リポソームボツリヌス毒素を使用する膀胱機能障害の治療
膀胱刺激および頻度の低下によって下部尿路症状の改善に役立てるための膀胱内薬物送達、具体的には、ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）の送達のためにリポソームを使用する。この系は、より低く且つより安全な用量のＢｏＮＴを使用し、尿閉リスクがより低い。膀胱への液体処方物としてのリポソーム−ＢｏＮＴ（典型的には３０〜６０ｍｌ）の簡潔な点滴注入により、ＢｏＮＴの膀胱鏡的針注射を用いて現在達成されている有効性に類似の有効性が達成されるであろう。用量を注射によって得られる用量より低くすることができ、それにより、尿閉リスクが有意に軽減される。リポソーム−ＢｏＮＴは、ＢｏＮＴを膀胱中および尿中での分解から防御することができる。リポソーム−ＢｏＮＴの点滴注入は、膀胱鏡的ＢｏＮＴ注射に精通し、且つ認定を受けた医師に制限される別の方法よりも患者にとってより快適であり、より多数の医院にこの治療形態を提供することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、膀胱機能障害、特に、治療抵抗性過活動膀胱の治療分野にある。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
尿失禁（すなわち、膀胱機能障害）は、膀胱制御の喪失である。症状は、軽度の尿漏れ（ｌｅａｋｉｎｇ）から制御不可能な尿漏れ（ｗｅｔｔｉｎｇ）までの範囲であり得る。誰もが起こり得るが、加齢と共により一般的となる。ほとんどの膀胱制御の問題は、筋肉が脆弱過ぎるかまたは過活動である場合に起こる。膀胱を閉じたままにする筋肉が弱い場合、くしゃみをした時、笑った時、または重いものを持ち上げた時に尿が漏れ得る。これは緊張性失禁である。膀胱筋が過活動になると、膀胱中にほとんど尿が存在しない場合でも用を足す衝動に強く駆られる。これは切迫尿失禁または過活動膀胱である。前立腺の問題および神経損傷などの他の失禁原因が存在する。
【０００３】
治療は問題の型に依存する。これには、簡単な運動、薬物、医師によって処方された特別なデバイスもしくは手順、または手術が含まれ得る。
【０００４】
膀胱内療法は、長年にわたって治療の頼みの綱であった（非特許文献１）。膀胱内薬物療法は、膀胱中の局所薬物濃度が高く、全身性副作用のリスクが低いことを提供し、経口投与した薬剤の尿中排泄レベルが低いという問題が解決される。試験した標準的な点滴注入時間は３０分間であり、これには患者が優れた忍容性を示す。臨床的に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｒｉｍｓｏ−５０）は疼痛性膀胱症候群（ｐａｉｎｆｕｌ ｂｌａｄｄｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）／間質性膀胱炎（ＰＢＳ／ＩＣ）の唯一のＦＤＡ承認された膀胱内治療薬であり、抗炎症性および肥満細胞安定効果を有すると考えられている（非特許文献２）。しかし、ＤＭＳＯの成功率は一般に控えめである。膀胱上皮は、主に、有毒な尿廃棄物の不透過性を維持するため、表面グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）層の存在および細胞間接触（すなわち、接着結合）の構造完全性に依存する（非特許文献３）。この障壁が損傷すると、尿成分が下部の膀胱層に漏れて、膀胱における刺激性の変化を開始し、それにより、知覚神経線維を刺激し、疼痛、尿意促迫、および頻尿症状（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｙｍｐｔｏｍ）を生じる（非特許文献４）。尿路上皮およびＧＡＧはまた、有効な膀胱内薬物送達に有意な障壁を示す。
【０００５】
米国の男性および女性の１７％が過活動膀胱（ＯＡＢ）を罹患し、その発生数は加齢と共に上昇し、その経済的負担は１６４０億ドルと見積もられていることがさらにより重要である。多くの専門家は、２５％のＯＡＢ患者が医学療法を求めていると考えている。伝統的に、治療を求める４００万人のＯＡＢ患者の２５％が経口薬物療法に失敗し、治療抵抗性ＯＡＢのための療法を求めていると見積もられている。
【０００６】
この数年間で、ＯＡＢのための、いくつかの新規の抗ムスカリン薬物および改善された処方物が出現している。２００８年に６つのＯＡＢ抗ムスカリン薬がＦＤＡで承認され、全世界での年間販売額は２０億ドルである。しかし、有効性が限られていることや有害作用（口内乾燥、便秘、および認知機能障害など）により、抗ムスカリン療法を継続している患者は２０％未満である。抗ムスカリン治療抵抗性患者のための第２選択療法としてしばしば実施される２つの手順は、ＦＤＡ承認された仙骨神経刺激（ＳＮＳ）（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｍ，Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．）および治療抵抗性ＯＡＢのための第ＩＩ相ＦＤＡ試験にあるＢｏＮＴの排尿筋内注射である（Ｂｏｔｏｘ，Ａｌｌｅｒｇａｎ Ｉｎｃ．，）。ボツリヌス毒素が投与されるいくつかの臨床試験が現在行われている。ボツリヌス毒素は治療抵抗性過活動膀胱（ＯＡＢ）を治療するのに役立つことが示されているが、膀胱壁への毒素の直接注射に膀胱鏡的手順が必要である。毒素を膀胱排尿筋に導入するので、膀胱収縮性が脆弱になる可能性があり、４３％までの患者が尿閉を発症し得る。
【０００７】
医薬品業界はまた、間質性膀胱炎に関連する尿意逼迫および頻尿の治療法の開発に高い関心を示している。ごく最近に、これらの療法には、カルメット・ゲラン杆菌（ＢＣＧ）、レシニフェラトキシン（ＲＴＸ）、ヒアルロン酸（Ｃｙｓｔｉｓｔａｔ）、ヒアルロン酸ナトリウム（ＳＩ−７２０１）、および仙骨神経刺激デバイスが含まれていた。
【０００８】
針注射を必要とせずにボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）を簡潔に点滴注入することができる必要がある。さらに、貯留および／または膀胱の筋力低下を引き起こすことなく下部尿路症状を改善するのに役立ち得るより低い濃度でＢｏＮＴを膀胱尿路上皮内層および感覚神経終末に送達させる必要がある。
【０００９】
他の泌尿器科学的様態（尿路感染症および膀胱癌など）において膀胱内での薬物接触時間がより長い局在化膀胱内薬物送達も必要である。
【００１０】
膀胱機能障害のための持続性薬物送達系は市販されていない。薬物放出を持続させるために薬物を有するバルーンリザーバまたはマトリックス材料を膀胱に配置する試みが他の者によってなされてきたが、これらの機械的方法は刺激（痛み）を生じ、そのサイズおよび形状による膀胱頸部出口の封鎖によって閉塞を生じ得る。
【００１１】
膀胱内ＢｏＮＴ点滴注入は、臨床経験不足により、今のところ成功していない。膀胱におけるＢｏＮＴ点滴注入による有効性の欠如の根底にある考えられる理由には、尿中プロテアーゼによる分解、尿中での希釈、または膀胱内腔に点滴注入されたＢｏＮＴ溶液からの尿路上皮への取り込みの不足が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｐａｒｋｉｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ（１９９７）４９，１０５−７
【非特許文献２】ＳｕｎおよびＣｈａｉ，ＢＪＵ Ｉｎｔ（２００２）９０，３８１−５
【非特許文献３】Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２０８，６０５−７
【非特許文献４】Ｌａｖｅｌｌｅら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００２）２８３，Ｆ２４２−５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、ＯＡＢおよび他の膀胱障害の治療のための膀胱への点滴注入による薬物送達のための方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
膀胱刺激および頻度の低下によって下部尿路症状の改善に役立てるための膀胱内薬物送達、具体的には、ＢｏＮＴの送達のためにリポソームを使用する。この系は、注射より低く且つより安全な用量のＢｏＮＴを使用し、尿閉リスクがより低い。
【００１５】
膀胱への液体処方物としてのリポソーム−ＢｏＮＴ（３０〜６０ｍｌの典型的な体積）の簡潔な点滴注入により、ＢｏＮＴの膀胱鏡的（ｃｙｓｔｓｃｏｐｉｃ）針注射で現在達成されている有効性に類似の有効性が達成される。用量を注射によって得られる用量より低くすることができ、それにより、尿閉リスクが有意に軽減される。リポソーム−ＢｏＮＴは、ＢｏＮＴを膀胱中および尿中での分解から保護することができる。
【００１６】
例により、処方物の有効性を証明する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．リポソーム−薬物処方物
リポソームカプセル化により、点滴注入後の低吸収の問題が解決されるはずである。ＢｏＮＴのリポソームカプセル化により、尿中での分解からＢｏＮＴを保護することができ、膀胱表面へのリポソーム接着からの尿路上皮を横切っての制限の無い吸収が可能である。ＢｏＮＴがリポソームの内側に捕捉されるので、尿による希釈に対して脆弱でなく、リポソーム表面でのＢｏＮＴの局在化濃度は、膀胱内腔表面へのリポソーム接着からの浸出ＢｏＮＴの侵入を促進するのに十分に高濃度であり得る。
【００１８】
Ａ．リポソーム
リポソーム（ＬＰ）は、水性区画によって分離された同心円状のリン脂質二重層から構成される球状の小胞である。ＬＰは、細胞表面に接着してその表面上に分子膜を作製するという特徴を有する。リポソームは、水性内部を取り囲んだ同心円状のリン脂質二重層から構成された脂質小胞である（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ３００，１２５−３０ ２００５；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ａｎｄ Ｒｙｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １２４，５８Ｐ（１９７１））。脂質小胞は、１つ（単層）またはいくつか（多重層）のリン脂質二重層のいずれかによって描写される１つまたはいくつかの水性区画のいずれかを含む（Ｓａｐｒａら、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ２，３６９−８１（２００５））。臨床でのリポソームの成功は、その処方物中で使用される脂質の非毒性に起因している。リポソームの脂質二重層および水性内部コアは共に治療という目的に適う。リポソームは、より低い用量でその有効性を増強するための毒素のキャリアとして十分に研究されている（Ａｌａｍら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１２，９７−１０７ １９９２；Ｃｈａｉｍ−Ｍａｔｙａｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １７（Ｐｔ １），３１−６ １９９３；ｄｅ Ｐａｉｖａ ａｎｄ Ｄｏｌｌｙ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２７７，１７１−４（１９９０）；Ｆｒｅｉｔａｓ ａｎｄ Ｆｒｅｚａｒｄ，Ｔｏｘｉｃｏｎ ３５，９１−１００（１９９７）；Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５６３，７−１７（２００２））。
【００１９】
リポソームは、細胞および組織の表面上に分子膜を形成する能力を有し、現在、創傷治癒および代用涙液として眼乾燥症治癒を促進するための可能な治療薬として試験されている。臨床研究により、局所治療薬としてのリポソームの有効性が証明されている（Ｄａｕｓｃｈら、Ｋｌｉｎ Ｍｏｎａｔｓｂｌ Ａｕｇｅｎｈｅｉｌｋｄ ２２３，９７４−８３（２００６）；Ｌｅｅら、Ｋｌｉｎ Ｍｏｎａｔｓｂｌ Ａｕｇｅｎｈｅｉｌｋｄ ２２１，８２５−３６（２００４））。リポソームはまた、眼科学において角膜炎、角膜移植片拒絶、ブドウ膜炎、眼内炎、および増殖性硝子体網膜症を改善するために使用されている（Ｅｂｒａｈｉｍら、２００５；Ｌｉら、２００７）。
【００２０】
