リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類の測定方法、ならびに当該方法を利用した測定装置
【課題】 試料に含まれる各リポタンパク中のビタミンＥ類を測定する方法において、各リポタンパク中のコレステロールも同時に測定可能な方法を提供すること。
【解決手段】 リポタンパクを含む試料をイオン交換クロマトグラフに供してリポタンパクを分離し、分離したリポタンパクを、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液と反応させてコレステロールおよびビタミンＥ類を遊離させ、遊離させたコレステロールおよびビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供して分離し、分離したコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定する、測定方法、ならびに前記方法を利用した装置により、前記課題を解決する。
【解決手段】 リポタンパクを含む試料をイオン交換クロマトグラフに供してリポタンパクを分離し、分離したリポタンパクを、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液と反応させてコレステロールおよびビタミンＥ類を遊離させ、遊離させたコレステロールおよびビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供して分離し、分離したコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定する、測定方法、ならびに前記方法を利用した装置により、前記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるリポタンパク（高比重リポタンパク（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）および中間型リポタンパク（ＩＤＬ）、超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）およびリポタンパク（ａ）（Ｌｐ（ａ）））中のコレステロールおよびビタミンＥ類（αトコフェロール、γトコフェロール）の同時測定方法、ならびに当該測定方法を利用した測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化の危険因子として、酸化したリポタンパクが注目を浴び、多くの研究がなされている。一方、リポタンパクが酸化リポタンパクになるのを防ぐための主要な抗酸化物質として、ビタミンＥ類（主にαトコフェロールとγトコフェロール）が知られている。従って、血液試料中に含まれる各リポタンパク中のビタミンＥ類の量を分析することは、動脈硬化のメカニズムを理解するうえで重要である。
【０００３】
血清リポタンパク中に多量に含まれるビタミンＥ類の一つ、αトコフェロールについては複数の学術研究が成されている。冠動脈疾患患者の血清ＬＤＬ中の総コレステロール量に対するαトコフェロール量が健常者のそれに比べて有意に低下していることが報告されており、ＬＤＬの抗酸化作用を低下させ動脈硬化の原因の一つになっていると考えられている（非特許文献１および２）。ＬＤＬ中のγトコフェロールおよびＬＤＬ以外のリポタンパク中のビタミンＥ類についての報告はこれまでにないが、ＬＤＬ以外のリポタンパク中にもビタミンＥ類が含まれていることから、各リポタンパク中のビタミンＥ類の量を分析し比較することで、動脈硬化の進展のメカニズムの詳細を知ることができ、動脈硬化性疾患の予防および治療に結びつけられることが予想される。
【０００４】
従来、リポタンパク中のビタミンＥ類の測定方法として、試料中の各リポタンパクを分離後、リポタンパク中のビタミンＥ類をヘキサンで抽出し、抽出溶液を乾固して濃縮後、メタノール等により再溶解して逆相クロマトグラフに供する方法が知られている（非特許文献１から４）。また前記測定方法における、各リポタンパクの分離方法については、超遠心分離による方法（非特許文献１から４）、アクリルアミド電気泳動による方法、ゲルろ過クロマトグラフによる方法、イオン交換クロマトグラフによる方法（非特許文献５および６）が知られている。
【０００５】
一方、本出願人は以前、
イオン交換クロマトグラフによりリポタンパクを分離し、
有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液と反応させてビタミンＥ類を遊離させ、
遊離したビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供し分離し、
分離したビタミンＥ類の量を測定する、
リポタンパク中のビタミンＥ類の測定方法を確立している（特開２００８−００３０８２号公報：特許文献１）。前記測定方法は、試料に含まれる各リポタンパク中のビタミンＥ類を簡便に測定できる方法であり、自動化も可能な方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−００３０８２号公報
【特許文献２】特開２００２−２９６２６１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈａｉｄａｒｉ Ｍら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７、ｐ．１２３４（２００１）
【非特許文献２】Ｆｅｋｉ Ｍら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４６、ｐ．１４０１（２０００）
【非特許文献３】Ｙｏｌａｎｄａ Ｂら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７、ｐ．１２７（１９９７）
【非特許文献４】Ｔｅｉｓｓｉｅｒ Ｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２、ｐ．４３０（１９９６）
【非特許文献５】Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ Ｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４、ｐ．１４０４（２００３）
【非特許文献６】Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ Ｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０８、ｐ．３３６（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述した特許文献１で開示のリポタンパク中のビタミンＥ類の測定方法は、試料に含まれる各リポタンパク中のビタミンＥ類を簡便に測定できる方法である。しかしながら、リポタンパク中のビタミンＥ類の測定値は、試料に含まれる各リポタンパクの濃度によっても変動する。したがって、例えば、患者が異なる場合や、同じ患者であっても時期が異なる場合や、特定の病態を有する患者集団間で比較する場合には、各リポタンパク中のビタミンＥ類の測定値と、当該リポタンパク中のコレステロール量、タンパク量、中性脂肪量、総脂肪量などとの比率を算出して、比較する必要がある。しかしながら、前記比較を行なうには、特許文献１で開示のリポタンパク中のビタミンＥ類の測定方法と、各リポタンパク質中のコレステロール、タンパク質、中性脂肪または総脂肪を測定する方法（例えば非特許文献５に記載の方法）とを別個に行なった後、各方法で得られた結果を組み合わせる必要があったため、操作が煩雑であった。また、比率を算出する際、誤差が大きくなる問題があった。
【０００９】
そこで本発明は、試料に含まれる各リポタンパク中のビタミンＥ類を測定する方法において、各リポタンパク中のコレステロールも同時に測定可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するためになされた本発明は、以下の態様を包含する：
すなわち本発明の第一の態様は、
リポタンパクを含む試料をイオン交換クロマトグラフに供してリポタンパクを分離し、
分離したリポタンパクを、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液と反応させてコレステロールおよびビタミンＥ類を遊離させ、
遊離させたコレステロールおよびビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供して分離し、
分離したコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定する、
リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を同時に測定する方法である。
【００１１】
また本発明の第二の態様は、分離したコレステロール量の測定と分離したビタミンＥ類の量の測定とを、異なる検出器で行なう、前記第一の態様に記載の方法である。
【００１２】
また本発明の第三の態様は、前記第一または第二の発明に記載の測定方法で得られた、各リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出することで、糖尿病の病態を測定する方法である。
【００１３】
また本発明の第四の態様は、前記第一または第二の発明に記載の測定方法で得られた、各リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出することで、心筋梗塞の病態を測定する方法である。
【００１４】
また本発明の第五の態様は、
リポタンパクを含む試料を一定量導入する試料導入部と、
リポタンパク質を分離するためのイオン交換カラムを有したイオン交換クロマトグラフ部と、
イオン交換クロマトグラフ部から溶出した液の一部または全部と、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液とを混合する試薬混合部と、
前処理液により遊離したコレステロールおよびビタミンＥ類を分離するための逆相カラムを有した逆相クロマトグラフ部と、
逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるコレステロール量を測定するための検出器と、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類の量を測定するための検出器と、を有した検出部と、
試料導入部で導入した試料およびイオン交換カラムに導入する溶離液を送液する第一の送液部と、
前処理液を送液する第二の送液部と、
逆相カラムに導入する溶離液を送液する第三の送液部と、
を備えた、リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を同時に測定する装置である。
【００１５】
また本発明の第六の態様は、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるコレステロール量を測定する検出器が紫外検出器であり、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類の量を測定する検出器が蛍光検出器である、前記第五の態様に記載の装置である。
【００１６】
また本発明の第七の態様は、逆相クロマトグラフ部に有した逆相カラムが二本以上である、前記第五または第六の態様に記載の装置である。
【００１７】
以下に、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
本発明の測定方法の測定対象である、リポタンパクを含む試料としては、全血、血清、血漿、血清といった血液試料や、前記試料を適切な溶液に懸濁して得られる懸濁溶液が例示できる。
【００１９】
本発明の測定方法で測定するコレステロールは、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液により遊離された遊離コレステロールである。血液中のコレステロールには、遊離型コレステロールとエステル型コレステロールの２種類が存在し、通常コレステロールの測定に用いられる、コレステロールエステラーゼにより試料中のエステル型コレステロールを遊離型コレステロールに変換後、コレステロールオキシダーゼにより遊離型コレステロールを分解して生じた過酸化水素の量を比色法で測定する方法では、遊離型コレステロールとエステル型コレステロールとの総和（総コレステロール量）を測定する。しかしながら、本発明の測定方法では、前述したエステル型コレステロールを遊離型コレステロールに変換する反応を組み入れると測定装置が複雑となることから、遊離型コレステロールのみを測定する。ただし、各リポタンパク中の総コレステロール量と遊離型コレステロール量とは良好な相関関係（後述の実施例１参照）があることから、本発明の測定方法で得られる、各リポタンパク中の遊離コレステロール量とビタミンＥ類との比率を、病態を測定する際用いる、各リポタンパク中の総コレステロール量とビタミンＥ類との比率として用いてもよい。
【００２０】
本発明の測定方法では、リポタンパクを含む試料をまずイオン交換クロマトグラフに供して各リポタンパクを分離する。イオン交換クロマトグラフは、分離能が高く、種々のリポタンパクを精密に分離することができる。イオン交換クロマトグラフは、分離剤をカラムに充填した態様で実施すると好ましく、また使用する分離剤（イオン交換体）としては、リポタンパクの分離能が高い、陰イオン交換クロマトグラフ用の分離剤（陰イオン交換体）が好ましい。イオン交換クロマトグラフによるリポタンパクの分離操作では、試料中のリポタンパクを分離剤（例えば陰イオン交換体）にいったん吸着させた後、塩濃度の異なる溶離液をステップグラジエントまたはリニアグラジエントで供することにより、電荷の差および疎水性の差に基づいて各リポタンパクが分離溶出される。イオン交換クロマトグラフで使用する溶離液には、カオトロピックイオンを添加すると好ましい（特許文献１）。イオン交換クロマトグラフにおいて使用する、分離剤の量（イオン交換容量）、溶離液の組成、溶離液の流速等の諸条件は、供する試料の種類や量に応じ、後述する実施例で採用した条件、または予備検討により、各リポタンパクを分離し、異なる画分として回収できるような条件を適宜決定すればよい。ステップグラジエントまたはリニアグラジエントの溶出条件は、どのリポタンパク中のビタミンＥ類を測定するかによって適宜設定すればよい。例えば、血液中の主たるリポタンパクである、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）および超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）中のビタミンＥ類を測定することを目的とする場合は、まず試料中のリポタンパクをイオン交換体表面にいったん吸着させた後、最初の溶出条件（ステップ）でＨＤＬを溶出し、２番目のステップでＬＤＬおよび中間リポタンパク（ＩＤＬ）を溶出し、３番目のステップでＶＬＤＬを溶出し、４番目のステップでカイロミクロン（ＣＭ）およびリポタンパク（ａ）（Ｌｐ（ａ）を溶出すればよい。なお、２番目のステップでＬＤＬとＩＤＬを同時に溶出させているが、これは、広義のＬＤＬはＩＤＬも含むこと、またＩＤＬが高値を示す病態がまれであること、から同時に溶出させている。イオン交換クロマトグラフからの溶出液の回収は、例えば、ステップグラジエントの各ステップ毎、または一定容量毎に回収すればよい。
