リン酸化−脱リン酸化反応検出用基質群およびそれを用いた検出方法
【課題】プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼの反応性を簡便に測定可能な手段の提供。
【解決手段】プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも１種含有するプロテインキナーゼの基質群、前記基質群を固定してなるペプチドアレイ、前記ペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、リン酸化および／または脱リン酸化反応を検出する方法、前記ペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、プロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの活性化および／または不活化に基づく疾患の診断方法、ならびに前記ペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法。
【解決手段】プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも１種含有するプロテインキナーゼの基質群、前記基質群を固定してなるペプチドアレイ、前記ペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、リン酸化および／または脱リン酸化反応を検出する方法、前記ペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、プロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの活性化および／または不活化に基づく疾患の診断方法、ならびに前記ペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化−脱リン酸化反応検出用基質群およびそれを用いた検出方法に関する。詳しくは、本発明は、Non-RI法でリン酸化−脱リン酸化反応を高感度に検出するペプチド性基質群およびそれを用いたリン酸化−脱リン酸化反応の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内のタンパク質は、様々な生理的条件下で生化学的修飾を受けることによってその性質を変化させている。リン酸化は、タンパク質の主要な翻訳後修飾反応の1つであり、その反応は瞬時かつ可逆的におこるため、タンパク質の活性／不活性をコントロールする基本的な素過程の1つとして、生体内で重要な役割を担っていることが推測される。実際、真核細胞においては細胞内タンパク質の多くはリン酸化されており、多くのシグナル伝達系において、タンパク質リン酸化が情報伝達の方法として広く用いられていることが知られている。
【０００３】
一般に、タンパク質がリン酸化反応、あるいは脱リン酸化反応を受けると、タンパク質を構成するアミノ酸残基の局所的な極性に変化が生じることにより、結果としてタンパク質の高次構造に基づく機能や活性度に変化を生じることにより、タンパク質の活性／不活性がコントロールされていると考えられている。このように、細胞内情報伝達に深く関わっているタンパク質リン酸化酵素の働きを調べることは、細胞機能を解析する上で大変重要である。さらに、医薬品探索研究やポストゲノム研究として注目されているプロテオームの研究にも関連し大変興味深い。プロテオーム解析のツールとして、タンパク質またはペプチドを基盤上に固定するマイクロアレイ技術が知られている（特許文献１および２、非特許文献１〜６）。
【０００４】
タンパク質リン酸化酵素（プロテインキナーゼ）は、タンパク質の特定の部位をリン酸化してその機能を変える働きをもち、その基質であるタンパク質のセリンまたはスレオニン残基をリン酸化する「セリン／スレオニンキナーゼ」と、チロシン残基をリン酸化する「チロシンキナーゼ」の２つに大別される。ここで、「チロシンキナーゼ」は細胞膜内あるいは近傍に存在し情報伝達の最上流に位置し細胞外の環境変化を直接検知する場合が多く、「セリン／スレオニンキナーゼ」は上流からの信号を受けて逐次的に情報伝達を行い、細胞機能の直接的な調節に関与する場合が多い。
【０００５】
プロテインキナーゼは、細胞外部からの刺激を細胞内部に伝達し、これらの刺激に対する細胞の応答に関与する。このように、プロテインキナーゼはリン酸化を通して、代謝、増殖、分化、情報伝達、運動などの多彩な細胞機能の調節を担っている。細胞内でのプロテインキナーゼは特定のタンパク質を基質として認識することで特異性の高いリン酸化反応を進行させ、これらリン酸化反応の逐次的反応の組み合わせとして、細胞外の環境変化や薬剤に対する応答として信号を伝達し細胞機能を調節している。遺伝子配列の解析から、約８００種類のプロテインキナーゼが存在して細胞内のシグナル伝達に関与していると予想されている。タンパク質リン酸化の異常は、癌、糖尿病、関節炎などの様々な疾患の原因または結果と考えられている。
【０００６】
一方、プロテインホスファターゼは、リン酸化されたタンパク質を基質として脱リン酸化を触媒する酵素であり、タンパク質リン酸化の可逆性を保障している。プロテインキナーゼは、それ自体がキナーゼの基質でもあり、スレオニン、セリン（ホスホリラーゼなど）、チロシン（srcなどガン遺伝子関連のタンパク質に例が多い）などのいずれかの残基がリン酸化されたプロテインキナーゼは、プロテインホスファターゼによって再び元の酵素に戻り、次の情報による活性化に備える。シグナル伝達経路の共通の特徴として、その反応の一過性がある。この一過性は、シグナル伝達分子の量や活性化状態の一過性の反映である。タンパク質のリン酸化は、ある場合には活性化を、ある場合には不活性化を引き起こす。実際、タンパク質の脱リン酸化反応が積極的なスイッチオンの役割を担っている場合も知られている。
【０００７】
プロテインキナーゼは、その基質特異性が高いことが特徴であるが、基質タンパク質の被リン酸化部位を含むアミノ酸配列からなるペプチド性部分を抽出したペプチドもまた基質としてリン酸化を受けることが広く知られている。そのため、プロテインキナーゼの反応性を調べる際には、ペプチド性基質を用いて調べることが可能である。
【０００８】
前記「プロテインキナーゼの反応性」は、その適当な基質を用いてリン酸化反応を行わせ、生成物であるリン酸化基質やＡＤＰの増加、あるいは出発物である基質やＡＴＰの減少を何らかの方法で計測することで判定が可能である。今日では、タンパク質リン酸化は、放射性核種32Ｐの取り込みを直接測定する方法か、または抗リン酸化タンパク質抗体を用いる方法が一般的である。
【０００９】
最近では、基質に含まれるリン酸化セリン残基、リン酸化スレオニン残基またはリン酸化チロシン残基を、抗体および表面プラズモン共鳴によって検出する方法（特許文献３）や、適当なキレート性検出試薬および表面プラズモン共鳴によって検出する方法（特許文献４）が注目されている。これらの方法では、放射性物質を取り扱う必要がなく操作性にも優れているが、抗体や検出試薬の認識能力に強く依存し、これらの認識能力を基とした間接的な検出と測定を行うことになる。そのため、認識能力の優れた抗体や検出試薬の開発が重要かつ不可欠となる。
【００１０】
チロシン残基のリン酸化の検出に関しては、タンパク質またはペプチド配列内のリン酸化チロシン残基を幅広く認識する多くの優れた抗リン酸化チロシン抗体が知られており、市販されている。そのため、それらの抗体を用いることでチロシンキナーゼの反応性は比較的容易に測定可能である。一方、セリン／スレオニンキナーゼの場合は、幅広くかつ一般的にリン酸化セリンあるいはリン酸化スレオニン残基を認識可能な優れた抗体は知られていない。そのため、抗体を使ってセリン／スレオニンキナーゼの反応性を調べる場合、特定のリン酸化タンパク質あるいはリン酸化ペプチドを特異的に認識する抗体をその都度作製して用いなければならず、セリン／スレオニンキナーゼの反応性を抗体により一般的かつ簡便に検出し測定する方法はほとんど知られていない。
【特許文献１】ＷＯ ０２／０８３９３３ Ａ２
【特許文献２】ＷＯ ０２／０８３８８４ Ａ２
【特許文献３】特開２００４−２８３１１４号公報
【特許文献４】特開２００４−３０９３０３号公報
【非特許文献１】M. Bettencourt-Dias, R. Giet, R. Sinka, A. Mazumdar, W. G. Lock, F. Balloux, P. J. Zafiropoulos, S. Yamaguchi, S. Winter, R. W. Carthew, M. Cooper, D. Jones, L. Frenz, D. M. Glover. Nature. 2004, 432, 980-7.
【非特許文献２】G. Manning, D. B. Whyte, R. Martnez, T. Hunter, S. Sudarsanam. Science. 2002, 298, 1912-1934.
【非特許文献３】S. J. Lee, S. Y. Lee. Anal. Biochem. 2004, 330, 311-316.
【非特許文献４】R. C. Panicker, X. Huang, S. Q. Yao. Comb. Chem. High Throughput Screen. 2004, 7, 547-56.
【非特許文献５】D. S. Y. Yeo, R. C. Panicker, L. P. Tan, S. Q. Yao. Comb. Chem. High Throughput Screen. 2004, 7, 213-221.
【非特許文献６】B. T. Houseman, J. H. Huh, S. J. Kron, M. Mrksich. Nature Biotech. 2002. 20. 270-274.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述の理由から、現在においては、セリン／スレオニンキナーゼのアッセイに関しては、放射性核種の32Ｐの取り込みを直接測定する方法が一般的となっているが、実験施設や作業環境に制約があり、また実験者の放射能被爆の問題もある為、あまり大規模なハイスループット（high throughput）解析には適さないという問題がある。したがって、大規模なプロテオーム解析を実施して疾患とタンパク質リン酸化カスケードの関連を調べる上で、放射化標識されたＡＴＰ等を用いないNon-RI法で、タンパク質のリン酸化／脱リン酸化を高感度に検出するアッセイを可能にすることが重要な課題となっている。
本発明の目的は、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼの反応性を簡便に測定可能な手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討した結果、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼの基質として以下に示すような人工ペプチドを用いることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
【００１３】
〔１〕 プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも１種含有するプロテインキナーゼの基質群。
〔２〕 プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をリン酸化スレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも１種さらに含有する、前記〔１〕に記載の基質群。
〔３〕 前記人工ペプチド基質が５〜３０のアミノ酸残基を有するものである、前記〔１〕または〔２〕に記載の基質群。
〔４〕 前記プロテインキナーゼがセリン／スレオニンキナーゼである前記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の基質群。
〔５〕 前記セリン／スレオニンキナーゼがｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡである、前記〔４〕に記載の基質群。
〔６〕 前記セリン／スレオニンキナーゼがプロテインキナーゼＣである、前記〔４〕に記載の基質群。
〔７〕 前記セリン／スレオニンキナーゼがＡＭＰ活性化プロテインキナーゼである、前記〔４〕に記載の基質群。
〔８〕 前記人工ペプチド基質が配列番号１１〜２９９に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列を有するものである前記〔１〕〜〔７〕いずれかに記載の基質群。
〔９〕 前記〔１〕〜〔８〕いずれかに記載の基質群を固定してなるペプチドアレイ。
〔１０〕 前記〔９〕に記載のペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、リン酸化および／または脱リン酸化反応を検出する方法。
〔１１〕 前記抗リン酸化スレオニン抗体がポリクローナル抗体である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕 下記工程：
被験者由来の生体試料からプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼを含む画分を調製する工程；
前記画分と前記〔９〕に記載のペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならびに
前記検出結果を、対照における検出結果と比較し、疾患の有無に応じて変化するプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含むプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの活性化および／または不活化に基づく疾患の診断方法。
〔１３〕 前記疾患が癌、悪性腫瘍、糖尿病、糖尿病性合併症、代謝性疾患、自己免疫疾患、免疫異常疾患、免疫不全、神経変性疾患、虚血性疾患、内分泌疾患、肝疾患または骨疾患である前記〔１２〕に記載の診断方法。
〔１４〕 下記工程：
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料と、前記〔９〕に記載のペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならびに
前記検出結果を被検物質を含まない試料における検出結果と比較し、被検物質の有無により変化するプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含む、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のプロテインキナーゼの基質群によると、適切に設計されたアミノ酸配列に基づいて合成した人工基質を含むことから、Non-RI法で高感度にタンパク質のリン酸化または脱リン酸化を測定可能な一連の基質を提供することが可能となり、さらにコンビナトリアルケミストリーの技術を応用すれば、ペプチド基質ライブラリーを作製することができるため、プロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼのハイスループット解析に供することができる。
本発明のペプチドアレイおよびそれを用いたリン酸化および／または脱リン酸化の検出方法によると、プロテオーム解析の手段として、ハイスループット解析が可能であるとともにリン酸化と脱リン酸化を１つのアレイで同時に検出することも可能である。
本発明の診断方法によると、セリン／スレオニンキナーゼによるリン酸化および／またはプロテインホスファターゼによる脱リン酸化を高感度かつ迅速に検出することが可能であるので、かかるリン酸化および／または脱リン酸化が関与する疾患の有無を迅速に判定することできる。
本発明のスクリーニング方法によると、セリン／スレオニンキナーゼによるリン酸化またはプロテインホスファターゼによる脱リン酸化を高感度かつ迅速に検出することが可能であるので、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を促進または阻害する物質を効率よく選択することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明においてプロテインキナーゼとは、大別してセリン／スレオニンキナーゼとチロシンキナーゼとを含む概念であるが、以下、これまで有用なキナーゼ活性の測定方法が開発されていなかったセリン／スレオニンキナーゼを中心に述べる。
【００１６】
セリン／スレオニンキナーゼとしては、アミノ酸配列中のセリンまたはスレオニンをリン酸化する酵素であれば特に限定されるものではないが、例えば、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）、カルシウム依存性プロテインキナーゼ、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ、カゼインキナーゼ、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ、Ｒａｆキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）などがあげられ、前記カルシウム依存性プロテインキナーゼとしては、ホスホリラーゼキナーゼ、ミオシン軽鎖キナーゼ、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ、リン脂質依存性プロテインキナーゼ（プロテインキナーゼＣ：ＰＫＣ）などがあげられる。これらの中でも、細胞内における役割が解明されつつあり、疾患との関連が示唆されているＰＫＡ、ＡＭＰＫ、ＰＫＣなどが好ましい。
【００１７】
本発明においてプロテインホスファターゼとは、リン酸化セリン／スレオニン残基、リン酸化チロシン残基またはリン酸化セリン／スレオニン／チロシン残基のリン酸エステル結合を加水分解する酵素をいい、好ましくはリン酸化セリン／スレオニン残基のリン酸エステル結合を加水分解する酵素である。具体的には、リン酸化されたセリン／スレオニン残基に特異的なホスファターゼとしては、ＰＰ１、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２ＢおよびＰＰ２Ｃなどのホスファターゼがあげられる。これらは、それぞれ基質特異性や阻害剤に対する感受性、金属イオン要求性の違いによって分類されている。ＰＰ２Ｃは単量体酵素であるが、ＰＰ１、ＰＰ２ＡおよびＰＰ２Ｂは、調節サブユニットと活性サブユニットで構成される複合体を形成し、細胞内での局在性は、その調節サブユニットとの相互作用により調節されていると言われている。タイプ２Ｂは、一般に、カルシニューリンともよばれている。一方、リン酸化されたチロシン残基を特異的に脱リン酸化するホスファターゼとしては、細胞膜貫通ドメインを持つ受容体型と、それらをもたない細胞質型が存在し、それぞれに分子構造や活性調節機構を異にする多様な分子種を含んでいる。またリン酸化されたセリン／スレオニン／チロシン残基を脱リン酸化するホスファターゼとしても、基質特異性を異にする複数の分子種が存在することが知られている。
【００１８】
本発明において基質とは、プロテインキナーゼが認識するアミノ酸配列を含有するペプチドまたはタンパク質をいう。前記ペプチドまたはタンパク質を構成するアミノ酸としては、天然アミノ酸として知られるαアミノ酸、βアミノ酸もしくはγアミノ酸に加えて、それらを化学的に修飾したもの、さらにはアミノ酸のアミノ基または水酸基とカルボキシル基やスルフォニル基やフォスフォリル基等を介してペプチド様化学結合を行うことが可能な分子量約８００以下の化学構造を有する部分化学構造体もその範囲に含まれる。
【００１９】
前記基質としては、人工的に適切なアミノ酸配列を設計、合成可能で、かつ、保存性および操作性に優れているペプチド基質が好ましい。
【００２０】
本発明において天然に存在する基質とは、プロテインキナーゼの基質として知られているタンパク質を構成するアミノ酸配列の全部または一部からなるものをいい、セリン／スレオニン残基、好ましくはセリン／スレオニンキナーゼが認識してリン酸化可能なセリン／スレオニン残基を１つまたは複数含むアミノ酸配列からなるものである。天然に存在する基質におけるアミノ酸残基の数としては、５〜タンパク質の全長のアミノ酸残基の数であり、好ましくは５〜３０、より好ましくは１０〜２０である。
【００２１】
本発明において人工ペプチド基質とは、前記天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基に置換したものをいい、好ましくはセリン／スレオニンキナーゼが認識してリン酸化可能なセリン残基をスレオニン残基またはリン酸化スレオニン残基で置換したものである。人工ペプチド基質は、酵素の特異性や検出の容易性を担保するためには、セリン／スレオニンキナーゼが認識可能なセリン残基をスレオニン残基（またはリン酸化されたスレオニン残基）に置換した部位を１つ含むものであることが好ましい。人工ペプチド基質中のアミノ酸残基の数としては、セリン／スレオニンキナーゼが認識できる程度のペプチド長となれば特に限定されるものではないが、通常５〜５００、好ましくは５〜３０、より好ましくは１０〜２０である。
【００２２】
なお、前記人工ペプチド基質は、前記天然に存在する基質から設計されたものであるから、天然に存在する基質中のセリン／スレオニンキナーゼが認識できる程度のアミノ酸残基からなるペプチド部分を含有していればよく、人工ペプチド基質および天然に存在する基質のアミノ酸残基の数が互いに一致する必要はない。
【００２３】
本発明のプロテインキナーゼの基質群は、前記人工ペプチド基質を少なくとも１種含有することを特徴とする。「セリン／スレオニンキナーゼ」は、タンパク質性またはペプチド性基質のセリンおよび／またはスレオニン残基をリン酸化するが、セリン残基とスレオニン残基ではそれらの反応性に若干の差はあるものの共にリン酸化を受けるものと考えられる。そこで、本発明では、セリン／スレオニンキナーゼのリン酸化能を調べる目的のためにセリン／スレオニンキナーゼの基質として被リン酸化セリン残基をスレオニン残基に置換した人工ペプチド基質を用いる。あるいは、プロテインホスファターゼの脱リン酸化能を調べる目的のために、前記被リン酸化セリン残基をリン酸化スレオニン残基に置換した人工ペプチド基質を用いてもよい。
【００２４】
本発明の基質群に含まれる基質の数は、前記人工ペプチド基質を少なくとも１種含有していれば特に限定されるものではないが、好ましくは、１〜１０００００、より好ましくは２〜５００００、さらにより好ましくは１０〜５０００である。かかる範囲内の基質群は、ペプチドアレイまたはペプチドチップとして、１個の担体上に固定化することが可能である。
【００２５】
本発明の基質群は、そのすべてが前記人工ペプチド基質であってもよく、前記人工ペプチド基質と天然に存在する基質とを含んでいてもよく、本発明の検出方法等に用いる場合に、陽性対照および／または陰性対照となる人工ペプチド基質または天然の基質を含んでいてもよい。陽性対照および陰性対照となる人工ペプチド基質には、セリン残基をリン酸化スレオニン残基またはアラニン残基に置換した人工ペプチド基質も含まれる。
【００２６】
人工ペプチド基質の具体的な配列は、配列番号１１〜２９９に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列が好ましい。かかるアミノ酸配列を全部用いてもよく、あるいは、対象とするプロテインキナーゼに応じて適宜組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
本発明の人工ペプチド基質は、天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中の被リン酸化セリン残基をスレオニン残基またはリン酸化スレオニン残基に置換することによって調製することができる。以下、かかる人工ペプチド基質配列の設計と調製方法について説明する。
【００２８】
基質配列設計の方法としては、ゲノム情報またはタンパク質情報からセリン／スレオニンキナーゼの基質となるタンパク質の被リン酸化部位を含むペプチド断片を予測し抽出する。抽出したペプチド断片を、セリン／スレオニンキナーゼのペプチド性基質配列として既に知られているものをも含め、「ペプチド基質の基本配列」と定義して用いる。
【００２９】
次に、前記ペプチド基質の基本配列の被リン酸化部位（セリン残基）を全てスレオニン残基に置換し、その他のアミノ酸残基は基本配列と同様にしてもよいし、適当な方法で一部のアミノ酸残基をさらに他のアミノ酸残基に置換してもよい。さらなる置換は、セリン／スレオニンキナーゼの人工ペプチド基質の製造、固定化等に有利な置換基を導入するために行われる。このように人工的に配列設計されたペプチドを、基質群（集合体あるいはペプチド基質ライブラリー）として供する。配列設計するペプチド配列は、化学合成の効率と活性発現を担保するために、４０アミノ酸残基以下とすることが好ましい。
【００３０】
前記ライブラリーには、被リン酸化部位をリン酸化スレオニンに置換した基質を少なくとも１種含有してもよい。リン酸化スレオニン置換した基質は、リン酸化の陽性対照となるばかりでなく、プロテインホスファターゼの基質ともなり、リン酸化／脱リン酸化を同時に検出することができるので好ましい。
【００３１】
「配列設計されたペプチド性基質の集合体（ペプチド性基質ライブラリー）」は、一般的な化学的ペプチド合成方法（例えば、Fmoc法での固相合成等）により化学合成されて供与される。ここで重要な点は、天然に存在する被リン酸化部位としてのセリン残基を敢えてスレオニン残基に置換して配列設計し、化学合成することである。
【００３２】
上記の方法によって設計し化学合成した人工ペプチド基質を含有する基質群を、溶液状態または「固相状態」でセリン／スレオニンキナーゼによるリン酸化反応の基質として用いる。キナーゼ反応の生成物であるペプチド性リン酸化基質を抗リン酸化スレオニン抗体で認識させ検出することで、セリン／スレオニンキナーゼの種々の条件下での反応性を検出し測定することができる。逆に、ホスファターゼ反応の生成物である脱リン酸化基質が抗体で検出されなくなることで、プロテインホスファターゼの種々の条件下での反応性、好ましくはセリン／スレオニンキナーゼとの競合性を検出し測定することができる。
【００３３】
ここでいう「固相状態」とは、ペプチド性基質を種々の固相担体に直接またはリンカーと呼ばれる適当な化学構造体を介して結合した状態をいう。固相担体としては、有機高分子もしくは無機高分子材料（プラスチック等）、ガラス、金属等で作製された平板、試験管（生化学分野で一般的にプレートと呼称されるものを含む）、薄膜、微粒子等を指す。
【００３４】
「リンカー」としては、特に限定されるものではないが、例えば、酸素、窒素、硫黄またはリン原子を含む鎖状または環状構造を含む炭化水素基などがあげられる。
【００３５】
「固相担体とペプチド性基質との直接またはリンカーを介した結合」としては、共有結合、静電的結合、水素結合、疎水結合、吸着、接着等が含まれる。当然ながら、生化学分野で９６穴プレート、３８４穴プレート、１５３６穴プレートと一般的に呼ばれている実験器材にペプチド性基質を結合させたものやスライドガラスや金薄膜上に微細格子状にペプチド性基質を結合させたペプチドアレイも本発明における「固相状態」の範疇に含まれる。
