リン酸カルシウム多孔体およびその製造方法
【課題】骨形成を促進させることができるリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法を提供すること。
【解決手段】繊維状リン酸カルシウム２が互いに係合して成形されたリン酸カルシウム多孔体１であって、繊維状リン酸カルシウム２の係合により形成された複数の第一気孔３と、第一気孔３の内径よりも大きな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第二気孔４とを有する。
【解決手段】繊維状リン酸カルシウム２が互いに係合して成形されたリン酸カルシウム多孔体１であって、繊維状リン酸カルシウム２の係合により形成された複数の第一気孔３と、第一気孔３の内径よりも大きな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第二気孔４とを有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸カルシウム多孔体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨折のような硬組織に対する損傷では、前記の硬組織の損傷を修復するために使用される材料が必要となる。前記材料は、しばしば損傷を受けた硬組織の機能を維持するために十分な機械的強度を具備することが必要とされる。これらの材料は、前記の硬組織自身が修復する間に一時的に使用されるか又は永久的な置換として使用される。前記の硬組織の修復に使用される材料としてはセラミックスが挙げられる。
【０００３】
最近になり、前記の目的に三つのタイプのセラミックスが臨床的に使用されている。
第一のタイプのセラミックスは、患者の骨に直接結合する生物学的に活性なセラミックスである。第一のタイプのセラミックスの例としては、ヒドロキシアパタイト（HAp ：Ca10(PO4)6(OH)2）などが挙げられる。
第二のタイプのセラミックスは、徐々に体に吸収される生体吸収性セラミックスである。第二のタイプのセラミックスの例としては、β‐リン酸三カルシウム（β-TCP：β-Ca3(PO4)2）などが挙げられる。
第三のタイプのセラミックスは、生体内で不活性であり、かつ高い機械的強度を有するセラミックスである。第三のタイプのセラミックスの例としては、α‐アルミナ（α-Al2O3）及び正方晶系ジルコニア（t-ZrO2）などが挙げられる。
【０００４】
生体吸収性セラミックスの具体的な例として、特許文献１には、リン酸三カルシウムからなる繊維状リン酸カルシウムが開示されている。特許文献１には、繊維状リン酸カルシウムを用いて成形された多孔質リン酸カルシウム成形体が、細胞を内部に取り込むための気孔と、細胞の培養に必要な培養液を内部に取り込むための気孔とを備えることが記載されている。これにより、成形体の内部で骨組織等を培養することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２８４９３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
硬組織の損傷に対して使用される生体吸収性セラミックスは、損傷を受けた硬組織の機能を維持するための強度を有することと、細胞が迅速に進入して自家骨などに置換されることとを両立することが求められている。
しかしながら、一般的なリン酸三カルシウムからなる多孔体は、多孔体の実用的な強度を維持しつつ細胞を好適に進入させるための複数の気孔を互いに連通させることが困難であり、骨形成の速度が不十分であった。
【０００７】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、骨形成をより促進させることができるリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、この発明は以下の手段を提案している。
本発明のリン酸カルシウム多孔体は、繊維状リン酸カルシウムが互いに係合して成形されたリン酸カルシウム多孔体であって、前記繊維状リン酸カルシウムの係合により形成された複数の第一気孔と、前記第一気孔の内径よりも大きな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第二気孔とを有することを特徴とするリン酸カルシウム多孔体である。
【０００９】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記第一気孔の内径よりも大きく前記第二気孔の内径よりも小さな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第三気孔をさらに有することが好ましい。
【００１０】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記第二気孔同士を連通させる第一連通孔を有することが好ましい。
【００１１】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記第二気孔と前記第三気孔とを連通させる第二連通孔を有することが好ましい。
【００１２】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記第三気孔同士を連通させる第三連通孔を有することが好ましい。
【００１３】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記繊維状リン酸カルシウムがβ‐リン酸三カルシウムからなることが好ましい。
【００１４】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記繊維状リン酸カルシウムがヒドロキシアパタイトからなっていてもよい。
【００１５】
本発明のリン酸カルシウム多孔体の製造方法は、繊維状リン酸カルシウム、第一の直径を有し加熱により焼失する複数の第一ビーズ、および前記第一の直径よりも大きな第二の直径を有し加熱により焼失する複数の第二ビーズを溶媒中に分散させて混合物を生成する混合工程と、前記混合物を所定の形状に成形する成形工程と、前記所定の形状に成形された前記混合物を、前記第一ビーズおよび前記第二ビーズが焼失する温度以上の温度で焼成する焼成工程と、を有することを特徴とするリン酸カルシウム多孔体の製造方法である。
【００１６】
また、前記混合工程では前記混合物をスラリー状とし、前記成形工程では前記混合物から前記溶媒を除去するとともにゲル状とすることが好ましい。
【００１７】
また、前記成形工程の後、前記焼成工程の前に、成形された前記混合物を加圧する加圧工程をさらに備えることが好ましい。
【００１８】
また、前記第一の直径は平均粒子径で10-30μmであり、前記第二の直径は平均粒子径で100-300μmであることが好ましい。
【００１９】
また、前記混合工程では、前記第一ビーズと前記第二ビーズとの少なくともいずれかの表面が粗面加工された状態で前記繊維状リン酸カルシウムと混合されてもよい。
【００２０】
また、前記粗面加工は、前記第一ビーズと前記第二ビーズとの少なくともいずれかを加熱することにより行われることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法によれば、骨形成をより促進させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】（A）は本発明の第１実施形態のリン酸カルシウム多孔体の断面写真、（B）はその一部拡大写真である。
【図２】同実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造方法を示すフローチャートである。
【図３】同実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造工程を示す説明図である。
【図４】同実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造工程を示す説明図である。
【図５】本発明の第２実施形態のリン酸カルシウム多孔体の断面写真である。
【図６】同実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造工程における予備成形体の模式図である。
【図７】同実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造工程における焼成後の多孔体の模式図である。
【図８】第１実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法の実施例におけるカーボンビーズの添加量と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示すグラフである。
【図９】第１実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体の製造方法の実施例において算出された三点曲げ強度を示すグラフである。
【図１０】同実施例において算出されたヤング率を示すグラフである。
【図１１】第１実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体の製造方法の実施例における成形圧とβ‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示すグラフである。
【図１２】第１実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法のさらに他の実施例におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。
【図１３】（Ａ）はHE染色された組織切片の画像、（Ｂ）は同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。
【図１４】（Ａ）はトルイジン青染色された組織切片の画像、（Ｂ）は同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。
【図１５】（Ａ）はTRAP染色された組織切片の画像、（Ｂ）は同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。
【図１６】（Ａ）はALP染色された組織切片の画像、（Ｂ）は同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。
【図１７】（Ａ）はクローン豚の脛骨に埋入する前のβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像、（Ｂ）はクローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像である。
【図１８】（Ａ）はクローン豚の脛骨に埋入する前のヒドロキシアパタイト多孔体の断面の画像、（Ｂ）はクローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるヒドロキシアパタイト多孔体の断面の画像である。
【図１９】図１７（Ａ）ないし図１８（Ｂ）に示す画像に基づいてリン酸カルシウム多孔体の面積を算出した結果を示すグラフである。
【図２０】β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体の骨形成面積を示すグラフである。
【図２１】β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体が埋入された筋肉組織切片のマッソン・トリクローム染色された画像である。
【図２２】β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体が埋入された筋肉組織切片のヘマトキシリンエオジン染色された画像である。
【図２３】β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体が埋入された脂肪組織切片のマッソン・トリクローム染色された画像である。
【図２４】β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体が埋入された脂肪組織切片のヘマトキシリンエオジン染色された画像である。
【図２５】（Ａ）は未処理のカーボンビーズを示す写真、（Ｂ）、（Ｃ）、および（Ｄ）は加熱温度変化による粗面加工を行ったカーボンビーズを示す写真である。
【図２６】（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）は、加熱温度の保持時間長短による粗面加工を行ったカーボンビーズを示す写真である。
【図２７】加熱温度の保持時間による粗面加工を行ったカーボンビーズの質量を示すグラフである。
【図２８】粗面加工をしていないカーボンビーズを使用した場合のβ‐リン酸三カルシウム多孔体を示す断面写真である。
【図２９】粗面加工されたカーボンビーズを用いて製造されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体を示す断面写真である。
【図３０】第一ビーズと第二ビーズとの混合比と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示すグラフである。
【図３１】第２実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体の製造方法の実施例１５において算出された三点曲げ強度を示すグラフである。
【図３２】同実施例において算出されたヤング率を示すグラフである。
【図３３】第２実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体の製造方法の実施例１５におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。
【図３４】リン酸カルシウム多孔体の製造方法の他の実施例におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。
【図３５】リン酸カルシウム多孔体の製造方法の実施例５、１５、１６におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径とＬｏｇ微分細孔体積との関係を重ねて示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（第１実施形態）
本発明の第１実施形態のリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法について説明する。図１は、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１のＳＥＭ観察による断面写真である。図２は、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１の製造方法を示すフローチャートである。図３および図４は、リン酸カルシウム多孔体１の製造工程を示す説明図である。
【００２４】
図１の（Ａ）に示すように、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１は、繊維状リン酸カルシウム２が互いに係合して成形されたリン酸カルシウム多孔体であって、繊維状リン酸カルシウム２の係合により形成された複数の第一気孔３と、第一気孔３の内径よりも大きな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第二気孔４とを有する。図１の（Ａ）の□で囲んだ部分を拡大した図１の（Ｂ）は繊維状リン酸カルシウム２が互いに契合して多孔体を形成していることを示している。