【００２１】
回収したイオン交換クロマトグラフからの溶出液は、当該溶出液の全て、または当該溶出液のうちリポタンパクを含む画分に対して、前処理液を一定の容量比で添加することで、リポタンパクからコレステロールおよびビタミンＥを遊離させる。前処理液は、コレステロールおよびビタミンＥ類を溶解するための有機溶媒と、リポタンパク粒子を壊してコレステロールおよびビタミンＥ類を遊離させるための界面活性剤とを少なくとも含んでいればよく、さらにアスコルビン酸等コレステロールおよびビタミンＥ類の酸化を防止するための還元剤や、界面活性剤とともにタンパク変性作用によりリポタンパク粒子を壊す効果を有するカオトロピックイオンを含んでもよい。特にイオン交換クロマトグラフにおける溶離液にカオトロピックイオンが添加されていない場合には、前処理液にカオトロピックイオンを含むと好ましい。コレステロールとビタミンＥ類は、いずれもリポタンパク中に含まれており、かつ両者の疎水性が類似していることから、前処理液の組成は、特許文献１に記載した、リポタンパク中のビタミンＥ類を遊離させる前処理液の組成と同様の組成としてよい。
【００２２】
前処理液との反応により、各リポタンパクから遊離したコレステロールおよびビタミンＥ類は、リポタンパクと前処理液との混合液として逆相クロマトグラフに供する。イオン交換クロマトグラフにより各リポタンパク画分を分離して溶出させる際、塩を含む溶離液を使用することから、本発明の測定方法では遊離したコレステロールおよびビタミンＥ類の分離に、塩類を含む試料を精度よく分離できる逆相クロマトグラフを採用している。逆相クロマトグラフは、イオン交換クロマトグラフと同様、分離剤をカラムに充填した態様で実施すると好ましい。前処理液により遊離させたコレステロールおよびビタミンＥ類を含む試料を、逆相クロマトグラフに供することにより、コレステロールおよびビタミンＥ類を分離して溶出させ、当該溶出液に含まれるコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定することで、リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を同時に測定することができる。逆相クロマトグラフにおける、使用する分離剤の量、溶離液の組成、溶離液の流速等の諸条件は、分析に供する試料の種類や量に応じ、後述する実施例で採用した条件、または予備検討により、適宜決定すればよい。なお分析精度の向上を目的に、イオン交換クロマトグラフによるリポタンパクの分離後、逆相クロマトグラフに供するまでに、δトコフェロールをインターナルコントロールとして添加してもよい。δトコフェロールはビタミンＥ類の一つであるが、リポタンパク中に含まれるビタミンＥ類は主にαトコフェロールとγトコフェロールであり、δトコフェロールはαトコフェロールの１００分の１程度しか存在しないため、インターナルコントロールとして最適である。
【００２３】
逆相クロマトグラフにより分離されたリポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類は各測定対象に適した方法で検出することで、コレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定することができる。ただし、リポタンパク中のコレステロールとリポタンパク中のビタミンＥ類とを同一の方法で検出すると、クロマトグラムにおいてピークが重なった場合、検出が困難となることから、好ましくは、リポタンパク中のコレステロールの検出と、リポタンパク中のビタミンＥ類の検出は、異なる方法（検出器）で検出したほうが好ましい。
【００２４】
本発明の測定方法で得られる、リポタンパク中のコレステロール量およびリポタンパク中のビタミンＥ類の量から、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出することで、糖尿病の病態および心筋梗塞の病態を測定することができる。具体的には、
（１）ＶＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有し、健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないとする、糖尿病の病態の測定、
（２）ＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ高い場合は糖尿病の病態を有し、健常人の平均値に比べ高くない場合は糖尿病の病態を有しないとする、糖尿病の病態の測定、
（３）ＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ高い場合は心筋梗塞の病態を有し、健常人の平均値に比べ高くない場合は心筋梗塞の病態を有しないとする、心筋梗塞の病態の測定、
（４）ＶＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有し、健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないとする、糖尿病の病態の測定、
が例示できる（特許文献１）。
【００２５】
本発明の測定方法を用いた、リポタンパク中のコレステロール量およびビタミンＥ類の量を同時に測定する装置（以下単に、本発明の測定装置とする）における試料導入部は、試料導入部の所定場所に搬入された試料容器等から自動的に一定量の試料を採取し得るものであれば特に制限はなく、ＡＳ−８０２０（商品名、東ソー（株）製）など、通常用いられるオートサンプラーを使用することができる。また試料導入部には、試料容器を前記所定場所に自動的に搬入する装置をさらに有してもよい。
【００２６】
本発明の測定装置におけるイオン交換カラムは、各リポタンパクを分離可能なものであれば制限はなく、具体例として、ＤＥＡＥ−ＮＰＲ、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（いずれも商品名、東ソー製）があげられる。特に、ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（商品名、東ソー製）といった、分離能力の高いノンポーラス系の陰イオン交換カラムが好ましい。
【００２７】
本発明の測定装置における逆相カラムは、コレステロールおよびビタミンＥ類を吸着可能なものであれば制限はなく、具体例として、ＯＤＳ−８０Ｔｓ（商品名、東ソー製）があげられる。なお本発明の測定装置において、逆相クロマトグラフ部による一回の分析には、一定の時間が必要である。後述の実施例２のように、一回の分析に１５分程度を要する場合には、そのままだとイオン交換クロマトグラフ部から溶出した各リポタンパクに対する逆相カラムでの分析が完了する前に、他のリポタンパクがイオン交換クロマトグラフ部から溶出してしまう。このため、目的のリポタンパクを溶出させた後、一旦、イオン交換カラムに導入する溶離液の流速を下げるか、溶離液を停止するか、塩濃度の低い溶離液を流す。そして逆相クロマトグラフ部による前記リポタンパクの分析終了後、イオン交換カラムに導入する溶離液の流速を戻す（溶離液の流速を下げるか、溶離液を停止する場合）、または溶離液の塩濃度を戻し（塩濃度の低い溶離液を流した場合）、イオン交換クロマトグラフ部から次のリポタンパクを溶出させ、逆相クロマトグラフ部へ導入する。したがって、本発明の測定装置に備える逆相カラムとして、マイクロカラムのような、分析に要する時間を短縮可能なカラムを用いると好ましいといえる。
【００２８】
本発明の測定装置における試薬混合部は、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液の一部または全部と、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液とを混合可能な構成であればよい。後述の実施例２では、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液の全部を前処理液と混合後、その一部を逆相クロマトグラフ部に導入している。ただし、クロマトグラフ条件が一定であれば、イオン交換クロマトグラフ部からの各リポタンパクの溶出時間が予想し得るため、前処理試薬の送液を当該予想時間に合わせて行ない、それ以外の時間は送液を停止する態様を採用してもよく、当該態様により前処理試薬の消費量を節約することができる。イオン交換クロマトグラフ部からの溶出と前処理試薬との混合は、例えば、前処理試薬を送液する配管とイオン交換クロマトグラフ部からの溶出液を送液する配管とを単に合流させるのみでもよいが、合流後に例えばスタティックミキサーＣ（商品名、東ソー製）のような混合装置を用いて混合したり、合流後に配管内径が太い配管を設け流速を低下させることで混合したり、内壁に凹凸を形成した配管や内径が変化する配管を用いて混合したりすると好ましい。
【００２９】
本発明の測定装置における検出部は、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるコレステロール量を測定するための検出器と、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類の量を測定するための検出器とを有している。コレステロール量を測定可能な検出器としては、紫外検出器、質量検出器、蛍光検出器、電気化学検出器を例示できる。この中でも、十分な検出感度を有し、かつメンテナンス等の維持作業が容易な、紫外検出器が特に好ましい。ビタミンＥ類の量を測定するための検出器としては、紫外検出器、質量検出器、蛍光検出器、電気化学検出器が例示できる。この中でも、十分な検出感度を有し、かつメンテナンス等の維持作業が容易な、蛍光検出器が特に好ましい。
【００３０】
本発明の測定装置の一例を図２に示す。図２に示す測定装置は、
リポタンパクを含む試料を一定量導入するオートサンプラー４と、
リポタンパク質を分離するための陰イオン交換カラム５を有したイオン交換クロマトグラフ部と、
イオン交換クロマトグラフ部から溶出した液の一部または全部と、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液６とを混合する、三方混合流路７と混合装置３ｂとを有した、試薬混合部と、
前処理液により遊離したコレステロールおよびビタミンＥ類を分離するための逆相カラム１０ａ・１０ｂを有した逆相クロマトグラフ部と、
逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれる遊離したコレステロール量を測定するための紫外検出器１１と、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類の量を測定するための蛍光検出器１２と、を有した検出部と、
試料導入部で導入した試料およびイオン交換カラム５に導入する溶離液１ａ・１ｂと、溶離液１ａ・１ｂを送液するためのポンプ２ａ・２ｂと、溶離液１ａ・１ｂを混合させるための混合装置３ａとを有した、第一の送液部と、
前処理液６と、前処理液６を送液するためのポンプ２ｅと、有した第二の送液部と、
逆相カラム１０に導入する溶離液１ｃ・１ｄと、溶離液１ｃ・１ｄを送液するためのポンプ２ｃ・２ｄと、有した第三の送液部と、
イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と前処理液との混合液をサンプルループ９に充填可能な状態（ＯＦＦ状態）と、サンプルループ９に充填した混合液を溶離液１ｃにより逆相カラム１０ａへ送液可能な状態（ＯＮ状態）とを切り替え可能な、流路切り替えバルブ８ａと、
サンプルループ９に充填した混合液を逆相カラム１０ａに充填可能な状態（ＯＦＦ状態）と、逆相カラム１０ａに吸着したリポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を
溶離液１ｄにより逆相カラム１０ｂへ送液可能な状態（ＯＮ状態）とを切り替え可能な、流路切り替えバルブ８ｂと、
を備えた装置である。
【００３１】
図２に示す測定装置では、ポンプ２ａ・２ｂの駆動をコンピューター等で制御し塩濃度の異なる溶離液１ａ・１ｂの送液量を制御することで、イオン交換カラム５に導入する異なる組成（塩濃度）の溶離液をステップグラジエントまたはリニアグラジエントのいずれのモ−ドでも導入することが可能である。ポンプ２ａ・２ｂの具体例としては、ＤＰ−８０２０（商品名、東ソー製）があげられる。なお、図２に示す測定装置では、ポンプ２ａ・２ｂにより送液された溶離液１ａ・１ｂは、イオン交換カラム５に導入する前に混合装置３ａで混合される。混合装置３ａの具体例としては、スタティックミキサーＣ（商品名、東ソー製）があげられる。
【００３２】
図２に示す測定装置において、前処理試薬を送液するポンプ２ｅ、および逆相カラムに導入する溶離液を送液するポンプ２ｃ・２ｄは、前述のポンプ２ａ・２ｂ同様、ＤＰ−８０２０（商品名、東ソー製）のような、液体クロマトグラフで通常用いられるポンプを使用することができる。なお、図２に示す測定装置では、六方切り替えバルブ８ａを備えることで、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と前処理試薬との混合液、および逆相カラムに導入する溶離液１ｃを送液するための送液部を簡略化している。
【００３３】
また図２に示す測定装置では、逆相クロマトグラフ部に逆相カラムを二本有している。これにより、リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類のクロマトグラムにおける、テーリング（本来のピークの後に尾を引く現象）やリーディング（本来のピークの前に尾を引く現象）の発生が抑えられ、ピーク形状が改善する。その結果、分離性能の向上と、測定再現性および測定精度の向上が期待できる。さらに図２に示す測定装置では、二本の逆相カラムの一方１０ａを、流路切り替えバルブ８ｂのサンプルループ上に設けており、逆相カラム１０ａは、イオン交換クロマトグラフ部から溶出した液と前処理液との混合液に含まれるコレステロールおよびビタミンＥ類を吸着する一方、当該混合液に含まれる不純物はある程度除去する働きを有する。これにより、例えばリポタンパクを含む試料が患者血液の場合、当該試料に含まれる投与薬物による妨害を受けにくくなる。また、後続の逆相カラム１０ｂの耐久性も向上する。さらに、コレステロールおよびビタミンＥ類の吸着工程と分離工程とを分けて行なうため、分析時間の短縮にもつながる。
【００３４】
図２に示す測定装置による、リポタンパク中のコレステロール量およびビタミンＥ類の量の測定は、具体的には以下の方法で行なう。
（Ａ）オートサンプラー４を用いて採取したリポタンパクを含む試料を、溶離液１ａ・１ｂとともにポンプ２ａ・２ｂで送液してイオン交換カラム５に供し、試料中のリポタンパクをカラムに保持させる。
（Ｂ）同一組成の溶離液を一定量送液後、ポンプ２ａ・２ｂの送液量を制御し、イオン交換カラム５に導入する溶離液の塩濃度を高くすることで、イオン交換カラム５に保持された各リポタンパクを分離して溶出させる。