リポソームは、種々の化学療法薬のための薬物キャリアとして広く研究されている（この研究対象について約２５，０００報の科学論文が発表されている）（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２９５，７６５−７０（１９７６）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ３００，１２５−３０（２００５））。水溶性抗癌物質（ドキソルビシンなど）をリン脂質二重層によって区切られたリポソームの水性区画の内部で保護することができるのに対して、脂溶性物質（アンホテリシンおよびカプサイシンなど）をリン脂質二重層に組み込むことができる（Ａｂｏｕｌ−Ｆａｄｌ，Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １２，２１９３−２１４（２００５）；Ｔｙａｇｉら、Ｊ Ｕｒｏｌ １７１，４８３−９（２００４））。シクロスポリンの局所および硝子体送達は、リポソームを使用して劇的に改良された（Ｌａｌｌｅｍａｎｄら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ５６，３０７−１８ ２００３）。化学療法薬の送達により、薬物動態が改善され、毒性プロフィールが軽減される（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３，５２７−３７（１９９５）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４５，７１−４ １９７４；Ｓａｐｒａら、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ２，３６９−８１（２００５））。１０種を超えるリポソーム処方物および脂質ベースの処方物が規制当局によって承認されており、多数のリポソーム薬が前臨床開発段階または臨床試験段階にある（Ｂａｒｎｅｓ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ７，６０７−１５（２００６）；Ｍｉｎｋｏら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ６，５３７−５２（２００６））。Ｆｒａｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，２００３；６１：６５６−６６３により、リポソームの膀胱内点滴注入が、硫酸プロタミンでの尿路上皮の破壊およびその後のＫＣｌでの膀胱の刺激によって誘導されたラット活動亢進膀胱モデルにおいて機能障害性尿路上皮のバリア特性を増強し、高排尿頻度を部分的に逆転することを証明した。Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｕｒｏｌ．，２００４；１７１；４８３−４８９は、リポソームが３０％エタノールと比較してビヒクル誘導性炎症が低いカプサイシンの膀胱内投与のための優れたビヒクルであると報告した。リポソームの急性、亜慢性、および慢性の毒性に関する安全データは、何千人もの患者についてのリポソームの膨大な臨床使用経験から得られている。意図する臨床経路のためのリポソームの安全な使用はまた、患者における抗癌薬のためのビヒクルとしてのその広範な使用によって支持されている。
【００２１】
Ｂ．点滴注入のためのボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）および他の薬物
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍによって産生されるボツリヌス神経毒は、ヒトに対して公知の最も強力な生物毒素と見なされている（Ｓｍｉｔｈ＆Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ，Ｊ Ｕｒｏｌ，１７１：２１２８（２００４）。ＢｏＮＴは、筋肉の過剰な収縮を伴う種々の状態に有効に使用されている。７つの免疫学的に異なる神経毒（Ａ型〜Ｇ型）のうち、ＢｏＮＴ−Ａは、最も一般的に臨床的に使用されているボツリヌス毒素である。この数年間で、ＢｏＮＴ−ＡおよびＢｏＮＴ−Ｂは、複数の部位への排尿筋内ＢｏＮＴ−Ａ注射を使用して神経性膀胱活動亢進を有する脊髄損傷患者の治療で首尾よく使用されている（Ｓｃｈｕｒｃｈら、２０００）。
【００２２】
Ａｃｈおよびノルエピネフリン放出阻害に及ぼす影響：ＢｏＮＴは、神経筋接合部でのＡｃｈ放出および自律神経伝達の阻害によって効果を発揮することが知られている。ＢｏＮＴの筋肉内注射後、骨格筋および平滑筋において一過性の化学的除神経（ｃｈｅｍｏｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ）および筋弛緩が起こり得る（Ｃｈｕａｎｇ ＆ Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ，Ｊ Ｕｒｏｌ．１７６（６ Ｐｔ １）：２３７５−８２（２００６））。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｕｒｏｌ，１６９：１８９６（２００３））は、ラット近位尿道括約筋へのＢｏＮＴ注射によって高電場刺激で標識されたノルエピネフリンが劇的に減少したが、低電場刺激では減少しないことが見出され、ＢｏＮＴが自律神経終末でのノルエピネフリン放出を阻害することを示す。
【００２３】
知覚機構阻害に及ぼす影響：ＢｏＮＴが膀胱における求心性神経伝達も阻害するという概念を支持する証拠が増加しつつある（Ｃｈｕａｎｇら、Ｊ Ｕｒｏｌ １７２，１５２９−３２（２００４）；Ｋｈｅｒａら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ，４５：９８７（２００４））。痛みの感覚のメディエーターである神経ペプチド，グルタミン酸塩、およびアデノシン三リン酸の放出を阻害することが示されている（Ｃｕｉら、Ｐａｉｎ，１０７：１２５（２００４））。類似の影響が酢酸誘導性膀胱過活動モデルで認められた。ＢｏＮＴの排尿筋内注射後の尿意促迫の減少に関連する尿路上皮下神経線維中の感覚受容器Ｐ２Ｘ３および一過性受容器電位バニロイド１（ＴＲＰＶ１）受容体レベルの減少がヒト排尿筋過活動で認められている（Ａｐｏｓｔｏｌｉｄｉｓら、Ｊ Ｕｒｏｌ，１７４：９７７ ２００５）。
【００２４】
ＢｏＮＴの標的タンパク質は、脂質環境下で存在する膜内在性タンパク質である。リポソームは、尿路上皮により強い接着させることによってメタロプロテアーゼ（ＢｏＮＴなど）の活性を増強することができる。膀胱鏡ガイド注射は、膀胱にＢｏＮＴを投与するためのクリニックにおける現在の標準的な手順である。ここ数年、膀胱刺激の動物モデルにおけるＢｏＮＴの膀胱内点滴注入の可能性について評価する研究が行われている（Ｋｈｅｒａら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ６６，２０８−１２（２００５））。この論文中の以前の報告により、ＶＡＭＰに特異的なＢｏＮＴの金属タンパク質分解活性が脂質膜の存在によって強く増強されることが示唆される。この効果は、これらの神経毒が単離されたＶＡＭＰ分子よりも脂質小胞内に挿入されたＶＡＭＰおよびニューロン中のＶＡＭＰに対して活性が高いという事実を説明している。この脂質増強効果は、脂質によって起こる。この研究は、ＢｏＮＴ点滴注入のための送達ビヒクルとしてのリポソーム使用が合理的であることを強く支持している。
【００２５】
膀胱に点滴注入することができる他の薬物を、特に局所送達によって回避される全身性副作用を有する者にリポソーム送達系を使用して送達させることもできる。
【００２６】
開示のリポソーム送達系を使用して送達させることができる適切な薬物または活性薬剤には、癌治療薬、免疫調節薬、鎮痛薬、抗炎症薬、抗ヒスタミン薬、エンドルフィン、プロスタグランジン、カナボイドＴＲＰ受容体、ペプチド、タンパク質、および抗体、プラスミド、裸のＤＮＡ、ウイルスベクター、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アミノ酸；ヒアルロン酸；ペントサンポリ硫酸ナトリウム、β３受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、グレリン受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに局所麻酔薬（リドカインなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
例示的癌治療薬には、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ビンクリスチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビノレルビン、ビンデシン、タキソールおよびその誘導体、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスファート、テニポシド、エピポドフィロトキシン、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、セツキシマブ、およびリツキシマブ（リツキサン（登録商標）またはＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、ならびにその組み合わせが含まれる。
【００２８】
例示的免疫調節薬には、インターフェロンおよびカルメット・ゲラン桿菌が含まれる。
【００２９】
開示の薬物送達組成物を使用して、間質性膀胱炎、疼痛性膀胱症候群、過活動膀胱、膀胱癌、前立腺癌、および細菌、真菌、またはウイルスに起因する尿路感染の治療に適切な薬物を送達させることもできる。
【００３０】
ＩＩ．製造方法
リポソームの製造：
リポソームの製造方法は、上記で引用した論文に記載されており、且つ周知である。
【００３１】
１つの実施形態では、水性リポソーム懸濁液を顕微溶液化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によって生成する。最終生成物は、一連の安定性問題（凝集、融合、およびリン脂質加水分解など）に供され得る（Ｎｏｕｎｏｕら、Ａｃｔａ Ｐｏｌ Ｐｈａｒｍ ６２，３８１−９１（２００５））。
【００３２】
リポソーム生成物は、その臨床的利点が実現される前に適切な化学的および物理的な安定性を持たなければならない（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５８，１５３２−５５（２００６））。好ましい実施形態では、脱水リポソームをｔｅｒｔ−ブチルアルコール（ＴＢＡ）／水共溶媒系中のリン脂質の均一な分散液から形成する。リポソームの等方性単相性溶液を凍結乾燥させて、滅菌バイアル中に脱水リポソーム粉末を生成する。凍結乾燥工程により、バイアルからの水およびＴＢＡの除去後に空の脂質小胞または脱水リポソームが得られる。生理学的食塩水の添加の際、凍結乾燥生成物は均一なリポソーム調製物を自発的に形成する（Ａｍｓｅｌｅｍら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ７９，１０４５−５２（１９９０）；Ｏｚｔｕｒｋら、Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ５５３，２３１−４２（２００４））。脂質／ＴＢＡ比が得られたリポソーム調製物のサイズおよび多分散性に影響を及ぼす主な要因であるので、低脂質濃度は本方法に理想的に役立つ。
【００３３】
リポソームＢｏＮＴの調製：
好ましい実施形態では、リポソームＢｏＮＴ（「ＬＰＡ−０８」）を、少し修正した脱水−再水化法によって調製する。前の工程で調製されたリポソームを、３７℃の注射用蒸留水中のＢｏＮＴの溶液（５０単位／ｍｌ）で水和する。次いで、水浴を使用して混合物を３７℃で２時間インキュベートして、オリゴラメラ水和リポソームを形成する。マンニトールを、０．５％、１％、２．５％、および５％マンニトール（ｗ／ｖ）の濃度で最終混合物にそれぞれ添加し、その後にアセトン−ドライアイス浴中で凍結させる。マンニトールは、凍結乾燥過程における抗凍結剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として作用する。凍結混合物を、−４０℃および５ミリバールで一晩凍結乾燥させる。凍結乾燥させたケーキを生理食塩水で所望のＢｏＮＴ最終濃度に再懸濁する。超遠心分離器を使用した１２，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって遊離ＢｏＮＴを捕捉ＢｏＮＴから除去する。３回の洗浄後、沈殿を生理食塩水に再懸濁する。
