リンパ系の細胞接着物質、リンパ系薬物輸送材およびそれを含有する薬剤
【課題】
腫瘍細胞が転移しているセンチネルリンパ節とリンパ管との細胞への接着物質、その細胞へ選択的に薬物を輸送するリンパ系薬物輸送材、それを含有しており長時間センチネルリンパ節やリンパ管に滞留するリンパ系疾患用薬剤を提供する。
【解決手段】
リンパ系の細胞接着物質は、リンパ管内皮細胞またはセンチネルリンパ節細胞の細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得る、リガンド基含有化合物が、含まれている。リンパ系薬物輸送材は、該リンパ系の細胞接着物質と、診断薬および／または治療薬とが該コロイド粒子に含有され、該リガンド基含有化合物が該コロイド粒子の表面から露出している。リンパ系疾患用薬剤は、該リンパ系薬物輸送材と、該コロイド粒子を分散させる分散液とを含んでいる。
腫瘍細胞が転移しているセンチネルリンパ節とリンパ管との細胞への接着物質、その細胞へ選択的に薬物を輸送するリンパ系薬物輸送材、それを含有しており長時間センチネルリンパ節やリンパ管に滞留するリンパ系疾患用薬剤を提供する。
【解決手段】
リンパ系の細胞接着物質は、リンパ管内皮細胞またはセンチネルリンパ節細胞の細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得る、リガンド基含有化合物が、含まれている。リンパ系薬物輸送材は、該リンパ系の細胞接着物質と、診断薬および／または治療薬とが該コロイド粒子に含有され、該リガンド基含有化合物が該コロイド粒子の表面から露出している。リンパ系疾患用薬剤は、該リンパ系薬物輸送材と、該コロイド粒子を分散させる分散液とを含んでいる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ行性に転移した腫瘍細胞を診断したり治療したりするための原材として用いられるリンパ系の細胞接着物質やリンパ系薬物輸送材、それを含有するリンパ系疾患の診断や治療のための薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胃癌や乳癌等の上皮性腫瘍は、リンパ系内でリンパ液を介してその所属リンパ節に転移する悪性腫瘍である。
【０００３】
このような腫瘍の原発巣を摘出する手術の際、所属リンパ節に転移した腫瘍細胞が残存していると術後に再発する危険性があるので、腫瘍原発巣とその周辺のリンパ管やリンパ節とを広範囲に摘出するリンパ節郭清が施されていた。正常なリンパ節等の組織も摘出するものであるから、患者に対する侵襲が大きい。
【０００４】
患者への侵襲を小さくするために、腫瘍細胞がリンパ液を介し最初に到達するみはりリンパ節すなわちセンチネルリンパ節を特定し、そこに転移がなければ他のリンパ節を摘出せず腫瘍原発巣のみを摘出するという手術が行なわれるようになってきた。
【０００５】
このようなセンチネルリンパ節は、例えば特許文献１に記載されているように皮下投与した超音波造影剤で造影させたり、皮下注射した色素で染色させたり、局所注射した放射線物質で検出したりして、特定される。
【０００６】
皮下深くに存在するセンチネルリンパ節を造影したり染色したりしても、色調が薄くて目視し難いうえ造影剤や色素がリンパ液とともに経時的に流れ去ってしまうので熟練した医師が迅速に特定しなければならない。さらに、転移しているセンチネルリンパ節のみならず転移していないそれ以外のリンパ節が染色されてしまうことがある。または患者が放射線物質で被ばくしてしまう。
【０００７】
一方、非特許文献１には、胃の腺粘液細胞分泌物であるα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン基含有Ｏ−グリカンが、胃癌の原因であるヘリコバクターピロリ菌の細胞壁構成成分の生合成を阻害し、抗菌剤として有用である旨、記載されている。非特許文献２には、これを生成するα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素について記載されている。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２３８４５０号公報
【非特許文献１】川久保雅友，小林基弘，中山 淳，Molecular Medicine, Vol.40, No.9, p1086-1092 (2003)
【非特許文献２】M.Kawakubo, Y. Ito, Y. Okimura, M. Kobayashi, K. Sakura, S. Kasama, M. N. Fukuda, M. Fukuda, T. Katsuyama, J. Nakayama; "Natural Antibiotic Function of a Human Gastric Mucin Against Helicobacter pylori Infection", Science, Vol.305, p1003-1006, (2004)、および[online], Science, Supporting online material, (http://www.scieccemag/cgi/data/305/5686/1003/DC/1)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、腫瘍細胞が転移しているセンチネルリンパ節とそこに至るまでのリンパ管との細胞への接着物質、その細胞へ選択的に薬物を輸送するリンパ系薬物輸送材、それを含有しており長時間センチネルリンパ節やリンパ管に滞留することができるリンパ系疾患の診断や治療のための安全な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載の発明は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得る、リガンド基含有化合物が、含まれていることを特徴とするリンパ系の細胞接着物質である。
【００１１】
該リガンド基が、糖鎖基であることが好ましい。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、該リガンド基が、非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖含有糖鎖基、シアリルルイスＸ糖鎖基またはマンノース含有糖鎖基であることを特徴とする請求項１に記載のリンパ系の細胞接着物質である。
【００１３】
リガンド基含有化合物が、シアリルルイスＸであってもよく、マンノース単糖であってもよく、非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖またはマンノースを有する多糖であってもよい。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、該非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖含有糖鎖基が、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖基であることを特徴とする請求項２に記載のリンパ系の細胞接着物質である。
【００１５】
このようなα結合型のアセチルグルコサミン含有基を有する化合物は、β結合型のアセチルグルコサミン含有基を有する化合物にα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が作用して生成されるものである。
【００１６】
非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖含有糖鎖基が、Ｎ−アセチルグルコサミンα１→４ガラクトースβ含有糖鎖基であることが好ましい。
【００１７】
請求項４に記載の発明は、リガンド基含有化合物が、下記式（Ｉ）
【化１】
で示されることを特徴とする請求項３に記載のリンパ系の細胞接着物質である。
【００１８】
式（Ｉ）のリガンド基含有化合物は、ｓＣＤ４３で示される可溶型のＬｅｕｋｏｓｉａｌｉｎというタンパク質に、そのＳｅｒ／Ｔｈｒ（セリン−スレオニン）残基を介して、２分岐型Ｏ−グリカンの３ＧａｌＮａｃα１が結合したものである。
【００１９】