（Ｃ）溶出した各リポタンパクに対し、ポンプ２ｅにより送液された前処理液６を混合することで、リポタンパクからコレステロールおよびビタミンＥ類を遊離させる。なお前処理液６の送液量は、イオン交換カラム５から溶出するリポタンパクが希釈されすぎると、後続の逆相クロマトグラフ部における検出感度が低下するおそれがあり、また、前処理液に含まれる界面活性剤の濃度によっては、送液量を多くすると気泡が生じて送液不良となるおそれがあることから、イオン交換カラムから溶出される液量に対して０．２倍から５倍量とするとよく、０．５倍から２倍量とするとさらによい。
（Ｄ）流路切り替えバルブ８ａをＯＦＦ状態に切り替え、遊離させたコレステロールおよびビタミンＥ類を含む液を、サンプルループ９に導入する。なおサンプルループ９の容量は、後続の逆相カラム１０ａに導入すべき液量とすればよい。
（Ｅ）流路切り替えバルブ８ａをＯＮ状態、流路切り替えバルブ８ｂをＯＦＦ状態に、それぞれ切り替え、サンプルループ９に導入したコレステロールおよびビタミンＥ類を含む液をポンプ２ｃにより逆相カラム１０ａに導入することで、逆相カラム１０ａにコレステロールおよびビタミンＥ類を吸着させる一方、それ以外の不純物を除去する。
（Ｆ）流路切り替えバルブ８ｂをＯＮ状態に切り替え、溶離液１ｄをポンプ２ｄで逆相カラム１０ａに導入することで、吸着したコレステロールおよびビタミンＥ類を溶出させ、逆相カラム１０ｂに導入させる。
（Ｇ）逆相カラム１０ｂによりコレステロールおよびビタミンＥ類を分離溶出を行ない、分離溶出したコレステロール量を紫外検出器１１で測定し、分離溶出したビタミンＥ類の量を蛍光検出器１２で測定する。
【００３５】
前記（Ａ）から（Ｇ）の動作は、各機器をパーソナルコンピュータにつなぎ、自動的に制御することができる。また、測定したデ−タを同じパーソナルコンピュータで取り込み、各リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を自動的に算出させることもできる。
【００３６】
図２の測定装置により、イオン交換クロマトグラフによりリポタンパクを４つ（ＨＤＬ、ＬＤＬ＋ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ＋Ｌｐ（ａ））に分画し、各リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を測定する場合、概ね１試料あたりの分析時間は１時間程度となる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の測定方法は、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量とを同時に測定可能な方法である。病態やリスクの評価に用いる、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出する際、従来の方法では、リポタンパク中のコレステロール量の測定方法と、リポタンパク中のビタミンＥ類の測定方法とを別々の装置で行ない、前記二つの装置で得られた結果から別途比率を算出する必要があった。そのため、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出する場合に、二つの測定方法（測定装置）による試料注入量の誤差等が加算される問題があった。一方、本発明の測定方法では、単一の装置による一回の測定で、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量とを同時測定できるため、従来の方法と比較し、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を簡便に算出することができる効果を有している。また、前記比率を算出する際に、試料注入量に関する誤差等が発生しない、という効果も有している。
【００３８】
なお、本発明の測定方法を利用した装置において、逆相クロマトグラフ部が逆相カラムを二本以上有し、かつ、そのうち少なくとも一本を不純物除去用とした態様とすると、後続のコレステロールおよびビタミンＥ類を分離するための逆相カラムにより得られるクロマトグラムにおいて、テーリング（本来のピークの後に尾を引く現象）やリーディング（本来のピークの前に尾を引く現象）の発生を抑えることができる。そのため、測定精度や感度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】各リポタンパク中の総コレステロール量と遊離コレステロール量との相関を示す図。（ａ）はＨＤＬでの、（ｂ）はＬＤＬでの、（ｃ）はＩＤＬでの、（ｄ）はＶＬＤＬでの、（ｅ）はカイロミクロンでの結果である。
【図２】本発明の測定装置の一例を示す図。
【図３】実施例２の方法で測定した結果（クロマトグラム）。（ａ）は蛍光検出器で各リポタンパク中のビタミンＥ類を検出した結果（クロマトグラム）であり、（ｂ）は紫外検出器で各リポタンパク中のコレステロールを検出した結果（クロマトグラム）である。
【図４】実施例３の方法で測定した結果（クロマトグラム）。（ａ）は蛍光検出器でＨＤＬ画分中のビタミンＥ類を測定した結果（クロマトグラム）であり、（ｂ）は紫外検出器でＨＤＬ画分中のコレステロールを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図５】実施例３の方法で測定した結果（クロマトグラム）。（ａ）は蛍光検出器で（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のビタミンＥ類を測定した結果（クロマトグラム）であり、（ｂ）は紫外検出器で（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロールを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図６】実施例５の方法で測定した結果（クロマトグラム）。（ａ）は蛍光検出器で各リポタンパク中のビタミンＥ類を測定した結果（クロマトグラム）であり、（ｂ）は紫外検出器で各リポタンパク中のコレステロールを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図７】各リポタンパク中のビタミンＥ類の希釈直線性試験の結果を示す図。（ａ）はＨＤＬ画分中のγトコフェロール、（ｂ）はＨＤＬ画分中のαトコフェロール、（ｃ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のγトコフェロール、（ｄ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のαトコフェロール、（ｅ）はＶＬＤＬ画分中のγトコフェロール、（ｆ）はＶＬＤＬ画分中のαトコフェロールの結果である。
【図８】各リポタンパク中のコレステロールの希釈直線性試験の結果を示す図。（ａ）はＨＤＬ画分中のコレステロール、（ｂ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロール、（ｃ）はＶＬＤＬ画分中のコレステロールの結果である。
【図９】ＨＰＬＣ法および超遠心法で測定した、各リポタンパク中のビタミンＥ類の量の相関性を示す図。（ａ）はＨＤＬ画分中のγトコフェロール量、（ｂ）はＨＤＬ画分中のαトコフェロール量、（ｃ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のγトコフェロール量、（ｄ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のαトコフェロール量、（ｅ）はＶＬＤＬ画分中のγトコフェロール量、（ｆ）はＶＬＤＬ画分中のαトコフェロール量の結果である。
【図１０】ＨＰＬＣ法および超遠心法で測定した、各リポタンパク中のコレステロール量の相関性を示す図。（ａ）はＨＤＬ画分中のコレステロール量、（ｂ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロール量、（ｃ）はＶＬＤＬ画分中のコレステロール量の結果である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明を限定するものではない。
【００４１】
実施例１
特開２００２−２９６２６１号公報（特許文献２）の実施例で開示のリポタンパク質の測定方法と同様の方法により、各リポタンパク中の総コレステロール値と遊離コレステロール値を測定した。ただし、カラム（ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ、東ソー製）のサイズは３．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｍｍとし、流速は溶離液Ａと溶離液Ｂとの合計で０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、反応液の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。溶離液Ａと溶離液Ｂを混合するミキサーはスタティックミキサーＣ（東ソー製）とし、反応コイルのサイズは０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍとし、反応温度は４５℃とした。血清の注入量は１．９μＬとした。総コレステロールを測定する反応液としてはＴＣＨＯ−ＣＬ（セロテック製）を用い、遊離コレステロールを測定する反応液としては遊離コレステロールＥテストワコー（和光純薬工業製）を使用した。溶離液のステップグラジエントパターンは、０から２分は溶離液Ｂの割合を１７．２％、２分から４分は溶離液Ｂの割合を２１．７％、４分から５．５分は溶離液Ｂの割合を２３．６％、５．５分から７分は溶離液Ｂの割合を３２．６％、７分から８分は溶離液Ｂの割合を１００％、８分から１０分は溶離液Ｂの割合を１０％とし、１０分で１回の試料の測定が終了するよう設定した。
【００４２】
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア２０名から採血した血清試料について、前記方法により、血清試料中に含まれるリポタンパク（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン（ＣＭ））を分離し、各リポタンパク中の総コレステロール量と遊離コレステロール量を測定した。各血清試料について測定結果をプロットした結果を図１に示す。いずれのリポタンパクにおいても、総コレステロール量と遊離コレステロール量との相関が良好であることから、各リポタンパク中のコレステロール量当たりのビタミンＥ類の量を算出する場合、コレステロール量として、総コレステロール量を用いても、遊離コレステロール量を用いても、その結果は同等といえる。以降の実施例では、遊離コレステロールを単にコレステロールとしている。
【００４３】
実施例２
図２に示す本発明の測定装置を用いて、各リポタンパク中のコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定した。装置構成および測定条件を以下に示す。
【００４４】
図２の装置構成
溶離液Ａ（１ａ）：
５０ｍＭ トリス＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ（ｐＨ７．５）
溶離液Ｂ（１ｂ）：
５０ｍＭ トリス＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ＋５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウム
（ｐＨ７．５）
溶離液Ｃ（１ｃ）：
２５ｍＭ 過塩素酸ナトリウム＋３０％ エタノール
溶離液Ｄ（１ｄ）：
２５ｍＭ 過塩素酸ナトリウム＋８６．５％ エタノール＋０．０２５ｍＭ 過
塩素酸
送液ポンプ２ａ・２ｂ・２ｃ・２ｄ・２ｅ：ＤＰ−８０２０（東ソー製）
混合装置３ａ・３ｂ：スタティックミキサーＣ（東ソー製）
オートサンプラー４：ＡＳ−８０２０（東ソー製）
陰イオン交換カラム５：
ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（東ソー製）、３．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｍｍ
前処理液６：
１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）＋７０％ エタノール
サンプルループ９：
容量２．５ｍＬのステンレスチューブ（０．８ｍｍＩ．Ｄ．×４９７．５ｃｍ）
逆相カラム１０ａ：
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３．５
ｃｍ
逆相カラム１０ｂ：
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×７．５
ｃｍ
測定条件
試料導入：
１００μＬ（導入した試料は、血清試料を（溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９：１）の溶
液で１５倍希釈した試料）
陰イオン交換カラム５への溶離液導入量：
０．２５ｍＬ／ｍｉｎ（溶離液Ａと溶離液Ｂとの合計）
陰イオン交換カラム５のグラジエントパターン：
０分から２分は溶離液Ｂ１９％＋溶離液Ａ８１％
２分から５分は溶離液Ｂ１９％＋溶離液Ａ８１％から溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ
９０％へのリニアグラジエント
５分から１０分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
１０分から１２分は溶離液Ｂ２６％＋溶離液Ａ７４％
１２分から１５分は溶離液Ｂ２６％＋溶離液Ａ７４％から溶離液Ｂ１０％＋溶離
液Ａ９０％へのリニアグラジエント
１５分から２０分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
２０分から２２分は溶離液Ｂ３３％＋溶離液Ａ６７％
２２分から２５分は溶離液Ｂ３３％＋溶離液Ａ６７％から溶離液Ｂ１０％＋溶離
液Ａ９０％へのリニアグラジエント
２５分から３０分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
３０分から３２分は溶離液Ｂ１００％
３２分から３５分は溶離液Ｂ１００％から溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％への
リニアグラジエント
３５分から５０分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
前処理液６の流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液Ｃ（１ｃ）および溶離液Ｄ（１ｄ）の流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
流路切り替えバルブ８ａ・８ｂの切り替え
０．３分にバルブ８ａをＯＦＦ、２．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
６．３分にバルブ８ａをＯＮ、８．３分にバルブ８ｂをＯＮ
１０．８分にバルブ８ａをＯＦＦ、１２．８分にバルブ８ｂをＯＦＦ
１６．８分にバルブ８ａをＯＮ、１８．８分にバルブ８ｂをＯＮ
２０．８分にバルブ８ａをＯＦＦ、２３．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
２６．８分にバルブ８ａをＯＮ、２８．８分にバルブ８ｂをＯＮ