【００２５】
リン酸カルシウム多孔体１において、繊維状リン酸カルシウムは互いに絡み合うことで互いの間に1μm〜3μm程度の隙間を有して一体的に成形されている。繊維状リン酸カルシウムが互いに絡み合うことで生じる隙間が第一気孔３である。本実施形態では、繊維状リン酸カルシウム２は、β‐リン酸三カルシウムからなる。β‐リン酸三カルシウムは、生体吸収性が高い材料であり、例えば骨欠損部にβ‐リン酸三カルシウムを充填した場合に、自家骨への置換が起こることが知られている。
【００２６】
第二気孔４は、リン酸カルシウム多孔体１内において略均一に分散されて形成された空洞である。第二気孔４の内面形状は、後述する製造方法において使用されるカーボンビーズＣＢ（図３参照）の外面に沿った形状となっている。カーボンビーズＣＢは、主に炭素を含有し加熱することにより焼失する略球形の粉粒体である。本実施形態では、リン酸カルシウム多孔体１の製造工程において、カーボンビーズＣＢが焼失し、焼成された繊維状リン酸カルシウム２が残留することにより、第二気孔４が形成される。
【００２７】
第二気孔４の最大内径は、カーボンビーズＣＢの直径と略等しい。本実施形態では、第二気孔４の内径が約150μm程度となるようにするために、平均粒子径が150μmのカーボンビーズＣＢを用いて第二気孔４が形成されている。
なお、本明細書において、平均粒子径とは、メジアン径をもって表す。
【００２８】
複数の第二気孔４の一部は、隣接する第二気孔４同士を連通させる第一連通孔５を有している。第一連通孔５の大きさは、隣接する第二気孔４間の距離によって異なる。例えば後述する製造方法によってリン酸カルシウム多孔体１を製造した場合、第一連通孔５の大きさは、１〜50μm、好ましくは5〜30μm、さらに好ましくは10〜20μmとなっている。なお、製造条件によっては、上記第一連通孔５を有しておらず隣接する他の第二気孔４と連通していない第二気孔４（図４に符号４ａで示す）が形成される場合もある。隣接する他の第二気孔４と連通していない第二気孔４は、リン酸カルシウム多孔体１の使用時、例えば骨欠損部にリン酸カルシウム多孔体１を埋入する場合に、繊維状リン酸カルシウム２が生体に吸収されることによって、外部に開口される。
【００２９】
次に、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１の製造方法について説明する。
図２に示すステップＳ１は、長さが60〜200μmの範囲にあり、アスペクト比が20〜100の範囲にある繊維状（ファイバー状）の構造を有する繊維状リン酸カルシウムとカーボンビーズＣＢとを混合するステップ（混合工程）である。
ステップＳ１では、まず、繊維状リン酸カルシウムを純水に懸濁する。次に、繊維状リン酸カルシウムが懸濁されたスラリーに、カーボンビーズＣＢを添加する。さらに、繊維状リン酸カルシウムとカーボンビーズＣＢとが混合されたスラリー全重量に対して0.1mass%の寒天を添加する。続いて、繊維状リン酸カルシウムとカーボンビーズＣＢと寒天とが純水に懸濁されたスラリーを、寒天が溶解する温度まで加熱する。その後、エタノールを、水／エタノール混合比が7/3[v/v]となるように加えて攪拌し、室温まで冷却する。これにより、繊維状リン酸カルシウムとカーボンビーズＣＢとのスラリー状の混合物が出来上がる。
これでステップＳ１は終了し、ステップＳ２へ進む。
【００３０】
ステップＳ２は、上記ステップＳ１において出来上がったスラリー状の混合物を成形するステップ（成形工程）である。
ステップＳ２では、繊維状リン酸カルシウムとカーボンビーズＣＢとの何れの粒径よりも孔径が小さなろ過フィルターが底部に設けられた成形型に、ステップＳ１において出来上がったスラリー状の混合物を投入し、ろ過フィルターを介して液体を吸引して除去する。これにより、スラリー状の混合物から液体が除去される。液体が除去された混合物は、成形型の内面に沿う形状に成形される。続いて、液体が除去された混合物は成形型から取り外される。このとき、液体が除去された混合物は、寒天の存在によってゲル状となっている。成形型から取り外された混合物は、成形型の内面形状に沿って成形された予備成形体となる。
図３に示すように、予備成形体は、繊維状リン酸カルシウムによってカーボンビーズＣＢが囲まれた状態となっている。
これでステップＳ２は終了し、ステップＳ３へ進む。
【００３１】
ステップＳ３は、上記ステップＳ２で生じた予備成形体に対して一軸加圧成形を行うステップ（加圧工程）である。
ステップＳ３では、予備成形体を乾燥させ、その後、所定の成形圧（例えば本実施形態では40MPa）をかける。ステップＳ３においてかける成形圧が高いほど予備成形体は強く圧縮される。このため、ステップＳ３においてかける成形圧が高いほど、一連の製造工程が終了した後のリン酸カルシウム多孔体１の機械的強度が高くなる傾向がある。
これでステップＳ３は終了し、ステップＳ４へ進む。
【００３２】
ステップＳ４は、上記ステップＳ３で加圧成形された予備成形体を焼成するステップ（焼成工程）である。
ステップＳ４では、加圧成形された予備成形体を、カーボンビーズＣＢが焼失する温度以上に空気気流中で加熱する。これにより、カーボンビーズＣＢはCO2となって予備成形体の外部へと流出する。
これでステップＳ４は終了する。
【００３３】
図４に示すように、ステップＳ４によって、焼成された予備成形体からはカーボンビーズＣＢが焼失し、予備成形体はリン酸カルシウム多孔体１となる。
予備成形体においてカーボンビーズＣＢが占有していた空間は、上記ステップＳ４においてカーボンビーズＣＢが焼失することにより、リン酸カルシウム多孔体１においては略球形の空洞となる。リン酸カルシウム多孔体１における上記空洞は、細胞が進入可能な150μm程度の直径を有する気孔（第二気孔４）として機能する。また、繊維状リン酸カルシウム２同士が絡み合うことによって形成された隙間は、体液や培養液が進入可能な1〜3μm程度の内径を有する気孔（第一気孔３）として機能する。
また、隣り合う第二気孔４には、直径1〜20μm程度の連通孔（第一連通孔５）が生じている場合がある。第一連通孔５は、ある第二気孔４から隣の第二気孔４へ細胞が移動するための通路として機能する。
【００３４】
本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１は、内部に細胞が進入できる第二気孔４と、体液あるいは培養液が進入可能な第一気孔３とが略均一に分散して形成されている。このため、リン酸カルシウム多孔体１の内部に細胞を生着させやすく、骨形成を促進させることができる。
【００３５】
また、上記の例では、繊維状リン酸カルシウム２がβ‐リン酸三カルシウムからなるので、生体吸収性が高く、自家骨へ置換させやすい。一方、繊維状リン酸カルシウム２がヒドロキシアパタイトからなる場合には、自家骨への置換がβ‐リン酸三カルシウムよりも遅く、生体内で機械的強度をβ‐リン酸三カルシウムの場合より長い間高く保つことができる。
【００３６】
（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態のリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法について説明する。図５は、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１ＡのＳＥＭ観察による断面写真である。
図６および図７は、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造方法における製造工程を説明するための図であり、図６は、予備成形体の模式図である。図７は、焼成後のリン酸カルシウム多孔体１Ａの模式図である。
【００３７】
図５および図７に示すように、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１Ａは、第１実施形態で説明した第一気孔３の内径よりも大きく第１実施形態で説明した第二気孔４の内径よりも小さな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第三気孔６をさらに有する点で、上述の第１実施形態で説明したリン酸カルシウム多孔体１と構成が異なっている。
【００３８】
第三気孔６は、リン酸カルシウム多孔体１Ａ内において略均一に分散されて形成された空洞である。第三気孔６の内面形状は、後述する製造方法において第三気孔６を形成するために使用されるカーボンビーズ（第一ビーズＣＢ１、図６参照）の外面に沿った形状となっている。第一ビーズＣＢ１は、第二気孔４を形成するために使用されるカーボンビーズＣＢ（以下、第一ビーズＣＢ１と区別するために「第二ビーズＣＢ２」と称する。図６参照）と同様に、主に炭素を含有し加熱することにより焼失する粉粒体である。
【００３９】
第一ビーズＣＢ１の直径は、第二ビーズＣＢ２の直径よりも小さく、細胞の直径と同等程度の直径である。具体的には、第一ビーズＣＢ１は、平均粒子径が約10〜30μmとされている。
【００４０】
第三気孔６は、複数の第二気孔４の隙間に位置し、互いに離間して位置する第二気孔４を連通させる通路として、また細胞を生着させて骨形成を行う場として機能する。
【００４１】
また、複数の第三気孔６の一部は、第二気孔４と第三気孔６との内部を連通させる第二連通孔７を有している。第二連通孔７の大きさは、第二気孔４と第三気孔６との距離によって異なる。例えば後述する製造方法によってリン酸カルシウム多孔体１を製造した場合、第二連通孔７の大きさは、1μm以上5μm以下となっている。なお、リン酸カルシウム多孔体１の製造条件によっては、隣接する他の第三気孔６や第二気孔４と連通していない第三気孔６が形成される場合もある。このような第三気孔６も、隣接する他の第二気孔４と連通していない第二気孔４ａ（図４参照）と同様に、繊維状リン酸カルシウム２が生体に吸収されることによって、外部に開口される。
【００４２】
さらに、図７に示すように、リン酸カルシウム多孔体１Ａは、複数の第三気孔６同士を連通させる第三連通孔８を有している。例えば、リン酸カルシウム多孔体１Ａに第三連通孔８が形成されている場合、互いに離間して形成されている第二気孔４（図７に符号４ｂ、４ｃで示す）を、複数の第三気孔６を介して連通させることができる。
【００４３】
次に、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造方法について、上述の第１実施形態と異なる点を中心に説明する。
本実施形態では、上記ステップＳ１（混合工程、図２参照）において、第一ビーズＣＢ１と第二ビーズＣＢ２とを共に混合してスラリー状とする。第一ビーズＣＢ１と第二ビーズＣＢ２との混合比は、リン酸カルシウム多孔体１Ａに要求される強度に基づいて適宜設定することができる。平均粒子径が小さな第一ビーズＣＢ１の割合が多くなるほど、リン酸カルシウム多孔体１Ａの強度は低くなる。逆に、平均粒子径が大きな第二ビーズＣＢ２の割合が多くなるほど、リン酸カルシウム多孔体１Ａへ細胞が進入しやすくなる。
【００４４】
その後、第１実施形態で説明したステップＳ２ないしステップＳ４と同様の工程を行い、リン酸カルシウム多孔体１Ａを得る。
図６および図７に示すように、本実施形態では、第一ビーズＣＢ１が焼失したことによって生じる略球形の空隙は、内部に細胞が進入可能な気孔（第三気孔６）として機能する。
【００４５】
また、第一ビーズＣＢ１が第二ビーズＣＢ２とともに添加されていることにより、第二ビーズＣＢ２（上述の第１実施形態におけるカーボンビーズＣＢに相当）を上述の第１実施形態よりもさらに均一に分散させることができる。このため、第二気孔４が均一に分散した状態で形成され、細胞が進入しやすく骨形成を促進できるリン酸カルシウム多孔体１Ａを得ることができる。
【００４６】
また、第一ビーズＣＢ１を用いて形成された第三気孔６によって、互いに離間して位置する第二気孔４同士を連通することができるので、リン酸カルシウム多孔体１Ａの強度を維持しつつ連通性を高めることができる。
【００４７】
次に、以下に示す各実施例に基づいて、本発明のリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法についてより詳細に説明する。
【実施例１】
【００４８】
本実施例では、平均粒子径が150μmのカーボンビーズを用いて上述の第１実施形態で説明したリン酸カルシウム多孔体を製造する例を示す。
（繊維状リン酸カルシウムの合成）
出発物質として、和光純薬工業試薬特級の硝酸カルシウム四水和物(Ca(NO3)2・4H2O)、リン酸水素二アンモニウム((NH4)2HPO4)、尿素((NH2)2CO)および硝酸(HNO3)を用いた。試料溶液は、Ca/P比が1.67になるように、0.167mol・dm-3Ca(NO3)2・4H2O、0.100mol・dm-3(NH4)2HPO4、0.500mol・dm-3(NH2)2COおよび0.10mol・dm-3HNO3を混合することにより調製した。
【００４９】
この試料溶液750cm3を１Ｌの三ツ口丸底フラスコに入れ、80℃で48時間還流した。反応時間は、試料溶液が80℃に達したときを0時間として計測した。その後、試料溶液を吸引濾過し、濾過によって得られた固形成分を最大500cm3の純水で３回洗浄した後、純水を加えて2mass%の繊維状リン酸カルシウムスラリー（以下、「CPFスラリー」と称する。）とした。
【００５０】
（混合工程）
上記CPFスラリーに、平均粒子径150μmのカーボンビーズ（ニカビーズ（登録商標）；日本カーボン社製）を、CPFスラリー中の繊維状リン酸カルシウムの質量に対して50%となるように添加した。さらに、カーボンビーズが添加されたCPFスラリーに、和光純薬工業試薬特級の寒天を0.10mass%となるように添加した。繊維状リン酸カルシウム、カーボンビーズ、および寒天の混合物を60℃で1時間加熱して寒天を溶かしたあと、エタノールを、水／エタノール混合比が7/3[ v/v]となるように加えて攪拌した。その後、調製した混合物を室温で静置し、ゲル化させた。
【００５１】
（成形工程）
上記混合工程において調製された混合物を攪拌し、成形型（塩化ビニル管（内径16mm）あるいはアクリル型（内寸6mm×45mm））の中に注いだ。塩化ビニル管およびアクリル型内に注いだ混合物から吸引濾過により液体（純水）を除去した。塩化ビニル管には、最大25cm3の混合物が供給され、アクリル型には最大40cm3の混合物が供給された。
塩化ビニル管あるいはアクリル型に供給された混合物は、空気中で乾燥させることにより、所定の形状の予備成形体となった。
【００５２】
（加圧工程）
予備成形体を、40MPaで一軸加圧成形し、塩化ビニル管によって成形された予備成形体は円板状に、アクリル型によって成形された予備成形体は板状に成形した。
それぞれの予備成形体の厚さ寸法は、約3mmであった。
【００５３】
（焼成工程）
予備成形体を、光洋サーモシステム社製KTF433N型1500℃チューブ炉を用いて焼成し、リン酸カルシウム多孔体とした。
焼成工程は、昇温速度を5℃・min-1とし、1000℃に達したら、保持時間を５時間、焼成雰囲気を空気気流中(300cm3・min-1)として行った。
本実施例で示す一連の工程によって、上記第１実施形態で説明したβ‐リン酸三カルシウム多孔体が得られた。
【実施例２】
【００５４】
本実施例では、上記実施例１で得られたβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、カーボンビーズの添加量と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示す。