【００３４】
強力な細菌毒素のリポソームへの処方には、極めて注意深いアプローチが必要である。ＢｏＮＴを、リポソーム製造で一般に使用される有機溶媒に曝露することができない。薄層水和法および液体ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を使用して実施例を行った。簡潔に述べれば、ＤＰＰＣのクロロホルム溶液を、丸底フラスコ中にて窒素細流下で最初に蒸発させた。脂質薄膜を真空下で一晩乾燥させた。次いで、乾燥させた脂質をＢｏＮＴ水溶液で水和した。
【００３５】
以下の実施例２で証明されるように、ＢｏＮＴ／脂質比の慎重な制御によって最適な結果が得られる。本研究によって証明されるように、最適な比および脂質組成を、日常的な実験を使用して決定することができる。
【００３６】
ＩＩＩ．リポソームＢｏＮＴ送達
リポソーム−ＢｏＮＴの点滴注入は、膀胱鏡的ＢｏＮＴ注射に精通し、且つ認定を受けた医師に制限される別の方法よりも患者にとって快適であり、より多数の医院にこの治療形態を提供することが可能である。ＢｏＮＴは巨大分子であり、細胞層を貫通して筋肉および神経終末に到達しない。リポソームを使用しないＢｏＮＴの点滴注入には、別の方法で膀胱内層を損傷し得る腐食剤（プロタミンなど）が必要であろう。これはＦＤＡによって承認されておらず、膀胱の痛みおよび損傷を引き起こし得る。ＢｏＮＴの点滴注入は、治療抵抗性過活動膀胱患者の治療費を下げることができる。異なる研究所から報告された種々の研究は、膀胱刺激の動物モデルにおけるＢｏＮＴの膀胱内点滴注入の可能性を評価している（Ｃｈｕａｎｇら、２００４；Ｋｈｅｒａら、２００５）。しかし、ＢｏＮＴの膀胱内点滴注入は、臨床経験不足により成功していない。リポソームカプセル化により、点滴注入後の低吸収の問題が解決される。ＢｏＮＴがリポソームの内側に捕捉されるので、尿による希釈に対して脆弱でなく、リポソーム表面でのＢｏＮＴの局在化濃度は、膀胱表面上のリポソーム接着からの浸出ＢｏＮＴの受動拡散を促進するのに十分に高濃度である。リポソームの脂質関門はまた、膀胱によって吸収される前に尿中のプロテアーゼおよびプロテイナーゼがＢｏＮＴに接近してＢｏＮＴが切断されるのを防止することができる。
【００３７】
点滴注入方法は公知である。例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｉａら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８，７６０−８（２００１）；Ｎｏｇａｗａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１５，９７８−８５（２００５）；Ｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３９１，３０４−１３ ２００５；Ｔｙａｇｉら、Ｊ Ｕｒｏｌ １７１，４８３−９（２００４）；Ｔｒｅｖｉｓａｎｉら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３０９，１１６７−７３（２００４）；Ｔｒｅｖｉｓａｎｉら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５，５４６−５１（２００２））；（Ｓｅｇａｌら、１９７５）．（Ｄｙｓｏｎら、２００５）．（Ｂａｔｉｓｔａら、２００５；Ｄｙｓｏｎら、２００５）を参照のこと。
【００３８】
以下の実施例１で証明されるように、リポソーム−ＢｏＮＴの体積は、送達有効性において重要である。日常的実験を使用して、送達体積を最適にすることができる。
【００３９】
開示のリポソームを使用して、他の部位（尿路（尿道、膀胱、尿管、腎内収集系（ｉｎｔｒａｒｅｎａｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）が含まれる）など）、婦人科学的部位（膣、子宮、ファロピウス管など）、胃腸管部位（口腔、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門が含まれる）、および外耳または内耳、皮膚、鼻に治療薬を点滴注入することもできる。
【００４０】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解されるであろう。
【実施例】
【００４１】
実施例１：点滴注入後のリポソームＢｏＮＴの吸収に及ぼす膀胱膨満の影響
材料と方法
点滴注入後のリポソームＢｏＮＴの吸収に及ぼす膀胱膨満の影響を、漸増体積での同一用量のリポソームＢｏＮＴの点滴注入によって決定した。同一組成の脂質およびＢｏＮＴ（各ＢｏＮＴ単位について０．５ｍｇの脂質）を使用して作製したリポソームを異なる点滴注入体積（０．５、０．５５、０．６ｍｌ）で使用してラットに点滴注入した。リポソームを、ハロタン麻酔下にて滞留時間３０分でラット膀胱に点滴注入した。次いで、動物を回復させ、飼料および水を与え、ケージに収容した。ウレタン麻酔下（用量１．０ｇ／ｋｇ体重）で２４時間後、０．０４ｍｌ／分の速度での生理食塩水の注入によって、治療ラットに対して経尿道開放膀胱内圧測定を行った。正常なベースラインが１時間得られた後、生理食塩水中の酢酸（０．２５％）を注入して膀胱刺激を誘導した。異なる体積の点滴注入を使用したＢｏＮＴ処置の７日後、ウレタン麻酔下での継続的な経尿道膀胱内圧測定によって膀胱膨満の影響を評価した。
【００４２】
結果
標準体積０．５ｍｌを点滴注入したラットは、０．０８ｍｌ／分の速度での生理食塩水の一定の注入によって誘導された排尿反射に関する規則的なＣＭＧを示した。しかし、同用量のリポソームＢｏＮＴを含む１０〜２０％高い体積の点滴注入（０．５５ｍｌまたは０．６ｍｌの点滴注入）を使用して注入したラットは、生理食塩水での膀胱内圧測定下で溢流の自制（ｏｖｅｒｆｌｏｗ ｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ）の特徴を示した。
【００４３】
低体積の点滴注入は尿路上皮のみに対するＢｏＮＴの影響を制限するが、１０〜２０％の点滴注入体積の増加によって吸収に対する障壁が劇的に減少され、点滴注入後にＢｏＮＴを排尿筋に到達させることが可能である。高体積のリポソームＢｏＮＴを点滴注入したラットは、覚醒状態での尿閉および麻酔状態下での溢流性尿失禁を示した。これは、反射性排尿の強い抑制を示している。麻酔状態下での溢流性尿失禁が排尿反射の求心路（ａｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｍ）に作用する薬物の望ましい特徴を反映するということに留意することは興味深いことである。麻酔条件下での溢流性尿失禁は、覚醒状態での求心性入力の減少と言い換えられる。
【００４４】
ＢｏＮＴは分子量１５０ｋＤの巨大分子であるので、拡散の大部分を吸収機構から除外することができる。エンドサイトーシスは、より可能性の高い膀胱吸収機構である。以前の研究により、尿路上皮のアンブレラ細胞のエンドサイトーシスが静水圧などの外部刺激と共に増加することが示されている。膀胱充填中のエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスの比は、正味の影響が膜に付加され、膀胱伸長に適応するために尿路上皮の表面積が増加するような比である。したがって、ＢｏＮＴの膀胱取り込みを改善するための膀胱伸長後のエンドサイトーシス活性がより高いと予想される。
【００４５】
実施例２：脂質のＢｏＮＴに対する比率の影響
ＢｏＮＴの最適な有効性のために、脂質および毒素は最適な比率でなければならない。
【００４６】
材料と方法
ＢｏＮＴ比を固定したままで脂質比を変化させてリポソームＢｏＮＴを調製した。例えば、ハロタン麻酔下にて、２５ＩＵのＢｏＮＴから開始して、同一組成の脂質およびＢｏＮＴ（各ＢｏＮＴ単位について０．５ｍｇの脂質）を使用して作製したリポソームを異なる体積で使用してラットに点滴注入した。ＢｏＮＴの膀胱内用量を一定に保持し、脂質濃度を変化させて至適な毒素：脂質比を決定した。リポソームＢｏＮＴの有効性を、生理食塩水中の遊離ＢｏＮＴと比較した。点滴注入から７日後の酢酸誘導した膀胱刺激を鈍化させる能力を、ハロタン麻酔ラットで試験した。点滴注入と有効性評価との間の７日間の間隔を、公開された研究に基づいて選択した（Ｃｈｕａｎｇら、２００４）。
【００４７】
結果
最適な毒素／脂質比１：０．５は、膀胱内点滴注入後のＢｏＮＴの有効性の増強に有効である。より高い脂質比で有効性が低下するのは、多重層リポソームからのＢｏＮＴの放出が非常に遅く、それにより、膀胱へのＢｏＮＴ取り込みが有効ではなくなることに起因し得る。
【００４８】
実施例３：ラットの酢酸誘導性膀胱活動亢進における膀胱内ＢｏＮＴ−Ａリポソーム送達の尿力学的効果および免疫組織化学的効果の評価
材料と方法
リポソーム（ＬＰ）、ボツリヌス毒素Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）、およびリポトキシン（ＬＰ＋ＢｏＮＴ−Ａ）の調製：ＬＰ（１０ｍｇ、リポイド）を生理食塩水（１ｍｌ）中に分散させた。この分散液はリポソーム形態である。ＢｏＮＴ−Ａを生理食塩水に溶解した（１ｍｌ、生理食塩水中２０ｕ／ｍｌ，Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）。ＢｏＮＴ−Ａをカプセル化したＬＰ（リポトキシンと呼ばれる）を、２０単位のＢｏＮＴ−Ａを１０ｍｇのＬＰ分散液（１ｍｌ）にロードする修正した脱水−再水和小胞法によって調製した（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ １９，１５６−６２ １９９９）。異なる動物群でＢｏＮＴ−Ａの用量を同一に保持した。
【００４９】
膀胱内圧測定図（ＣＭＧ）：全実験手順を雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２２０〜２８０ｇｍ）に対して行い、この手順は、研究開始前にＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって再調査および承認されていた。動物を、ウレタン（１．２ｇ／ｋｇ）の皮下注射によって麻酔した。ＰＥ−５０管を尿道を介して膀胱に挿入し、三方止め栓を介して圧トランスデューサーならびに膀胱内圧の記録および膀胱への溶液の注入のためのシリンジポンプに接続した。１日目に、反復排尿を誘発するための生理食塩水（０．０８ｍｌ／分）での膀胱の充填によってコントロールＣＭＧを行った。反射膀胱収縮の振幅、圧力閾値（ＰＴ）、圧力ベースライン（ＰＢ）、および収縮間隔（ＩＣＩ）を記録した。各動物における測定値を、３〜５つの膀胱収縮の平均で示した。
【００５０】
８日目に、生理食塩水注入中にベースライン測定値を確立した後、膀胱に０．３％酢酸（ＡＡ）を０．０８ｍｌ／分で注入して膀胱活動亢進を急性的に促進させた。注入３０分後に３〜５つの膀胱収縮を測定した。
【００５１】
薬物の点滴注入：ベースラインＣＭＧの１日後、ＰＥ−５０管（Ｃｌａｙ−Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）を、結紮糸によってハロタン麻酔下で尿道口周囲の適所に結紮した。膀胱の尿を空にし、ＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、またはリポトキシンをカテーテルによって１時間充填した。
【００５２】
経心臓的灌流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）：ＣＭＧ研究の８日後、いくつかの動物（各群あたりＮ＝６）を深く麻酔し、最初にクレブス緩衝液を使用し、その後に４％パラホルムアルデヒド固定液を使用する経心臓的灌流によって屠殺した。次いで、動物を解剖して膀胱を採取した。
【００５３】
組織学：組織学のために膀胱組織をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで４時間固定し、次いで、ＰＢＳ中の３０％スクロースで一晩置いた。組織学用のサンプルをパラフィンに包埋し、厚さ１０μｍの切片に切断し、Ｈ＆Ｅで染色した。ＡＡ誘導性炎症反応を、以下のように０〜３のスコアによって格付けした：０、炎症細胞浸潤や間質性浮腫の証拠無し；１、軽度（炎症細胞浸潤がほとんどなく、かつわずかな間質性浮腫）；２、中等度（中程度の炎症細胞浸潤および中程度の間質性浮腫あり）；３、重症（大量の炎症細胞浸潤および重症間質性浮腫が拡散して存在する）。
