レジン及びアスファルテン分解菌
【課題】レジン及びアスファルテンに対する優れた分解能力を有する新規微生物を提供すること、更に、当該微生物を利用した汚染環境の浄化方法、及び、レジン及びアスファルテンの分解方法を提供すること。
【解決手段】レジン分解能及びアスファルテン分解能を有するカンジダ・ボイディニー（Candida boidinii）GB01株（受領番号FERM AP-21834）。並びに当該微生物を利用した汚染環境の浄化方法、及びレジン又はアスファルテンの分解方法。
【解決手段】レジン分解能及びアスファルテン分解能を有するカンジダ・ボイディニー（Candida boidinii）GB01株（受領番号FERM AP-21834）。並びに当該微生物を利用した汚染環境の浄化方法、及びレジン又はアスファルテンの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レジン及びアスファルテンの分解が可能な新規微生物、またそれを利用したバイオレメディエーション技術に主に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油は、アルカンとその他の炭化水素の混合物である。これらの石油成分の中で、高分子量の炭化水素、特に、長鎖ノルマルアルカン、長鎖シクロアルカン、レジン、アスファルテン等は、揮発しにくく、また生分解を受け難い。そのため、石油に汚染された土壌には、これらの高分子量の炭化水素が長期間残留する。
【０００３】
石油汚染土壌を浄化する手段としては、微生物による炭化水素分解機能を利用したバイオレメディエーションが着目され、研究・開発が進められてきた。そして、この成果として、長鎖ノルマルアルカンおよび長鎖シクロアルカンを分解する微生物が環境中から分離され、これらをバイオレメディエーションへ利用する技術も構築されてきている（特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、これまでレジン及びアスファルテンを分解する能力に優れた微生物は得られていなかった。
【０００５】
上記のように、汚染土壌を浄化する技術としては、微生物の炭化水素分解能力を利用したバイオレメディエーションの利用開発が進められている。一方、レジン、アスファルテンは、環境中での残留性が非常に高いため、微量であっても、環境浄化の観点からみれば大きな問題である。
【０００６】
このため、石油汚染土壌をはじめとする環境浄化技術の向上を目指す上では、レジン、アスファルテンを分解できる微生物とそれを利用したバイオレメディエーション技術の構築が重要な課題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１３５４２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、レジン及びアスファルテンに対する優れた分解能力を有する新規微生物を提供すること、更に、当該微生物を利用したバイオレメディエーション技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題を解決することを主な目的として鋭意検討を重ねた結果、環境中からレジン及びアスファルテンに対する分解能力を備えた新規微生物を見出すことに成功し、更に、鋭意検討を重ねることによって本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は次の事項に関する。
【００１１】
項1：レジン分解能及びアスファルテン分解能を有するカンジダ・ボイディニー（Candida boidinii）GB01株（受領番号FERM AP-21834）。
【００１２】
項2：レジン又はアスファルテンで汚染された環境に、項1に記載の微生物を接触させることを特徴とする汚染環境の浄化方法。
【００１３】
項3：項1に記載の微生物を用いて、レジン又はアスファルテンを分解することを特徴とする、レジン又はアスファルテンの分解方法。
【００１４】
以下、本発明について、より詳細に説明する。
【００１５】
尚、本明細書において、「レジン」とは、多環芳香族が縮合した炭化水素であり、分子量が凡そ500-50,000で、軽質の炭化水素に溶解するものをいう。また「アスファルテン」とは、多環芳香族が縮合した炭化水素であり、分子量が凡そ1,000-100,000で、層状構造を形成しており、軽質の炭化水素に溶解しないものをいう。軽質の炭化水素としては、低分子量のパラフィン、例えば、ペンタン、ヘキサン等が挙げられる。
【００１６】
１．新規微生物
本発明の新規微生物カンジダ・ボイディニー（Candida boidinii）GB01株は、下記の菌学的性質を有する。
【００１７】
（1）科学的性質及び分類学的性質
26S rDNA-D1/D2の塩基配列解析を行った結果、配列表の配列番号１に記載の塩基配列が得られた。
【００１８】
また、当該塩基配列について、国際塩基配列データベース（GenBank／DDBJ／EMBL）に基づき、相同性検索を行ったところ、下記表１に示す結果となった。
【００１９】
【表１】
【００２０】
更に、本菌株の形態観察を行った結果、LB寒天培地（Polypeptone 10 g/L、Extract Yeast Dried 5 g/L、NaCl 5 g/L、Agar 20 g/L）上で、30℃下、培養3日間において、コロニーは以下の性状を示した。
【００２１】
直径：1〜2 mm
色調：クリーム色
形 ： 円形
隆起状態：扁平状
周縁：全縁
表面の形状等：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：バター様
【００２２】