同じく請求項５に記載の発明は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞へ接着するコロイド粒子に診断薬および／または治療薬が、付されていることを特徴とするリンパ系薬物輸送材である。
【００２０】
このリンパ系薬物輸送材は、リンパ管やセンチネルリンパ節に集積してリンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞に接着したまま長く滞留するので、コロイド粒子表面に露出している診断薬や治療薬を、これら細胞へ効率的に輸送する。
【００２１】
診断薬または治療薬は、付着や吸着や粘着により付されつつ、コロイド粒子の表面から露出している。その診断薬として、コロイド粒子の表面に付着するＰＫＨ２６のような蛍光剤で例示される感光剤が挙げられる。
【００２２】
同じく請求項６に記載の発明は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得るリガンド基含有化合物を、含んでいるリンパ系の細胞接着物質と、診断薬および／または治療薬とが、コロイド粒子に含有され、該リガンド基含有化合物が該コロイド粒子の表面から露出していることを特徴とするリンパ系薬物輸送材である。
【００２３】
診断薬または治療薬は、コロイド粒子に完全に内包されたり、コロイド粒子に内包されつつ一部がコロイド粒子の表面から露出したり、付着や吸着や粘着により付されつつコロイド粒子の表面から露出したりしている。
【００２４】
この細胞接着因子は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞に多く存在している。リンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞は、リガンド基含有化合物のリガンド基と同一または異なるリガンド基を有する物質を産生して、表面からこの基を露出させている。リンパ球やリンパ行性腫瘍細胞と、リンパ系薬物輸送材表面のリガンド基含有化合物とが、夫々のリガンド基に対する特異的な細胞接着因子のレセプターと相互作用する結果、リンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞へ、競合的に接着する。
【００２５】
その結果、このリンパ系薬物輸送材は、このリンパ系輸送材は、リガンド基含有化合物に由来して強くこれらの細胞に接着することができる。そのため、リンパ液に流されることなくこれらの細胞に集積したまま長時間滞留するので、コロイド粒子表面に露出しているような診断薬や治療薬を、これら細胞へ効率的に輸送する。
【００２６】
リンパ系薬物輸送材は、コロイド粒子単独でもリンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞へ接着するが、前記のリガンド基含有化合物、特に式（Ｉ）の化合物を含んでいるリンパ系の細胞接着物質を含有していると、リンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞により集積し、それらと一層強く接着する。
【００２７】
請求項７に記載の発明は、該コロイド粒子が、リポソーム、金属含有コロイド粒子、生体分解性樹脂コロイド粒子、フチン酸含有コロイド粒子、硫黄コロイド粒子またはタンパク質コロイド粒子であることを特徴とする請求項５または６に記載のリンパ系薬物輸送材である。
【００２８】
リポソームは、例えば脂肪やリン脂質でできたコロイド粒子が挙げられ、より具体的には、ＳＵＶリポソーム(small unilamellar vesicle liposome:小さな１枚膜リポソーム)、ＲＥＶリポソーム（reversephase evaporation vesicle liposome：逆相蒸発法リポソーム）、またはＭＬＶリポソーム（multilamellar vesicle liposome：多重層リポソーム）が挙げられる。金属含有コロイド粒子は、スズ含有コロイド、金含有コロイドが挙げられる。生体分解性樹脂コロイド粒子は、懸濁させたポリ乳酸粒子が挙げられる。
【００２９】
これらのリンパ系薬物輸送材は、例えばリポソームを構成する脂質の１００重量部に対し、それに保持されたリガンド基含有化合物や診断薬や治療薬を夫々５０〜５００重量部含有している。診断薬や治療薬のリポソームへの取込みの割合、すなわち、保持効率で表すと夫々１０〜１００％となる。
【００３０】
同じく請求項８に記載の発明は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞へ接着するコロイド粒子に診断薬および／または治療薬が付されているリンパ系薬物輸送材と、
該コロイド粒子を分散させる分散液とを
含んでいることを特徴とするリンパ系疾患用薬剤である。
【００３１】
同じく請求項９に記載の発明は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得るリガンド基含有化合物を含んでいるリンパ系の細胞接着物質と、診断薬および／または治療薬とが、コロイド粒子に含有され、該リガンド基含有化合物が該コロイド粒子の表面から露出しているリンパ系薬物輸送材と、
該コロイド粒子を分散させる分散液とを
含んでいることを特徴とするリンパ系疾患用薬剤である。
【００３２】
このリンパ系疾患用薬剤は、リガンド基含有化合物に由来して一層強くこれらの細胞に接着することができる。
【００３３】
診断薬は、インジゴカルミンで例示される色素、ＰＫＨ２６やローダミン６Ｇのような蛍光剤で例示される感光剤、核磁気共鳴画像診断用ガドリニウム化合物や超音波コントラスト剤で例示される造影剤が挙げられる。コロイド粒子がリン脂質であるとき、ＰＫＨ２６はリン脂質二重層の外側表面に付着し、ローダミン６Ｇはリン脂質二重層内側内空に封入される。
【００３４】
この薬剤をリンパ系疾患の診断のために用いる場合、活性化されたリンパ球やリンパ行性腫瘍細胞が産生するシアリルルイスＸや炎症性サイトカインに起因して、薬物輸送材がリンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞に一層接着し易くなり、多く接着する。そのため、腫瘍細胞が転移しているリンパ管やセンチネルリンパ節で、より明瞭に染色等がなされて、それを特定でき易くなり、確実かつ簡易に診断できる。そのうえ、リンパ系診断薬剤は長く滞留し診断薬を徐放するので、長時間にわたって明瞭かつ確実に診断することができる。
【００３５】
治療剤は、抗癌剤、抗炎症剤が挙げられる。
【００３６】
この薬剤をリンパ系疾患の治療のために用いる場合も同様にリンパ系薬物輸送材が作用する。そのため、この薬剤は、リンパ行性に転移した腫瘍細胞がセンチネルリンパ節に滞留している初期のリンパ行性腫瘍転移の薬物治療の際に、長時間にわたって、薬効を持続させることができる。
【００３７】
リンパ系疾患用薬剤は、例えばリポソームを構成する脂質の１００重量部に対し、それに保持された診断薬や治療薬を夫々５０〜５００重量部含有している。診断薬や治療薬のリポソームへの取込みの割合、すなわち、保持効率で表すと１０〜１００％となる。例えばこの薬剤を診断に用いる場合、過テクネチウム酸ナトリウムで放射線標識した塩化第一スズのコロイド０．１ｍｇ／ｍｌを成人一人当たり３７〜１１１ＭＢｑ静脈内投与する。
【００３８】
これらの分散液は、精製水、生理食塩水、リンゲル液が挙げられる。
【００３９】
この薬剤は、懸濁液または乳濁液である注射液、用時懸濁させた注射液で例示される製剤であってもよい。
【発明の効果】
【００４０】
本発明のリンパ系の細胞接着物質を含んでいるリンパ系薬物輸送材は、リンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞に特異的に集積して接着し、そこに長時間滞留する安全な薬剤材料であり、簡便に製造できる。
【００４１】
本発明のリンパ系疾患用薬剤は診断薬剤として、腫瘍原発巣からリンパ管を経てセンチネルリンパ節に至るまでのリンパ系に催行したリンパ行性腫瘍細胞を、長時間にわたって正確かつ明瞭に検出できる。また、転移の軌跡を追ったり転移の拡がりを検査したりするマッピング剤としても使用できる。
【００４２】