【００３６】
本発明においては、本発明の基質群を固定してなるペプチドアレイが好ましく用いられる。
【００３７】
本発明のリン酸化および／または脱リン酸化反応を検出する方法は、前記ペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする。具体的には、前記ペプチドアレイを用いることで多様なセリン／スレオニンキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの反応を行い、抗リン酸化スレオニン抗体を用いることで、多様なセリン／スレオニンキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの反応性を幅広くかつ同時に検出する。
【００３８】
前記抗リン酸化スレオニン抗体は、リン酸化スレオニン残基を認識するものであれば特に限定されるものではなく、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でもよいが、基質の配列に限定されずにリン酸化スレオニン残基を認識する可能性が高いという観点から、ポリクローナル抗体が好ましい。かかる抗体は、公知の方法（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜11.13(2000)；Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）により製造することができる。あるいは、市販の抗体の中から本発明の目的に適うものを適宜選択することもできる。好適な市販品の抗体としては、ポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体（Zymed）などがあげられる。
【００３９】
さらに、ポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体を用いれば、リン酸化スレオニン残基を含むペプチド性基質配列のみならずリン酸化セリン残基を含むペプチド性配列をも幅広く一般的に検出することが可能である。リン酸化セリン残基を含むペプチド配列に対する抗リン酸化セリン抗体の親和力は、抗リン酸化スレオニン抗体の親和力よりも低い傾向がある。
【００４０】
反応性を検出する「プロテインキナーゼ」としては、生体試料から抽出した画分中に含まれるキナーゼ；遺伝子組み換えにより発現精製されたキナーゼ；プロテインキナーゼ遺伝子からタンパク質として発現されたプロテインキナーゼであって精製されることなく細胞抽出液もしくは細胞破砕液として適当な緩衝溶液に可溶化された状態のキナーゼ；細胞培養時に分子量約１０００以下の化学物質（医薬品、生理活性化合物を含む）、ペプチド、核酸、糖鎖等を培地に添加して刺激を与えることで細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液中に含まれるキナーゼ；または種々の機能既知もしくは未知遺伝子を導入することで、細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液に含まれるキナーゼなどがあげられる。
【００４１】
反応性を検出する「プロテインホスファターゼ」としては、生体試料から抽出した画分中に含まれるホスファターゼ；遺伝子組み換えにより発現精製されたホスファターゼ；プロテインホスファターゼ遺伝子からタンパク質として発現されたプロテインホスファターゼであって精製されることなく細胞抽出液もしくは細胞破砕液として適当な緩衝溶液に可溶化された状態のホスファターゼ；細胞培養時に分子量約１０００以下の化学物質（医薬品、生理活性化合物を含む）、ペプチド、核酸、糖鎖等を培地に添加して刺激を与えることで細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液に含まれるホスファターゼ；または種々の機能既知もしくは未知遺伝子を導入することで、細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液に含まれるホスファターゼなどがあげられる。
【００４２】
本発明において、セリン／スレオニンキナーゼの基質配列内のセリン残基とスレオニン残基を互いに置換しあった配列を準備し、それらの反応性の違いを比較検討した結果、セリン／スレオニンキナーゼが基質ペプチド配列を認識する場合には、被リン酸化部位を含むある一定の周辺配列を認識し局所的な被リン酸化部位としてのセリンあるいはスレオニン残基の構造の違いを厳密に区別してはいないものと考えられる。
【００４３】
本発明の検出方法は、本発明のペプチドアレイに前記検出対象の「セリン／スレオニンキナーゼ」および／または「プロテインホスファターゼ」を含む溶液を加えて、キナーゼ反応および／またはホスファターゼ反応が進行する条件下でインキュベートする。かかる工程を、以下、接触工程とも称する。前記条件は、検出対象のキナーゼまたはホスファターゼに応じて適宜設定することができるが、通常、０．０５〜０．５ｍＭのＡＴＰ存在下、ｐＨ６．５〜７．５、温度３０〜４０℃で、５分〜２４時間である。なお、プロテインキナーゼおよびプロテインフォスファターゼの分子種は、いずれも大変多岐に渡るため、単独の阻害剤としては、それぞれの全ての分子種に対して十分に効果的な阻害効果を示す汎用的なものは見当たらない。したがって、キナーゼ反応のみを進行させる場合は、それぞれ特異性を異にする公知の複数の種類のプロテインホスファターゼ阻害剤を溶液中に共存させることが好ましく、また、ホスファターゼ反応のみを進行させる場合には、それぞれ特異性を異にする公知の複数の種類のキナーゼ阻害剤を溶液中に共存させることが好ましい。また、いずれの反応を行う場合でも、さらに公知のプロテアーゼ阻害剤を溶液中に共存させることが好ましい。
【００４４】
前記ホスファターゼ阻害剤としては、例えば、オカダ酸、カリキュリンＡ、トウトマイシンなどがあげられ、前記キナーゼ阻害剤としては、ＰＫＣに比較的特異性の高い Calphostin C、 Hypericin、 Phloretin、 H-7 等；ＰＫＡに比較的特異性の高い KT5720 等； ＰＴＫに特異性の高い Curcumin、 AG1024 等；カルモジュリンキナーゼに特異性の高い HA1077、 Lavendustin C などがあげられる。前記プロテアーゼ阻害剤としては、ＰＭＳＦ（phenylmethanesulfonyl fluoride）、ロイペプチン（leupeptin）、アプロチニン(aprotinin)、ペプスタチン（pepstatin）、Ｅ−６４、ＡＥＢＳＦ (4-(2-Aminoethyl)-bezenesulfonylfluoride)、ＤＦＰ（diisopropyl fluorophosphate）、ＺＰＣＫ（N-carbobenzoxy-L-phenylalanine chloromethyl ketone）などがあげられる。以上は例示的に挙げたにすぎず、今日では、数多くのホスファターゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤が市販されているので、通常の知識を有する当業者であれば、それらの市販された特異性の異なる複数の試薬を適宜組み合わせてカクテルとして使用することにより、容易に目的を達成することができる。
【００４５】
次に、前記キナーゼおよび／またはホスファターゼ反応が終了した後、抗リン酸化スレオニン抗体を用いて、ペプチドアレイ上のリン酸化スレオニンの有無を検出する。
【００４６】
検出手段としては、ペプチドアレイ上のリン酸化スレオニンに対する抗リン酸化スレオニン抗体の認識能を検出可能な適当な物理化学量に変換する手段をとる。具体的には、抗体を蛍光標識化することで蛍光強度に変換すること、化学発光色素を発する酵素を結合させた２次抗体（抗リン酸化スレオニン抗体の非可変部位を認識する）を用いて発光強度や吸光強度に変換すること、抗体結合による分子量増加分による表面プラズモン共鳴強度に変換すること等があげられる。
【００４７】
例えば、マイクロタイタープレートを用いて作製したプレートアレイでセリン／スレオニンキナーゼの反応性を測定する手段は、「酵素結合抗体法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）」である。このＥＬＩＳＡを応用した本発明の検出方法を、より詳細に説明する。マイクロタイタープレートとしてアミノコートプレート（住友ベークライト、コーニング製）を用い、リンカー構造としてグルタルアルデヒドを介して本発明のペプチド基質群を固定化する。牛血清アルブミン等でブロッキング操作を行った後、対象とするセリン／スレオニンキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼによるリン酸化および／または脱リン酸化反応を固相上で行う。反応液を除いた後、洗浄操作を繰り返し、１次抗体としてポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体（Zymed）等でリン酸化スレオニン残基を認識させる。続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合性２次抗体等で１次抗体を認識させ、ペルオキシダーゼ反応による発色を測定する。
【００４８】
別の態様として、スライドガラスを用いて作製したペプチドアレイでのセリン／スレオニンキナーゼの反応性を測定する手段は、前記ＥＬＩＳＡと同様である。ただし、酵素による発色反応を測定するのではなく、蛍光標識化された抗体を用いて蛍光強度を測定することが好ましい。より詳細に説明すると、ガラス表面がアミノ修飾されたＤＮＡマイクロアレイ用スライドガラスを基本基板（例えば、松浪ガラス製高密度アミノ修飾スライドガラス）として用いる。これに対して、両末端にカルボン酸を有する直鎖型リンカーを活性エステルとし、基本基板に作用させる。その結果、ガラス表面に活性エステル基を有するスライドガラスが作製される。一方、ペプチド性基質のＮ末端にはシステイン残基を導入したものを合成し準備しておく。ペプチド性基質をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、ＤＮＡマイクロアレイ作製用アレイヤーで微細格子状に微量分注（約１ｎＬ／スポット）する。ガラス表面の活性エステルとペプチド性基質のＮ末端のシステイン残基が位置選択的に反応し、ペプチド性基質が微細格子状にスライドガラスに固定化される。過剰の溶液を洗い流した後、大部分のガラス表面を占める活性エステルを化学的にブロッキングする。即ち、ブロッキング剤として適度に親水性と親油性とが制御された性質を持ち１級アミノ基を有する化学構造体を作製し、ペプチド性基質が微細格子状に固相化されたスライドガラス表面全体に作用させる。このことで、キナーゼまたはホスファターゼによるリン酸化／脱リン酸化反応と抗体反応が円滑に行われ得るペプチドマイクロアレイが作製される。作製されたマイクロアレイを、プレートアレイと同様に牛血清アルブミン等でブロッキングし、対象とするセリン／スレオニンキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼによるリン酸化／脱リン酸化反応をマイクロアレイ上で行う。反応液を除いた後、洗浄操作を繰り返し、蛍光標識化されたポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体（Zymed）等でリン酸化スレオニン残基を認識させる。過剰の抗体溶液を洗い流し乾燥させた後、ＤＮＡマイクロアレイ解析用蛍光スキャナーで蛍光強度を測定することで、対象とするセリン／スレオニンキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの反応性を調べることが可能となる。
【００４９】
本発明の検出方法において、プロテインホスファターゼの反応性は、抗リン酸化スレオニン抗体によって認識され得るリン酸化スレオニン残基に置換したペプチド基質の量を、ホスファターゼの添加前後において比較定量することにより可能である。さらに、例えば、反応液にプロテインキナーゼとプロテインホスファターゼが共存することもあり得るが、この場合は両酵素が共に反応しうる条件下で、酵素間の競合反応を測定することも可能である。その際、それぞれの特異的な配列を有する基質について、前述の特定のキナーゼ阻害剤やホスファターゼ阻害剤を適宜添加した場合と無添加の場合の反応性を比較することによって、それらの酵素間の関係を詳細に解析できる可能性がある。
【００５０】
本発明の検出方法により、
（１） 単離精製されたセリン／スレオニンキナーゼのペプチド性基質を見いだすこと
（２） セリン／スレオニンキナーゼを適当な細胞で遺伝子から発現させ、単離精製することなく細胞抽出液のまま使用しペプチド性基質を見いだすこと
（３） 細胞培養の際に薬剤刺激、対象遺伝子の導入に対する細胞の応答や細胞機能変化をリン酸化反応変化として検出可能なペプチド性基質を見いだすこと
が可能である。
【００５１】
上記のペプチド性基質を見いだす際に、ペプチドアレイ上の多数のペプチド性基質は、単離精製セリン／スレオニンキナーゼ、遺伝子導入細胞の細胞抽出液、薬剤刺激細胞の細胞抽出液といったリン酸化条件に応答する形でリン酸化反応性を示し、あるパターンを与える。この得られたリン酸化パターンにより元の単離精製セリン／スレオニンキナーゼの機能、遺伝子導入に用いた遺伝子の機能、薬剤刺激をかけた刺激薬剤の機能を定義づけることが可能となる。ここでは、このような機能の定義づけを「リン酸化プロファイリング（Phosphorylation Profiling）」と称する。
【００５２】
本発明のプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの活性化および／または不活化に基づく疾患の診断方法は、下記工程：
被験者由来の生体試料からプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼを含む画分を調製する工程；
前記画分と前記ペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出し、対照と比較する工程；ならびに
前記比較結果に基づき、疾患の有無に応じて変化するプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含むことを特徴とする。
【００５３】
前記診断対象となる疾患としては、癌、悪性腫瘍、糖尿病、糖尿病性合併症、代謝性疾患、リウマチや関節炎等の自己免疫疾患、免疫不全やアトピー性疾患などの免疫異常疾患、アルツハイマー病、ハンチントン病、プリオン病などの神経変性疾患、肥大性心疾患、脳梗塞、心筋梗塞、肝硬変等の虚血性疾患、内分泌疾患、肝疾患、骨疾患等の様々な疾患があげられるが、これらに限定されない。
【００５４】
被験者由来の生体試料としては、特に限定されるものではないが、血液、尿、粘膜、各種組織などがあげられる。
【００５５】
前記生体試料からプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼを含む画分の調製は、自体公知のタンパク質の精製方法により行うことができる。生体試料が細胞の場合、細胞抽出液、細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分などの調製が可能である。
【００５６】
前記画分と前記ペプチドアレイとの接触工程は、前記本発明の検出方法で記載したとおりである。
【００５７】
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出する工程は、前記したとおりである。
【００５８】
次に、比較工程において、前記検出工程で得られた結果を対照と比較する。ここで、対照としては、正常者由来の生体試料を被験者由来の生体試料の場合と同様にして前記検出工程に供して得られた結果；予め正常範囲となる基準のリン酸化または脱リン酸化を決定しておいた基準などがあげられる。比較結果は、特定の基質のリン酸化または脱リン酸化の有無として得られる。それぞれの基質のリン酸化または脱リン酸化の有無と疾患との関連を調べることにより、疾患の有無で反応性の異なっている特定の基質のアミノ酸配列を同定することが可能となる。そして、タンパク質配列データベースが整備されてきた今日では、それらの配列をクエリーとして既存の配列データベースをホモロジーサーチすることによって、当該配列に相当する部分配列を含むタンパク質を同定し、その実態を解明できる可能性がある。それらの疾患関連タンパク質は、特定のプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼが作用する標的として機能しており、例えば、治療薬開発におけるスクリーニング系に利用できる可能性がある。
【００５９】
最後に、判定工程において、前記比較結果に基づき、疾患の有無に応じて変化するプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼ活性を判定する。ここで、あらかじめ精製されたプロテインキナーゼまたはフォスファターゼによる同一基質群の反応性を確認しておくことで、疾患の有無で反応性が変化しているプロテインキナーゼまたはフォスファターゼを同定することが可能となる場合も有り得る。
【００６０】
これまでに特定の疾患と特定のタンパク質のリン酸化との関連については、多くの研究がなされているが、それらを制御するキナーゼやフォスファターゼの実態については、必ずしも明確になっていない場合が多い。例えば、アルツハイマー病においては、tau タンパク質の過剰かつ異常なリン酸化が神経変性の引き金となることを示唆する報告が多いが、実際にどのような制御因子がtau タンパク質のリン酸化に関与しているかについては、諸説あって未だに解明されていない。また、Pin 1タンパク質のリン酸化と神経変性疾患との関連や、p53 や Myc 、EGFRのリン酸化と癌、悪性腫瘍との関連を示唆する報告も多いが、リン酸化の生理的意味については、必ずしもよく理解されてはいない。本発明の方法は、プロテオーム技術の網羅的方法として利用されることにより、これらの疾患特異的な重要な分子メカニズムを解明する上での有力な手段を提供することができる。
【００６１】
本発明のプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法は、下記工程：
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料と、前記ペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出し、前記検出結果と被検物質を含まない試料における検出結果とを比較する工程；
被検物質の有無により変化するプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含むことを特徴とする。
【００６２】
前記被検物質としては、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
【００６３】
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料としては、生体試料から抽出した画分中に含まれるキナーゼまたはホスファターゼに被検物質を添加したもの；遺伝子組み換えにより発現精製されたキナーゼまたはホスファターゼに被検物質を添加した試料；プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ遺伝子からタンパク質として発現されたキナーゼまたはホスファターゼであって精製されることなく細胞抽出液もしくは細胞破砕液として適当な緩衝溶液に可溶化された状態のキナーゼまたはホスファターゼに被検物質を添加した試料；細胞培養時に被検物質を培地に添加して刺激を与えることで細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液中に含まれるキナーゼまたはホスファターゼ；または種々の機能既知もしくは未知遺伝子を導入することで、細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液に含まれるキナーゼまたはホスファターゼに被検物質を添加した試料などがあげられる。
【００６４】
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料と、ペプチドアレイとの接触工程は、前記本発明の検出方法で記載したとおりである。
【００６５】
プロテインキナーゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法の場合、ペプチドアレイにはスレオニン残基を含むペプチド基質を固定させ、陽性対照としてリン酸化スレオニン残基を含むペプチド基質を固定させたものを用いることが好ましい。次いで、検出工程において、接触工程前後のペプチドアレイについて抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドを定性的または定量的に検出し、比較工程において、前記検出結果と被検物質を含まない試料における検出結果とを比較する。
【００６６】
プロテインホスファターゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法の場合、ペプチドアレイにはリン酸化スレオニン残基を含むペプチド基質を固定させ、陽性対照としてスレオニン残基を含むペプチド基質を固定させたものを用いることが好ましい。次いで、検出工程において、接触工程前後のペプチドアレイについて抗リン酸化スレオニン抗体を用いたリン酸化ペプチドの検出を介して、脱リン酸化により検出されなくなったペプチド基質を定性的または定量的に検出し、比較工程において、前記検出結果と被検物質を含まない試料における検出結果とを比較する。
【００６７】
最後に、判定工程において、被検物質の有無により変化するプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を判定する。プロテインキナーゼ活性は、抗リン酸化スレオニン抗体により検出されるペプチド基質の数および検出強度で示すことができる。プロテインホスファターゼ活性は、抗リン酸化スレオニン抗体により検出されなくなったペプチド基質の数および検出強度で示すことができる。
【００６８】
前記判定工程において、プロテインキナーゼ活性が促進されている場合、被検物質は、プロテインキナーゼの活性化を介した疾患の治療剤の候補として選択することができる。プロテインキナーゼ活性が阻害されている場合、被検物質は、プロテインキナーゼ活性の抑制化を介した疾患の治療剤の候補として選択することができる。被検物質は、プロテインキナーゼ調節剤または研究用試薬としても有用である。あるいは、前記判定工程において、プロテインホスファターゼ活性が促進されている場合、被検物質は、プロテインホスファターゼの活性化を介した疾患の治療剤の候補として選択することができる。プロテインホスファターゼ活性が阻害されている場合、被検物質は、プロテインホスファターゼ活性の抑制化を介した疾患の治療剤の候補として選択することができる。被検物質は、プロテインホスファターゼ調節剤または研究用試薬としても有用である。
【実施例】
【００６９】
次に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。なお、本実施例において市販のキットあるいは試薬を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。本実施例で汎用的に使用した試薬、培地、緩衝溶液を以下に記す。
【００７０】
ペプチド基質
被リン酸化部位としてスレオニンまたはセリン残基を含みＮ末端にシステイン残基を含む１０から１８アミノ酸からなるペプチド配列を通常のFmoc法による化学合成を行い使用した。
以下の１０配列は、合成した粗精製品を逆相クロマトグラフにより精製を行い使用した。pS*はリン酸化セリン残基、pT*はリン酸化スレオニン残基を示す。
【００７１】
ＰＫＡ用基質ペプチド
Kemptide(A): CGGLRRAALG-NH2 （配列番号１）
Kemptide(S): CGGLRRASLG-NH2（配列番号２）
Kemptide(T) : CGGLRRATLG-NH2（配列番号３）
Kemptide(pS*): CGGLRRA(pS*)LG-NH2（配列番号４）
Kemptide(pT*) : CGGLRRA(pT*)LG-NH2（配列番号５）
ＡＭＰＫ用基質ペプチド
SAMA: CGGHMRSAMAGLHLVKRR-NH2（配列番号６）
SAMT: CGGHMRSAMTGLHLVKRR-NH2（配列番号７）
ＰＫＣ用基質ペプチド
IQAA: CGGAAKIQAAFRGHMARKK-NH2（配列番号８）
IQAT: CGGAAKIQATFRGHMARKK-NH2（配列番号９）
IQA(pT*): CGGAAKIQA(pT*)FRGHMARKK-NH2（配列番号１０）
【００７２】
以下に示す２８９配列は、合成した粗精製品を精製することなく使用した。pTはリン酸化されていてもよいスレオニン残基を示す。
PT001: CGGHMRSAM(pT)GLHLVKRR （配列番号１１）
PT002: CGGAMARAA(pT)AAALARRR （配列番号１２）
PT003: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号１３）
PT004: CGGKSGELLA(pT)WAGSPPY （配列番号１４）
PT005: CGGKSGEPLS(pT)WAGSPPY （配列番号１５）
PT006: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号１６）
PT007: CGGSDGEFLR(pT)SAGSPNY （配列番号１７）
PT008: CGGTFGNKLD(pT)FAGSPPY （配列番号１８）
PT009: CGGTLGSKLD(pT)FAGSPPY （配列番号１９）
PT010: CGGTVGGKLD(pT)FAGSPPY （配列番号２０）
PT011: CGGTVGNKLD(pT)FAGSPPY （配列番号２１）
PT012: CGGVGDSLLE(pT)SAGSPHY （配列番号２２）
PT013: CGGKSAEPLS(pT)WAGSPPY （配列番号２３）
PT014: CGGVGDSLFE(pT)SAGSPHY （配列番号２４）
PT015: CGGTVGGKID(pT)FAGSPPY （配列番号２５）
PT016: CGGKSGEPLS(pT)WAGSPPH （配列番号２６）
PT017: CGGTLGSKLD(pT)FAGNPPY （配列番号２７）
PT018: CGGTVAGKLD(pT)FAGSPPY （配列番号２８）
PT019: CGGVGDSLLE(pT)SAGSPHH （配列番号２９）
PT020: CGGVGDSLLE(pT)SAASPHY （配列番号３０）
PT021: CGGYQGKFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号３１）
PT022: CGGKSGELLA(pT)WSGSPPY （配列番号３２）
PT023: CGGSDGEFLR(pT)TAGSPNY （配列番号３３）
PT024: CGGKSGDPLS(pT)WAGSPPY （配列番号３４）
