、所望の重量比（Ｄ／Ｆ）の条件を満たす量の内包対象薬剤（Ｄ）および脂質成分（Ｆ）を用い、内包対象薬剤（Ｄ）については水性溶媒（ｗ１）に、脂質成分（Ｆ）のうち脂質成分（Ｆ１）については揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に、脂質成分（Ｆ）のうち非結晶性の脂質成分（ＦＮ）については水相液（Ｗ２）及び所要によりＷ１／Ｏエマルションに、脂質成分（Ｆ）のうち脂質成分（Ｆ２）については水相液（Ｗ２）及び／またはＷ１／Ｏエマルションに、それぞれ、溶解すればよい。
【００５２】
以下、内包対象薬剤（Ｄ）および脂質成分（Ｆ）の必要量の計算例（薬剤重量比を0.5〜5とする場合）を示す。
水溶性薬剤を内包させる目的は、水溶性薬剤を内水相としての水相液（Ｗ１）に溶解することによって達成される。したがって水溶性の高い薬剤類は、水相液（Ｗ１）に高濃度で溶解すれば、内包される絶対量は増やすことができる。一方、水相液（Ｗ１）の量は適宜変えることができ、所定の粒径の粒子(Ｗ１／Ｏ)を作成しようとすれば、それに必要な脂質の量(個数)は計算できる。たとえば、100 nm のＷ１／Ｏエマルション(粒子体積0.0005 μm3)を形成する場合、水相液（Ｗ１）(内水相) 1.0 mLで製造すれば2.0 x1015個のW1/O粒子が生成する計算である。一方、100 nm のＷ１／Ｏナノエマルション(粒子表面積2500 nm2)はリン脂質分子(レシチン表面積0.7 nm2) 0.4 x105個で構成されている、と計算される。したがって、薬液 1.0 mL の一次乳化に必要な脂質量は、2.0 x1015個ｘ0.4 x105個＝0.8 x1020個、すなわち0.132 mmolである。レシチン以外の脂質分子も、その表面積はおおよそ0.7 nm2として差し支えないため、脂質類の総量として0.132 mmolが100 nm のW1/Oナノエマルションを作成するのに必要最少量と考えられる。リポソームを作成するには、その倍の0.264 mmolが必要であり、代表的なリン脂質のDPPCで分子量換算すると193 mgが必要である。
【００５３】
そこで、薬剤を1.0 mLに溶解し、100 nmのリポソームを作成する場合を考えると、薬局法記載の通りシタラビンは0.1〜1.0 g溶解するので、薬剤重量比0.1 g/0.193 g〜1.0 g/0.193 g、イオヘキソール(造影剤)は1.0 g以上溶解するので、薬剤重量比1.0 g/0.193 g以上である。これは、脂質量を低減して効率的に薬剤を内包できることを意味し、脂質の投与量を減らすことができる点、臨床上有意義であり、本手法により薬剤重量比0.5〜5が達成できる。さらに、より多くの薬剤を溶解すると、一般的に飽和状態に近づき粘度が上昇する。本手法により、内水相の粘度として１０mPa・sまで内包可能である。
【００５４】
また、100 nmより大きい粒子を製造する場合には、脂質の必要量はそれより少なくて済むので、より効率的ということになる。
水溶性の高い薬剤類を内包対象薬剤（Ｄ）として高濃度で溶解した水相液（Ｗ１）を得る工夫は、薬剤が過飽和状態で溶解した水相液（Ｗ１）を用意することでも実現できる。この方法で、内包される薬剤の絶対量をさらに増やすことができる。アモルファス状態の薬剤を用意して溶解する、ナノ粒子状結晶薬剤を用意して溶解するあるいは溶解助剤を添加する、と言った方法で過飽和状態を実現できる。ただし、過飽和状態からの薬剤結晶の析出は容易に進行するので、過飽和状態での実験作業は数時間以内に限られるのが一般的である。しかしながら、析出のメカニズムの研究が進むにつれ、過飽和技術も進歩して工業化に耐えうるようになってきたので、長時間に及ぶ実験作業も現実味を帯びてきている。すなわち、析出のメカニズムとしては、溶液中で析出が起こるバルク析出機構（bulk precipitation mechanism: BPM)と固体表面で析出が起こる表面析出機構（surface precipitation mechanism: SPM)の2種類が提唱されており、内包対象薬剤（Ｄ）がどちらに属するかを判別して、適切な過飽和化を実現できるようになってきている。実際に、結晶化の刺激となる埃などの要因を排除すれば、実験作業は半日以上問題ないケースもある。
【００５５】
リポソームおよびその水性分散液
本発明のリポソーム、典型的には以下に説明するような本発明の製造方法により得られるリポソームは、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が添加されている水相液（Ｗ２）を外水相とするものであり、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が添加されていない水相液（Ｗ２）を外水相とするものに比べてＷ／Ｏ／Ｗエマルション形成をより円滑に進めることができる。
【００５６】
なお、本発明において、「単胞リポソーム」（ULV、単核リポソームと同義である）は、単一の内水相を有するリポソーム構造物を指し、体積平均粒径はナノメートルの範囲、通常は２０〜５００ｎｍ程度である。これに対して、「多胞リポソーム」（MVL: multivesicular liposomes）は、複数の非同心円状の内水相を包囲する脂質膜を含んでなるリポソーム構造物を指し、また「多重膜リポソーム」（MLV）は、複数の「タマネギの皮」のような同心円状の膜を有し、その間に殻様の同心円状の水系コンパートメントがあるリポソーム構造物を指す。多胞リポソームおよび多重膜リポソームの体積平均粒径はマイクロメートルの範囲、通常は０．５〜２５μｍ程度である。
【００５７】
本発明のリポソームは、典型的には以下に説明するような本発明の製造方法により、水相液（Ｗ２：外水相）中に懸濁した状態で得られる。このようなリポソームの水性分散液が各種の用途に供されるが、使用されるまでの間、たとえば凍結乾燥法などにより粉末状態のリポソームとして保存することもできる。使用の際には、粉末状態のリポソームを水性溶媒に添加し、再度懸濁させればよい。
【００５８】
本発明のリポソームのサイズは、体積平均粒子径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるので、毛細血管を閉塞するおそれがほとんどなく、またがん組織近辺の血管にできる間隙を通過することもできるため、医薬品等として人体に投与して使用する上で好都合である。
【００５９】
なお、本発明における、リポソームおよびエマルションの体積平均粒子径は、動的光散乱法により測定されるものであり、たとえば、リポソームの水性懸濁液をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて粒度分布や体積平均粒子径を算出することができる。
【００６０】
〔リポソームの製造方法〕
本発明のリポソームの製造方法は、少なくとも下記工程（１）〜（４）を含み、必要に応じてその他の工程をさらに含むことができるものである。そして、これらの工程を得ることで、平均粒径５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の単胞リポソームが得られるのである。
【００６１】
（１）一次乳化工程
一次乳化工程は、脂質成分（Ｆ１）を揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に溶解または分散した油相液（Ｏ）と、内包対象薬剤（Ｄ）を水性溶媒（ｗ１）に溶解して得られる水相液（Ｗ１）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏエマルションを調製する工程である。
【００６２】
この一次乳化工程において、脂質成分（Ｆ１）の代わりに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いることができる。この場合、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）は、水相液（Ｗ１）中に溶解または分散した形で用いることができる。水相液（Ｗ１）に非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が添加されていると、結晶状態の脂質成分を添加したときと比べて小さなリポソーム粒子を得ることができ、且つその粒度分布もシャープになるので好ましい。
【００６３】
Ｗ１／Ｏエマルションを調製するための方法は特に限定されるものではなく、従来のリポソームの製造方法でも用いられているような方法を採用することができる。たとえば、超音波乳化機、撹拌乳化機、膜乳化機、高圧ホモジナイザーなどの装置を用いた乳化方法が挙げられるが、平均粒径を広い範囲で制御でき、かつ得られるＷ１／Ｏエマルションが単分散性となるような方法が好ましい。ここで、超音波乳化機を用いる場合、パルス状に発振される超音波（以下、「パルス超音波」と呼ぶ。）を適用して一次乳化を行うことが好ましい。かかる方法によれば、一次乳化に伴って生じる発熱を抑えることができるので、本発明で用いられる工程（１）〜（４）を含む全ての工程を低温（例えば、５〜１０℃）で行うことも可能となる。また、かかる方法を用いる場合、発振された超音波が乳化を行う系において局所に集中することを回避できることから、均一なＷ１／Ｏエマルションの形成が速やかに進行すると推測しており、これによって、粒度分布の狭いリポソーム粒子を得ることができると考えられる。
【００６４】
水相液（Ｗ１）のｐＨは、通常３〜１０の範囲で調節され、たとえば、脂質成分にオレイン酸を用いる場合、ｐＨは６〜８．５とすることが好ましい。ｐＨを調整するためには適切な緩衝液を用いればよい。
【００６５】