またこのリンパ系疾患用薬剤は、治療薬剤として、制癌剤等の治療薬を長時間リンパ行性腫瘍細胞の近傍に滞留させて、それの増殖抑制や転移抑制や破壊・死滅促進をすることができる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
リンパ系循環におけるリンパ球・癌細胞と、リンパ管内皮細胞との接着機構は未解明である。そこで、先ずその接着機構について検討した。
【００４５】
試験例１のようにして、ヒト胃癌細胞（ＡＧＳ細胞）と、培養リンパ管内皮細胞との細胞接着機構を、解析した。
【００４６】
（試験例１）
(１)ＡＧＳ細胞の調製
始めに非特許文献１および２に記載の方法でα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）を調製した。
【００４７】
ヒト胃癌細胞由来のＡＧＳ細胞（大日本製薬株式会社製）を２群に分け、その内の１群にα４ＧｎＴを投与して培養し、リガンド基含有化合物として前記式（Ｉ）に記載のα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖含有基を有する化合物を産生するα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン発現ヒト胃癌細胞（α１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞）を得た。なお、このＡＧＳ細胞が、前記式（Ｉ）のリガンド基含有化合物を産生していることは、免疫組織化学的染色、ラテックス凝集反応および酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）による定量で確認した。
【００４８】
他方の１群を培養して、リガンド基含有化合物を産生しないα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン非発現ヒト胃癌細胞（α１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞）とした。
【００４９】
(２)α１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞とリンパ管内皮細胞との細胞接着性試験
(i)ヒト由来のリンパ管内皮細胞を播種した培養皿で、細胞質染色用蛍光色素ＣＦＳＥ（株式会社同人化学研究所製：商品名）により標識したα１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞を共培養し、静置した。３０分後、培養皿を３回洗浄し、接着していないＡＧＳ細胞と浮遊しているＡＧＳ細胞とを除去した。この培養皿を、位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡とを用いて、リンパ管内皮細胞に接着して蛍光しているＡＧＳ細胞を観察した。その結果を図１（ａ）に示す。
【００５０】
(ii)リンパ行性ヒト胃癌細胞から大量に産生される炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α（Tumor Necrosis Factor-α）を１０ｎｇ／ｍＬを培養リンパ管内皮細胞に添加して共培養したこと以外は、前記(i)と同様にして、リンパ管内皮細胞に接着して蛍光しているＡＧＳ細胞を観察した。その結果を図１（ｂ）に示す。
【００５１】
(３)α１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞とリンパ管内皮細胞との細胞接着性試験
対照のため、α１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞に代えて、α１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞を用いたこと以外は、前記（２）の(i)および(ii)と同様にして、リンパ管内皮細胞に接着して蛍光しているＡＧＳ細胞を観察した。その結果を図１（ｃ）および（ｄ）に示す。
【００５２】
(４)ＡＧＳ細胞とリンパ管内皮細胞との細胞接着性試験結果
ＴＮＦ−α添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞（図１(b)参照）は、ＴＮＦ−α非添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞（同図(a)）よりも、多く培養ヒトリンパ管内皮細胞に接着していた。
【００５３】
ＴＮＦ−α非添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞（同図(a)）は、ＴＮＦ−α添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞（同図(d)）よりも、多く培養ヒトリンパ管内皮細胞に接着していた。
【００５４】
ＴＮＦ−α添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞（同図(d)）は、ＴＮＦ−α非添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞（同図(c)）よりも、多く培養ヒトリンパ管内皮細胞に接着していた。
【００５５】
このようにα１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞であって、ＴＮＦ−α添加処理していると、細胞接着数が増加していた。
【００５６】
このことから、リガンド基としてα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖基を有する前記式（Ｉ）に記載のリガンド基含有化合物は、リンパ管内皮細胞が有する細胞接着因子のレセプターと接着し易く、ＴＮＦ−αに起因して一層接着し易くなることが明らかとなった。したがって、このリガンド基含有化合物が露出したリンパ系薬物輸送材は、リンパ行性腫瘍細胞であるＡＧＳ細胞存在下で、リンパ管内皮細胞に極めて接着し易いものであることが示された。
【００５７】
次に、試験例２のようにして、リンパ球と、培養リンパ管内皮細胞との細胞接着機構を解析した。免疫組織化学的検索によってヒトの正常組織においても、細胞接着因子であるＥ−セレクチンを発現していることが、知られている。そこで試験例２では、このＥ−セレクチンに着目し、その発現について検討した。なおこのＥ−セレクチンは、抗原であるシアリルルイスＸに対する、レセプターである。
【００５８】
（試験例２）
（１）リンパ管内皮細胞のＥ−セレクチン発現試験
乳癌患者の乳腺内分泌外科手術をし、その承諾を得たヒトリンパ管内皮細胞を、培養し、免疫細胞化学像を観察したところ、培養ヒトリンパ管内皮細胞は、Ｅ−セレクチンを発現していることが確認された。リンパ行性ヒト胃癌細胞から大量に産生される炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αを培養ヒトリンパ管内皮細胞に添加したところ、Ｅ−セレクチンの発現が増強していることが示された。
【００５９】
（２）リンパ管内皮細胞のＥ−セレクチン発現試験結果
この試験から、リンパ管内皮細胞とリンパ球との細胞接着機構にリンパ管内皮細胞のＥ−セレクチンが関与していた。したがって、このリガンド基含有化合物としてシリアルルイスＸが露出したリンパ系薬物輸送材は、ＡＧＳ細胞であるリンパ行性腫瘍細胞存在下でリンパ管内皮細胞に極めて接着し易いものであることが示された。
【００６０】
なお、ＴＮＦ−αに代えて、同じくサイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ１β）を用いても、同様であった。
【００６１】
次にリンパ性疾患用薬剤を調製し、投与した例を示す。
【００６２】
調製実施例１でリンパ系疾患用診断薬剤を調製した。
【００６３】
（調製実施例１）
卵黄レシチンより調製されたリン脂質をクロロホルムに溶いて、薄膜を作製した。これに、ジエチルエーテルとリン酸バッファーを加えて超音波で分散させた。さらにこれを超音波処理して、最終的にリン脂質濃度が２０ｍｇ／ｍｌであるＳＵＶリポソームを調製した。このリポソーム０．５ｍｌに、蛍光剤であるＰＫＨ２６（Ｚｙｎａｘｉｓ社製）の１μｌを加え、１分間震盪した後、ウシ胎児血清０．５ｍｌを加えさらに１分間震盪して、リンパ系疾患用診断薬剤として、蛍光リポソームを得た。この薬剤は、蛍光剤がリポソームのリン脂質二重膜を標識して蛍光しているものである。