上記塩基配列解析及び形状的特徴の結果から、本菌株はCandida boidiniiに属せしめるのが適当であると認められた。更に、後述の実施例に示すように本菌株は優れたレジン分解能及びアスファルテン分解能を有する菌であるが、Candida boidiniiに属する菌株においてこのような特性を有する菌はこれまで知られていない。
【００２３】
そのため、本菌を新菌株と認定し、GB01（ジービーゼロワン）株と命名した。本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に、受領番号FERM AP-21834として、平成21年8月12日に寄託された。以下本菌株をGB01株とも称する。
【００２４】
更に、本菌株の培養条件、保管条件を示すと、以下のとおりである。
【００２５】
（2）培養条件
培地名：LB培地（Polypeptone 10 g/L、Extract Yeast Dried 5 g/L、NaCl 5 g/L）
培地の殺菌条件：オートクレーブ（121 ℃、15 min）
培養温度： 30 ℃
培養期間：2〜3日
酸素要求性：好気
培養方法：好気培養
光要求性:不要
【００２６】
（3）保管条件
凍結乾燥法による保管：可能（保管温度：5℃、保護剤の組成：10％スキムミルク、1%グルタミン酸ナトリウム、pH無調整、加圧滅菌(115℃、15分)）
凍結法による保管（−80℃付近）：可能（保護剤：20％グリセロール）
継代培養による保管：固体培養、液体培養どちらでも可（植え継ぎ間隔：1ヶ月、保管温度：5℃）
【００２７】
本発明のCandida boidinii GB01株は、長鎖炭化水素、特にレジン及びアスファルテンを分解する能力に優れる。
【００２８】
レジン分解能及びアスファルテン分解能は、レジン及びアスファルテンに菌株を接触させてレジン及びアスファルテンの重量の変化や分解量を調べることによって測定することができる。或いは、レジン及びアスファルテンを含む物質等に、菌株を接触させて、当該物質に含まれるレジン及びアスファルテンの比率や残存量を調べることによっても測定することができる。具体的には、実施例に記載の方法に従ってレジン及びアスファルテンの分解能力を測定することができる。
【００２９】
本菌株Candida boidinii GB01株は、優れたレジン分解能及びアスファルテン分解能を有することから、汚染環境に対するバイオレメディエーションにおいてレジン及びアスファルテン分解菌として利用することができる。例えば、GB01株をレジン及びアスファルテン分解菌として石油汚染土壌に投与し、汚染土壌の浄化に利用することができる。
【００３０】
2．浄化方法
本発明の浄化方法は、上記Candida boidinii GB01株を、レジン又はアスファルテンで汚染された環境に接触させて、当該微生物の働きによりレジン又はアスファルテンを分解することを特徴とする。
【００３１】
レジン又はアスファルテンで汚染された環境としては、例えば、レジン又はアスファルテンが残留している土壌、海、河川、湖沼、排水、廃液などが挙げられる。
【００３２】
レジン又はアスファルテンは、石油又はアスファルトに含まれる成分であり、石油やアスファルトで汚染された環境も、本発明における汚染された環境に含まれる。
【００３３】
Candida boidinii GB01株を汚染環境に接触させる方法は特に限定されないが、例えば、Candida boidinii GB01株を土壌に投入したり、Candida boidinii GB01株を固定化した接触ろ材に排水を通水させたりして、接触させることができる。
【００３４】
また、接触におけるCandida boidinii GB01株の形態も適宜設定することができる。例えば、Candida boidiniiGB01株は生菌体として用いてもよく、製剤化した形として用いてもよい。また適当な固定化材料に固定化して用いてもよい。
【００３５】
処理条件、換言すると、Candida boidinii GB01株を汚染環境に接触させてレジン、アスファルテンの分解処理を行うための条件は、本発明の効果が奏される範囲内であれば特に限定されないが、例えば、温度範囲は通常10〜33℃程度、好ましくは20〜30℃程度である。また、処理時間、換言すると、環境中でCandida boidinii GB01株を培養する時間は、通常20〜60時間程度、特に30〜40時間程度である。
【００３６】
また接触させる微生物の量又は濃度も、残存するレジン、アスファルテンの量又は対象となる環境等によって適宜設定することができ、特に限定されないが、レジン1,000 mg/Lに対し、Candida boidinii GB01株は通常1×106〜1×109 cells/ml、好ましくは1×107〜1×109 cells/ml程度である。またアスファルテン1,000 mg/Lに対し、Candida boidinii GB01株は通常1×106〜1×109 cells/ml程度、好ましくは1×107〜1×109 cells/ml程度である。
【００３７】
また土壌の場合は、1,000 mg/kgに対し、Candida boidinii GB01株は通常1×106〜1×109 cells/g、好ましくは1×107〜1×109 cells/g程度である。
本発明の浄化方法においては、Candida boidinii GB01株に加えて更に他の微生物を汚染環境に接触させることもできる。
【００３８】
他の微生物は、炭化水素分解能を有し、Candida boidinii GB01株のレジン及びアスファルテン分解能を必要以上に阻害しないものから適宜設定することができる。特に、長鎖ノルマルアルカンや長鎖シクロアルカンを分解可能な微生物が好ましい。長鎖ノルマルアルカンや長鎖シクロアルカンを分解可能な微生物としては、例えば、ロドコッカス（Rhodococcus）属や、ゴルドニア（Gordonia）属の炭化水素分解菌等が挙げられる。また、他の微生物は１種用いてもよく、２種以上用いてもよい。
【００３９】