本実施例では、混合工程において、CPFスラリー中の繊維状リン酸カルシウムの質量に対してカーボンビーズが25%, 50%, 75%, および100%となるようにカーボンビーズを添加した。また、カーボンビーズを添加しない場合を対照実験とした。その他の製造工程は上記実施例１と同様である。
図８は、カーボンビーズの添加量と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示すグラフである。
図８に示すように、カーボンビーズを添加することによりリン酸カルシウム多孔体の気孔率は高くなった。また、カーボンビーズの添加量が多くなるほど気孔率も高くなった。
【実施例３】
【００５５】
本実施例では、上記実施例２で製造したβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、カーボンビーズの添加量と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の機械的強度との関係を示す。
機械的強度は、三点曲げ強度の測定と、ヤング率の測定とによって評価した。
三点曲げ強度の測定は、上述の実施例２で製造した板状のβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、島津オートグラフAGF-J（島津製作所製）を用いた。三点曲げ強度の測定条件を表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
また、三点曲げ強度は、下記式１を用いて算出した。
【００５８】
【数１】
【００５９】
上記式１において、Ｓｂは三点曲げ強度[Ｐａ]、Pは荷重[Ｎ]、lは支点間距離[ｍ]、tは試料片の厚さ[ｍ]、wは試料片の幅[ｍ]である。
【００６０】
三点曲げ強度の算出には、島津製作所製データ処理ソフトTRAPEZIUM Ver2.2.2.を用いた。
【００６１】
ヤング率は、上記三点曲げ強度の値から得られた荷重‐変位曲線の傾きから、下記式２を用いて算出した。
【００６２】
【数２】
【００６３】
上記式２において、Ｅｂは三点曲げ試験によるヤング率[Ｎ・ｍ−２]、ｙｂは荷重点の正味の変位量[ｍ]、Pは荷重[Ｎ]、lは支点間距離[ｍ]、tは試料片の厚さ[ｍ]、wは試料片の幅[ｍ]である。
【００６４】
図９および図１０は、本実施例において算出された三点曲げ強度およびヤング率をそれぞれ示すグラフである。図９および図１０に示すように、カーボンビーズの添加量が多くなるに従って、β‐リン酸三カルシウム多孔体の三点曲げ強度およびヤング率は低下した。
【実施例４】
【００６５】
本実施例では、上記実施例１で得られたβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、成形工程の成形圧における圧力と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示す。
本実施例では、上述の実施例１において、成形工程の成形圧を、30MPa、40MPa、50MPaの三通りとしてβ‐リン酸三カルシウム多孔体を製造し、それぞれの気孔率を測定した。図１１は、それぞれの成形圧におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率を示すグラフである。
図１１に示すように、成形工程の成形圧が高くなるに従ってβ‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率が低下する傾向があった。
【実施例５】
【００６６】
本実施例では、上記実施例１に示す工程によって製造されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔径分布を示す。
β‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔径分布の測定は、Micromeritics社製オートポアIV9520を用いた水銀圧入法によって行った。細孔径分布の測定条件を下記表２に示す。
【００６７】
【表２】
【００６８】
図１２は、本実施例におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。図１２において、符号１０１で示す線は積算細孔体積を示し、符号１０２で示す線はLog微分細孔体積を示す。
図１２に示すように、本実施例では、1〜3μm、〜15μm、および〜100μmの３つのピークを有する曲線状の細孔径分布となった。
ここで、2μm、5μm、および100μmの３つのピークは、それぞれ、繊維状リン酸カルシウム同士が係合して形成された第一気孔、複数の第二気孔が連通された第一連通孔、および第二気孔自身によって生じている。
【実施例６】
【００６９】
本実施例では、上記実施例１に示す工程に準じて製造されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体のin vivo評価結果を、図１３ないし図１６を参照して示す。
なお、本実施例では、上記実施例１とは異なり、直径4mm、高さ8mmの円柱形状のβ‐リン酸三カルシウム多孔体を成形して使用した。
上記円柱形状に形成されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体を、160°Cで90 min乾熱滅菌し、クサビラオレンジ蛍光遺伝子(huKO)を導入したクローン豚の脛骨に埋入した。実験条件を下記表３に纏めて示す。
【００７０】
【表３】
【００７１】
６週間の埋入後、β‐リン酸三カルシウム多孔体が埋入された上記クローン豚の脛骨を摘出し、凍結ミクロトーム(Leica CM3050 S)を用いてβ‐リン酸三カルシウム多孔体を含む凍結組織切片を作製した。さらに、作製された凍結組織切片を染色して画像解析処理ソフト(三谷商事製WinROOF)を用いて観察および解析を行った。
【００７２】
凍結組織切片は、HE染色、トルイジン青染色、TRAP染色、ALP染色によってそれぞれ染色した。染色された凍結組織切片は、位相差観察モードおよび蛍光観察モードを有する生物顕微鏡を用いて観察し、顕微鏡カメラを用いて画像を取得した。なお、図１３ないし図１６において、（Ａ）は各染色色素による染色結果を示しており、濃く示された部分が各染色色素によって染色された部分である。また、図１３ないし図１６において、（Ｂ）は蛍光観察の結果を示しており、白く示された部分が蛍光を発している部分である。
【００７３】
図１３（Ａ）は、HE染色された組織切片の画像である。図１３（Ｂ）は、同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）に示すように、HE染色により、核および細胞質が染め分けられた。また、成熟骨は、視野内の他の細胞よりも濃く染色されていた。
【００７４】
図１４（Ａ）は、トルイジン青染色された組織切片の画像である。図１４（Ｂ）は、同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。図１４（Ａ）および図１４（Ｂ）に示すように、β‐リン酸三カルシウム多孔体の端部において、第二気孔の壁部に沿って成熟骨が多く見られた。また、β‐リン酸三カルシウム多孔体の中心部においては、未成熟の新生骨が多く見られた。
【００７５】
図１５（Ａ）は、TRAP染色された組織切片の画像である。図１５（Ｂ）は、同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）に示すように、β‐リン酸三カルシウム多孔体の第二気孔の壁部には、破骨細胞が存在している。また、β‐リン酸三カルシウム多孔体の中心部に破骨細胞が進入している。
【００７６】
図１６（Ａ）は、ALP染色された組織切片の画像である。図１６（Ｂ）は、同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。図１６（Ａ）および図１６（Ｂ）に示すように、β‐リン酸三カルシウム多孔体の第二気孔の壁部に沿って骨芽細胞が存在している。また、β‐リン酸三カルシウム多孔体の中心部に骨芽細胞が進入している。
このように、本実施例では、クローン豚の脛骨に埋入されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体の内部に細胞が進入し、β‐リン酸三カルシウム多孔体の壁面に沿って骨形成が起こっている。
【実施例７】
【００７７】
本実施例では、上記実施例６と同様にクローン豚の脛骨に埋入されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体の生体吸収性について示す。
本実施例では、クローン豚の脛骨に埋入する前のβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像と、クローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像とを顕微鏡カメラを用いて撮影（図１７、図１８）し、β‐リン酸三カルシウム多孔体の断面積をそれぞれ計測して比較した。
【００７８】
また、本実施例では、繊維状リン酸カルシウムの材料としてヒドロキシアパタイトを使用し、ヒドロキシアパタイト多孔体を製造した例も併せて示す。
図１７（Ａ）は、クローン豚の脛骨に埋入する前のβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像である。図１７（Ｂ）は、クローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像である。
図１８（Ａ）は、クローン豚の脛骨に埋入する前のヒドロキシアパタイト多孔体の断面の画像である。図１８（Ｂ）は、クローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるヒドロキシアパタイト多孔体の断面の画像である。
【００７９】
図１９は、図１７（Ａ）ないし図１８（Ｂ）に示す画像に基づいてリン酸カルシウム多孔体の面積を算出した結果を示すグラフである。図１９において、HAp(150)は、平均粒子径150μmのカーボンビーズを添加して製造されたヒドロキシアパタイト多孔体における結果を示し、TCP(150)は、平均粒子径150μmのカーボンビーズを添加して製造されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体における結果を示している。
【００８０】
図１９に示すように、ヒドロキシアパタイト多孔体では、埋入後における断面積が埋入前よりも僅かに増加している。
また、図１９に示すように、β‐リン酸三カルシウム多孔体では、埋入後には、埋入前よりも断面積が25%低下している。すなわち、β‐リン酸三カルシウム多孔体は、クローン豚の脛骨に埋入されている期間内にその25%が分解あるいは吸収された。
【実施例８】
【００８１】
本実施例では、上記実施例６と同様にクローン豚の脛骨に埋入されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体の骨形成面積について示す。
本実施例では、クローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像を顕微鏡カメラを用いて撮影し、埋入前のβ‐リン酸三カルシウム多孔体による円形の領域を全体面積（100%）とし、全体面積内におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の割合と新生骨の割合とを算出した。
【００８２】
また、上記実施例７で用いたヒドロキシアパタイト多孔体についても同様に、全体面積内におけるヒドロキシアパタイト多孔体の割合と新生骨の割合とを算出した。
図２０は、β‐リン酸三カルシウム多孔体(TCP(150))およびヒドロキシアパタイト多孔体(HAp(150))の骨形成面積を示すグラフである。図２０に示すように、β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体における新生骨の割合は、それぞれ全体面積に対して25.5%、31.2％であった。また、β‐リン酸三カルシウム多孔体における新生骨の割合の方が、ヒドロキシアパタイト多孔体における新生骨の割合よりも高かった。
【実施例９】
【００８３】
本実施例では、上記実施例１に示す工程に準じ、β‐リン酸三カルシウム多孔体(TCP(150))、カーボンビーズの平均粒子径を20μmに変えたβ‐リン酸三カルシウム多孔体(TCP(20))、繊維状リン酸カルシウムとしてヒドロキシアパタイトを原料としたヒドロキシアパタイト多孔体(HAp(150))をそれぞれ試料片として、それぞれの骨誘導能をin vivoで評価した。各試料片の作製条件および材料特性を下記表４に示す。
【００８４】
【表４】
【００８５】
多孔質セラミックスの骨誘導能の検証には、上記TCP(150), TCP(20), およびHAp(150)を、直径4 mm × 高さ8 mmの寸法からなる円柱状に成形した試料片が用いられた。なお、各試料片は160 °Cで90 min乾熱滅菌したものを使用した。
【００８６】
実験動物には、赤色蛍光タンパクであるクサビラオレンジ(Kusabira-Orange (huKO))を遺伝子に導入したトランスジェニック・クローンブタ(huKOブタ, 29週齢, ♂, ~100 kg)を用いた。ソムノペンチル(共立製薬)を用いてhuKOブタに麻酔をかけた後に、腹部および左後肢の大腿部を剃毛し、メスで皮膚を切開して腹部脂肪および大腿部筋肉を露出させた。腹部脂肪および大腿部筋肉に深さ1 cm程度のポケットを作り、各試料片をポケットに1個ずつ(合計2個)埋入した後に、皮膚をナイロン製縫合糸で縫合した。
【００８７】
試料片を上記huKOブタに埋入してから13週後、麻酔薬の過剰投与によりhuKOブタを犠牲にした。さらに、埋入された試料片をhuKOブタから摘出し、4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液(和光純薬工業)に浸漬して組織を固定した。各試料片をパラフィン包埋し、脱灰後、マッソントリクローム染色およびヘマトキシリンエオジン染色を施した組織切片を作製した。組織学的観察は、研究用システム顕微鏡（BX5,オリンパス社製）を用いて行った。
【００８８】
図２１は、筋内に埋入した各試料片のマッソン・トリクローム染色の結果である。図２１において上段は低倍率（４０倍）で撮影した像であり、下段は、上段において四角い枠で囲った部分を強拡大した高倍率（２００倍）の組織像を示している。
図２１に示すように、HAp(150)およびTCP(150)では、丸い第二気孔内に骨が形成されている様子が観察された。一方、TCP(20)では、13週の埋入では骨形成は認められなかった。
【００８９】
図２２は、上述の各試料片のヘマトキシリンエオジン染色の結果である。図２２に示すように、150μmのカーボンビーズを使用した多孔体（TCP(150), HAp(150)）では、丸い第二気孔内に骨の形成が認められた。TCP(150)およびHAp(150)の組織学的所見は、連通気孔構造を備えた多孔体が骨芽細胞の存在しない筋内でも骨形成を生じる「骨誘導能」を有することを示している。
【００９０】
図２３および図２４は、上述の各試料片を脂肪内に埋入した結果であり、それぞれマッソン・トリクローム染色およびヘマトキシリンエオジン染色を施した組織像を示している。
図２３に示すように、脂肪組織の場合、気孔内には線維性の組織が入り込んでおり、骨形成はほとんど認められなかった。また、図２４に示すように、ヘマトキシリンエオジン染色の組織像においても図２３と同様に、気孔内には繊維性の組織が入り込んでおり、骨形成はほとんど認められなかった。
【実施例１０】
【００９１】
本実施例では、カーボンビーズを粗面加工する例について示す。