【００６４】
次の投与実施例１で、薬物輸送材であるリンパ系疾患用診断薬剤中のリポソームについて、リンパ節への動態を調べた。
【００６５】
（投与実施例１）
雄性ｄｄＹマウスにペントバルビタール７５ｍｇ／ｋｇＢＷを腹腔内投与して、麻酔を行った。調製実施例１で得たリンパ系疾患用診断薬剤を、マウスの足底に１０μＬ皮下注入し、５分間足底のマッサージを負荷した。その後、足底と膝窩リンパ節とを、目視観察および蛍光観察した。いずれも蛍光が認められた。その結果を、図２の（ａ）および（ｂ）に示す。なお、矢印は注射針刺入点である。その他の組織に蛍光は認められなかった。対照のためリンパ系疾患用診断薬剤無投与のマウスを同様に観察したが蛍光は認められなかった（同図（ｃ）および（ｄ）参照）。したがって、リンパ系疾患用診断薬剤は、リンパ節に集積することが確認された。
【００６６】
投与実施例１から明らかなとおり、リンパ系診断薬剤は、皮下からリンパ節へ移行することが確認された。
【００６７】
調製実施例２で別なリンパ系疾患用診断薬剤を調製した。
【００６８】
（調製実施例２）
卵黄レシチンより調製されたリン脂質をクロロホルムに溶いて、薄膜を作製した。これに、ジエチルエーテルと蛍光剤であるローダミン６Ｇとが含まれたリン酸バッファーを加えた後、震盪させることにより分散させた。これを蒸発ゲル化させた後リン酸バッファー中に震盪分散させ、最終的なリン脂質濃度を２０ｍｇ／ｍｌにして、リンパ系疾患用診断薬剤としてＲＥＶリポソームを調製した。この薬剤は、蛍光剤がリポソームのリン脂質二重膜内空に封入されて蛍光しているものである。
【００６９】
次の投与実施例２で、リンパ液を採集して、リンパ液中のリンパ系疾患用診断薬剤のリポソームを定量した。
【００７０】
（投与実施例２）
雄の日本白色家兎にペントバルビタール２０ｍｇ／ｋｇＢＷとケタミン２０ｍｇ／ｋｇＢＷとを静脈内投与して、麻酔を行った。その後、ポリエチレンチューブを用いて膝窩リンパ節の節前リンパ管、または節後リンパ管へ逆行性にカニュレーションした。リン脂質に換算したリポソーム濃度１０ｍｇ／ｍＬである前記調製実施例２のリンパ系疾患用診断薬剤を、足背皮下に０．１ｍＬ注入した。１時間後、十分なリンパ流を得るため下肢全体の回転運動を行いながらリンパ液を採集した。その後、さらに１５分間注入部位にマッサージを負荷して、リンパ液を採集した。それらを蛍光顕微鏡で観察したところ、マッサージ負荷によりリポソームのリンパ管への取込み量は著明に増加することが分った。
【００７１】
各リンパ液中のリポソーム濃度を測定するため、検量線を作成した。調製実施例２で得た既知の濃度のリポソームのリンパ系疾患用診断薬剤を１００倍、１０００倍および１００００倍に夫々希釈し、蛍光顕微鏡で単位視野当たり観察される蛍光粒子数より、検量線を得た。
【００７２】
リンパ液を蛍光顕微鏡で観察したときの蛍光粒子数と、検量線とを比較することにより、このリンパ液中のリポソームを定量した。また、リンパ液中のリポソーム濃度とリンパ液流量との積から、リポソーム輸送量を算出した。リンパ系疾患用診断薬剤投与後のリンパ液中のリポソーム濃度は、マッサージ後、０．０３ｍｇ／ｍＬであった。このときのリンパ液流量は２．０ｍＬ／時であったから、１本のリンパ管によるリポソーム輸送量は、その積から算出されるとおり０．０６ｍｇ／時であった。
【００７３】
投与実施例２から明らかなとおり、リンパ系診断薬剤は、皮下からリンパ節へ移行することが確認された。
【００７４】
なお、調製実施例２のローダミン６Ｇに代えて、別な診断薬や治療薬を用いたこと以外は調製実施例２と同様にして、診断薬や治療薬がリポソームへ封入された薬剤が得られる。この薬剤も同様な動態を示す。
【００７５】
（調製実施例３）
非特許文献１〜３の記載に従い、シアル酸トランスポーターの欠損した変異型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であるＬｅｃ２細胞に、α４ＧｎＴとコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）を、可溶化ＣＤ４３とともに遺伝子導入し、コア２分岐型Ｏ−グリカンの非還元末端にα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖基を持つＯ−グリカンである前記化学式（Ｉ）のリガンド基含有化合物を調製した。
【００７６】
リガンド基含有化合物をさらに加えてリポソームのようなコロイド粒子に含有させた薬剤を得ることができる。
【００７７】
なお、薬剤は、調製実施例１または２のように、診断薬や治療薬をコロイド粒子に封入したり付したりした薬剤であってもよい。またリガンド基含有化合物をリポソームのようなコロイド粒子表面へ、吸着や付着等により被覆してもよく、直接または結合性分子を介して化学結合により結合させてもよい。この薬剤も同様に、センチネルリンパ節やリンパ管に特異的に集積する動態を示す。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明のリンパ系薬物輸送材は、リンパ系疾患の診断や治療用の薬剤の材料として有用である。また、これを含むリンパ系診断薬剤や治療薬剤は、安全であり、注射剤をはじめ様々な剤型とすることができる汎用性の高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】α１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞とリンパ管内皮細胞との細胞接着性試験の結果を示す写真である。
【００８０】
【図２】本発明を適用するリンパ系疾患用薬剤を投与または非投与の足底と膝窩リンパ節との写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ行性に転移した腫瘍細胞を診断したり治療したりするための原材として用いられるリンパ系の細胞接着物質やリンパ系薬物輸送材、それを含有するリンパ系疾患の診断や治療のための薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胃癌や乳癌等の上皮性腫瘍は、リンパ系内でリンパ液を介してその所属リンパ節に転移する悪性腫瘍である。
【０００３】
このような腫瘍の原発巣を摘出する手術の際、所属リンパ節に転移した腫瘍細胞が残存していると術後に再発する危険性があるので、腫瘍原発巣とその周辺のリンパ管やリンパ節とを広範囲に摘出するリンパ節郭清が施されていた。正常なリンパ節等の組織も摘出するものであるから、患者に対する侵襲が大きい。
【０００４】
患者への侵襲を小さくするために、腫瘍細胞がリンパ液を介し最初に到達するみはりリンパ節すなわちセンチネルリンパ節を特定し、そこに転移がなければ他のリンパ節を摘出せず腫瘍原発巣のみを摘出するという手術が行なわれるようになってきた。
【０００５】
このようなセンチネルリンパ節は、例えば特許文献１に記載されているように皮下投与した超音波造影剤で造影させたり、皮下注射した色素で染色させたり、局所注射した放射線物質で検出したりして、特定される。
【０００６】
皮下深くに存在するセンチネルリンパ節を造影したり染色したりしても、色調が薄くて目視し難いうえ造影剤や色素がリンパ液とともに経時的に流れ去ってしまうので熟練した医師が迅速に特定しなければならない。さらに、転移しているセンチネルリンパ節のみならず転移していないそれ以外のリンパ節が染色されてしまうことがある。または患者が放射線物質で被ばくしてしまう。
【０００７】
一方、非特許文献１には、胃の腺粘液細胞分泌物であるα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン基含有Ｏ−グリカンが、胃癌の原因であるヘリコバクターピロリ菌の細胞壁構成成分の生合成を阻害し、抗菌剤として有用である旨、記載されている。非特許文献２には、これを生成するα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素について記載されている。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２３８４５０号公報
