レコンビナーゼポリメラーゼ増幅
【課題】レコンビナーゼポリメラーゼ増幅を提供すること。
【解決手段】本発明は、新規の、多様な、ハイブリッドおよび作成されたレコンビナーゼ酵素、ならびにDNA増幅アッセイを行うための、関連組換え因子をともなうそのような蛋白質の使用を、その特色とする。また、本発明は、DNA増幅アッセイにおける異なる生化学的活性を有する異なるレコンビナーゼ「系」、ならびに負荷因子、一本鎖DNA結合蛋白質(SSB)、および使用される密集剤の量についての異なる要求も、その特色とする。さらに詳しくは、本発明は、T6、Rb69、Aehl、およびKVP40ハイブリッドおよび作成蛋白質の使用、およびそのような蛋白質のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイにおける使用に関する。
【解決手段】本発明は、新規の、多様な、ハイブリッドおよび作成されたレコンビナーゼ酵素、ならびにDNA増幅アッセイを行うための、関連組換え因子をともなうそのような蛋白質の使用を、その特色とする。また、本発明は、DNA増幅アッセイにおける異なる生化学的活性を有する異なるレコンビナーゼ「系」、ならびに負荷因子、一本鎖DNA結合蛋白質(SSB)、および使用される密集剤の量についての異なる要求も、その特色とする。さらに詳しくは、本発明は、T6、Rb69、Aehl、およびKVP40ハイブリッドおよび作成蛋白質の使用、およびそのような蛋白質のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイにおける使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
二本鎖標的核酸分子の増幅のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
(a)UvsX、UvsY、およびgp32蛋白質を、該二本鎖標的核酸分子に対して特異的な第一および第二の一本鎖核酸プライマーと接触させて、第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーを形成させる工程であって、ここに、該UvsX、UvsY、およびgp32は、各々、ミオウイルス科ファージに由来し、およびここに、該UvsX、UvsY、およびgp32蛋白質のうちの2以下はT4ファージ蛋白質である、工程;
(b)該標的核酸分子を完全に変性することなく、該第一の核酸プライマーおよび該第二の核酸プライマーの3’末端が同一二本鎖標的核酸分子上で相互に対して向けられるように、該第一のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のDループ構造を作り出し、次いで、該第二のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該二本鎖標的核酸分子の第二の部分において第二のDループ構造を作り出す工程;
(c)ストランド変位合成を可能とする1以上のポリメラーゼおよびdNTPで該第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーの3’末端を延長して、第一および第二の二本鎖標的核酸分子および第一および第二の変位された核酸のストランドを作り出す工程;ならびに、
(d)所望の程度の増幅に到達するまで、(b)および(c)の反復を通じて反応を継続する工程;
を含む、方法。
【請求項2】
前記第一および第二の変位された核酸のストランドが工程(c)の後に相互にハイブリダイズして、第三の二本鎖標的核酸分子を形成する、請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記UvsX、UvsYおよびgp32蛋白質が由来する前記ミオウイルス科ファージが:T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、アシネトバクターファージ133、アエロモナスファージ65、シアノファージP−SSM2、シアノファージPSSM4、シアノファージS−PM2、Rb14、Rb32、アエロモナスファージ25、ビブリオファージnt−1、phi−1、Rb16、Rb43、ファージ31、ファージ44RR2.8t、Rb49、ファージRb3、およびファージLZ2から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項4】
前記UvsX、UvsYおよびgp32が:
(a)Rb69 UvsX、Rb69 UvsYおよびRb69 gp32;
(b)Aeh1 UvsX、Aeh1 UvsYおよびRb69 gp32;
(c)T4 UvsX、T4 UvsYおよびRb69 gp32;および
(d)T4 UvsX、Rb69 UvsYおよびT4 gp32
よりなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項5】
前記UvsX、UvsY、およびgp32が、同一または異なるミオウイルス科ファージ源からの天然、ハイブリッドまたは突然変異体蛋白質である、請求項1記載の方法。
【請求項6】
前記ハイブリッド蛋白質がミオウイルス科ファージの2つの異なる種からの1以上のアミノ酸残基を含んで、前記方法において改良された性能特徴を持つ蛋白質を生じる、請求項5記載の方法。
【請求項7】
前記UvsXが突然変異体UvsXである、請求項5記載の方法。
【請求項8】
前記突然変異体UvsXがRb69 UvsXアミノ酸配列において少なくとも1つの突然変異を含むRb69 UvsXであり、ここに、該突然変異は:
位置64におけるヒスチジンではないアミノ酸;
位置64におけるセリン;
C−末端における1以上のグルタミン酸残基の付加;
C−末端における1以上のアスパラギン酸残基の付加;および
その組合せ
よりなる群から選択される、請求項7記載の方法。
【請求項9】
前記突然変異体UvsXがT6 UvsXアミノ酸配列において少なくとも1つの突然変異を有するT6 UvsXであり、ここに、該突然変異が:
位置66におけるヒスチジンではないアミノ酸;
位置66におけるセリン;
C−末端における1以上のグルタミン酸残基の付加;
C−末端における1以上のアスパラギン酸残基の付加;および
その組合せ
よりなる群から選択される、請求項7記載の方法。
【請求項10】
前記ハイブリッド蛋白質が、異なるUvsX種からのアミノ酸配列を含む少なくとも1つの領域を含むUvsX蛋白質である、請求項6記載の方法。