本実施例では、平均粒子径150μmのカーボンビーズ（ニカビーズ（登録商標）;日本カーボン社製）をアルミナボートに5g入れ、光洋サーモシステム社製KBF31型1700℃箱型電気炉を用いて、下記表５および表６に示す条件で加熱した。
【００９２】
【表５】
【００９３】
【表６】
【００９４】
図２５と図２６は、ＳＥＭ観察によるが、図２５（Ａ）は、未処理のカーボンビーズを示す写真である。図２５（Ｂ）は、表５に示す条件１に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。図２５（Ｃ）は、表５に示す条件２に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。図２５（Ｄ）は、表５に示す条件３に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。
図２５（Ａ）ないし図２５（Ｄ）に示すように、カーボンビーズを加熱する温度が高いほど、カーボンビーズの表面の凹凸が大きくなっている。また、カーボンビーズを加熱する温度が高いほど、カーボンビーズの焼失量が多くなる傾向が見られる。
【００９５】
図２６（Ａ）は、表６に示す条件４に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。図２６（Ｂ）は、表６に示す条件５に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。図２６（Ｃ）は、表６に示す条件６に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。
図２７は、表６に示す条件４〜７に基づいて処理したカーボンビーズの質量を、加熱していないカーボンビーズの重量を１００％としたときの比で示したグラフである。
図２６（Ａ）ないし図２６（Ｃ）に示すように、カーボンビーズを加熱状態で保持する時間が長くなっても表面の形状には大きな差はみられなかった。
また、図２７に示すように、カーボンビーズを加熱状態で保持する時間が３０分まではカーボンビーズの質量が減少する。
本発明においては、加熱状態の保持時間は１０分ほどが最適であった。
【実施例１１】
【００９６】
本実施例では、上記実施例１０における条件５によって粗面加工されたカーボンビーズ（図２６（Ｂ）参照）を用いてリン酸カルシウム多孔体を製造する例を示す。
本実施例では、太平化学産業社製のβ‐リン酸三カルシウム粉体（β‐ＴＣＰ‐１００）を5gと、上記条件５によって粗面加工されたカーボンビーズを2.5gと、和光純薬工業試薬特級の寒天を0.3ｇとを、純水250cm3に添加し、60℃で1時間加熱した。得られた混合物に、エタノールを107cm3加えて攪拌し、室温で静置してゲル化させた。
【００９７】
ゲル化した混合物のスラリーを攪拌し、内径16mmの塩化ビニル管内に注ぎ、吸引濾過したあとに濾過ケーキを60℃で24時間乾燥させた。乾燥した濾過ケーキを、カーボンビーズが脱落しないように軽くほぐし、β‐リン酸三カルシウム粉体とカーボンビーズの混合粉体を調製した。
【００９８】
さらに、上述のβ‐リン酸三カルシウム粉体とカーボンビーズの混合粉体を1.0ｇ秤量し、100MPaで一軸加圧成形して円板状の予備成形体（直径16mm、厚さ3mm）を作製した。この円板状の予備成形体を、上述の実施例１と同一の条件で焼成し、リン酸カルシウム多孔体とした。
【００９９】
図２８は、粗面加工をしていないカーボンビーズを使用した場合の比較例を示すＳＥＭ観察による写真である。図２９は、上記実施例１０における条件５によって粗面加工されたカーボンビーズを用いて製造されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体を示すＳＥＭ観察による写真である。
図２８および図２９に示すように、粗面加工されたカーボンビーズを使用した場合には、粗面加工されていないカーボンビーズを使用した場合と比較して第二気孔４の内面の凹凸が大きく、また、隣り合う第二気孔４を繋ぐ第一連通孔５の直径が大きい。
【実施例１２】
【０１００】
本実施例では、上述の第２実施形態で説明したリン酸カルシウム多孔体を製造する例を示す。
本実施例では、平均粒子径20μmのカーボンビーズ（第一ビーズ）と、平均粒子径150μmのカーボンビーズ（第二ビーズ）とを使用してリン酸カルシウム多孔体を製造した。
線維状リン酸カルシウムに対するカーボンビーズの添加量は50%とし、第一ビーズと第二ビーズとの混合比は50:50とした。
その他の条件は上述の実施例１と同一である。
本実施例で示す一連の工程によって、上記第２実施形態で説明したβ‐リン酸三カルシウム多孔体が得られた。
【実施例１３】
【０１０１】
本実施例では、上記実施例１２で得られたβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、第一ビーズと第二ビーズとの混合比と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示す。
本実施例では、混合工程において、第一ビーズと第二ビーズとの混合比を、0:10（第一ビーズのみ）、5:5、および10:0（第二ビーズのみ）とした。
図３０は、第一ビーズと第二ビーズとの混合比と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示すグラフである。図３０に示すように、第一ビーズと第二ビーズとの混合比によらず、気孔率は約70%であった。
【実施例１４】
【０１０２】
本実施例では、上記実施例１３で製造したβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、第一ビーズと第二ビーズとの混合比と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の機械的強度との関係を示す。
機械的強度は、上述の実施例３と同様に、三点曲げ強度の測定と、ヤング率の測定とによって評価した。
【０１０３】
図３１、図３２は、本実施例において算出された三点曲げ強度およびヤング率をそれぞれ示すグラフである。図３１および図３２に示すように、平均粒子径が小さい第一ビーズが多く添加されている場合には三点曲げ強度およびヤング率が低く、平均粒子径が大きい第二ビーズが多く添加されている場合には三点曲げ強度およびヤング率が高い。
【実施例１５】
【０１０４】
本実施例では、上記実施例１２で得られたβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔径分布を示す。
β‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔径分布の測定は、上述の実施例５と同様の手順および条件にて行った。
【０１０５】
図３３は、本実施例におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。図３３において、符号１１１で示す線は積算細孔体積であり、符号１１２で示す線はLog微分細孔体積である。
図３３に示すように、本実施例では、2μmおよび10μmの２つの大きなピークと、100μmの小さなピークとを有する曲線状の細孔径分布となった。
【実施例１６】
【０１０６】
本実施例では、上記実施例１と同様の工程によって、平均粒子径20μmの第一ビーズのみをカーボンビーズの材料としてリン酸カルシウム多孔体を製造した例を示す。
図３４は、本実施例におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。図３４において、符号１２１で示す線は積算細孔体積であり、符号１２２で示す線はLog微分細孔体積である。
図３４に示すように、本実施例では、2μmおよび5μmの２つのピークを有する曲線状の細孔体積となった。
【０１０７】
図３５は、上記実施例５、実施例１５、および実施例１６で示した細孔直径とＬｏｇ微分細孔体積との関係の曲線と、対照実験としてカーボンビーズを含まないリン酸カルシウム多孔体の細孔径分布を示す曲線とを重ねて示したグラフである。
図３５において、符号１３１で示す線は、カーボンビーズを含まないリン酸カルシウム多孔体の細孔体積を示す。また、図３５において、符号１３２で示す線は、第一ビーズが単体で添加されたリン酸カルシウム多孔体の細孔径分布を示す。また、図３５において、符号１３３で示す線は、第一ビーズと第二ビーズとを含むリン酸カルシウム多孔体の細孔径分布を示す。また、図３５において、符号１３４で示す線は、第二ビーズが単体で添加されたリン酸カルシウム多孔体の細孔体積を示す。
【０１０８】
図３５に示すように、カーボンビーズを添加しないで製造したリン酸カルシウム多孔体は、1〜3μmの範囲に１つのピークを有している。これに対して、平均粒子径20μmの第一ビーズを単体で添加した場合には、1〜3μmのピークに加えて〜5μmのピークを有する。また、平均粒子径150μmの第二ビーズを単独で添加した場合には、1〜3μm、〜15μm、および〜100μmの３つのピークを有する。さらに、第一ビーズと第二ビーズとの両方を添加した場合には、1〜3μmおよび7μmの２つのピークを有する。
【０１０９】
以上、本発明の実施形態および実施例について図面を参照して詳述したが、本発明の具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
たとえば、上述の第１実施形態および第２実施形態では、繊維状リン酸カルシウムがβ‐リン酸三カルシウムからなる例を用いて説明したが、繊維状リン酸カルシウムの材料はβ‐リン酸三カルシウムには限られない。たとえば、繊維状リン酸カルシウムはヒドロキシアパタイトからなるものであってもよい。なお、ヒドロキシアパタイトは、β‐リン酸三カルシウムと比較して生体に吸収されにくい材料であり、骨欠損部において長期間その形状を維持することができる。
【０１１０】
また、繊維状リン酸カルシウムの材料を、繊維状リン酸カルシウムが生体に吸収される速度を調整するために適宜選択することもできる。また、β‐リン酸三カルシウムとヒドロキシアパタイトとを混合して繊維状リン酸カルシウムの材料としてもよい。生体に吸収される速度を高めるためには、β‐リン酸三カルシウムに代えてα‐リン酸三カルシウムを用いることも有益である。この場合、焼成温度を1150℃以上にするとα‐リン酸三カルシウムが生成する傾向にあることを利用することが好ましい。
【０１１１】
また、上述の各実施形態において示した構成要素、および各実施例において示した事項は、適宜に組み合わせて構成することが可能である。
たとえば、上述の実施例において示した粗面加工は、上述の第２実施形態で示したように異なる平均粒子径を有する複数種類のカーボンビーズのいずれかあるいはそれぞれに対して行われてもよい。これにより、第二連通孔や第三連通孔の径を制御することができる。
【０１１２】
また、上述の実施形態および実施例では、炭素を主に含有するカーボンビーズを使用した例を示したが、カーボン以外の材料からなるビーズを公知の材料から適宜選択することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明は、生体骨や歯などの硬組織の欠損部位を補填するための多孔体およびその製造方法として適用することができる。
【符号の説明】
【０１１４】
１、１Ａ リン酸カルシウム多孔体
２ 繊維状リン酸カルシウム
３ 第一気孔
４ 第二気孔
５ 第一連通孔
６ 第三気孔
７ 第二連通孔
８ 第三連通孔
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸カルシウム多孔体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨折のような硬組織に対する損傷では、前記の硬組織の損傷を修復するために使用される材料が必要となる。前記材料は、しばしば損傷を受けた硬組織の機能を維持するために十分な機械的強度を具備することが必要とされる。これらの材料は、前記の硬組織自身が修復する間に一時的に使用されるか又は永久的な置換として使用される。前記の硬組織の修復に使用される材料としてはセラミックスが挙げられる。
【０００３】
最近になり、前記の目的に三つのタイプのセラミックスが臨床的に使用されている。
第一のタイプのセラミックスは、患者の骨に直接結合する生物学的に活性なセラミックスである。第一のタイプのセラミックスの例としては、ヒドロキシアパタイト（HAp ：Ca10(PO4)6(OH)2）などが挙げられる。
第二のタイプのセラミックスは、徐々に体に吸収される生体吸収性セラミックスである。第二のタイプのセラミックスの例としては、β‐リン酸三カルシウム（β-TCP：β-Ca3(PO4)2）などが挙げられる。
第三のタイプのセラミックスは、生体内で不活性であり、かつ高い機械的強度を有するセラミックスである。第三のタイプのセラミックスの例としては、α‐アルミナ（α-Al2O3）及び正方晶系ジルコニア（t-ZrO2）などが挙げられる。
【０００４】
生体吸収性セラミックスの具体的な例として、特許文献１には、リン酸三カルシウムからなる繊維状リン酸カルシウムが開示されている。特許文献１には、繊維状リン酸カルシウムを用いて成形された多孔質リン酸カルシウム成形体が、細胞を内部に取り込むための気孔と、細胞の培養に必要な培養液を内部に取り込むための気孔とを備えることが記載されている。これにより、成形体の内部で骨組織等を培養することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２８４９３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
硬組織の損傷に対して使用される生体吸収性セラミックスは、損傷を受けた硬組織の機能を維持するための強度を有することと、細胞が迅速に進入して自家骨などに置換されることとを両立することが求められている。
しかしながら、一般的なリン酸三カルシウムからなる多孔体は、多孔体の実用的な強度を維持しつつ細胞を好適に進入させるための複数の気孔を互いに連通させることが困難であり、骨形成の速度が不十分であった。
【０００７】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、骨形成をより促進させることができるリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、この発明は以下の手段を提案している。
本発明のリン酸カルシウム多孔体は、繊維状リン酸カルシウムが互いに係合して成形されたリン酸カルシウム多孔体であって、前記繊維状リン酸カルシウムの係合により形成された複数の第一気孔と、前記第一気孔の内径よりも大きな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第二気孔とを有することを特徴とするリン酸カルシウム多孔体である。
【０００９】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記第一気孔の内径よりも大きく前記第二気孔の内径よりも小さな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第三気孔をさらに有することが好ましい。
【００１０】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記第二気孔同士を連通させる第一連通孔を有することが好ましい。
【００１１】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記第二気孔と前記第三気孔とを連通させる第二連通孔を有することが好ましい。