一次乳化工程におけるその他の条件、たとえば、脂質成分（Ｆ１）の量（油相液（Ｏ）を構成する揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に対する割合）、油相液（Ｏ）と水相液（Ｗ１）の体積比、Ｗ１／Ｏエマルションの平均粒径などは、公知のリポソームの製造方法（一次乳化工程）に準じて、続く二次乳化工程の条件や最終的に調製するリポソームの態様などを考慮しながら、適宜調節することができる。通常、脂質成分（Ｆ１）の量は油相液（Ｏ）に対して１〜５０質量％の割合であり、油相液（Ｏ）と水相液（Ｗ１）との体積比は１００：１〜１：２である。Ｗ１／Ｏエマルションの体積平均粒径は、好ましくは５０〜１，０００ｎｍであり、より好ましくは５０〜２００ｎｍである。
【００６６】
本発明では、リポソームに内包対象薬剤（Ｄ）として水溶性薬剤類を内包させるために、一次乳化工程（１）の際に、水溶性薬剤類を添加してある水相液（Ｗ１）を用いてＷ１／Ｏエマルションを得てから、後述する二次乳化工程（２）および溶媒除去工程（３）を行うことにより、二次乳化工程終了時点で当該水溶性薬剤類を内包するリポソームが得られるようにする方法を用いることもできる。
【００６７】
ここで、内包対象薬剤（Ｄ）を水性溶媒（Ｗ１）に溶解して得られる含薬剤水溶液において、内包対象薬剤として用いられる薬剤類が過飽和状態で溶解していてもよい。この場合、後述する水相置換工程（４）において、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）が大きいリポソーム含有製剤、例えば、この重量比（Ｄ／Ｆ）が０．０５以上、好ましくは０．５以上のリポソーム含有製剤を調製する上で有利となることがある。
【００６８】
なお、必要であれば、内包対象薬剤（Ｄ）として脂溶性の物質（脂溶性薬剤類）を、本発明のリポソームの脂質膜内に内包させることも可能である。その場合は、脂溶性薬剤類を、一次乳化工程（１）の際に油相液（Ｏ）に溶解させた状態で添加すればよい。
【００６９】
（２）二次乳化工程
二次乳化工程は、上記一次乳化工程（１）により得られたＷ１／Ｏエマルションと、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する工程である。本発明では、水相液（Ｗ２）中に非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が添加されているので、結晶状態の脂質成分が添加されている場合と比べて、リポソームに内包される内包対象薬剤（Ｄ）の内包率が向上する利点がある。これは、脂質の配列速度が向上し、目的の構造体が早く得られるため、配列途中の構造体が崩壊する速度に勝っていることが要因と考察できる。
【００７０】
ここで、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）は、水相液（Ｗ２）に添加された形で用いることができるとともに、混合乳化の前に予めＷ１／Ｏエマルションにも添加された形で用いることもできる。この場合、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）は、Ｗ１／Ｏエマルションに溶解または分散した形で添加することができる。
【００７１】
Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製するための方法は特に限定されるものではなく、従来のＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造方法でも用いられているような方法を採用することができる。
【００７２】
たとえば、乳化操作時の液滴の崩壊および液滴からの内包物質の漏出を抑えるため、乳化処理に大きな機械的剪断力を必要としないマイクロチャネル乳化法を用いることが好適である。マイクロチャネル乳化法では、たとえば、シリコン製マイクロチャンネル基板およびこの基板上部を覆うガラス板から構成される、マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用する。上記基板およびガラス板により形成される溝型マイクロチャネルの出口側、あるいは上記基板上に加工された貫通型マイクロチャネルの出口側には、外水相をなす水相液（Ｗ２）を満たしておき、マイクロチャネルの入口側からＷ１／Ｏエマルションを圧入することで、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを形成できる。上記基板としては、デッドエンド型、クロスフロー型、貫通孔型など、種々の形態のものを用いることができる。
【００７３】
また、Ｗ１／Ｏエマルションを乳化膜に通過させて水相液（Ｗ２）中に液滴として分散させることによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する、膜乳化法を用いることもできる。特に、直径０．１〜５．０μｍ程度の微細な細孔を有するＳＰＧ（Shirasu Porous Glass：シラス多孔質ガラス）で形成された乳化膜を用いる膜乳化法が好適であり、コストが安く処理量が多い、工業的に有利な方法とすることができる。
【００７４】
なお、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの平均粒径の単分散性を向上させるために、上記のような方法または他の方法による膜乳化でＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを得た後、さらに１回ないし複数回、当該膜乳化で用いた膜と同じ膜またはそれとは異なる膜にＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションによる膜処理を行ってもよい。特に、膜乳化に用いる膜よりも小さな細孔径を有する膜を用いて膜処理を行うようにした場合、膜処理を行うことなく１回の膜乳化でＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する場合に較べて、膜乳化および膜処理それぞれの膜への負荷（エマルションを膜に通過させるために必要な圧力）を小さくすることができ、それにより膜の長寿命化や二次乳化工程に要する処理時間の短縮を図ることができ、リポソームの生産性の向上および低コスト化にも有利である。
【００７５】
また、本発明では、二次乳化工程（２）における混合乳化を、機械的剪断力の生じる可能性のある撹拌乳化によって行うことによっても、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを得ることができる。
【００７６】
撹拌乳化については二液以上の流体を混合するために用いられる方法・装置を用いることができる。たとえば攪拌装置にはいろいろな形状の物が存在する。単に棒・板・プロペラ状の攪拌子を槽内で一定速度・一方向に回転させるものが多いが、攪拌子を間欠回転させたり逆回転させる場合もある。特殊な状況では複数の攪拌子を並べ交互に逆回転させたり、槽側に攪拌子と組合された突起あるいは板を取り付けて攪拌子が発生するせん断応力を増強させるなどの様々な工夫がなされる。攪拌子への動力伝達方法も様々であり、回転軸を介して攪拌子を回転させるものが殆どであるが、磁石を封入しテフロン（登録商標）等でコーティングした攪拌子を容器の外部から回転する磁界で動力を伝達するマグネチックスターラーも存在する。
【００７７】
本発明では、上記一次乳化工程（１）により得られたＷ１／Ｏエマルションと、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水性溶媒（Ｗ２）とを混合乳化する際に、下記式（ｅ１）の条件を満たす撹拌乳化により実施することが好ましい。
【００７８】
0.02385 <ｒ×ｎ／Ｌ' < 0.1431 （ｅ１）
上記式（ｅ１）において、ｒは攪拌子の半径［ｍ］，Ｌ'はＷ１／Ｏエマルションの粒径［ｎｍ］，ｎは攪拌子の毎分回転数［rpm］を表す。
【００７９】
ここで、上記式（ｅ１）は、流体の移動に伴う運動量を表したニュートン則のひとつである、
τ (せん断力) ＝ μ (粘度) x ｖ(速度)/ Ｌ (長さ) （ｅ２）
および以下に示すいくつかの仮説に基づいて考案し、実験により確からしさを検証したものである。
【００８０】
先に示した通り二次乳化工程（２）における混合乳化は、撹拌によるせん断現象によっても進行するし、マイクロチャネルにおけるちぎれ現象によって進行する。このちぎれ現象は流体の表面張力という力が働いて起こる現象ととらえられ、その力の大きさはたとえばSugiura, Langmuir 2001,5562によって測定されている。すなわち、マイクロチャネルにおけるオリーブ油液滴形成の実測表面張力が4.5 mN/mであった。ところで、流体力学の基礎方程式(オイラー方程式)のさまざまな展開が研究者によって進められ、流体に働く力の近似式がすでに提示されている。慣性力、重力、粘性力、界面張力などが流体に働く力として知られており、界面張力は次の式で近似される。
【００８１】
表面張力＝界面張力（単位長さあたりの表面張力）× 系の代表長さ= ρ x L
液滴が直径17.8μｍで生成していることからSugiuraらの系での界面張力は、2.5×102 [Pa]と算出される。
【００８２】
4.5 x 10-3 [N/m] /17.8 x 10-6 [m] ＝ 2.5×102 [Pa]