【非特許文献１】川久保雅友，小林基弘，中山 淳，Molecular Medicine, Vol.40, No.9, p1086-1092 (2003)
【非特許文献２】M.Kawakubo, Y. Ito, Y. Okimura, M. Kobayashi, K. Sakura, S. Kasama, M. N. Fukuda, M. Fukuda, T. Katsuyama, J. Nakayama; "Natural Antibiotic Function of a Human Gastric Mucin Against Helicobacter pylori Infection", Science, Vol.305, p1003-1006, (2004)、および[online], Science, Supporting online material, (http://www.scieccemag/cgi/data/305/5686/1003/DC/1)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、腫瘍細胞が転移しているセンチネルリンパ節とそこに至るまでのリンパ管との細胞への接着物質、その細胞へ選択的に薬物を輸送するリンパ系薬物輸送材、それを含有しており長時間センチネルリンパ節やリンパ管に滞留することができるリンパ系疾患の診断や治療のための安全な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載の発明は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得る、リガンド基含有化合物が、含まれていることを特徴とするリンパ系の細胞接着物質である。
【００１１】
該リガンド基が、糖鎖基であることが好ましい。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、該リガンド基が、非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖含有糖鎖基、シアリルルイスＸ糖鎖基またはマンノース含有糖鎖基であることを特徴とする請求項１に記載のリンパ系の細胞接着物質である。
【００１３】
リガンド基含有化合物が、シアリルルイスＸであってもよく、マンノース単糖であってもよく、非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖またはマンノースを有する多糖であってもよい。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、該非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖含有糖鎖基が、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖基であることを特徴とする請求項２に記載のリンパ系の細胞接着物質である。
【００１５】
このようなα結合型のアセチルグルコサミン含有基を有する化合物は、β結合型のアセチルグルコサミン含有基を有する化合物にα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が作用して生成されるものである。
【００１６】
非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖含有糖鎖基が、Ｎ−アセチルグルコサミンα１→４ガラクトースβ含有糖鎖基であることが好ましい。
【００１７】
請求項４に記載の発明は、リガンド基含有化合物が、下記式（Ｉ）
【化１】
で示されることを特徴とする請求項３に記載のリンパ系の細胞接着物質である。
【００１８】
式（Ｉ）のリガンド基含有化合物は、ｓＣＤ４３で示される可溶型のＬｅｕｋｏｓｉａｌｉｎというタンパク質に、そのＳｅｒ／Ｔｈｒ（セリン−スレオニン）残基を介して、２分岐型Ｏ−グリカンの３ＧａｌＮａｃα１が結合したものである。
【００１９】
同じく請求項５に記載の発明は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞へ接着するコロイド粒子に診断薬および／または治療薬が、付されていることを特徴とするリンパ系薬物輸送材である。
【００２０】
このリンパ系薬物輸送材は、リンパ管やセンチネルリンパ節に集積してリンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞に接着したまま長く滞留するので、コロイド粒子表面に露出している診断薬や治療薬を、これら細胞へ効率的に輸送する。
【００２１】
診断薬または治療薬は、付着や吸着や粘着により付されつつ、コロイド粒子の表面から露出している。その診断薬として、コロイド粒子の表面に付着するＰＫＨ２６のような蛍光剤で例示される感光剤が挙げられる。
【００２２】
同じく請求項６に記載の発明は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得るリガンド基含有化合物を、含んでいるリンパ系の細胞接着物質と、診断薬および／または治療薬とが、コロイド粒子に含有され、該リガンド基含有化合物が該コロイド粒子の表面から露出していることを特徴とするリンパ系薬物輸送材である。
【００２３】
診断薬または治療薬は、コロイド粒子に完全に内包されたり、コロイド粒子に内包されつつ一部がコロイド粒子の表面から露出したり、付着や吸着や粘着により付されつつコロイド粒子の表面から露出したりしている。
【００２４】
この細胞接着因子は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞に多く存在している。リンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞は、リガンド基含有化合物のリガンド基と同一または異なるリガンド基を有する物質を産生して、表面からこの基を露出させている。リンパ球やリンパ行性腫瘍細胞と、リンパ系薬物輸送材表面のリガンド基含有化合物とが、夫々のリガンド基に対する特異的な細胞接着因子のレセプターと相互作用する結果、リンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞へ、競合的に接着する。
【００２５】
その結果、このリンパ系薬物輸送材は、このリンパ系輸送材は、リガンド基含有化合物に由来して強くこれらの細胞に接着することができる。そのため、リンパ液に流されることなくこれらの細胞に集積したまま長時間滞留するので、コロイド粒子表面に露出しているような診断薬や治療薬を、これら細胞へ効率的に輸送する。
【００２６】
リンパ系薬物輸送材は、コロイド粒子単独でもリンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞へ接着するが、前記のリガンド基含有化合物、特に式（Ｉ）の化合物を含んでいるリンパ系の細胞接着物質を含有していると、リンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞により集積し、それらと一層強く接着する。
【００２７】
請求項７に記載の発明は、該コロイド粒子が、リポソーム、金属含有コロイド粒子、生体分解性樹脂コロイド粒子、フチン酸含有コロイド粒子、硫黄コロイド粒子またはタンパク質コロイド粒子であることを特徴とする請求項５または６に記載のリンパ系薬物輸送材である。
【００２８】
リポソームは、例えば脂肪やリン脂質でできたコロイド粒子が挙げられ、より具体的には、ＳＵＶリポソーム(small unilamellar vesicle liposome:小さな１枚膜リポソーム)、ＲＥＶリポソーム（reversephase evaporation vesicle liposome：逆相蒸発法リポソーム）、またはＭＬＶリポソーム（multilamellar vesicle liposome：多重層リポソーム）が挙げられる。金属含有コロイド粒子は、スズ含有コロイド、金含有コロイドが挙げられる。生体分解性樹脂コロイド粒子は、懸濁させたポリ乳酸粒子が挙げられる。
【００２９】