【００５４】
ＣＧＲＰおよびＳＮＡＰ−２５の免疫蛍光顕微鏡法：あるいは、サンプルを凍結し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ封入剤（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）中にマウントし、厚さ１０μｍの長手方向の切片をクリオスタット上で切断し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔスライド上にマウントした。アセトン中での１５分間の浸漬によって切片を固定し、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中０．３％Ｈ２Ｏ２溶液中でスライドを１０分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。ＰＢＳでのさらなる洗浄後、切片をＩｍａｇｅ−ｉＴＴＷ固定シグナルエンハンサー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１時間インキュベートした。ＣＧＲＰ免疫染色のために、次いで、スライドをヤギ抗ＣＧＲＰポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，１：５０希釈）にて＋４℃で４８時間染色した。翌日、切片をＰＢＳで洗浄し、ロバ抗ヤギＩｇＧ ＦＩＴＣ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，１：２０００希釈）と１時間インキュベートした。切片を洗浄し、ＳｌｏｗＦａｄｅ ａｎｔｉｆａｄｅ ｇｏｌｄ ｒｅａｇｅｎｔ（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマウントした。ＳＮＡＰ−２５免疫染色のために、次いで、スライドをマウス抗ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体（ＡｂＤ，ＮＣ，ＵＳＡ，１：２０００希釈）にて＋４℃で一晩染色した。翌日、切片をＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１：２０００希釈）と１時間インキュベートした。筋線維を検出するために、切片をテトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）標識ファロイジン（Ｓｉｇｍａ，１：２０００希釈）で対比染色し、洗浄し、ＳｌｏｗＦａｄｅ ａｎｔｉｆａｄｅ ｇｏｌｄ ｒｅａｇｅｎｔ（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマウントした。スライドを蛍光顕微鏡で試験して画像を記録した。
【００５５】
ＳＮＡＰ−２５発現のウェスタンブロット分析：いくつかの動物（各群あたりＮ＝６）を深く麻酔し、経心臓的灌流を使用せずに屠殺した。標準的プロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にしたがって、ＳＮＡＰ−２５発現のウェスタンブロット分析のための膀胱を取り出した。サンプルをタンパク質抽出溶液（Ｔ−ＰＥＲ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中でホモジナイズし、その後に超音波処理および精製を行った。総タンパク質量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して測定した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、Ｌａｅｍｍｌｉの緩衝液系を使用して行った。簡潔に述べれば、３０μｇタンパク質に等しい抽出物のアリコートを８％ポリアクリルアミドゲル上にロードし、１００Ｖの定電圧で１時間電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。膜をブロッキング剤でブロッキングし、次いで、マウス抗ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体（ＡｂＤ，ＮＣ，ＵＳＡ，１：５００希釈）およびマウス抗β−アクチンモノクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ，１：２０００希釈）を使用して＋４℃で一晩免疫ブロッティングした。洗浄後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギまたは抗マウス免疫グロブリンＧを使用して、ＴＢＳ中の５％脱脂粉乳を使用した二次抗体と室温で２時間インキュベートした。ウェスタンブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって視覚化した。内部コントロールとしてβ−アクチン量も検出した。ＬａｂＷｏｒｋｓ画像収集および分析ソフトウェアを使用して、定量分析を行った。
【００５６】
統計分析：定量的データを、平均±平均の標準誤差として示す。ボンフェローニ事後試験（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）を使用した一元置換ＡＮＯＶＡまたはダンの事後試験（Ｄｕｎｎ’ｓ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）を使用したクラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）を使用して統計分析（適用可能な場合）を行った。ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【００５７】
結果
ＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、およびリポトキシン前処置に対するＣＭＧ応答：
１日目の膀胱内への生理食塩水の点滴注入の間のＬＰ群（コントロール群）、ＢｏＮＴ−Ａ群、およびリポトキシン群におけるＣＭＧパラメータは、８日目とそれほど相違しなかった。これらの結果は、正常条件下での８日目の膀胱機能がＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、およびリポトキシンの前処置の影響を受けなかったことを示す。８日目に、注入開始から２０〜３０分後に酢酸の刺激作用が明らかになった。ＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群では、ＡＡの膀胱内点滴注入後に、それぞれ、収縮間隔（ＩＣＩ）が５７．２％および５６．０％有意に減少した。しかし、リポトキシン処置前に受容したラットは、ＡＡ点滴注入への応答が有意に減少した（ＩＣＩ２１．１％減少）。これらの結果は、リポトキシン前処置によってＡＡ誘導性膀胱過活動が抑制され、この作用が同用量のＢｏＮＴ−Ａ前処置群で認められなかったことを示す。
【００５８】
ＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、およびリポトキシン前処置に対する組織学的応答：ヘマトキシリン（ｈａｍａｔｏｘｙｌｉｎ）およびエオシンで染色した組織切片を組織病理学的評価によって決定したところ、ＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群においてＡＡ点滴注入によって中程度の炎症反応が誘導された。しかし、ＡＡ誘導性炎症反応は、リポトキシン前処置群で有意に減少した（総炎症スコアは、ＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群と比較してそれぞれ４８．９％および３３．３％減少した）。これらの結果は、リポトキシン前処置がＡＡ誘導性膀胱炎症を阻害することを示す。
【００５９】
ＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、およびリポトキシン前処置に対するＣＧＲＰ免疫染色：ＣＧＲＰ免疫染色がリポトキシン前処置群の膀胱粘膜層で確認された。これは、ＬＰ前処置群でもＢｏＮＴ−Ａ前処置群でも認められなかった。これらの結果により、リポトキシン前処置がＣＧＲＰ放出を阻害することが示唆される。
【００６０】
ＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、およびリポトキシン前処置におけるＳＮＡＰ−２５発現：ＳＮＡＰ−２５陽性ニューロン線維はＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置動物の膀胱サンプル中で検出された。しかし、ＳＮＡＰ−２５陽性ニューロン線維は、リポトキシン前処理動物で稀にしか認められなかった。ウェスタンブロッティングにより、平均ＳＮＡＰ−２５タンパク質レベルはＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群と比較してそれぞれ６６．４％および５８．１％減少することが証明された。これらの結果は、リポトキシン前処置によってＳＮＡＰ−２５発現が減少したことを示す。
【００６１】
結論：
ＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置ラットにおいて、ＡＡの膀胱内点滴注入後の収縮間隔（ＩＣＩ）がそれぞれ５７．２％および５６．０％減少した。しかし、リポトキシンを受容したラットは、ＡＡ点滴注入に対する応答が有意に減少した（ＩＣＩ２１．１％減少）。さらに、リポトキシン前処置ラットは、ＬＰまたはＢｏＮＴ−Ａ前処置ラットと比較して有意に炎症反応およびＳＮＡＰ−２５発現が減少し、ＣＧＲＰ免疫反応性が増加した。膀胱内リポトキシン投与により、ＳＮＡＰ−２５が切断され、求心性神経終末からのＣＧＲＰ放出が阻害され、ＡＡ誘導性活動亢進膀胱が遮断された。これらの結果は、注射を必要とせず、且つ排尿筋への影響が回避されるＢｏＮＴ−Ａ送達に有効なビヒクルとしてのＬＰを支持する。
【００６２】
本研究の主な所見は、この動物モデルにおいて膀胱内リポトキシン前処置によってＡＡ誘導性の膀胱活動亢進および炎症反応が抑制され、この作用はＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群で認められなかったことである。尿閉は認められなかった。さらに、このモデルにおいて、ＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群と比較してリポトキシン前処置群においてＳＮＡＰ−２５発現が有意に減少し、ＣＧＲＰが有意に増加した。膀胱内リポトキシン点滴注入により、尿閉を引き起こし得る注射を必要とせずにＢｏＮＴ−Ａのより簡潔で有効な送達方法を得ることができる。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、膀胱機能障害、特に、治療抵抗性過活動膀胱の治療分野にある。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
尿失禁（すなわち、膀胱機能障害）は、膀胱制御の喪失である。症状は、軽度の尿漏れ（ｌｅａｋｉｎｇ）から制御不可能な尿漏れ（ｗｅｔｔｉｎｇ）までの範囲であり得る。誰もが起こり得るが、加齢と共により一般的となる。ほとんどの膀胱制御の問題は、筋肉が脆弱過ぎるかまたは過活動である場合に起こる。膀胱を閉じたままにする筋肉が弱い場合、くしゃみをした時、笑った時、または重いものを持ち上げた時に尿が漏れ得る。これは緊張性失禁である。膀胱筋が過活動になると、膀胱中にほとんど尿が存在しない場合でも用を足す衝動に強く駆られる。これは切迫尿失禁または過活動膀胱である。前立腺の問題および神経損傷などの他の失禁原因が存在する。
【０００３】
治療は問題の型に依存する。これには、簡単な運動、薬物、医師によって処方された特別なデバイスもしくは手順、または手術が含まれ得る。
【０００４】