【００１２】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記第三気孔同士を連通させる第三連通孔を有することが好ましい。
【００１３】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記繊維状リン酸カルシウムがβ‐リン酸三カルシウムからなることが好ましい。
【００１４】
また、本発明のリン酸カルシウム多孔体は、前記繊維状リン酸カルシウムがヒドロキシアパタイトからなっていてもよい。
【００１５】
本発明のリン酸カルシウム多孔体の製造方法は、繊維状リン酸カルシウム、第一の直径を有し加熱により焼失する複数の第一ビーズ、および前記第一の直径よりも大きな第二の直径を有し加熱により焼失する複数の第二ビーズを溶媒中に分散させて混合物を生成する混合工程と、前記混合物を所定の形状に成形する成形工程と、前記所定の形状に成形された前記混合物を、前記第一ビーズおよび前記第二ビーズが焼失する温度以上の温度で焼成する焼成工程と、を有することを特徴とするリン酸カルシウム多孔体の製造方法である。
【００１６】
また、前記混合工程では前記混合物をスラリー状とし、前記成形工程では前記混合物から前記溶媒を除去するとともにゲル状とすることが好ましい。
【００１７】
また、前記成形工程の後、前記焼成工程の前に、成形された前記混合物を加圧する加圧工程をさらに備えることが好ましい。
【００１８】
また、前記第一の直径は平均粒子径で10-30μmであり、前記第二の直径は平均粒子径で100-300μmであることが好ましい。
【００１９】
また、前記混合工程では、前記第一ビーズと前記第二ビーズとの少なくともいずれかの表面が粗面加工された状態で前記繊維状リン酸カルシウムと混合されてもよい。
【００２０】
また、前記粗面加工は、前記第一ビーズと前記第二ビーズとの少なくともいずれかを加熱することにより行われることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法によれば、骨形成をより促進させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】（A）は本発明の第１実施形態のリン酸カルシウム多孔体の断面写真、（B）はその一部拡大写真である。
【図２】同実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造方法を示すフローチャートである。
【図３】同実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造工程を示す説明図である。
【図４】同実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造工程を示す説明図である。
【図５】本発明の第２実施形態のリン酸カルシウム多孔体の断面写真である。
【図６】同実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造工程における予備成形体の模式図である。
【図７】同実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造工程における焼成後の多孔体の模式図である。
【図８】第１実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法の実施例におけるカーボンビーズの添加量と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示すグラフである。
【図９】第１実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体の製造方法の実施例において算出された三点曲げ強度を示すグラフである。
【図１０】同実施例において算出されたヤング率を示すグラフである。
【図１１】第１実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体の製造方法の実施例における成形圧とβ‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示すグラフである。
【図１２】第１実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法のさらに他の実施例におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。
【図１３】（Ａ）はHE染色された組織切片の画像、（Ｂ）は同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。
【図１４】（Ａ）はトルイジン青染色された組織切片の画像、（Ｂ）は同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。
【図１５】（Ａ）はTRAP染色された組織切片の画像、（Ｂ）は同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。
【図１６】（Ａ）はALP染色された組織切片の画像、（Ｂ）は同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。
【図１７】（Ａ）はクローン豚の脛骨に埋入する前のβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像、（Ｂ）はクローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像である。
【図１８】（Ａ）はクローン豚の脛骨に埋入する前のヒドロキシアパタイト多孔体の断面の画像、（Ｂ）はクローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるヒドロキシアパタイト多孔体の断面の画像である。
【図１９】図１７（Ａ）ないし図１８（Ｂ）に示す画像に基づいてリン酸カルシウム多孔体の面積を算出した結果を示すグラフである。
【図２０】β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体の骨形成面積を示すグラフである。
【図２１】β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体が埋入された筋肉組織切片のマッソン・トリクローム染色された画像である。
【図２２】β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体が埋入された筋肉組織切片のヘマトキシリンエオジン染色された画像である。
【図２３】β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体が埋入された脂肪組織切片のマッソン・トリクローム染色された画像である。
【図２４】β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体が埋入された脂肪組織切片のヘマトキシリンエオジン染色された画像である。
【図２５】（Ａ）は未処理のカーボンビーズを示す写真、（Ｂ）、（Ｃ）、および（Ｄ）は加熱温度変化による粗面加工を行ったカーボンビーズを示す写真である。
【図２６】（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）は、加熱温度の保持時間長短による粗面加工を行ったカーボンビーズを示す写真である。
【図２７】加熱温度の保持時間による粗面加工を行ったカーボンビーズの質量を示すグラフである。
【図２８】粗面加工をしていないカーボンビーズを使用した場合のβ‐リン酸三カルシウム多孔体を示す断面写真である。
【図２９】粗面加工されたカーボンビーズを用いて製造されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体を示す断面写真である。
【図３０】第一ビーズと第二ビーズとの混合比と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示すグラフである。
【図３１】第２実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体の製造方法の実施例１５において算出された三点曲げ強度を示すグラフである。
【図３２】同実施例において算出されたヤング率を示すグラフである。
【図３３】第２実施形態に係るリン酸カルシウム多孔体の製造方法の実施例１５におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。
【図３４】リン酸カルシウム多孔体の製造方法の他の実施例におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。
【図３５】リン酸カルシウム多孔体の製造方法の実施例５、１５、１６におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径とＬｏｇ微分細孔体積との関係を重ねて示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（第１実施形態）
本発明の第１実施形態のリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法について説明する。図１は、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１のＳＥＭ観察による断面写真である。図２は、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１の製造方法を示すフローチャートである。図３および図４は、リン酸カルシウム多孔体１の製造工程を示す説明図である。
【００２４】
図１の（Ａ）に示すように、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１は、繊維状リン酸カルシウム２が互いに係合して成形されたリン酸カルシウム多孔体であって、繊維状リン酸カルシウム２の係合により形成された複数の第一気孔３と、第一気孔３の内径よりも大きな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第二気孔４とを有する。図１の（Ａ）の□で囲んだ部分を拡大した図１の（Ｂ）は繊維状リン酸カルシウム２が互いに契合して多孔体を形成していることを示している。
【００２５】
リン酸カルシウム多孔体１において、繊維状リン酸カルシウムは互いに絡み合うことで互いの間に1μm〜3μm程度の隙間を有して一体的に成形されている。繊維状リン酸カルシウムが互いに絡み合うことで生じる隙間が第一気孔３である。本実施形態では、繊維状リン酸カルシウム２は、β‐リン酸三カルシウムからなる。β‐リン酸三カルシウムは、生体吸収性が高い材料であり、例えば骨欠損部にβ‐リン酸三カルシウムを充填した場合に、自家骨への置換が起こることが知られている。
【００２６】
第二気孔４は、リン酸カルシウム多孔体１内において略均一に分散されて形成された空洞である。第二気孔４の内面形状は、後述する製造方法において使用されるカーボンビーズＣＢ（図３参照）の外面に沿った形状となっている。カーボンビーズＣＢは、主に炭素を含有し加熱することにより焼失する略球形の粉粒体である。本実施形態では、リン酸カルシウム多孔体１の製造工程において、カーボンビーズＣＢが焼失し、焼成された繊維状リン酸カルシウム２が残留することにより、第二気孔４が形成される。
【００２７】
第二気孔４の最大内径は、カーボンビーズＣＢの直径と略等しい。本実施形態では、第二気孔４の内径が約150μm程度となるようにするために、平均粒子径が150μmのカーボンビーズＣＢを用いて第二気孔４が形成されている。
なお、本明細書において、平均粒子径とは、メジアン径をもって表す。
【００２８】
複数の第二気孔４の一部は、隣接する第二気孔４同士を連通させる第一連通孔５を有している。第一連通孔５の大きさは、隣接する第二気孔４間の距離によって異なる。例えば後述する製造方法によってリン酸カルシウム多孔体１を製造した場合、第一連通孔５の大きさは、１〜50μm、好ましくは5〜30μm、さらに好ましくは10〜20μmとなっている。なお、製造条件によっては、上記第一連通孔５を有しておらず隣接する他の第二気孔４と連通していない第二気孔４（図４に符号４ａで示す）が形成される場合もある。隣接する他の第二気孔４と連通していない第二気孔４は、リン酸カルシウム多孔体１の使用時、例えば骨欠損部にリン酸カルシウム多孔体１を埋入する場合に、繊維状リン酸カルシウム２が生体に吸収されることによって、外部に開口される。
【００２９】
次に、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１の製造方法について説明する。
図２に示すステップＳ１は、長さが60〜200μmの範囲にあり、アスペクト比が20〜100の範囲にある繊維状（ファイバー状）の構造を有する繊維状リン酸カルシウムとカーボンビーズＣＢとを混合するステップ（混合工程）である。
ステップＳ１では、まず、繊維状リン酸カルシウムを純水に懸濁する。次に、繊維状リン酸カルシウムが懸濁されたスラリーに、カーボンビーズＣＢを添加する。さらに、繊維状リン酸カルシウムとカーボンビーズＣＢとが混合されたスラリー全重量に対して0.1mass%の寒天を添加する。続いて、繊維状リン酸カルシウムとカーボンビーズＣＢと寒天とが純水に懸濁されたスラリーを、寒天が溶解する温度まで加熱する。その後、エタノールを、水／エタノール混合比が7/3[v/v]となるように加えて攪拌し、室温まで冷却する。これにより、繊維状リン酸カルシウムとカーボンビーズＣＢとのスラリー状の混合物が出来上がる。
これでステップＳ１は終了し、ステップＳ２へ進む。
【００３０】
ステップＳ２は、上記ステップＳ１において出来上がったスラリー状の混合物を成形するステップ（成形工程）である。
ステップＳ２では、繊維状リン酸カルシウムとカーボンビーズＣＢとの何れの粒径よりも孔径が小さなろ過フィルターが底部に設けられた成形型に、ステップＳ１において出来上がったスラリー状の混合物を投入し、ろ過フィルターを介して液体を吸引して除去する。これにより、スラリー状の混合物から液体が除去される。液体が除去された混合物は、成形型の内面に沿う形状に成形される。続いて、液体が除去された混合物は成形型から取り外される。このとき、液体が除去された混合物は、寒天の存在によってゲル状となっている。成形型から取り外された混合物は、成形型の内面形状に沿って成形された予備成形体となる。
図３に示すように、予備成形体は、繊維状リン酸カルシウムによってカーボンビーズＣＢが囲まれた状態となっている。
これでステップＳ２は終了し、ステップＳ３へ進む。
【００３１】
ステップＳ３は、上記ステップＳ２で生じた予備成形体に対して一軸加圧成形を行うステップ（加圧工程）である。
ステップＳ３では、予備成形体を乾燥させ、その後、所定の成形圧（例えば本実施形態では40MPa）をかける。ステップＳ３においてかける成形圧が高いほど予備成形体は強く圧縮される。このため、ステップＳ３においてかける成形圧が高いほど、一連の製造工程が終了した後のリン酸カルシウム多孔体１の機械的強度が高くなる傾向がある。
これでステップＳ３は終了し、ステップＳ４へ進む。
【００３２】
ステップＳ４は、上記ステップＳ３で加圧成形された予備成形体を焼成するステップ（焼成工程）である。
ステップＳ４では、加圧成形された予備成形体を、カーボンビーズＣＢが焼失する温度以上に空気気流中で加熱する。これにより、カーボンビーズＣＢはCO2となって予備成形体の外部へと流出する。
これでステップＳ４は終了する。
【００３３】