流体に働く力として界面張力が支配的なマイクロチャネルの乳化条件と、せん断力が支配的な撹拌の乳化条件を同列の扱うことには無理があり、次の仮説を数学的に検証することは困難ではあるが、最終的には実験的な検証から式（ｅ１）の妥当性が判明した。その仮説とは、この界面張力を同等の力を、攪拌におけるせん断力として与えることにより同様のちぎれ現象が起こるとの仮定である。すなわち、せん断力をτ＝2.5×102 [Pa]と仮定し、粘度μについて、水とヘキサンの中間の値としてμ＝0.0005（＝0.5×10-3） [PaS]と仮定し、ＬがＷ１／Ｏエマルション粒径の10倍であると仮定すると、上記式（ｅ２）は、攪拌子の半径ｒ［ｍ］，Ｗ１／Ｏエマルションの粒径Ｌ'［ｎｍ］，攪拌子の毎分回転数ｎ［rpm］を用いて、
2.5×102 ＝ 0.0005×（2π×ｒ×ｎ／60）／（10×Ｌ'×10?9） （ｅ２’）
と表すことができる。ここで、ＬをＷ１／Ｏエマルションの10倍と仮定したのは、Ｗ１／Ｏエマルション粒径の10倍程度の粒径を有する粒子をせん断する力であれば、Ｗ１／Ｏエマルションはせん断されないと推定したからである。
【００８３】
上記（ｅ２’）をさらに変換すると、
ｒ×ｎ／Ｌ' ＝ （2.5×102）×（10×10?9）／（0.0005×２π）×60 ≒ 0.0478
と算出される。
【００８４】
ここで、界面張力と同程度という仮定を、界面張力の0.5倍から３倍程度としますと、これに対応してｒ×ｎ／Ｌ'もまた、0.0478の0.5倍から３倍程度となり、
0.0478×0.5 <ｒ×ｎ／Ｌ' < 0.0478×３
すなわち、
0.02385 <ｒ×ｎ／Ｌ' < 0.1431 （ｅ１）
と導き出される。
【００８５】
本発明においては、上記攪拌子の毎分回転数ｎが１００〜１００００であると、攪拌操作の取り扱いの面から好ましい。
さらに、小型観賞用水槽のエアレーション装置や工業用スプレードライ装置等、粘度の低い流体では攪拌子を使わずに、槽の流体や外気を槽外に設置したポンプで加圧して槽内にいきよい良く吹き込むことで槽内を攪拌する装置も存在する。また、ミルと呼ばれる粉砕機としてハンマーミル、ピンミル、オングミル、コボルミル、アスペックミル、ボールミル、ジェットミル、ロールミル、コロイドミル、ディスパーミルなどがあるが、これらは、圧縮力・圧搾力・膨張力・せん断力・衝撃力・キャビテーション力などの機械的な力の作用により流体を混合するものである。したがって、本発明においては、攪拌子による攪拌の代わりに、これらの装置を用いて攪拌を行っても良い。さらに、こうした機械的な方法以外にも、電気的な撹拌方法を使用することもできる。
【００８６】
二次乳化工程におけるその他の条件、たとえば、Ｗ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）の体積比、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの平均粒径などは、公知のリポソームの製造方法（二次乳化工程）に準じて、最終的に調製するリポソームの用途などを考慮しながら適宜調節することができる。
【００８７】
また、二次乳化工程（２）においては、必要に応じて脂質成分（Ｆ２）が、水相液（Ｗ２）およびＷ１／Ｏエマルションのうちの少なくとも何れか一方に添加されていても良い。
【００８８】
さらに、二次乳化工程（２）では、水相液（Ｗ２）に乳化剤（Ｒ）を添加してもよい。本発明において必要に応じて水相液（Ｗ２）に添加される乳化剤（Ｒ）は、図１に示すように、分散剤として機能することができる。
【００８９】
本願で用いることのできる乳化剤（Ｒ）として、リポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤（ｒ）が挙げられる。界面化学の分野では多くの乳化剤が知られており、代表的には、タンパク質、多糖類、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤などが、水溶性乳化剤として乳化・分散プロセスに用いられている。
【００９０】
上記タンパク質としては、ゼラチン（コラーゲンを加熱により変性させた可溶性のタンパク質）、アルブミンやトリプシンなどが挙げられる。ゼラチンは通常、数千〜数百万の分子量分布を有するが、たとえば重量平均分子量が１,０００〜１００,０００であるものが好ましい。医療用ないし食品用として市販されているゼラチンを用いることができる。アルブミンには、卵アルブミン（分子量約４５,０００）、血清アルブミン（分子量約６６,０００…ウシ血清アルブミン）、乳アルブミン（分子量約１４,０００…α−ラクトアルブミン）などが含まれ、たとえば卵アルブミンである乾燥脱糖卵白が好ましい。
【００９１】
上記多糖類としては、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、ペクチン、キトサン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、グァーガム、マルトトリオース、アミロース、プルラン、ヘパリン、デキストリンなどが挙げられ、たとえば重量平均分子量が１,０００〜１００,０００のデキストランが好ましい。
【００９２】
上記イオン性界面活性剤としては、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。
上記非イオン性界面活性剤としては、オクチルグルコシド等のアルキルグリコシド、ポリアルキレンオキサイド系の化合物、たとえば「Tween 80」（東京化成工業株式会社，ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート，分子量1309.68）や「プルロニック F-68」（BASF、ポリオキシエチレン（160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600）の製品や、重量平均分子量が1000〜100000のポリエチレングリコール類などが挙げられる。ポリエチレングリコール(PEG)類は、製品として「ユニルーブ」（日油株式会社）、GL4-400NP、GL4-800NP（日油株式会社）、PEG200,000(和光純薬)、マクロゴール（三洋化成工業株式会社）などが挙げられる。
【００９３】
分子量は、小さすぎると脂質膜中に混入しやすくなってリポソームの形成を阻害するおそれがあり、逆に大きすぎるとＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの外水相中への分散や界面への配向の速度が遅れてリポソームの合一や多胞リポソームの形成につながるおそれがある。そのため、水溶性乳化剤の重量平均分子量は１，０００〜１００，０００の範囲内にあることが好ましい。また、この範囲の重量平均分子量であると、リポソームの薬剤の内包率が良い。
【００９４】
上記のようにして脂質成分（Ｆ２）および／または水溶性乳化剤（ｒ）を用いる場合の各種の条件、たとえば、それらの量や、水相液（Ｗ２）およびＷ１／Ｏエマルションとの混合態様（添加順序等）は特に限定されるものではなく、公知のリポソームの製造方法に準じて、適切なものとすればよい。たとえば脂質成分（Ｆ２）が主として水溶性脂質からなる場合、あらかじめそのような脂質成分（Ｆ２）および／または水溶性乳化剤（ｒ）をＷ２に添加しておき、それにＷ１／Ｏエマルションを添加して乳化処理を行うことができる。一方、脂質成分（Ｆ２）が主として脂溶性脂質からなる場合、あらかじめ（Ｗ１／Ｏエマルション調製後）そのような脂質成分（Ｆ２）をＷ１／Ｏエマルションの油相に添加しておき、それを、必要に応じて水溶性乳化剤（ｒ）が添加されている水相液（Ｗ２）に添加して乳化処理を行うことができる。
【００９５】
（３）溶媒除去工程
溶媒除去工程は、上記二次乳化工程（２）を経て得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから有機溶媒、具体的には揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）（以下、単に「有機溶媒（ｏ）」と称する場合がある。）を除去することによりリポソーム分散液を調製する工程である。これにより、脂質成分（Ｆ１）（および必要に応じて添加される（Ｆ２））からなる脂質膜を内水相の周囲に形成し、リポソームを得ることができる。有機溶媒の除去の進行につれて、リポソームを構成する脂質の水和が進み、多胞リポソームが解けて単胞のリポソーム状態にばらけるか、またはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの界面に近い位置から単胞のリポソームがちぎれて形成されるものと考えられる。
【００９６】
溶媒除去工程は、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを回収し、開放容器内に移し静置あるいは撹拌することで、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒（ｏ）を蒸発除去することによって好適に行うことができる。
【００９７】
上記のような方法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションからの溶媒除去は、定法に従い、必要に応じて加温、減圧、撹拌を用いながら行えばよい。
溶媒除去は、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを開放容器内に静置したままでも行うことができるが、撹拌すればより均一に溶媒除去が進み、気液界面が広がることで溶媒除去にかかる時間も短縮される。二次乳化工程（２）において撹拌乳化法によりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製した場合は、その後さらに撹拌を継続して溶媒を除去するといったように、二次乳化工程（２）と溶媒除去工程（３）とを連続的に行うことも可能である。
【００９８】
