リポ多糖の分析方法
【課題】 リポ多糖の分析を容易に行う方法を提供する。
【解決手段】 大腸菌、赤痢菌又はサルモネラ菌等のリポ多糖の分析方法であって、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン及びピリジンなどの塩基性イオンペアを含む移動相を用いて、リポ多糖を逆相系液体クロマトグラフィー又はサイズ排除系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、を包含する方法。
【解決手段】 大腸菌、赤痢菌又はサルモネラ菌等のリポ多糖の分析方法であって、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン及びピリジンなどの塩基性イオンペアを含む移動相を用いて、リポ多糖を逆相系液体クロマトグラフィー又はサイズ排除系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポ多糖の新規分析方法に関する。より詳しくは、リポ多糖を逆相系又はサイズ排除系液体クロマトグラフィーにより容易に分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポ多糖（以下、「ＬＰＳ」という）とは、共有結合で結ばれた脂質と多糖の複合体であり、特に、主としてグラム陰性細菌の外膜成分として存在するエンドトキシンの本体である。ＬＰＳの基本構造には、菌種間で共通性がみられ、分類学的に遠縁の菌では大きな違いがある。ＬＰＳは様々な生物活性を示し、病原細菌のＬＰＳは、宿主の免疫系により感染のシグナルとして認識される。
【０００３】
一方、エンドトキシンとは内毒素のことであり、細菌の菌体成分中にある毒性物質の総称であり、外毒素が生きた菌が産生して菌体外に放出されるのに対して、エンドトキシンは菌が死ぬことによって遊離する。エンドトキシンの成分はＬＰＳであることから、エンドトキシンは、大腸菌、赤痢菌、サルモネラ菌などのグラム陰性細菌のＬＰＳの同義語として用いられる。エンドトキシンをヒトや動物に注射すると、発熱がおこり、一時的に白血球が減少し、また多量に与えると死に至る。
【０００４】
従来知られているＬＰＳの検出方法としては、ウサギ発熱試験又はリムルス試験がある。
【０００５】
ウサギ発熱試験は、日本薬局方の発熱性物質試験に準拠するものであり、試験液を、３匹のウサギに静脈注射し、直腸温を注射後3時間観察し、注射直前の体温より０．６℃以上の上昇を示すウサギが２又は３匹の場合、発熱性物質が存在すると判断される。
【０００６】
一方、リムルス試験は、アメリカ産カブトガニの学名Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓに由来するものであり、１９６４年にＬｅｖｉｎｅとＢａｎｇが“生きた化石”といわれるカブトガニの血液にエンドトキシンを加えると凝固（ゲル化）することを見出し、その血球抽出液（ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ，ＬＡＬ）を用いて凝固の有無をみることにより検体中のエンドトキシンを検出する方法を創案したことに始まる。現在では、リムルス試験の分析キットが市販されている。
【０００７】
しかしながら、ウサギ発熱試験は、ｉｎ ｖｉｖｏでの試験であるので、コストがかかり、一方、リムルス試験は、分析キットが高価であり、いずれもＬＰＳの検出が容易に且つ安価に行えるものではない。
【０００８】
一方、糖類の分析方法としては、例えば、分析化学、３５巻、８６９−８７４ページ（１９８６年）が知られているが、この方法をリポ多糖に適用した例は存在しない。
【非特許文献１】分析化学、３５巻、８６９−８７４ページ、（１９８６年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＬＰＳの分析を容易に行う方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＬＰＳの簡易な分析方法につき検討を行った結果、ＬＰＳは両親媒性の化合物であるため、分析が難しく、逆相系液体クロマトグラフィーによる分析例は皆無であることがわかり、又、ＬＰＳは、直接マススペクトル分析はできないこともわかった。そこで、発明者らは、更に検討を行い、ＬＰＳが、特定なイオンペアの存在下、特定条件下で逆相系液体クロマトグラフィーを用いて容易に分離することが可能であること、又、特定な検出方法を用いることにより、分離したＬＰＳを容易に検出可能であることを見出し、かかる知見に基づいて本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明は、
（１） リポ多糖の分析方法であって、塩基性イオンペアを含む移動相を用いて、リポ多糖を逆相系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、を包含する方法、に関する。
【００１２】
更に、本発明は、
（２） リポ多糖の分析方法であって、
（ａ） 塩基性イオンペアを含む移動相を用いて、リポ多糖を逆相系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、
（ｂ） 分離したリポ多糖をアミンの存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させる工程、及び
（ｃ） 上記（ｂ）で得られた反応物を検出する工程、を包含する方法、に関する。
【００１３】
更に、本発明は、
（３） リポ多糖の分析方法であって、
（ａ） リポ多糖をサイズ排除系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、
（ｂ） 分離したリポ多糖をアミンの存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させる工程、及び
（ｃ） 上記（ｂ）で得られた反応物を検出する工程、を包含する方法、にも関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、移動相にトリブチルアミン等の塩基性イオンペアを加えることで、Ｃ１８等の逆相系のカラムを用いた液体クロマトグラフィー、特に高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」という）での分離がはじめて可能になった。
【００１５】
本発明の方法によれば、分離したＬＰＳをアミンの存在下で過ヨウ素酸酸化することで、少量のＬＰSの検出が可能となった。
【００１６】
本発明の方法によれば、移動相にトリブチルアミン等のイオンペアを加えることで、ＬＰＳの蛍光強度を検出する場合、蛍光強度が増加し、ＬＰＳの検出が容易となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００１８】
ＬＰＳの分離工程
本発明の分析の対象となるＬＰＳの試料としては、特に限定されないが、大腸菌、赤痢菌、サルモネラ菌などのグラム陰性細菌由来のＬＰＳが例示される。
【００１９】
分析する試料としては、ＬＰＳを含むものであれば特に限定されず、生体試料も含まれるが、生体試料に関しては固相抽出あるはカラムスイッチングバルブを用いる前処理を行ってもよい。更には、試料中のＬＰＳの有無の検出においては、ＬＰＳが存在しない試料も対象となる。
【００２０】
本発明で用いられる逆相系ＨＰＬＣ用の固定相としては、逆相系のものであれば特に限定されないが、例えば、トリアコンタン（Ｃ３０）、オクタデシル（Ｃ１８）、オクチル（Ｃ８）、ブチル（Ｃ４）、ＣＮ、グラファイトカーボン等の担体が例示され、好ましくはＣ１８、Ｃ８又はＣＮが推奨され、特にＣ１８又はＣＮが推奨される。
【００２１】
ＨＰＬＣは、固定相を含むカラムを市販のＨＰＬＣ装置を用いて行うことが可能であり、又、固定相を含むカラムも市販のものを用いればよい。カラムに充填する固定相の担体は、球形、破砕形を用いることができ、その粒子径は３〜１０μｍであり、５μｍ以下が好ましく、さらに３μｍが好ましい。用いるカラムのサイズはサンプルとして用いる試料の容積にもよるが、例えば内径２〜８ｍｍ、長さ２．５〜３０ｃｍのものを用いればよい。又、必要に応じてカードカラムを使用してもよい。
【００２２】