膀胱内療法は、長年にわたって治療の頼みの綱であった（非特許文献１）。膀胱内薬物療法は、膀胱中の局所薬物濃度が高く、全身性副作用のリスクが低いことを提供し、経口投与した薬剤の尿中排泄レベルが低いという問題が解決される。試験した標準的な点滴注入時間は３０分間であり、これには患者が優れた忍容性を示す。臨床的に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｒｉｍｓｏ−５０）は疼痛性膀胱症候群（ｐａｉｎｆｕｌ ｂｌａｄｄｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）／間質性膀胱炎（ＰＢＳ／ＩＣ）の唯一のＦＤＡ承認された膀胱内治療薬であり、抗炎症性および肥満細胞安定効果を有すると考えられている（非特許文献２）。しかし、ＤＭＳＯの成功率は一般に控えめである。膀胱上皮は、主に、有毒な尿廃棄物の不透過性を維持するため、表面グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）層の存在および細胞間接触（すなわち、接着結合）の構造完全性に依存する（非特許文献３）。この障壁が損傷すると、尿成分が下部の膀胱層に漏れて、膀胱における刺激性の変化を開始し、それにより、知覚神経線維を刺激し、疼痛、尿意促迫、および頻尿症状（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｙｍｐｔｏｍ）を生じる（非特許文献４）。尿路上皮およびＧＡＧはまた、有効な膀胱内薬物送達に有意な障壁を示す。
【０００５】
米国の男性および女性の１７％が過活動膀胱（ＯＡＢ）を罹患し、その発生数は加齢と共に上昇し、その経済的負担は１６４０億ドルと見積もられていることがさらにより重要である。多くの専門家は、２５％のＯＡＢ患者が医学療法を求めていると考えている。伝統的に、治療を求める４００万人のＯＡＢ患者の２５％が経口薬物療法に失敗し、治療抵抗性ＯＡＢのための療法を求めていると見積もられている。
【０００６】
この数年間で、ＯＡＢのための、いくつかの新規の抗ムスカリン薬物および改善された処方物が出現している。２００８年に６つのＯＡＢ抗ムスカリン薬がＦＤＡで承認され、全世界での年間販売額は２０億ドルである。しかし、有効性が限られていることや有害作用（口内乾燥、便秘、および認知機能障害など）により、抗ムスカリン療法を継続している患者は２０％未満である。抗ムスカリン治療抵抗性患者のための第２選択療法としてしばしば実施される２つの手順は、ＦＤＡ承認された仙骨神経刺激（ＳＮＳ）（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｍ，Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．）および治療抵抗性ＯＡＢのための第ＩＩ相ＦＤＡ試験にあるＢｏＮＴの排尿筋内注射である（Ｂｏｔｏｘ，Ａｌｌｅｒｇａｎ Ｉｎｃ．，）。ボツリヌス毒素が投与されるいくつかの臨床試験が現在行われている。ボツリヌス毒素は治療抵抗性過活動膀胱（ＯＡＢ）を治療するのに役立つことが示されているが、膀胱壁への毒素の直接注射に膀胱鏡的手順が必要である。毒素を膀胱排尿筋に導入するので、膀胱収縮性が脆弱になる可能性があり、４３％までの患者が尿閉を発症し得る。
【０００７】
医薬品業界はまた、間質性膀胱炎に関連する尿意逼迫および頻尿の治療法の開発に高い関心を示している。ごく最近に、これらの療法には、カルメット・ゲラン杆菌（ＢＣＧ）、レシニフェラトキシン（ＲＴＸ）、ヒアルロン酸（Ｃｙｓｔｉｓｔａｔ）、ヒアルロン酸ナトリウム（ＳＩ−７２０１）、および仙骨神経刺激デバイスが含まれていた。
【０００８】
針注射を必要とせずにボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）を簡潔に点滴注入することができる必要がある。さらに、貯留および／または膀胱の筋力低下を引き起こすことなく下部尿路症状を改善するのに役立ち得るより低い濃度でＢｏＮＴを膀胱尿路上皮内層および感覚神経終末に送達させる必要がある。
【０００９】
他の泌尿器科学的様態（尿路感染症および膀胱癌など）において膀胱内での薬物接触時間がより長い局在化膀胱内薬物送達も必要である。
【００１０】
膀胱機能障害のための持続性薬物送達系は市販されていない。薬物放出を持続させるために薬物を有するバルーンリザーバまたはマトリックス材料を膀胱に配置する試みが他の者によってなされてきたが、これらの機械的方法は刺激（痛み）を生じ、そのサイズおよび形状による膀胱頸部出口の封鎖によって閉塞を生じ得る。
【００１１】
膀胱内ＢｏＮＴ点滴注入は、臨床経験不足により、今のところ成功していない。膀胱におけるＢｏＮＴ点滴注入による有効性の欠如の根底にある考えられる理由には、尿中プロテアーゼによる分解、尿中での希釈、または膀胱内腔に点滴注入されたＢｏＮＴ溶液からの尿路上皮への取り込みの不足が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｐａｒｋｉｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ（１９９７）４９，１０５−７
【非特許文献２】ＳｕｎおよびＣｈａｉ，ＢＪＵ Ｉｎｔ（２００２）９０，３８１−５
【非特許文献３】Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２０８，６０５−７
【非特許文献４】Ｌａｖｅｌｌｅら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００２）２８３，Ｆ２４２−５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、ＯＡＢおよび他の膀胱障害の治療のための膀胱への点滴注入による薬物送達のための方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
膀胱刺激および頻度の低下によって下部尿路症状の改善に役立てるための膀胱内薬物送達、具体的には、ＢｏＮＴの送達のためにリポソームを使用する。この系は、注射より低く且つより安全な用量のＢｏＮＴを使用し、尿閉リスクがより低い。
【００１５】
膀胱への液体処方物としてのリポソーム−ＢｏＮＴ（３０〜６０ｍｌの典型的な体積）の簡潔な点滴注入により、ＢｏＮＴの膀胱鏡的（ｃｙｓｔｓｃｏｐｉｃ）針注射で現在達成されている有効性に類似の有効性が達成される。用量を注射によって得られる用量より低くすることができ、それにより、尿閉リスクが有意に軽減される。リポソーム−ＢｏＮＴは、ＢｏＮＴを膀胱中および尿中での分解から保護することができる。
【００１６】
例により、処方物の有効性を証明する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．リポソーム−薬物処方物
リポソームカプセル化により、点滴注入後の低吸収の問題が解決されるはずである。ＢｏＮＴのリポソームカプセル化により、尿中での分解からＢｏＮＴを保護することができ、膀胱表面へのリポソーム接着からの尿路上皮を横切っての制限の無い吸収が可能である。ＢｏＮＴがリポソームの内側に捕捉されるので、尿による希釈に対して脆弱でなく、リポソーム表面でのＢｏＮＴの局在化濃度は、膀胱内腔表面へのリポソーム接着からの浸出ＢｏＮＴの侵入を促進するのに十分に高濃度であり得る。
【００１８】
Ａ．リポソーム
リポソーム（ＬＰ）は、水性区画によって分離された同心円状のリン脂質二重層から構成される球状の小胞である。ＬＰは、細胞表面に接着してその表面上に分子膜を作製するという特徴を有する。リポソームは、水性内部を取り囲んだ同心円状のリン脂質二重層から構成された脂質小胞である（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ３００，１２５−３０ ２００５；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ａｎｄ Ｒｙｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １２４，５８Ｐ（１９７１））。脂質小胞は、１つ（単層）またはいくつか（多重層）のリン脂質二重層のいずれかによって描写される１つまたはいくつかの水性区画のいずれかを含む（Ｓａｐｒａら、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ２，３６９−８１（２００５））。臨床でのリポソームの成功は、その処方物中で使用される脂質の非毒性に起因している。リポソームの脂質二重層および水性内部コアは共に治療という目的に適う。リポソームは、より低い用量でその有効性を増強するための毒素のキャリアとして十分に研究されている（Ａｌａｍら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１２，９７−１０７ １９９２；Ｃｈａｉｍ−Ｍａｔｙａｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １７（Ｐｔ １），３１−６ １９９３；ｄｅ Ｐａｉｖａ ａｎｄ Ｄｏｌｌｙ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２７７，１７１−４（１９９０）；Ｆｒｅｉｔａｓ ａｎｄ Ｆｒｅｚａｒｄ，Ｔｏｘｉｃｏｎ ３５，９１−１００（１９９７）；Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５６３，７−１７（２００２））。
【００１９】
リポソームは、細胞および組織の表面上に分子膜を形成する能力を有し、現在、創傷治癒および代用涙液として眼乾燥症治癒を促進するための可能な治療薬として試験されている。臨床研究により、局所治療薬としてのリポソームの有効性が証明されている（Ｄａｕｓｃｈら、Ｋｌｉｎ Ｍｏｎａｔｓｂｌ Ａｕｇｅｎｈｅｉｌｋｄ ２２３，９７４−８３（２００６）；Ｌｅｅら、Ｋｌｉｎ Ｍｏｎａｔｓｂｌ Ａｕｇｅｎｈｅｉｌｋｄ ２２１，８２５−３６（２００４））。リポソームはまた、眼科学において角膜炎、角膜移植片拒絶、ブドウ膜炎、眼内炎、および増殖性硝子体網膜症を改善するために使用されている（Ｅｂｒａｈｉｍら、２００５；Ｌｉら、２００７）。
【００２０】
リポソームは、種々の化学療法薬のための薬物キャリアとして広く研究されている（この研究対象について約２５，０００報の科学論文が発表されている）（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２９５，７６５−７０（１９７６）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ３００，１２５−３０（２００５））。水溶性抗癌物質（ドキソルビシンなど）をリン脂質二重層によって区切られたリポソームの水性区画の内部で保護することができるのに対して、脂溶性物質（アンホテリシンおよびカプサイシンなど）をリン脂質二重層に組み込むことができる（Ａｂｏｕｌ−Ｆａｄｌ，Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １２，２１９３−２１４（２００５）；Ｔｙａｇｉら、Ｊ Ｕｒｏｌ １７１，４８３−９（２００４））。シクロスポリンの局所および硝子体送達は、リポソームを使用して劇的に改良された（Ｌａｌｌｅｍａｎｄら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ５６，３０７−１８ ２００３）。化学療法薬の送達により、薬物動態が改善され、毒性プロフィールが軽減される（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３，５２７−３７（１９９５）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４５，７１−４ １９７４；Ｓａｐｒａら、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ２，３６９−８１（２００５））。１０種を超えるリポソーム処方物および脂質ベースの処方物が規制当局によって承認されており、多数のリポソーム薬が前臨床開発段階または臨床試験段階にある（Ｂａｒｎｅｓ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ７，６０７−１５（２００６）；Ｍｉｎｋｏら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ６，５３７−５２（２００６））。Ｆｒａｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，２００３；６１：６５６−６６３により、リポソームの膀胱内点滴注入が、硫酸プロタミンでの尿路上皮の破壊およびその後のＫＣｌでの膀胱の刺激によって誘導されたラット活動亢進膀胱モデルにおいて機能障害性尿路上皮のバリア特性を増強し、高排尿頻度を部分的に逆転することを証明した。Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｕｒｏｌ．，２００４；１７１；４８３−４８９は、リポソームが３０％エタノールと比較してビヒクル誘導性炎症が低いカプサイシンの膀胱内投与のための優れたビヒクルであると報告した。リポソームの急性、亜慢性、および慢性の毒性に関する安全データは、何千人もの患者についてのリポソームの膨大な臨床使用経験から得られている。意図する臨床経路のためのリポソームの安全な使用はまた、患者における抗癌薬のためのビヒクルとしてのその広範な使用によって支持されている。