Candida boidinii GB01株と他の微生物とを組合せる条件は、適宜設定することができ、例えば、Candida boidinii GB01株及び他の微生物を同時に汚染環境に接触させてもよく、時間的間隔をおいて別々に接触させてもよい。また組み合わせる量も、本発明の効果を奏する範囲内で適宜設定することができる。
【００４０】
また、本発明の浄化方法においては、必要に応じ、微生物を汚染環境に接触させる工程以外の他の工程を更に設けることもできる。
【００４１】
他の工程としては、例えば、汚染環境に含まれるレジン又はアスファルテンの量を測定する工程や、汚染環境から予め夾雑物を除去する工程、遠心分離や濾過などの前処理工程、分解処理後の液の固液分離工程などが挙げられる。また、環境中に生息する微生物を活性化して、汚染物質の分解又は土壌の浄化を促進するための栄養成分の投入工程等を設けてもよい。
【００４２】
また、本発明の浄化方法及び分解方法には、微生物を用いた浄化方法及び汚染物質の分解方法に関する公知の技術を必要に応じて付加し得るものである。
【００４３】
3．分解方法
本発明の分解方法は、上記Candida boidinii GB01株の働きにより、レジン又はアスファルテンを分解することを特徴とする。
【００４４】
レジン又はアスファルテンは、アスファルトや残油等に含まれた形態であってもよく、クロマトグラフィー等によりそれらから分別された形態であってもよい。
【００４５】
また、石油汚染土壌等において、レジン又はアスファルテンが分解されずに残存しているように、環境中に残留成分として含まれた形態であってもよい。
【００４６】
レジン又はアスファルテンの分解条件は、本発明の効果が奏される範囲であれば特に限定されないが、例えば、温度範囲は通常10〜33℃程度、好ましくは20〜30℃程度である。
【００４７】
また接触させる微生物の量又は濃度もレジン、アスファルテンの量等によって適宜設定し得るが、レジン1,000 mgに対して、GB01株は通常109〜1012 cells、好ましくは1010〜1012 cells、アスファルテン1,000 mgに対して、GB01株は通常109〜1012 cells、好ましくは1010〜1012 cells程度である。
【００４８】
分解にあたっては、レジン又はアスファルテンそのものにCandida boidinii GB01株を接触させてもよく、またレジン又はアスファルテンを含む土壌、廃液、残油等にCandida boidinii GB01株を添加してもよい。
【００４９】
また、Candida boidinii GB01株の接触形態も特に限定されず、例えば、Candida boidinii GB01株を生菌体として用いてもよく、製剤化した形として用いてもよい。また適当な固定化材料に固定化して用いてもよい。
【発明の効果】
【００５０】
本発明によれば、レジン分解能及びアスファルテン分解能を有する微生物Candida boidinii GB01株が提供される。
【００５１】
レジン及びアスファルテンは難分解性であり、環境中に長期間残留するため、環境浄化における難点の一つであった。特に環境浄化技術の中でも微生物の分解能を利用したバイオレメディエーションは、現場での効率のよい浄化を可能にするため、着目を集め、研究開発が進められているが、従来、レジン及びアスファルテンの分解に利用可能な菌は知られていなかった。
【００５２】
これに対し、本発明によれば、レジン及びアスファルテンに対して優れた分解能力を有する微生物が提供される。本発明の微生物を用いれば、従来バイオレメディエーションでは処理が困難であったレジン及びアスファルテンを効率よく処理することが可能となる。
【００５３】
更に、本発明によれば、当該微生物を用いた汚染環境の浄化方法、並びに、レジン及びアスファルテンの分解方法が提供される。これにより、レジン及びアスファルテンを微生物で処理する方法が提供される。
【００５４】
このように、本発明は、微生物による環境浄化技術を向上させる新たな手段を提供するものであり、バイオレメディエーション等の微生物を用いた環境浄化の促進及び実用化に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】イアトロスキャンにより渣油及びアスファルトの組成成分を解析した結果を示す図面である。Aは渣油、Bはアスファルトの結果を示す。
【図２】イアトロスキャンにより菌株の液体培養によるアスファルトの分解を解析した結果を示す図面である。Aは未植菌の場合、BはC. boidinii GB01株を投与した場合の結果を示す図面である。
【図３】GB01株によるアスファルトに含まれる各成分の分解率を示した図面である。
【図４】イアトロスキャンにより菌株の液体培養によるアスファルト分解の経時変化を解析した結果を示す図面である。Aは未植菌の場合の結果を示す。BはGB01株投与後5日間培養した結果を示す。Cは GB01株投与後10日間培養した結果を示す。DはGB01株投与後15日間培養した結果を示す。
【図５】GB01株の液体培養によるアスファルトに含まれる各成分の分解率を示した図面である。
【図６】イアトロスキャンにより菌株を模擬汚染土壌に投与した場合によるアスファルト分解の経時変化を解析した結果を示す図面である。Aは未植菌の場合の結果を示す。Bは GB01株投与後5日間培養した結果を示す。Cは GB01株投与後10日間培養した結果を示す。Dは GB01株投与後15日間培養した結果を示す。Eは GB01株投与後20日間培養した結果を示す。Fは GB01株投与後25日間培養した結果を示す。
【図７】GB01株の土壌培養によるアスファルトに含まれる各成分の分解率を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下に実施例及び比較例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５７】