３０．８分にバルブ８ａをＯＦＦ、３３．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
３６．８分にバルブ８ａをＯＮ、３８．８分にバルブ８ｂをＯＮ
紫外検出器１１の波長：２０５ｎｍ
蛍光検出器１２の波長：励起波長２９８ｎｍ、蛍光波長３２５ｎｍ
１試料当たりの測定時間：５０分
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア１名から採血した血清試料を前記条件で測定した結果（クロマトグラム）を図３に示す。蛍光検出器１１により、ＨＤＬ画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロール、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロール、ＶＬＤＬ画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロール、ならびに（カイロミクロン（ＣＭ）＋リポタンパク（ａ）（Ｌｐ（ａ））画分中のαトコフェロールが確認された（図３（ａ））。また紫外検出器１２により、ＨＤＬ画分中のコレステロール、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロール、ＶＬＤＬ画分中のコレステロール、および（ＣＭ＋Ｌｐ（ａ））画分中のコレステロールが確認された（図３（ｂ））。
【００４５】
実施例３
実施例２に示した装置構成および測定条件のうち、下記内容を変更した他は、実施例２と同様な条件でＨＤＬ画分および（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定した。
【００４６】
変更内容
逆相カラム１０ａ：
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１２ｃｍ
逆相カラム１０ｂ：設けず
流路切り替えバルブ８ａ・８ｂの切り替え（ＨＤＬ画分測定時）
０．３分にバルブ８ａをＯＦＦ、２．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
６．３分にバルブ８ａをＯＮ、８．３分にバルブ８ｂをＯＮ
流路切り替えバルブ８ａ・８ｂの切り替え（（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分測定時）
１０．８分にバルブ８ａをＯＦＦ、１２．８分にバルブ８ｂをＯＦＦ
１６．８分にバルブ８ａをＯＮ、１８．８分にバルブ８ｂをＯＮ
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア１名から採血した血清試料を前記方法で測定した結果（クロマトグラム）を図４（ＨＤＬ画分）および図５（（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分）に示す。ＨＤＬ画分中のαトコフェロールのピーク（図４（ａ））および（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のαトコフェロールのピーク（図５（ａ））において、逆相クロマトグラフ部に二本の逆相カラムを有した測定装置（実施例２）では確認されなかった、リーディング（本来のピークの前に尾を引く現象）が発生した。このため、本発明の測定装置に備える逆相クロマトグラフ部には、逆相カラムを二本以上有したほうが好ましいことがわかる。
【００４７】
実施例４
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア３名から採血した血清試料を実施例２の方法で測定した。また、比較対照法として、前記血漿試料を超遠心分離によりＨＤＬ、ＬＤＬ＋ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン（ＣＭ）に分画した後、ヘキサン抽出してビタミンＥ類（αトコフェロール、γトコフェロール）を測定するとともに、遊離コレステロールＥテストワコー（和光純薬工業（株）製）により試料中の遊離コレステロールを測定する、超遠心法も行なった。超遠心法における測定条件を以下に示す。
【００４８】
超遠心法の測定条件
超遠心分離による各リポタンパクの分画条件
ＨＤＬ画分：比重１．０６３ｇ／ｍＬ以上
（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分：比重１．００６から１．０６３ｇ／ｍＬ
ＶＬＤＬ画分：
比重１．００６ｇ／ｍＬ以下、かつ浮上係数（比重液１．０６３ｇ／ｍＬ）が
２０から４００
ＣＭ画分：
比重１．００６ｇ／ｍＬ以下、かつ浮上係数（比重液１．０６３ｇ／ｍＬ）が
４００以上
各リポタンパクからのビタミンＥ類の抽出
ｉ）分画した各リポタンパク画分（ＨＤＬ画分および（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分は
７５μＬ、ＶＬＤＬ画分およびＣＭ画分は１００μＬ）に対し、インターナ
ルコントロール溶液（１０μｇ／ｍＬのδトコフェロールを含むエタノール
溶液）１００μＬを加え、混合する
ｉｉ）エタノール６００μＬを添加し、混合する
ｉｉｉ）２ｍＬのヘキサンを添加し、混合する
ｉｖ）１ｍＬのヘキサン層（上層）を取り、窒素ガスを吹き付けて乾固させる
ｖ）エタノール５００μＬを添加し、再溶解する
液体クロマトグラフの条件
分析カラム：
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５
ｃｍ
溶離液：
２５ｍＭ 過塩素酸ナトリウム＋０．０２５ｍＭ 過塩素酸＋８６．５％ エ
タノール
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
蛍光検出器の波長：励起波長２９８ｎｍ、蛍光波長３２５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
実施例２の測定法（ＨＰＬＣ法）での測定値と比較対照法（超遠心法）での測定値とを比較した結果を表１から３に示す。なおリポタンパクのうち、Ｌｐ（ａ）は、ＨＰＬＣ法ではＣＭ画分に含まれ、超遠心法では（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分およびＨＤＬ画分に含まれる。また、ＣＭ画分中のγトコフェロール量およびコレステロール量は感度不足のため、測定が不可能であった。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
一部を除き、試料中に含まれる各リポタンパク中のビタミンＥ類（αトコフェロール量、γトコフェロール）の量およびコレステロール量の、測定値の比率（ＨＰＬＣ法での測定値に対する超遠心法での測定値の比率）は、１００±４０％の範囲に収まった。
【００５２】
実施例５
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア１名から採血した血清試料（実施例２で使用した血清試料とは異なる）を図２に示す本発明の測定装置を用いて、ＨＤＬ画分、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分、およびＶＬＤＬ画分の３つに分画し、各画分中のγトコフェロール量、αトコフェロール量およびコレステロール量を測定した。なお、測定条件は、下記変更内容を除き実施例２と同様である。
【００５３】
変更内容
溶離液Ｄ（１ｄ）：
２５ｍＭ 過塩素酸ナトリウム＋０．０２５ｍＭ 過塩素酸＋８４％ エタノー
ル
陰イオン交換カラム５のグラジエントパターン：
０分から２分は溶離液Ｂ１９％＋溶離液Ａ８１％
２分から５分は溶離液Ｂ１９％＋溶離液Ａ８１％から溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ
９０％へのリニアグラジエント
５分から１５分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
１５分から１７分は溶離液Ｂ２６％＋溶離液Ａ７４％
１７分から２０分は溶離液Ｂ２６％＋溶離液Ａ７４％から溶離液Ｂ１０％＋溶離
液Ａ９０％へのリニアグラジエント
２０分から３０分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
３０分から３２分は溶離液Ｂ３３％＋溶離液Ａ６７％
３２分から３５分は溶離液Ｂ３３％＋溶離液Ａ６７％から溶離液Ｂ１０％＋溶離
液Ａ９０％へのリニアグラジエント
３５分から４５分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
４５分から４７分は溶離液Ｂ１００％
４７分から５５分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
流路切り替えバルブ８ａ・８ｂの切り替え
０．３分にバルブ８ａをＯＦＦ、２．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
６．３分にバルブ８ａをＯＮ、８．３分にバルブ８ｂをＯＮ
１５．３分にバルブ８ａをＯＦＦ、１７．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
２１．３分にバルブ８ａをＯＮ、２３．３分にバルブ８ｂをＯＮ
３０．３分にバルブ８ａをＯＦＦ、３２．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
３６．３分にバルブ８ａをＯＮ、３８．３分にバルブ８ｂをＯＮ
測定結果（クロマトグラム）を図６に示す。蛍光検出器１１によりＨＤＬ画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロール、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロール、ＶＬＤＬ画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロールが確認された（図６（ａ））。また紫外検出器１２により、ＨＤＬ画分中のコレステロール、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロール、ＶＬＤＬ画分中のコレステロールが確認された（図６（ｂ））。
【００５４】
実施例６
実施例５で用いた血清試料と同じ試料を用いて、同時再現性試験（ｎ＝１０）を行なった。測定方法は実施例５と同様である。結果を表４に示す。
【００５５】
【表４】
各リポタンパク画分中のビタミンＥ類およびコレステロールのＣＶ（％）は、全て１０％以内であった。
【００５６】
実施例７
実施例５で用いた血清試料と同じ試料を用いて、希釈直線性試験を行なった。具体的には、血清試料を６段階に希釈（溶離液Ａ：Ｂ＝９：１の溶液で、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、または６０倍に希釈した試料）し、実施例５と同様の条件で測定した。各希釈試料を血清試料導入量に換算すると、それぞれ、１３．３μＬ、１０μＬ、６．７μＬ、５．０μＬ、３．３μＬ、１．７μＬとなる。結果を図７および図８に示す。各リポタンパク画分のγトコフェロール量およびαトコフェロール量の測定値と希釈試料導入量との相関係数はいずれも０．９以上を示し（図７）、各リポタンパク画分中のコレステロール量の測定値と希釈試料導入量との相関係数もいずれも０．９以上を示した（図８）。
【００５７】
実施例８
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア１０名から採血した血清試料を図２に示す本発明の測定装置を用いて、ＨＤＬ画分、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分、およびＶＬＤＬ画分の３つに分画し、各画分中のγトコフェロール量、αトコフェロール量、およびコレステロール量を測定した（ＨＰＬＣ法）。なお、測定条件は実施例５と同じである。また、比較対照法として、実施例４に示す（ただし、ＣＭ画分は使用しない）超遠心法も行なった。
【００５８】
実施例５の測定法（ＨＰＬＣ法）での測定値と比較対照法（超遠心法）での測定値とを比較した結果を図９および図１０に示す。ＨＤＬ画分、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分およびＶＬＤＬ画分、それぞれに含まれるγトコフェロール量、αトコフェロール量およびコレステロール量に関して、ＨＰＬＣ法での測定値と超遠心法での測定値との相関係数はいずれも０．８以上であった。
【符号の説明】
【００５９】
１：溶離液
２：ポンプ
３：混合装置
４：オートサンプラー
５：陰イオン交換カラム
６：前処理液
７：三方混合流路
８：流路切り替えバルブ（六方電磁弁）
９：サンプルループ
１０：逆相カラム
１１：紫外検出器
１２：蛍光検出器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるリポタンパク（高比重リポタンパク（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）および中間型リポタンパク（ＩＤＬ）、超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）およびリポタンパク（ａ）（Ｌｐ（ａ）））中のコレステロールおよびビタミンＥ類（αトコフェロール、γトコフェロール）の同時測定方法、ならびに当該測定方法を利用した測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化の危険因子として、酸化したリポタンパクが注目を浴び、多くの研究がなされている。一方、リポタンパクが酸化リポタンパクになるのを防ぐための主要な抗酸化物質として、ビタミンＥ類（主にαトコフェロールとγトコフェロール）が知られている。従って、血液試料中に含まれる各リポタンパク中のビタミンＥ類の量を分析することは、動脈硬化のメカニズムを理解するうえで重要である。
【０００３】
血清リポタンパク中に多量に含まれるビタミンＥ類の一つ、αトコフェロールについては複数の学術研究が成されている。冠動脈疾患患者の血清ＬＤＬ中の総コレステロール量に対するαトコフェロール量が健常者のそれに比べて有意に低下していることが報告されており、ＬＤＬの抗酸化作用を低下させ動脈硬化の原因の一つになっていると考えられている（非特許文献１および２）。ＬＤＬ中のγトコフェロールおよびＬＤＬ以外のリポタンパク中のビタミンＥ類についての報告はこれまでにないが、ＬＤＬ以外のリポタンパク中にもビタミンＥ類が含まれていることから、各リポタンパク中のビタミンＥ類の量を分析し比較することで、動脈硬化の進展のメカニズムの詳細を知ることができ、動脈硬化性疾患の予防および治療に結びつけられることが予想される。
【０００４】
従来、リポタンパク中のビタミンＥ類の測定方法として、試料中の各リポタンパクを分離後、リポタンパク中のビタミンＥ類をヘキサンで抽出し、抽出溶液を乾固して濃縮後、メタノール等により再溶解して逆相クロマトグラフに供する方法が知られている（非特許文献１から４）。また前記測定方法における、各リポタンパクの分離方法については、超遠心分離による方法（非特許文献１から４）、アクリルアミド電気泳動による方法、ゲルろ過クロマトグラフによる方法、イオン交換クロマトグラフによる方法（非特許文献５および６）が知られている。