本発明で用いる塩基性イオンペアとしては、塩基性のものであれば特に制限されないが、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、トリブチルアンモニウムホルメート、トリヘキシルアンモニウムホルメート、テトラブチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラメチルブチルアンモニウム等が例示され、好ましくはトリブチルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミンが推奨される。
【００２３】
特に、Ｃ１８カラムを用いる際は、トリエチルアミンとの組み合わせが好ましく、ＣＮカラムを用いる場合は、トリブチルアミンとの組み合わせが好ましい。
【００２４】
特に、検出方法として後述する蛍光分析方法を採用する場合、トリブチルアミン、トリエチルアミンは、蛍光強度を増強することが可能であり、より効果的である。
【００２５】
塩基性イオンペアの濃度としては、例えば、移動相中、５〜５０ｍＭが例示され、好ましくは５〜１５ｍＭが推奨される。
【００２６】
移動相としては、特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、メタノール、テトラヒドロフラン、水又はこれらの混合溶媒が例示され、又、溶出は移動相の組成及び濃度を徐々に変化させるグラジエント溶出により行なうことが好ましい。又、移動層のｐＨを一定に保つために、更にバッファーを使用してもよい。バッファーとしては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等が例示される。バッファー濃度としては、例えば、５〜５０ｍＭが例示されるが、溶出させるＬＰＳの種類に応じて適宜変更すればよい。
【００２７】
特に移動相として、リン酸バッファー−アセトニル系のグラジエント溶出が推奨される。
【００２８】
ＨＰＬＣ分離の際の試料の注入量は、試料の種類や用いるカラムにより適宜決定することができるが、例えば１〜1００μＬ、好ましくは５〜２０μＬが例示される。試料の濃度としては、０．００１〜１ｍｇ／ｍｌが例示され、好ましくは０．００５〜０．０５ｍｇ／ｍｌが推奨される。
【００２９】
ＨＰＬＣ分離の際の移動相の流速は、０．１ｍＬ／分〜１ｍＬ／分、好ましくは０．２ｍＬ／分〜０．５ｍＬ／分である。
【００３０】
ＨＰＬＣ分離の際のカラム温度は、特に限定されないが、例えば、2０〜８０℃、より好ましくは２５〜４０℃である。
【００３１】
かくして分離したＬＰＳは、続いて検出のための誘導体化を行う。
【００３２】
反応工程（ＬＰＳの誘導体化）
上記方法で分離したリポ多糖は、アミンの存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させ、検出が容易な誘導体とすることができる。尚、前段階で分離したＬＰＳをそのまま検出することも可能であるが、高感度の分析を行うためには、ＨＰＬＣにより分離後に誘導体化を行うことが好ましい。
【００３３】
誘導体化は、前段階で分離したＬＰＳの移動相を、アミンの存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることにより行う。
【００３４】
具体的には、前段階で分離したＬＰＳ含有移動相と、アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相とを混合することにより、誘導体化を行えばよい。
【００３５】
アミンとしては、アンモニア、タウリン、エチレンジアミン、エタノールアミン、２−アミノプロピオニトリル、２−シアノアセトアミド、アルギニン、フェニルアラニン、ベンズアミジン及びヒドラジン等が例示され、好ましくは、タウリンが挙げられる。
【００３６】
アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムの使用量としては、移動相中、アミンが、1０〜２００ｍＭ、好ましくは、５０〜１００ｍＭが例示され、及び過ヨウ素酸ナトリウムを２〜２０ｍＭ、好ましくは６〜１２ｍＭが例示される。
【００３７】
アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相としては、ＬＰＳ分離用の移動相と同じものが例示され、例えば、アセトニトリル−水が例示され、好ましくは、分離後の移動相と同じ溶媒組成の移動相をイソクラティックに溶出することが好ましい。
【００３８】
この場合の、アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相の流速としては、ＬＰＳ分離の際の流速と同じ流速であるか、少なくとも２分の1以上の流速が好ましい。
【００３９】
ＬＰＳ含有移動相と、アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相とを混合するに際しては、Ｔ字管により混合することが可能であるほか、必要に応じてミキサーにより混合してもよい。
【００４０】
誘導体化の反応温度としては、８０〜１５０℃が例示され、好ましくは１００〜１２０℃が推奨される。
【００４１】
尚、ＬＰＳをアミン存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて得られる化合物は、ＬＰＳの種類に応じて変化するが、ジャーナルオブクロマトグラフィー、７２０巻、１８３〜１９９ページ（１９９６年）に記載のようなピリジン誘導体が生じているものと考えられる。
【００４２】
検出工程
前工程で得られた反応物を検出することにより、ＬＰＳを分析する。
【００４３】
検出方法としては、誘導体化物を含む移動相を、ＵＶ、蛍光強度等の検出手段により検出する。ＵＶを検出する場合は、２１０ｎｍ、２５４ｎｍ等で検出することができ、又、蛍光強度の検出では、励起波長３５０nｍ及び蛍光波長４３０ｎｍにより検出することができる。特に、ＬＰＳの試料が少量である場合には、高感度の検出が可能な蛍光強度測定が好ましい。
【００４４】
尚、検出は、室温で行うことが好ましいが、誘導体化を行った場合は、移動相の温度は８０〜１５０℃になることがあるので、検出の前に移動相を冷却することが好ましい。
【００４５】
分析装置
本発明では、ＬＰＳを、ＨＰＬＣによる分析工程、反応工程及び検出工程により行うが、好ましくはこれらの工程は移動相中で連続して行う。用いられる装置の例として、図１に例示するものが挙げられる。
【００４６】
即ち、デガッサー３を通した移動相１及び２をバイナリーポンプ４から溶出しながら、ＬＰＳ含有サンプルをオートサンプラー５でサンプリングする。サンプルは、固定相であるカラム６で分離されたのち、ミキシング部位７に流れる。一方、アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相８は、デガッサー９を通し、バイナリーポンプ１０を通じてミキシング部位７に流れる。ミキシング部位７中で、ＬＰＳを含有する移動相とアミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相とが混合され、サーモリアクター１１中で誘導体化を行う。ＬＰＳの誘導体化後に、移動相を冷却器１２で冷却し、続いて検出器１３で検出を行う。
【００４７】
ここで、サーモリアクター１１としては、例えば資生堂サーモリアクター３０１９を使用することが可能である。又、検出器１３としては、アジレント１１００シリーズ蛍光検出器が例示される。
【００４８】
このように、本発明の分析工程、反応工程及び検出工程を組み合わせることにより、ＬＰＳの分析が、容易に、安価に、高感度に、そして再現性よく可能となった。
【００４９】
本発明では、逆相系液体クロマトグラフィーの代わりに、サイズ排除系クロマトグラフィーを用いてＬＰＳを分離してもよい。
【００５０】
サイズ排除系クロマトグラフィーに用いるカラムに充填する固定相の担体は、球形、破砕形を用いることができ、その粒子径としては３〜１０μｍが例示され、５μｍ以下が好ましい。用いるカラムのサイズは、サンプルとして用いる試料の容積にもよるが、例えば内径2〜8ｍｍ、長さ５〜３０ｃｍのものを用いればよい。又、必要に応じてカードカラムを使用してもよい。
【００５１】
サイズ排除系クロマトグラフィー用のカラムとしては、例えば、ジオール、ポリヒドロキシエチル、ポリヒドロキシメタクリレート等を固定相として充填したものが例示され、好ましくは水系のサイズ排除系クロマトグラフィー用のカラムであって、アセトニトリル、メタノールなどの有機溶媒も使用可能なカラム、例えばジオール、ポリヒドロキシエチルカラムが好ましく、特にジオールカラムが推奨される。