温度条件は、有機溶媒（ｏ）として用いる化合物の種類に応じて、突沸することなくそれを蒸発させることのできる範囲で調整すればよいが、０〜６０℃の範囲が好ましく、０〜２５℃がより好ましく、５〜１０℃が特に好ましい。
【００９９】
また、減圧条件は、有機溶媒（ｏ）の飽和蒸気圧〜大気圧の範囲内に設定されることが好ましく、有機溶媒（ｏ）の飽和蒸気圧の＋１％〜１０％の範囲内に設定されることがより好ましい。２種以上の揮発性の炭化水素系有機溶媒からなる混合溶媒を有機溶媒（ｏ）として用いる場合、より飽和蒸気圧の高い溶媒種に合わせた条件が好ましい。これらの除去条件は、溶媒が突沸しない範囲で組み合わせてもよく、例えば、熱に弱い薬剤を使用する際は、より低温側でかつ減圧条件で溶媒を溜去することが好ましい。
【０１００】
なお、上記のような製造方法により得られるリポソームには、製法の工程上、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルション由来の多胞リポソームがある程度の割合含まれることがあるが、これを減じるために、撹拌、減圧、またはそれらの組み合わせを行うことが効果的である。たとえば、溶媒の大半が抜ける時間より長く減圧および撹拌を行なうことにより、リポソームを構成する脂質の水和が進み、内包物の漏出を起こさないまま、多胞リポソームが解けて単胞のリポソーム状態にばらけることが可能である。また、本法で副生する、あるいは残存する多胞リポソームはその内部がＷ１／Ｏ由来の５０〜２００ｎｍ程度の水滴を多く含む構造であるので、Ｗ１／Ｏの粒子径よりもわずかに大きな孔径のフィルターを通過させることで、５０〜２００ｎｍ程度の単胞リポソームへ変換することも可能である。このような操作をしても残った多胞リポソームがある場合には、フィルターにより除去することもできる。
【０１０１】
（４）水相置換工程
水相置換工程は、上記溶媒除去工程（３）を経て得られたリポソーム分散液から水相液（Ｗ２）を除去し、水相液（Ｗ３）を添加して、リポソーム製剤を調製する工程である。この水相置換工程は、水相液（Ｗ２）に含まれることがある乳化剤（Ｒ）を除去することを主な目的としている。ただ、本発明では、この水相置換工程において、除去する水相液（Ｗ２）の量よりも、添加する水相液（Ｗ３）の量を少なくする場合がある。そのような場合、この水相置換工程は、実質的に濃縮工程としての性格をも有する。
【０１０２】
ここで、水相液（Ｗ２）の除去は、リポソームが破壊されない限り特に方法のいかんを問うものではないが、例えば、上記工程（３）を経て得られたリポソーム分散液を超遠心分離に付すあるいは限外濾過に付すことにより行うことができる。少量製造の場合には超遠心分離が、大量製造の場合には限外濾過が有効と考えられる。
【０１０３】
また、水相液（Ｗ３）は、上記「水相液（Ｗ１）・（Ｗ２）・（Ｗ３）」の項で上述したように、水性溶媒（ｗ１）と同一の、あるいは本発明の作用効果を阻害しない範囲で水性溶媒（ｗ１）とは異なる水性溶媒（ｗ３）からなる。ここで、水相液（Ｗ３）として用いられる水性溶媒（ｗ３）は、緩衝液としての組成などその他の条件において水性溶媒（ｗ１）と同一であればよく、水相液（Ｗ３）には内包対象薬剤（Ｄ）を溶解させる必要はない。
【０１０４】
水性溶媒（ｗ３）の添加量は、目的とするリポソーム含有製剤の薬剤濃度に応じて調整することができる。薬剤濃度を高めたい場合には、水性溶媒（ｗ３）の添加量を極力少なくすればよい。実質的には、内水相Ｗ１を含む微粒子リポソームが分散状態になるために必要最小限の水性溶媒（ｗ３）の添加が必要となり、その添加量はＷ１の量と等しいかそれ以上と考えられる。したがって、本工程で得られるリポソーム含有製剤の薬剤濃度は、内水相Ｗ１に含まれる薬剤濃度の半分あるいはそれ以下になると考えられる。
【０１０５】
この水相置換工程（４）を経て得られるリポソーム含有製剤は、内包対象薬剤（Ｄ）を内包するリポソームが水性溶媒（ｗ１）中に分散した形態をとる。実質的に全ての内包対象薬剤（Ｄ）はリポソームに内包された状態にある。
【０１０６】
以上の工程（１）〜（４）を含む本発明に係る単胞リポソームを製造する方法によれば、医療用のリポソーム製剤として好適に使用可能な体積平均粒径５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の単胞リポソームを得ることができる。ここで、本発明においては、水相置換工程（４）を得て得られるリポソーム含有製剤が、リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）に対する内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）が大きいものとすることができ、例えば、この重量比（Ｄ／Ｆ）が０．０５以上、好ましくは０．５以上のリポソーム含有製剤を調製することが可能である。
【０１０７】
（５）その他の工程
上記工程（１）〜（４）のほか、本発明において必要に応じて行われるその他の工程としては、たとえば分離工程、整粒工程や乾燥粉末化工程が挙げられる。
【０１０８】
分離工程は、乳化剤とリポソームとを分離し、リポソーム分散液中から乳化剤を除去するための工程であり、所要により、前記溶媒除去工程（３）の後水相置換工程（４）の前に行われる。たとえば、精密濾過膜（ＭＦ膜，孔径５０ｎｍ〜１０μｍ程度）または限外濾過膜（ＵＦ膜，孔径２〜２００ｎｍ程度）を用いれば、リポソームと自己による分子集合体（たとえば体積平均粒径１０ｎｍ以下）を形成した乳化剤とを効率よく分離することができる。なお、製品の用途に鑑みて、乳化剤とリポソームとを分離しなくとも問題がない場合には、この分離工程は設けなくともよい。
【０１０９】
整粒工程により、調製されたリポソームの粒径を所望の範囲に調整することができる。たとえば、孔径０．１〜０．４μｍのポリカーボネート膜またはセルロース膜をフィルターとして装着した静圧式押出し装置（日油リポソーム社製「エクストルーダー」、野村マイクロサイエンス社製「リポナイザー」など）を用いることにより、中心粒径が５０〜２００ｎｍ程度のリポソームが効率よく得られる。上記「エクストルーダー」等を用いれば、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる。
【０１１０】
また、リポソームの分散液を凍結乾燥などにより乾燥粉末化し、使用するまでの間の保管に適した形態にすることも望ましい。凍結乾燥は従来のリポソームを製造する場合と同様の手段や装置を用いて行うことができる。たとえば、間接加熱凍結方法、冷媒直膨方法、熱媒循環方法、三重熱交換方法、重複冷凍方法などに従い、適切な条件下（温度：−１２０〜−２０℃、圧力：１〜１５Pa、時間：１６〜２６時間など）で凍結乾燥を行えばよい。このようにして得られた凍結乾燥物を水中に投入すれば、再びリポソームの分散液を調製することができる。
【０１１１】
なお、本発明の好適な態様においては、上記工程（１）〜（５）に記載したすべての工程を５−１０℃で実施することができる。このような態様の下では、蛋白質など熱に弱い物質を内包対象薬剤（Ｄ）として用いたリポソームを製造することも可能となる。特に製造管理の厳しい医薬品グレードの製造では、内包する薬剤の劣化はわずかであっても問題視されるので、低温での製造は劣化防止の有効な対策になりえる。
【実施例】
【０１１２】
（Ｗ１／Ｏエマルションおよびリポソームの粒度分布の測定方法）
Ｗ１／Ｏエマルションはヘキサン／ジクロロメタン混合有機溶媒（体積比：１／１）で１０倍に希釈した後、一方リポソーム分散液はそのまま、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて粒度分布を測定した。その結果に基づき、Ｗ１／Ｏエマルションまたはリポソームの体積平均粒径を算出した。
【０１１３】
（内包率の算出）
各実施例および比較例において、W1に溶解している水溶性薬剤（シタラビン、ｓｉＲＮＡ）を以下のように定量した。すなわち、一次乳化工程で得られたＷ１／ＯエマルジョンにおいてＷ１に溶解している薬剤、二次乳化工程で得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルジョンにおいてＷ1に溶解している薬剤、および溶媒除去工程で得られたリポソームの内水相Ｗ1に溶解している薬剤は、超遠心装置を用いてＯ相と分離されたＷ１相、Ｗ２相と分離されたＷ１／Ｏエマルジョン、および外水相（上澄）と分離されたリポソーム（固形分）をそれぞれ分析してその量を決定した。
【０１１４】
水溶性薬剤（Ｄ）がシタラビンの場合にはＨＰＬＣ（カラム：VarianPolaris C18-A（3μm, 2x40mm））を用いて定量し、ｓｉＲＮＡの場合にはＨＰＬＣ（カラム：Develosil ODS-UG-5(6x150mm)）を用いて定量した。
【０１１５】
各粒子のＷ１相に存在している水溶性薬剤の量（ａ）および水溶性薬剤の仕込み量（ｂ）から、計算式a／ｂ×１００［％］により算出される値を、上記各水溶性薬剤の内包率とした。
【０１１６】
なお、以下の記載において、「水相液」および「油相液」を、それぞれ「水分散相」および「有機溶媒層」と呼ぶ場合がある。例えば、下記の記載にいう「水分散相（Ｗ１）」は、「水相液（Ｗ１）」に相当する。
【０１１７】
≪非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加する効果≫
以下の比較例１−１，１−２および１−３並びに実施例１−１および１−２により、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）が添加された水相液を水相液（Ｗ２）として用いる効果について検討した。ここで、実施例１−２においては、非結晶性の脂質成分としてフィルム状脂質を用いている。
【０１１８】
［比較例１−１］