【０００５】
一方、本出願人は以前、
イオン交換クロマトグラフによりリポタンパクを分離し、
有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液と反応させてビタミンＥ類を遊離させ、
遊離したビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供し分離し、
分離したビタミンＥ類の量を測定する、
リポタンパク中のビタミンＥ類の測定方法を確立している（特開２００８−００３０８２号公報：特許文献１）。前記測定方法は、試料に含まれる各リポタンパク中のビタミンＥ類を簡便に測定できる方法であり、自動化も可能な方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−００３０８２号公報
【特許文献２】特開２００２−２９６２６１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈａｉｄａｒｉ Ｍら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７、ｐ．１２３４（２００１）
【非特許文献２】Ｆｅｋｉ Ｍら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４６、ｐ．１４０１（２０００）
【非特許文献３】Ｙｏｌａｎｄａ Ｂら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７、ｐ．１２７（１９９７）
【非特許文献４】Ｔｅｉｓｓｉｅｒ Ｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２、ｐ．４３０（１９９６）
【非特許文献５】Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ Ｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４、ｐ．１４０４（２００３）
【非特許文献６】Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ Ｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０８、ｐ．３３６（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述した特許文献１で開示のリポタンパク中のビタミンＥ類の測定方法は、試料に含まれる各リポタンパク中のビタミンＥ類を簡便に測定できる方法である。しかしながら、リポタンパク中のビタミンＥ類の測定値は、試料に含まれる各リポタンパクの濃度によっても変動する。したがって、例えば、患者が異なる場合や、同じ患者であっても時期が異なる場合や、特定の病態を有する患者集団間で比較する場合には、各リポタンパク中のビタミンＥ類の測定値と、当該リポタンパク中のコレステロール量、タンパク量、中性脂肪量、総脂肪量などとの比率を算出して、比較する必要がある。しかしながら、前記比較を行なうには、特許文献１で開示のリポタンパク中のビタミンＥ類の測定方法と、各リポタンパク質中のコレステロール、タンパク質、中性脂肪または総脂肪を測定する方法（例えば非特許文献５に記載の方法）とを別個に行なった後、各方法で得られた結果を組み合わせる必要があったため、操作が煩雑であった。また、比率を算出する際、誤差が大きくなる問題があった。
【０００９】
そこで本発明は、試料に含まれる各リポタンパク中のビタミンＥ類を測定する方法において、各リポタンパク中のコレステロールも同時に測定可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するためになされた本発明は、以下の態様を包含する：
すなわち本発明の第一の態様は、
リポタンパクを含む試料をイオン交換クロマトグラフに供してリポタンパクを分離し、
分離したリポタンパクを、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液と反応させてコレステロールおよびビタミンＥ類を遊離させ、
遊離させたコレステロールおよびビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供して分離し、
分離したコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定する、
リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を同時に測定する方法である。
【００１１】
また本発明の第二の態様は、分離したコレステロール量の測定と分離したビタミンＥ類の量の測定とを、異なる検出器で行なう、前記第一の態様に記載の方法である。
【００１２】
また本発明の第三の態様は、前記第一または第二の発明に記載の測定方法で得られた、各リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出することで、糖尿病の病態を測定する方法である。
【００１３】
また本発明の第四の態様は、前記第一または第二の発明に記載の測定方法で得られた、各リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出することで、心筋梗塞の病態を測定する方法である。
【００１４】
また本発明の第五の態様は、
リポタンパクを含む試料を一定量導入する試料導入部と、
リポタンパク質を分離するためのイオン交換カラムを有したイオン交換クロマトグラフ部と、
イオン交換クロマトグラフ部から溶出した液の一部または全部と、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液とを混合する試薬混合部と、
前処理液により遊離したコレステロールおよびビタミンＥ類を分離するための逆相カラムを有した逆相クロマトグラフ部と、
逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるコレステロール量を測定するための検出器と、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類の量を測定するための検出器と、を有した検出部と、
試料導入部で導入した試料およびイオン交換カラムに導入する溶離液を送液する第一の送液部と、
前処理液を送液する第二の送液部と、
逆相カラムに導入する溶離液を送液する第三の送液部と、
を備えた、リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を同時に測定する装置である。
【００１５】
また本発明の第六の態様は、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるコレステロール量を測定する検出器が紫外検出器であり、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類の量を測定する検出器が蛍光検出器である、前記第五の態様に記載の装置である。
【００１６】
また本発明の第七の態様は、逆相クロマトグラフ部に有した逆相カラムが二本以上である、前記第五または第六の態様に記載の装置である。
【００１７】
以下に、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
本発明の測定方法の測定対象である、リポタンパクを含む試料としては、全血、血清、血漿、血清といった血液試料や、前記試料を適切な溶液に懸濁して得られる懸濁溶液が例示できる。
【００１９】
本発明の測定方法で測定するコレステロールは、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液により遊離された遊離コレステロールである。血液中のコレステロールには、遊離型コレステロールとエステル型コレステロールの２種類が存在し、通常コレステロールの測定に用いられる、コレステロールエステラーゼにより試料中のエステル型コレステロールを遊離型コレステロールに変換後、コレステロールオキシダーゼにより遊離型コレステロールを分解して生じた過酸化水素の量を比色法で測定する方法では、遊離型コレステロールとエステル型コレステロールとの総和（総コレステロール量）を測定する。しかしながら、本発明の測定方法では、前述したエステル型コレステロールを遊離型コレステロールに変換する反応を組み入れると測定装置が複雑となることから、遊離型コレステロールのみを測定する。ただし、各リポタンパク中の総コレステロール量と遊離型コレステロール量とは良好な相関関係（後述の実施例１参照）があることから、本発明の測定方法で得られる、各リポタンパク中の遊離コレステロール量とビタミンＥ類との比率を、病態を測定する際用いる、各リポタンパク中の総コレステロール量とビタミンＥ類との比率として用いてもよい。
【００２０】
本発明の測定方法では、リポタンパクを含む試料をまずイオン交換クロマトグラフに供して各リポタンパクを分離する。イオン交換クロマトグラフは、分離能が高く、種々のリポタンパクを精密に分離することができる。イオン交換クロマトグラフは、分離剤をカラムに充填した態様で実施すると好ましく、また使用する分離剤（イオン交換体）としては、リポタンパクの分離能が高い、陰イオン交換クロマトグラフ用の分離剤（陰イオン交換体）が好ましい。イオン交換クロマトグラフによるリポタンパクの分離操作では、試料中のリポタンパクを分離剤（例えば陰イオン交換体）にいったん吸着させた後、塩濃度の異なる溶離液をステップグラジエントまたはリニアグラジエントで供することにより、電荷の差および疎水性の差に基づいて各リポタンパクが分離溶出される。イオン交換クロマトグラフで使用する溶離液には、カオトロピックイオンを添加すると好ましい（特許文献１）。イオン交換クロマトグラフにおいて使用する、分離剤の量（イオン交換容量）、溶離液の組成、溶離液の流速等の諸条件は、供する試料の種類や量に応じ、後述する実施例で採用した条件、または予備検討により、各リポタンパクを分離し、異なる画分として回収できるような条件を適宜決定すればよい。ステップグラジエントまたはリニアグラジエントの溶出条件は、どのリポタンパク中のビタミンＥ類を測定するかによって適宜設定すればよい。例えば、血液中の主たるリポタンパクである、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）および超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）中のビタミンＥ類を測定することを目的とする場合は、まず試料中のリポタンパクをイオン交換体表面にいったん吸着させた後、最初の溶出条件（ステップ）でＨＤＬを溶出し、２番目のステップでＬＤＬおよび中間リポタンパク（ＩＤＬ）を溶出し、３番目のステップでＶＬＤＬを溶出し、４番目のステップでカイロミクロン（ＣＭ）およびリポタンパク（ａ）（Ｌｐ（ａ）を溶出すればよい。なお、２番目のステップでＬＤＬとＩＤＬを同時に溶出させているが、これは、広義のＬＤＬはＩＤＬも含むこと、またＩＤＬが高値を示す病態がまれであること、から同時に溶出させている。イオン交換クロマトグラフからの溶出液の回収は、例えば、ステップグラジエントの各ステップ毎、または一定容量毎に回収すればよい。
【００２１】
回収したイオン交換クロマトグラフからの溶出液は、当該溶出液の全て、または当該溶出液のうちリポタンパクを含む画分に対して、前処理液を一定の容量比で添加することで、リポタンパクからコレステロールおよびビタミンＥを遊離させる。前処理液は、コレステロールおよびビタミンＥ類を溶解するための有機溶媒と、リポタンパク粒子を壊してコレステロールおよびビタミンＥ類を遊離させるための界面活性剤とを少なくとも含んでいればよく、さらにアスコルビン酸等コレステロールおよびビタミンＥ類の酸化を防止するための還元剤や、界面活性剤とともにタンパク変性作用によりリポタンパク粒子を壊す効果を有するカオトロピックイオンを含んでもよい。特にイオン交換クロマトグラフにおける溶離液にカオトロピックイオンが添加されていない場合には、前処理液にカオトロピックイオンを含むと好ましい。コレステロールとビタミンＥ類は、いずれもリポタンパク中に含まれており、かつ両者の疎水性が類似していることから、前処理液の組成は、特許文献１に記載した、リポタンパク中のビタミンＥ類を遊離させる前処理液の組成と同様の組成としてよい。
【００２２】
前処理液との反応により、各リポタンパクから遊離したコレステロールおよびビタミンＥ類は、リポタンパクと前処理液との混合液として逆相クロマトグラフに供する。イオン交換クロマトグラフにより各リポタンパク画分を分離して溶出させる際、塩を含む溶離液を使用することから、本発明の測定方法では遊離したコレステロールおよびビタミンＥ類の分離に、塩類を含む試料を精度よく分離できる逆相クロマトグラフを採用している。逆相クロマトグラフは、イオン交換クロマトグラフと同様、分離剤をカラムに充填した態様で実施すると好ましい。前処理液により遊離させたコレステロールおよびビタミンＥ類を含む試料を、逆相クロマトグラフに供することにより、コレステロールおよびビタミンＥ類を分離して溶出させ、当該溶出液に含まれるコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定することで、リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を同時に測定することができる。逆相クロマトグラフにおける、使用する分離剤の量、溶離液の組成、溶離液の流速等の諸条件は、分析に供する試料の種類や量に応じ、後述する実施例で採用した条件、または予備検討により、適宜決定すればよい。なお分析精度の向上を目的に、イオン交換クロマトグラフによるリポタンパクの分離後、逆相クロマトグラフに供するまでに、δトコフェロールをインターナルコントロールとして添加してもよい。δトコフェロールはビタミンＥ類の一つであるが、リポタンパク中に含まれるビタミンＥ類は主にαトコフェロールとγトコフェロールであり、δトコフェロールはαトコフェロールの１００分の１程度しか存在しないため、インターナルコントロールとして最適である。
【００２３】
逆相クロマトグラフにより分離されたリポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類は各測定対象に適した方法で検出することで、コレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定することができる。ただし、リポタンパク中のコレステロールとリポタンパク中のビタミンＥ類とを同一の方法で検出すると、クロマトグラムにおいてピークが重なった場合、検出が困難となることから、好ましくは、リポタンパク中のコレステロールの検出と、リポタンパク中のビタミンＥ類の検出は、異なる方法（検出器）で検出したほうが好ましい。
【００２４】
本発明の測定方法で得られる、リポタンパク中のコレステロール量およびリポタンパク中のビタミンＥ類の量から、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出することで、糖尿病の病態および心筋梗塞の病態を測定することができる。具体的には、