【請求項11】
前記少なくとも1つの領域がUvsXのDNA−結合ループ−2領域である、請求項10記載の方法。
【請求項12】
前記方法がポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、フィコール(Ficoll)、デキストラン、PVP、アルブミンよりなる群から選択される、増幅を刺激する密集剤の存在下で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項13】
前記密集剤が200,000未満の分子量を有する、請求項12記載の方法。
【請求項14】
前記密集剤が約0.5w/v%ないし約15w/v%の量で存在する、請求項12記載の方法。
【請求項15】
前記ポリメラーゼがE.Coli Pol I、Bacillus subtilis
Pol I、Staphylococcus aureus Pol I、およびそのホモログよりなる群から選択される大断片ポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項16】
前記方法がヘパリンの存在下で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項17】
前記第一または第二の核酸プライマーがブロックされたプライマーであり、および前記方法がE.coliエキソヌクレアーゼIIIおよびE.coliエンドヌクレアーゼIVよりなる群から選択されるエンドヌクレアーゼの存在下で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項18】
前記方法が約1mMないし約8mMの二価マンガンイオンの存在下で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項19】
二本鎖標的核酸分子の増幅のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
(a)UvsX、およびgp32蛋白質を、該二本鎖標的核酸分子に対して特異的な第一および第二の一本鎖核酸プライマーと接触させて、第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーを形成させる工程であって、ここに、該UvsX、およびgp32は、各々、ミオウイルス科ファージに由来し、およびここに、該UvsX、およびgp32蛋白質のうちの1つ以下はT4ファージ蛋白質である、工程;
(b)該標的核酸分子を完全に変性することなく、該第一の核酸プライマーおよび該第二の核酸プライマーの3’末端が同一二本鎖標的核酸分子上で相互に対して向けられるように、該第一のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のDループ構造を作り出し、次いで、該第二のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該二本鎖標的核酸分子の第二の部分において第二のDループ構造を作り出す工程;
(c)ストランド変位合成を可能とする1以上のポリメラーゼおよびdNTPで該第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーの3’末端を延長して、第一および第二の二本鎖標的核酸分子および第一および第二の変位された核酸のストランドを作り出す工程;ならびに、
(d)所望の程度の増幅に到達するまで、(b)および(c)の反復を通じて反応を継続する工程;
を含む、方法であって、該方法は、UvsYの非存在下で行われる、方法。
【請求項20】
前記UvsX、UvsYまたはgp32蛋白質の少なくとも1つが配列番号:105、配列番号:106、配列番号:114、配列番号:115、配列番号:116、配列番号:117、配列番号:118、配列番号:119、配列番号:120、配列番号:121、配列番号:122、配列番号:123、および配列番号:124よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項21】
DNAの第一および第二のストランドでの二本鎖標的核酸分子の増幅のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
(a)UvsX、UvsY、およびgp32蛋白質を、該二本鎖標的核酸分子に対して特異的な第一の一本鎖核酸プライマーと接触させて、第一のヌクレオ蛋白質プライマーの集団を形成させる工程であって、ここに、該UvsX、UvsY、およびgp32は、各々、ミオウイルス科ファージに由来し、および該UvsX、UvsYおよびgp32蛋白質の2以下はT4ファージ蛋白質である工程;
(b)該第一のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子と接触させ、それにより、該標的核酸分子を完全に変性することなく、該二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のDループ構造を形成させる工程;
(c)ストランド変位合成が可能である1以上のポリメラーゼ、およびdNTPで該第一のヌクレオ蛋白質プライマーの3’末端を延長して、二本鎖標的核酸分子および変位した核酸分子のストランドを生じさせる工程;
(d)第二の一本鎖核酸プライマーを該変位した核酸分子のストランドとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズした第二の一本鎖核酸プライマーを形成させる工程;
(e)該ハイブリダイズした第二の一本鎖核酸プライマーを延長させて、二本鎖標的核酸分子を生じさせる工程;ならびに
(f)所望の程度の増幅に到達するまで、(b)から(e)の反復を通じて反応を継続する工程;
を含む、方法。
【請求項22】
前記UvsXが、配列番号:105のアミノ酸配列を含み、前記UvsYが、Rb69 UvsYであり、前記gp32蛋白質が、Rb69 gp32であり、そしてストランド変位合成を可能とする前記1以上のポリメラーゼが、DNAポリメラーゼ1である、請求項20記載の方法。
【請求項1】
二本鎖標的核酸分子の増幅のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
