試料におけるヒトpFLT3の存在を検出する方法が本明細書に提供される。本明細書に提供される典型的なアッセイは、ELISA法（例えば、サンドイッチELISA）である。また、試料におけるFLT3リン酸化を検出する方法、FLT3活性化突然変異を有する患者を診断する方法、ヒトFLT3リン酸化を活性化させる化合物又はさもなければヒトFLT3リン酸化のアゴニストである化合物を同定する方法、ヒトFLT3リン酸化を阻害する化合物又はさもなければヒトFLT3リン酸化のアンタゴニストである化合物を同定する方法、患者におけるヒトFLT3リン酸化を増大させ、低下させ、又はさもなければ調節する化合物の有効性を決定する方法も本明細書に提供される。さらに、前記方法を実施するキットが提供される。このようなキットは、固体支持体上に任意に固定化された少なくとも1つの総FLT3抗体と、標識済みpFLT3抗体とを含む。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料、血液溶解物試料、又は骨髄吸引物試料におけるヒトリン酸化型FMS関連チロシンキナーゼ3（pFLT3）の存在を検出する方法であって：
（a）該試料を、ヒト総FLT3に免疫特異的に結合する固定化された第一の抗体と接触させること；
（b）結合していない試料を除去すること；
（c）該固定化された第一の抗体に結合した該試料を、検出可能な第二の抗体と接触させること、ここで、該第二の抗体が、ヒトpFLT3に免疫特異的に結合し、かつ該第二の抗体が、該第一の抗体とは異なるFLT3エピトープに免疫特異的に結合する；
（d）結合していない第二の抗体を除去すること；及び
（e）該試料に結合した第二の抗体の存在を検出すること；を含み、
ここで、ヒトpFLT3を欠失する対照試料と比較した、該試料に結合した第二の抗体の量の増加が、該試料におけるヒトpFLT3の存在を示す、前記方法。
【請求項２】
血液、血液溶解物、又は骨髄吸引物におけるFLT3リン酸化を検出する方法であって：
（a）前記試料を、ヒト総FLT3に免疫特異的に結合する固定化された第一の抗体と接触させること；
（b）結合していない試料を除去すること；
（c）該固定化された第一の抗体に結合した該試料を、検出可能な第二の抗体と接触させること、ここで、該第二の抗体がヒトpFLT3に免疫特異的に結合し、かつ該第二の抗体が、該第一の抗体とは異なるエピトープに免疫特異的に結合する；
（d）結合していない第二の抗体を除去すること；及び
（e）該試料に結合した該第二の抗体の存在を検出すること；を含み、
ここで、pFLT3を有さない対照試料と比較した、該試料に結合した第二の抗体の量の増加が、該試料におけるFLT3リン酸化を示す、前記方法。
【請求項３】
FLT3活性化突然変異を有する患者を診断する方法であって：
（a）患者由来の血液試料、血液溶解物試料、又は骨髄吸引物試料を、ヒト総FLT3に免疫特異的に結合する固定化された第一の抗体と接触させること；
（b）結合していない試料を除去すること；
（c）該固定化された第一の抗体に結合した試料を、検出可能な第二の抗体と接触させること、ここで、該第二の抗体が、ヒトpFLT3に免疫特異的に結合し、かつ該第二の抗体が、該第一の抗体とは異なるFLT3エピトープに免疫特異的に結合する；
（d）結合していない第二の抗体を除去すること；及び
（e）該試料に結合した第二の抗体の存在を検出することを含む、前記方法。
【請求項４】
ヒトFLT3リン酸化を活性化させる試験化合物、又はさもなければ該リン酸化のアゴニストである試験化合物を同定する方法であって：
（a）該試験化合物の存在下及び不在下で、ヒトFLT3を含む血液試料、血液溶解物試料、又は骨髄吸引物試料を接触させること；
（b）該試料を、ヒト総FLT3に免疫特異的に結合する固定化された第一の抗体と接触させること；
（c）結合していない試料を除去すること；
（d）該固定化された第一の抗体に結合した該試料を、検出可能な第二の抗体と接触させること、ここで、該第二の抗体が、ヒトpFLT3に免疫特異的に結合し、かつ該第二の抗体が、該第一の抗体とは異なるFLT3エピトープに免疫特異的に結合する；
（e）結合していない第二の抗体を除去すること；及び
（f）該試料に結合した第二の抗体の存在を検出すること；を含み、
ここで、該試験化合物の不在下の該試料に結合した第二の抗体の量と比較した、該試験化合物の存在下の該試料に結合した第二の抗体の量の増加が、該試験化合物がヒトFLT3リン酸化を活性化させることを示す、前記方法。
【請求項５】
ヒトFLT3リン酸化を阻害する試験化合物、又はさもなければ該リン酸化のアンタゴニストである試験化合物を同定する方法であって：
（a）該試験化合物の存在下及び不在下で、ヒトFLT3を含む試料を接触させること；
（b）該試料を、ヒト総FLT3に免疫特異的に結合する固定化された第一の抗体と接触させること；
（c）結合していない試料を除去すること；
（d）該固定化された第一の抗体に結合した該試料を、検出可能な第二の抗体と接触させること、ここで、該第二の抗体が、ヒトpFLT3に免疫特異的に結合し、かつ該第二の抗体が、該第一の抗体とは異なるFLT3エピトープに免疫特異的に結合する；
（e）結合していない第二の抗体を除去すること；及び