PT025: CGGTFGNKLD(pT)FAGSPPF （配列番号３５）
PT026: CGGTVANKLD(pT)FAGSPPY （配列番号３６）
PT027: CGGKSGEPLS(pT)WAGTPPY （配列番号３７）
PT028: CGGKSGEPLS(pT)LAGSPPY （配列番号３８）
PT029: CGGTIGNKLD(pT)FAGSPPY （配列番号３９）
PT030: CGGSDGEFLK(pT)SAGSPNY （配列番号４０）
PT031: CGGTLGSKLD(pT)FAGSPAY （配列番号４１）
PT032: CGGSDGEFLR(pT)SAGSPNF （配列番号４２）
PT033: CGGKSGELLA(pT)WAASPPY （配列番号４３）
PT034: CGGTVGNKLD(pT)LAGSPPY （配列番号４４）
PT035: CGGKSGEPLT(pT)WAGSPPY （配列番号４５）
PT036: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSPLH （配列番号４６）
PT037: CGGTVGGKLD(pT)FAASPPY （配列番号４７）
PT038: CGGHQGKFLQ(pT)IAGSPLY （配列番号４８）
PT039: CGGKSAELLA(pT)WAGSPPY （配列番号４９）
PT040: CGGKTGELLA(pT)WAGSPPY （配列番号５０）
PT041: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSALY （配列番号５１）
PT042: CGGQKDKFIQ(pT)FAGSPLY （配列番号５２）
PT043: CGGTVGGKLD(pT)FAGNPPY （配列番号５３）
PT044: CGGTLGGKLD(pT)FAGSPPY （配列番号５４）
PT045: CGGHQGKLLQ(pT)FAGSPLY （配列番号５５）
PT046: CGGKSGEPLS(pT)WAGSPPF （配列番号５６）
PT047: CGGTFGNKLD(pT)LAGSPPY （配列番号５７）
PT048: CGGVGDSLLE(pT)SAGSPYY （配列番号５８）
PT049: CGGQKDRFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号５９）
PT050: CGGVGDSLLE(pT)SAGSPHF （配列番号６０）
PT051: CGGTVGGKLD(pT)FAGSPAY （配列番号６１）
PT052: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSPFY （配列番号６２）
PT053: CGGSVGNKLD(pT)FAGSPPY （配列番号６３）
PT054: CGGTVGGKLD(pT)FAGSAPY （配列番号６４）
PT055: CGGVGDSLVE(pT)SAGSPHY （配列番号６５）
PT056: CGGKSGEPLS(pT)WAASPPY （配列番号６６）
PT057: CGGTLGSKLE(pT)FAGSPPY （配列番号６７）
PT058: CGGSDGEFLR(pT)SAGSANY （配列番号６８）
PT059: CGGSDGELLR(pT)SAGSPNY （配列番号６９）
PT060: CGGRSGEPLS(pT)WAGSPPY （配列番号７０）
PT061: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSPIY （配列番号７１）
PT062: CGGTFGNKLD(pT)FAGSAPY （配列番号７２）
PT063: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSPVY （配列番号７３）
PT064: CGGKSGELLA(pT)LAGSPPY （配列番号７４）
PT065: CGGKTGEPLS(pT)WAGSPPY （配列番号７５）
PT066: CGGTVGGKLD(pT)FAGTPPY （配列番号７６）
PT067: CGGSDGEFLR(pT)SAGTPNY （配列番号７７）
PT068: CGGQKDKFLQ(pT)FSGSPLY （配列番号７８）
PT069: CGGIGDSLLE(pT)SAGSPHY （配列番号７９）
PT070: CGGQKDKFFQ(pT)FAGSPLY （配列番号８０）
PT071: CGGVGDSLLE(pT)TAGSPHY （配列番号８１）
PT072: CGGTFGNKLD(pT)FAGSPAY （配列番号８２）
PT073: CGGVGDSLLE(pT)SAGSAHY （配列番号８３）
PT074: CGGTLGSKLD(pT)FAGSAPY （配列番号８４）
PT075: CGGAGDSLLE(pT)SAGSPHY （配列番号８５）
PT076: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSPFY （配列番号８６）
PT077: CGGVGDSILE(pT)SAGSPHY （配列番号８７）
PT078: CGGQKDKILQ(pT)FAGSPLY （配列番号８８）
PT079: CGGLGDSLLE(pT)SAGSPHY （配列番号８９）
PT080: CGGQKDKFLQ(pT)LAGSPLY （配列番号９０）
PT081: CGGQKDKFLQ(pT)FAASPLY （配列番号９１）
PT082: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSPVY （配列番号９２）
PT083: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSPLH （配列番号９３）
PT084: CGGVGESLLE(pT)SAGSPHY （配列番号９４）
PT085: CGGVGDSLLE(pT)SAGSPRY （配列番号９５）
PT086: CGGSDGEFLR(pT)SAGSPNH （配列番号９６）
PT087: CGGHQGKILQ(pT)FAGSPLY （配列番号９７）
PT088: CGGSEGEFLR(pT)SAGSPNY （配列番号９８）
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PT142: CGGSSGSPAN(pT)FHFKEAW （配列番号１５２）
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PT145: CGGVTHTFSG(pT)IEYMAPE （配列番号１５５）
PT146: CGGVTHTFAG(pT)IEYMAPE （配列番号１５６）
PT147: CGGSQFDSKF(pT)RQTPVDS （配列番号１５７）
PT148: CGGNQVFLGF(pT)YVAPSVL （配列番号１５８）
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PT151: CGGEPLERRL(pT)LVPDSEQ （配列番号１６１）
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PT153: CGGPTMRPSM(pT)GLHLVKR （配列番号１６３）
PT154: CGGKTPNLRM(pT)EKKSSWA （配列番号１６４）
PT155: CGGLNVESVS(pT)HRERSED （配列番号１６５）
PT156: CGGLNVESVA(pT)HRERSED （配列番号１６６）
PT157: CGGNPLMRRN(pT)VTPLASP （配列番号１６７）
PT158: CGGPLASPEP(pT)KKPRINS （配列番号１６８）
PT159: CGGEPSRAPA(pT)LLPPAPE （配列番号１６９）
PT160: CGGYYSSIKR(pT)GSQAHEQ （配列番号１７０）
PT161: CGGWRRKRKE(pT)SNTDSAG （配列番号１７１）
PT162: CGGVEDPPAP(pT)EPVAVEQ （配列番号１７２）
PT163: CGGPQLLRLL(pT)TLAEEPR （配列番号１７３）
PT164: CGGTSRIRTQ(pT)FSLQERQ （配列番号１７４）
PT165: CGGHFAIAAD(pT)EAEQDSW （配列番号１７５）
PT166: CGGSGDYMPM(pT)PKSVSAP （配列番号１７６）
PT167: CGGQHLRLST(pT)SGRLLYA （配列番号１７７）
PT168: CGGPLGSGES(pT)STRRSSE （配列番号１７８）
PT169: CGGQHLRLST(pT)SGRILYA （配列番号１７９）
PT170: CGGTSRIRTQ(pT)ISLQERQ （配列番号１８０）
PT171: CGGNKRSRTR(pT)DTYSAGQ （配列番号１８１）
PT172: CGGDSLPSSP(pT)TATPHSQ （配列番号１８２）
PT173: CGGSHMVHNR(pT)KINLQDL （配列番号１８３）
PT174: CGGRSRTRTD(pT)YSAGQSI （配列番号１８４）
PT175: CGGPTMRPSM(pT)GLHLVRR （配列番号１８５）
PT176: CGGLHIRSSW(pT)GLHLLKQ （配列番号１８６）
PT177: CGGLHIRSSW(pT)GLYLVKQ （配列番号１８７）
PT178: CGGQHLRVST(pT)SGRLLYA （配列番号１８８）
PT179: CGGDTLPSSP(pT)SATPHSQ （配列番号１８９）
PT180: CGGTSRIRTQ(pT)FSFQERQ （配列番号１９０）
PT181: CGGNPLMRRN(pT)VTPLANP （配列番号１９１）
PT182: CGGSHMFHNR(pT)KINLQDL （配列番号１９２）
PT183: CGGLHIRSSW(pT)GLHVVKQ （配列番号１９３）
PT184: CGGRSRTRTD(pT)YTAGQSV （配列番号１９４）
PT185: CGGQHLRLST(pT)SGRLIYA （配列番号１９５）
PT186: CGGQHLRLST(pT)SGRLLYG （配列番号１９６）
PT187: CGGPTMKPSM(pT)GLHLVKR （配列番号１９７）
PT188: CGGTSHIRTQ(pT)FSLQERQ （配列番号１９８）
PT189: CGGLHIRSSW(pT)GLHLVRQ （配列番号１９９）
PT190: CGGESLPSSP(pT)SATPHSQ （配列番号２００）
PT191: CGGTSRIRTQ(pT)FTLQERQ （配列番号２０１）
PT192: CGGSHMIHNR(pT)KINIQDL （配列番号２０２）
PT193: CGGNPLMRRN(pT)VTPLGSP （配列番号２０３）
PT194: CGGQHLRLTT(pT)SGRLLYA （配列番号２０４）
PT195: CGGNPFMRRN(pT)VTPLASP （配列番号２０５）
PT196: CGGDSIPSSP(pT)SATPHSQ （配列番号２０６）
PT197: CGGSHMIHNR(pT)KVNLQDL （配列番号２０７）
PT198: CGGATMRPSM(pT)GLHLVKR （配列番号２０８）
PT199: CGGLHIRSSW(pT)ALHLVKQ （配列番号２０９）
PT200: CGGQRLRLST(pT)SGRLLYA （配列番号２１０）
PT201: CGGNPVMRRN(pT)VTPLASP （配列番号２１１）
PT202: CGGNPLMRRN(pT)VNPLASP （配列番号２１２）
PT203: CGGQHLRLST(pT)SGRLVYA （配列番号２１３）
PT204: CGGQHLRLST(pT)SGRVLYA （配列番号２１４）
PT205: CGGNPLMRRN(pT)VTPIASP （配列番号２１５）
PT206: CGGNPLLRRN(pT)VTPLASP （配列番号２１６）
PT207: CGGPSMRPSM(pT)GLHLVKR （配列番号２１７）
PT208: CGGPTMRPSM(pT)GFHLVKR （配列番号２１８）
PT209: CGGLHIRTSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２１９）
PT210: CGGDSVPSSP(pT)SATPHSQ （配列番号２２０）
PT211: CGGNPLMRRN(pT)ATPLASP （配列番号２２１）
PT212: CGGQHLRLST(pT)TGRLLYA （配列番号２２２）
PT213: CGGDSLPSSP(pT)SATAHSQ （配列番号２２３）
PT214: CGGPTMRPSL(pT)GLHLVKR （配列番号２２４）
PT215: CGGPTMRASM(pT)GLHLVKR （配列番号２２５）
PT216: CGGQHFRLST(pT)SGRLLYA （配列番号２２６）
PT217: CGGDSLPSSP(pT)SATPHNQ （配列番号２２７）
PT218: CGGLHIRSSW(pT)GLHLAKQ （配列番号２２８）
PT219: CGGLHIRSNW(pT)GLHLVKQ （配列番号２２９）
PT220: CGGQYLRLST(pT)SGRLLYA （配列番号２３０）
PT221: CGGQHLHLST(pT)SGRLLYA （配列番号２３１）
PT222: CGGTSRIRTQ(pT)FSLQDRQ （配列番号２３２）
PT223: CGGSHMIHNK(pT)KINLQDL （配列番号２３３）
PT224: CGGLRIRSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２３４）
PT225: CGGSHMIHNR(pT)RINLQDL （配列番号２３５）
PT226: CGGVHIRSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２３６）
PT227: CGGLHIRSSW(pT)GLRLVKQ （配列番号２３７）
PT228: CGGNPLMRRN(pT)VSPLASP （配列番号２３８）
PT229: CGGQHLRLST(pT)SGRLLHA （配列番号２３９）
PT230: CGGQHLRLSS(pT)SGRLLYA （配列番号２４０）
PT231: CGGNKRSRTK(pT)DSYSAGQ （配列番号２４１）
PT232: CGGQHIRLST(pT)SGRLLYA （配列番号２４２）
PT233: CGGNPIMRRN(pT)VTPLASP （配列番号２４３）
PT234: CGGQHLRLST(pT)SGRFLYA （配列番号２４４）
PT235: CGGSHMIHNR(pT)KINVQDL （配列番号２４５）
PT236: CGGDSLPSSP(pT)SATPYSQ （配列番号２４６）
PT237: CGGSYMIHNR(pT)KINLQDL （配列番号２４７）
PT238: CGGQHLRFST(pT)SGRLLYA （配列番号２４８）
PT239: CGGTSRIRTQ(pT)FSLQEHQ （配列番号２４９）
PT240: CGGNKRSRTR(pT)DSYSGGQ （配列番号２５０）
PT241: CGGEAMRRSV(pT)EAALAQP （配列番号２５１）
PT242: CGGPTMRPSM(pT)GLRLVKR （配列番号２５２）
PT243: CGGQHLRLST(pT)SGRLLFA （配列番号２５３）
PT244: CGGDSLPTSP(pT)SATPHSQ （配列番号２５４）
PT245: CGGTHMIHNR(pT)KINLQDL （配列番号２５５）
PT246: CGGRSRTRTD(pT)YSAGQSL （配列番号２５６）
PT247: CGGQHLRLST(pT)SGHLLYA （配列番号２５７）
PT248: CGGLHVRSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２５８）
PT249: CGGLHIRSSW(pT)GLHLIKQ （配列番号２５９）
PT250: CGGLHIRSSW(pT)GFHLVKQ （配列番号２６０）
PT251: CGGSHMIHNR(pT)KINFQDL （配列番号２６１）
PT252: CGGPTMRPSM(pT)GLHLVKK （配列番号２６２）
PT253: CGGPTMRPSM(pT)GVHLVKR （配列番号２６３）
PT254: CGGTNRLRSE(pT)IAFIEEN （配列番号２６４）
PT255: CGGPTLRPSM(pT)GLHLVKR （配列番号２６５）
PT256: CGGPTMRPNM(pT)GLHLVKR （配列番号２６６）
PT257: CGGQHVRLST(pT)SGRLLYA （配列番号２６７）
PT258: CGGLHIKSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２６８）
PT259: CGGLHIRSSW(pT)GVHLVKQ （配列番号２６９）
PT260: CGGDSLPSSP(pT)SATPHTQ （配列番号２７０）
PT261: CGGDSLPSSA(pT)SATPHSQ （配列番号２７１）
PT262: CGGLHIRSSL(pT)GLHLVKQ （配列番号２７２）
PT263: CGGNPLMRRN(pT)VTPLVSP （配列番号２７３）
PT264: CGGLHIRSSW(pT)GLHIVKQ （配列番号２７４）
PT265: CGGLHIRSTW(pT)GLHLVKQ （配列番号２７５）
PT266: CGGPTMRPSM(pT)GIHLVKR （配列番号２７６）
PT267: CGGPTMRPSM(pT)GLHVVKR （配列番号２７７）
PT268: CGGQHLRIST(pT)SGRLLYA （配列番号２７８）
PT269: CGGQHLRLST(pT)SARLLYA （配列番号２７９）
PT270: CGGPTMRPSM(pT)GLHLAKR （配列番号２８０）
PT271: CGGDSFPSSP(pT)SATPHSQ （配列番号２８１）
PT272: CGGPTMRPSM(pT)GLHLLKR （配列番号２８２）
PT273: CGGLYIRSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２８３）
PT274: CGGPNMRPSM(pT)GLHLVKR （配列番号２８４）
PT275: CGGQHLRLST(pT)SGRLFYA （配列番号２８５）
PT276: CGGFHIRSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２８６）
PT277: CGGLRRA(pT)LG （配列番号２８７）
PT278: CGGRPRAA(pT)F （配列番号２８８）
PT279: CGGFKK(pT)FKL （配列番号２８９）
PT280: CGGTIYRRG(pT)RRWRKL （配列番号２９０）
PT281: CGGQKRPRRKD(pT)P （配列番号２９１）
PT282: CGGRKR(pT)RAE （配列番号２９２）
PT283: CGGAPGLI(pT)PGGPP （配列番号２９３）
PT284: CGGKKALHRQE(pT)VDAL （配列番号２９４）
PT285: CGGMHRQE(pT)VDCLK （配列番号２９５）
PT286: CGGHA(pT)PPKKKRK （配列番号２９６）
PT287: CGGPK(pT)PKKAKKL （配列番号２９７）
PT288: CGGRRADD(pT)DDDDD （配列番号２９８）
PT289: CGGRRRDDD(pT)DDD （配列番号２９９）
【００７３】
ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液：
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を使用した。
ブロッキング緩衝溶液：
３％牛血清アルブミンと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を使用した。
抗リン酸化セリン抗体緩衝溶液：
市販品（後述）をブロッキング緩衝溶液で５００倍希釈して使用した。
抗リン酸化スレオニン抗体緩衝溶液：
市販品（後述）をブロッキング緩衝溶液で５００倍希釈して使用した。
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識抗マウス抗体緩衝溶液：
市販品（Zymed）をブロッキング緩衝溶液で5000倍希釈して使用した。
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識抗ウサギ抗体緩衝溶液：
市販品（Zymed）をブロッキング緩衝溶液で1000倍希釈して使用した。
ＰＫＡ酵素：市販品（Promega, Madison, WI、またはUpstate Biotechnology, Lake Placid, NY）を用いた。
ＰＫＣ酵素：市販品（Upstate）を用いた。
ＡＭＰＫ酵素：市販品（Upstate）を用いた。
ＰＫＡ反応緩衝溶液：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
40 mM Tris/HCl (pH 7.2)
15 mM MgCl2
0.2 mM ATP
ＡＭＰＫ反応緩衝溶液：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
40 mM HEPES (pH 7.4)
80 mM NaCl
5 mM Mg(OAc)2
1 mM DTT
0.2 mM 5’-AMP
0.2 mM ATP
ＰＫＣ反応緩衝溶液（全亜型共通）：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
20 mM MOPS (pH 7.2）
25 mM β-glycerophosphate
5 mM EGTA
0.2 mM DTT
1 mM CaCl2
20 mM MgCl2
1/5 Lipid Activator (Upstate)
0.2 mM ATP
カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−）：
塩化ナトリウム80g、塩化カリウム２g、リン酸水素ナトリウム11.5g、リン酸二水素カリウム2gを精製水１Lに溶解したものを１０倍希釈しオートクレーブで滅菌したものを用いた。
細胞剥離液：
トリプシン−ＥＤＴＡ液（GIBCO）を滅菌ＰＢＳ−で１０倍希釈して用いた。
ＨＥＫ２９３細胞生育培地：
500 mLのDulbeco’s リン酸緩衝生理食塩水（Sigma）に50 mLの牛胎児血清（５６℃で３０分間加熱し非働化したもの）と5 mLのペニシリン／ストレプトマイシン（10000 units/ml、10000 mg/ml）加えたものを用いた。
ＰＫＡプラスミド：
市販品（Stratagene）を使用した。
ＧＦＰプラスミド：
市販品（CloneTech）を使用した。
プラスミド溶液：
プラスミド４μgを250μLのOptiMem I (Invitrogen)と250μLのLipofectamine 2000 (Invitrogen)の混合液に溶解させたものを細胞培養用６穴プレートの１穴あたり用いた。
ＨＥＫ２９３細胞抽出用緩衝液：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
20 mM Tris/HCl (pH 7.2)
0.5 % TritonX-100
150 mM NaCl
20 mM β-glycerophosphate
2 mM EGTA
5 mM EDTA
1 mM Na3VO4(sodium orthovanadate)
0.2 mM PMSF
5 mg/ml Aprotinin
3 mg/ml Pepstatin A
Ｌ６細胞生育培地：
500 mLのαMEM（Sigma）に50 mLの牛胎児血清（５６℃で３０分間加熱し非働化したもの）、5 mLのペニシリン／ストレトマイシン（10000 units/ml、10000 mg/ml）と10 mLの200 mMグルタミンを加えたものを用いた。
Ｌ６細胞分化培地：
500 mLのαMEM（Sigma）に10 mLの牛胎児血清、5 mLのペニシリン／ストレプトマイシン（10000 units/ml、10000 mg/ml）混合液と10 mLの200 mMグルタミンを加えたものを用いた。
Ｌ６細胞抽出用緩衝液： 以下の組成の緩衝溶液を用いた。
30 mM HEPES (pH 7.4)
2.5 mM EGTA
3.0 mM EDTA
70 mM KCl
0.1 % Nonident P-40
20 mM β-glycerophosphate
20 mM NaF
2 mM NaPPi (sodium pyrophosphate)
1 mM Na3VO4(sodium orthovanadate)
0.2 mM PMSF
0.01 mM Pepstatin A
【００７４】
実施例１：マイクロタイタープレートでの抗体認識反応（１）
１％グルタルアルデヒドの５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を９６穴アミノプレート（住友ベークライトまたはコーニング製）に５０μＬずつ注ぎ入れ、３７℃で２時間反応させ、プレート表面を活性化させた。反応液を取り除き、精製水で洗浄した。ペプチド基質を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解させ（ペプチド濃度１μＭ〜２０μＭ）、活性化させた９６穴マイクロタイタープレートの各穴に５０μＬずつ注ぎ入れた。３７℃で２時間反応させた後、反応液を除いた。ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液と精製水で順次洗浄することでペプチド基質を固定化した。ペプチド基質を固定化させたマイクロタイタープレートを、ブロッキング緩衝溶液を用いて３０℃で１時間ブロッキング処理した。ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した後、抗リン酸化セリン抗体緩衝溶液または抗リン酸化スレオニン抗体緩衝溶液を１穴あたり５０μＬずつ用いて３０℃で１〜２時間抗体認識反応を行った。反応液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した。続いて、ＨＲＰ標識抗マウス緩衝溶液あるいは抗ウサギ抗体緩衝溶液で認識反応させた。認識反応は１穴あたり５０μＬずつ用いて３０℃で１時間行い、反応液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で４回洗浄した。ＴＭＢ（３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン）溶液を１００μＬ加えいれ３０℃で約１０分間反応させた。２Ｎ硫酸水溶液で反応を停止した後、吸光光度計で４５０ｎｍでの吸光度を定量した（図１および２、表１）。その結果、下記抗体１６がリン酸化セリンおよびリン酸化スレオニンの両方を認識することがわかった。
【００７５】
評価した抗リン酸化セリン抗体１０種類と抗リン酸化スレオニン抗体６種類を以下に示す。
抗体１．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン7F12、Alexis Biochemicals (San Diego, CA)