【００５２】
サイズ排除系クロマトグラフィーを用いる際の移動相としては、例えば、前記したアセトニトリル、メタノール、アセトニトリル−リン酸バッファーの混合液等が例示され、イソクラティック条件下で溶出させることが好ましい。
【００５３】
サイズ排除系クロマトグラフィーを用いる際の試料の注入量、移動相の流速、カラム温度等は逆相系ＨＰＬＣのものと同じものが適用できる。
【００５４】
そして、サイズ排除系クロマトグラフィーを用いて分離したＬＰＳは、前記記載の反応工程、及び前記記載の検出工程により検出することが可能である。
【００５５】
特に、サイズ排除系液体クロマトグラフィーとしてジオールカラムを用い、塩基性イオンペアとしてトリブチルアミンを用いた場合、サンプルのカラムへの吸着を防ぐことが可能となり、分析する際の再現性を高めることが可能となる。そして、リポ多糖関連化合物が1ピークで現れるため、検出感度が相対的に増す。
【実施例】
【００５６】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５７】
実施例１
０．１０ｍｇのＥ． ｃｏｌｉ Ｃ，ＬＰＳに１．０ｍＬの５０％メタノールを加え、ＬＰＳ溶液を調製した。溶液の５μＬを、下記の条件でＨＰＬＣ分析した。
【００５８】
カラム：サーモサイエンティフィックＢｉｏＢａｓｉｃ ＣＮ（２．１ｍｍφ×５０ｍｍ）
カラム温度：３０℃
【００５９】
移動相Ａ：１５ｍＭリン酸、１５ｍＭトリブチルアミンの混合溶液を４５％水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整；
移動相Ｂ：アセトニトリル；
グラジエント；移動相Ａ：Ｂ＝８０：２０→Ａ：Ｂ＝４０：６０（％、３０ｍｉｎ）、続いてＡ：Ｂ＝４０：６０（％、１０ｍｉｎ）
流速：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：カラム出口に三方コックを接続し、０．２５ｍｌ／ｍｉｎで反応液（１００ｍＭタウリン、６ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムの混合溶液を水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整）と混合し、１００℃の反応管（０．２５ｍｍφ×１０ｍ）で反応後、アジレント１１００シリーズ蛍光検出器（アジレントテクノロジーズ）に導入し、ゲイン×１６の感度で、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４３０ｎｍで測定した。分析結果を図２に示す。メインピークを含めて、保持時間１９．５分、２１．８分、２５．４分及び２６．７分に4本のピークを検出した。
【００６０】
このように、ＣＮカラムを用い、移動相にトリブチルアミン（イオンペアー）とアセトニトリルを用いたＨＰＬＣにより、ＬＰＳをカラムに適当な時間保持させ、各種成分を分離、検出することができた。
【００６１】
実施例２
０．１ｍｇのＥ． ｃｏｌｉ Ｃ， ＬＰＳに１．０ｍＬの５０％メタノールを加え、ＬＰＳ溶液を調製した。溶液の５μＬを、下記の条件でＨＰＬＣ分析した。
【００６２】
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８（２．１ｍｍφ×５０ｍｍ）
カラム温度：３０℃
移動相Ａ：１５ｍＭリン酸、１５ｍＭトリエチルアミンの混合溶液を４５％水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエント；移動相Ａ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（％、３０ｍｉｎ）、続いてＡ：Ｂ＝４０：６０（％、１０ｍｉｎ）
流速：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：カラム出口に三方コックを接続し、０．２５ｍｌ／ｍｉｎで反応液（１００ｍＭタウリン、６ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムの混合溶液を水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整）と混合し、１００℃の反応管（０．２５ｍｍφ×１０ｍｍ）で反応後、アジレント１１００シリーズ蛍光検出器（アジレントテクノロジーズ）に導入し、ゲイン×１６の感度で、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４３０ｎｍで測定した。分析結果を図３に示す。メインピークを含めて保持時間２４．５分、３３．６分、３５．８分及び３８．２分に４本のピークを検出した。
【００６３】
このように、Ｃ１８カラムを用い、移動相にトリエチルアミン（イオンペアー）とアセトニトリルを用いたＨＰＬＣにより、ＬＰＳをカラムに適当な時間保持させ、各種成分を分離、検出することができた。
【００６４】
即ち、逆相系のカラムとイオンペアーの脂溶性因子を適切に組み合わせることによりＬＰＳの分離分析が可能になる。しかし、その組み合わせが悪い場合はカラムに保持されない、あるいはLPSがカラムから溶出されない現象が観測される。又、イオン交換樹脂カラムを用いたHPLCでは、LPSを分離することはできなかった。
【００６５】
実施例３
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ，ＬＰＳ，０．１０ｍｇに５０％メタノール１．０ｍｌを加え、ＬＰＳ溶液を調製した。溶液の５μｌを、下記の条件でＨＰＬＣ分析した。
カラム： ポリエルシー社ＰｏｌｙＨＹＤＲＯＸＹＥＴＨＹＬ Ａ（４．６ｍｍφ×２００ｍｍ，５μｍ，３００Å）
カラム温度：３０℃
移動相Ａ：１５ｍＭリン酸、１５ｍＭトリブチルアミンの混合溶液を４５％水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整
移動相Ｂ：アセトニトリル
アイソクラチック：移動相Ａ：Ｂ＝８０：２０（％、３０ｍｉｎ）、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：カラム出口に三方コックを接続し、０．３ｍｌ／ｍｉｎで反応液（１００ｍＭタウリン、６ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムの混合溶液を水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整）と混合し、１００℃の反応管（０．２５ｍｍφ×１０ｍ）で反応後、アジレント１１００シリーズ蛍光検出器（アジレントテクノロジーズ）に導入し、ゲイン×１６の感度で、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４３０ｎｍで測定した。分析結果を図４に示す。保持時間７．９分にピークを検出した。
【００６６】
以下に、各種ＬＰＳをＰｏｌｙＨＹＤＲＯＸＹＥＴＨＹＬ Ａで分析した際の保持時間を示す。
【００６７】
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ；７．９分、
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４；７．７分、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；７．６分Ｅ． ｃｏｌｉ Ｊ５；８．５分、
Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＨ１００；８．４分
【００６８】
このように、ＰｏｌｙＨＹＤＲＯＸＹＥＴＨＹＬ Ａカラムを用い、ＬＰＳを1本のピークとして、検出することができた。
【００６９】
尚、このカラムを用いた分析において、糖類は以下の保持時間を有している。
グルコース；１０．９分、
フルクトース；１０．７分
マルトース；１０．４分
ラクトース；１０．２分
α−シクロデキストリン；９．７分
【００７０】
実施例４
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ，ＬＰＳ，０．１０ｍｇに５０％メタノール１．０ｍｌを加え、ＬＰＳ溶液を調製した。溶液の５μｌを、下記の条件でＨＰＬＣ分析した。