尚、下記実施例及び比較例において、「％」は、特に断らない限り、「重量％」を意味する。
【実施例】
【００５８】
１．解析方法
（1）総油分分解率
下記実施例及び試験例において、総油分分解率は、下記クロロホルム・メタノール抽出法により算出した。
【００５９】
培養液100 mlに対して、クロロホルム：メタノール（混合比＝3：1、vol）混合溶液を30 ml添加して十分混合することにより残存する油分をクロロホルム層に抽出した。混合液を250 ml容有機溶媒耐性遠心チューブに移し、himac CR22G（日立工機、東京）を用いて20℃、4,000×gで30分間遠心分離した。水層を除去し、クロロホルム層を50 ml容有機溶媒耐性遠心チューブに移した。これを20℃、10,000×gで10分間遠心分離した後、クロロホルム層5.0 mlをあらかじめ重量を測定したシャーレに注ぎ、室温で24時間乾燥させて溶媒を除去した。乾燥後、重量を測定して残存油分量を算出し、未植菌で同様の操作を行ったブランクと比較して油分分解率を以下の式１より算出した。
＜式１＞
【００６０】
【数１】
【００６１】
尚、式１において、ブランク値(g) = 0.231とした。
【００６２】
（2）イアトロスキャン分析法（TLC-FID）
実施例及び試験例で行ったイアトロスキャンは下記の条件で測定した。
クロロホルム・メタノール抽出法により得られた油分抽出サンプルを、クロマロッド（三菱化学ヤトロン、東京）に1 μlスポットし、風乾した後、n−ヘキサンで展開した（10 cm）。このクロマロッドを風乾させた後、アセトンで展開した（5 cm）。再度、風乾させた後、n−ヘキサン・アセトン混合溶液（混合比＝1：1、vol）で展開した（2 cm）。これを風乾させた後、イアトロスキャンMK-6s（三菱化学ヤトロン、東京）で解析し、ピーク面積比から炭化水素成分の構成比（飽和炭化水素、芳香族炭化水素、レジン、及びアスファルテン）を算出した。イアトロスキャンの分析条件を表２に示す。なお、各成分の保持時間は、A重油の分析結果を基準として決定した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
2．使用基質の検討
レジン、アスファルテン分解菌を分離するためには、レジン、アスファルテンを多く含む基質を使用する必要がある。そこで、レジン、アスファルテンを多く含むと考えられる渣油（日工株式会社より提供）とアスファルト（美松工業株式会社）について、炭化水素成分の構成比をイアトロスキャン（TLC-FID）により解析した（図1）。
【００６５】
図1から、本実験で用いた渣油にはアスファルテンが約9 %含まれていたが、レジンはほとんど含まれていなかった。一方、アスファルトにはレジン、アスファルテンがそれぞれ約8 %、約34 %含まれていた。
【００６６】
レジン又はアスファルテンの存在が確認されたことから、以降の実験では、これらの基質を用いて検討を行った。
【００６７】
3．レジン・アスファルテン分解菌の分離
（1）1次スクリーニング
レジン、アスファルテン分解菌を分離するため、渣油およびアスファルトを基質として1次スクリーニングを行った。0.1 %（w/v）の渣油またはアスファルトを含む改変SW培地に土壌サンプルを植菌し、OD660＞0.7の土壌サンプルを1次スクリーニング通過サンプルとした。128の土壌サンプル中、26サンプルがOD660＞0.7を示した。この培養液をLB寒天培地に塗布し、92菌株を単離した。
【００６８】
（2）2次スクリーニング
2次スクリーニングでは、1次スクリーニングで単離した菌株が、渣油またはアスファルトを含む改変SW培地に単独で生育できるかを確認した。92菌株中24菌株がOD660＞0.5を示したことから、これらを2次スクリーニング通過菌株とした。
【００６９】
（3）3次スクリーニング
3次スクリーニングでは、試験管スケールで基質として渣油を用いてその分解率を測定した。50 ml容試験管に渣油を0.1 %含む改変SW培地5 mlを入れ、121℃、15分オートクレーブ滅菌した。2次スクリーニング通過菌株をLB液体培地で一晩前培養し、前述の培地に植菌後、30℃、200 rpmで振盪培養した。5日後、クロロホルム・メタノール（3：1）混合溶液で残存油分を抽出し、乾燥重量を測定した。重量減少量から渣油の分解率を算出した。総油分分解率を表3に示す。
【００７０】
3次スクリーニングにおいて、下記のように高い分解率を示した菌株GB01を最終取得菌株とした。
【００７１】
【表３】
【００７２】
更に、GB01株について、生理・生化学試験や、26S rDNAの相同性検索などを行い、菌株の同定を行った。
【００７３】
4.GB01株の同定
GB01株について、下記のように26S rDNA-D1/D2の塩基配列を解析した。
【００７４】
Candida boidinii GB01株をLB培地に植菌し、30℃、48時間培養した培養液から、DNeasyTM Plant Mini Kit（QIAGEN、Hilden、Germany）を用いてDNAを精製した。得られたDNA配列を、下記プライマーNL1、NL2、NL3およびNL4（O’Donnell, K. (1993）, CAB International, Wllingford, UK, pp. 225-233）：
NL1 Forward 5'-gcata tcaat aagcg gaga aaag-3'（配列番号2）
NL2 Forward 5'-ctctc ttttc aaagt tcttt tcatc t-3'（配列番号3）
NL3 Reverse 5'-agatg aaaag aactt tgaaa agaga g-3'（配列番号4）
NL4 Reverse 5’-ggtcc gtgtt tcaag acgg-3’（配列番号5）