図４に示すように、ステップＳ４によって、焼成された予備成形体からはカーボンビーズＣＢが焼失し、予備成形体はリン酸カルシウム多孔体１となる。
予備成形体においてカーボンビーズＣＢが占有していた空間は、上記ステップＳ４においてカーボンビーズＣＢが焼失することにより、リン酸カルシウム多孔体１においては略球形の空洞となる。リン酸カルシウム多孔体１における上記空洞は、細胞が進入可能な150μm程度の直径を有する気孔（第二気孔４）として機能する。また、繊維状リン酸カルシウム２同士が絡み合うことによって形成された隙間は、体液や培養液が進入可能な1〜3μm程度の内径を有する気孔（第一気孔３）として機能する。
また、隣り合う第二気孔４には、直径1〜20μm程度の連通孔（第一連通孔５）が生じている場合がある。第一連通孔５は、ある第二気孔４から隣の第二気孔４へ細胞が移動するための通路として機能する。
【００３４】
本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１は、内部に細胞が進入できる第二気孔４と、体液あるいは培養液が進入可能な第一気孔３とが略均一に分散して形成されている。このため、リン酸カルシウム多孔体１の内部に細胞を生着させやすく、骨形成を促進させることができる。
【００３５】
また、上記の例では、繊維状リン酸カルシウム２がβ‐リン酸三カルシウムからなるので、生体吸収性が高く、自家骨へ置換させやすい。一方、繊維状リン酸カルシウム２がヒドロキシアパタイトからなる場合には、自家骨への置換がβ‐リン酸三カルシウムよりも遅く、生体内で機械的強度をβ‐リン酸三カルシウムの場合より長い間高く保つことができる。
【００３６】
（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態のリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法について説明する。図５は、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１ＡのＳＥＭ観察による断面写真である。
図６および図７は、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造方法における製造工程を説明するための図であり、図６は、予備成形体の模式図である。図７は、焼成後のリン酸カルシウム多孔体１Ａの模式図である。
【００３７】
図５および図７に示すように、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体１Ａは、第１実施形態で説明した第一気孔３の内径よりも大きく第１実施形態で説明した第二気孔４の内径よりも小さな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第三気孔６をさらに有する点で、上述の第１実施形態で説明したリン酸カルシウム多孔体１と構成が異なっている。
【００３８】
第三気孔６は、リン酸カルシウム多孔体１Ａ内において略均一に分散されて形成された空洞である。第三気孔６の内面形状は、後述する製造方法において第三気孔６を形成するために使用されるカーボンビーズ（第一ビーズＣＢ１、図６参照）の外面に沿った形状となっている。第一ビーズＣＢ１は、第二気孔４を形成するために使用されるカーボンビーズＣＢ（以下、第一ビーズＣＢ１と区別するために「第二ビーズＣＢ２」と称する。図６参照）と同様に、主に炭素を含有し加熱することにより焼失する粉粒体である。
【００３９】
第一ビーズＣＢ１の直径は、第二ビーズＣＢ２の直径よりも小さく、細胞の直径と同等程度の直径である。具体的には、第一ビーズＣＢ１は、平均粒子径が約10〜30μmとされている。
【００４０】
第三気孔６は、複数の第二気孔４の隙間に位置し、互いに離間して位置する第二気孔４を連通させる通路として、また細胞を生着させて骨形成を行う場として機能する。
【００４１】
また、複数の第三気孔６の一部は、第二気孔４と第三気孔６との内部を連通させる第二連通孔７を有している。第二連通孔７の大きさは、第二気孔４と第三気孔６との距離によって異なる。例えば後述する製造方法によってリン酸カルシウム多孔体１を製造した場合、第二連通孔７の大きさは、1μm以上5μm以下となっている。なお、リン酸カルシウム多孔体１の製造条件によっては、隣接する他の第三気孔６や第二気孔４と連通していない第三気孔６が形成される場合もある。このような第三気孔６も、隣接する他の第二気孔４と連通していない第二気孔４ａ（図４参照）と同様に、繊維状リン酸カルシウム２が生体に吸収されることによって、外部に開口される。
【００４２】
さらに、図７に示すように、リン酸カルシウム多孔体１Ａは、複数の第三気孔６同士を連通させる第三連通孔８を有している。例えば、リン酸カルシウム多孔体１Ａに第三連通孔８が形成されている場合、互いに離間して形成されている第二気孔４（図７に符号４ｂ、４ｃで示す）を、複数の第三気孔６を介して連通させることができる。
【００４３】
次に、本実施形態のリン酸カルシウム多孔体の製造方法について、上述の第１実施形態と異なる点を中心に説明する。
本実施形態では、上記ステップＳ１（混合工程、図２参照）において、第一ビーズＣＢ１と第二ビーズＣＢ２とを共に混合してスラリー状とする。第一ビーズＣＢ１と第二ビーズＣＢ２との混合比は、リン酸カルシウム多孔体１Ａに要求される強度に基づいて適宜設定することができる。平均粒子径が小さな第一ビーズＣＢ１の割合が多くなるほど、リン酸カルシウム多孔体１Ａの強度は低くなる。逆に、平均粒子径が大きな第二ビーズＣＢ２の割合が多くなるほど、リン酸カルシウム多孔体１Ａへ細胞が進入しやすくなる。
【００４４】
その後、第１実施形態で説明したステップＳ２ないしステップＳ４と同様の工程を行い、リン酸カルシウム多孔体１Ａを得る。
図６および図７に示すように、本実施形態では、第一ビーズＣＢ１が焼失したことによって生じる略球形の空隙は、内部に細胞が進入可能な気孔（第三気孔６）として機能する。
【００４５】
また、第一ビーズＣＢ１が第二ビーズＣＢ２とともに添加されていることにより、第二ビーズＣＢ２（上述の第１実施形態におけるカーボンビーズＣＢに相当）を上述の第１実施形態よりもさらに均一に分散させることができる。このため、第二気孔４が均一に分散した状態で形成され、細胞が進入しやすく骨形成を促進できるリン酸カルシウム多孔体１Ａを得ることができる。
【００４６】
また、第一ビーズＣＢ１を用いて形成された第三気孔６によって、互いに離間して位置する第二気孔４同士を連通することができるので、リン酸カルシウム多孔体１Ａの強度を維持しつつ連通性を高めることができる。
【００４７】
次に、以下に示す各実施例に基づいて、本発明のリン酸カルシウム多孔体およびその製造方法についてより詳細に説明する。
【実施例１】
【００４８】
本実施例では、平均粒子径が150μmのカーボンビーズを用いて上述の第１実施形態で説明したリン酸カルシウム多孔体を製造する例を示す。
（繊維状リン酸カルシウムの合成）
出発物質として、和光純薬工業試薬特級の硝酸カルシウム四水和物(Ca(NO3)2・4H2O)、リン酸水素二アンモニウム((NH4)2HPO4)、尿素((NH2)2CO)および硝酸(HNO3)を用いた。試料溶液は、Ca/P比が1.67になるように、0.167mol・dm-3Ca(NO3)2・4H2O、0.100mol・dm-3(NH4)2HPO4、0.500mol・dm-3(NH2)2COおよび0.10mol・dm-3HNO3を混合することにより調製した。
【００４９】
この試料溶液750cm3を１Ｌの三ツ口丸底フラスコに入れ、80℃で48時間還流した。反応時間は、試料溶液が80℃に達したときを0時間として計測した。その後、試料溶液を吸引濾過し、濾過によって得られた固形成分を最大500cm3の純水で３回洗浄した後、純水を加えて2mass%の繊維状リン酸カルシウムスラリー（以下、「CPFスラリー」と称する。）とした。
【００５０】
（混合工程）
上記CPFスラリーに、平均粒子径150μmのカーボンビーズ（ニカビーズ（登録商標）；日本カーボン社製）を、CPFスラリー中の繊維状リン酸カルシウムの質量に対して50%となるように添加した。さらに、カーボンビーズが添加されたCPFスラリーに、和光純薬工業試薬特級の寒天を0.10mass%となるように添加した。繊維状リン酸カルシウム、カーボンビーズ、および寒天の混合物を60℃で1時間加熱して寒天を溶かしたあと、エタノールを、水／エタノール混合比が7/3[ v/v]となるように加えて攪拌した。その後、調製した混合物を室温で静置し、ゲル化させた。
【００５１】
（成形工程）
上記混合工程において調製された混合物を攪拌し、成形型（塩化ビニル管（内径16mm）あるいはアクリル型（内寸6mm×45mm））の中に注いだ。塩化ビニル管およびアクリル型内に注いだ混合物から吸引濾過により液体（純水）を除去した。塩化ビニル管には、最大25cm3の混合物が供給され、アクリル型には最大40cm3の混合物が供給された。
塩化ビニル管あるいはアクリル型に供給された混合物は、空気中で乾燥させることにより、所定の形状の予備成形体となった。
【００５２】
（加圧工程）
予備成形体を、40MPaで一軸加圧成形し、塩化ビニル管によって成形された予備成形体は円板状に、アクリル型によって成形された予備成形体は板状に成形した。
それぞれの予備成形体の厚さ寸法は、約3mmであった。
【００５３】
（焼成工程）
予備成形体を、光洋サーモシステム社製KTF433N型1500℃チューブ炉を用いて焼成し、リン酸カルシウム多孔体とした。
焼成工程は、昇温速度を5℃・min-1とし、1000℃に達したら、保持時間を５時間、焼成雰囲気を空気気流中(300cm3・min-1)として行った。
本実施例で示す一連の工程によって、上記第１実施形態で説明したβ‐リン酸三カルシウム多孔体が得られた。
【実施例２】
【００５４】
本実施例では、上記実施例１で得られたβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、カーボンビーズの添加量と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示す。
本実施例では、混合工程において、CPFスラリー中の繊維状リン酸カルシウムの質量に対してカーボンビーズが25%, 50%, 75%, および100%となるようにカーボンビーズを添加した。また、カーボンビーズを添加しない場合を対照実験とした。その他の製造工程は上記実施例１と同様である。
図８は、カーボンビーズの添加量と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示すグラフである。
図８に示すように、カーボンビーズを添加することによりリン酸カルシウム多孔体の気孔率は高くなった。また、カーボンビーズの添加量が多くなるほど気孔率も高くなった。
【実施例３】
【００５５】
本実施例では、上記実施例２で製造したβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、カーボンビーズの添加量と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の機械的強度との関係を示す。
機械的強度は、三点曲げ強度の測定と、ヤング率の測定とによって評価した。
三点曲げ強度の測定は、上述の実施例２で製造した板状のβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、島津オートグラフAGF-J（島津製作所製）を用いた。三点曲げ強度の測定条件を表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
また、三点曲げ強度は、下記式１を用いて算出した。
【００５８】
【数１】
【００５９】
上記式１において、Ｓｂは三点曲げ強度[Ｐａ]、Pは荷重[Ｎ]、lは支点間距離[ｍ]、tは試料片の厚さ[ｍ]、wは試料片の幅[ｍ]である。
【００６０】
三点曲げ強度の算出には、島津製作所製データ処理ソフトTRAPEZIUM Ver2.2.2.を用いた。
【００６１】
ヤング率は、上記三点曲げ強度の値から得られた荷重‐変位曲線の傾きから、下記式２を用いて算出した。
【００６２】
【数２】
【００６３】
上記式２において、Ｅｂは三点曲げ試験によるヤング率[Ｎ・ｍ−２]、ｙｂは荷重点の正味の変位量[ｍ]、Pは荷重[Ｎ]、lは支点間距離[ｍ]、tは試料片の厚さ[ｍ]、wは試料片の幅[ｍ]である。
【００６４】
図９および図１０は、本実施例において算出された三点曲げ強度およびヤング率をそれぞれ示すグラフである。図９および図１０に示すように、カーボンビーズの添加量が多くなるに従って、β‐リン酸三カルシウム多孔体の三点曲げ強度およびヤング率は低下した。
【実施例４】
【００６５】
本実施例では、上記実施例１で得られたβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、成形工程の成形圧における圧力と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示す。
本実施例では、上述の実施例１において、成形工程の成形圧を、30MPa、40MPa、50MPaの三通りとしてβ‐リン酸三カルシウム多孔体を製造し、それぞれの気孔率を測定した。図１１は、それぞれの成形圧におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率を示すグラフである。
図１１に示すように、成形工程の成形圧が高くなるに従ってβ‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率が低下する傾向があった。
【実施例５】
【００６６】
本実施例では、上記実施例１に示す工程によって製造されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔径分布を示す。
β‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔径分布の測定は、Micromeritics社製オートポアIV9520を用いた水銀圧入法によって行った。細孔径分布の測定条件を下記表２に示す。
【００６７】
【表２】
【００６８】
図１２は、本実施例におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。図１２において、符号１０１で示す線は積算細孔体積を示し、符号１０２で示す線はLog微分細孔体積を示す。
図１２に示すように、本実施例では、1〜3μm、〜15μm、および〜100μmの３つのピークを有する曲線状の細孔径分布となった。
ここで、2μm、5μm、および100μmの３つのピークは、それぞれ、繊維状リン酸カルシウム同士が係合して形成された第一気孔、複数の第二気孔が連通された第一連通孔、および第二気孔自身によって生じている。
【実施例６】
【００６９】
本実施例では、上記実施例１に示す工程に準じて製造されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体のin vivo評価結果を、図１３ないし図１６を参照して示す。
なお、本実施例では、上記実施例１とは異なり、直径4mm、高さ8mmの円柱形状のβ‐リン酸三カルシウム多孔体を成形して使用した。
上記円柱形状に形成されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体を、160°Cで90 min乾熱滅菌し、クサビラオレンジ蛍光遺伝子(huKO)を導入したクローン豚の脛骨に埋入した。実験条件を下記表３に纏めて示す。
【００７０】
【表３】
【００７１】