(a)UvsX、UvsY、およびgp32蛋白質を、該二本鎖標的核酸分子に対して特異的な第一および第二の一本鎖核酸プライマーと接触させて、第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーを形成させる工程であって、ここに、該UvsX、UvsY、およびgp32は、各々、ミオウイルス科ファージに由来し、およびここに、該UvsX、UvsY、およびgp32蛋白質のうちの2以下はT4ファージ蛋白質である、工程;
(b)該標的核酸分子を完全に変性することなく、該第一の核酸プライマーおよび該第二の核酸プライマーの3’末端が同一二本鎖標的核酸分子上で相互に対して向けられるように、該第一のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のDループ構造を作り出し、次いで、該第二のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該二本鎖標的核酸分子の第二の部分において第二のDループ構造を作り出す工程;
(c)ストランド変位合成を可能とする1以上のポリメラーゼおよびdNTPで該第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーの3’末端を延長して、第一および第二の二本鎖標的核酸分子および第一および第二の変位された核酸のストランドを作り出す工程;ならびに、
(d)所望の程度の増幅に到達するまで、(b)および(c)の反復を通じて反応を継続する工程;
を含む、方法。
【請求項2】
前記第一および第二の変位された核酸のストランドが工程(c)の後に相互にハイブリダイズして、第三の二本鎖標的核酸分子を形成する、請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記UvsX、UvsYおよびgp32蛋白質が由来する前記ミオウイルス科ファージが:T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、アシネトバクターファージ133、アエロモナスファージ65、シアノファージP−SSM2、シアノファージPSSM4、シアノファージS−PM2、Rb14、Rb32、アエロモナスファージ25、ビブリオファージnt−1、phi−1、Rb16、Rb43、ファージ31、ファージ44RR2.8t、Rb49、ファージRb3、およびファージLZ2から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項4】
前記UvsX、UvsYおよびgp32が:
(a)Rb69 UvsX、Rb69 UvsYおよびRb69 gp32;
(b)Aeh1 UvsX、Aeh1 UvsYおよびRb69 gp32;
(c)T4 UvsX、T4 UvsYおよびRb69 gp32;および
(d)T4 UvsX、Rb69 UvsYおよびT4 gp32
よりなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項5】
前記UvsX、UvsY、およびgp32が、同一または異なるミオウイルス科ファージ源からの天然、ハイブリッドまたは突然変異体蛋白質である、請求項1記載の方法。
【請求項6】
前記ハイブリッド蛋白質がミオウイルス科ファージの2つの異なる種からの1以上のアミノ酸残基を含んで、前記方法において改良された性能特徴を持つ蛋白質を生じる、請求項5記載の方法。
【請求項7】
前記UvsXが突然変異体UvsXである、請求項5記載の方法。
【請求項8】
前記突然変異体UvsXがRb69 UvsXアミノ酸配列において少なくとも1つの突然変異を含むRb69 UvsXであり、ここに、該突然変異は:
位置64におけるヒスチジンではないアミノ酸;
位置64におけるセリン;
C−末端における1以上のグルタミン酸残基の付加;
C−末端における1以上のアスパラギン酸残基の付加;および
その組合せ
よりなる群から選択される、請求項7記載の方法。
【請求項9】
前記突然変異体UvsXがT6 UvsXアミノ酸配列において少なくとも1つの突然変異を有するT6 UvsXであり、ここに、該突然変異が:
位置66におけるヒスチジンではないアミノ酸;
位置66におけるセリン;
C−末端における1以上のグルタミン酸残基の付加;
C−末端における1以上のアスパラギン酸残基の付加;および
その組合せ
よりなる群から選択される、請求項7記載の方法。
【請求項10】
前記ハイブリッド蛋白質が、異なるUvsX種からのアミノ酸配列を含む少なくとも1つの領域を含むUvsX蛋白質である、請求項6記載の方法。
【請求項11】
前記少なくとも1つの領域がUvsXのDNA−結合ループ−2領域である、請求項10記載の方法。
【請求項12】
前記方法がポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、フィコール(Ficoll)、デキストラン、PVP、アルブミンよりなる群から選択される、増幅を刺激する密集剤の存在下で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項13】
前記密集剤が200,000未満の分子量を有する、請求項12記載の方法。
【請求項14】
前記密集剤が約0.5w/v%ないし約15w/v%の量で存在する、請求項12記載の方法。
【請求項15】
前記ポリメラーゼがE.Coli Pol I、Bacillus subtilis
Pol I、Staphylococcus aureus Pol I、およびそのホモログよりなる群から選択される大断片ポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項16】
前記方法がヘパリンの存在下で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項17】
前記第一または第二の核酸プライマーがブロックされたプライマーであり、および前記方法がE.coliエキソヌクレアーゼIIIおよびE.coliエンドヌクレアーゼIVよりなる群から選択されるエンドヌクレアーゼの存在下で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項18】
前記方法が約1mMないし約8mMの二価マンガンイオンの存在下で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項19】