を用いて、puReTaq Ready-To-GoTM PCR beads（Amersham Biosciences、NJ、USA）を用いたPCRにより増幅し、BigDyeTM Terminator v3.1 Kit（Applied Biosystems、CA、USA）を用いたサイクルシークエンス法によりABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer System（Applied Biosystems、CA、USA）を用いて塩基配列を解析した。更に得られた塩基配列情報を元にChromasPro 1.12（Technelysium Pty Ltd.、Tewantin、AUS）を用いて一本の配列とし、塩基配列を決定した。
【００７５】
その結果、配列表の配列番号１に記載の塩基配列が得られた。
【００７６】
当該塩基配列について、国際塩基配列データベース（GenBank／DDBJ／EMBL）に基づき、相同性検索を行ったところ、下記表4に示す結果となった。
【００７７】
【表４】
【００７８】
上記のように、当該株は、Candida boidiniiと高い相同性を示すことが明らかになった。
【００７９】
更に、当株の最近縁種及び周辺近縁種は、いずれも安全度レベル（BSL）が1の菌種である。一方、当該株と、安全度レベルが2の「Candida albicans」とは、相同率が低く、90 %以下であった。
【００８０】
従って、Candida boidiniiとの相同性が高い本菌株は、安全度レベル1菌種であり、安全度レベル2には該当しないと判断した。
【００８１】
更に、本菌株の形態観察を行った。形態観察は、光学顕微鏡BX50F4（オリンパス、東京）及びマウント液（ラクトフェノールコットンブルー）を使用して、測定倍率1,500倍で行った。
【００８２】
その結果、LB寒天培地（Polypeptone 10 g/L、Extract Yeast Dried 5 g/L、NaCl 5 g/L、Agar 20 g/L）上で30℃下、培養3日間において、コロニーは以下の性状を示した。
【００８３】
直径：1〜2 mm
色調：クリーム色
形 ： 円形
隆起状態：扁平状
周縁：全縁
表面の形状等：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：バター様
【００８４】
上記塩基配列解析及び形状的特徴の結果から、本菌株はCandida boidiniiに属せしめるのが適当であると認められた。更に、下記実施例に示すように、本菌株は優れたレジン及びアスファルテン分解能を有している。Candida boidiniiに属する菌株においてこのような特性を有する菌はこれまで知られていないことから、本菌を新菌株と認定し、Candida boidinii GB01株と命名した。
【００８５】
5. 液体培養によるレジン、アスファルテン分解率の解析
GB01株について、基質におけるレジン、アスファルテン画分の分解を解析するため、アスファルト0.1%（w/v）を含有する改変SW培地に分離菌株の前培養液を1 %（v/v）植菌し、イアトロスキャンを用いてアスファルトに含まれる各成分の分解率を解析した。結果を図2に示す。AはGB01株を植菌しない以外は同様とした場合の結果を示す。また、BはGB01株を植菌した場合の結果を示す。
【００８６】
イアトロスキャンにおける保持時間0.40付近のピークはレジン分、また0.46付近のピークがアスファルテン分と考えられる。
【００８７】
図2の対比から明らかなように、未植菌におけるレジン分及びアスファルテン分の検出強度は、GB01株の植菌により、減少した。特に、アスファルテン分の減少が顕著であった。
【００８８】
また、図2におけるイアトロスキャンの結果及び総油分量を測定した結果から求めた、アスファルトに含まれる各成分の分解率を図3に示す。
【００８９】
GB01株では、レジン及びアスファルテンの減少が確認された。一方で、飽和分、芳香族分が増加していたが、これはレジン及びアスファルテンが分解され、飽和分、芳香族分に該当する分解産物が生成したのではないかと考えられた。
【００９０】
また、GB01株によるアスファルトの総油分分解率、またGB01株によるアスファルト中のレジン分解率及びアスファルテン分解率を表5に示す。
【００９１】
レジン分解率は、イアトロスキャン分析で算出したレジンの成分割合を、クロロホルム−メタノール抽出法により測定した総油分量に乗じ、レジンの残存量を算出し、これを下記式により未植菌の系と比較して、算出した。
【００９２】
【数２】
【００９３】
またアスファルテン分解率は、イアトロスキャン分析で算出したアスファルテンの成分割合を、クロロホルム−メタノール抽出法により測定した総油分量に乗じ、アスファルテンの残存量を算出し、これを下記式により未植菌の系と比較して、算出した。
【００９４】
【数３】
【００９５】
以下、レジン分解率及びアスファルテン分解率とは、上記と同様に算出された値を示す。
【００９６】
【表５】
【００９７】
上記のように、GB01株は、アスファルテン及びレジンの両者に対して優れた分解能を有することがわかった。
【００９８】
6. 液体培養の経時変化におけるレジン、アスファルテン分解能の解析
レジン、アスファルテンの経時的な分解を解析するため、アスファルト濃度0.1%(w/v)を含む改変SW培地にCandida boidinii GB01株を1 %（v/v）投与し、アスファルト分解を経時的にイアトロスキャンで解析した。結果を図4に示す。AはGB01株を投与しない以外は同様に試験した場合の結果を示す。BはGB01株投与後5日目の結果を示す。CはGB01株投与後10日目の結果を示す。DはGB01株投与後15日目の結果を示す。
【００９９】
また、GB01株の液体培養によるアスファルトに含まれる各成分の分解率を図5に示す。
【０１００】