（１）ＶＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有し、健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないとする、糖尿病の病態の測定、
（２）ＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ高い場合は糖尿病の病態を有し、健常人の平均値に比べ高くない場合は糖尿病の病態を有しないとする、糖尿病の病態の測定、
（３）ＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ高い場合は心筋梗塞の病態を有し、健常人の平均値に比べ高くない場合は心筋梗塞の病態を有しないとする、心筋梗塞の病態の測定、
（４）ＶＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有し、健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないとする、糖尿病の病態の測定、
が例示できる（特許文献１）。
【００２５】
本発明の測定方法を用いた、リポタンパク中のコレステロール量およびビタミンＥ類の量を同時に測定する装置（以下単に、本発明の測定装置とする）における試料導入部は、試料導入部の所定場所に搬入された試料容器等から自動的に一定量の試料を採取し得るものであれば特に制限はなく、ＡＳ−８０２０（商品名、東ソー（株）製）など、通常用いられるオートサンプラーを使用することができる。また試料導入部には、試料容器を前記所定場所に自動的に搬入する装置をさらに有してもよい。
【００２６】
本発明の測定装置におけるイオン交換カラムは、各リポタンパクを分離可能なものであれば制限はなく、具体例として、ＤＥＡＥ−ＮＰＲ、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（いずれも商品名、東ソー製）があげられる。特に、ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（商品名、東ソー製）といった、分離能力の高いノンポーラス系の陰イオン交換カラムが好ましい。
【００２７】
本発明の測定装置における逆相カラムは、コレステロールおよびビタミンＥ類を吸着可能なものであれば制限はなく、具体例として、ＯＤＳ−８０Ｔｓ（商品名、東ソー製）があげられる。なお本発明の測定装置において、逆相クロマトグラフ部による一回の分析には、一定の時間が必要である。後述の実施例２のように、一回の分析に１５分程度を要する場合には、そのままだとイオン交換クロマトグラフ部から溶出した各リポタンパクに対する逆相カラムでの分析が完了する前に、他のリポタンパクがイオン交換クロマトグラフ部から溶出してしまう。このため、目的のリポタンパクを溶出させた後、一旦、イオン交換カラムに導入する溶離液の流速を下げるか、溶離液を停止するか、塩濃度の低い溶離液を流す。そして逆相クロマトグラフ部による前記リポタンパクの分析終了後、イオン交換カラムに導入する溶離液の流速を戻す（溶離液の流速を下げるか、溶離液を停止する場合）、または溶離液の塩濃度を戻し（塩濃度の低い溶離液を流した場合）、イオン交換クロマトグラフ部から次のリポタンパクを溶出させ、逆相クロマトグラフ部へ導入する。したがって、本発明の測定装置に備える逆相カラムとして、マイクロカラムのような、分析に要する時間を短縮可能なカラムを用いると好ましいといえる。
【００２８】
本発明の測定装置における試薬混合部は、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液の一部または全部と、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液とを混合可能な構成であればよい。後述の実施例２では、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液の全部を前処理液と混合後、その一部を逆相クロマトグラフ部に導入している。ただし、クロマトグラフ条件が一定であれば、イオン交換クロマトグラフ部からの各リポタンパクの溶出時間が予想し得るため、前処理試薬の送液を当該予想時間に合わせて行ない、それ以外の時間は送液を停止する態様を採用してもよく、当該態様により前処理試薬の消費量を節約することができる。イオン交換クロマトグラフ部からの溶出と前処理試薬との混合は、例えば、前処理試薬を送液する配管とイオン交換クロマトグラフ部からの溶出液を送液する配管とを単に合流させるのみでもよいが、合流後に例えばスタティックミキサーＣ（商品名、東ソー製）のような混合装置を用いて混合したり、合流後に配管内径が太い配管を設け流速を低下させることで混合したり、内壁に凹凸を形成した配管や内径が変化する配管を用いて混合したりすると好ましい。
【００２９】
本発明の測定装置における検出部は、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるコレステロール量を測定するための検出器と、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類の量を測定するための検出器とを有している。コレステロール量を測定可能な検出器としては、紫外検出器、質量検出器、蛍光検出器、電気化学検出器を例示できる。この中でも、十分な検出感度を有し、かつメンテナンス等の維持作業が容易な、紫外検出器が特に好ましい。ビタミンＥ類の量を測定するための検出器としては、紫外検出器、質量検出器、蛍光検出器、電気化学検出器が例示できる。この中でも、十分な検出感度を有し、かつメンテナンス等の維持作業が容易な、蛍光検出器が特に好ましい。
【００３０】
本発明の測定装置の一例を図２に示す。図２に示す測定装置は、
リポタンパクを含む試料を一定量導入するオートサンプラー４と、
リポタンパク質を分離するための陰イオン交換カラム５を有したイオン交換クロマトグラフ部と、
イオン交換クロマトグラフ部から溶出した液の一部または全部と、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液６とを混合する、三方混合流路７と混合装置３ｂとを有した、試薬混合部と、
前処理液により遊離したコレステロールおよびビタミンＥ類を分離するための逆相カラム１０ａ・１０ｂを有した逆相クロマトグラフ部と、
逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれる遊離したコレステロール量を測定するための紫外検出器１１と、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類の量を測定するための蛍光検出器１２と、を有した検出部と、
試料導入部で導入した試料およびイオン交換カラム５に導入する溶離液１ａ・１ｂと、溶離液１ａ・１ｂを送液するためのポンプ２ａ・２ｂと、溶離液１ａ・１ｂを混合させるための混合装置３ａとを有した、第一の送液部と、
前処理液６と、前処理液６を送液するためのポンプ２ｅと、有した第二の送液部と、
逆相カラム１０に導入する溶離液１ｃ・１ｄと、溶離液１ｃ・１ｄを送液するためのポンプ２ｃ・２ｄと、有した第三の送液部と、
イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と前処理液との混合液をサンプルループ９に充填可能な状態（ＯＦＦ状態）と、サンプルループ９に充填した混合液を溶離液１ｃにより逆相カラム１０ａへ送液可能な状態（ＯＮ状態）とを切り替え可能な、流路切り替えバルブ８ａと、
サンプルループ９に充填した混合液を逆相カラム１０ａに充填可能な状態（ＯＦＦ状態）と、逆相カラム１０ａに吸着したリポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を
溶離液１ｄにより逆相カラム１０ｂへ送液可能な状態（ＯＮ状態）とを切り替え可能な、流路切り替えバルブ８ｂと、
を備えた装置である。
【００３１】
図２に示す測定装置では、ポンプ２ａ・２ｂの駆動をコンピューター等で制御し塩濃度の異なる溶離液１ａ・１ｂの送液量を制御することで、イオン交換カラム５に導入する異なる組成（塩濃度）の溶離液をステップグラジエントまたはリニアグラジエントのいずれのモ−ドでも導入することが可能である。ポンプ２ａ・２ｂの具体例としては、ＤＰ−８０２０（商品名、東ソー製）があげられる。なお、図２に示す測定装置では、ポンプ２ａ・２ｂにより送液された溶離液１ａ・１ｂは、イオン交換カラム５に導入する前に混合装置３ａで混合される。混合装置３ａの具体例としては、スタティックミキサーＣ（商品名、東ソー製）があげられる。
【００３２】
図２に示す測定装置において、前処理試薬を送液するポンプ２ｅ、および逆相カラムに導入する溶離液を送液するポンプ２ｃ・２ｄは、前述のポンプ２ａ・２ｂ同様、ＤＰ−８０２０（商品名、東ソー製）のような、液体クロマトグラフで通常用いられるポンプを使用することができる。なお、図２に示す測定装置では、六方切り替えバルブ８ａを備えることで、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と前処理試薬との混合液、および逆相カラムに導入する溶離液１ｃを送液するための送液部を簡略化している。
【００３３】
また図２に示す測定装置では、逆相クロマトグラフ部に逆相カラムを二本有している。これにより、リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類のクロマトグラムにおける、テーリング（本来のピークの後に尾を引く現象）やリーディング（本来のピークの前に尾を引く現象）の発生が抑えられ、ピーク形状が改善する。その結果、分離性能の向上と、測定再現性および測定精度の向上が期待できる。さらに図２に示す測定装置では、二本の逆相カラムの一方１０ａを、流路切り替えバルブ８ｂのサンプルループ上に設けており、逆相カラム１０ａは、イオン交換クロマトグラフ部から溶出した液と前処理液との混合液に含まれるコレステロールおよびビタミンＥ類を吸着する一方、当該混合液に含まれる不純物はある程度除去する働きを有する。これにより、例えばリポタンパクを含む試料が患者血液の場合、当該試料に含まれる投与薬物による妨害を受けにくくなる。また、後続の逆相カラム１０ｂの耐久性も向上する。さらに、コレステロールおよびビタミンＥ類の吸着工程と分離工程とを分けて行なうため、分析時間の短縮にもつながる。
【００３４】
図２に示す測定装置による、リポタンパク中のコレステロール量およびビタミンＥ類の量の測定は、具体的には以下の方法で行なう。
（Ａ）オートサンプラー４を用いて採取したリポタンパクを含む試料を、溶離液１ａ・１ｂとともにポンプ２ａ・２ｂで送液してイオン交換カラム５に供し、試料中のリポタンパクをカラムに保持させる。
（Ｂ）同一組成の溶離液を一定量送液後、ポンプ２ａ・２ｂの送液量を制御し、イオン交換カラム５に導入する溶離液の塩濃度を高くすることで、イオン交換カラム５に保持された各リポタンパクを分離して溶出させる。
（Ｃ）溶出した各リポタンパクに対し、ポンプ２ｅにより送液された前処理液６を混合することで、リポタンパクからコレステロールおよびビタミンＥ類を遊離させる。なお前処理液６の送液量は、イオン交換カラム５から溶出するリポタンパクが希釈されすぎると、後続の逆相クロマトグラフ部における検出感度が低下するおそれがあり、また、前処理液に含まれる界面活性剤の濃度によっては、送液量を多くすると気泡が生じて送液不良となるおそれがあることから、イオン交換カラムから溶出される液量に対して０．２倍から５倍量とするとよく、０．５倍から２倍量とするとさらによい。
（Ｄ）流路切り替えバルブ８ａをＯＦＦ状態に切り替え、遊離させたコレステロールおよびビタミンＥ類を含む液を、サンプルループ９に導入する。なおサンプルループ９の容量は、後続の逆相カラム１０ａに導入すべき液量とすればよい。
（Ｅ）流路切り替えバルブ８ａをＯＮ状態、流路切り替えバルブ８ｂをＯＦＦ状態に、それぞれ切り替え、サンプルループ９に導入したコレステロールおよびビタミンＥ類を含む液をポンプ２ｃにより逆相カラム１０ａに導入することで、逆相カラム１０ａにコレステロールおよびビタミンＥ類を吸着させる一方、それ以外の不純物を除去する。
（Ｆ）流路切り替えバルブ８ｂをＯＮ状態に切り替え、溶離液１ｄをポンプ２ｄで逆相カラム１０ａに導入することで、吸着したコレステロールおよびビタミンＥ類を溶出させ、逆相カラム１０ｂに導入させる。
（Ｇ）逆相カラム１０ｂによりコレステロールおよびビタミンＥ類を分離溶出を行ない、分離溶出したコレステロール量を紫外検出器１１で測定し、分離溶出したビタミンＥ類の量を蛍光検出器１２で測定する。
【００３５】
前記（Ａ）から（Ｇ）の動作は、各機器をパーソナルコンピュータにつなぎ、自動的に制御することができる。また、測定したデ−タを同じパーソナルコンピュータで取り込み、各リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を自動的に算出させることもできる。
【００３６】
図２の測定装置により、イオン交換クロマトグラフによりリポタンパクを４つ（ＨＤＬ、ＬＤＬ＋ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ＋Ｌｐ（ａ））に分画し、各リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を測定する場合、概ね１試料あたりの分析時間は１時間程度となる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の測定方法は、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量とを同時に測定可能な方法である。病態やリスクの評価に用いる、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出する際、従来の方法では、リポタンパク中のコレステロール量の測定方法と、リポタンパク中のビタミンＥ類の測定方法とを別々の装置で行ない、前記二つの装置で得られた結果から別途比率を算出する必要があった。そのため、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出する場合に、二つの測定方法（測定装置）による試料注入量の誤差等が加算される問題があった。一方、本発明の測定方法では、単一の装置による一回の測定で、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量とを同時測定できるため、従来の方法と比較し、リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を簡便に算出することができる効果を有している。また、前記比率を算出する際に、試料注入量に関する誤差等が発生しない、という効果も有している。
【００３８】
なお、本発明の測定方法を利用した装置において、逆相クロマトグラフ部が逆相カラムを二本以上有し、かつ、そのうち少なくとも一本を不純物除去用とした態様とすると、後続のコレステロールおよびビタミンＥ類を分離するための逆相カラムにより得られるクロマトグラムにおいて、テーリング（本来のピークの後に尾を引く現象）やリーディング（本来のピークの前に尾を引く現象）の発生を抑えることができる。そのため、測定精度や感度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】各リポタンパク中の総コレステロール量と遊離コレステロール量との相関を示す図。（ａ）はＨＤＬでの、（ｂ）はＬＤＬでの、（ｃ）はＩＤＬでの、（ｄ）はＶＬＤＬでの、（ｅ）はカイロミクロンでの結果である。