【００２１】
Ｂ．点滴注入のためのボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）および他の薬物
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍによって産生されるボツリヌス神経毒は、ヒトに対して公知の最も強力な生物毒素と見なされている（Ｓｍｉｔｈ＆Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ，Ｊ Ｕｒｏｌ，１７１：２１２８（２００４）。ＢｏＮＴは、筋肉の過剰な収縮を伴う種々の状態に有効に使用されている。７つの免疫学的に異なる神経毒（Ａ型〜Ｇ型）のうち、ＢｏＮＴ−Ａは、最も一般的に臨床的に使用されているボツリヌス毒素である。この数年間で、ＢｏＮＴ−ＡおよびＢｏＮＴ−Ｂは、複数の部位への排尿筋内ＢｏＮＴ−Ａ注射を使用して神経性膀胱活動亢進を有する脊髄損傷患者の治療で首尾よく使用されている（Ｓｃｈｕｒｃｈら、２０００）。
【００２２】
Ａｃｈおよびノルエピネフリン放出阻害に及ぼす影響：ＢｏＮＴは、神経筋接合部でのＡｃｈ放出および自律神経伝達の阻害によって効果を発揮することが知られている。ＢｏＮＴの筋肉内注射後、骨格筋および平滑筋において一過性の化学的除神経（ｃｈｅｍｏｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ）および筋弛緩が起こり得る（Ｃｈｕａｎｇ ＆ Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ，Ｊ Ｕｒｏｌ．１７６（６ Ｐｔ １）：２３７５−８２（２００６））。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｕｒｏｌ，１６９：１８９６（２００３））は、ラット近位尿道括約筋へのＢｏＮＴ注射によって高電場刺激で標識されたノルエピネフリンが劇的に減少したが、低電場刺激では減少しないことが見出され、ＢｏＮＴが自律神経終末でのノルエピネフリン放出を阻害することを示す。
【００２３】
知覚機構阻害に及ぼす影響：ＢｏＮＴが膀胱における求心性神経伝達も阻害するという概念を支持する証拠が増加しつつある（Ｃｈｕａｎｇら、Ｊ Ｕｒｏｌ １７２，１５２９−３２（２００４）；Ｋｈｅｒａら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ，４５：９８７（２００４））。痛みの感覚のメディエーターである神経ペプチド，グルタミン酸塩、およびアデノシン三リン酸の放出を阻害することが示されている（Ｃｕｉら、Ｐａｉｎ，１０７：１２５（２００４））。類似の影響が酢酸誘導性膀胱過活動モデルで認められた。ＢｏＮＴの排尿筋内注射後の尿意促迫の減少に関連する尿路上皮下神経線維中の感覚受容器Ｐ２Ｘ３および一過性受容器電位バニロイド１（ＴＲＰＶ１）受容体レベルの減少がヒト排尿筋過活動で認められている（Ａｐｏｓｔｏｌｉｄｉｓら、Ｊ Ｕｒｏｌ，１７４：９７７ ２００５）。
【００２４】
ＢｏＮＴの標的タンパク質は、脂質環境下で存在する膜内在性タンパク質である。リポソームは、尿路上皮により強い接着させることによってメタロプロテアーゼ（ＢｏＮＴなど）の活性を増強することができる。膀胱鏡ガイド注射は、膀胱にＢｏＮＴを投与するためのクリニックにおける現在の標準的な手順である。ここ数年、膀胱刺激の動物モデルにおけるＢｏＮＴの膀胱内点滴注入の可能性について評価する研究が行われている（Ｋｈｅｒａら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ６６，２０８−１２（２００５））。この論文中の以前の報告により、ＶＡＭＰに特異的なＢｏＮＴの金属タンパク質分解活性が脂質膜の存在によって強く増強されることが示唆される。この効果は、これらの神経毒が単離されたＶＡＭＰ分子よりも脂質小胞内に挿入されたＶＡＭＰおよびニューロン中のＶＡＭＰに対して活性が高いという事実を説明している。この脂質増強効果は、脂質によって起こる。この研究は、ＢｏＮＴ点滴注入のための送達ビヒクルとしてのリポソーム使用が合理的であることを強く支持している。
【００２５】
膀胱に点滴注入することができる他の薬物を、特に局所送達によって回避される全身性副作用を有する者にリポソーム送達系を使用して送達させることもできる。
【００２６】
開示のリポソーム送達系を使用して送達させることができる適切な薬物または活性薬剤には、癌治療薬、免疫調節薬、鎮痛薬、抗炎症薬、抗ヒスタミン薬、エンドルフィン、プロスタグランジン、カナボイドＴＲＰ受容体、ペプチド、タンパク質、および抗体、プラスミド、裸のＤＮＡ、ウイルスベクター、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アミノ酸；ヒアルロン酸；ペントサンポリ硫酸ナトリウム、β３受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、グレリン受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに局所麻酔薬（リドカインなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
例示的癌治療薬には、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ビンクリスチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビノレルビン、ビンデシン、タキソールおよびその誘導体、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスファート、テニポシド、エピポドフィロトキシン、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、セツキシマブ、およびリツキシマブ（リツキサン（登録商標）またはＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、ならびにその組み合わせが含まれる。
【００２８】
例示的免疫調節薬には、インターフェロンおよびカルメット・ゲラン桿菌が含まれる。
【００２９】
開示の薬物送達組成物を使用して、間質性膀胱炎、疼痛性膀胱症候群、過活動膀胱、膀胱癌、前立腺癌、および細菌、真菌、またはウイルスに起因する尿路感染の治療に適切な薬物を送達させることもできる。
【００３０】
ＩＩ．製造方法
リポソームの製造：
リポソームの製造方法は、上記で引用した論文に記載されており、且つ周知である。
【００３１】
１つの実施形態では、水性リポソーム懸濁液を顕微溶液化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によって生成する。最終生成物は、一連の安定性問題（凝集、融合、およびリン脂質加水分解など）に供され得る（Ｎｏｕｎｏｕら、Ａｃｔａ Ｐｏｌ Ｐｈａｒｍ ６２，３８１−９１（２００５））。
【００３２】
リポソーム生成物は、その臨床的利点が実現される前に適切な化学的および物理的な安定性を持たなければならない（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５８，１５３２−５５（２００６））。好ましい実施形態では、脱水リポソームをｔｅｒｔ−ブチルアルコール（ＴＢＡ）／水共溶媒系中のリン脂質の均一な分散液から形成する。リポソームの等方性単相性溶液を凍結乾燥させて、滅菌バイアル中に脱水リポソーム粉末を生成する。凍結乾燥工程により、バイアルからの水およびＴＢＡの除去後に空の脂質小胞または脱水リポソームが得られる。生理学的食塩水の添加の際、凍結乾燥生成物は均一なリポソーム調製物を自発的に形成する（Ａｍｓｅｌｅｍら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ７９，１０４５−５２（１９９０）；Ｏｚｔｕｒｋら、Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ５５３，２３１−４２（２００４））。脂質／ＴＢＡ比が得られたリポソーム調製物のサイズおよび多分散性に影響を及ぼす主な要因であるので、低脂質濃度は本方法に理想的に役立つ。
【００３３】
リポソームＢｏＮＴの調製：
好ましい実施形態では、リポソームＢｏＮＴ（「ＬＰＡ−０８」）を、少し修正した脱水−再水化法によって調製する。前の工程で調製されたリポソームを、３７℃の注射用蒸留水中のＢｏＮＴの溶液（５０単位／ｍｌ）で水和する。次いで、水浴を使用して混合物を３７℃で２時間インキュベートして、オリゴラメラ水和リポソームを形成する。マンニトールを、０．５％、１％、２．５％、および５％マンニトール（ｗ／ｖ）の濃度で最終混合物にそれぞれ添加し、その後にアセトン−ドライアイス浴中で凍結させる。マンニトールは、凍結乾燥過程における抗凍結剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として作用する。凍結混合物を、−４０℃および５ミリバールで一晩凍結乾燥させる。凍結乾燥させたケーキを生理食塩水で所望のＢｏＮＴ最終濃度に再懸濁する。超遠心分離器を使用した１２，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって遊離ＢｏＮＴを捕捉ＢｏＮＴから除去する。３回の洗浄後、沈殿を生理食塩水に再懸濁する。
【００３４】
強力な細菌毒素のリポソームへの処方には、極めて注意深いアプローチが必要である。ＢｏＮＴを、リポソーム製造で一般に使用される有機溶媒に曝露することができない。薄層水和法および液体ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を使用して実施例を行った。簡潔に述べれば、ＤＰＰＣのクロロホルム溶液を、丸底フラスコ中にて窒素細流下で最初に蒸発させた。脂質薄膜を真空下で一晩乾燥させた。次いで、乾燥させた脂質をＢｏＮＴ水溶液で水和した。
【００３５】
以下の実施例２で証明されるように、ＢｏＮＴ／脂質比の慎重な制御によって最適な結果が得られる。本研究によって証明されるように、最適な比および脂質組成を、日常的な実験を使用して決定することができる。
【００３６】
ＩＩＩ．リポソームＢｏＮＴ送達
リポソーム−ＢｏＮＴの点滴注入は、膀胱鏡的ＢｏＮＴ注射に精通し、且つ認定を受けた医師に制限される別の方法よりも患者にとって快適であり、より多数の医院にこの治療形態を提供することが可能である。ＢｏＮＴは巨大分子であり、細胞層を貫通して筋肉および神経終末に到達しない。リポソームを使用しないＢｏＮＴの点滴注入には、別の方法で膀胱内層を損傷し得る腐食剤（プロタミンなど）が必要であろう。これはＦＤＡによって承認されておらず、膀胱の痛みおよび損傷を引き起こし得る。ＢｏＮＴの点滴注入は、治療抵抗性過活動膀胱患者の治療費を下げることができる。異なる研究所から報告された種々の研究は、膀胱刺激の動物モデルにおけるＢｏＮＴの膀胱内点滴注入の可能性を評価している（Ｃｈｕａｎｇら、２００４；Ｋｈｅｒａら、２００５）。しかし、ＢｏＮＴの膀胱内点滴注入は、臨床経験不足により成功していない。リポソームカプセル化により、点滴注入後の低吸収の問題が解決される。ＢｏＮＴがリポソームの内側に捕捉されるので、尿による希釈に対して脆弱でなく、リポソーム表面でのＢｏＮＴの局在化濃度は、膀胱表面上のリポソーム接着からの浸出ＢｏＮＴの受動拡散を促進するのに十分に高濃度である。リポソームの脂質関門はまた、膀胱によって吸収される前に尿中のプロテアーゼおよびプロテイナーゼがＢｏＮＴに接近してＢｏＮＴが切断されるのを防止することができる。
【００３７】