カラム：ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ． Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｄｉｏｌ(３．０ｍｍφ×２５０ｍｍ，５μｍ，３００Å）
カラム温度：３０℃
移動相Ａ：１５ｍＭリン酸、１５ｍＭトリブチルアミンの混合溶液を４５％水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整
移動相Ｂ：アセトニトリル
アイソクラチック：移動相Ａ：Ｂ＝８０：２０（％、３０ｍｉｎ）、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：カラム出口に三方コックを接続し、０．２５ｍｌ／ｍｉｎで反応液（１００ｍＭタウリン、６ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムの混合溶液を水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整）と混合し、１００℃の反応管（０．２５ｍｍφ×１０ｍ）で反応後、アジレント１１００シリーズ蛍光検出器（アジレントテクノロジーズ）に導入し、ゲイン×１６の感度で、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４３０ｎｍで測定した。分析結果を図５に示す。保持時間８．８分にピークを検出した。
【００７１】
以下に、各種ＬＰＳをＩｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｄｉｏｌで分析した際の保持時間を示す。
【００７２】
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ；８．８分、
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４；８．０分、１０．２分
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；７．９分、１０．１分
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｊ５；７．８分、
Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＨ１００；８．７分、１０．４分
【００７３】
このように、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｄｉｏｌカラムを用いて分析し、各種ＬＰＳを1本ないし２本のピークとして、検出することができた。
【００７４】
尚、このカラムを用いた分析において、以下の糖類は以下の保持時間を有している。
グルコース；１０．８分、
フルクトース；１０．８分
マルトース；１０．７分
ラクトース；１０．７分
α−シクロデキストリン；１０．６分
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明により、ＬＰＳを、特殊なキットを用いることなく、容易に分離し、検出することが可能となった。更に、液体状の医薬の開発において、試料中のエンドトキシンを容易に分析することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明に用いる分析装置を示す図である。
【図２】ＣＮカラムを用いてＬＰＳを分析した結果を示す図である。
【図３】Ｃ１８カラムを用いてＬＰＳを分析した結果を示す図である。
【図４】ポリヒドロキシエチルカラムを用いてＬＰＳを分析した結果を示す図である。
【図５】ジオールカラムを用いてＬＰＳを分析した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００７７】
１ 移動相１
２ 移動相２
３ デガッサ
４ バイナリーポンプ
５ オートサンプラー
６ カラム
７ ミキシング部位
８ アミン及び過ヨウ素酸ナトリウム含有移動相
９ デガッサ
１０ バイナリーポンプ
１１ サーモリアクター
１２ 冷却器
１３ 検出器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポ多糖の新規分析方法に関する。より詳しくは、リポ多糖を逆相系又はサイズ排除系液体クロマトグラフィーにより容易に分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポ多糖（以下、「ＬＰＳ」という）とは、共有結合で結ばれた脂質と多糖の複合体であり、特に、主としてグラム陰性細菌の外膜成分として存在するエンドトキシンの本体である。ＬＰＳの基本構造には、菌種間で共通性がみられ、分類学的に遠縁の菌では大きな違いがある。ＬＰＳは様々な生物活性を示し、病原細菌のＬＰＳは、宿主の免疫系により感染のシグナルとして認識される。
【０００３】
一方、エンドトキシンとは内毒素のことであり、細菌の菌体成分中にある毒性物質の総称であり、外毒素が生きた菌が産生して菌体外に放出されるのに対して、エンドトキシンは菌が死ぬことによって遊離する。エンドトキシンの成分はＬＰＳであることから、エンドトキシンは、大腸菌、赤痢菌、サルモネラ菌などのグラム陰性細菌のＬＰＳの同義語として用いられる。エンドトキシンをヒトや動物に注射すると、発熱がおこり、一時的に白血球が減少し、また多量に与えると死に至る。
【０００４】
従来知られているＬＰＳの検出方法としては、ウサギ発熱試験又はリムルス試験がある。
【０００５】
ウサギ発熱試験は、日本薬局方の発熱性物質試験に準拠するものであり、試験液を、３匹のウサギに静脈注射し、直腸温を注射後3時間観察し、注射直前の体温より０．６℃以上の上昇を示すウサギが２又は３匹の場合、発熱性物質が存在すると判断される。
【０００６】
一方、リムルス試験は、アメリカ産カブトガニの学名Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓに由来するものであり、１９６４年にＬｅｖｉｎｅとＢａｎｇが“生きた化石”といわれるカブトガニの血液にエンドトキシンを加えると凝固（ゲル化）することを見出し、その血球抽出液（ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ，ＬＡＬ）を用いて凝固の有無をみることにより検体中のエンドトキシンを検出する方法を創案したことに始まる。現在では、リムルス試験の分析キットが市販されている。
【０００７】
しかしながら、ウサギ発熱試験は、ｉｎ ｖｉｖｏでの試験であるので、コストがかかり、一方、リムルス試験は、分析キットが高価であり、いずれもＬＰＳの検出が容易に且つ安価に行えるものではない。
【０００８】
一方、糖類の分析方法としては、例えば、分析化学、３５巻、８６９−８７４ページ（１９８６年）が知られているが、この方法をリポ多糖に適用した例は存在しない。
【非特許文献１】分析化学、３５巻、８６９−８７４ページ、（１９８６年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＬＰＳの分析を容易に行う方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＬＰＳの簡易な分析方法につき検討を行った結果、ＬＰＳは両親媒性の化合物であるため、分析が難しく、逆相系液体クロマトグラフィーによる分析例は皆無であることがわかり、又、ＬＰＳは、直接マススペクトル分析はできないこともわかった。そこで、発明者らは、更に検討を行い、ＬＰＳが、特定なイオンペアの存在下、特定条件下で逆相系液体クロマトグラフィーを用いて容易に分離することが可能であること、又、特定な検出方法を用いることにより、分離したＬＰＳを容易に検出可能であることを見出し、かかる知見に基づいて本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明は、
（１） リポ多糖の分析方法であって、塩基性イオンペアを含む移動相を用いて、リポ多糖を逆相系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、を包含する方法、に関する。
【００１２】
更に、本発明は、
（２） リポ多糖の分析方法であって、
（ａ） 塩基性イオンペアを含む移動相を用いて、リポ多糖を逆相系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、
（ｂ） 分離したリポ多糖をアミンの存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させる工程、及び