（f）該試料に結合した第二の抗体の存在を検出すること；を含み、
ここで、試験化合物の不在下の試料に結合した第二の抗体の量と比較した、試験化合物の存在下の該試料に結合した第二の抗体の量の減少が、該試験化合物が、ヒトFLT3リン酸化を阻害することを示す、前記方法。
【請求項６】
前記試験化合物が、複数の試験化合物のうちの1つであって、ここで、該試験化合物のうちの少なくとも2つが互いに異なる、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記複数の試験化合物が、1〜100,000の試験化合物、1〜35,000の試験化合物、1〜10,000の試験化合物、1〜1,000の試験化合物、1〜100の試験化合物、又は1〜10の試験化合物を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
患者におけるヒトFLT3リン酸化を低下させる化合物の有効性を決定する方法であって：
（a）該化合物を該患者に投与すること；
（b）該患者由来の血液試料、血液溶解物試料、又は骨髄吸引物試料を、ヒト総FLT3に免疫特異的に結合する固定化された第一の抗体と接触させること；
（c）結合していない試料を除去すること；
（d）該固定化された第一の抗体に結合した該試料を、検出可能な第二の抗体と接触させること、ここで、該第二の抗体が、ヒトpFLT3に免疫特異的に結合し、かつ該第二の抗体が、該第一の抗体とは異なるFLT3エピトープに免疫特異的に結合する；
（e）結合していない第二の抗体を除去すること；及び
（f）該試料に結合した第二の抗体の存在を検出すること；を含み、
ここで、該化合物の投与前の患者由来の対照試料と比較した、該試料に結合した第二の抗体の量の減少が、該患者におけるヒトFLT3リン酸化を低下させるための化合物の有効性を示す、前記方法。
【請求項９】
前記試料が患者に由来する、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が、FLT3活性化突然変異を有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記第二の抗体が標識を含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が、ビオチン、放射性核種、酵素、基質、蛍光マーカー、化学発光マーカー、又はルテニウム（II）トリ-ビピリジン-(4-メチルスルホナート)NHSエステルである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記第一の抗体が、多重ウェルプレート又は多重ドメインプレートのうちの1つのウェルにおいて固定化されている、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記多重ウェルプレート又は多重ドメインプレートが、前記プレートの底部に電極を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記第二の抗体がビオチン化されている、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の抗体を標識済みストレプトアビジンと接触させ、並びに、結合していない第二の抗体を除去した後、かつ前記試料に結合した第二の抗体の存在を検出する前に、結合していない標識済みストレプトアビジンを除去することをさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記標識済みストレプトアビジンが、ルテニウム（II）トリ-ビピリジン-(4-メチルスルホナート)NHSエステルを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記試料に結合した第二の抗体の存在が、前記炭素電極の表面上のタグ付きストレプトアビジンのECLによって検出される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
試料におけるヒトpFLT3の存在を検出する方法であって：
（a）該試料を、ヒトFLT3の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する固定化された第一の抗体と接触させること、ここで、第一の抗体が、多重ウェルプレート又は多重ドメイン多重ウェルプレートの底部に電極を含む該プレートの上のウェルに固定化されており；
（b）結合していない試料を除去すること；
（c）該固定化された第一の抗体に結合した該試料を、ビオチン化した第二の抗体と標識済みストレプトアビジンとの混合物と接触させること、ここで、該第二の抗体が、ヒトpFLT3に免疫特異的に結合し、かつ該第二の抗体が、該第一の抗体とは異なるFLT3エピトープに免疫特異的に結合し、かつ該標識済みストレプトアビジンが、ルテニウム（II）トリ-ビピリジン-(4-メチルスルホナート)NHSエステルを含む；
（d）結合していない第二の抗体及び結合していない標識済みストレプトアビジンを除去すること；及び
（e）該試料に結合した第二の抗体の存在を、該電極の表面の標識済みストレプトアビジンのECLによって検出すること；を含み