これらのリンパ系薬物輸送材は、例えばリポソームを構成する脂質の１００重量部に対し、それに保持されたリガンド基含有化合物や診断薬や治療薬を夫々５０〜５００重量部含有している。診断薬や治療薬のリポソームへの取込みの割合、すなわち、保持効率で表すと夫々１０〜１００％となる。
【００３０】
同じく請求項８に記載の発明は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞へ接着するコロイド粒子に診断薬および／または治療薬が付されているリンパ系薬物輸送材と、
該コロイド粒子を分散させる分散液とを
含んでいることを特徴とするリンパ系疾患用薬剤である。
【００３１】
同じく請求項９に記載の発明は、リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得るリガンド基含有化合物を含んでいるリンパ系の細胞接着物質と、診断薬および／または治療薬とが、コロイド粒子に含有され、該リガンド基含有化合物が該コロイド粒子の表面から露出しているリンパ系薬物輸送材と、
該コロイド粒子を分散させる分散液とを
含んでいることを特徴とするリンパ系疾患用薬剤である。
【００３２】
このリンパ系疾患用薬剤は、リガンド基含有化合物に由来して一層強くこれらの細胞に接着することができる。
【００３３】
診断薬は、インジゴカルミンで例示される色素、ＰＫＨ２６やローダミン６Ｇのような蛍光剤で例示される感光剤、核磁気共鳴画像診断用ガドリニウム化合物や超音波コントラスト剤で例示される造影剤が挙げられる。コロイド粒子がリン脂質であるとき、ＰＫＨ２６はリン脂質二重層の外側表面に付着し、ローダミン６Ｇはリン脂質二重層内側内空に封入される。
【００３４】
この薬剤をリンパ系疾患の診断のために用いる場合、活性化されたリンパ球やリンパ行性腫瘍細胞が産生するシアリルルイスＸや炎症性サイトカインに起因して、薬物輸送材がリンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞に一層接着し易くなり、多く接着する。そのため、腫瘍細胞が転移しているリンパ管やセンチネルリンパ節で、より明瞭に染色等がなされて、それを特定でき易くなり、確実かつ簡易に診断できる。そのうえ、リンパ系診断薬剤は長く滞留し診断薬を徐放するので、長時間にわたって明瞭かつ確実に診断することができる。
【００３５】
治療剤は、抗癌剤、抗炎症剤が挙げられる。
【００３６】
この薬剤をリンパ系疾患の治療のために用いる場合も同様にリンパ系薬物輸送材が作用する。そのため、この薬剤は、リンパ行性に転移した腫瘍細胞がセンチネルリンパ節に滞留している初期のリンパ行性腫瘍転移の薬物治療の際に、長時間にわたって、薬効を持続させることができる。
【００３７】
リンパ系疾患用薬剤は、例えばリポソームを構成する脂質の１００重量部に対し、それに保持された診断薬や治療薬を夫々５０〜５００重量部含有している。診断薬や治療薬のリポソームへの取込みの割合、すなわち、保持効率で表すと１０〜１００％となる。例えばこの薬剤を診断に用いる場合、過テクネチウム酸ナトリウムで放射線標識した塩化第一スズのコロイド０．１ｍｇ／ｍｌを成人一人当たり３７〜１１１ＭＢｑ静脈内投与する。
【００３８】
これらの分散液は、精製水、生理食塩水、リンゲル液が挙げられる。
【００３９】
この薬剤は、懸濁液または乳濁液である注射液、用時懸濁させた注射液で例示される製剤であってもよい。
【発明の効果】
【００４０】
本発明のリンパ系の細胞接着物質を含んでいるリンパ系薬物輸送材は、リンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節細胞に特異的に集積して接着し、そこに長時間滞留する安全な薬剤材料であり、簡便に製造できる。
【００４１】
本発明のリンパ系疾患用薬剤は診断薬剤として、腫瘍原発巣からリンパ管を経てセンチネルリンパ節に至るまでのリンパ系に催行したリンパ行性腫瘍細胞を、長時間にわたって正確かつ明瞭に検出できる。また、転移の軌跡を追ったり転移の拡がりを検査したりするマッピング剤としても使用できる。
【００４２】
またこのリンパ系疾患用薬剤は、治療薬剤として、制癌剤等の治療薬を長時間リンパ行性腫瘍細胞の近傍に滞留させて、それの増殖抑制や転移抑制や破壊・死滅促進をすることができる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
リンパ系循環におけるリンパ球・癌細胞と、リンパ管内皮細胞との接着機構は未解明である。そこで、先ずその接着機構について検討した。
【００４５】
試験例１のようにして、ヒト胃癌細胞（ＡＧＳ細胞）と、培養リンパ管内皮細胞との細胞接着機構を、解析した。
【００４６】
（試験例１）
(１)ＡＧＳ細胞の調製
始めに非特許文献１および２に記載の方法でα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）を調製した。
【００４７】
ヒト胃癌細胞由来のＡＧＳ細胞（大日本製薬株式会社製）を２群に分け、その内の１群にα４ＧｎＴを投与して培養し、リガンド基含有化合物として前記式（Ｉ）に記載のα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖含有基を有する化合物を産生するα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン発現ヒト胃癌細胞（α１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞）を得た。なお、このＡＧＳ細胞が、前記式（Ｉ）のリガンド基含有化合物を産生していることは、免疫組織化学的染色、ラテックス凝集反応および酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）による定量で確認した。
【００４８】
他方の１群を培養して、リガンド基含有化合物を産生しないα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン非発現ヒト胃癌細胞（α１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞）とした。
【００４９】
(２)α１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞とリンパ管内皮細胞との細胞接着性試験
(i)ヒト由来のリンパ管内皮細胞を播種した培養皿で、細胞質染色用蛍光色素ＣＦＳＥ（株式会社同人化学研究所製：商品名）により標識したα１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞を共培養し、静置した。３０分後、培養皿を３回洗浄し、接着していないＡＧＳ細胞と浮遊しているＡＧＳ細胞とを除去した。この培養皿を、位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡とを用いて、リンパ管内皮細胞に接着して蛍光しているＡＧＳ細胞を観察した。その結果を図１（ａ）に示す。
【００５０】
(ii)リンパ行性ヒト胃癌細胞から大量に産生される炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α（Tumor Necrosis Factor-α）を１０ｎｇ／ｍＬを培養リンパ管内皮細胞に添加して共培養したこと以外は、前記(i)と同様にして、リンパ管内皮細胞に接着して蛍光しているＡＧＳ細胞を観察した。その結果を図１（ｂ）に示す。
【００５１】
(３)α１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞とリンパ管内皮細胞との細胞接着性試験
対照のため、α１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞に代えて、α１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞を用いたこと以外は、前記（２）の(i)および(ii)と同様にして、リンパ管内皮細胞に接着して蛍光しているＡＧＳ細胞を観察した。その結果を図１（ｃ）および（ｄ）に示す。
【００５２】