（ｃ） 上記（ｂ）で得られた反応物を検出する工程、を包含する方法、に関する。
【００１３】
更に、本発明は、
（３） リポ多糖の分析方法であって、
（ａ） リポ多糖をサイズ排除系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、
（ｂ） 分離したリポ多糖をアミンの存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させる工程、及び
（ｃ） 上記（ｂ）で得られた反応物を検出する工程、を包含する方法、にも関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、移動相にトリブチルアミン等の塩基性イオンペアを加えることで、Ｃ１８等の逆相系のカラムを用いた液体クロマトグラフィー、特に高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」という）での分離がはじめて可能になった。
【００１５】
本発明の方法によれば、分離したＬＰＳをアミンの存在下で過ヨウ素酸酸化することで、少量のＬＰSの検出が可能となった。
【００１６】
本発明の方法によれば、移動相にトリブチルアミン等のイオンペアを加えることで、ＬＰＳの蛍光強度を検出する場合、蛍光強度が増加し、ＬＰＳの検出が容易となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００１８】
ＬＰＳの分離工程
本発明の分析の対象となるＬＰＳの試料としては、特に限定されないが、大腸菌、赤痢菌、サルモネラ菌などのグラム陰性細菌由来のＬＰＳが例示される。
【００１９】
分析する試料としては、ＬＰＳを含むものであれば特に限定されず、生体試料も含まれるが、生体試料に関しては固相抽出あるはカラムスイッチングバルブを用いる前処理を行ってもよい。更には、試料中のＬＰＳの有無の検出においては、ＬＰＳが存在しない試料も対象となる。
【００２０】
本発明で用いられる逆相系ＨＰＬＣ用の固定相としては、逆相系のものであれば特に限定されないが、例えば、トリアコンタン（Ｃ３０）、オクタデシル（Ｃ１８）、オクチル（Ｃ８）、ブチル（Ｃ４）、ＣＮ、グラファイトカーボン等の担体が例示され、好ましくはＣ１８、Ｃ８又はＣＮが推奨され、特にＣ１８又はＣＮが推奨される。
【００２１】
ＨＰＬＣは、固定相を含むカラムを市販のＨＰＬＣ装置を用いて行うことが可能であり、又、固定相を含むカラムも市販のものを用いればよい。カラムに充填する固定相の担体は、球形、破砕形を用いることができ、その粒子径は３〜１０μｍであり、５μｍ以下が好ましく、さらに３μｍが好ましい。用いるカラムのサイズはサンプルとして用いる試料の容積にもよるが、例えば内径２〜８ｍｍ、長さ２．５〜３０ｃｍのものを用いればよい。又、必要に応じてカードカラムを使用してもよい。
【００２２】
本発明で用いる塩基性イオンペアとしては、塩基性のものであれば特に制限されないが、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、トリブチルアンモニウムホルメート、トリヘキシルアンモニウムホルメート、テトラブチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラメチルブチルアンモニウム等が例示され、好ましくはトリブチルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミンが推奨される。
【００２３】
特に、Ｃ１８カラムを用いる際は、トリエチルアミンとの組み合わせが好ましく、ＣＮカラムを用いる場合は、トリブチルアミンとの組み合わせが好ましい。
【００２４】
特に、検出方法として後述する蛍光分析方法を採用する場合、トリブチルアミン、トリエチルアミンは、蛍光強度を増強することが可能であり、より効果的である。
【００２５】
塩基性イオンペアの濃度としては、例えば、移動相中、５〜５０ｍＭが例示され、好ましくは５〜１５ｍＭが推奨される。
【００２６】
移動相としては、特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、メタノール、テトラヒドロフラン、水又はこれらの混合溶媒が例示され、又、溶出は移動相の組成及び濃度を徐々に変化させるグラジエント溶出により行なうことが好ましい。又、移動層のｐＨを一定に保つために、更にバッファーを使用してもよい。バッファーとしては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等が例示される。バッファー濃度としては、例えば、５〜５０ｍＭが例示されるが、溶出させるＬＰＳの種類に応じて適宜変更すればよい。
【００２７】
特に移動相として、リン酸バッファー−アセトニル系のグラジエント溶出が推奨される。
【００２８】
ＨＰＬＣ分離の際の試料の注入量は、試料の種類や用いるカラムにより適宜決定することができるが、例えば１〜1００μＬ、好ましくは５〜２０μＬが例示される。試料の濃度としては、０．００１〜１ｍｇ／ｍｌが例示され、好ましくは０．００５〜０．０５ｍｇ／ｍｌが推奨される。
【００２９】
ＨＰＬＣ分離の際の移動相の流速は、０．１ｍＬ／分〜１ｍＬ／分、好ましくは０．２ｍＬ／分〜０．５ｍＬ／分である。
【００３０】
ＨＰＬＣ分離の際のカラム温度は、特に限定されないが、例えば、2０〜８０℃、より好ましくは２５〜４０℃である。
【００３１】
かくして分離したＬＰＳは、続いて検出のための誘導体化を行う。
【００３２】
反応工程（ＬＰＳの誘導体化）
上記方法で分離したリポ多糖は、アミンの存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させ、検出が容易な誘導体とすることができる。尚、前段階で分離したＬＰＳをそのまま検出することも可能であるが、高感度の分析を行うためには、ＨＰＬＣにより分離後に誘導体化を行うことが好ましい。
【００３３】
誘導体化は、前段階で分離したＬＰＳの移動相を、アミンの存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることにより行う。
【００３４】
具体的には、前段階で分離したＬＰＳ含有移動相と、アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相とを混合することにより、誘導体化を行えばよい。
【００３５】
アミンとしては、アンモニア、タウリン、エチレンジアミン、エタノールアミン、２−アミノプロピオニトリル、２−シアノアセトアミド、アルギニン、フェニルアラニン、ベンズアミジン及びヒドラジン等が例示され、好ましくは、タウリンが挙げられる。
【００３６】
アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムの使用量としては、移動相中、アミンが、1０〜２００ｍＭ、好ましくは、５０〜１００ｍＭが例示され、及び過ヨウ素酸ナトリウムを２〜２０ｍＭ、好ましくは６〜１２ｍＭが例示される。
【００３７】
アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相としては、ＬＰＳ分離用の移動相と同じものが例示され、例えば、アセトニトリル−水が例示され、好ましくは、分離後の移動相と同じ溶媒組成の移動相をイソクラティックに溶出することが好ましい。
【００３８】
この場合の、アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相の流速としては、ＬＰＳ分離の際の流速と同じ流速であるか、少なくとも２分の1以上の流速が好ましい。
【００３９】
ＬＰＳ含有移動相と、アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相とを混合するに際しては、Ｔ字管により混合することが可能であるほか、必要に応じてミキサーにより混合してもよい。
【００４０】
誘導体化の反応温度としては、８０〜１５０℃が例示され、好ましくは１００〜１２０℃が推奨される。
【００４１】
尚、ＬＰＳをアミン存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて得られる化合物は、ＬＰＳの種類に応じて変化するが、ジャーナルオブクロマトグラフィー、７２０巻、１８３〜１９９ページ（１９９６年）に記載のようなピリジン誘導体が生じているものと考えられる。