図5に示されるように、Candida boidinii GB01株におけるアスファルテン分解率は、培養15日目において80.7%であった。また、レジン分解率は、培養15日目において、45.7%を示した。
【０１０１】
このように、Candida boidinii GB01株はレジン分解能及びアスファルテン分解能が非常に高いことが示された。
【０１０２】
7. 土壌中でのレジン、アスファルテン分解率の解析
Candida boidinii GB01株について、レジン、アスファルテン模擬汚染土壌でのアスファルト分解能を解析した。基質としてアスファルト5,000 mg/kg-soil、及び、GB01株1.0×108 cells/g-soilを土壌に投入した。培養期間は、25日とし、5日間ごとにレジン、アスファルテン分解率を解析した。イアトロスキャンの解析結果を図6に示す。AはGB01株を投入しない以外は同様に試験した場合の結果を示す。BはGB01株投与後5日目の結果を示す。CはGB01株投与後10日目の結果を示す。DはGB01株投与後15日目の結果を示す。EはGB01株投与後20日目の結果を示す。FはGB01株投与後25日目の結果を示す。
【０１０３】
また、アスファルトの各成分の経時変化の解析結果を図7に示す。
【０１０４】
図7に示されるように、アスファルト汚染土壌にCandida boidinii GB01株を投入した場合に、経時的に総炭化水素は減少し、炭化水素成分の中でも、アスファルテンが経時的に減少しているのが確認された。
【０１０５】
また培養25日目のアスファルトに対する総油分分解率、アスファルテン分解率、レジン分解率を表6に示す。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
表6に示されるように、土壌培養25日目において、20%を超える総油分量の減少が確認された。また、アスファルトの中でも、アスファルテンの分解率が高く、80.9%を示した。また、レジンについても、35.2%の分解率を示した。
【０１０８】
さらに、芳香族についても、69.6%の分解率が示された。
【０１０９】
一方、飽和炭化水素については、増加が確認されたことから、アスファルテン及びレジン、芳香族が分解され、飽和画分に移行したのではないかと考えられる。
【０１１０】
土壌培養におけるレジンとアスファルテンの分解が確認されたことから、GB01株は、レジン、アスファルテン汚染土壌中の浄化も可能と考えられた。
【０１１１】
8. レジン、アスファルテン分解菌による潤滑油（ベースオイル）の分解解析
更に、GB01株によるレジン、アスファルテン以外の炭化水素の分解能力についても、検討を行った。
【０１１２】
基質として、自動車用エンジンオイルのベースオイル（グレード：SAE10、新日本石油株式会社）を用いた。当該ベースオイルは、約15%の長鎖ノルマルアルカン（炭素数約16〜30）および約60%の長鎖シクロアルカン（側鎖の炭素数約4〜14のアルキルシクロヘキサンや環の数が2以上のシクロアルカン）で構成されている。
【０１１３】
Candida boidinii GB01株をLB培地5 mlに植菌し、30℃、180 rpmで24時間振盪培養した。この前培養液を、0.5 %（w/v）の前記ベースオイルを含む液体培地100 mlに植菌し、30℃、120 rpmで120時間振盪培養した（AT-12R、Thomas、東京）。培養後の残存油分の抽出および分解率の算出は、クロロホルム・メタノール抽出法により行った。
【０１１４】
その結果、ベースオイルの総油分分解率は、6.6 %であった。
【０１１５】
本培養条件において、GB01株が生育するために必要な炭素源・エネルギー源は、ベースオイルを分解することで得られる。従って、GB01株は、ベースオイル中の長鎖ノルマルアルカンや長鎖シクロアルカン等の長鎖炭化水素を分解し、炭素源・エネルギー源として利用できることが示唆される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レジン及びアスファルテンの分解が可能な新規微生物、またそれを利用したバイオレメディエーション技術に主に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油は、アルカンとその他の炭化水素の混合物である。これらの石油成分の中で、高分子量の炭化水素、特に、長鎖ノルマルアルカン、長鎖シクロアルカン、レジン、アスファルテン等は、揮発しにくく、また生分解を受け難い。そのため、石油に汚染された土壌には、これらの高分子量の炭化水素が長期間残留する。
【０００３】
石油汚染土壌を浄化する手段としては、微生物による炭化水素分解機能を利用したバイオレメディエーションが着目され、研究・開発が進められてきた。そして、この成果として、長鎖ノルマルアルカンおよび長鎖シクロアルカンを分解する微生物が環境中から分離され、これらをバイオレメディエーションへ利用する技術も構築されてきている（特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、これまでレジン及びアスファルテンを分解する能力に優れた微生物は得られていなかった。
【０００５】
上記のように、汚染土壌を浄化する技術としては、微生物の炭化水素分解能力を利用したバイオレメディエーションの利用開発が進められている。一方、レジン、アスファルテンは、環境中での残留性が非常に高いため、微量であっても、環境浄化の観点からみれば大きな問題である。
【０００６】