本比較例では、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いることなく、脂質成分（Ｆ１）を用いてリポソームの製造を行った。
【０１１９】
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ, 日油株式会社）０．３ｇ、コレステロール（Chol, 日油株式会社）０．１５２ｇおよびオレイン酸（OA）０．１０８ｇを含むヘキサン１５ｍＬを油相液（Ｏ）とし、シタラビン（０．４ｍＭ：分子量２４３．２２）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水相液（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径２０ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２５℃にて１５分間超音波を照射し（出力５．５）、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１６８ｎｍの単分散Ｗ１／Ｏエマルションであることが確認された。このＷ１／Ｏエマルションにおけるシタラビンの内包率は５５％であった。
【０１２０】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
続いて、半径１６ｍｍの攪拌子を用いたマグネチックスターラーにより、0.1％プルロニックを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）である水相液（Ｗ２）を強く撹拌しているところに（回転数１０００ｒｐｍ）、上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションの一部を供給し、Ｗ１／ＯとＷ２の容積比が１：３となる比率で混合撹拌してＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。その結果、微細で粒度分布が正規分布を示すリポソーム粒子の分散液が得られ、この粒子内にはシタラビンが含まれていることが確認された。このＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおけるシタラビンの内包率は４８％であった。
【０１２１】
（溶媒除去工程によるリポソームの製造）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間、攪拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。溶媒除去後のシタラビンの内包率は４６％であった。
【０１２２】
（水相置換工程によるリポソーム製剤の調製）
得られたリポソーム溶液を超遠心分離に付し、上澄みの水相液（Ｗ２）を除去しながら、水相液（Ｗ３）としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加して、水相液（Ｗ２）に含まれるシタラビンを排除した。最終的に内水相用の水相液（Ｗ１）５ｍＬの倍の体積である、10 mLのリポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１６５ｎｍであった。
【０１２３】
この製剤中にシタラビンは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのシタラビンの４６％（０．４ｍＭ×５ｍＬ×２４３．２２×０．４６×１．００＝０．２２ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、０．２２［ｍｇ］／（３００＋１５２＋１０８）［ｍｇ］＝０．２２／５６０＝０．０００４である。
【０１２４】
超遠心分離時に、白い結晶が沈降していることが確認され、添加したが未溶解状態であったホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ, 日油株式会社）およびコレステロール（Chol）の結晶であることが確認された。
【０１２５】
［比較例１−２］
本比較例では、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いることなく、脂質成分（Ｆ１）および脂質成分（Ｆ２）を用いてリポソーム製剤の調製を行った。
【０１２６】
具体的には、上記ホスファチジルコリンおよび上記コレステロールの添加量をそれぞれ半量の０．１５ｇおよび０．０７５ｇとし、且つ、
外水相用の水相液（Ｗ２）として、上記ホスファチジルコリンおよび上記コレステロールの添加量をそれぞれ半量の０．１５ｇおよび０．０７５ｇをさらに添加したものを用いたことを除いて、上記比較例１−１で行った方法と同じ条件を用いて、一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造、溶媒除去工程によるリポソームの製造、および、水相置換工程によるリポソーム製剤の調製の各工程を行うことにより、リポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１６９ｎｍであった。
【０１２７】
ここで、シタラビンの内包率は、Ｗ１／Ｏエマルションにおいては５５％であり、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおいては４８％であり、溶媒除去後においては４５％であった。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１６０ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。超遠心分離後の製剤中にシタラビンは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのシタラビンの４５％（０．４ｍＭ×５ｍＬ×２４３．２２×０．４５×１．００＝０．２２ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、０．２２［ｍｇ］／（３００＋１５２＋１０８）［ｍｇ］＝０．２２／５６０＝０．０００４である。
【０１２８】
［実施例１−１］
本実施例では、脂質成分（Ｆ２）に代えて非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いるとともに、脂質成分（Ｆ１）も用いてリポソーム製剤の調製を行った。
【０１２９】
すなわち、上記ホスファチジルコリンおよび上記コレステロールの添加量をそれぞれ半量の０．１５ｇおよび０．０７５ｇとし、
外水相用の水相液（Ｗ２）として、特開平２−１６７２１８号公報記載の方法に従ってホスファチジルコリンおよびコレステロールがそれぞれ０．１５ｇおよび０．０７５ｇ含まれるように調製された多孔質状の脂質をさらに添加したものを用いたことを除いて、上記比較例１−１で行った方法と同じ条件を用いて、一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造、溶媒除去工程によるリポソームの製造、および、水相置換工程によるリポソーム製剤の調製の各工程を行うことにより、リポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１５４ｎｍであった。
【０１３０】
ここで、シタラビンの内包率は、Ｗ１／Ｏエマルションにおいては５５％であり、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおいては５５％であり、溶媒除去後においては５５％であった。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１６０ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。超遠心分離後の製剤中にシタラビンは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのシタラビンの５５％（０．４ｍＭ×５ｍＬ×２４３．２２×０．５５×１．００＝０．２６ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、０．２６［ｍｇ］／（（１５０＋７５＋１０８）＋（１５０＋７５））［ｍｇ］＝０．２２／５５８＝０．０００４である。
【０１３１】
超遠心分離時に、白い結晶の沈降は認められなかった。
なお、実施例１−１および比較例１−１における二次乳化工程を撹拌乳化に代えてSPG膜乳化で実施した場合にも同様の結果が得られた。
【０１３２】
［実施例１−２］
本実施例では、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）として、多孔質状の脂質に代えてフィルム状脂質を用いてリポソームの製造を行った。ここで、本実施例では、シタラビンに代えてｓｉＲＮＡを内包対象薬剤として用いている。
【０１３３】
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ｓｉＲＮＡ（ランダム配列：分子量１３０００）１０ｍｇを等張ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ溶解させて内水相用の水相液（Ｗ１）とし、DPPC（ジパルミトイルホスファチジルコリン、「MC-6060」、日油株式会社）５０ｍｇ、およびDPPG（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、「COATSOME MG-6060LA」、日油株式会社）１０ｍｇを含むヘキサン１．２５ｍＬを油相液（Ｏ）とした。３．５ｍＬのサンプル瓶にこれらの混合液を入れ、φ７ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２０℃にて１５分間超音波を照射し乳化処理を行うことにより、Ｗ１／Ｏエマルションを得た。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１０２ｎｍの単分散Ｗ１／Ｏエマルションであることが確認された。このＷ１／ＯエマルションにおけるｓｉＲＮＡの内包率は６７％であった。