【００４２】
検出工程
前工程で得られた反応物を検出することにより、ＬＰＳを分析する。
【００４３】
検出方法としては、誘導体化物を含む移動相を、ＵＶ、蛍光強度等の検出手段により検出する。ＵＶを検出する場合は、２１０ｎｍ、２５４ｎｍ等で検出することができ、又、蛍光強度の検出では、励起波長３５０nｍ及び蛍光波長４３０ｎｍにより検出することができる。特に、ＬＰＳの試料が少量である場合には、高感度の検出が可能な蛍光強度測定が好ましい。
【００４４】
尚、検出は、室温で行うことが好ましいが、誘導体化を行った場合は、移動相の温度は８０〜１５０℃になることがあるので、検出の前に移動相を冷却することが好ましい。
【００４５】
分析装置
本発明では、ＬＰＳを、ＨＰＬＣによる分析工程、反応工程及び検出工程により行うが、好ましくはこれらの工程は移動相中で連続して行う。用いられる装置の例として、図１に例示するものが挙げられる。
【００４６】
即ち、デガッサー３を通した移動相１及び２をバイナリーポンプ４から溶出しながら、ＬＰＳ含有サンプルをオートサンプラー５でサンプリングする。サンプルは、固定相であるカラム６で分離されたのち、ミキシング部位７に流れる。一方、アミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相８は、デガッサー９を通し、バイナリーポンプ１０を通じてミキシング部位７に流れる。ミキシング部位７中で、ＬＰＳを含有する移動相とアミン及び過ヨウ素酸ナトリウムを含有する移動相とが混合され、サーモリアクター１１中で誘導体化を行う。ＬＰＳの誘導体化後に、移動相を冷却器１２で冷却し、続いて検出器１３で検出を行う。
【００４７】
ここで、サーモリアクター１１としては、例えば資生堂サーモリアクター３０１９を使用することが可能である。又、検出器１３としては、アジレント１１００シリーズ蛍光検出器が例示される。
【００４８】
このように、本発明の分析工程、反応工程及び検出工程を組み合わせることにより、ＬＰＳの分析が、容易に、安価に、高感度に、そして再現性よく可能となった。
【００４９】
本発明では、逆相系液体クロマトグラフィーの代わりに、サイズ排除系クロマトグラフィーを用いてＬＰＳを分離してもよい。
【００５０】
サイズ排除系クロマトグラフィーに用いるカラムに充填する固定相の担体は、球形、破砕形を用いることができ、その粒子径としては３〜１０μｍが例示され、５μｍ以下が好ましい。用いるカラムのサイズは、サンプルとして用いる試料の容積にもよるが、例えば内径2〜8ｍｍ、長さ５〜３０ｃｍのものを用いればよい。又、必要に応じてカードカラムを使用してもよい。
【００５１】
サイズ排除系クロマトグラフィー用のカラムとしては、例えば、ジオール、ポリヒドロキシエチル、ポリヒドロキシメタクリレート等を固定相として充填したものが例示され、好ましくは水系のサイズ排除系クロマトグラフィー用のカラムであって、アセトニトリル、メタノールなどの有機溶媒も使用可能なカラム、例えばジオール、ポリヒドロキシエチルカラムが好ましく、特にジオールカラムが推奨される。
【００５２】
サイズ排除系クロマトグラフィーを用いる際の移動相としては、例えば、前記したアセトニトリル、メタノール、アセトニトリル−リン酸バッファーの混合液等が例示され、イソクラティック条件下で溶出させることが好ましい。
【００５３】
サイズ排除系クロマトグラフィーを用いる際の試料の注入量、移動相の流速、カラム温度等は逆相系ＨＰＬＣのものと同じものが適用できる。
【００５４】
そして、サイズ排除系クロマトグラフィーを用いて分離したＬＰＳは、前記記載の反応工程、及び前記記載の検出工程により検出することが可能である。
【００５５】
特に、サイズ排除系液体クロマトグラフィーとしてジオールカラムを用い、塩基性イオンペアとしてトリブチルアミンを用いた場合、サンプルのカラムへの吸着を防ぐことが可能となり、分析する際の再現性を高めることが可能となる。そして、リポ多糖関連化合物が1ピークで現れるため、検出感度が相対的に増す。
【実施例】
【００５６】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５７】
実施例１
０．１０ｍｇのＥ． ｃｏｌｉ Ｃ，ＬＰＳに１．０ｍＬの５０％メタノールを加え、ＬＰＳ溶液を調製した。溶液の５μＬを、下記の条件でＨＰＬＣ分析した。
【００５８】
カラム：サーモサイエンティフィックＢｉｏＢａｓｉｃ ＣＮ（２．１ｍｍφ×５０ｍｍ）
カラム温度：３０℃
【００５９】
移動相Ａ：１５ｍＭリン酸、１５ｍＭトリブチルアミンの混合溶液を４５％水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整；
移動相Ｂ：アセトニトリル；
グラジエント；移動相Ａ：Ｂ＝８０：２０→Ａ：Ｂ＝４０：６０（％、３０ｍｉｎ）、続いてＡ：Ｂ＝４０：６０（％、１０ｍｉｎ）
流速：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：カラム出口に三方コックを接続し、０．２５ｍｌ／ｍｉｎで反応液（１００ｍＭタウリン、６ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムの混合溶液を水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整）と混合し、１００℃の反応管（０．２５ｍｍφ×１０ｍ）で反応後、アジレント１１００シリーズ蛍光検出器（アジレントテクノロジーズ）に導入し、ゲイン×１６の感度で、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４３０ｎｍで測定した。分析結果を図２に示す。メインピークを含めて、保持時間１９．５分、２１．８分、２５．４分及び２６．７分に4本のピークを検出した。
【００６０】
このように、ＣＮカラムを用い、移動相にトリブチルアミン（イオンペアー）とアセトニトリルを用いたＨＰＬＣにより、ＬＰＳをカラムに適当な時間保持させ、各種成分を分離、検出することができた。
【００６１】
実施例２
０．１ｍｇのＥ． ｃｏｌｉ Ｃ， ＬＰＳに１．０ｍＬの５０％メタノールを加え、ＬＰＳ溶液を調製した。溶液の５μＬを、下記の条件でＨＰＬＣ分析した。
【００６２】
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８（２．１ｍｍφ×５０ｍｍ）
カラム温度：３０℃
移動相Ａ：１５ｍＭリン酸、１５ｍＭトリエチルアミンの混合溶液を４５％水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエント；移動相Ａ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（％、３０ｍｉｎ）、続いてＡ：Ｂ＝４０：６０（％、１０ｍｉｎ）
流速：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：カラム出口に三方コックを接続し、０．２５ｍｌ／ｍｉｎで反応液（１００ｍＭタウリン、６ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムの混合溶液を水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整）と混合し、１００℃の反応管（０．２５ｍｍφ×１０ｍｍ）で反応後、アジレント１１００シリーズ蛍光検出器（アジレントテクノロジーズ）に導入し、ゲイン×１６の感度で、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４３０ｎｍで測定した。分析結果を図３に示す。メインピークを含めて保持時間２４．５分、３３．６分、３５．８分及び３８．２分に４本のピークを検出した。
【００６３】
このように、Ｃ１８カラムを用い、移動相にトリエチルアミン（イオンペアー）とアセトニトリルを用いたＨＰＬＣにより、ＬＰＳをカラムに適当な時間保持させ、各種成分を分離、検出することができた。
【００６４】
即ち、逆相系のカラムとイオンペアーの脂溶性因子を適切に組み合わせることによりＬＰＳの分離分析が可能になる。しかし、その組み合わせが悪い場合はカラムに保持されない、あるいはLPSがカラムから溶出されない現象が観測される。又、イオン交換樹脂カラムを用いたHPLCでは、LPSを分離することはできなかった。
【００６５】
実施例３