このため、石油汚染土壌をはじめとする環境浄化技術の向上を目指す上では、レジン、アスファルテンを分解できる微生物とそれを利用したバイオレメディエーション技術の構築が重要な課題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１３５４２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、レジン及びアスファルテンに対する優れた分解能力を有する新規微生物を提供すること、更に、当該微生物を利用したバイオレメディエーション技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題を解決することを主な目的として鋭意検討を重ねた結果、環境中からレジン及びアスファルテンに対する分解能力を備えた新規微生物を見出すことに成功し、更に、鋭意検討を重ねることによって本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は次の事項に関する。
【００１１】
項1：レジン分解能及びアスファルテン分解能を有するカンジダ・ボイディニー（Candida boidinii）GB01株（受領番号FERM AP-21834）。
【００１２】
項2：レジン又はアスファルテンで汚染された環境に、項1に記載の微生物を接触させることを特徴とする汚染環境の浄化方法。
【００１３】
項3：項1に記載の微生物を用いて、レジン又はアスファルテンを分解することを特徴とする、レジン又はアスファルテンの分解方法。
【００１４】
以下、本発明について、より詳細に説明する。
【００１５】
尚、本明細書において、「レジン」とは、多環芳香族が縮合した炭化水素であり、分子量が凡そ500-50,000で、軽質の炭化水素に溶解するものをいう。また「アスファルテン」とは、多環芳香族が縮合した炭化水素であり、分子量が凡そ1,000-100,000で、層状構造を形成しており、軽質の炭化水素に溶解しないものをいう。軽質の炭化水素としては、低分子量のパラフィン、例えば、ペンタン、ヘキサン等が挙げられる。
【００１６】
１．新規微生物
本発明の新規微生物カンジダ・ボイディニー（Candida boidinii）GB01株は、下記の菌学的性質を有する。
【００１７】
（1）科学的性質及び分類学的性質
26S rDNA-D1/D2の塩基配列解析を行った結果、配列表の配列番号１に記載の塩基配列が得られた。
【００１８】
また、当該塩基配列について、国際塩基配列データベース（GenBank／DDBJ／EMBL）に基づき、相同性検索を行ったところ、下記表１に示す結果となった。
【００１９】
【表１】
【００２０】
更に、本菌株の形態観察を行った結果、LB寒天培地（Polypeptone 10 g/L、Extract Yeast Dried 5 g/L、NaCl 5 g/L、Agar 20 g/L）上で、30℃下、培養3日間において、コロニーは以下の性状を示した。
【００２１】
直径：1〜2 mm
色調：クリーム色
形 ： 円形
隆起状態：扁平状
周縁：全縁
表面の形状等：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：バター様
【００２２】
上記塩基配列解析及び形状的特徴の結果から、本菌株はCandida boidiniiに属せしめるのが適当であると認められた。更に、後述の実施例に示すように本菌株は優れたレジン分解能及びアスファルテン分解能を有する菌であるが、Candida boidiniiに属する菌株においてこのような特性を有する菌はこれまで知られていない。
【００２３】
そのため、本菌を新菌株と認定し、GB01（ジービーゼロワン）株と命名した。本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に、受領番号FERM AP-21834として、平成21年8月12日に寄託された。以下本菌株をGB01株とも称する。
【００２４】
更に、本菌株の培養条件、保管条件を示すと、以下のとおりである。
【００２５】
（2）培養条件
培地名：LB培地（Polypeptone 10 g/L、Extract Yeast Dried 5 g/L、NaCl 5 g/L）
培地の殺菌条件：オートクレーブ（121 ℃、15 min）
培養温度： 30 ℃
培養期間：2〜3日
酸素要求性：好気
培養方法：好気培養
光要求性:不要
【００２６】
（3）保管条件
凍結乾燥法による保管：可能（保管温度：5℃、保護剤の組成：10％スキムミルク、1%グルタミン酸ナトリウム、pH無調整、加圧滅菌(115℃、15分)）
凍結法による保管（−80℃付近）：可能（保護剤：20％グリセロール）
継代培養による保管：固体培養、液体培養どちらでも可（植え継ぎ間隔：1ヶ月、保管温度：5℃）
【００２７】
本発明のCandida boidinii GB01株は、長鎖炭化水素、特にレジン及びアスファルテンを分解する能力に優れる。
【００２８】
レジン分解能及びアスファルテン分解能は、レジン及びアスファルテンに菌株を接触させてレジン及びアスファルテンの重量の変化や分解量を調べることによって測定することができる。或いは、レジン及びアスファルテンを含む物質等に、菌株を接触させて、当該物質に含まれるレジン及びアスファルテンの比率や残存量を調べることによっても測定することができる。具体的には、実施例に記載の方法に従ってレジン及びアスファルテンの分解能力を測定することができる。
【００２９】
本菌株Candida boidinii GB01株は、優れたレジン分解能及びアスファルテン分解能を有することから、汚染環境に対するバイオレメディエーションにおいてレジン及びアスファルテン分解菌として利用することができる。例えば、GB01株をレジン及びアスファルテン分解菌として石油汚染土壌に投与し、汚染土壌の浄化に利用することができる。
【００３０】
2．浄化方法
本発明の浄化方法は、上記Candida boidinii GB01株を、レジン又はアスファルテンで汚染された環境に接触させて、当該微生物の働きによりレジン又はアスファルテンを分解することを特徴とする。
【００３１】