６週間の埋入後、β‐リン酸三カルシウム多孔体が埋入された上記クローン豚の脛骨を摘出し、凍結ミクロトーム(Leica CM3050 S)を用いてβ‐リン酸三カルシウム多孔体を含む凍結組織切片を作製した。さらに、作製された凍結組織切片を染色して画像解析処理ソフト(三谷商事製WinROOF)を用いて観察および解析を行った。
【００７２】
凍結組織切片は、HE染色、トルイジン青染色、TRAP染色、ALP染色によってそれぞれ染色した。染色された凍結組織切片は、位相差観察モードおよび蛍光観察モードを有する生物顕微鏡を用いて観察し、顕微鏡カメラを用いて画像を取得した。なお、図１３ないし図１６において、（Ａ）は各染色色素による染色結果を示しており、濃く示された部分が各染色色素によって染色された部分である。また、図１３ないし図１６において、（Ｂ）は蛍光観察の結果を示しており、白く示された部分が蛍光を発している部分である。
【００７３】
図１３（Ａ）は、HE染色された組織切片の画像である。図１３（Ｂ）は、同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）に示すように、HE染色により、核および細胞質が染め分けられた。また、成熟骨は、視野内の他の細胞よりも濃く染色されていた。
【００７４】
図１４（Ａ）は、トルイジン青染色された組織切片の画像である。図１４（Ｂ）は、同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。図１４（Ａ）および図１４（Ｂ）に示すように、β‐リン酸三カルシウム多孔体の端部において、第二気孔の壁部に沿って成熟骨が多く見られた。また、β‐リン酸三カルシウム多孔体の中心部においては、未成熟の新生骨が多く見られた。
【００７５】
図１５（Ａ）は、TRAP染色された組織切片の画像である。図１５（Ｂ）は、同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）に示すように、β‐リン酸三カルシウム多孔体の第二気孔の壁部には、破骨細胞が存在している。また、β‐リン酸三カルシウム多孔体の中心部に破骨細胞が進入している。
【００７６】
図１６（Ａ）は、ALP染色された組織切片の画像である。図１６（Ｂ）は、同部位におけるクサビラオレンジの蛍光画像である。図１６（Ａ）および図１６（Ｂ）に示すように、β‐リン酸三カルシウム多孔体の第二気孔の壁部に沿って骨芽細胞が存在している。また、β‐リン酸三カルシウム多孔体の中心部に骨芽細胞が進入している。
このように、本実施例では、クローン豚の脛骨に埋入されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体の内部に細胞が進入し、β‐リン酸三カルシウム多孔体の壁面に沿って骨形成が起こっている。
【実施例７】
【００７７】
本実施例では、上記実施例６と同様にクローン豚の脛骨に埋入されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体の生体吸収性について示す。
本実施例では、クローン豚の脛骨に埋入する前のβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像と、クローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像とを顕微鏡カメラを用いて撮影（図１７、図１８）し、β‐リン酸三カルシウム多孔体の断面積をそれぞれ計測して比較した。
【００７８】
また、本実施例では、繊維状リン酸カルシウムの材料としてヒドロキシアパタイトを使用し、ヒドロキシアパタイト多孔体を製造した例も併せて示す。
図１７（Ａ）は、クローン豚の脛骨に埋入する前のβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像である。図１７（Ｂ）は、クローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像である。
図１８（Ａ）は、クローン豚の脛骨に埋入する前のヒドロキシアパタイト多孔体の断面の画像である。図１８（Ｂ）は、クローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるヒドロキシアパタイト多孔体の断面の画像である。
【００７９】
図１９は、図１７（Ａ）ないし図１８（Ｂ）に示す画像に基づいてリン酸カルシウム多孔体の面積を算出した結果を示すグラフである。図１９において、HAp(150)は、平均粒子径150μmのカーボンビーズを添加して製造されたヒドロキシアパタイト多孔体における結果を示し、TCP(150)は、平均粒子径150μmのカーボンビーズを添加して製造されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体における結果を示している。
【００８０】
図１９に示すように、ヒドロキシアパタイト多孔体では、埋入後における断面積が埋入前よりも僅かに増加している。
また、図１９に示すように、β‐リン酸三カルシウム多孔体では、埋入後には、埋入前よりも断面積が25%低下している。すなわち、β‐リン酸三カルシウム多孔体は、クローン豚の脛骨に埋入されている期間内にその25%が分解あるいは吸収された。
【実施例８】
【００８１】
本実施例では、上記実施例６と同様にクローン豚の脛骨に埋入されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体の骨形成面積について示す。
本実施例では、クローン豚の脛骨に埋入して６週後の脛骨におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の断面の画像を顕微鏡カメラを用いて撮影し、埋入前のβ‐リン酸三カルシウム多孔体による円形の領域を全体面積（100%）とし、全体面積内におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の割合と新生骨の割合とを算出した。
【００８２】
また、上記実施例７で用いたヒドロキシアパタイト多孔体についても同様に、全体面積内におけるヒドロキシアパタイト多孔体の割合と新生骨の割合とを算出した。
図２０は、β‐リン酸三カルシウム多孔体(TCP(150))およびヒドロキシアパタイト多孔体(HAp(150))の骨形成面積を示すグラフである。図２０に示すように、β‐リン酸三カルシウム多孔体およびヒドロキシアパタイト多孔体における新生骨の割合は、それぞれ全体面積に対して25.5%、31.2％であった。また、β‐リン酸三カルシウム多孔体における新生骨の割合の方が、ヒドロキシアパタイト多孔体における新生骨の割合よりも高かった。
【実施例９】
【００８３】
本実施例では、上記実施例１に示す工程に準じ、β‐リン酸三カルシウム多孔体(TCP(150))、カーボンビーズの平均粒子径を20μmに変えたβ‐リン酸三カルシウム多孔体(TCP(20))、繊維状リン酸カルシウムとしてヒドロキシアパタイトを原料としたヒドロキシアパタイト多孔体(HAp(150))をそれぞれ試料片として、それぞれの骨誘導能をin vivoで評価した。各試料片の作製条件および材料特性を下記表４に示す。
【００８４】
【表４】
【００８５】
多孔質セラミックスの骨誘導能の検証には、上記TCP(150), TCP(20), およびHAp(150)を、直径4 mm × 高さ8 mmの寸法からなる円柱状に成形した試料片が用いられた。なお、各試料片は160 °Cで90 min乾熱滅菌したものを使用した。
【００８６】
実験動物には、赤色蛍光タンパクであるクサビラオレンジ(Kusabira-Orange (huKO))を遺伝子に導入したトランスジェニック・クローンブタ(huKOブタ, 29週齢, ♂, ~100 kg)を用いた。ソムノペンチル(共立製薬)を用いてhuKOブタに麻酔をかけた後に、腹部および左後肢の大腿部を剃毛し、メスで皮膚を切開して腹部脂肪および大腿部筋肉を露出させた。腹部脂肪および大腿部筋肉に深さ1 cm程度のポケットを作り、各試料片をポケットに1個ずつ(合計2個)埋入した後に、皮膚をナイロン製縫合糸で縫合した。
【００８７】
試料片を上記huKOブタに埋入してから13週後、麻酔薬の過剰投与によりhuKOブタを犠牲にした。さらに、埋入された試料片をhuKOブタから摘出し、4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液(和光純薬工業)に浸漬して組織を固定した。各試料片をパラフィン包埋し、脱灰後、マッソントリクローム染色およびヘマトキシリンエオジン染色を施した組織切片を作製した。組織学的観察は、研究用システム顕微鏡（BX5,オリンパス社製）を用いて行った。
【００８８】
図２１は、筋内に埋入した各試料片のマッソン・トリクローム染色の結果である。図２１において上段は低倍率（４０倍）で撮影した像であり、下段は、上段において四角い枠で囲った部分を強拡大した高倍率（２００倍）の組織像を示している。
図２１に示すように、HAp(150)およびTCP(150)では、丸い第二気孔内に骨が形成されている様子が観察された。一方、TCP(20)では、13週の埋入では骨形成は認められなかった。
【００８９】
図２２は、上述の各試料片のヘマトキシリンエオジン染色の結果である。図２２に示すように、150μmのカーボンビーズを使用した多孔体（TCP(150), HAp(150)）では、丸い第二気孔内に骨の形成が認められた。TCP(150)およびHAp(150)の組織学的所見は、連通気孔構造を備えた多孔体が骨芽細胞の存在しない筋内でも骨形成を生じる「骨誘導能」を有することを示している。
【００９０】
図２３および図２４は、上述の各試料片を脂肪内に埋入した結果であり、それぞれマッソン・トリクローム染色およびヘマトキシリンエオジン染色を施した組織像を示している。
図２３に示すように、脂肪組織の場合、気孔内には線維性の組織が入り込んでおり、骨形成はほとんど認められなかった。また、図２４に示すように、ヘマトキシリンエオジン染色の組織像においても図２３と同様に、気孔内には繊維性の組織が入り込んでおり、骨形成はほとんど認められなかった。
【実施例１０】
【００９１】
本実施例では、カーボンビーズを粗面加工する例について示す。
本実施例では、平均粒子径150μmのカーボンビーズ（ニカビーズ（登録商標）;日本カーボン社製）をアルミナボートに5g入れ、光洋サーモシステム社製KBF31型1700℃箱型電気炉を用いて、下記表５および表６に示す条件で加熱した。
【００９２】
【表５】
【００９３】
【表６】
【００９４】
図２５と図２６は、ＳＥＭ観察によるが、図２５（Ａ）は、未処理のカーボンビーズを示す写真である。図２５（Ｂ）は、表５に示す条件１に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。図２５（Ｃ）は、表５に示す条件２に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。図２５（Ｄ）は、表５に示す条件３に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。
図２５（Ａ）ないし図２５（Ｄ）に示すように、カーボンビーズを加熱する温度が高いほど、カーボンビーズの表面の凹凸が大きくなっている。また、カーボンビーズを加熱する温度が高いほど、カーボンビーズの焼失量が多くなる傾向が見られる。
【００９５】
図２６（Ａ）は、表６に示す条件４に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。図２６（Ｂ）は、表６に示す条件５に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。図２６（Ｃ）は、表６に示す条件６に基づいて処理したカーボンビーズの写真である。
図２７は、表６に示す条件４〜７に基づいて処理したカーボンビーズの質量を、加熱していないカーボンビーズの重量を１００％としたときの比で示したグラフである。
図２６（Ａ）ないし図２６（Ｃ）に示すように、カーボンビーズを加熱状態で保持する時間が長くなっても表面の形状には大きな差はみられなかった。
また、図２７に示すように、カーボンビーズを加熱状態で保持する時間が３０分まではカーボンビーズの質量が減少する。
本発明においては、加熱状態の保持時間は１０分ほどが最適であった。
【実施例１１】
【００９６】
本実施例では、上記実施例１０における条件５によって粗面加工されたカーボンビーズ（図２６（Ｂ）参照）を用いてリン酸カルシウム多孔体を製造する例を示す。
本実施例では、太平化学産業社製のβ‐リン酸三カルシウム粉体（β‐ＴＣＰ‐１００）を5gと、上記条件５によって粗面加工されたカーボンビーズを2.5gと、和光純薬工業試薬特級の寒天を0.3ｇとを、純水250cm3に添加し、60℃で1時間加熱した。得られた混合物に、エタノールを107cm3加えて攪拌し、室温で静置してゲル化させた。
【００９７】
ゲル化した混合物のスラリーを攪拌し、内径16mmの塩化ビニル管内に注ぎ、吸引濾過したあとに濾過ケーキを60℃で24時間乾燥させた。乾燥した濾過ケーキを、カーボンビーズが脱落しないように軽くほぐし、β‐リン酸三カルシウム粉体とカーボンビーズの混合粉体を調製した。
【００９８】
さらに、上述のβ‐リン酸三カルシウム粉体とカーボンビーズの混合粉体を1.0ｇ秤量し、100MPaで一軸加圧成形して円板状の予備成形体（直径16mm、厚さ3mm）を作製した。この円板状の予備成形体を、上述の実施例１と同一の条件で焼成し、リン酸カルシウム多孔体とした。
【００９９】
図２８は、粗面加工をしていないカーボンビーズを使用した場合の比較例を示すＳＥＭ観察による写真である。図２９は、上記実施例１０における条件５によって粗面加工されたカーボンビーズを用いて製造されたβ‐リン酸三カルシウム多孔体を示すＳＥＭ観察による写真である。
図２８および図２９に示すように、粗面加工されたカーボンビーズを使用した場合には、粗面加工されていないカーボンビーズを使用した場合と比較して第二気孔４の内面の凹凸が大きく、また、隣り合う第二気孔４を繋ぐ第一連通孔５の直径が大きい。
【実施例１２】
【０１００】
本実施例では、上述の第２実施形態で説明したリン酸カルシウム多孔体を製造する例を示す。
本実施例では、平均粒子径20μmのカーボンビーズ（第一ビーズ）と、平均粒子径150μmのカーボンビーズ（第二ビーズ）とを使用してリン酸カルシウム多孔体を製造した。
線維状リン酸カルシウムに対するカーボンビーズの添加量は50%とし、第一ビーズと第二ビーズとの混合比は50:50とした。
その他の条件は上述の実施例１と同一である。
本実施例で示す一連の工程によって、上記第２実施形態で説明したβ‐リン酸三カルシウム多孔体が得られた。
【実施例１３】
【０１０１】
本実施例では、上記実施例１２で得られたβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、第一ビーズと第二ビーズとの混合比と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示す。
本実施例では、混合工程において、第一ビーズと第二ビーズとの混合比を、0:10（第一ビーズのみ）、5:5、および10:0（第二ビーズのみ）とした。
図３０は、第一ビーズと第二ビーズとの混合比と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の気孔率との関係を示すグラフである。図３０に示すように、第一ビーズと第二ビーズとの混合比によらず、気孔率は約70%であった。
【実施例１４】
【０１０２】
本実施例では、上記実施例１３で製造したβ‐リン酸三カルシウム多孔体について、第一ビーズと第二ビーズとの混合比と、β‐リン酸三カルシウム多孔体の機械的強度との関係を示す。