【０１３４】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
あらかじめDPPCおよびDPPGがそれぞれ25 mgおよび5 mg含まれるように調製しておいたフィルム状脂質および０．１％のプルロニックＦ６８を含む等張ＰＢＳ溶液を水相液（Ｗ２）として用いた。この水相液（Ｗ２）１５ｍＬ中に、上記一次乳化工程によって得られたＷ１／Ｏエマルションを供給しながら、半径１６ｍｍ（すなわち、０．０１６ｍ）の攪拌子を用いて回転数１０００ｒｐｍで１５分間撹拌して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。このＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおけるｓｉＲＮＡの内包率は６７％であった。
【０１３５】
なお、フィルム状脂質は、DPPCおよびDPPGそれぞれ25 mgおよび5 mgをクロロフォルムに完全溶解してナスコルに入れ、エバポレーターでゆっくりとクロロフォルムを留去し、ナスコル壁面に配列した脂質膜を回収することで用意した。この回収方法は古典的リポソーム製造法であるバンガム法の一工程として知られている。
【０１３６】
（溶媒除去工程によるリポソームの製造）
得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、２０℃・５００ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間攪拌し、次いで２０℃・１８０ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間撹拌し、段階的に溶媒を揮発させた。得られたリポソーム分散液は半透明の黄色であり、この粒子内にはｓｉＲＮＡが含まれていることが確認された。リポソームのｓｉＲＮＡの内包率は66％であった。
【０１３７】
（水相置換工程によるリポソーム製剤の調製）
得られたリポソーム溶液を超遠心分離に付し、上澄みの水相液（Ｗ２）を除去しながら、水相液（Ｗ３）として等張ＰＢＳ溶液を添加した。最終的に内水相用の水相液（Ｗ１）０．２５ｍＬの４倍の体積である、１．０mLのリポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１１０ｎｍであった。
【０１３８】
超遠心分離処理後の製剤中にｓｉＲＮＡは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのｓｉＲＮＡの６６％（１０ｍｇ×０．６６×１．００＝６．６ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、６．６［ｍｇ］／（（５０＋１０）＋（２５＋５））［ｍｇ］＝６．６／９０＝０．０７３である。
【０１３９】
［比較例１−３］
本比較例では、上記実施例１−２に対応する比較例として、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いることなく、脂質成分（Ｆ１）のみを脂質成分として用いてリポソームの製造を行った。
【０１４０】
すなわち、二次乳化工程においてフィルム状脂質を用いなかったことを除いては、実施例１−２と同じ方法と条件を用いて一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造、溶媒除去工程によるリポソームの製造、および、水相置換工程によるリポソーム製剤の調製の各工程を行うことにより、リポソーム製剤を調製した。すなわち、本比較例においては、得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、９５ｎｍであった。
【０１４１】
ここで、ｓｉＲＮＡの内包率は、Ｗ１／Ｏエマルションにおいては６７％であり、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおいては５９％であり、溶媒除去後においては５１％であった。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約９９ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。
【０１４２】
超遠心分離処理後の製剤中にｓｉＲＮＡは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのｓｉＲＮＡの５１％（１０ｍｇ×０．５１×１．００＝５．１ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、５．１［ｍｇ］／（５０＋１０）［ｍｇ］＝５．１／６０＝０．０８５である。
【０１４３】
［実施例１−１および１−２、並びに比較例１−１、１−２および１−３の結果からの考察］
以上の実施例１−１及び比較例１−１の結果から、添加したが未溶解状態であったホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ, 日油株式会社）およびコレステロール（Chol）は、膜形成に関与していないことが推測され、混合した脂質成分の比率どおりに膜構成脂質の比率が形成されていない可能性が高いことが示唆される。
【０１４４】
また、内包率については、Ｗ１／Ｏエマルションの内包率を比較した場合には、実施例１−１、比較例１−１及び比較例１−２のいずれの場合でも変化が認められなかった。一方、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションおよび溶媒除去後のリポソーム分散液を比較した場合には、比較例１−１及び比較例１−２では内包率が低下していたのに対して、実施例１−１では内包率が維持されていた。これは、二次乳化のプロセスで結晶状態の脂質が悪影響し、内包率が低下していることを意味している。内包率におけるこのような違いは、実施例１−２とこれに対応する比較例１−３との間にも同様に認められた。ここで注目すべきことは、実施例１−１と比較例１−２では、ともに水相液（Ｗ２）に脂質成分を添加している点で共通するにもかかわらず、溶媒除去後のリポソーム分散液における内包率に違いが生じていることである。このことは、本発明の製造方法において内包率が維持されるという効果は、単に水相液（Ｗ２）に脂質成分を添加したことによるものではなく、水相液（Ｗ２）に添加する脂質成分として非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いたことによることを示唆している。
【０１４５】
また、比較例１−１において、一次乳化の内水相用の水相液（Ｗ１）に多孔質状の脂質を添加し、外水相用の水相液（Ｗ２）に結晶状脂質を添加した場合には、内包率が低下し、超遠心分離時に、白い結晶の沈降が認められた。このことから、多孔質状の脂質は外水相用の水相液（Ｗ２）に加えることで効果があることが分かった。一次乳化でも結晶状態の脂質が速やかになくなるわけではないので、結晶状態の脂質が一次乳化のプロセスでも悪影響を起こすことは容易に想定できるが、そのような悪影響を窺わせるような現象は見られなかった。
【０１４６】
≪攪拌乳化における攪拌子の半径と回転数による効果≫
上記実施例１−１及び、下記に示す実施例２から４−２および比較例２−１から３−２により、攪拌乳化における攪拌子の半径と回転数による二次乳化への効果について検討した。
【０１４７】
［実施例２］
本実施例では、一次乳化の内水相用の水相液（Ｗ１）および外水相用の水相液（Ｗ２）のそれぞれに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加して、リポソーム製剤の調製を行った。
【０１４８】
具体的には、一次乳化の内水相用の水相液（Ｗ１）に添加する脂質を上記多孔質状の脂質に変更するするとともに、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造の際に、半径３ｍｍ（すなわち、０．００３ｍ）の攪拌子を用いて回転数１０００ｒｐｍで攪拌を行ったことを除いて、実施例１−１と同じ条件でリポソーム製剤を調製した。
【０１４９】
溶媒除去後のシタラビンの内包率は４４％であり、溶媒除去後の粒度分布は正規分布であることが確認された。また、一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約６９ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。このＷ１／Ｏエマルションの体積平均粒径は、外水相用の水相液（Ｗ２）にのみ非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した上記実施例１−１で得られたＷ１／Ｏエマルションの体積平均粒径（約１６８ｎｍ）と比べて小さい。
【０１５０】
非結晶性脂質を一次乳化の内水相用の水相液（Ｗ１）のみに添加した場合に、内包率が低下するというデメリットについては上記考察で述べたとおりである。しかしながら、その場合でもＷ１／Ｏエマルションの体積平均粒径が小さくできるのに伴い、最終的に得られるリポソームの体積平均粒径を小さくすることができた。非結晶性脂質を一次乳化の内水相用の水相液（Ｗ１）に添加した場合に、体積平均粒径が小さくできる効果は、Ｗ１／Ｏエマルションの生成速度が速くなってエネルギーが効率的に使用された結果であり、それは脂質分子の炭化水素系有機溶媒中での分散性・溶解性が高いことに由来すると考えられる。