抗体２．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン16B4、Alexis Biochemicals (San Diego, CA)
抗体３．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローンQ5、Qiagen (Valencia, CA)
抗体４．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローンab6639、Abcam (Cambridge, UK)
抗体５．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローンPSR-45、Sigma (St. Lois, MO)
抗体６．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン608、Zymed (South San Francisco, CA)
抗体７．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローンIC8、Calbiochem (San Diego, CA)
抗体８．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン4A3、Calbiochem (San Diego, CA)
抗体９．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン4A9、Calbiochem (San Diego, CA)
抗体１０．ウサギポリクローナル抗リン酸化セリン抗体：
Zymed (South San Francisco, CA)
抗体１１．マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
クローンPTHR-1E11、nanoTools (Germany)
抗体１２．マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
クローンPTHR-4D11、nanoTools (Germany)
抗体１３．マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
クローンPTHR-14B3、nanoTools (Germany)
抗体１４．マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
クローンQ7、Qiagen (Valencia, CA)
抗体１５．ウサギポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
CHEMICON (Temecula, CA)
抗体１６．ウサギポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
Zymed (South San Francisco, CA)
【００７６】
【表１−１】
【００７７】
【表１−２】
【００７８】
実施例２：マイクロタイタープレートでの抗体認識反応（２）
実施例１で見出した抗体１６について、Ｎ末端にシステイン残基を有しリン酸化スレオニン残基を含む１０から１８アミノ酸からなる２８９種類のペプチド配列（PT001〜PT289）に対する認識能を調べた。
抗体認識能は、実施例１に示すように１次抗体としての抗リン酸化スレオニン抗体（抗体１６）と２次抗体としての抗ウサギ抗体とを組み合わせて調べた。しかし、１次抗体としての抗リン酸化スレオニン抗体（抗体１６）の機能をより詳細に調べる目的で２８９ペプチドの全配列について以下の２つの条件で抗体認識反応を比較した。さらに実験に用いる各プレートには実施例１で用いたKemptide(A)、Kemptide(T)、Kemptide(pT*)を標準サンプルとして常に固相化させ比較検討した（表２）。
【００７９】
条件１：１次抗体（−）、二次抗体（＋）
ペプチド性基質を実施例１と同様の方法で固定化させた９６穴マイクロタイタープレートをブロッキング緩衝溶液を用いて３０℃で１時間ブロッキング処理を行った。ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体緩衝溶液で認識反応させた。認識反応は３０℃で１時間行い、反応液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で４回洗浄した。ＴＭＢ溶液を１００μＬ加えいれ３０℃で約１０分間反応させた。２Ｎ硫酸水溶液で反応を停止した後、吸光光度計で４５０ｎｍでの吸光度を定量した。
【００８０】
条件２：１次抗体（＋）、二次抗体（＋）
ペプチド性基質を実施例１と同様の方法で固定化させた９６穴マイクロタイタープレートをブロッキング緩衝溶液を用いて３０℃で１時間ブロッキング処理を行った。ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した後、抗体１６の抗リン酸化スレオニン抗体緩衝溶液により３０℃で１〜２時間反応させた。反応液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した。続いて、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体緩衝溶液で認識反応させた。認識反応は３０℃で１時間行い、反応液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で４回洗浄した。ＴＭＢ溶液を１００μＬ加えいれ３０℃で約１０分間反応させた。２Ｎ硫酸水溶液で反応を停止した後、吸光光度計で４５０ｎｍでの吸光度を定量した。
【００８１】
【表２−１】
【００８２】
【表２−２】
【００８３】
【表２−３】
【００８４】
【表２−４】
【００８５】
【表２−５】
【００８６】
【表２−６】
【００８７】
【表２−７】
【００８８】
実施例３：プレートでの精製ＰＫＡでのリン酸化検出
ＰＫＡ用基質ペプチドを実施例１と同様の方法で９６穴マイクロタイタープレートに固定化し、１穴あたり１Ｕまたは１５０ ｍＵのＰＫＡ（Promega, Madison, WIまたはUpstate）を含むＰＫＡ反応緩衝溶液を１穴あたり５０μＬずつ用いて３０℃でリン酸化反応を行い経時変化を追った。反応溶液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液と精製水で洗浄した。実施例１に示す方法で、生成物であるリン酸化ペプチドを抗体１６を用いて測定した（図３−１、３−２）。
図３−１、３−２より、ＰＫＡは基質ペプチド（配列番号２および３）中のセリンおよびスレオニン残基を経時的にリン酸化し、抗体１６は、リン酸化セリンおよびリン酸化スレオニンを同程度に認識することがわかった。
【００８９】
実施例４：プレートでの精製ＡＭＰＫでのリン酸化検出
ＡＭＰＫ用基質ペプチドを実施例１に示した方法で９６穴マイクロタイタープレートに固定化し、１穴あたり１０ ｍＵのＡＭＰＫ（Upstate）を含むＡＭＰＫ反応緩衝溶液を１穴あたり５０μＬずつ用いて３０℃でリン酸化反応を行い経時変化を測定した。反応溶液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液と精製水で洗浄した。さらに、実施例１に示す方法で、生成物であるリン酸化ペプチドを測定した。ＡＭＰＫ反応緩衝溶液からＡＴＰとＡＭＰを除いた場合、ＡＭＰだけ除いた場合のリン酸化反応も同時に測定した（図４）。
図４より、ＡＭＰＫは基質ペプチドＳＡＭＴ（配列番号７）を経時的にリン酸化し、抗体１６を用いて当該リン酸化を検出することにより、ＡＴＰの存在下よりもＡＭＰとＡＴＰの共存下の方がリン酸化の程度が強いことがわかった。
【００９０】
実施例５：プレートでの精製ＰＫＣでのリン酸化検出
ＰＫＣ用基質ペプチドを実施例１と同様の方法で９６穴マイクロタイタープレートに固定化し、各穴あたり６．３ ｍＵのＰＫＣ（Upstate）を含むＰＫＣ反応緩衝溶液を１穴あたり５０μＬずつ用いて３０℃で１時間リン酸化反応を行った。用いたＰＫＣは、ＰＫＣα、ＰＫＣβII、ＰＫＣγ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣη、ＰＫＣθおよびＰＫＣζであった。反応溶液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液と精製水で洗浄した。実施例１に示す方法により、生成物であるリン酸化ペプチドを抗体１６を用いて測定した（図５）。
図５より、用いたＰＫＣはすべて基質ペプチドＩＱＡＴ（配列番号９）をＡＴＰ存在下でリン酸化することがわかった。
【００９１】
実施例６：ＨＥＫ２９３細胞でＰＫＡとＧＦＰ遺伝子を発現させた細胞抽出液でのリン酸化反応の検出
５０ｍＬの滅菌済み試験管にＨＥＫ２９３細胞を入れ、３７℃に温めたＨＥＫ２９３細胞生育培地２０ｍＬをゆっくりと加え懸濁した。毎分１０００回転で５分間遠心分離して細胞を沈殿させ上清を捨てた。ＨＥＫ２９３細胞生育培地１５ｍＬを加えて細胞を再懸濁した。得られた懸濁液を細胞培養用Ｆ７５フラスコ（コーニング）に移し、二酸化炭素培養装置内で３７℃で培養した。細胞が約８０％コンフルエント状態に達したら、次のように継代を行った。フラスコ内の培地を捨て、１０ｍＬのＰＢＳ−で２回洗浄した。約１０ｍＬの細胞剥離液で細胞をはがした。ＨＥＫ２９３細胞生育培地で細胞を回収し、毎分１０００回転で５分間遠心分離し、細胞を沈殿させ上清を捨てた。ＨＥＫ２９３細胞生育培地を加えて細胞を再懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を使い、新しい細胞培養用Ｆ７５フラスコで同じように増殖させた。必要量の細胞数を得るために継代を繰り返した。継代を繰り返して得たＨＥＫ２９３細胞を３００，０００／ｍｌの密度で細胞培養用６穴プレート（SUMILON MS-8496F5）に播き、１穴あたりＨＥＫ２９３細胞生育培地で約２mＬにし、ＰＫＡもしくはＧＦＰ遺伝子のプラスミド溶液を加え入れ、３７℃で約４時間遺伝子導入処理を行った。４時間後、継代作業と同じように新しいＨＥＫ２９３細胞生育培地に交換し、コンフルエント状態に達するまで細胞を増殖させた。培地を取り除き、冷やしたＰＢＳ−で２回洗浄した。ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液で細胞を回収した。毎分３０００回転で５分間遠心分離した後上清を除き、ＨＥＫ２９３細胞抽出用緩衝液を加え、４℃で細胞成分を溶解させた。得られた溶解液を毎分１５，０００回転で遠心分離し、上清を細胞抽出液として得た。得られた細胞抽出液を各穴あたり０．０３μｇのタンパク量になるようにＰＫＡ反応緩衝液５０μＬに混合した溶液を用いて、実施例３と同様に、ＰＫＡ用基質ペプチドを固定化した９６穴マイクロタイタープレートでリン酸化反応を３０℃で１時間行い、実施例１と同様にして、リン酸化ペプチドを抗体１６により検出した（図６）。
図６より、本発明のペプチドアレイを用いて、細胞抽出液中に含まれるＰＫＡ活性を測定できることがわかった。
【００９２】
実施例７：Ｌ６培養細胞の細胞抽出液でのリン酸化反応の検出
５０ｍＬの滅菌済み試験管にＬ６細胞を入れ、３７℃に温めたＬ６細胞生育培地２０ ｍＬをゆっくりと加え、懸濁した。毎分１０００回転で５分間遠心分離して細胞を沈殿させ、上清を捨てた。Ｌ６細胞生育培地１５ｍＬを加えて細胞を再懸濁した。得られた懸濁液を細胞培養用Ｆ７５フラスコ（コーニング）に移し、二酸化炭素培養装置内で３７℃で培養した。約８０％コンフルエント状態で、以下のように継代を行った。フラスコ内の培地を捨て、１０ｍＬのＰＢＳ−で２回洗浄した。約１０ｍＬの細胞剥離液で室温下処理し細胞をはがした。Ｌ６細胞生育培地で細胞を回収し、毎分１０００回転で５分間遠心分離して細胞を沈殿させ、上清を捨てた。Ｌ６細胞生育培地を加えて細胞を再懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を使い、新しい細胞培養用Ｆ７５フラスコで同じように増殖させた。継代を繰り返し、必要量の細胞数に達したら分化を行った。継代の際と同じようにして得た所定の密度のＬ６細胞生育培地で懸濁した細胞を細胞培養用６穴プレート（SUMILON MS-8496F5）に１００μＬずつ分注して培養した。コンフルエント状態にして培地を完全に除き、Ｌ６細胞分化培地１００μＬに置換した。そのまま１〜３日間培養し、筋芽が筋管に分化したのを確認した後、９０μＬのＬ６細胞分化培地に交換した。ＡＩＣＡＲ(5-amino-4- imidazole carboxamide)とメトフォルミンを所定の１０倍濃度にＬ６細胞分化培地で希釈し、各ウェルに１０μＬずつ添加し２時間インキュベートした。２時間後、培地を取り除き、冷やしたＰＢＳ−で２回洗浄した。各ウェルあたり５０μＬのＬ６細胞抽出用緩衝液を加え、４℃で攪拌しながら細胞成分を抽出した。抽出物を毎分５０００回転で遠心分離し、上清を得た。作製した細胞抽出液を各穴あたり０．１μｇのタンパク量になるようにＡＭＰＫ反応緩衝液５０μＬに混合した溶液を用いて、実施例４と同様に、ＡＭＰＫ用基質ペプチドを固定化した９６穴マイクロタイタープレートでリン酸化反応を３０℃で１時間行い、実施例１と同様にしてリン酸化ペプチドを抗体１６により検出した（図７）。
図７より、本発明のペプチドアレイを用いて、ＡＩＣＡＲまたはメトフォルミンで誘導したＡＭＰＫ活性を測定できることがわかった。
【００９３】
実施例８：Ｃｙ３標識化抗体１６の緩衝溶液の調製
５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）で２倍に希釈した抗体１６をＣｙ３標識キット（アマシャムバイオサイエンス：コード番号PA33001）を用いて添付手順書に従ってＣｙ３標識化した。得られたＣｙ３標識化抗体１６をブロッキング緩衝溶液で１０００倍に希釈しＣｙ３標識化抗体１６の緩衝溶液とした。
【００９４】
実施例９：スライドガラス表面に固定化したペプチド基質を用いてのリン酸化検出
高密度化アミノ基導入コートＤＮＡマイクロアレイ用スライドガラス（松浪ガラス：品番SDM0011）に４−マレイミドブチル酸のＮ−スクシイミドエステル（CAS No. 80307-12-6: Fluka）の１００ｍＭのＤＭＦ溶液を室温下１２時間反応させた後、反応液をＤＭＦで洗い流した。さらに、ＤＭＦ、精製水、エタノールを用いて順に２回ずつ洗浄し、減圧室温下乾燥した。得られたスライドガラスにＤＮＡマイクロアレイ作製用アレイヤー（Genetic Microsystems：GMS417 Arrayer）を用いて０．３８μｍ間隔でＰＫＡ用基質ペプチドの１００μＭリン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐＨ７．２）を分注し固定化した。固定化したスライドガラスを室温下３時間静置した後、水、ＤＭＦ、水、エタノールで順に２回ずつ洗浄し、減圧室温下乾燥した。乾燥したスライドガラスをブロッキング緩衝溶液で室温下１時間ブロッキング処理した後、実施例３および実施例６と同様の方法でスライドガラス上でリン酸化反応を行った。ＰＫＡを使った場合は、スライドガラス１枚あたり１５０ｍＵの酵素量を、ＰＫＡおよびＧＦＰ発現細胞抽出液を使った場合は、スライドガラス１枚あたり０．１μｇのタンパク質量を用いた。３０℃で１時間反応させた後、スライドガラスをＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液および精製水で２回ずつ洗浄し、再度ブロッキング緩衝溶液で室温下１時間ブロッキング処理した。実施例８で作製したＣｙ３標識化抗体１６の緩衝溶液をスライドガラスに３０℃で１時間作用させた。ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で２回と精製水で５回洗浄を行った後、毎分５００回転の遠心操作を行い乾燥させた。得られたスライドガラスはＤＮＡマイクロアレイ用蛍光スキャナー（ScanArray 5000: GSI Lumonics）を用いて、励起波長（５４３ｎｍ）検出波長（５７０ｎｍ）で蛍光イメージング画像を取得した（図８）。
図８の写真は、左からそれぞれ、キナーゼを加えないコントロール〔Kinase(-)〕、PKA酵素を使った場合〔PKA(+)〕、PKA発現細胞抽出液を使った場合〔PKA Lysate(+)〕、GFP発現細胞抽出液を使った場合〔GFP Lysate(+)〕の結果を示す。マイクロタイタープレートを用いて作製したプレートアレイでの結果と同様に、スライドガラス上に作製したマイクロアレイ上でも、ＰＫＡ遺伝子を発現させた未精製の細胞抽出液を作用させることによって、精製されたＰＫＡ酵素を作用させた場合と同様に、ＰＫＡによるリン酸化反応が円滑に進行している状態が検出できた。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、これまで標準とされてきた放射化標識されたＡＴＰを用いたリン酸化検出方法に置き換わる新しいリン酸化検出方法ならびにその実施に使用される基質群およびペプチドアレイを提供する。さらに、より優れたポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体を作製することで、より高感度なリン酸化検出方法、ならびにこれに基づく診断方法やスクリーニング方法をも提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】リン酸化セリン残基の抗体認識反応を４５０ｎｍでの吸光度により定量 (ｎ＝１)した図である。抗体１〜抗体１６は、それぞれ、[表１−１]の各抗体を意味する。
【図２】リン酸化スレオニン残基の抗体認識反応を４５０ｎｍでの吸光度により定量 (ｎ＝１)した図である。抗体１１〜抗体１６は、それぞれ、[表１−２]の各抗体を意味する。
【図３−１】ＰＫＡによるセリン残基のリン酸化の抗体１６を使った検出を示す図である。ＰＫＡ １Ｕ／ｗｅｌｌ、３０℃で反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*、 * 平均値±標準誤差（ｎ＝３）
【図３−２】ＰＫＡによるスレオニン残基のリン酸化の抗体１６を使った検出を示す図である。ＰＫＡ １Ｕ／ｗｅｌｌ、３０℃で反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*、 * 平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【図４】ＡＭＰＫによるスレオニン残基のリン酸化の抗体１６を使った検出を示す図である。ＡＭＰＫ １０ ｍＵ／ｗｅｌｌ、３０℃で反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*， * 平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【図５】ＰＫＣによるスレオニン残基のリン酸化の抗体１６を使った検出を示す図である。ＰＫＣ ６．３ ｍＵ／ｗｅｌｌ、３０℃で１時間反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*， * 平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【図６】ＨＥＫ２９３細胞でＰＫＡとＧＦＰ遺伝子を発現させた細胞抽出液でのリン酸化反応の検出を示す図である。タンパク量０．０３μｇ／ｗｅｌｌ、３０℃で１時間反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*， * 平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【図７】Ｌ６細胞でのメトフォルミンとＡＩＣＡＲ刺激細胞抽出液でのリン酸化反応の検出を示す図である。 タンパク量０．１μｇ／ｗｅｌｌ、３０℃で１時間反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*， * 平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【図８】スライドガラス表面に固定化したペプチドアレイを用いて、リン酸化反応を蛍光イメージング画像で示した図である。 写真は、左からそれぞれ、キナーゼを加えないコントロール〔Kinase(-)〕、PKA酵素を使った場合〔PKA(+)〕、PKA発現細胞抽出液を使った場合〔PKA Lysate(+)〕、GFP発現細胞抽出液を使った場合〔GFP Lysate(+)〕の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化−脱リン酸化反応検出用基質群およびそれを用いた検出方法に関する。詳しくは、本発明は、Non-RI法でリン酸化−脱リン酸化反応を高感度に検出するペプチド性基質群およびそれを用いたリン酸化−脱リン酸化反応の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内のタンパク質は、様々な生理的条件下で生化学的修飾を受けることによってその性質を変化させている。リン酸化は、タンパク質の主要な翻訳後修飾反応の1つであり、その反応は瞬時かつ可逆的におこるため、タンパク質の活性／不活性をコントロールする基本的な素過程の1つとして、生体内で重要な役割を担っていることが推測される。実際、真核細胞においては細胞内タンパク質の多くはリン酸化されており、多くのシグナル伝達系において、タンパク質リン酸化が情報伝達の方法として広く用いられていることが知られている。
【０００３】
一般に、タンパク質がリン酸化反応、あるいは脱リン酸化反応を受けると、タンパク質を構成するアミノ酸残基の局所的な極性に変化が生じることにより、結果としてタンパク質の高次構造に基づく機能や活性度に変化を生じることにより、タンパク質の活性／不活性がコントロールされていると考えられている。このように、細胞内情報伝達に深く関わっているタンパク質リン酸化酵素の働きを調べることは、細胞機能を解析する上で大変重要である。さらに、医薬品探索研究やポストゲノム研究として注目されているプロテオームの研究にも関連し大変興味深い。プロテオーム解析のツールとして、タンパク質またはペプチドを基盤上に固定するマイクロアレイ技術が知られている（特許文献１および２、非特許文献１〜６）。
【０００４】
タンパク質リン酸化酵素（プロテインキナーゼ）は、タンパク質の特定の部位をリン酸化してその機能を変える働きをもち、その基質であるタンパク質のセリンまたはスレオニン残基をリン酸化する「セリン／スレオニンキナーゼ」と、チロシン残基をリン酸化する「チロシンキナーゼ」の２つに大別される。ここで、「チロシンキナーゼ」は細胞膜内あるいは近傍に存在し情報伝達の最上流に位置し細胞外の環境変化を直接検知する場合が多く、「セリン／スレオニンキナーゼ」は上流からの信号を受けて逐次的に情報伝達を行い、細胞機能の直接的な調節に関与する場合が多い。
【０００５】
プロテインキナーゼは、細胞外部からの刺激を細胞内部に伝達し、これらの刺激に対する細胞の応答に関与する。このように、プロテインキナーゼはリン酸化を通して、代謝、増殖、分化、情報伝達、運動などの多彩な細胞機能の調節を担っている。細胞内でのプロテインキナーゼは特定のタンパク質を基質として認識することで特異性の高いリン酸化反応を進行させ、これらリン酸化反応の逐次的反応の組み合わせとして、細胞外の環境変化や薬剤に対する応答として信号を伝達し細胞機能を調節している。遺伝子配列の解析から、約８００種類のプロテインキナーゼが存在して細胞内のシグナル伝達に関与していると予想されている。タンパク質リン酸化の異常は、癌、糖尿病、関節炎などの様々な疾患の原因または結果と考えられている。
【０００６】
一方、プロテインホスファターゼは、リン酸化されたタンパク質を基質として脱リン酸化を触媒する酵素であり、タンパク質リン酸化の可逆性を保障している。プロテインキナーゼは、それ自体がキナーゼの基質でもあり、スレオニン、セリン（ホスホリラーゼなど）、チロシン（srcなどガン遺伝子関連のタンパク質に例が多い）などのいずれかの残基がリン酸化されたプロテインキナーゼは、プロテインホスファターゼによって再び元の酵素に戻り、次の情報による活性化に備える。シグナル伝達経路の共通の特徴として、その反応の一過性がある。この一過性は、シグナル伝達分子の量や活性化状態の一過性の反映である。タンパク質のリン酸化は、ある場合には活性化を、ある場合には不活性化を引き起こす。実際、タンパク質の脱リン酸化反応が積極的なスイッチオンの役割を担っている場合も知られている。
【０００７】
プロテインキナーゼは、その基質特異性が高いことが特徴であるが、基質タンパク質の被リン酸化部位を含むアミノ酸配列からなるペプチド性部分を抽出したペプチドもまた基質としてリン酸化を受けることが広く知られている。そのため、プロテインキナーゼの反応性を調べる際には、ペプチド性基質を用いて調べることが可能である。
【０００８】
前記「プロテインキナーゼの反応性」は、その適当な基質を用いてリン酸化反応を行わせ、生成物であるリン酸化基質やＡＤＰの増加、あるいは出発物である基質やＡＴＰの減少を何らかの方法で計測することで判定が可能である。今日では、タンパク質リン酸化は、放射性核種32Ｐの取り込みを直接測定する方法か、または抗リン酸化タンパク質抗体を用いる方法が一般的である。
【０００９】
最近では、基質に含まれるリン酸化セリン残基、リン酸化スレオニン残基またはリン酸化チロシン残基を、抗体および表面プラズモン共鳴によって検出する方法（特許文献３）や、適当なキレート性検出試薬および表面プラズモン共鳴によって検出する方法（特許文献４）が注目されている。これらの方法では、放射性物質を取り扱う必要がなく操作性にも優れているが、抗体や検出試薬の認識能力に強く依存し、これらの認識能力を基とした間接的な検出と測定を行うことになる。そのため、認識能力の優れた抗体や検出試薬の開発が重要かつ不可欠となる。
【００１０】
チロシン残基のリン酸化の検出に関しては、タンパク質またはペプチド配列内のリン酸化チロシン残基を幅広く認識する多くの優れた抗リン酸化チロシン抗体が知られており、市販されている。そのため、それらの抗体を用いることでチロシンキナーゼの反応性は比較的容易に測定可能である。一方、セリン／スレオニンキナーゼの場合は、幅広くかつ一般的にリン酸化セリンあるいはリン酸化スレオニン残基を認識可能な優れた抗体は知られていない。そのため、抗体を使ってセリン／スレオニンキナーゼの反応性を調べる場合、特定のリン酸化タンパク質あるいはリン酸化ペプチドを特異的に認識する抗体をその都度作製して用いなければならず、セリン／スレオニンキナーゼの反応性を抗体により一般的かつ簡便に検出し測定する方法はほとんど知られていない。
【特許文献１】ＷＯ ０２／０８３９３３ Ａ２
【特許文献２】ＷＯ ０２／０８３８８４ Ａ２
【特許文献３】特開２００４−２８３１１４号公報
【特許文献４】特開２００４−３０９３０３号公報
【非特許文献１】M. Bettencourt-Dias, R. Giet, R. Sinka, A. Mazumdar, W. G. Lock, F. Balloux, P. J. Zafiropoulos, S. Yamaguchi, S. Winter, R. W. Carthew, M. Cooper, D. Jones, L. Frenz, D. M. Glover. Nature. 2004, 432, 980-7.