点滴注入方法は公知である。例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｉａら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８，７６０−８（２００１）；Ｎｏｇａｗａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１５，９７８−８５（２００５）；Ｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３９１，３０４−１３ ２００５；Ｔｙａｇｉら、Ｊ Ｕｒｏｌ １７１，４８３−９（２００４）；Ｔｒｅｖｉｓａｎｉら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３０９，１１６７−７３（２００４）；Ｔｒｅｖｉｓａｎｉら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５，５４６−５１（２００２））；（Ｓｅｇａｌら、１９７５）．（Ｄｙｓｏｎら、２００５）．（Ｂａｔｉｓｔａら、２００５；Ｄｙｓｏｎら、２００５）を参照のこと。
【００３８】
以下の実施例１で証明されるように、リポソーム−ＢｏＮＴの体積は、送達有効性において重要である。日常的実験を使用して、送達体積を最適にすることができる。
【００３９】
開示のリポソームを使用して、他の部位（尿路（尿道、膀胱、尿管、腎内収集系（ｉｎｔｒａｒｅｎａｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）が含まれる）など）、婦人科学的部位（膣、子宮、ファロピウス管など）、胃腸管部位（口腔、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門が含まれる）、および外耳または内耳、皮膚、鼻に治療薬を点滴注入することもできる。
【００４０】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解されるであろう。
【実施例】
【００４１】
実施例１：点滴注入後のリポソームＢｏＮＴの吸収に及ぼす膀胱膨満の影響
材料と方法
点滴注入後のリポソームＢｏＮＴの吸収に及ぼす膀胱膨満の影響を、漸増体積での同一用量のリポソームＢｏＮＴの点滴注入によって決定した。同一組成の脂質およびＢｏＮＴ（各ＢｏＮＴ単位について０．５ｍｇの脂質）を使用して作製したリポソームを異なる点滴注入体積（０．５、０．５５、０．６ｍｌ）で使用してラットに点滴注入した。リポソームを、ハロタン麻酔下にて滞留時間３０分でラット膀胱に点滴注入した。次いで、動物を回復させ、飼料および水を与え、ケージに収容した。ウレタン麻酔下（用量１．０ｇ／ｋｇ体重）で２４時間後、０．０４ｍｌ／分の速度での生理食塩水の注入によって、治療ラットに対して経尿道開放膀胱内圧測定を行った。正常なベースラインが１時間得られた後、生理食塩水中の酢酸（０．２５％）を注入して膀胱刺激を誘導した。異なる体積の点滴注入を使用したＢｏＮＴ処置の７日後、ウレタン麻酔下での継続的な経尿道膀胱内圧測定によって膀胱膨満の影響を評価した。
【００４２】
結果
標準体積０．５ｍｌを点滴注入したラットは、０．０８ｍｌ／分の速度での生理食塩水の一定の注入によって誘導された排尿反射に関する規則的なＣＭＧを示した。しかし、同用量のリポソームＢｏＮＴを含む１０〜２０％高い体積の点滴注入（０．５５ｍｌまたは０．６ｍｌの点滴注入）を使用して注入したラットは、生理食塩水での膀胱内圧測定下で溢流の自制（ｏｖｅｒｆｌｏｗ ｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ）の特徴を示した。
【００４３】
低体積の点滴注入は尿路上皮のみに対するＢｏＮＴの影響を制限するが、１０〜２０％の点滴注入体積の増加によって吸収に対する障壁が劇的に減少され、点滴注入後にＢｏＮＴを排尿筋に到達させることが可能である。高体積のリポソームＢｏＮＴを点滴注入したラットは、覚醒状態での尿閉および麻酔状態下での溢流性尿失禁を示した。これは、反射性排尿の強い抑制を示している。麻酔状態下での溢流性尿失禁が排尿反射の求心路（ａｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｍ）に作用する薬物の望ましい特徴を反映するということに留意することは興味深いことである。麻酔条件下での溢流性尿失禁は、覚醒状態での求心性入力の減少と言い換えられる。
【００４４】
ＢｏＮＴは分子量１５０ｋＤの巨大分子であるので、拡散の大部分を吸収機構から除外することができる。エンドサイトーシスは、より可能性の高い膀胱吸収機構である。以前の研究により、尿路上皮のアンブレラ細胞のエンドサイトーシスが静水圧などの外部刺激と共に増加することが示されている。膀胱充填中のエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスの比は、正味の影響が膜に付加され、膀胱伸長に適応するために尿路上皮の表面積が増加するような比である。したがって、ＢｏＮＴの膀胱取り込みを改善するための膀胱伸長後のエンドサイトーシス活性がより高いと予想される。
【００４５】
実施例２：脂質のＢｏＮＴに対する比率の影響
ＢｏＮＴの最適な有効性のために、脂質および毒素は最適な比率でなければならない。
【００４６】
材料と方法
ＢｏＮＴ比を固定したままで脂質比を変化させてリポソームＢｏＮＴを調製した。例えば、ハロタン麻酔下にて、２５ＩＵのＢｏＮＴから開始して、同一組成の脂質およびＢｏＮＴ（各ＢｏＮＴ単位について０．５ｍｇの脂質）を使用して作製したリポソームを異なる体積で使用してラットに点滴注入した。ＢｏＮＴの膀胱内用量を一定に保持し、脂質濃度を変化させて至適な毒素：脂質比を決定した。リポソームＢｏＮＴの有効性を、生理食塩水中の遊離ＢｏＮＴと比較した。点滴注入から７日後の酢酸誘導した膀胱刺激を鈍化させる能力を、ハロタン麻酔ラットで試験した。点滴注入と有効性評価との間の７日間の間隔を、公開された研究に基づいて選択した（Ｃｈｕａｎｇら、２００４）。
【００４７】
結果
最適な毒素／脂質比１：０．５は、膀胱内点滴注入後のＢｏＮＴの有効性の増強に有効である。より高い脂質比で有効性が低下するのは、多重層リポソームからのＢｏＮＴの放出が非常に遅く、それにより、膀胱へのＢｏＮＴ取り込みが有効ではなくなることに起因し得る。
【００４８】
実施例３：ラットの酢酸誘導性膀胱活動亢進における膀胱内ＢｏＮＴ−Ａリポソーム送達の尿力学的効果および免疫組織化学的効果の評価
材料と方法
リポソーム（ＬＰ）、ボツリヌス毒素Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）、およびリポトキシン（ＬＰ＋ＢｏＮＴ−Ａ）の調製：ＬＰ（１０ｍｇ、リポイド）を生理食塩水（１ｍｌ）中に分散させた。この分散液はリポソーム形態である。ＢｏＮＴ−Ａを生理食塩水に溶解した（１ｍｌ、生理食塩水中２０ｕ／ｍｌ，Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）。ＢｏＮＴ−Ａをカプセル化したＬＰ（リポトキシンと呼ばれる）を、２０単位のＢｏＮＴ−Ａを１０ｍｇのＬＰ分散液（１ｍｌ）にロードする修正した脱水−再水和小胞法によって調製した（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ １９，１５６−６２ １９９９）。異なる動物群でＢｏＮＴ−Ａの用量を同一に保持した。
【００４９】
膀胱内圧測定図（ＣＭＧ）：全実験手順を雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２２０〜２８０ｇｍ）に対して行い、この手順は、研究開始前にＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって再調査および承認されていた。動物を、ウレタン（１．２ｇ／ｋｇ）の皮下注射によって麻酔した。ＰＥ−５０管を尿道を介して膀胱に挿入し、三方止め栓を介して圧トランスデューサーならびに膀胱内圧の記録および膀胱への溶液の注入のためのシリンジポンプに接続した。１日目に、反復排尿を誘発するための生理食塩水（０．０８ｍｌ／分）での膀胱の充填によってコントロールＣＭＧを行った。反射膀胱収縮の振幅、圧力閾値（ＰＴ）、圧力ベースライン（ＰＢ）、および収縮間隔（ＩＣＩ）を記録した。各動物における測定値を、３〜５つの膀胱収縮の平均で示した。
【００５０】
８日目に、生理食塩水注入中にベースライン測定値を確立した後、膀胱に０．３％酢酸（ＡＡ）を０．０８ｍｌ／分で注入して膀胱活動亢進を急性的に促進させた。注入３０分後に３〜５つの膀胱収縮を測定した。
【００５１】
薬物の点滴注入：ベースラインＣＭＧの１日後、ＰＥ−５０管（Ｃｌａｙ−Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）を、結紮糸によってハロタン麻酔下で尿道口周囲の適所に結紮した。膀胱の尿を空にし、ＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、またはリポトキシンをカテーテルによって１時間充填した。
【００５２】
経心臓的灌流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）：ＣＭＧ研究の８日後、いくつかの動物（各群あたりＮ＝６）を深く麻酔し、最初にクレブス緩衝液を使用し、その後に４％パラホルムアルデヒド固定液を使用する経心臓的灌流によって屠殺した。次いで、動物を解剖して膀胱を採取した。
【００５３】
組織学：組織学のために膀胱組織をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで４時間固定し、次いで、ＰＢＳ中の３０％スクロースで一晩置いた。組織学用のサンプルをパラフィンに包埋し、厚さ１０μｍの切片に切断し、Ｈ＆Ｅで染色した。ＡＡ誘導性炎症反応を、以下のように０〜３のスコアによって格付けした：０、炎症細胞浸潤や間質性浮腫の証拠無し；１、軽度（炎症細胞浸潤がほとんどなく、かつわずかな間質性浮腫）；２、中等度（中程度の炎症細胞浸潤および中程度の間質性浮腫あり）；３、重症（大量の炎症細胞浸潤および重症間質性浮腫が拡散して存在する）。
【００５４】
ＣＧＲＰおよびＳＮＡＰ−２５の免疫蛍光顕微鏡法：あるいは、サンプルを凍結し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ封入剤（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）中にマウントし、厚さ１０μｍの長手方向の切片をクリオスタット上で切断し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔスライド上にマウントした。アセトン中での１５分間の浸漬によって切片を固定し、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中０．３％Ｈ２Ｏ２溶液中でスライドを１０分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。ＰＢＳでのさらなる洗浄後、切片をＩｍａｇｅ−ｉＴＴＷ固定シグナルエンハンサー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１時間インキュベートした。ＣＧＲＰ免疫染色のために、次いで、スライドをヤギ抗ＣＧＲＰポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，１：５０希釈）にて＋４℃で４８時間染色した。翌日、切片をＰＢＳで洗浄し、ロバ抗ヤギＩｇＧ ＦＩＴＣ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，１：２０００希釈）と１時間インキュベートした。切片を洗浄し、ＳｌｏｗＦａｄｅ ａｎｔｉｆａｄｅ ｇｏｌｄ ｒｅａｇｅｎｔ（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマウントした。ＳＮＡＰ−２５免疫染色のために、次いで、スライドをマウス抗ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体（ＡｂＤ，ＮＣ，ＵＳＡ，１：２０００希釈）にて＋４℃で一晩染色した。翌日、切片をＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１：２０００希釈）と１時間インキュベートした。筋線維を検出するために、切片をテトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）標識ファロイジン（Ｓｉｇｍａ，１：２０００希釈）で対比染色し、洗浄し、ＳｌｏｗＦａｄｅ ａｎｔｉｆａｄｅ ｇｏｌｄ ｒｅａｇｅｎｔ（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマウントした。スライドを蛍光顕微鏡で試験して画像を記録した。