ここで、ヒトpFLT3を欠失しているか又は検出不可能な量のヒトpFLT3を有するかのいずれかの対照試料と比較して、該試料に結合したより多量の第二の抗体が、該試料におけるヒトpFLT3の存在を示す、前記方法。
【請求項２０】
前記固定化された第一の抗体が、前記ウェルに約0.1μg／mL〜約10μg／mLの範囲の濃度で添加される、請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
約0.25ng〜約2.5μg、又は約2.5ng〜約250ngの第一の抗体が1ウェルあたりに添加される、請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記第一の抗体が、ヒトFLT3 27-543の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、請求項１〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記第一の抗体が、未変性型のヒトFLT3に免疫特異的に結合する、請求項１〜２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記第一の抗体が、膜近傍ドメイン（アミノ酸572〜603配列番号1の配列）、キナーゼ挿入領域アミノ酸配列番号1の配列の711〜780、細胞外ドメインアミノ酸配列番号1の配列の564〜993、及びC末端（配列番号1の配列のアミノ酸974〜993）のうちの1つ以上に免疫特異的に結合しない、請求項１〜２３のいずれか一項記載の方法。具体的な実施態様において、該第一の抗体は、ポリクローナル抗体ではない。
【請求項２５】
前記第一の抗体が、ポリクローナル抗体ではない、請求項１〜２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記第一の抗体が、マウスモノクローナル抗体である、請求項１〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記第二の抗体が、pFLT3のリン酸化型チロシン残基589、591、597、599、726、842、及び955のうちの1つ以上に免疫特異的に結合する、請求項１〜２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記第二の抗体が、前記リン酸化型チロシン残基589及び591のうちの1つ以上に単独で免疫特異的に結合しない、請求項１〜２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記第二の抗体が、マウスモノクローナル抗体である、請求項１〜２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記第二の抗体が、約0.1μg／mL〜約10μg／mLの範囲の濃度で前記試料と接触する、請求項１〜２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
約0.25ng〜約2.5μg、又は約2.5ng〜約250ngの第二の抗体が、1ウェルあたりに添加される、請求項１〜３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
1つ以上の容器にある、請求項１〜３１のいずれか一項記載の方法を実施するキット。
【請求項３３】
試料におけるヒトpFLT3の存在を検出するキットであって：
（a）多重ウェルプレート又は多重ドメインプレートの底部に電極を含む該プレート；
（b）ヒトFLT3の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する第一の抗体であって、該プレートのウェルに任意に固定化される該第一の抗体；
（c）ヒトpFLT3に免疫特異的に結合し、かつ該第一の抗体とは異なるFLT3エピトープに免疫特異的に結合し、かつ任意にビオチン化される第二の抗体；及び
（d）任意に、標識済みストレプトアビジンが、ルテニウム（II）トリ-ビピリジン-(4-メチルスルホナート)NHSエステルを含む、前記キット。
【請求項３４】
必要な試薬並びに任意でポジティブコントロール及びネガティブコントロールをさらに含む、請求項３２又は３３に記載のキット。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【公表番号】特表２０１２−５０８３６７（Ｐ２０１２−５０８３６７Ａ）
【公表日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３４９２７（Ｐ２０１１−５３４９２７）
【出願日】平成２１年１１月６日（２００９．１１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３５３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５４１８５
【国際公開日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【出願人】（５０８２７８２３９）
【Ｆターム（参考）】