【非特許文献２】G. Manning, D. B. Whyte, R. Martnez, T. Hunter, S. Sudarsanam. Science. 2002, 298, 1912-1934.
【非特許文献３】S. J. Lee, S. Y. Lee. Anal. Biochem. 2004, 330, 311-316.
【非特許文献４】R. C. Panicker, X. Huang, S. Q. Yao. Comb. Chem. High Throughput Screen. 2004, 7, 547-56.
【非特許文献５】D. S. Y. Yeo, R. C. Panicker, L. P. Tan, S. Q. Yao. Comb. Chem. High Throughput Screen. 2004, 7, 213-221.
【非特許文献６】B. T. Houseman, J. H. Huh, S. J. Kron, M. Mrksich. Nature Biotech. 2002. 20. 270-274.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述の理由から、現在においては、セリン／スレオニンキナーゼのアッセイに関しては、放射性核種の32Ｐの取り込みを直接測定する方法が一般的となっているが、実験施設や作業環境に制約があり、また実験者の放射能被爆の問題もある為、あまり大規模なハイスループット（high throughput）解析には適さないという問題がある。したがって、大規模なプロテオーム解析を実施して疾患とタンパク質リン酸化カスケードの関連を調べる上で、放射化標識されたＡＴＰ等を用いないNon-RI法で、タンパク質のリン酸化／脱リン酸化を高感度に検出するアッセイを可能にすることが重要な課題となっている。
本発明の目的は、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼの反応性を簡便に測定可能な手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討した結果、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼの基質として以下に示すような人工ペプチドを用いることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
【００１３】
〔１〕 プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも１種含有するプロテインキナーゼの基質群。
〔２〕 プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をリン酸化スレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも１種さらに含有する、前記〔１〕に記載の基質群。
〔３〕 前記人工ペプチド基質が５〜３０のアミノ酸残基を有するものである、前記〔１〕または〔２〕に記載の基質群。
〔４〕 前記プロテインキナーゼがセリン／スレオニンキナーゼである前記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の基質群。
〔５〕 前記セリン／スレオニンキナーゼがｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡである、前記〔４〕に記載の基質群。
〔６〕 前記セリン／スレオニンキナーゼがプロテインキナーゼＣである、前記〔４〕に記載の基質群。
〔７〕 前記セリン／スレオニンキナーゼがＡＭＰ活性化プロテインキナーゼである、前記〔４〕に記載の基質群。
〔８〕 前記人工ペプチド基質が配列番号１１〜２９９に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列を有するものである前記〔１〕〜〔７〕いずれかに記載の基質群。
〔９〕 前記〔１〕〜〔８〕いずれかに記載の基質群を固定してなるペプチドアレイ。
〔１０〕 前記〔９〕に記載のペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、リン酸化および／または脱リン酸化反応を検出する方法。
〔１１〕 前記抗リン酸化スレオニン抗体がポリクローナル抗体である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕 下記工程：
被験者由来の生体試料からプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼを含む画分を調製する工程；
前記画分と前記〔９〕に記載のペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならびに
前記検出結果を、対照における検出結果と比較し、疾患の有無に応じて変化するプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含むプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの活性化および／または不活化に基づく疾患の診断方法。
〔１３〕 前記疾患が癌、悪性腫瘍、糖尿病、糖尿病性合併症、代謝性疾患、自己免疫疾患、免疫異常疾患、免疫不全、神経変性疾患、虚血性疾患、内分泌疾患、肝疾患または骨疾患である前記〔１２〕に記載の診断方法。
〔１４〕 下記工程：
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料と、前記〔９〕に記載のペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならびに
前記検出結果を被検物質を含まない試料における検出結果と比較し、被検物質の有無により変化するプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含む、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のプロテインキナーゼの基質群によると、適切に設計されたアミノ酸配列に基づいて合成した人工基質を含むことから、Non-RI法で高感度にタンパク質のリン酸化または脱リン酸化を測定可能な一連の基質を提供することが可能となり、さらにコンビナトリアルケミストリーの技術を応用すれば、ペプチド基質ライブラリーを作製することができるため、プロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼのハイスループット解析に供することができる。
本発明のペプチドアレイおよびそれを用いたリン酸化および／または脱リン酸化の検出方法によると、プロテオーム解析の手段として、ハイスループット解析が可能であるとともにリン酸化と脱リン酸化を１つのアレイで同時に検出することも可能である。
本発明の診断方法によると、セリン／スレオニンキナーゼによるリン酸化および／またはプロテインホスファターゼによる脱リン酸化を高感度かつ迅速に検出することが可能であるので、かかるリン酸化および／または脱リン酸化が関与する疾患の有無を迅速に判定することできる。
本発明のスクリーニング方法によると、セリン／スレオニンキナーゼによるリン酸化またはプロテインホスファターゼによる脱リン酸化を高感度かつ迅速に検出することが可能であるので、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を促進または阻害する物質を効率よく選択することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明においてプロテインキナーゼとは、大別してセリン／スレオニンキナーゼとチロシンキナーゼとを含む概念であるが、以下、これまで有用なキナーゼ活性の測定方法が開発されていなかったセリン／スレオニンキナーゼを中心に述べる。
【００１６】
セリン／スレオニンキナーゼとしては、アミノ酸配列中のセリンまたはスレオニンをリン酸化する酵素であれば特に限定されるものではないが、例えば、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）、カルシウム依存性プロテインキナーゼ、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ、カゼインキナーゼ、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ、Ｒａｆキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）などがあげられ、前記カルシウム依存性プロテインキナーゼとしては、ホスホリラーゼキナーゼ、ミオシン軽鎖キナーゼ、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ、リン脂質依存性プロテインキナーゼ（プロテインキナーゼＣ：ＰＫＣ）などがあげられる。これらの中でも、細胞内における役割が解明されつつあり、疾患との関連が示唆されているＰＫＡ、ＡＭＰＫ、ＰＫＣなどが好ましい。
【００１７】
本発明においてプロテインホスファターゼとは、リン酸化セリン／スレオニン残基、リン酸化チロシン残基またはリン酸化セリン／スレオニン／チロシン残基のリン酸エステル結合を加水分解する酵素をいい、好ましくはリン酸化セリン／スレオニン残基のリン酸エステル結合を加水分解する酵素である。具体的には、リン酸化されたセリン／スレオニン残基に特異的なホスファターゼとしては、ＰＰ１、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２ＢおよびＰＰ２Ｃなどのホスファターゼがあげられる。これらは、それぞれ基質特異性や阻害剤に対する感受性、金属イオン要求性の違いによって分類されている。ＰＰ２Ｃは単量体酵素であるが、ＰＰ１、ＰＰ２ＡおよびＰＰ２Ｂは、調節サブユニットと活性サブユニットで構成される複合体を形成し、細胞内での局在性は、その調節サブユニットとの相互作用により調節されていると言われている。タイプ２Ｂは、一般に、カルシニューリンともよばれている。一方、リン酸化されたチロシン残基を特異的に脱リン酸化するホスファターゼとしては、細胞膜貫通ドメインを持つ受容体型と、それらをもたない細胞質型が存在し、それぞれに分子構造や活性調節機構を異にする多様な分子種を含んでいる。またリン酸化されたセリン／スレオニン／チロシン残基を脱リン酸化するホスファターゼとしても、基質特異性を異にする複数の分子種が存在することが知られている。
【００１８】
本発明において基質とは、プロテインキナーゼが認識するアミノ酸配列を含有するペプチドまたはタンパク質をいう。前記ペプチドまたはタンパク質を構成するアミノ酸としては、天然アミノ酸として知られるαアミノ酸、βアミノ酸もしくはγアミノ酸に加えて、それらを化学的に修飾したもの、さらにはアミノ酸のアミノ基または水酸基とカルボキシル基やスルフォニル基やフォスフォリル基等を介してペプチド様化学結合を行うことが可能な分子量約８００以下の化学構造を有する部分化学構造体もその範囲に含まれる。
【００１９】
前記基質としては、人工的に適切なアミノ酸配列を設計、合成可能で、かつ、保存性および操作性に優れているペプチド基質が好ましい。
【００２０】
本発明において天然に存在する基質とは、プロテインキナーゼの基質として知られているタンパク質を構成するアミノ酸配列の全部または一部からなるものをいい、セリン／スレオニン残基、好ましくはセリン／スレオニンキナーゼが認識してリン酸化可能なセリン／スレオニン残基を１つまたは複数含むアミノ酸配列からなるものである。天然に存在する基質におけるアミノ酸残基の数としては、５〜タンパク質の全長のアミノ酸残基の数であり、好ましくは５〜３０、より好ましくは１０〜２０である。
【００２１】
本発明において人工ペプチド基質とは、前記天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基に置換したものをいい、好ましくはセリン／スレオニンキナーゼが認識してリン酸化可能なセリン残基をスレオニン残基またはリン酸化スレオニン残基で置換したものである。人工ペプチド基質は、酵素の特異性や検出の容易性を担保するためには、セリン／スレオニンキナーゼが認識可能なセリン残基をスレオニン残基（またはリン酸化されたスレオニン残基）に置換した部位を１つ含むものであることが好ましい。人工ペプチド基質中のアミノ酸残基の数としては、セリン／スレオニンキナーゼが認識できる程度のペプチド長となれば特に限定されるものではないが、通常５〜５００、好ましくは５〜３０、より好ましくは１０〜２０である。
【００２２】
なお、前記人工ペプチド基質は、前記天然に存在する基質から設計されたものであるから、天然に存在する基質中のセリン／スレオニンキナーゼが認識できる程度のアミノ酸残基からなるペプチド部分を含有していればよく、人工ペプチド基質および天然に存在する基質のアミノ酸残基の数が互いに一致する必要はない。
【００２３】
本発明のプロテインキナーゼの基質群は、前記人工ペプチド基質を少なくとも１種含有することを特徴とする。「セリン／スレオニンキナーゼ」は、タンパク質性またはペプチド性基質のセリンおよび／またはスレオニン残基をリン酸化するが、セリン残基とスレオニン残基ではそれらの反応性に若干の差はあるものの共にリン酸化を受けるものと考えられる。そこで、本発明では、セリン／スレオニンキナーゼのリン酸化能を調べる目的のためにセリン／スレオニンキナーゼの基質として被リン酸化セリン残基をスレオニン残基に置換した人工ペプチド基質を用いる。あるいは、プロテインホスファターゼの脱リン酸化能を調べる目的のために、前記被リン酸化セリン残基をリン酸化スレオニン残基に置換した人工ペプチド基質を用いてもよい。
【００２４】
本発明の基質群に含まれる基質の数は、前記人工ペプチド基質を少なくとも１種含有していれば特に限定されるものではないが、好ましくは、１〜１０００００、より好ましくは２〜５００００、さらにより好ましくは１０〜５０００である。かかる範囲内の基質群は、ペプチドアレイまたはペプチドチップとして、１個の担体上に固定化することが可能である。
【００２５】
本発明の基質群は、そのすべてが前記人工ペプチド基質であってもよく、前記人工ペプチド基質と天然に存在する基質とを含んでいてもよく、本発明の検出方法等に用いる場合に、陽性対照および／または陰性対照となる人工ペプチド基質または天然の基質を含んでいてもよい。陽性対照および陰性対照となる人工ペプチド基質には、セリン残基をリン酸化スレオニン残基またはアラニン残基に置換した人工ペプチド基質も含まれる。
【００２６】
人工ペプチド基質の具体的な配列は、配列番号１１〜２９９に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列が好ましい。かかるアミノ酸配列を全部用いてもよく、あるいは、対象とするプロテインキナーゼに応じて適宜組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
本発明の人工ペプチド基質は、天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中の被リン酸化セリン残基をスレオニン残基またはリン酸化スレオニン残基に置換することによって調製することができる。以下、かかる人工ペプチド基質配列の設計と調製方法について説明する。
【００２８】
基質配列設計の方法としては、ゲノム情報またはタンパク質情報からセリン／スレオニンキナーゼの基質となるタンパク質の被リン酸化部位を含むペプチド断片を予測し抽出する。抽出したペプチド断片を、セリン／スレオニンキナーゼのペプチド性基質配列として既に知られているものをも含め、「ペプチド基質の基本配列」と定義して用いる。
【００２９】
次に、前記ペプチド基質の基本配列の被リン酸化部位（セリン残基）を全てスレオニン残基に置換し、その他のアミノ酸残基は基本配列と同様にしてもよいし、適当な方法で一部のアミノ酸残基をさらに他のアミノ酸残基に置換してもよい。さらなる置換は、セリン／スレオニンキナーゼの人工ペプチド基質の製造、固定化等に有利な置換基を導入するために行われる。このように人工的に配列設計されたペプチドを、基質群（集合体あるいはペプチド基質ライブラリー）として供する。配列設計するペプチド配列は、化学合成の効率と活性発現を担保するために、４０アミノ酸残基以下とすることが好ましい。
【００３０】
前記ライブラリーには、被リン酸化部位をリン酸化スレオニンに置換した基質を少なくとも１種含有してもよい。リン酸化スレオニン置換した基質は、リン酸化の陽性対照となるばかりでなく、プロテインホスファターゼの基質ともなり、リン酸化／脱リン酸化を同時に検出することができるので好ましい。
【００３１】
「配列設計されたペプチド性基質の集合体（ペプチド性基質ライブラリー）」は、一般的な化学的ペプチド合成方法（例えば、Fmoc法での固相合成等）により化学合成されて供与される。ここで重要な点は、天然に存在する被リン酸化部位としてのセリン残基を敢えてスレオニン残基に置換して配列設計し、化学合成することである。
【００３２】
上記の方法によって設計し化学合成した人工ペプチド基質を含有する基質群を、溶液状態または「固相状態」でセリン／スレオニンキナーゼによるリン酸化反応の基質として用いる。キナーゼ反応の生成物であるペプチド性リン酸化基質を抗リン酸化スレオニン抗体で認識させ検出することで、セリン／スレオニンキナーゼの種々の条件下での反応性を検出し測定することができる。逆に、ホスファターゼ反応の生成物である脱リン酸化基質が抗体で検出されなくなることで、プロテインホスファターゼの種々の条件下での反応性、好ましくはセリン／スレオニンキナーゼとの競合性を検出し測定することができる。
【００３３】
ここでいう「固相状態」とは、ペプチド性基質を種々の固相担体に直接またはリンカーと呼ばれる適当な化学構造体を介して結合した状態をいう。固相担体としては、有機高分子もしくは無機高分子材料（プラスチック等）、ガラス、金属等で作製された平板、試験管（生化学分野で一般的にプレートと呼称されるものを含む）、薄膜、微粒子等を指す。
【００３４】
「リンカー」としては、特に限定されるものではないが、例えば、酸素、窒素、硫黄またはリン原子を含む鎖状または環状構造を含む炭化水素基などがあげられる。
【００３５】
「固相担体とペプチド性基質との直接またはリンカーを介した結合」としては、共有結合、静電的結合、水素結合、疎水結合、吸着、接着等が含まれる。当然ながら、生化学分野で９６穴プレート、３８４穴プレート、１５３６穴プレートと一般的に呼ばれている実験器材にペプチド性基質を結合させたものやスライドガラスや金薄膜上に微細格子状にペプチド性基質を結合させたペプチドアレイも本発明における「固相状態」の範疇に含まれる。
【００３６】
本発明においては、本発明の基質群を固定してなるペプチドアレイが好ましく用いられる。
【００３７】
本発明のリン酸化および／または脱リン酸化反応を検出する方法は、前記ペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする。具体的には、前記ペプチドアレイを用いることで多様なセリン／スレオニンキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの反応を行い、抗リン酸化スレオニン抗体を用いることで、多様なセリン／スレオニンキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの反応性を幅広くかつ同時に検出する。
【００３８】
前記抗リン酸化スレオニン抗体は、リン酸化スレオニン残基を認識するものであれば特に限定されるものではなく、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でもよいが、基質の配列に限定されずにリン酸化スレオニン残基を認識する可能性が高いという観点から、ポリクローナル抗体が好ましい。かかる抗体は、公知の方法（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜11.13(2000)；Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）により製造することができる。あるいは、市販の抗体の中から本発明の目的に適うものを適宜選択することもできる。好適な市販品の抗体としては、ポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体（Zymed）などがあげられる。
【００３９】
さらに、ポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体を用いれば、リン酸化スレオニン残基を含むペプチド性基質配列のみならずリン酸化セリン残基を含むペプチド性配列をも幅広く一般的に検出することが可能である。リン酸化セリン残基を含むペプチド配列に対する抗リン酸化セリン抗体の親和力は、抗リン酸化スレオニン抗体の親和力よりも低い傾向がある。
【００４０】
反応性を検出する「プロテインキナーゼ」としては、生体試料から抽出した画分中に含まれるキナーゼ；遺伝子組み換えにより発現精製されたキナーゼ；プロテインキナーゼ遺伝子からタンパク質として発現されたプロテインキナーゼであって精製されることなく細胞抽出液もしくは細胞破砕液として適当な緩衝溶液に可溶化された状態のキナーゼ；細胞培養時に分子量約１０００以下の化学物質（医薬品、生理活性化合物を含む）、ペプチド、核酸、糖鎖等を培地に添加して刺激を与えることで細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液中に含まれるキナーゼ；または種々の機能既知もしくは未知遺伝子を導入することで、細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液に含まれるキナーゼなどがあげられる。
【００４１】
反応性を検出する「プロテインホスファターゼ」としては、生体試料から抽出した画分中に含まれるホスファターゼ；遺伝子組み換えにより発現精製されたホスファターゼ；プロテインホスファターゼ遺伝子からタンパク質として発現されたプロテインホスファターゼであって精製されることなく細胞抽出液もしくは細胞破砕液として適当な緩衝溶液に可溶化された状態のホスファターゼ；細胞培養時に分子量約１０００以下の化学物質（医薬品、生理活性化合物を含む）、ペプチド、核酸、糖鎖等を培地に添加して刺激を与えることで細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液に含まれるホスファターゼ；または種々の機能既知もしくは未知遺伝子を導入することで、細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液に含まれるホスファターゼなどがあげられる。
【００４２】
本発明において、セリン／スレオニンキナーゼの基質配列内のセリン残基とスレオニン残基を互いに置換しあった配列を準備し、それらの反応性の違いを比較検討した結果、セリン／スレオニンキナーゼが基質ペプチド配列を認識する場合には、被リン酸化部位を含むある一定の周辺配列を認識し局所的な被リン酸化部位としてのセリンあるいはスレオニン残基の構造の違いを厳密に区別してはいないものと考えられる。
【００４３】
本発明の検出方法は、本発明のペプチドアレイに前記検出対象の「セリン／スレオニンキナーゼ」および／または「プロテインホスファターゼ」を含む溶液を加えて、キナーゼ反応および／またはホスファターゼ反応が進行する条件下でインキュベートする。かかる工程を、以下、接触工程とも称する。前記条件は、検出対象のキナーゼまたはホスファターゼに応じて適宜設定することができるが、通常、０．０５〜０．５ｍＭのＡＴＰ存在下、ｐＨ６．５〜７．５、温度３０〜４０℃で、５分〜２４時間である。なお、プロテインキナーゼおよびプロテインフォスファターゼの分子種は、いずれも大変多岐に渡るため、単独の阻害剤としては、それぞれの全ての分子種に対して十分に効果的な阻害効果を示す汎用的なものは見当たらない。したがって、キナーゼ反応のみを進行させる場合は、それぞれ特異性を異にする公知の複数の種類のプロテインホスファターゼ阻害剤を溶液中に共存させることが好ましく、また、ホスファターゼ反応のみを進行させる場合には、それぞれ特異性を異にする公知の複数の種類のキナーゼ阻害剤を溶液中に共存させることが好ましい。また、いずれの反応を行う場合でも、さらに公知のプロテアーゼ阻害剤を溶液中に共存させることが好ましい。
【００４４】
前記ホスファターゼ阻害剤としては、例えば、オカダ酸、カリキュリンＡ、トウトマイシンなどがあげられ、前記キナーゼ阻害剤としては、ＰＫＣに比較的特異性の高い Calphostin C、 Hypericin、 Phloretin、 H-7 等；ＰＫＡに比較的特異性の高い KT5720 等； ＰＴＫに特異性の高い Curcumin、 AG1024 等；カルモジュリンキナーゼに特異性の高い HA1077、 Lavendustin C などがあげられる。前記プロテアーゼ阻害剤としては、ＰＭＳＦ（phenylmethanesulfonyl fluoride）、ロイペプチン（leupeptin）、アプロチニン(aprotinin)、ペプスタチン（pepstatin）、Ｅ−６４、ＡＥＢＳＦ (4-(2-Aminoethyl)-bezenesulfonylfluoride)、ＤＦＰ（diisopropyl fluorophosphate）、ＺＰＣＫ（N-carbobenzoxy-L-phenylalanine chloromethyl ketone）などがあげられる。以上は例示的に挙げたにすぎず、今日では、数多くのホスファターゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤が市販されているので、通常の知識を有する当業者であれば、それらの市販された特異性の異なる複数の試薬を適宜組み合わせてカクテルとして使用することにより、容易に目的を達成することができる。
【００４５】
次に、前記キナーゼおよび／またはホスファターゼ反応が終了した後、抗リン酸化スレオニン抗体を用いて、ペプチドアレイ上のリン酸化スレオニンの有無を検出する。
【００４６】
検出手段としては、ペプチドアレイ上のリン酸化スレオニンに対する抗リン酸化スレオニン抗体の認識能を検出可能な適当な物理化学量に変換する手段をとる。具体的には、抗体を蛍光標識化することで蛍光強度に変換すること、化学発光色素を発する酵素を結合させた２次抗体（抗リン酸化スレオニン抗体の非可変部位を認識する）を用いて発光強度や吸光強度に変換すること、抗体結合による分子量増加分による表面プラズモン共鳴強度に変換すること等があげられる。
【００４７】