(４)ＡＧＳ細胞とリンパ管内皮細胞との細胞接着性試験結果
ＴＮＦ−α添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞（図１(b)参照）は、ＴＮＦ−α非添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞（同図(a)）よりも、多く培養ヒトリンパ管内皮細胞に接着していた。
【００５３】
ＴＮＦ−α非添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞（同図(a)）は、ＴＮＦ−α添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞（同図(d)）よりも、多く培養ヒトリンパ管内皮細胞に接着していた。
【００５４】
ＴＮＦ−α添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞（同図(d)）は、ＴＮＦ−α非添加のα１，４−ＧｌｃＮＡｃ非発現ＡＧＳ細胞（同図(c)）よりも、多く培養ヒトリンパ管内皮細胞に接着していた。
【００５５】
このようにα１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞であって、ＴＮＦ−α添加処理していると、細胞接着数が増加していた。
【００５６】
このことから、リガンド基としてα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖基を有する前記式（Ｉ）に記載のリガンド基含有化合物は、リンパ管内皮細胞が有する細胞接着因子のレセプターと接着し易く、ＴＮＦ−αに起因して一層接着し易くなることが明らかとなった。したがって、このリガンド基含有化合物が露出したリンパ系薬物輸送材は、リンパ行性腫瘍細胞であるＡＧＳ細胞存在下で、リンパ管内皮細胞に極めて接着し易いものであることが示された。
【００５７】
次に、試験例２のようにして、リンパ球と、培養リンパ管内皮細胞との細胞接着機構を解析した。免疫組織化学的検索によってヒトの正常組織においても、細胞接着因子であるＥ−セレクチンを発現していることが、知られている。そこで試験例２では、このＥ−セレクチンに着目し、その発現について検討した。なおこのＥ−セレクチンは、抗原であるシアリルルイスＸに対する、レセプターである。
【００５８】
（試験例２）
（１）リンパ管内皮細胞のＥ−セレクチン発現試験
乳癌患者の乳腺内分泌外科手術をし、その承諾を得たヒトリンパ管内皮細胞を、培養し、免疫細胞化学像を観察したところ、培養ヒトリンパ管内皮細胞は、Ｅ−セレクチンを発現していることが確認された。リンパ行性ヒト胃癌細胞から大量に産生される炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αを培養ヒトリンパ管内皮細胞に添加したところ、Ｅ−セレクチンの発現が増強していることが示された。
【００５９】
（２）リンパ管内皮細胞のＥ−セレクチン発現試験結果
この試験から、リンパ管内皮細胞とリンパ球との細胞接着機構にリンパ管内皮細胞のＥ−セレクチンが関与していた。したがって、このリガンド基含有化合物としてシリアルルイスＸが露出したリンパ系薬物輸送材は、ＡＧＳ細胞であるリンパ行性腫瘍細胞存在下でリンパ管内皮細胞に極めて接着し易いものであることが示された。
【００６０】
なお、ＴＮＦ−αに代えて、同じくサイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ１β）を用いても、同様であった。
【００６１】
次にリンパ性疾患用薬剤を調製し、投与した例を示す。
【００６２】
調製実施例１でリンパ系疾患用診断薬剤を調製した。
【００６３】
（調製実施例１）
卵黄レシチンより調製されたリン脂質をクロロホルムに溶いて、薄膜を作製した。これに、ジエチルエーテルとリン酸バッファーを加えて超音波で分散させた。さらにこれを超音波処理して、最終的にリン脂質濃度が２０ｍｇ／ｍｌであるＳＵＶリポソームを調製した。このリポソーム０．５ｍｌに、蛍光剤であるＰＫＨ２６（Ｚｙｎａｘｉｓ社製）の１μｌを加え、１分間震盪した後、ウシ胎児血清０．５ｍｌを加えさらに１分間震盪して、リンパ系疾患用診断薬剤として、蛍光リポソームを得た。この薬剤は、蛍光剤がリポソームのリン脂質二重膜を標識して蛍光しているものである。
【００６４】
次の投与実施例１で、薬物輸送材であるリンパ系疾患用診断薬剤中のリポソームについて、リンパ節への動態を調べた。
【００６５】
（投与実施例１）
雄性ｄｄＹマウスにペントバルビタール７５ｍｇ／ｋｇＢＷを腹腔内投与して、麻酔を行った。調製実施例１で得たリンパ系疾患用診断薬剤を、マウスの足底に１０μＬ皮下注入し、５分間足底のマッサージを負荷した。その後、足底と膝窩リンパ節とを、目視観察および蛍光観察した。いずれも蛍光が認められた。その結果を、図２の（ａ）および（ｂ）に示す。なお、矢印は注射針刺入点である。その他の組織に蛍光は認められなかった。対照のためリンパ系疾患用診断薬剤無投与のマウスを同様に観察したが蛍光は認められなかった（同図（ｃ）および（ｄ）参照）。したがって、リンパ系疾患用診断薬剤は、リンパ節に集積することが確認された。
【００６６】
投与実施例１から明らかなとおり、リンパ系診断薬剤は、皮下からリンパ節へ移行することが確認された。
【００６７】
調製実施例２で別なリンパ系疾患用診断薬剤を調製した。
【００６８】
（調製実施例２）
卵黄レシチンより調製されたリン脂質をクロロホルムに溶いて、薄膜を作製した。これに、ジエチルエーテルと蛍光剤であるローダミン６Ｇとが含まれたリン酸バッファーを加えた後、震盪させることにより分散させた。これを蒸発ゲル化させた後リン酸バッファー中に震盪分散させ、最終的なリン脂質濃度を２０ｍｇ／ｍｌにして、リンパ系疾患用診断薬剤としてＲＥＶリポソームを調製した。この薬剤は、蛍光剤がリポソームのリン脂質二重膜内空に封入されて蛍光しているものである。
【００６９】
次の投与実施例２で、リンパ液を採集して、リンパ液中のリンパ系疾患用診断薬剤のリポソームを定量した。
【００７０】
（投与実施例２）
雄の日本白色家兎にペントバルビタール２０ｍｇ／ｋｇＢＷとケタミン２０ｍｇ／ｋｇＢＷとを静脈内投与して、麻酔を行った。その後、ポリエチレンチューブを用いて膝窩リンパ節の節前リンパ管、または節後リンパ管へ逆行性にカニュレーションした。リン脂質に換算したリポソーム濃度１０ｍｇ／ｍＬである前記調製実施例２のリンパ系疾患用診断薬剤を、足背皮下に０．１ｍＬ注入した。１時間後、十分なリンパ流を得るため下肢全体の回転運動を行いながらリンパ液を採集した。その後、さらに１５分間注入部位にマッサージを負荷して、リンパ液を採集した。それらを蛍光顕微鏡で観察したところ、マッサージ負荷によりリポソームのリンパ管への取込み量は著明に増加することが分った。
【００７１】
各リンパ液中のリポソーム濃度を測定するため、検量線を作成した。調製実施例２で得た既知の濃度のリポソームのリンパ系疾患用診断薬剤を１００倍、１０００倍および１００００倍に夫々希釈し、蛍光顕微鏡で単位視野当たり観察される蛍光粒子数より、検量線を得た。
【００７２】
リンパ液を蛍光顕微鏡で観察したときの蛍光粒子数と、検量線とを比較することにより、このリンパ液中のリポソームを定量した。また、リンパ液中のリポソーム濃度とリンパ液流量との積から、リポソーム輸送量を算出した。リンパ系疾患用診断薬剤投与後のリンパ液中のリポソーム濃度は、マッサージ後、０．０３ｍｇ／ｍＬであった。このときのリンパ液流量は２．０ｍＬ／時であったから、１本のリンパ管によるリポソーム輸送量は、その積から算出されるとおり０．０６ｍｇ／時であった。
【００７３】
投与実施例２から明らかなとおり、リンパ系診断薬剤は、皮下からリンパ節へ移行することが確認された。
【００７４】
なお、調製実施例２のローダミン６Ｇに代えて、別な診断薬や治療薬を用いたこと以外は調製実施例２と同様にして、診断薬や治療薬がリポソームへ封入された薬剤が得られる。この薬剤も同様な動態を示す。
【００７５】
（調製実施例３）