機械的強度は、上述の実施例３と同様に、三点曲げ強度の測定と、ヤング率の測定とによって評価した。
【０１０３】
図３１、図３２は、本実施例において算出された三点曲げ強度およびヤング率をそれぞれ示すグラフである。図３１および図３２に示すように、平均粒子径が小さい第一ビーズが多く添加されている場合には三点曲げ強度およびヤング率が低く、平均粒子径が大きい第二ビーズが多く添加されている場合には三点曲げ強度およびヤング率が高い。
【実施例１５】
【０１０４】
本実施例では、上記実施例１２で得られたβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔径分布を示す。
β‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔径分布の測定は、上述の実施例５と同様の手順および条件にて行った。
【０１０５】
図３３は、本実施例におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。図３３において、符号１１１で示す線は積算細孔体積であり、符号１１２で示す線はLog微分細孔体積である。
図３３に示すように、本実施例では、2μmおよび10μmの２つの大きなピークと、100μmの小さなピークとを有する曲線状の細孔径分布となった。
【実施例１６】
【０１０６】
本実施例では、上記実施例１と同様の工程によって、平均粒子径20μmの第一ビーズのみをカーボンビーズの材料としてリン酸カルシウム多孔体を製造した例を示す。
図３４は、本実施例におけるβ‐リン酸三カルシウム多孔体の細孔直径と細孔体積との関係を示すグラフである。図３４において、符号１２１で示す線は積算細孔体積であり、符号１２２で示す線はLog微分細孔体積である。
図３４に示すように、本実施例では、2μmおよび5μmの２つのピークを有する曲線状の細孔体積となった。
【０１０７】
図３５は、上記実施例５、実施例１５、および実施例１６で示した細孔直径とＬｏｇ微分細孔体積との関係の曲線と、対照実験としてカーボンビーズを含まないリン酸カルシウム多孔体の細孔径分布を示す曲線とを重ねて示したグラフである。
図３５において、符号１３１で示す線は、カーボンビーズを含まないリン酸カルシウム多孔体の細孔体積を示す。また、図３５において、符号１３２で示す線は、第一ビーズが単体で添加されたリン酸カルシウム多孔体の細孔径分布を示す。また、図３５において、符号１３３で示す線は、第一ビーズと第二ビーズとを含むリン酸カルシウム多孔体の細孔径分布を示す。また、図３５において、符号１３４で示す線は、第二ビーズが単体で添加されたリン酸カルシウム多孔体の細孔体積を示す。
【０１０８】
図３５に示すように、カーボンビーズを添加しないで製造したリン酸カルシウム多孔体は、1〜3μmの範囲に１つのピークを有している。これに対して、平均粒子径20μmの第一ビーズを単体で添加した場合には、1〜3μmのピークに加えて〜5μmのピークを有する。また、平均粒子径150μmの第二ビーズを単独で添加した場合には、1〜3μm、〜15μm、および〜100μmの３つのピークを有する。さらに、第一ビーズと第二ビーズとの両方を添加した場合には、1〜3μmおよび7μmの２つのピークを有する。
【０１０９】
以上、本発明の実施形態および実施例について図面を参照して詳述したが、本発明の具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
たとえば、上述の第１実施形態および第２実施形態では、繊維状リン酸カルシウムがβ‐リン酸三カルシウムからなる例を用いて説明したが、繊維状リン酸カルシウムの材料はβ‐リン酸三カルシウムには限られない。たとえば、繊維状リン酸カルシウムはヒドロキシアパタイトからなるものであってもよい。なお、ヒドロキシアパタイトは、β‐リン酸三カルシウムと比較して生体に吸収されにくい材料であり、骨欠損部において長期間その形状を維持することができる。
【０１１０】
また、繊維状リン酸カルシウムの材料を、繊維状リン酸カルシウムが生体に吸収される速度を調整するために適宜選択することもできる。また、β‐リン酸三カルシウムとヒドロキシアパタイトとを混合して繊維状リン酸カルシウムの材料としてもよい。生体に吸収される速度を高めるためには、β‐リン酸三カルシウムに代えてα‐リン酸三カルシウムを用いることも有益である。この場合、焼成温度を1150℃以上にするとα‐リン酸三カルシウムが生成する傾向にあることを利用することが好ましい。
【０１１１】
また、上述の各実施形態において示した構成要素、および各実施例において示した事項は、適宜に組み合わせて構成することが可能である。
たとえば、上述の実施例において示した粗面加工は、上述の第２実施形態で示したように異なる平均粒子径を有する複数種類のカーボンビーズのいずれかあるいはそれぞれに対して行われてもよい。これにより、第二連通孔や第三連通孔の径を制御することができる。
【０１１２】
また、上述の実施形態および実施例では、炭素を主に含有するカーボンビーズを使用した例を示したが、カーボン以外の材料からなるビーズを公知の材料から適宜選択することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明は、生体骨や歯などの硬組織の欠損部位を補填するための多孔体およびその製造方法として適用することができる。
【符号の説明】
【０１１４】
１、１Ａ リン酸カルシウム多孔体
２ 繊維状リン酸カルシウム
３ 第一気孔
４ 第二気孔
５ 第一連通孔
６ 第三気孔
７ 第二連通孔
８ 第三連通孔
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維状リン酸カルシウムが互いに係合して成形されたリン酸カルシウム多孔体であって、
前記繊維状リン酸カルシウムの係合により形成された複数の第一気孔と、
前記第一気孔の内径よりも大きな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第二気孔と
を有することを特徴とするリン酸カルシウム多孔体。
【請求項２】
前記第一気孔の内径よりも大きく前記第二気孔の内径よりも小さな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第三気孔をさらに有することを特徴とする請求項１に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項３】
前記第二気孔同士を連通させる第一連通孔を有することを特徴とする請求項１または２に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項４】
前記第二気孔と前記第三気孔とを連通させる第二連通孔を有することを特徴とする請求項２に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項５】
前記第三気孔同士を連通させる第三連通孔を有することを特徴とする請求項２に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項６】
前記繊維状リン酸カルシウムがヒドロキシアパタイトからなることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項７】
前記繊維状リン酸カルシウムがβ‐リン酸三カルシウムからなることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項８】
繊維状リン酸カルシウム、第一の直径を有し加熱により焼失する複数の第一ビーズ、および前記第一の直径よりも大きな第二の直径を有し加熱により焼失する複数の第二ビーズを液体中に分散させて混合物を生成する混合工程と、
前記混合物を所定の形状に成形する成形工程と、
前記所定の形状に成形された前記混合物を、前記第一ビーズおよび前記第二ビーズが焼失する温度以上の温度で焼成する焼成工程と、
を有することを特徴とするリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【請求項９】
前記混合工程では前記混合物をスラリー状とし、
前記成形工程では前記混合物から前記液体を除去するとともにゲル状とする
ことを特徴とする請求項８に記載のリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【請求項１０】
前記成形工程の後、前記焼成工程の前に、成形された前記混合物を加圧する加圧工程をさらに備えることを特徴とする請求項８または９に記載のリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【請求項１１】
前記第一の直径は平均粒子径（メジアン径）で１０〜３０μmであり、
前記第二の直径は平均粒子径（メジアン径）で１００〜３００μmである
ことを特徴とする請求項８から１０のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【請求項１２】
前記混合工程では、前記第一ビーズと前記第二ビーズとの少なくともいずれかの表面が粗面加工された状態で前記繊維状リン酸カルシウムと混合されることを特徴とする請求項８から１１のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【請求項１３】
前記粗面加工は、前記第一ビーズと前記第二ビーズとの少なくともいずれかを加熱することにより行われることを特徴とする請求項１２に記載のリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【請求項１】
繊維状リン酸カルシウムが互いに係合して成形されたリン酸カルシウム多孔体であって、
前記繊維状リン酸カルシウムの係合により形成された複数の第一気孔と、
前記第一気孔の内径よりも大きな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第二気孔と
を有することを特徴とするリン酸カルシウム多孔体。
【請求項２】
前記第一気孔の内径よりも大きく前記第二気孔の内径よりも小さな内径を有し互いに略同径な略球形に形成された複数の第三気孔をさらに有することを特徴とする請求項１に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項３】
前記第二気孔同士を連通させる第一連通孔を有することを特徴とする請求項１または２に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項４】
前記第二気孔と前記第三気孔とを連通させる第二連通孔を有することを特徴とする請求項２に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項５】
前記第三気孔同士を連通させる第三連通孔を有することを特徴とする請求項２に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項６】
前記繊維状リン酸カルシウムがヒドロキシアパタイトからなることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項７】
前記繊維状リン酸カルシウムがβ‐リン酸三カルシウムからなることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム多孔体。
【請求項８】
繊維状リン酸カルシウム、第一の直径を有し加熱により焼失する複数の第一ビーズ、および前記第一の直径よりも大きな第二の直径を有し加熱により焼失する複数の第二ビーズを液体中に分散させて混合物を生成する混合工程と、
前記混合物を所定の形状に成形する成形工程と、
前記所定の形状に成形された前記混合物を、前記第一ビーズおよび前記第二ビーズが焼失する温度以上の温度で焼成する焼成工程と、
を有することを特徴とするリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【請求項９】
前記混合工程では前記混合物をスラリー状とし、
前記成形工程では前記混合物から前記液体を除去するとともにゲル状とする
ことを特徴とする請求項８に記載のリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【請求項１０】
前記成形工程の後、前記焼成工程の前に、成形された前記混合物を加圧する加圧工程をさらに備えることを特徴とする請求項８または９に記載のリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【請求項１１】
前記第一の直径は平均粒子径（メジアン径）で１０〜３０μmであり、
前記第二の直径は平均粒子径（メジアン径）で１００〜３００μmである
ことを特徴とする請求項８から１０のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【請求項１２】
前記混合工程では、前記第一ビーズと前記第二ビーズとの少なくともいずれかの表面が粗面加工された状態で前記繊維状リン酸カルシウムと混合されることを特徴とする請求項８から１１のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【請求項１３】
前記粗面加工は、前記第一ビーズと前記第二ビーズとの少なくともいずれかを加熱することにより行われることを特徴とする請求項１２に記載のリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１９】
【図２０】
【図２７】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図１】
【図５】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２８】
【図２９】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１９】
【図２０】
【図２７】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図１】
【図５】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２８】
【図２９】
【公開番号】特開２０１２−１９７２０３（Ｐ２０１２−１９７２０３Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６２９９７（Ｐ２０１１−６２９９７）
【出願日】平成２３年３月２２日（２０１１．３．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本セラミックス協会 生体関連材料部会，第１４回生体関連セラミックス討論会 講演予稿集 １４ページ，２０１０年１２月３日
【出願人】（８０１００００２７）学校法人明治大学 (161)
【出願人】（５９９０８８４３８）昭和医科工業株式会社 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２２日（２０１１．３．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本セラミックス協会 生体関連材料部会，第１４回生体関連セラミックス討論会 講演予稿集 １４ページ，２０１０年１２月３日
【出願人】（８０１００００２７）学校法人明治大学 (161)
【出願人】（５９９０８８４３８）昭和医科工業株式会社 (11)
【Ｆターム（参考）】
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