例えば、マイクロタイタープレートを用いて作製したプレートアレイでセリン／スレオニンキナーゼの反応性を測定する手段は、「酵素結合抗体法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）」である。このＥＬＩＳＡを応用した本発明の検出方法を、より詳細に説明する。マイクロタイタープレートとしてアミノコートプレート（住友ベークライト、コーニング製）を用い、リンカー構造としてグルタルアルデヒドを介して本発明のペプチド基質群を固定化する。牛血清アルブミン等でブロッキング操作を行った後、対象とするセリン／スレオニンキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼによるリン酸化および／または脱リン酸化反応を固相上で行う。反応液を除いた後、洗浄操作を繰り返し、１次抗体としてポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体（Zymed）等でリン酸化スレオニン残基を認識させる。続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合性２次抗体等で１次抗体を認識させ、ペルオキシダーゼ反応による発色を測定する。
【００４８】
別の態様として、スライドガラスを用いて作製したペプチドアレイでのセリン／スレオニンキナーゼの反応性を測定する手段は、前記ＥＬＩＳＡと同様である。ただし、酵素による発色反応を測定するのではなく、蛍光標識化された抗体を用いて蛍光強度を測定することが好ましい。より詳細に説明すると、ガラス表面がアミノ修飾されたＤＮＡマイクロアレイ用スライドガラスを基本基板（例えば、松浪ガラス製高密度アミノ修飾スライドガラス）として用いる。これに対して、両末端にカルボン酸を有する直鎖型リンカーを活性エステルとし、基本基板に作用させる。その結果、ガラス表面に活性エステル基を有するスライドガラスが作製される。一方、ペプチド性基質のＮ末端にはシステイン残基を導入したものを合成し準備しておく。ペプチド性基質をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、ＤＮＡマイクロアレイ作製用アレイヤーで微細格子状に微量分注（約１ｎＬ／スポット）する。ガラス表面の活性エステルとペプチド性基質のＮ末端のシステイン残基が位置選択的に反応し、ペプチド性基質が微細格子状にスライドガラスに固定化される。過剰の溶液を洗い流した後、大部分のガラス表面を占める活性エステルを化学的にブロッキングする。即ち、ブロッキング剤として適度に親水性と親油性とが制御された性質を持ち１級アミノ基を有する化学構造体を作製し、ペプチド性基質が微細格子状に固相化されたスライドガラス表面全体に作用させる。このことで、キナーゼまたはホスファターゼによるリン酸化／脱リン酸化反応と抗体反応が円滑に行われ得るペプチドマイクロアレイが作製される。作製されたマイクロアレイを、プレートアレイと同様に牛血清アルブミン等でブロッキングし、対象とするセリン／スレオニンキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼによるリン酸化／脱リン酸化反応をマイクロアレイ上で行う。反応液を除いた後、洗浄操作を繰り返し、蛍光標識化されたポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体（Zymed）等でリン酸化スレオニン残基を認識させる。過剰の抗体溶液を洗い流し乾燥させた後、ＤＮＡマイクロアレイ解析用蛍光スキャナーで蛍光強度を測定することで、対象とするセリン／スレオニンキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの反応性を調べることが可能となる。
【００４９】
本発明の検出方法において、プロテインホスファターゼの反応性は、抗リン酸化スレオニン抗体によって認識され得るリン酸化スレオニン残基に置換したペプチド基質の量を、ホスファターゼの添加前後において比較定量することにより可能である。さらに、例えば、反応液にプロテインキナーゼとプロテインホスファターゼが共存することもあり得るが、この場合は両酵素が共に反応しうる条件下で、酵素間の競合反応を測定することも可能である。その際、それぞれの特異的な配列を有する基質について、前述の特定のキナーゼ阻害剤やホスファターゼ阻害剤を適宜添加した場合と無添加の場合の反応性を比較することによって、それらの酵素間の関係を詳細に解析できる可能性がある。
【００５０】
本発明の検出方法により、
（１） 単離精製されたセリン／スレオニンキナーゼのペプチド性基質を見いだすこと
（２） セリン／スレオニンキナーゼを適当な細胞で遺伝子から発現させ、単離精製することなく細胞抽出液のまま使用しペプチド性基質を見いだすこと
（３） 細胞培養の際に薬剤刺激、対象遺伝子の導入に対する細胞の応答や細胞機能変化をリン酸化反応変化として検出可能なペプチド性基質を見いだすこと
が可能である。
【００５１】
上記のペプチド性基質を見いだす際に、ペプチドアレイ上の多数のペプチド性基質は、単離精製セリン／スレオニンキナーゼ、遺伝子導入細胞の細胞抽出液、薬剤刺激細胞の細胞抽出液といったリン酸化条件に応答する形でリン酸化反応性を示し、あるパターンを与える。この得られたリン酸化パターンにより元の単離精製セリン／スレオニンキナーゼの機能、遺伝子導入に用いた遺伝子の機能、薬剤刺激をかけた刺激薬剤の機能を定義づけることが可能となる。ここでは、このような機能の定義づけを「リン酸化プロファイリング（Phosphorylation Profiling）」と称する。
【００５２】
本発明のプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの活性化および／または不活化に基づく疾患の診断方法は、下記工程：
被験者由来の生体試料からプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼを含む画分を調製する工程；
前記画分と前記ペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出し、対照と比較する工程；ならびに
前記比較結果に基づき、疾患の有無に応じて変化するプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含むことを特徴とする。
【００５３】
前記診断対象となる疾患としては、癌、悪性腫瘍、糖尿病、糖尿病性合併症、代謝性疾患、リウマチや関節炎等の自己免疫疾患、免疫不全やアトピー性疾患などの免疫異常疾患、アルツハイマー病、ハンチントン病、プリオン病などの神経変性疾患、肥大性心疾患、脳梗塞、心筋梗塞、肝硬変等の虚血性疾患、内分泌疾患、肝疾患、骨疾患等の様々な疾患があげられるが、これらに限定されない。
【００５４】
被験者由来の生体試料としては、特に限定されるものではないが、血液、尿、粘膜、各種組織などがあげられる。
【００５５】
前記生体試料からプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼを含む画分の調製は、自体公知のタンパク質の精製方法により行うことができる。生体試料が細胞の場合、細胞抽出液、細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分などの調製が可能である。
【００５６】
前記画分と前記ペプチドアレイとの接触工程は、前記本発明の検出方法で記載したとおりである。
【００５７】
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出する工程は、前記したとおりである。
【００５８】
次に、比較工程において、前記検出工程で得られた結果を対照と比較する。ここで、対照としては、正常者由来の生体試料を被験者由来の生体試料の場合と同様にして前記検出工程に供して得られた結果；予め正常範囲となる基準のリン酸化または脱リン酸化を決定しておいた基準などがあげられる。比較結果は、特定の基質のリン酸化または脱リン酸化の有無として得られる。それぞれの基質のリン酸化または脱リン酸化の有無と疾患との関連を調べることにより、疾患の有無で反応性の異なっている特定の基質のアミノ酸配列を同定することが可能となる。そして、タンパク質配列データベースが整備されてきた今日では、それらの配列をクエリーとして既存の配列データベースをホモロジーサーチすることによって、当該配列に相当する部分配列を含むタンパク質を同定し、その実態を解明できる可能性がある。それらの疾患関連タンパク質は、特定のプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼが作用する標的として機能しており、例えば、治療薬開発におけるスクリーニング系に利用できる可能性がある。
【００５９】
最後に、判定工程において、前記比較結果に基づき、疾患の有無に応じて変化するプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼ活性を判定する。ここで、あらかじめ精製されたプロテインキナーゼまたはフォスファターゼによる同一基質群の反応性を確認しておくことで、疾患の有無で反応性が変化しているプロテインキナーゼまたはフォスファターゼを同定することが可能となる場合も有り得る。
【００６０】
これまでに特定の疾患と特定のタンパク質のリン酸化との関連については、多くの研究がなされているが、それらを制御するキナーゼやフォスファターゼの実態については、必ずしも明確になっていない場合が多い。例えば、アルツハイマー病においては、tau タンパク質の過剰かつ異常なリン酸化が神経変性の引き金となることを示唆する報告が多いが、実際にどのような制御因子がtau タンパク質のリン酸化に関与しているかについては、諸説あって未だに解明されていない。また、Pin 1タンパク質のリン酸化と神経変性疾患との関連や、p53 や Myc 、EGFRのリン酸化と癌、悪性腫瘍との関連を示唆する報告も多いが、リン酸化の生理的意味については、必ずしもよく理解されてはいない。本発明の方法は、プロテオーム技術の網羅的方法として利用されることにより、これらの疾患特異的な重要な分子メカニズムを解明する上での有力な手段を提供することができる。
【００６１】
本発明のプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法は、下記工程：
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料と、前記ペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出し、前記検出結果と被検物質を含まない試料における検出結果とを比較する工程；
被検物質の有無により変化するプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含むことを特徴とする。
【００６２】
前記被検物質としては、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
【００６３】
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料としては、生体試料から抽出した画分中に含まれるキナーゼまたはホスファターゼに被検物質を添加したもの；遺伝子組み換えにより発現精製されたキナーゼまたはホスファターゼに被検物質を添加した試料；プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ遺伝子からタンパク質として発現されたキナーゼまたはホスファターゼであって精製されることなく細胞抽出液もしくは細胞破砕液として適当な緩衝溶液に可溶化された状態のキナーゼまたはホスファターゼに被検物質を添加した試料；細胞培養時に被検物質を培地に添加して刺激を与えることで細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液中に含まれるキナーゼまたはホスファターゼ；または種々の機能既知もしくは未知遺伝子を導入することで、細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液に含まれるキナーゼまたはホスファターゼに被検物質を添加した試料などがあげられる。
【００６４】
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料と、ペプチドアレイとの接触工程は、前記本発明の検出方法で記載したとおりである。
【００６５】
プロテインキナーゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法の場合、ペプチドアレイにはスレオニン残基を含むペプチド基質を固定させ、陽性対照としてリン酸化スレオニン残基を含むペプチド基質を固定させたものを用いることが好ましい。次いで、検出工程において、接触工程前後のペプチドアレイについて抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドを定性的または定量的に検出し、比較工程において、前記検出結果と被検物質を含まない試料における検出結果とを比較する。
【００６６】
プロテインホスファターゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法の場合、ペプチドアレイにはリン酸化スレオニン残基を含むペプチド基質を固定させ、陽性対照としてスレオニン残基を含むペプチド基質を固定させたものを用いることが好ましい。次いで、検出工程において、接触工程前後のペプチドアレイについて抗リン酸化スレオニン抗体を用いたリン酸化ペプチドの検出を介して、脱リン酸化により検出されなくなったペプチド基質を定性的または定量的に検出し、比較工程において、前記検出結果と被検物質を含まない試料における検出結果とを比較する。
【００６７】
最後に、判定工程において、被検物質の有無により変化するプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を判定する。プロテインキナーゼ活性は、抗リン酸化スレオニン抗体により検出されるペプチド基質の数および検出強度で示すことができる。プロテインホスファターゼ活性は、抗リン酸化スレオニン抗体により検出されなくなったペプチド基質の数および検出強度で示すことができる。
【００６８】
前記判定工程において、プロテインキナーゼ活性が促進されている場合、被検物質は、プロテインキナーゼの活性化を介した疾患の治療剤の候補として選択することができる。プロテインキナーゼ活性が阻害されている場合、被検物質は、プロテインキナーゼ活性の抑制化を介した疾患の治療剤の候補として選択することができる。被検物質は、プロテインキナーゼ調節剤または研究用試薬としても有用である。あるいは、前記判定工程において、プロテインホスファターゼ活性が促進されている場合、被検物質は、プロテインホスファターゼの活性化を介した疾患の治療剤の候補として選択することができる。プロテインホスファターゼ活性が阻害されている場合、被検物質は、プロテインホスファターゼ活性の抑制化を介した疾患の治療剤の候補として選択することができる。被検物質は、プロテインホスファターゼ調節剤または研究用試薬としても有用である。
【実施例】
【００６９】
次に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。なお、本実施例において市販のキットあるいは試薬を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。本実施例で汎用的に使用した試薬、培地、緩衝溶液を以下に記す。
【００７０】
ペプチド基質
被リン酸化部位としてスレオニンまたはセリン残基を含みＮ末端にシステイン残基を含む１０から１８アミノ酸からなるペプチド配列を通常のFmoc法による化学合成を行い使用した。
以下の１０配列は、合成した粗精製品を逆相クロマトグラフにより精製を行い使用した。pS*はリン酸化セリン残基、pT*はリン酸化スレオニン残基を示す。
【００７１】
ＰＫＡ用基質ペプチド
Kemptide(A): CGGLRRAALG-NH2 （配列番号１）
Kemptide(S): CGGLRRASLG-NH2（配列番号２）
Kemptide(T) : CGGLRRATLG-NH2（配列番号３）
Kemptide(pS*): CGGLRRA(pS*)LG-NH2（配列番号４）
Kemptide(pT*) : CGGLRRA(pT*)LG-NH2（配列番号５）
ＡＭＰＫ用基質ペプチド
SAMA: CGGHMRSAMAGLHLVKRR-NH2（配列番号６）
SAMT: CGGHMRSAMTGLHLVKRR-NH2（配列番号７）
ＰＫＣ用基質ペプチド
IQAA: CGGAAKIQAAFRGHMARKK-NH2（配列番号８）
IQAT: CGGAAKIQATFRGHMARKK-NH2（配列番号９）
IQA(pT*): CGGAAKIQA(pT*)FRGHMARKK-NH2（配列番号１０）
【００７２】
以下に示す２８９配列は、合成した粗精製品を精製することなく使用した。pTはリン酸化されていてもよいスレオニン残基を示す。
PT001: CGGHMRSAM(pT)GLHLVKRR （配列番号１１）
PT002: CGGAMARAA(pT)AAALARRR （配列番号１２）
PT003: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号１３）
PT004: CGGKSGELLA(pT)WAGSPPY （配列番号１４）
PT005: CGGKSGEPLS(pT)WAGSPPY （配列番号１５）
PT006: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号１６）
PT007: CGGSDGEFLR(pT)SAGSPNY （配列番号１７）
PT008: CGGTFGNKLD(pT)FAGSPPY （配列番号１８）
PT009: CGGTLGSKLD(pT)FAGSPPY （配列番号１９）
PT010: CGGTVGGKLD(pT)FAGSPPY （配列番号２０）
PT011: CGGTVGNKLD(pT)FAGSPPY （配列番号２１）
PT012: CGGVGDSLLE(pT)SAGSPHY （配列番号２２）
PT013: CGGKSAEPLS(pT)WAGSPPY （配列番号２３）
PT014: CGGVGDSLFE(pT)SAGSPHY （配列番号２４）
PT015: CGGTVGGKID(pT)FAGSPPY （配列番号２５）
PT016: CGGKSGEPLS(pT)WAGSPPH （配列番号２６）
PT017: CGGTLGSKLD(pT)FAGNPPY （配列番号２７）
PT018: CGGTVAGKLD(pT)FAGSPPY （配列番号２８）
PT019: CGGVGDSLLE(pT)SAGSPHH （配列番号２９）
PT020: CGGVGDSLLE(pT)SAASPHY （配列番号３０）
PT021: CGGYQGKFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号３１）
PT022: CGGKSGELLA(pT)WSGSPPY （配列番号３２）
PT023: CGGSDGEFLR(pT)TAGSPNY （配列番号３３）
PT024: CGGKSGDPLS(pT)WAGSPPY （配列番号３４）
PT025: CGGTFGNKLD(pT)FAGSPPF （配列番号３５）
PT026: CGGTVANKLD(pT)FAGSPPY （配列番号３６）
PT027: CGGKSGEPLS(pT)WAGTPPY （配列番号３７）
PT028: CGGKSGEPLS(pT)LAGSPPY （配列番号３８）
PT029: CGGTIGNKLD(pT)FAGSPPY （配列番号３９）
PT030: CGGSDGEFLK(pT)SAGSPNY （配列番号４０）
PT031: CGGTLGSKLD(pT)FAGSPAY （配列番号４１）
PT032: CGGSDGEFLR(pT)SAGSPNF （配列番号４２）
PT033: CGGKSGELLA(pT)WAASPPY （配列番号４３）
PT034: CGGTVGNKLD(pT)LAGSPPY （配列番号４４）
PT035: CGGKSGEPLT(pT)WAGSPPY （配列番号４５）
PT036: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSPLH （配列番号４６）
PT037: CGGTVGGKLD(pT)FAASPPY （配列番号４７）
PT038: CGGHQGKFLQ(pT)IAGSPLY （配列番号４８）
PT039: CGGKSAELLA(pT)WAGSPPY （配列番号４９）
PT040: CGGKTGELLA(pT)WAGSPPY （配列番号５０）
PT041: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSALY （配列番号５１）
PT042: CGGQKDKFIQ(pT)FAGSPLY （配列番号５２）
PT043: CGGTVGGKLD(pT)FAGNPPY （配列番号５３）
PT044: CGGTLGGKLD(pT)FAGSPPY （配列番号５４）
PT045: CGGHQGKLLQ(pT)FAGSPLY （配列番号５５）
PT046: CGGKSGEPLS(pT)WAGSPPF （配列番号５６）
PT047: CGGTFGNKLD(pT)LAGSPPY （配列番号５７）
PT048: CGGVGDSLLE(pT)SAGSPYY （配列番号５８）
PT049: CGGQKDRFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号５９）
PT050: CGGVGDSLLE(pT)SAGSPHF （配列番号６０）
PT051: CGGTVGGKLD(pT)FAGSPAY （配列番号６１）
PT052: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSPFY （配列番号６２）
PT053: CGGSVGNKLD(pT)FAGSPPY （配列番号６３）
PT054: CGGTVGGKLD(pT)FAGSAPY （配列番号６４）
PT055: CGGVGDSLVE(pT)SAGSPHY （配列番号６５）
PT056: CGGKSGEPLS(pT)WAASPPY （配列番号６６）
PT057: CGGTLGSKLE(pT)FAGSPPY （配列番号６７）
PT058: CGGSDGEFLR(pT)SAGSANY （配列番号６８）
PT059: CGGSDGELLR(pT)SAGSPNY （配列番号６９）
PT060: CGGRSGEPLS(pT)WAGSPPY （配列番号７０）
PT061: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSPIY （配列番号７１）
PT062: CGGTFGNKLD(pT)FAGSAPY （配列番号７２）
PT063: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSPVY （配列番号７３）
PT064: CGGKSGELLA(pT)LAGSPPY （配列番号７４）
PT065: CGGKTGEPLS(pT)WAGSPPY （配列番号７５）
PT066: CGGTVGGKLD(pT)FAGTPPY （配列番号７６）
PT067: CGGSDGEFLR(pT)SAGTPNY （配列番号７７）
PT068: CGGQKDKFLQ(pT)FSGSPLY （配列番号７８）
PT069: CGGIGDSLLE(pT)SAGSPHY （配列番号７９）
PT070: CGGQKDKFFQ(pT)FAGSPLY （配列番号８０）
PT071: CGGVGDSLLE(pT)TAGSPHY （配列番号８１）
PT072: CGGTFGNKLD(pT)FAGSPAY （配列番号８２）
PT073: CGGVGDSLLE(pT)SAGSAHY （配列番号８３）
PT074: CGGTLGSKLD(pT)FAGSAPY （配列番号８４）
PT075: CGGAGDSLLE(pT)SAGSPHY （配列番号８５）
PT076: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSPFY （配列番号８６）
PT077: CGGVGDSILE(pT)SAGSPHY （配列番号８７）
PT078: CGGQKDKILQ(pT)FAGSPLY （配列番号８８）
PT079: CGGLGDSLLE(pT)SAGSPHY （配列番号８９）
PT080: CGGQKDKFLQ(pT)LAGSPLY （配列番号９０）
PT081: CGGQKDKFLQ(pT)FAASPLY （配列番号９１）
PT082: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSPVY （配列番号９２）
PT083: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSPLH （配列番号９３）
PT084: CGGVGESLLE(pT)SAGSPHY （配列番号９４）
PT085: CGGVGDSLLE(pT)SAGSPRY （配列番号９５）
PT086: CGGSDGEFLR(pT)SAGSPNH （配列番号９６）
PT087: CGGHQGKILQ(pT)FAGSPLY （配列番号９７）
PT088: CGGSEGEFLR(pT)SAGSPNY （配列番号９８）
PT089: CGGKSGELVA(pT)WAGSPPY （配列番号９９）
PT090: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSPLF （配列番号１００）
PT091: CGGQKDKFVQ(pT)FAGSPLY （配列番号１０１）
PT092: CGGKSGDLLA(pT)WAGSPPY （配列番号１０２）
PT093: CGGSDAEFLR(pT)SAGSPNY （配列番号１０３）
PT094: CGGVGDSLLD(pT)SAGSPHY （配列番号１０４）
PT095: CGGSDGEFLR(pT)SAASPNY （配列番号１０５）
PT096: CGGTFGNKLE(pT)FAGSPPY （配列番号１０６）
PT097: CGGQRDKFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号１０７）
PT098: CGGHQAKFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号１０８）
PT099: CGGQKDKFLQ(pT)FAGNPLY （配列番号１０９）