【図２】本発明の測定装置の一例を示す図。
【図３】実施例２の方法で測定した結果（クロマトグラム）。（ａ）は蛍光検出器で各リポタンパク中のビタミンＥ類を検出した結果（クロマトグラム）であり、（ｂ）は紫外検出器で各リポタンパク中のコレステロールを検出した結果（クロマトグラム）である。
【図４】実施例３の方法で測定した結果（クロマトグラム）。（ａ）は蛍光検出器でＨＤＬ画分中のビタミンＥ類を測定した結果（クロマトグラム）であり、（ｂ）は紫外検出器でＨＤＬ画分中のコレステロールを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図５】実施例３の方法で測定した結果（クロマトグラム）。（ａ）は蛍光検出器で（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のビタミンＥ類を測定した結果（クロマトグラム）であり、（ｂ）は紫外検出器で（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロールを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図６】実施例５の方法で測定した結果（クロマトグラム）。（ａ）は蛍光検出器で各リポタンパク中のビタミンＥ類を測定した結果（クロマトグラム）であり、（ｂ）は紫外検出器で各リポタンパク中のコレステロールを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図７】各リポタンパク中のビタミンＥ類の希釈直線性試験の結果を示す図。（ａ）はＨＤＬ画分中のγトコフェロール、（ｂ）はＨＤＬ画分中のαトコフェロール、（ｃ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のγトコフェロール、（ｄ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のαトコフェロール、（ｅ）はＶＬＤＬ画分中のγトコフェロール、（ｆ）はＶＬＤＬ画分中のαトコフェロールの結果である。
【図８】各リポタンパク中のコレステロールの希釈直線性試験の結果を示す図。（ａ）はＨＤＬ画分中のコレステロール、（ｂ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロール、（ｃ）はＶＬＤＬ画分中のコレステロールの結果である。
【図９】ＨＰＬＣ法および超遠心法で測定した、各リポタンパク中のビタミンＥ類の量の相関性を示す図。（ａ）はＨＤＬ画分中のγトコフェロール量、（ｂ）はＨＤＬ画分中のαトコフェロール量、（ｃ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のγトコフェロール量、（ｄ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のαトコフェロール量、（ｅ）はＶＬＤＬ画分中のγトコフェロール量、（ｆ）はＶＬＤＬ画分中のαトコフェロール量の結果である。
【図１０】ＨＰＬＣ法および超遠心法で測定した、各リポタンパク中のコレステロール量の相関性を示す図。（ａ）はＨＤＬ画分中のコレステロール量、（ｂ）は（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロール量、（ｃ）はＶＬＤＬ画分中のコレステロール量の結果である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明を限定するものではない。
【００４１】
実施例１
特開２００２−２９６２６１号公報（特許文献２）の実施例で開示のリポタンパク質の測定方法と同様の方法により、各リポタンパク中の総コレステロール値と遊離コレステロール値を測定した。ただし、カラム（ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ、東ソー製）のサイズは３．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｍｍとし、流速は溶離液Ａと溶離液Ｂとの合計で０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、反応液の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。溶離液Ａと溶離液Ｂを混合するミキサーはスタティックミキサーＣ（東ソー製）とし、反応コイルのサイズは０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍとし、反応温度は４５℃とした。血清の注入量は１．９μＬとした。総コレステロールを測定する反応液としてはＴＣＨＯ−ＣＬ（セロテック製）を用い、遊離コレステロールを測定する反応液としては遊離コレステロールＥテストワコー（和光純薬工業製）を使用した。溶離液のステップグラジエントパターンは、０から２分は溶離液Ｂの割合を１７．２％、２分から４分は溶離液Ｂの割合を２１．７％、４分から５．５分は溶離液Ｂの割合を２３．６％、５．５分から７分は溶離液Ｂの割合を３２．６％、７分から８分は溶離液Ｂの割合を１００％、８分から１０分は溶離液Ｂの割合を１０％とし、１０分で１回の試料の測定が終了するよう設定した。
【００４２】
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア２０名から採血した血清試料について、前記方法により、血清試料中に含まれるリポタンパク（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン（ＣＭ））を分離し、各リポタンパク中の総コレステロール量と遊離コレステロール量を測定した。各血清試料について測定結果をプロットした結果を図１に示す。いずれのリポタンパクにおいても、総コレステロール量と遊離コレステロール量との相関が良好であることから、各リポタンパク中のコレステロール量当たりのビタミンＥ類の量を算出する場合、コレステロール量として、総コレステロール量を用いても、遊離コレステロール量を用いても、その結果は同等といえる。以降の実施例では、遊離コレステロールを単にコレステロールとしている。
【００４３】
実施例２
図２に示す本発明の測定装置を用いて、各リポタンパク中のコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定した。装置構成および測定条件を以下に示す。
【００４４】
図２の装置構成
溶離液Ａ（１ａ）：
５０ｍＭ トリス＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ（ｐＨ７．５）
溶離液Ｂ（１ｂ）：
５０ｍＭ トリス＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ＋５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウム
（ｐＨ７．５）
溶離液Ｃ（１ｃ）：
２５ｍＭ 過塩素酸ナトリウム＋３０％ エタノール
溶離液Ｄ（１ｄ）：
２５ｍＭ 過塩素酸ナトリウム＋８６．５％ エタノール＋０．０２５ｍＭ 過
塩素酸
送液ポンプ２ａ・２ｂ・２ｃ・２ｄ・２ｅ：ＤＰ−８０２０（東ソー製）
混合装置３ａ・３ｂ：スタティックミキサーＣ（東ソー製）
オートサンプラー４：ＡＳ−８０２０（東ソー製）
陰イオン交換カラム５：
ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（東ソー製）、３．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｍｍ
前処理液６：
１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）＋７０％ エタノール
サンプルループ９：
容量２．５ｍＬのステンレスチューブ（０．８ｍｍＩ．Ｄ．×４９７．５ｃｍ）
逆相カラム１０ａ：
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３．５
ｃｍ
逆相カラム１０ｂ：
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×７．５
ｃｍ
測定条件
試料導入：
１００μＬ（導入した試料は、血清試料を（溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９：１）の溶
液で１５倍希釈した試料）
陰イオン交換カラム５への溶離液導入量：
０．２５ｍＬ／ｍｉｎ（溶離液Ａと溶離液Ｂとの合計）
陰イオン交換カラム５のグラジエントパターン：
０分から２分は溶離液Ｂ１９％＋溶離液Ａ８１％
２分から５分は溶離液Ｂ１９％＋溶離液Ａ８１％から溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ
９０％へのリニアグラジエント
５分から１０分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
１０分から１２分は溶離液Ｂ２６％＋溶離液Ａ７４％
１２分から１５分は溶離液Ｂ２６％＋溶離液Ａ７４％から溶離液Ｂ１０％＋溶離
液Ａ９０％へのリニアグラジエント
１５分から２０分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
２０分から２２分は溶離液Ｂ３３％＋溶離液Ａ６７％
２２分から２５分は溶離液Ｂ３３％＋溶離液Ａ６７％から溶離液Ｂ１０％＋溶離
液Ａ９０％へのリニアグラジエント
２５分から３０分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
３０分から３２分は溶離液Ｂ１００％
３２分から３５分は溶離液Ｂ１００％から溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％への
リニアグラジエント
３５分から５０分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
前処理液６の流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液Ｃ（１ｃ）および溶離液Ｄ（１ｄ）の流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
流路切り替えバルブ８ａ・８ｂの切り替え
０．３分にバルブ８ａをＯＦＦ、２．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
６．３分にバルブ８ａをＯＮ、８．３分にバルブ８ｂをＯＮ
１０．８分にバルブ８ａをＯＦＦ、１２．８分にバルブ８ｂをＯＦＦ
１６．８分にバルブ８ａをＯＮ、１８．８分にバルブ８ｂをＯＮ
２０．８分にバルブ８ａをＯＦＦ、２３．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
２６．８分にバルブ８ａをＯＮ、２８．８分にバルブ８ｂをＯＮ
３０．８分にバルブ８ａをＯＦＦ、３３．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
３６．８分にバルブ８ａをＯＮ、３８．８分にバルブ８ｂをＯＮ
紫外検出器１１の波長：２０５ｎｍ
蛍光検出器１２の波長：励起波長２９８ｎｍ、蛍光波長３２５ｎｍ
１試料当たりの測定時間：５０分
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア１名から採血した血清試料を前記条件で測定した結果（クロマトグラム）を図３に示す。蛍光検出器１１により、ＨＤＬ画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロール、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロール、ＶＬＤＬ画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロール、ならびに（カイロミクロン（ＣＭ）＋リポタンパク（ａ）（Ｌｐ（ａ））画分中のαトコフェロールが確認された（図３（ａ））。また紫外検出器１２により、ＨＤＬ画分中のコレステロール、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロール、ＶＬＤＬ画分中のコレステロール、および（ＣＭ＋Ｌｐ（ａ））画分中のコレステロールが確認された（図３（ｂ））。
【００４５】
実施例３
実施例２に示した装置構成および測定条件のうち、下記内容を変更した他は、実施例２と同様な条件でＨＤＬ画分および（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定した。
【００４６】
変更内容
逆相カラム１０ａ：
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１２ｃｍ
逆相カラム１０ｂ：設けず
流路切り替えバルブ８ａ・８ｂの切り替え（ＨＤＬ画分測定時）
０．３分にバルブ８ａをＯＦＦ、２．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
６．３分にバルブ８ａをＯＮ、８．３分にバルブ８ｂをＯＮ
流路切り替えバルブ８ａ・８ｂの切り替え（（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分測定時）
１０．８分にバルブ８ａをＯＦＦ、１２．８分にバルブ８ｂをＯＦＦ
１６．８分にバルブ８ａをＯＮ、１８．８分にバルブ８ｂをＯＮ
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア１名から採血した血清試料を前記方法で測定した結果（クロマトグラム）を図４（ＨＤＬ画分）および図５（（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分）に示す。ＨＤＬ画分中のαトコフェロールのピーク（図４（ａ））および（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のαトコフェロールのピーク（図５（ａ））において、逆相クロマトグラフ部に二本の逆相カラムを有した測定装置（実施例２）では確認されなかった、リーディング（本来のピークの前に尾を引く現象）が発生した。このため、本発明の測定装置に備える逆相クロマトグラフ部には、逆相カラムを二本以上有したほうが好ましいことがわかる。
【００４７】
実施例４
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア３名から採血した血清試料を実施例２の方法で測定した。また、比較対照法として、前記血漿試料を超遠心分離によりＨＤＬ、ＬＤＬ＋ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン（ＣＭ）に分画した後、ヘキサン抽出してビタミンＥ類（αトコフェロール、γトコフェロール）を測定するとともに、遊離コレステロールＥテストワコー（和光純薬工業（株）製）により試料中の遊離コレステロールを測定する、超遠心法も行なった。超遠心法における測定条件を以下に示す。
【００４８】