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ，ＬＰＳ，０．１０ｍｇに５０％メタノール１．０ｍｌを加え、ＬＰＳ溶液を調製した。溶液の５μｌを、下記の条件でＨＰＬＣ分析した。
カラム： ポリエルシー社ＰｏｌｙＨＹＤＲＯＸＹＥＴＨＹＬ Ａ（４．６ｍｍφ×２００ｍｍ，５μｍ，３００Å）
カラム温度：３０℃
移動相Ａ：１５ｍＭリン酸、１５ｍＭトリブチルアミンの混合溶液を４５％水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整
移動相Ｂ：アセトニトリル
アイソクラチック：移動相Ａ：Ｂ＝８０：２０（％、３０ｍｉｎ）、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：カラム出口に三方コックを接続し、０．３ｍｌ／ｍｉｎで反応液（１００ｍＭタウリン、６ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムの混合溶液を水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整）と混合し、１００℃の反応管（０．２５ｍｍφ×１０ｍ）で反応後、アジレント１１００シリーズ蛍光検出器（アジレントテクノロジーズ）に導入し、ゲイン×１６の感度で、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４３０ｎｍで測定した。分析結果を図４に示す。保持時間７．９分にピークを検出した。
【００６６】
以下に、各種ＬＰＳをＰｏｌｙＨＹＤＲＯＸＹＥＴＨＹＬ Ａで分析した際の保持時間を示す。
【００６７】
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ；７．９分、
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４；７．７分、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；７．６分Ｅ． ｃｏｌｉ Ｊ５；８．５分、
Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＨ１００；８．４分
【００６８】
このように、ＰｏｌｙＨＹＤＲＯＸＹＥＴＨＹＬ Ａカラムを用い、ＬＰＳを1本のピークとして、検出することができた。
【００６９】
尚、このカラムを用いた分析において、糖類は以下の保持時間を有している。
グルコース；１０．９分、
フルクトース；１０．７分
マルトース；１０．４分
ラクトース；１０．２分
α−シクロデキストリン；９．７分
【００７０】
実施例４
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ，ＬＰＳ，０．１０ｍｇに５０％メタノール１．０ｍｌを加え、ＬＰＳ溶液を調製した。溶液の５μｌを、下記の条件でＨＰＬＣ分析した。
カラム：ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ． Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｄｉｏｌ(３．０ｍｍφ×２５０ｍｍ，５μｍ，３００Å）
カラム温度：３０℃
移動相Ａ：１５ｍＭリン酸、１５ｍＭトリブチルアミンの混合溶液を４５％水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整
移動相Ｂ：アセトニトリル
アイソクラチック：移動相Ａ：Ｂ＝８０：２０（％、３０ｍｉｎ）、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：カラム出口に三方コックを接続し、０．２５ｍｌ／ｍｉｎで反応液（１００ｍＭタウリン、６ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムの混合溶液を水酸化カリウム水溶液でｐＨ７．０に調整）と混合し、１００℃の反応管（０．２５ｍｍφ×１０ｍ）で反応後、アジレント１１００シリーズ蛍光検出器（アジレントテクノロジーズ）に導入し、ゲイン×１６の感度で、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４３０ｎｍで測定した。分析結果を図５に示す。保持時間８．８分にピークを検出した。
【００７１】
以下に、各種ＬＰＳをＩｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｄｉｏｌで分析した際の保持時間を示す。
【００７２】
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ；８．８分、
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４；８．０分、１０．２分
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；７．９分、１０．１分
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｊ５；７．８分、
Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＨ１００；８．７分、１０．４分
【００７３】
このように、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｄｉｏｌカラムを用いて分析し、各種ＬＰＳを1本ないし２本のピークとして、検出することができた。
【００７４】
尚、このカラムを用いた分析において、以下の糖類は以下の保持時間を有している。
グルコース；１０．８分、
フルクトース；１０．８分
マルトース；１０．７分
ラクトース；１０．７分
α−シクロデキストリン；１０．６分
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明により、ＬＰＳを、特殊なキットを用いることなく、容易に分離し、検出することが可能となった。更に、液体状の医薬の開発において、試料中のエンドトキシンを容易に分析することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明に用いる分析装置を示す図である。
【図２】ＣＮカラムを用いてＬＰＳを分析した結果を示す図である。
【図３】Ｃ１８カラムを用いてＬＰＳを分析した結果を示す図である。
【図４】ポリヒドロキシエチルカラムを用いてＬＰＳを分析した結果を示す図である。
【図５】ジオールカラムを用いてＬＰＳを分析した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００７７】
１ 移動相１
２ 移動相２
３ デガッサ
４ バイナリーポンプ
５ オートサンプラー
６ カラム
７ ミキシング部位
８ アミン及び過ヨウ素酸ナトリウム含有移動相
９ デガッサ
１０ バイナリーポンプ
１１ サーモリアクター
１２ 冷却器
１３ 検出器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポ多糖の分析方法であって、塩基性イオンペアを含む移動相を用いて、リポ多糖を逆相系又はサイズ排除系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、を包含する方法。
【請求項２】
リポ多糖の分析方法であって、
（１） 塩基性イオンペアを含む移動相を用いて、リポ多糖を逆相系又はサイズ排除系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、
（２） 分離したリポ多糖をアミンの存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させる工程、及び
（３） 上記（２）で得られた反応物を検出する工程、を包含する方法。
【請求項３】
塩基性イオンペアが、トリメチルアミン、トリエチルアミン及びトリブチルアミンよりなる群から選択される、請求項1又は請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
塩基性イオンペアが、トリブチルアミン又はトリエチルアミンである請求項1又は請求項２に記載の分析方法。
【請求項５】
塩基性イオンペアの濃度が、５〜５０ｍＭである、請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