PT100: CGGQKDKFLQ(pT)FAGTPLY （配列番号１１０）
PT101: CGGQKEKFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号１１１）
PT102: CGGHQGKFLQ(pT)FAGNPLY （配列番号１１２）
PT103: CGGSDGEFVR(pT)SAGSPNY （配列番号１１３）
PT104: CGGHQGKFVQ(pT)FAGSPLY （配列番号１１４）
PT105: CGGKSGEPLS(pT)WAGSPAY （配列番号１１５）
PT106: CGGVGDNLLE(pT)SAGSPHY （配列番号１１６）
PT107: CGGKSGEPVS(pT)WAGSPPY （配列番号１１７）
PT108: CGGVADSLLE(pT)SAGSPHY （配列番号１１８）
PT109: CGGVGDSLLE(pT)SAGTPHY （配列番号１１９）
PT110: CGGKSGELLV(pT)WAGSPPY （配列番号１２０）
PT111: CGGVGDSVLE(pT)SAGSPHY （配列番号１２１）
PT112: CGGHQGKFLQ(pT)FAGSALY （配列番号１２２）
PT113: CGGHQGKFLQ(pT)LAGSPLY （配列番号１２３）
PT114: CGGQKDKFLQ(pT)IAGSPLY （配列番号１２４）
PT115: CGGHQGKFLQ(pT)FAGTPLY （配列番号１２５）
PT116: CGGHQGKFLQ(pT)FSGSPLY （配列番号１２６）
PT117: CGGKSGELLA(pT)WAGTPPY （配列番号１２７）
PT118: CGGKNGELLA(pT)WAGSPPY （配列番号１２８）
PT119: CGGTVGGKLE(pT)FAGSPPY （配列番号１２９）
PT120: CGGKSGEPLS(pT)WSGSPPY （配列番号１３０）
PT121: CGGKSGEPLS(pT)WAGSAPY （配列番号１３１）
PT122: CGGKSGELLA(pT)WAGSPPF （配列番号１３２）
PT123: CGGQKDKLLQ(pT)FAGSPLY （配列番号１３３）
PT124: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSPLF （配列番号１３４）
PT125: CGGHQGRFLQ(pT)FAGSPLY （配列番号１３５）
PT126: CGGHQGKFLQ(pT)FAASPLY （配列番号１３６）
PT127: CGGQKDKFLQ(pT)FAGSPIY （配列番号１３７）
PT128: CGGKSGELLA(pT)WAGSPAY （配列番号１３８）
PT129: CGGVGDSLLE(pT)SSGSPHY （配列番号１３９）
PT130: CGGKSGELLA(pT)WAGSAPY （配列番号１４０）
PT131: CGGHQGKFLQ(pT)SAGSPHY （配列番号１４１）
PT132: CGGKSGELLA(pT)FAGSPLY （配列番号１４２）
PT133: CGGTVGNKLD(pT)SAGSPHY （配列番号１４３）
PT134: CGGKSGEPLS(pT)SAGSPHY （配列番号１４４）
PT135: CGGVGDSLLE(pT)SAGSPNY （配列番号１４５）
PT136: CGGLALHIRS(pT)WSGLHLV （配列番号１４６）
PT137: CGGLHIRSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号１４７）
PT138: CGGLEMVKAA(pT)ETNLPLL （配列番号１４８）
PT139: CGGHNMLDDS(pT)DPILTTI （配列番号１４９）
PT140: CGGYRYPRPA(pT)VPPSPSL （配列番号１５０）
PT141: CGGPSLSRHS(pT)PHQSEDE （配列番号１５１）
PT142: CGGSSGSPAN(pT)FHFKEAW （配列番号１５２）
PT143: CGGSPRVRTL(pT)GSRPPLL （配列番号１５３）
PT144: CGGNLMLDRL(pT)GKILHID （配列番号１５４）
PT145: CGGVTHTFSG(pT)IEYMAPE （配列番号１５５）
PT146: CGGVTHTFAG(pT)IEYMAPE （配列番号１５６）
PT147: CGGSQFDSKF(pT)RQTPVDS （配列番号１５７）
PT148: CGGNQVFLGF(pT)YVAPSVL （配列番号１５８）
PT149: CGGEPMRRSV(pT)EAALAQP （配列番号１５９）
PT150: CGGWTETKKQ(pT)FKQTGEF （配列番号１６０）
PT151: CGGEPLERRL(pT)LVPDSEQ （配列番号１６１）
PT152: CGGRVPTMRP(pT)MSGLHLV （配列番号１６２）
PT153: CGGPTMRPSM(pT)GLHLVKR （配列番号１６３）
PT154: CGGKTPNLRM(pT)EKKSSWA （配列番号１６４）
PT155: CGGLNVESVS(pT)HRERSED （配列番号１６５）
PT156: CGGLNVESVA(pT)HRERSED （配列番号１６６）
PT157: CGGNPLMRRN(pT)VTPLASP （配列番号１６７）
PT158: CGGPLASPEP(pT)KKPRINS （配列番号１６８）
PT159: CGGEPSRAPA(pT)LLPPAPE （配列番号１６９）
PT160: CGGYYSSIKR(pT)GSQAHEQ （配列番号１７０）
PT161: CGGWRRKRKE(pT)SNTDSAG （配列番号１７１）
PT162: CGGVEDPPAP(pT)EPVAVEQ （配列番号１７２）
PT163: CGGPQLLRLL(pT)TLAEEPR （配列番号１７３）
PT164: CGGTSRIRTQ(pT)FSLQERQ （配列番号１７４）
PT165: CGGHFAIAAD(pT)EAEQDSW （配列番号１７５）
PT166: CGGSGDYMPM(pT)PKSVSAP （配列番号１７６）
PT167: CGGQHLRLST(pT)SGRLLYA （配列番号１７７）
PT168: CGGPLGSGES(pT)STRRSSE （配列番号１７８）
PT169: CGGQHLRLST(pT)SGRILYA （配列番号１７９）
PT170: CGGTSRIRTQ(pT)ISLQERQ （配列番号１８０）
PT171: CGGNKRSRTR(pT)DTYSAGQ （配列番号１８１）
PT172: CGGDSLPSSP(pT)TATPHSQ （配列番号１８２）
PT173: CGGSHMVHNR(pT)KINLQDL （配列番号１８３）
PT174: CGGRSRTRTD(pT)YSAGQSI （配列番号１８４）
PT175: CGGPTMRPSM(pT)GLHLVRR （配列番号１８５）
PT176: CGGLHIRSSW(pT)GLHLLKQ （配列番号１８６）
PT177: CGGLHIRSSW(pT)GLYLVKQ （配列番号１８７）
PT178: CGGQHLRVST(pT)SGRLLYA （配列番号１８８）
PT179: CGGDTLPSSP(pT)SATPHSQ （配列番号１８９）
PT180: CGGTSRIRTQ(pT)FSFQERQ （配列番号１９０）
PT181: CGGNPLMRRN(pT)VTPLANP （配列番号１９１）
PT182: CGGSHMFHNR(pT)KINLQDL （配列番号１９２）
PT183: CGGLHIRSSW(pT)GLHVVKQ （配列番号１９３）
PT184: CGGRSRTRTD(pT)YTAGQSV （配列番号１９４）
PT185: CGGQHLRLST(pT)SGRLIYA （配列番号１９５）
PT186: CGGQHLRLST(pT)SGRLLYG （配列番号１９６）
PT187: CGGPTMKPSM(pT)GLHLVKR （配列番号１９７）
PT188: CGGTSHIRTQ(pT)FSLQERQ （配列番号１９８）
PT189: CGGLHIRSSW(pT)GLHLVRQ （配列番号１９９）
PT190: CGGESLPSSP(pT)SATPHSQ （配列番号２００）
PT191: CGGTSRIRTQ(pT)FTLQERQ （配列番号２０１）
PT192: CGGSHMIHNR(pT)KINIQDL （配列番号２０２）
PT193: CGGNPLMRRN(pT)VTPLGSP （配列番号２０３）
PT194: CGGQHLRLTT(pT)SGRLLYA （配列番号２０４）
PT195: CGGNPFMRRN(pT)VTPLASP （配列番号２０５）
PT196: CGGDSIPSSP(pT)SATPHSQ （配列番号２０６）
PT197: CGGSHMIHNR(pT)KVNLQDL （配列番号２０７）
PT198: CGGATMRPSM(pT)GLHLVKR （配列番号２０８）
PT199: CGGLHIRSSW(pT)ALHLVKQ （配列番号２０９）
PT200: CGGQRLRLST(pT)SGRLLYA （配列番号２１０）
PT201: CGGNPVMRRN(pT)VTPLASP （配列番号２１１）
PT202: CGGNPLMRRN(pT)VNPLASP （配列番号２１２）
PT203: CGGQHLRLST(pT)SGRLVYA （配列番号２１３）
PT204: CGGQHLRLST(pT)SGRVLYA （配列番号２１４）
PT205: CGGNPLMRRN(pT)VTPIASP （配列番号２１５）
PT206: CGGNPLLRRN(pT)VTPLASP （配列番号２１６）
PT207: CGGPSMRPSM(pT)GLHLVKR （配列番号２１７）
PT208: CGGPTMRPSM(pT)GFHLVKR （配列番号２１８）
PT209: CGGLHIRTSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２１９）
PT210: CGGDSVPSSP(pT)SATPHSQ （配列番号２２０）
PT211: CGGNPLMRRN(pT)ATPLASP （配列番号２２１）
PT212: CGGQHLRLST(pT)TGRLLYA （配列番号２２２）
PT213: CGGDSLPSSP(pT)SATAHSQ （配列番号２２３）
PT214: CGGPTMRPSL(pT)GLHLVKR （配列番号２２４）
PT215: CGGPTMRASM(pT)GLHLVKR （配列番号２２５）
PT216: CGGQHFRLST(pT)SGRLLYA （配列番号２２６）
PT217: CGGDSLPSSP(pT)SATPHNQ （配列番号２２７）
PT218: CGGLHIRSSW(pT)GLHLAKQ （配列番号２２８）
PT219: CGGLHIRSNW(pT)GLHLVKQ （配列番号２２９）
PT220: CGGQYLRLST(pT)SGRLLYA （配列番号２３０）
PT221: CGGQHLHLST(pT)SGRLLYA （配列番号２３１）
PT222: CGGTSRIRTQ(pT)FSLQDRQ （配列番号２３２）
PT223: CGGSHMIHNK(pT)KINLQDL （配列番号２３３）
PT224: CGGLRIRSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２３４）
PT225: CGGSHMIHNR(pT)RINLQDL （配列番号２３５）
PT226: CGGVHIRSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２３６）
PT227: CGGLHIRSSW(pT)GLRLVKQ （配列番号２３７）
PT228: CGGNPLMRRN(pT)VSPLASP （配列番号２３８）
PT229: CGGQHLRLST(pT)SGRLLHA （配列番号２３９）
PT230: CGGQHLRLSS(pT)SGRLLYA （配列番号２４０）
PT231: CGGNKRSRTK(pT)DSYSAGQ （配列番号２４１）
PT232: CGGQHIRLST(pT)SGRLLYA （配列番号２４２）
PT233: CGGNPIMRRN(pT)VTPLASP （配列番号２４３）
PT234: CGGQHLRLST(pT)SGRFLYA （配列番号２４４）
PT235: CGGSHMIHNR(pT)KINVQDL （配列番号２４５）
PT236: CGGDSLPSSP(pT)SATPYSQ （配列番号２４６）
PT237: CGGSYMIHNR(pT)KINLQDL （配列番号２４７）
PT238: CGGQHLRFST(pT)SGRLLYA （配列番号２４８）
PT239: CGGTSRIRTQ(pT)FSLQEHQ （配列番号２４９）
PT240: CGGNKRSRTR(pT)DSYSGGQ （配列番号２５０）
PT241: CGGEAMRRSV(pT)EAALAQP （配列番号２５１）
PT242: CGGPTMRPSM(pT)GLRLVKR （配列番号２５２）
PT243: CGGQHLRLST(pT)SGRLLFA （配列番号２５３）
PT244: CGGDSLPTSP(pT)SATPHSQ （配列番号２５４）
PT245: CGGTHMIHNR(pT)KINLQDL （配列番号２５５）
PT246: CGGRSRTRTD(pT)YSAGQSL （配列番号２５６）
PT247: CGGQHLRLST(pT)SGHLLYA （配列番号２５７）
PT248: CGGLHVRSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２５８）
PT249: CGGLHIRSSW(pT)GLHLIKQ （配列番号２５９）
PT250: CGGLHIRSSW(pT)GFHLVKQ （配列番号２６０）
PT251: CGGSHMIHNR(pT)KINFQDL （配列番号２６１）
PT252: CGGPTMRPSM(pT)GLHLVKK （配列番号２６２）
PT253: CGGPTMRPSM(pT)GVHLVKR （配列番号２６３）
PT254: CGGTNRLRSE(pT)IAFIEEN （配列番号２６４）
PT255: CGGPTLRPSM(pT)GLHLVKR （配列番号２６５）
PT256: CGGPTMRPNM(pT)GLHLVKR （配列番号２６６）
PT257: CGGQHVRLST(pT)SGRLLYA （配列番号２６７）
PT258: CGGLHIKSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２６８）
PT259: CGGLHIRSSW(pT)GVHLVKQ （配列番号２６９）
PT260: CGGDSLPSSP(pT)SATPHTQ （配列番号２７０）
PT261: CGGDSLPSSA(pT)SATPHSQ （配列番号２７１）
PT262: CGGLHIRSSL(pT)GLHLVKQ （配列番号２７２）
PT263: CGGNPLMRRN(pT)VTPLVSP （配列番号２７３）
PT264: CGGLHIRSSW(pT)GLHIVKQ （配列番号２７４）
PT265: CGGLHIRSTW(pT)GLHLVKQ （配列番号２７５）
PT266: CGGPTMRPSM(pT)GIHLVKR （配列番号２７６）
PT267: CGGPTMRPSM(pT)GLHVVKR （配列番号２７７）
PT268: CGGQHLRIST(pT)SGRLLYA （配列番号２７８）
PT269: CGGQHLRLST(pT)SARLLYA （配列番号２７９）
PT270: CGGPTMRPSM(pT)GLHLAKR （配列番号２８０）
PT271: CGGDSFPSSP(pT)SATPHSQ （配列番号２８１）
PT272: CGGPTMRPSM(pT)GLHLLKR （配列番号２８２）
PT273: CGGLYIRSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２８３）
PT274: CGGPNMRPSM(pT)GLHLVKR （配列番号２８４）
PT275: CGGQHLRLST(pT)SGRLFYA （配列番号２８５）
PT276: CGGFHIRSSW(pT)GLHLVKQ （配列番号２８６）
PT277: CGGLRRA(pT)LG （配列番号２８７）
PT278: CGGRPRAA(pT)F （配列番号２８８）
PT279: CGGFKK(pT)FKL （配列番号２８９）
PT280: CGGTIYRRG(pT)RRWRKL （配列番号２９０）
PT281: CGGQKRPRRKD(pT)P （配列番号２９１）
PT282: CGGRKR(pT)RAE （配列番号２９２）
PT283: CGGAPGLI(pT)PGGPP （配列番号２９３）
PT284: CGGKKALHRQE(pT)VDAL （配列番号２９４）
PT285: CGGMHRQE(pT)VDCLK （配列番号２９５）
PT286: CGGHA(pT)PPKKKRK （配列番号２９６）
PT287: CGGPK(pT)PKKAKKL （配列番号２９７）
PT288: CGGRRADD(pT)DDDDD （配列番号２９８）
PT289: CGGRRRDDD(pT)DDD （配列番号２９９）
【００７３】
ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液：
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を使用した。
ブロッキング緩衝溶液：
３％牛血清アルブミンと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を使用した。
抗リン酸化セリン抗体緩衝溶液：
市販品（後述）をブロッキング緩衝溶液で５００倍希釈して使用した。
抗リン酸化スレオニン抗体緩衝溶液：
市販品（後述）をブロッキング緩衝溶液で５００倍希釈して使用した。
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識抗マウス抗体緩衝溶液：
市販品（Zymed）をブロッキング緩衝溶液で5000倍希釈して使用した。
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識抗ウサギ抗体緩衝溶液：
市販品（Zymed）をブロッキング緩衝溶液で1000倍希釈して使用した。
ＰＫＡ酵素：市販品（Promega, Madison, WI、またはUpstate Biotechnology, Lake Placid, NY）を用いた。
ＰＫＣ酵素：市販品（Upstate）を用いた。
ＡＭＰＫ酵素：市販品（Upstate）を用いた。
ＰＫＡ反応緩衝溶液：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
40 mM Tris/HCl (pH 7.2)
15 mM MgCl2
0.2 mM ATP
ＡＭＰＫ反応緩衝溶液：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
40 mM HEPES (pH 7.4)
80 mM NaCl
5 mM Mg(OAc)2
1 mM DTT
0.2 mM 5’-AMP
0.2 mM ATP
ＰＫＣ反応緩衝溶液（全亜型共通）：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
20 mM MOPS (pH 7.2）
25 mM β-glycerophosphate
5 mM EGTA
0.2 mM DTT
1 mM CaCl2
20 mM MgCl2
1/5 Lipid Activator (Upstate)
0.2 mM ATP
カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−）：
塩化ナトリウム80g、塩化カリウム２g、リン酸水素ナトリウム11.5g、リン酸二水素カリウム2gを精製水１Lに溶解したものを１０倍希釈しオートクレーブで滅菌したものを用いた。
細胞剥離液：
トリプシン−ＥＤＴＡ液（GIBCO）を滅菌ＰＢＳ−で１０倍希釈して用いた。
ＨＥＫ２９３細胞生育培地：
500 mLのDulbeco’s リン酸緩衝生理食塩水（Sigma）に50 mLの牛胎児血清（５６℃で３０分間加熱し非働化したもの）と5 mLのペニシリン／ストレプトマイシン（10000 units/ml、10000 mg/ml）加えたものを用いた。
ＰＫＡプラスミド：
市販品（Stratagene）を使用した。
ＧＦＰプラスミド：
市販品（CloneTech）を使用した。
プラスミド溶液：
プラスミド４μgを250μLのOptiMem I (Invitrogen)と250μLのLipofectamine 2000 (Invitrogen)の混合液に溶解させたものを細胞培養用６穴プレートの１穴あたり用いた。
ＨＥＫ２９３細胞抽出用緩衝液：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
20 mM Tris/HCl (pH 7.2)
0.5 % TritonX-100
150 mM NaCl
20 mM β-glycerophosphate
2 mM EGTA
5 mM EDTA
1 mM Na3VO4(sodium orthovanadate)
0.2 mM PMSF
5 mg/ml Aprotinin
3 mg/ml Pepstatin A
Ｌ６細胞生育培地：
500 mLのαMEM（Sigma）に50 mLの牛胎児血清（５６℃で３０分間加熱し非働化したもの）、5 mLのペニシリン／ストレトマイシン（10000 units/ml、10000 mg/ml）と10 mLの200 mMグルタミンを加えたものを用いた。
Ｌ６細胞分化培地：
500 mLのαMEM（Sigma）に10 mLの牛胎児血清、5 mLのペニシリン／ストレプトマイシン（10000 units/ml、10000 mg/ml）混合液と10 mLの200 mMグルタミンを加えたものを用いた。
Ｌ６細胞抽出用緩衝液： 以下の組成の緩衝溶液を用いた。
30 mM HEPES (pH 7.4)
2.5 mM EGTA
3.0 mM EDTA
70 mM KCl
0.1 % Nonident P-40
20 mM β-glycerophosphate
20 mM NaF
2 mM NaPPi (sodium pyrophosphate)
1 mM Na3VO4(sodium orthovanadate)
0.2 mM PMSF
0.01 mM Pepstatin A
【００７４】
実施例１：マイクロタイタープレートでの抗体認識反応（１）
１％グルタルアルデヒドの５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を９６穴アミノプレート（住友ベークライトまたはコーニング製）に５０μＬずつ注ぎ入れ、３７℃で２時間反応させ、プレート表面を活性化させた。反応液を取り除き、精製水で洗浄した。ペプチド基質を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解させ（ペプチド濃度１μＭ〜２０μＭ）、活性化させた９６穴マイクロタイタープレートの各穴に５０μＬずつ注ぎ入れた。３７℃で２時間反応させた後、反応液を除いた。ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液と精製水で順次洗浄することでペプチド基質を固定化した。ペプチド基質を固定化させたマイクロタイタープレートを、ブロッキング緩衝溶液を用いて３０℃で１時間ブロッキング処理した。ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した後、抗リン酸化セリン抗体緩衝溶液または抗リン酸化スレオニン抗体緩衝溶液を１穴あたり５０μＬずつ用いて３０℃で１〜２時間抗体認識反応を行った。反応液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した。続いて、ＨＲＰ標識抗マウス緩衝溶液あるいは抗ウサギ抗体緩衝溶液で認識反応させた。認識反応は１穴あたり５０μＬずつ用いて３０℃で１時間行い、反応液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で４回洗浄した。ＴＭＢ（３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン）溶液を１００μＬ加えいれ３０℃で約１０分間反応させた。２Ｎ硫酸水溶液で反応を停止した後、吸光光度計で４５０ｎｍでの吸光度を定量した（図１および２、表１）。その結果、下記抗体１６がリン酸化セリンおよびリン酸化スレオニンの両方を認識することがわかった。
【００７５】
評価した抗リン酸化セリン抗体１０種類と抗リン酸化スレオニン抗体６種類を以下に示す。
抗体１．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン7F12、Alexis Biochemicals (San Diego, CA)
抗体２．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン16B4、Alexis Biochemicals (San Diego, CA)
抗体３．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローンQ5、Qiagen (Valencia, CA)
抗体４．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローンab6639、Abcam (Cambridge, UK)
抗体５．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローンPSR-45、Sigma (St. Lois, MO)
抗体６．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン608、Zymed (South San Francisco, CA)
抗体７．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローンIC8、Calbiochem (San Diego, CA)
抗体８．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン4A3、Calbiochem (San Diego, CA)
抗体９．マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン4A9、Calbiochem (San Diego, CA)
抗体１０．ウサギポリクローナル抗リン酸化セリン抗体：