【０１５１】
［実施例３−１〜３−２，比較例３−１〜３−２］
実施例３−１〜３−２，および比較例３−１〜３−２については、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造において、攪拌子の半径および攪拌時の回転数を表１に示す値としたこと、および、製造容器を相似形として適宜製造スケールを上下させたことを除き、上記実施例１−１と同様の反応条件でリポソーム製剤を調製した。
【０１５２】
［実施例４−１〜４−２，比較例２−１〜２−２］
実施例４−１〜４−２，および比較例２−１〜２−２については、二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造において、攪拌子の半径および攪拌時の回転数を表１に示す値としたこと、および、製造容器を相似形として適宜製造スケールを上下させたことを除き、上記実施例２と同様の反応条件でリポソーム製剤を調製した。
【０１５３】
また、実施例３−１、４−２における１５分間超音波照射（出力５．５）による一次乳化について、超音波を１５分間連続して照射する代わりに、１分間の照射と1分間の非照射とを交互に繰り返すパルス超音波を照射するように変更して実験したところ、溶媒除去後の内包率及び粒度分布は同等の結果が得られ、さらに粒度分布の幅はシャープになる傾向が見られた。
【０１５４】
【表１】
≪脂質成分（Ｆ）に対する内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）が０．５以上のリポソーム製剤の製造≫
以下の実施例５−１及び５−２として、脂質成分（Ｆ）に対する内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）が０．５以上のリポソーム製剤の製造を行った。ここで、実施例５−２は、水相液（Ｗ１）として、内包対象薬剤（Ｄ）を過飽和状態で溶解させたものを用いた場合に該当する。
【０１５５】
［実施例５−１］
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ｓｉＲＮＡ（ランダム配列）４０ｍｇを等張ＰＢＳ溶液０．１２５ｍＬ溶解させて内水相（Ｗ１）とし、DPPC（ジパルミトイルホスファチジルコリン、「MC-6060」、日油株式会社）２５ｍｇ、およびDPPG（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、「COATSOME MG-6060LA」、日油株式会社）５ｍｇを含むヘキサン１．２５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とした。３．５ｍＬのサンプル瓶にこれらの混合液を入れ、φ７ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２０℃にて１５分間超音波を照射し乳化処理を行うことにより、Ｗ１／Ｏエマルションを得た。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１３１ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。このＷ１／ＯエマルションにおけるｓｉＲＮＡの内包率は７１％であった。
【０１５６】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
あらかじめDPPCおよびDPPGがそれぞれ１2.5 mgおよび2.5 mg含まれるように調製しておいた多孔質脂質(日本精化社製)および０．１％のプルロニックＦ６８を含む等張ＰＢＳ溶液を水相液（Ｗ２）として用いた。この水相液（Ｗ２）１５ｍＬ中に、上記一次乳化工程によって得られたＷ１／Ｏエマルションを供給しながら、半径１６ｍｍ（すなわち、０．０１６ｍ）の攪拌子を用いて回転数１０００ｒｐｍで室温下１５分間撹拌して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。このＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおけるｓｉＲＮＡの内包率は７１％であった。
【０１５７】
（溶媒除去工程によるリポソームの製造）
得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、２０℃・５００ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間攪拌し、次いで２０℃・１８０ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間撹拌し、段階的に溶媒を揮発させた。得られたリポソーム分散液は半透明の黄色であり、この粒子内にはsiRNAが含まれていることが確認された。リポソームのｓｉＲＮＡの内包率は７０％であった。
【０１５８】
（水相置換工程によるリポソーム製剤の調製）
得られたリポソーム溶液を室温下超遠心分離に付し、上澄みの水相液（Ｗ２）を除去しながら、水相液（Ｗ３）として等張ＰＢＳ溶液を添加した。最終的に内水相用の水相液（Ｗ１）０．１２５ｍＬの４倍の体積である、1.0mLのリポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１３３ｎｍであった。
【０１５９】
超遠心分離処理後の製剤中にｓｉＲＮＡは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのｓｉＲＮＡの７０％（４０ｍｇ×０．７０×１．００＝２８ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、２８［ｍｇ］／（（２５＋５）＋（１２．５＋２．５））［ｍｇ］＝６．６／４５＝０．６２である。
【０１６０】
［実施例５−２］
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
シタラビン（１０００ｍM）の等張ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬを内水相（Ｗ１）とし、DPPC（ジパルミトイルホスファチジルコリン、「MC-6060」、日油株式会社）２５ｍｇ、コレステロール（Chol, 日油株式会社）７．３ｍｇおよびDSPE-PEG2000（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール、日油株式会社）１１ｍｇを含むヘキサン１．２５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とした。３．５ｍＬのサンプル瓶にこれらの混合液を入れ、φ７ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２０℃にて１５分間超音波を照射し乳化処理を行うことにより、Ｗ１／Ｏエマルションを得た。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１１２ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認された。このＷ１／Ｏエマルションにおけるシタラビンの内包率は５８％であった。
【０１６１】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
あらかじめDPPCおよびコレステロールがそれぞれ１２．５ｍｇおよび３．７ｍｇ含まれるように調製しておいた多孔質脂質および０．１％のプルロニックＦ６８を含む等張ＰＢＳ溶液を水相液（Ｗ２）として用いた。この水相液（Ｗ２）１５ｍＬ中に、上記一次乳化工程によって得られたＷ１／Ｏエマルションを供給しながら、半径１６ｍｍ（すなわち、０．０１６ｍ）の攪拌子を用いて回転数１０００ｒｐｍで１５分間撹拌して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。このＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションにおけるシタラビンの内包率は５８％であった。
【０１６２】
（溶媒除去工程によるリポソームの製造）
得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、２０℃・５００ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間攪拌し、次いで２０℃・１８０ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間撹拌し、段階的に溶媒を揮発させた。得られたリポソーム分散液は半透明の黄色であり、この粒子内にはシタラビンが含まれていることが確認された。リポソームのシタラビンの内包率は５５％であった。
【０１６３】
（水相置換工程によるリポソーム製剤の調製）
得られたリポソーム溶液を超遠心分離に付し、上澄みの水相液（Ｗ２）を除去しながら、水相液（Ｗ３）として等張ＰＢＳ溶液を添加した。最終的に内水相用の水相液（Ｗ１）０．２５ｍＬの４倍の体積である、1.0mLのリポソーム製剤を調製した。得られたリポソーム製剤におけるリポソームの体積平均粒径は、１０３ｎｍであった。
【０１６４】