超遠心法の測定条件
超遠心分離による各リポタンパクの分画条件
ＨＤＬ画分：比重１．０６３ｇ／ｍＬ以上
（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分：比重１．００６から１．０６３ｇ／ｍＬ
ＶＬＤＬ画分：
比重１．００６ｇ／ｍＬ以下、かつ浮上係数（比重液１．０６３ｇ／ｍＬ）が
２０から４００
ＣＭ画分：
比重１．００６ｇ／ｍＬ以下、かつ浮上係数（比重液１．０６３ｇ／ｍＬ）が
４００以上
各リポタンパクからのビタミンＥ類の抽出
ｉ）分画した各リポタンパク画分（ＨＤＬ画分および（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分は
７５μＬ、ＶＬＤＬ画分およびＣＭ画分は１００μＬ）に対し、インターナ
ルコントロール溶液（１０μｇ／ｍＬのδトコフェロールを含むエタノール
溶液）１００μＬを加え、混合する
ｉｉ）エタノール６００μＬを添加し、混合する
ｉｉｉ）２ｍＬのヘキサンを添加し、混合する
ｉｖ）１ｍＬのヘキサン層（上層）を取り、窒素ガスを吹き付けて乾固させる
ｖ）エタノール５００μＬを添加し、再溶解する
液体クロマトグラフの条件
分析カラム：
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５
ｃｍ
溶離液：
２５ｍＭ 過塩素酸ナトリウム＋０．０２５ｍＭ 過塩素酸＋８６．５％ エ
タノール
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
蛍光検出器の波長：励起波長２９８ｎｍ、蛍光波長３２５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
実施例２の測定法（ＨＰＬＣ法）での測定値と比較対照法（超遠心法）での測定値とを比較した結果を表１から３に示す。なおリポタンパクのうち、Ｌｐ（ａ）は、ＨＰＬＣ法ではＣＭ画分に含まれ、超遠心法では（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分およびＨＤＬ画分に含まれる。また、ＣＭ画分中のγトコフェロール量およびコレステロール量は感度不足のため、測定が不可能であった。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
一部を除き、試料中に含まれる各リポタンパク中のビタミンＥ類（αトコフェロール量、γトコフェロール）の量およびコレステロール量の、測定値の比率（ＨＰＬＣ法での測定値に対する超遠心法での測定値の比率）は、１００±４０％の範囲に収まった。
【００５２】
実施例５
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア１名から採血した血清試料（実施例２で使用した血清試料とは異なる）を図２に示す本発明の測定装置を用いて、ＨＤＬ画分、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分、およびＶＬＤＬ画分の３つに分画し、各画分中のγトコフェロール量、αトコフェロール量およびコレステロール量を測定した。なお、測定条件は、下記変更内容を除き実施例２と同様である。
【００５３】
変更内容
溶離液Ｄ（１ｄ）：
２５ｍＭ 過塩素酸ナトリウム＋０．０２５ｍＭ 過塩素酸＋８４％ エタノー
ル
陰イオン交換カラム５のグラジエントパターン：
０分から２分は溶離液Ｂ１９％＋溶離液Ａ８１％
２分から５分は溶離液Ｂ１９％＋溶離液Ａ８１％から溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ
９０％へのリニアグラジエント
５分から１５分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
１５分から１７分は溶離液Ｂ２６％＋溶離液Ａ７４％
１７分から２０分は溶離液Ｂ２６％＋溶離液Ａ７４％から溶離液Ｂ１０％＋溶離
液Ａ９０％へのリニアグラジエント
２０分から３０分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
３０分から３２分は溶離液Ｂ３３％＋溶離液Ａ６７％
３２分から３５分は溶離液Ｂ３３％＋溶離液Ａ６７％から溶離液Ｂ１０％＋溶離
液Ａ９０％へのリニアグラジエント
３５分から４５分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
４５分から４７分は溶離液Ｂ１００％
４７分から５５分は溶離液Ｂ１０％＋溶離液Ａ９０％
流路切り替えバルブ８ａ・８ｂの切り替え
０．３分にバルブ８ａをＯＦＦ、２．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
６．３分にバルブ８ａをＯＮ、８．３分にバルブ８ｂをＯＮ
１５．３分にバルブ８ａをＯＦＦ、１７．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
２１．３分にバルブ８ａをＯＮ、２３．３分にバルブ８ｂをＯＮ
３０．３分にバルブ８ａをＯＦＦ、３２．３分にバルブ８ｂをＯＦＦ
３６．３分にバルブ８ａをＯＮ、３８．３分にバルブ８ｂをＯＮ
測定結果（クロマトグラム）を図６に示す。蛍光検出器１１によりＨＤＬ画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロール、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロール、ＶＬＤＬ画分中のγトコフェロールおよびαトコフェロールが確認された（図６（ａ））。また紫外検出器１２により、ＨＤＬ画分中のコレステロール、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分中のコレステロール、ＶＬＤＬ画分中のコレステロールが確認された（図６（ｂ））。
【００５４】
実施例６
実施例５で用いた血清試料と同じ試料を用いて、同時再現性試験（ｎ＝１０）を行なった。測定方法は実施例５と同様である。結果を表４に示す。
【００５５】
【表４】
各リポタンパク画分中のビタミンＥ類およびコレステロールのＣＶ（％）は、全て１０％以内であった。
【００５６】
実施例７
実施例５で用いた血清試料と同じ試料を用いて、希釈直線性試験を行なった。具体的には、血清試料を６段階に希釈（溶離液Ａ：Ｂ＝９：１の溶液で、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、または６０倍に希釈した試料）し、実施例５と同様の条件で測定した。各希釈試料を血清試料導入量に換算すると、それぞれ、１３．３μＬ、１０μＬ、６．７μＬ、５．０μＬ、３．３μＬ、１．７μＬとなる。結果を図７および図８に示す。各リポタンパク画分のγトコフェロール量およびαトコフェロール量の測定値と希釈試料導入量との相関係数はいずれも０．９以上を示し（図７）、各リポタンパク画分中のコレステロール量の測定値と希釈試料導入量との相関係数もいずれも０．９以上を示した（図８）。
【００５７】
実施例８
東ソー株式会社東京研究所で同意を得たボランティア１０名から採血した血清試料を図２に示す本発明の測定装置を用いて、ＨＤＬ画分、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分、およびＶＬＤＬ画分の３つに分画し、各画分中のγトコフェロール量、αトコフェロール量、およびコレステロール量を測定した（ＨＰＬＣ法）。なお、測定条件は実施例５と同じである。また、比較対照法として、実施例４に示す（ただし、ＣＭ画分は使用しない）超遠心法も行なった。
【００５８】
実施例５の測定法（ＨＰＬＣ法）での測定値と比較対照法（超遠心法）での測定値とを比較した結果を図９および図１０に示す。ＨＤＬ画分、（ＬＤＬ＋ＩＤＬ）画分およびＶＬＤＬ画分、それぞれに含まれるγトコフェロール量、αトコフェロール量およびコレステロール量に関して、ＨＰＬＣ法での測定値と超遠心法での測定値との相関係数はいずれも０．８以上であった。
【符号の説明】
【００５９】
１：溶離液
２：ポンプ
３：混合装置
４：オートサンプラー
５：陰イオン交換カラム
６：前処理液
７：三方混合流路
８：流路切り替えバルブ（六方電磁弁）
９：サンプルループ
１０：逆相カラム
１１：紫外検出器
１２：蛍光検出器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポタンパクを含む試料をイオン交換クロマトグラフに供してリポタンパクを分離し、
分離したリポタンパクを、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液と反応させてコレステロールおよびビタミンＥ類を遊離させ、
遊離させたコレステロールおよびビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供して分離し、
分離したコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定する、
リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を同時に測定する方法。
【請求項２】
分離したコレステロール量の測定と分離したビタミンＥ類の量の測定とを、異なる検出器で行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の測定方法で得られた、各リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出することで、糖尿病の病態を測定する方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の測定方法で得られた、各リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出することで、心筋梗塞の病態を測定する方法。
【請求項５】
リポタンパクを含む試料を一定量導入する試料導入部と、
リポタンパク質を分離するためのイオン交換カラムを有したイオン交換クロマトグラフ部と、
イオン交換クロマトグラフ部から溶出した液の一部または全部と、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液とを混合する試薬混合部と、
前処理液により遊離したコレステロールおよびビタミンＥ類を分離するための逆相カラムを有した逆相クロマトグラフ部と、
逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるコレステロール量を測定するための検出器と、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類の量を測定するための検出器と、を有した検出部と、
試料導入部で導入した試料およびイオン交換カラムに導入する溶離液を送液する第一の送液部と、
前処理液を送液する第二の送液部と、
逆相カラムに導入する溶離液を送液する第三の送液部と、
を備えた、リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を同時に測定する装置。
【請求項６】
逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるコレステロールを検出する検出器が紫外検出器であり、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類を検出する検出器が蛍光検出器である、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
逆相クロマトグラフ部に有した逆相カラムが二本以上である、請求項５または６に記載の装置。
【請求項１】
リポタンパクを含む試料をイオン交換クロマトグラフに供してリポタンパクを分離し、
分離したリポタンパクを、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液と反応させてコレステロールおよびビタミンＥ類を遊離させ、
遊離させたコレステロールおよびビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供して分離し、
分離したコレステロール量およびビタミンＥ類の量を測定する、
リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を同時に測定する方法。
【請求項２】
分離したコレステロール量の測定と分離したビタミンＥ類の量の測定とを、異なる検出器で行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の測定方法で得られた、各リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出することで、糖尿病の病態を測定する方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の測定方法で得られた、各リポタンパク中のコレステロール量とビタミンＥ類の量との比率を算出することで、心筋梗塞の病態を測定する方法。
【請求項５】
リポタンパクを含む試料を一定量導入する試料導入部と、
リポタンパク質を分離するためのイオン交換カラムを有したイオン交換クロマトグラフ部と、
イオン交換クロマトグラフ部から溶出した液の一部または全部と、有機溶媒および界面活性剤を含む前処理液とを混合する試薬混合部と、
前処理液により遊離したコレステロールおよびビタミンＥ類を分離するための逆相カラムを有した逆相クロマトグラフ部と、
逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるコレステロール量を測定するための検出器と、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類の量を測定するための検出器と、を有した検出部と、
試料導入部で導入した試料およびイオン交換カラムに導入する溶離液を送液する第一の送液部と、
前処理液を送液する第二の送液部と、
逆相カラムに導入する溶離液を送液する第三の送液部と、
を備えた、リポタンパク中のコレステロールおよびビタミンＥ類を同時に測定する装置。
【請求項６】
逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるコレステロールを検出する検出器が紫外検出器であり、逆相クロマトグラフ部から溶出した液に含まれるビタミンＥ類を検出する検出器が蛍光検出器である、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
逆相クロマトグラフ部に有した逆相カラムが二本以上である、請求項５または６に記載の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１３−８３４７９（Ｐ２０１３−８３４７９Ａ）
【公開日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２２０４６（Ｐ２０１１−２２２０４６）
【出願日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【公開日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
[ Back to top ]