液体クロマトグラフィーが逆相系液体クロマトグラフィーであり、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム又はＣＮカラムを用いるものである、請求項１〜５のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項７】
逆相系液体クロマトグラフィーが、Ｃ１８カラムを用い、塩基性イオンペアがトリエチルアミンである、請求項６に記載の分析方法。
【請求項８】
逆相系液体クロマトグラフィーが、ＣＮカラムを用い、塩基性イオンペアがトリブチルアミンである、請求項６に記載の分析方法。
【請求項９】
移動相としてリン酸バッファー−アセトニトリルの濃度勾配を用いる、請求項６〜８のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１０】
液体クロマトグラフィーがサイズ排除系液体クロマトグラフィーであり、ジオールカラムを用いるものである、請求項１〜５のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１１】
サイズ排除系液体クロマトグラフィーが、ジオールカラムを用いるものであり、塩基性イオンペアがトリブチルアミンである、請求項１０に記載の分析方法。
【請求項１２】
移動相としてアセトニトリルを用いる、請求項１０又は請求項１１のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１３】
（２）の反応工程におけるアミンが、アンモニア、タウリン、エチレンジアミン、エタノールアミン、２−アミノプロピオニトリル、２−シアノアセトアミド、アルギニン、フェニルアラニン、ベンズアミジン及びヒドラジンよりなる群から選択される、請求項２〜１２のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１４】
（２）の反応工程におけるアミンが、タウリンである、請求項１３に記載の分析方法。
【請求項１５】
（２）の反応工程が、８０〜１５０℃の温度で反応を行う、請求項２〜１４のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１６】
タウリンを５０〜１００ｍＭ、及び過ヨウ素酸ナトリウムを２〜２０ｍＭの濃度で反応を行う、請求項１５に記載の分析方法。
【請求項１７】
上記（３）の検出工程が、蛍光強度を測定するものである、請求項２〜１６のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１８】
蛍光強度の測定が、励起波長３５０ｎｍ及び蛍光波長４３０ｎｍで行う、請求項１７に記載の分析方法。
【請求項１９】
リポ多糖が、大腸菌、赤痢菌又はサルモネラ菌由来のものである、請求項１〜１８のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項２０】
上記（１）、（２）及び（３）の工程を移動相中で連続して行う、請求項２〜１９のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１】
リポ多糖の分析方法であって、塩基性イオンペアを含む移動相を用いて、リポ多糖を逆相系又はサイズ排除系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、を包含する方法。
【請求項２】
リポ多糖の分析方法であって、
（１） 塩基性イオンペアを含む移動相を用いて、リポ多糖を逆相系又はサイズ排除系液体クロマトグラフィーにより分離する工程、
（２） 分離したリポ多糖をアミンの存在下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させる工程、及び
（３） 上記（２）で得られた反応物を検出する工程、を包含する方法。
【請求項３】
塩基性イオンペアが、トリメチルアミン、トリエチルアミン及びトリブチルアミンよりなる群から選択される、請求項1又は請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
塩基性イオンペアが、トリブチルアミン又はトリエチルアミンである請求項1又は請求項２に記載の分析方法。
【請求項５】
塩基性イオンペアの濃度が、５〜５０ｍＭである、請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
液体クロマトグラフィーが逆相系液体クロマトグラフィーであり、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム又はＣＮカラムを用いるものである、請求項１〜５のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項７】
逆相系液体クロマトグラフィーが、Ｃ１８カラムを用い、塩基性イオンペアがトリエチルアミンである、請求項６に記載の分析方法。
【請求項８】
逆相系液体クロマトグラフィーが、ＣＮカラムを用い、塩基性イオンペアがトリブチルアミンである、請求項６に記載の分析方法。
【請求項９】
移動相としてリン酸バッファー−アセトニトリルの濃度勾配を用いる、請求項６〜８のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１０】
液体クロマトグラフィーがサイズ排除系液体クロマトグラフィーであり、ジオールカラムを用いるものである、請求項１〜５のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１１】
サイズ排除系液体クロマトグラフィーが、ジオールカラムを用いるものであり、塩基性イオンペアがトリブチルアミンである、請求項１０に記載の分析方法。
【請求項１２】
移動相としてアセトニトリルを用いる、請求項１０又は請求項１１のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１３】
（２）の反応工程におけるアミンが、アンモニア、タウリン、エチレンジアミン、エタノールアミン、２−アミノプロピオニトリル、２−シアノアセトアミド、アルギニン、フェニルアラニン、ベンズアミジン及びヒドラジンよりなる群から選択される、請求項２〜１２のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１４】
（２）の反応工程におけるアミンが、タウリンである、請求項１３に記載の分析方法。
【請求項１５】
（２）の反応工程が、８０〜１５０℃の温度で反応を行う、請求項２〜１４のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１６】
タウリンを５０〜１００ｍＭ、及び過ヨウ素酸ナトリウムを２〜２０ｍＭの濃度で反応を行う、請求項１５に記載の分析方法。
【請求項１７】
上記（３）の検出工程が、蛍光強度を測定するものである、請求項２〜１６のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項１８】
蛍光強度の測定が、励起波長３５０ｎｍ及び蛍光波長４３０ｎｍで行う、請求項１７に記載の分析方法。
【請求項１９】
リポ多糖が、大腸菌、赤痢菌又はサルモネラ菌由来のものである、請求項１〜１８のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【請求項２０】
上記（１）、（２）及び（３）の工程を移動相中で連続して行う、請求項２〜１９のいずれかの請求項に記載の分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１４５１９１（Ｐ２０１０−１４５１９１Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２１７８０（Ｐ２００８−３２１７８０）
【出願日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（０００００５０７２）萬有製薬株式会社 (51)
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（０００００５０７２）萬有製薬株式会社 (51)
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
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