二本鎖標的核酸分子の増幅のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
(a)UvsX、およびgp32蛋白質を、該二本鎖標的核酸分子に対して特異的な第一および第二の一本鎖核酸プライマーと接触させて、第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーを形成させる工程であって、ここに、該UvsX、およびgp32は、各々、ミオウイルス科ファージに由来し、およびここに、該UvsX、およびgp32蛋白質のうちの1つ以下はT4ファージ蛋白質である、工程;
(b)該標的核酸分子を完全に変性することなく、該第一の核酸プライマーおよび該第二の核酸プライマーの3’末端が同一二本鎖標的核酸分子上で相互に対して向けられるように、該第一のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のDループ構造を作り出し、次いで、該第二のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該二本鎖標的核酸分子の第二の部分において第二のDループ構造を作り出す工程;
(c)ストランド変位合成を可能とする1以上のポリメラーゼおよびdNTPで該第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーの3’末端を延長して、第一および第二の二本鎖標的核酸分子および第一および第二の変位された核酸のストランドを作り出す工程;ならびに、
(d)所望の程度の増幅に到達するまで、(b)および(c)の反復を通じて反応を継続する工程;
を含む、方法であって、該方法は、UvsYの非存在下で行われる、方法。
【請求項20】
前記UvsX、UvsYまたはgp32蛋白質の少なくとも1つが配列番号:105、配列番号:106、配列番号:114、配列番号:115、配列番号:116、配列番号:117、配列番号:118、配列番号:119、配列番号:120、配列番号:121、配列番号:122、配列番号:123、および配列番号:124よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項21】
DNAの第一および第二のストランドでの二本鎖標的核酸分子の増幅のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
(a)UvsX、UvsY、およびgp32蛋白質を、該二本鎖標的核酸分子に対して特異的な第一の一本鎖核酸プライマーと接触させて、第一のヌクレオ蛋白質プライマーの集団を形成させる工程であって、ここに、該UvsX、UvsY、およびgp32は、各々、ミオウイルス科ファージに由来し、および該UvsX、UvsYおよびgp32蛋白質の2以下はT4ファージ蛋白質である工程;
(b)該第一のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子と接触させ、それにより、該標的核酸分子を完全に変性することなく、該二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のDループ構造を形成させる工程;
(c)ストランド変位合成が可能である1以上のポリメラーゼ、およびdNTPで該第一のヌクレオ蛋白質プライマーの3’末端を延長して、二本鎖標的核酸分子および変位した核酸分子のストランドを生じさせる工程;
(d)第二の一本鎖核酸プライマーを該変位した核酸分子のストランドとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズした第二の一本鎖核酸プライマーを形成させる工程;
(e)該ハイブリダイズした第二の一本鎖核酸プライマーを延長させて、二本鎖標的核酸分子を生じさせる工程;ならびに
(f)所望の程度の増幅に到達するまで、(b)から(e)の反復を通じて反応を継続する工程;
を含む、方法。
【請求項22】
前記UvsXが、配列番号:105のアミノ酸配列を含み、前記UvsYが、Rb69 UvsYであり、前記gp32蛋白質が、Rb69 gp32であり、そしてストランド変位合成を可能とする前記1以上のポリメラーゼが、DNAポリメラーゼ1である、請求項20記載の方法。
【図60】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59】
【図61】
【図62】
【図63】
【図64】
【図65】
【図66】
【図67】
【図68】
【図69】
【図70】
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【図3】
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【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59】
【図61】
【図62】
【図63】
【図64】
【図65】
【図66】
【図67】
【図68】
【図69】
【図70】
【図71】
【公開番号】特開2012−143236(P2012−143236A)
【公開日】平成24年8月2日(2012.8.2)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2012−45874(P2012−45874)
【出願日】平成24年3月1日(2012.3.1)
【分割の表示】特願2009−508545(P2009−508545)の分割
【原出願日】平成19年5月4日(2007.5.4)
【出願人】(512051941)アリーア サン ディエゴ, インコーポレイテッド (7)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成24年8月2日(2012.8.2)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−45874(P2012−45874)
【出願日】平成24年3月1日(2012.3.1)
【分割の表示】特願2009−508545(P2009−508545)の分割
【原出願日】平成19年5月4日(2007.5.4)
【出願人】(512051941)アリーア サン ディエゴ, インコーポレイテッド (7)
【Fターム(参考)】
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