Zymed (South San Francisco, CA)
抗体１１．マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
クローンPTHR-1E11、nanoTools (Germany)
抗体１２．マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
クローンPTHR-4D11、nanoTools (Germany)
抗体１３．マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
クローンPTHR-14B3、nanoTools (Germany)
抗体１４．マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
クローンQ7、Qiagen (Valencia, CA)
抗体１５．ウサギポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
CHEMICON (Temecula, CA)
抗体１６．ウサギポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体：
Zymed (South San Francisco, CA)
【００７６】
【表１−１】
【００７７】
【表１−２】
【００７８】
実施例２：マイクロタイタープレートでの抗体認識反応（２）
実施例１で見出した抗体１６について、Ｎ末端にシステイン残基を有しリン酸化スレオニン残基を含む１０から１８アミノ酸からなる２８９種類のペプチド配列（PT001〜PT289）に対する認識能を調べた。
抗体認識能は、実施例１に示すように１次抗体としての抗リン酸化スレオニン抗体（抗体１６）と２次抗体としての抗ウサギ抗体とを組み合わせて調べた。しかし、１次抗体としての抗リン酸化スレオニン抗体（抗体１６）の機能をより詳細に調べる目的で２８９ペプチドの全配列について以下の２つの条件で抗体認識反応を比較した。さらに実験に用いる各プレートには実施例１で用いたKemptide(A)、Kemptide(T)、Kemptide(pT*)を標準サンプルとして常に固相化させ比較検討した（表２）。
【００７９】
条件１：１次抗体（−）、二次抗体（＋）
ペプチド性基質を実施例１と同様の方法で固定化させた９６穴マイクロタイタープレートをブロッキング緩衝溶液を用いて３０℃で１時間ブロッキング処理を行った。ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体緩衝溶液で認識反応させた。認識反応は３０℃で１時間行い、反応液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で４回洗浄した。ＴＭＢ溶液を１００μＬ加えいれ３０℃で約１０分間反応させた。２Ｎ硫酸水溶液で反応を停止した後、吸光光度計で４５０ｎｍでの吸光度を定量した。
【００８０】
条件２：１次抗体（＋）、二次抗体（＋）
ペプチド性基質を実施例１と同様の方法で固定化させた９６穴マイクロタイタープレートをブロッキング緩衝溶液を用いて３０℃で１時間ブロッキング処理を行った。ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した後、抗体１６の抗リン酸化スレオニン抗体緩衝溶液により３０℃で１〜２時間反応させた。反応液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した。続いて、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体緩衝溶液で認識反応させた。認識反応は３０℃で１時間行い、反応液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で４回洗浄した。ＴＭＢ溶液を１００μＬ加えいれ３０℃で約１０分間反応させた。２Ｎ硫酸水溶液で反応を停止した後、吸光光度計で４５０ｎｍでの吸光度を定量した。
【００８１】
【表２−１】
【００８２】
【表２−２】
【００８３】
【表２−３】
【００８４】
【表２−４】
【００８５】
【表２−５】
【００８６】
【表２−６】
【００８７】
【表２−７】
【００８８】
実施例３：プレートでの精製ＰＫＡでのリン酸化検出
ＰＫＡ用基質ペプチドを実施例１と同様の方法で９６穴マイクロタイタープレートに固定化し、１穴あたり１Ｕまたは１５０ ｍＵのＰＫＡ（Promega, Madison, WIまたはUpstate）を含むＰＫＡ反応緩衝溶液を１穴あたり５０μＬずつ用いて３０℃でリン酸化反応を行い経時変化を追った。反応溶液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液と精製水で洗浄した。実施例１に示す方法で、生成物であるリン酸化ペプチドを抗体１６を用いて測定した（図３−１、３−２）。
図３−１、３−２より、ＰＫＡは基質ペプチド（配列番号２および３）中のセリンおよびスレオニン残基を経時的にリン酸化し、抗体１６は、リン酸化セリンおよびリン酸化スレオニンを同程度に認識することがわかった。
【００８９】
実施例４：プレートでの精製ＡＭＰＫでのリン酸化検出
ＡＭＰＫ用基質ペプチドを実施例１に示した方法で９６穴マイクロタイタープレートに固定化し、１穴あたり１０ ｍＵのＡＭＰＫ（Upstate）を含むＡＭＰＫ反応緩衝溶液を１穴あたり５０μＬずつ用いて３０℃でリン酸化反応を行い経時変化を測定した。反応溶液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液と精製水で洗浄した。さらに、実施例１に示す方法で、生成物であるリン酸化ペプチドを測定した。ＡＭＰＫ反応緩衝溶液からＡＴＰとＡＭＰを除いた場合、ＡＭＰだけ除いた場合のリン酸化反応も同時に測定した（図４）。
図４より、ＡＭＰＫは基質ペプチドＳＡＭＴ（配列番号７）を経時的にリン酸化し、抗体１６を用いて当該リン酸化を検出することにより、ＡＴＰの存在下よりもＡＭＰとＡＴＰの共存下の方がリン酸化の程度が強いことがわかった。
【００９０】
実施例５：プレートでの精製ＰＫＣでのリン酸化検出
ＰＫＣ用基質ペプチドを実施例１と同様の方法で９６穴マイクロタイタープレートに固定化し、各穴あたり６．３ ｍＵのＰＫＣ（Upstate）を含むＰＫＣ反応緩衝溶液を１穴あたり５０μＬずつ用いて３０℃で１時間リン酸化反応を行った。用いたＰＫＣは、ＰＫＣα、ＰＫＣβII、ＰＫＣγ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣη、ＰＫＣθおよびＰＫＣζであった。反応溶液を除いた後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液と精製水で洗浄した。実施例１に示す方法により、生成物であるリン酸化ペプチドを抗体１６を用いて測定した（図５）。
図５より、用いたＰＫＣはすべて基質ペプチドＩＱＡＴ（配列番号９）をＡＴＰ存在下でリン酸化することがわかった。
【００９１】
実施例６：ＨＥＫ２９３細胞でＰＫＡとＧＦＰ遺伝子を発現させた細胞抽出液でのリン酸化反応の検出
５０ｍＬの滅菌済み試験管にＨＥＫ２９３細胞を入れ、３７℃に温めたＨＥＫ２９３細胞生育培地２０ｍＬをゆっくりと加え懸濁した。毎分１０００回転で５分間遠心分離して細胞を沈殿させ上清を捨てた。ＨＥＫ２９３細胞生育培地１５ｍＬを加えて細胞を再懸濁した。得られた懸濁液を細胞培養用Ｆ７５フラスコ（コーニング）に移し、二酸化炭素培養装置内で３７℃で培養した。細胞が約８０％コンフルエント状態に達したら、次のように継代を行った。フラスコ内の培地を捨て、１０ｍＬのＰＢＳ−で２回洗浄した。約１０ｍＬの細胞剥離液で細胞をはがした。ＨＥＫ２９３細胞生育培地で細胞を回収し、毎分１０００回転で５分間遠心分離し、細胞を沈殿させ上清を捨てた。ＨＥＫ２９３細胞生育培地を加えて細胞を再懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を使い、新しい細胞培養用Ｆ７５フラスコで同じように増殖させた。必要量の細胞数を得るために継代を繰り返した。継代を繰り返して得たＨＥＫ２９３細胞を３００，０００／ｍｌの密度で細胞培養用６穴プレート（SUMILON MS-8496F5）に播き、１穴あたりＨＥＫ２９３細胞生育培地で約２mＬにし、ＰＫＡもしくはＧＦＰ遺伝子のプラスミド溶液を加え入れ、３７℃で約４時間遺伝子導入処理を行った。４時間後、継代作業と同じように新しいＨＥＫ２９３細胞生育培地に交換し、コンフルエント状態に達するまで細胞を増殖させた。培地を取り除き、冷やしたＰＢＳ−で２回洗浄した。ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液で細胞を回収した。毎分３０００回転で５分間遠心分離した後上清を除き、ＨＥＫ２９３細胞抽出用緩衝液を加え、４℃で細胞成分を溶解させた。得られた溶解液を毎分１５，０００回転で遠心分離し、上清を細胞抽出液として得た。得られた細胞抽出液を各穴あたり０．０３μｇのタンパク量になるようにＰＫＡ反応緩衝液５０μＬに混合した溶液を用いて、実施例３と同様に、ＰＫＡ用基質ペプチドを固定化した９６穴マイクロタイタープレートでリン酸化反応を３０℃で１時間行い、実施例１と同様にして、リン酸化ペプチドを抗体１６により検出した（図６）。
図６より、本発明のペプチドアレイを用いて、細胞抽出液中に含まれるＰＫＡ活性を測定できることがわかった。
【００９２】
実施例７：Ｌ６培養細胞の細胞抽出液でのリン酸化反応の検出
５０ｍＬの滅菌済み試験管にＬ６細胞を入れ、３７℃に温めたＬ６細胞生育培地２０ ｍＬをゆっくりと加え、懸濁した。毎分１０００回転で５分間遠心分離して細胞を沈殿させ、上清を捨てた。Ｌ６細胞生育培地１５ｍＬを加えて細胞を再懸濁した。得られた懸濁液を細胞培養用Ｆ７５フラスコ（コーニング）に移し、二酸化炭素培養装置内で３７℃で培養した。約８０％コンフルエント状態で、以下のように継代を行った。フラスコ内の培地を捨て、１０ｍＬのＰＢＳ−で２回洗浄した。約１０ｍＬの細胞剥離液で室温下処理し細胞をはがした。Ｌ６細胞生育培地で細胞を回収し、毎分１０００回転で５分間遠心分離して細胞を沈殿させ、上清を捨てた。Ｌ６細胞生育培地を加えて細胞を再懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を使い、新しい細胞培養用Ｆ７５フラスコで同じように増殖させた。継代を繰り返し、必要量の細胞数に達したら分化を行った。継代の際と同じようにして得た所定の密度のＬ６細胞生育培地で懸濁した細胞を細胞培養用６穴プレート（SUMILON MS-8496F5）に１００μＬずつ分注して培養した。コンフルエント状態にして培地を完全に除き、Ｌ６細胞分化培地１００μＬに置換した。そのまま１〜３日間培養し、筋芽が筋管に分化したのを確認した後、９０μＬのＬ６細胞分化培地に交換した。ＡＩＣＡＲ(5-amino-4- imidazole carboxamide)とメトフォルミンを所定の１０倍濃度にＬ６細胞分化培地で希釈し、各ウェルに１０μＬずつ添加し２時間インキュベートした。２時間後、培地を取り除き、冷やしたＰＢＳ−で２回洗浄した。各ウェルあたり５０μＬのＬ６細胞抽出用緩衝液を加え、４℃で攪拌しながら細胞成分を抽出した。抽出物を毎分５０００回転で遠心分離し、上清を得た。作製した細胞抽出液を各穴あたり０．１μｇのタンパク量になるようにＡＭＰＫ反応緩衝液５０μＬに混合した溶液を用いて、実施例４と同様に、ＡＭＰＫ用基質ペプチドを固定化した９６穴マイクロタイタープレートでリン酸化反応を３０℃で１時間行い、実施例１と同様にしてリン酸化ペプチドを抗体１６により検出した（図７）。
図７より、本発明のペプチドアレイを用いて、ＡＩＣＡＲまたはメトフォルミンで誘導したＡＭＰＫ活性を測定できることがわかった。
【００９３】
実施例８：Ｃｙ３標識化抗体１６の緩衝溶液の調製
５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）で２倍に希釈した抗体１６をＣｙ３標識キット（アマシャムバイオサイエンス：コード番号PA33001）を用いて添付手順書に従ってＣｙ３標識化した。得られたＣｙ３標識化抗体１６をブロッキング緩衝溶液で１０００倍に希釈しＣｙ３標識化抗体１６の緩衝溶液とした。
【００９４】
実施例９：スライドガラス表面に固定化したペプチド基質を用いてのリン酸化検出
高密度化アミノ基導入コートＤＮＡマイクロアレイ用スライドガラス（松浪ガラス：品番SDM0011）に４−マレイミドブチル酸のＮ−スクシイミドエステル（CAS No. 80307-12-6: Fluka）の１００ｍＭのＤＭＦ溶液を室温下１２時間反応させた後、反応液をＤＭＦで洗い流した。さらに、ＤＭＦ、精製水、エタノールを用いて順に２回ずつ洗浄し、減圧室温下乾燥した。得られたスライドガラスにＤＮＡマイクロアレイ作製用アレイヤー（Genetic Microsystems：GMS417 Arrayer）を用いて０．３８μｍ間隔でＰＫＡ用基質ペプチドの１００μＭリン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐＨ７．２）を分注し固定化した。固定化したスライドガラスを室温下３時間静置した後、水、ＤＭＦ、水、エタノールで順に２回ずつ洗浄し、減圧室温下乾燥した。乾燥したスライドガラスをブロッキング緩衝溶液で室温下１時間ブロッキング処理した後、実施例３および実施例６と同様の方法でスライドガラス上でリン酸化反応を行った。ＰＫＡを使った場合は、スライドガラス１枚あたり１５０ｍＵの酵素量を、ＰＫＡおよびＧＦＰ発現細胞抽出液を使った場合は、スライドガラス１枚あたり０．１μｇのタンパク質量を用いた。３０℃で１時間反応させた後、スライドガラスをＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液および精製水で２回ずつ洗浄し、再度ブロッキング緩衝溶液で室温下１時間ブロッキング処理した。実施例８で作製したＣｙ３標識化抗体１６の緩衝溶液をスライドガラスに３０℃で１時間作用させた。ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で２回と精製水で５回洗浄を行った後、毎分５００回転の遠心操作を行い乾燥させた。得られたスライドガラスはＤＮＡマイクロアレイ用蛍光スキャナー（ScanArray 5000: GSI Lumonics）を用いて、励起波長（５４３ｎｍ）検出波長（５７０ｎｍ）で蛍光イメージング画像を取得した（図８）。
図８の写真は、左からそれぞれ、キナーゼを加えないコントロール〔Kinase(-)〕、PKA酵素を使った場合〔PKA(+)〕、PKA発現細胞抽出液を使った場合〔PKA Lysate(+)〕、GFP発現細胞抽出液を使った場合〔GFP Lysate(+)〕の結果を示す。マイクロタイタープレートを用いて作製したプレートアレイでの結果と同様に、スライドガラス上に作製したマイクロアレイ上でも、ＰＫＡ遺伝子を発現させた未精製の細胞抽出液を作用させることによって、精製されたＰＫＡ酵素を作用させた場合と同様に、ＰＫＡによるリン酸化反応が円滑に進行している状態が検出できた。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、これまで標準とされてきた放射化標識されたＡＴＰを用いたリン酸化検出方法に置き換わる新しいリン酸化検出方法ならびにその実施に使用される基質群およびペプチドアレイを提供する。さらに、より優れたポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体を作製することで、より高感度なリン酸化検出方法、ならびにこれに基づく診断方法やスクリーニング方法をも提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】リン酸化セリン残基の抗体認識反応を４５０ｎｍでの吸光度により定量 (ｎ＝１)した図である。抗体１〜抗体１６は、それぞれ、[表１−１]の各抗体を意味する。
【図２】リン酸化スレオニン残基の抗体認識反応を４５０ｎｍでの吸光度により定量 (ｎ＝１)した図である。抗体１１〜抗体１６は、それぞれ、[表１−２]の各抗体を意味する。
【図３−１】ＰＫＡによるセリン残基のリン酸化の抗体１６を使った検出を示す図である。ＰＫＡ １Ｕ／ｗｅｌｌ、３０℃で反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*、 * 平均値±標準誤差（ｎ＝３）
【図３−２】ＰＫＡによるスレオニン残基のリン酸化の抗体１６を使った検出を示す図である。ＰＫＡ １Ｕ／ｗｅｌｌ、３０℃で反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*、 * 平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【図４】ＡＭＰＫによるスレオニン残基のリン酸化の抗体１６を使った検出を示す図である。ＡＭＰＫ １０ ｍＵ／ｗｅｌｌ、３０℃で反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*， * 平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【図５】ＰＫＣによるスレオニン残基のリン酸化の抗体１６を使った検出を示す図である。ＰＫＣ ６．３ ｍＵ／ｗｅｌｌ、３０℃で１時間反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*， * 平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【図６】ＨＥＫ２９３細胞でＰＫＡとＧＦＰ遺伝子を発現させた細胞抽出液でのリン酸化反応の検出を示す図である。タンパク量０．０３μｇ／ｗｅｌｌ、３０℃で１時間反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*， * 平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【図７】Ｌ６細胞でのメトフォルミンとＡＩＣＡＲ刺激細胞抽出液でのリン酸化反応の検出を示す図である。 タンパク量０．１μｇ／ｗｅｌｌ、３０℃で１時間反応Ａ４５０ｎｍ (ｎ＝３)*， * 平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【図８】スライドガラス表面に固定化したペプチドアレイを用いて、リン酸化反応を蛍光イメージング画像で示した図である。 写真は、左からそれぞれ、キナーゼを加えないコントロール〔Kinase(-)〕、PKA酵素を使った場合〔PKA(+)〕、PKA発現細胞抽出液を使った場合〔PKA Lysate(+)〕、GFP発現細胞抽出液を使った場合〔GFP Lysate(+)〕の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも１種含有するプロテインキナーゼの基質群。
【請求項２】
プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をリン酸化スレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも１種さらに含有する、請求項１に記載の基質群。
【請求項３】
前記人工ペプチド基質が５〜３０のアミノ酸残基を有するものである、請求項１または２に記載の基質群。
【請求項４】
前記プロテインキナーゼがセリン／スレオニンキナーゼである請求項１〜３いずれかに記載の基質群。
【請求項５】
前記セリン／スレオニンキナーゼがｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡである、請求項４に記載の基質群。
【請求項６】
前記セリン／スレオニンキナーゼがプロテインキナーゼＣである、請求項４に記載の基質群。
【請求項７】
前記セリン／スレオニンキナーゼがＡＭＰ活性化プロテインキナーゼである、請求項４に記載の基質群。
【請求項８】
前記人工ペプチド基質が配列番号１１〜２９９に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列を有するものである請求項１〜７いずれかに記載の基質群。
【請求項９】
請求項１〜８いずれかに記載の基質群を固定してなるペプチドアレイ。
【請求項１０】
請求項９に記載のペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、リン酸化および／または脱リン酸化反応を検出する方法。
【請求項１１】
前記抗リン酸化スレオニン抗体がポリクローナル抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
下記工程：
被験者由来の生体試料からプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼを含む画分を調製する工程；
前記画分と請求項９に記載のペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならびに
前記検出結果を、対照における検出結果と比較し、疾患の有無に応じて変化するプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含むプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの活性化および／または不活化に基づく疾患の診断方法。
【請求項１３】
前記疾患が癌、悪性腫瘍、糖尿病、糖尿病性合併症、代謝性疾患、自己免疫疾患、免疫異常疾患、免疫不全、神経変性疾患、虚血性疾患、内分泌疾患、肝疾患または骨疾患である請求項１２に記載の診断方法。
【請求項１４】
下記工程：
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料と、請求項９に記載のペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならびに
前記検出結果を被検物質を含まない試料における検出結果と比較し、被検物質の有無により変化するプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含む、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法。
【請求項１】
プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも１種含有するプロテインキナーゼの基質群。
【請求項２】
プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をリン酸化スレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも１種さらに含有する、請求項１に記載の基質群。
【請求項３】
前記人工ペプチド基質が５〜３０のアミノ酸残基を有するものである、請求項１または２に記載の基質群。
【請求項４】
前記プロテインキナーゼがセリン／スレオニンキナーゼである請求項１〜３いずれかに記載の基質群。
【請求項５】
前記セリン／スレオニンキナーゼがｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡである、請求項４に記載の基質群。
【請求項６】
前記セリン／スレオニンキナーゼがプロテインキナーゼＣである、請求項４に記載の基質群。
【請求項７】
前記セリン／スレオニンキナーゼがＡＭＰ活性化プロテインキナーゼである、請求項４に記載の基質群。
【請求項８】
前記人工ペプチド基質が配列番号１１〜２９９に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列を有するものである請求項１〜７いずれかに記載の基質群。
【請求項９】
請求項１〜８いずれかに記載の基質群を固定してなるペプチドアレイ。
【請求項１０】
請求項９に記載のペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、リン酸化および／または脱リン酸化反応を検出する方法。
【請求項１１】
前記抗リン酸化スレオニン抗体がポリクローナル抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
下記工程：
被験者由来の生体試料からプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼを含む画分を調製する工程；
前記画分と請求項９に記載のペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならびに
前記検出結果を、対照における検出結果と比較し、疾患の有無に応じて変化するプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含むプロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの活性化および／または不活化に基づく疾患の診断方法。
【請求項１３】
前記疾患が癌、悪性腫瘍、糖尿病、糖尿病性合併症、代謝性疾患、自己免疫疾患、免疫異常疾患、免疫不全、神経変性疾患、虚血性疾患、内分泌疾患、肝疾患または骨疾患である請求項１２に記載の診断方法。
【請求項１４】
下記工程：
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料と、請求項９に記載のペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドおよび／または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならびに
前記検出結果を被検物質を含まない試料における検出結果と比較し、被検物質の有無により変化するプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含む、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−１０４３５６（Ｐ２００８−１０４３５６Ａ）
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９６９０（Ｐ２００５−２９６９０）
【出願日】平成１７年２月４日（２００５．２．４）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月４日（２００５．２．４）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
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