【００５５】
ＳＮＡＰ−２５発現のウェスタンブロット分析：いくつかの動物（各群あたりＮ＝６）を深く麻酔し、経心臓的灌流を使用せずに屠殺した。標準的プロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にしたがって、ＳＮＡＰ−２５発現のウェスタンブロット分析のための膀胱を取り出した。サンプルをタンパク質抽出溶液（Ｔ−ＰＥＲ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中でホモジナイズし、その後に超音波処理および精製を行った。総タンパク質量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して測定した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、Ｌａｅｍｍｌｉの緩衝液系を使用して行った。簡潔に述べれば、３０μｇタンパク質に等しい抽出物のアリコートを８％ポリアクリルアミドゲル上にロードし、１００Ｖの定電圧で１時間電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。膜をブロッキング剤でブロッキングし、次いで、マウス抗ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体（ＡｂＤ，ＮＣ，ＵＳＡ，１：５００希釈）およびマウス抗β−アクチンモノクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ，１：２０００希釈）を使用して＋４℃で一晩免疫ブロッティングした。洗浄後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギまたは抗マウス免疫グロブリンＧを使用して、ＴＢＳ中の５％脱脂粉乳を使用した二次抗体と室温で２時間インキュベートした。ウェスタンブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって視覚化した。内部コントロールとしてβ−アクチン量も検出した。ＬａｂＷｏｒｋｓ画像収集および分析ソフトウェアを使用して、定量分析を行った。
【００５６】
統計分析：定量的データを、平均±平均の標準誤差として示す。ボンフェローニ事後試験（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）を使用した一元置換ＡＮＯＶＡまたはダンの事後試験（Ｄｕｎｎ’ｓ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）を使用したクラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）を使用して統計分析（適用可能な場合）を行った。ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【００５７】
結果
ＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、およびリポトキシン前処置に対するＣＭＧ応答：
１日目の膀胱内への生理食塩水の点滴注入の間のＬＰ群（コントロール群）、ＢｏＮＴ−Ａ群、およびリポトキシン群におけるＣＭＧパラメータは、８日目とそれほど相違しなかった。これらの結果は、正常条件下での８日目の膀胱機能がＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、およびリポトキシンの前処置の影響を受けなかったことを示す。８日目に、注入開始から２０〜３０分後に酢酸の刺激作用が明らかになった。ＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群では、ＡＡの膀胱内点滴注入後に、それぞれ、収縮間隔（ＩＣＩ）が５７．２％および５６．０％有意に減少した。しかし、リポトキシン処置前に受容したラットは、ＡＡ点滴注入への応答が有意に減少した（ＩＣＩ２１．１％減少）。これらの結果は、リポトキシン前処置によってＡＡ誘導性膀胱過活動が抑制され、この作用が同用量のＢｏＮＴ−Ａ前処置群で認められなかったことを示す。
【００５８】
ＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、およびリポトキシン前処置に対する組織学的応答：ヘマトキシリン（ｈａｍａｔｏｘｙｌｉｎ）およびエオシンで染色した組織切片を組織病理学的評価によって決定したところ、ＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群においてＡＡ点滴注入によって中程度の炎症反応が誘導された。しかし、ＡＡ誘導性炎症反応は、リポトキシン前処置群で有意に減少した（総炎症スコアは、ＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群と比較してそれぞれ４８．９％および３３．３％減少した）。これらの結果は、リポトキシン前処置がＡＡ誘導性膀胱炎症を阻害することを示す。
【００５９】
ＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、およびリポトキシン前処置に対するＣＧＲＰ免疫染色：ＣＧＲＰ免疫染色がリポトキシン前処置群の膀胱粘膜層で確認された。これは、ＬＰ前処置群でもＢｏＮＴ−Ａ前処置群でも認められなかった。これらの結果により、リポトキシン前処置がＣＧＲＰ放出を阻害することが示唆される。
【００６０】
ＬＰ、ＢｏＮＴ−Ａ、およびリポトキシン前処置におけるＳＮＡＰ−２５発現：ＳＮＡＰ−２５陽性ニューロン線維はＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置動物の膀胱サンプル中で検出された。しかし、ＳＮＡＰ−２５陽性ニューロン線維は、リポトキシン前処理動物で稀にしか認められなかった。ウェスタンブロッティングにより、平均ＳＮＡＰ−２５タンパク質レベルはＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群と比較してそれぞれ６６．４％および５８．１％減少することが証明された。これらの結果は、リポトキシン前処置によってＳＮＡＰ−２５発現が減少したことを示す。
【００６１】
結論：
ＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置ラットにおいて、ＡＡの膀胱内点滴注入後の収縮間隔（ＩＣＩ）がそれぞれ５７．２％および５６．０％減少した。しかし、リポトキシンを受容したラットは、ＡＡ点滴注入に対する応答が有意に減少した（ＩＣＩ２１．１％減少）。さらに、リポトキシン前処置ラットは、ＬＰまたはＢｏＮＴ−Ａ前処置ラットと比較して有意に炎症反応およびＳＮＡＰ−２５発現が減少し、ＣＧＲＰ免疫反応性が増加した。膀胱内リポトキシン投与により、ＳＮＡＰ−２５が切断され、求心性神経終末からのＣＧＲＰ放出が阻害され、ＡＡ誘導性活動亢進膀胱が遮断された。これらの結果は、注射を必要とせず、且つ排尿筋への影響が回避されるＢｏＮＴ−Ａ送達に有効なビヒクルとしてのＬＰを支持する。
【００６２】
本研究の主な所見は、この動物モデルにおいて膀胱内リポトキシン前処置によってＡＡ誘導性の膀胱活動亢進および炎症反応が抑制され、この作用はＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群で認められなかったことである。尿閉は認められなかった。さらに、このモデルにおいて、ＬＰおよびＢｏＮＴ−Ａ前処置群と比較してリポトキシン前処置群においてＳＮＡＰ−２５発現が有意に減少し、ＣＧＲＰが有意に増加した。膀胱内リポトキシン点滴注入により、尿閉を引き起こし得る注射を必要とせずにＢｏＮＴ−Ａのより簡潔で有効な送達方法を得ることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱への点滴注入のための薬学的に許容可能なキャリア中にボツリヌス毒素を含むリポソーム処方物。
【請求項２】
脂質対ボツリヌス毒素の比が送達を最適にするように調整される、請求項１に記載の処方物。
【請求項３】
膀胱中にリポソームキャリア中のボツリヌス毒素を点滴注入する工程を含む、過活動膀胱および下部尿路症状を治療するための方法。
【請求項４】
前記ボツリヌス毒素が、７つの血清型のうちの１つまたは複数であり、二本鎖または一本鎖である、請求項１に記載の処方物または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ボツリヌス毒素の用量が、過活動膀胱および下部尿路症状に同一の影響を及ぼすために注射によって投与される用量より少ない、請求項１に記載の処方物または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
点滴注入される前記処方物の体積を、取り込みを最適にするように至適化する、請求項１に記載の処方物または請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記処方物を、膣、肛門、直腸、皮膚、咽頭、口腔、鼻腔、および気道が含まれる、他の体腔および表面に点滴注入する、請求項１に記載の処方物。
【請求項１】
膀胱への点滴注入のための薬学的に許容可能なキャリア中にボツリヌス毒素を含むリポソーム処方物。
【請求項２】
脂質対ボツリヌス毒素の比が送達を最適にするように調整される、請求項１に記載の処方物。
【請求項３】
膀胱中にリポソームキャリア中のボツリヌス毒素を点滴注入する工程を含む、過活動膀胱および下部尿路症状を治療するための方法。
【請求項４】
前記ボツリヌス毒素が、７つの血清型のうちの１つまたは複数であり、二本鎖または一本鎖である、請求項１に記載の処方物または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ボツリヌス毒素の用量が、過活動膀胱および下部尿路症状に同一の影響を及ぼすために注射によって投与される用量より少ない、請求項１に記載の処方物または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
点滴注入される前記処方物の体積を、取り込みを最適にするように至適化する、請求項１に記載の処方物または請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記処方物を、膣、肛門、直腸、皮膚、咽頭、口腔、鼻腔、および気道が含まれる、他の体腔および表面に点滴注入する、請求項１に記載の処方物。
【公表番号】特表２０１１−５１６４９７（Ｐ２０１１−５１６４９７Ａ）
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０３２１４（Ｐ２０１１−５０３２１４）
【出願日】平成２１年４月３日（２００９．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３９４８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３９９８４
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５１０２６１９１３）リペラ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月３日（２００９．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３９４８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３９９８４
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５１０２６１９１３）リペラ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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