超遠心分離処理後の製剤中にシタラビンは100%リポソームに内包されている。すなわち、このリポソ−ム製剤中には、仕込みのシタラビンの５５％（１０００ｍＭ×０．２５ｍＬ×２４３．２２×０．５５×１．００＝３３．４ｍｇ）を内包するリポソームが含有されている。また、薬剤重量比（Ｄ／Ｆ）は、３３．４［ｍｇ］／（（２５＋７．３＋１１）＋（１２．５＋３．７））［ｍｇ］＝３３．４／５９．５＝０．５６である。
【０１６５】
［実施例５−３］
一次乳化工程、二次乳化工程、溶媒除去工程および水相置換工程の全てを低温で行うことができるかどうかを確認するため、上記実施例５−１に示した製造方法を低温で実施した。
【０１６６】
具体的には、上記実施例５−１の一次乳化工程において、２０℃にて１５分間超音波を照射し乳化処理を５〜１０℃に変更して実施し、二次乳化工程において室温下１５分間撹拌する部分を５〜１０℃に変更して実施し、溶媒除去工程において２０℃の減圧条件下で攪拌する部分を５〜１０℃に変更して実施し、水相液（Ｗ２）の除去において室温下超遠心分離に付している部分を５〜１０℃に変更して実施した。すなわち、すべての工程を５〜１０℃で実施した。
その結果、上記実施例５−１と同等の結果を得ることができた。
【０１６７】
［実施例５−４］
プルロニックＦ６８以外の乳化剤を用いることができるかどうかを確認するため、上記実施例５−２の二次乳化工程においてプルロニックＦ６８(分子量９６００)を添加する代わりに、ゼラチン(新田ゼラチン、コラーゲンペプチド2000、分子量2000)を０．５％濃度で添加したことを除き、実施例５−２に示した通りの製造方法を実施した。
その結果、上記実施例５−２と同等の結果を得ることができた。
【０１６８】
［実施例５−５］
プルロニックＦ６８以外の乳化剤を用いることができるかどうかを確認するもう一つの実施例として、上記実施例５−２の二次乳化工程においてプルロニックＦ６８(分子量９６００)を添加する代わりに、デキストラン60000(和光純薬、分子量60000)を3％濃度で添加したことを除き、実施例５−２に示した通りの製造方法を実施した。
その結果、上記実施例５−２と同等の結果を得ることができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（４）を含む、体積平均粒径５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の単胞リポソームを製造する方法
（１）脂質成分（Ｆ１）を揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に溶解または分散した揮発性の油相液（Ｏ）と、内包対象薬剤（Ｄ）を水性溶媒（ｗ１）に溶解して得られる水相液（Ｗ１）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程；
（２）上記工程（１）を経て得られたＷ１／Ｏエマルションと、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程；
（３）上記工程（２）を経て得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから炭化水素系有機溶媒（ｏ）を除去することによりリポソーム分散液を調製する溶媒除去工程；
（４）上記工程（３）を経て得られたリポソーム分散液から水相液（Ｗ２）を除去し、水相液（Ｗ３）を添加して、リポソーム製剤を調製する水相置換工程。
【請求項２】
前記工程（１）において脂質成分（Ｆ１）の代わりに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いるか、あるいは、前記工程（２）において非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）と混合乳化する前にＷ１／Ｏエマルションに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２）における二次乳化を下記式（ｅ１）の条件を満たす撹拌乳化により実施する、請求項１または２記載の方法：
0.02385 <ｒ×ｎ／Ｌ' < 0.1431 （ｅ１）
上記式（ｅ１）において、ｒは攪拌子の半径［ｍ］，Ｌ'はＷ１／Ｏエマルションの粒径［ｎｍ］，ｎは攪拌子の毎分回転数［rpm］を表す。
【請求項４】
前記工程（４）を経て得られるリポソーム含有製剤が、リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）に対する該内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）が0.05以上であるものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記リポソーム含有製剤における前記重量比（Ｄ／Ｆ）が0.5以上である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記工程（１）において、水性溶媒（ｗ１）に上記内包対象薬剤（Ｄ）が過飽和状態で溶解した水相液（Ｗ１）を用いる、請求項４および５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記工程（２）において、乳化剤（Ｒ）が溶解した水相液（Ｗ２）を用いる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記工程（１）〜（４）のすべての工程を５−１０℃の範囲の温度で実施する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記工程（１）における混合乳化をパルス超音波で実施する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
下記工程（１）〜（４）を含む、体積平均粒径５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の単胞リポソームを製造する方法
（１）脂質成分（Ｆ１）を揮発性の炭化水素系有機溶媒（ｏ）に溶解または分散した揮発性の油相液（Ｏ）と、内包対象薬剤（Ｄ）を水性溶媒（ｗ１）に溶解して得られる水相液（Ｗ１）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程；
（２）上記工程（１）を経て得られたＷ１／Ｏエマルションと、非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程；
（３）上記工程（２）を経て得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから炭化水素系有機溶媒（ｏ）を除去することによりリポソーム分散液を調製する溶媒除去工程；
（４）上記工程（３）を経て得られたリポソーム分散液から水相液（Ｗ２）を除去し、水相液（Ｗ３）を添加して、リポソーム製剤を調製する水相置換工程。
【請求項２】
前記工程（１）において脂質成分（Ｆ１）の代わりに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を用いるか、あるいは、前記工程（２）において非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加した水相液（Ｗ２）と混合乳化する前にＷ１／Ｏエマルションに非結晶性の脂質成分（ＦＮ）を添加する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２）における二次乳化を下記式（ｅ１）の条件を満たす撹拌乳化により実施する、請求項１または２記載の方法：
0.02385 <ｒ×ｎ／Ｌ' < 0.1431 （ｅ１）
上記式（ｅ１）において、ｒは攪拌子の半径［ｍ］，Ｌ'はＷ１／Ｏエマルションの粒径［ｎｍ］，ｎは攪拌子の毎分回転数［rpm］を表す。
【請求項４】
前記工程（４）を経て得られるリポソーム含有製剤が、リポソームを構成する脂質成分（Ｆ）に対する該内包対象薬剤（Ｄ）の重量比（Ｄ／Ｆ）が0.05以上であるものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記リポソーム含有製剤における前記重量比（Ｄ／Ｆ）が0.5以上である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記工程（１）において、水性溶媒（ｗ１）に上記内包対象薬剤（Ｄ）が過飽和状態で溶解した水相液（Ｗ１）を用いる、請求項４および５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記工程（２）において、乳化剤（Ｒ）が溶解した水相液（Ｗ２）を用いる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記工程（１）〜（４）のすべての工程を５−１０℃の範囲の温度で実施する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記工程（１）における混合乳化をパルス超音波で実施する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１３−２２４８２（Ｐ２０１３−２２４８２Ａ）
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５６７７０（Ｐ２０１１−１５６７７０）
【出願日】平成２３年７月１５日（２０１１．７．１５）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１５日（２０１１．７．１５）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
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