非特許文献１〜３の記載に従い、シアル酸トランスポーターの欠損した変異型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であるＬｅｃ２細胞に、α４ＧｎＴとコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）を、可溶化ＣＤ４３とともに遺伝子導入し、コア２分岐型Ｏ−グリカンの非還元末端にα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖基を持つＯ−グリカンである前記化学式（Ｉ）のリガンド基含有化合物を調製した。
【００７６】
リガンド基含有化合物をさらに加えてリポソームのようなコロイド粒子に含有させた薬剤を得ることができる。
【００７７】
なお、薬剤は、調製実施例１または２のように、診断薬や治療薬をコロイド粒子に封入したり付したりした薬剤であってもよい。またリガンド基含有化合物をリポソームのようなコロイド粒子表面へ、吸着や付着等により被覆してもよく、直接または結合性分子を介して化学結合により結合させてもよい。この薬剤も同様に、センチネルリンパ節やリンパ管に特異的に集積する動態を示す。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明のリンパ系薬物輸送材は、リンパ系疾患の診断や治療用の薬剤の材料として有用である。また、これを含むリンパ系診断薬剤や治療薬剤は、安全であり、注射剤をはじめ様々な剤型とすることができる汎用性の高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】α１，４−ＧｌｃＮＡｃ発現ＡＧＳ細胞とリンパ管内皮細胞との細胞接着性試験の結果を示す写真である。
【００８０】
【図２】本発明を適用するリンパ系疾患用薬剤を投与または非投与の足底と膝窩リンパ節との写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得る、リガンド基含有化合物が、含まれていることを特徴とするリンパ系の細胞接着物質。
【請求項２】
該リガンド基が、非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖含有糖鎖基、シアリルルイスＸ糖鎖基またはマンノース含有糖鎖基であることを特徴とする請求項１に記載のリンパ系の細胞接着物質。
【請求項３】
該非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖含有糖鎖基が、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖基であることを特徴とする請求項２に記載のリンパ系の細胞接着物質。
【請求項４】
リガンド基含有化合物が、下記式（Ｉ）
【化１】
で示されることを特徴とする請求項３に記載のリンパ系の細胞接着物質。
【請求項５】
リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞へ接着するコロイド粒子に診断薬および／または治療薬が、付されていることを特徴とするリンパ系薬物輸送材。
【請求項６】
リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得るリガンド基含有化合物を、含んでいるリンパ系の細胞接着物質と、診断薬および／または治療薬とが、コロイド粒子に含有され、該リガンド基含有化合物が該コロイド粒子の表面から露出していることを特徴とするリンパ系薬物輸送材。
【請求項７】
該コロイド粒子が、リポソーム、金属含有コロイド粒子、生体分解性樹脂コロイド粒子、フチン酸含有コロイド粒子、硫黄コロイド粒子またはタンパク質コロイド粒子であることを特徴とする請求項５または６に記載のリンパ系薬物輸送材。
【請求項８】
リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞へ接着するコロイド粒子に診断薬および／または治療薬が付されているリンパ系薬物輸送材と、
該コロイド粒子を分散させる分散液とを
含んでいることを特徴とするリンパ系疾患用薬剤。
【請求項９】
リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得るリガンド基含有化合物を含んでいるリンパ系の細胞接着物質と、診断薬および／または治療薬とが、コロイド粒子に含有され、該リガンド基含有化合物が該コロイド粒子の表面から露出しているリンパ系薬物輸送材と、
該コロイド粒子を分散させる分散液とを
含んでいることを特徴とするリンパ系疾患用薬剤。
【請求項１】
リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得る、リガンド基含有化合物が、含まれていることを特徴とするリンパ系の細胞接着物質。
【請求項２】
該リガンド基が、非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖含有糖鎖基、シアリルルイスＸ糖鎖基またはマンノース含有糖鎖基であることを特徴とする請求項１に記載のリンパ系の細胞接着物質。
【請求項３】
該非還元末端α１，４−Ｎ−アセチルアミノ糖含有糖鎖基が、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖基であることを特徴とする請求項２に記載のリンパ系の細胞接着物質。
【請求項４】
リガンド基含有化合物が、下記式（Ｉ）
【化１】
で示されることを特徴とする請求項３に記載のリンパ系の細胞接着物質。
【請求項５】
リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞へ接着するコロイド粒子に診断薬および／または治療薬が、付されていることを特徴とするリンパ系薬物輸送材。
【請求項６】
リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得るリガンド基含有化合物を、含んでいるリンパ系の細胞接着物質と、診断薬および／または治療薬とが、コロイド粒子に含有され、該リガンド基含有化合物が該コロイド粒子の表面から露出していることを特徴とするリンパ系薬物輸送材。
【請求項７】
該コロイド粒子が、リポソーム、金属含有コロイド粒子、生体分解性樹脂コロイド粒子、フチン酸含有コロイド粒子、硫黄コロイド粒子またはタンパク質コロイド粒子であることを特徴とする請求項５または６に記載のリンパ系薬物輸送材。
【請求項８】
リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞へ接着するコロイド粒子に診断薬および／または治療薬が付されているリンパ系薬物輸送材と、
該コロイド粒子を分散させる分散液とを
含んでいることを特徴とするリンパ系疾患用薬剤。
【請求項９】
リンパ管内皮細胞およびセンチネルリンパ節細胞の少なくともいずれかの細胞に存在しそれにリンパ球またはリンパ行性腫瘍細胞を接着させる細胞接着因子のレセプターへ結合し得るリガンド基含有化合物を含んでいるリンパ系の細胞接着物質と、診断薬および／または治療薬とが、コロイド粒子に含有され、該リガンド基含有化合物が該コロイド粒子の表面から露出しているリンパ系薬物輸送材と、
該コロイド粒子を分散させる分散液とを
含んでいることを特徴とするリンパ系疾患用薬剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−３２８０２８（Ｐ２００６−３２８０２８Ａ）
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１５７３７１（Ｐ２００５−１５７３７１）
【出願日】平成１７年５月３０日（２００５．５．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、経済産業省、地域新生コンソーシアム研究開発事業、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月３０日（２００５．５．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、経済産業省、地域新生コンソーシアム研究開発事業、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
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