レジン又はアスファルテンで汚染された環境としては、例えば、レジン又はアスファルテンが残留している土壌、海、河川、湖沼、排水、廃液などが挙げられる。
【００３２】
レジン又はアスファルテンは、石油又はアスファルトに含まれる成分であり、石油やアスファルトで汚染された環境も、本発明における汚染された環境に含まれる。
【００３３】
Candida boidinii GB01株を汚染環境に接触させる方法は特に限定されないが、例えば、Candida boidinii GB01株を土壌に投入したり、Candida boidinii GB01株を固定化した接触ろ材に排水を通水させたりして、接触させることができる。
【００３４】
また、接触におけるCandida boidinii GB01株の形態も適宜設定することができる。例えば、Candida boidiniiGB01株は生菌体として用いてもよく、製剤化した形として用いてもよい。また適当な固定化材料に固定化して用いてもよい。
【００３５】
処理条件、換言すると、Candida boidinii GB01株を汚染環境に接触させてレジン、アスファルテンの分解処理を行うための条件は、本発明の効果が奏される範囲内であれば特に限定されないが、例えば、温度範囲は通常10〜33℃程度、好ましくは20〜30℃程度である。また、処理時間、換言すると、環境中でCandida boidinii GB01株を培養する時間は、通常20〜60時間程度、特に30〜40時間程度である。
【００３６】
また接触させる微生物の量又は濃度も、残存するレジン、アスファルテンの量又は対象となる環境等によって適宜設定することができ、特に限定されないが、レジン1,000 mg/Lに対し、Candida boidinii GB01株は通常1×106〜1×109 cells/ml、好ましくは1×107〜1×109 cells/ml程度である。またアスファルテン1,000 mg/Lに対し、Candida boidinii GB01株は通常1×106〜1×109 cells/ml程度、好ましくは1×107〜1×109 cells/ml程度である。
【００３７】
また土壌の場合は、1,000 mg/kgに対し、Candida boidinii GB01株は通常1×106〜1×109 cells/g、好ましくは1×107〜1×109 cells/g程度である。
本発明の浄化方法においては、Candida boidinii GB01株に加えて更に他の微生物を汚染環境に接触させることもできる。
【００３８】
他の微生物は、炭化水素分解能を有し、Candida boidinii GB01株のレジン及びアスファルテン分解能を必要以上に阻害しないものから適宜設定することができる。特に、長鎖ノルマルアルカンや長鎖シクロアルカンを分解可能な微生物が好ましい。長鎖ノルマルアルカンや長鎖シクロアルカンを分解可能な微生物としては、例えば、ロドコッカス（Rhodococcus）属や、ゴルドニア（Gordonia）属の炭化水素分解菌等が挙げられる。また、他の微生物は１種用いてもよく、２種以上用いてもよい。
【００３９】
Candida boidinii GB01株と他の微生物とを組合せる条件は、適宜設定することができ、例えば、Candida boidinii GB01株及び他の微生物を同時に汚染環境に接触させてもよく、時間的間隔をおいて別々に接触させてもよい。また組み合わせる量も、本発明の効果を奏する範囲内で適宜設定することができる。
【００４０】
また、本発明の浄化方法においては、必要に応じ、微生物を汚染環境に接触させる工程以外の他の工程を更に設けることもできる。
【００４１】
他の工程としては、例えば、汚染環境に含まれるレジン又はアスファルテンの量を測定する工程や、汚染環境から予め夾雑物を除去する工程、遠心分離や濾過などの前処理工程、分解処理後の液の固液分離工程などが挙げられる。また、環境中に生息する微生物を活性化して、汚染物質の分解又は土壌の浄化を促進するための栄養成分の投入工程等を設けてもよい。
【００４２】
また、本発明の浄化方法及び分解方法には、微生物を用いた浄化方法及び汚染物質の分解方法に関する公知の技術を必要に応じて付加し得るものである。
【００４３】
3．分解方法
本発明の分解方法は、上記Candida boidinii GB01株の働きにより、レジン又はアスファルテンを分解することを特徴とする。
【００４４】
レジン又はアスファルテンは、アスファルトや残油等に含まれた形態であってもよく、クロマトグラフィー等によりそれらから分別された形態であってもよい。
【００４５】
また、石油汚染土壌等において、レジン又はアスファルテンが分解されずに残存しているように、環境中に残留成分として含まれた形態であってもよい。
【００４６】
レジン又はアスファルテンの分解条件は、本発明の効果が奏される範囲であれば特に限定されないが、例えば、温度範囲は通常10〜33℃程度、好ましくは20〜30℃程度である。
【００４７】
また接触させる微生物の量又は濃度もレジン、アスファルテンの量等によって適宜設定し得るが、レジン1,000 mgに対して、GB01株は通常109〜1012 cells、好ましくは1010〜1012 cells、アスファルテン1,000 mgに対して、GB01株は通常109〜1012 cells、好ましくは1010〜1012 cells程度である。
【００４８】
分解にあたっては、レジン又はアスファルテンそのものにCandida boidinii GB01株を接触させてもよく、またレジン又はアスファルテンを含む土壌、廃液、残油等にCandida boidinii GB01株を添加してもよい。
【００４９】
また、Candida boidinii GB01株の接触形態も特に限定されず、例えば、Candida boidinii GB01株を生菌体として用いてもよく、製剤化した形として用いてもよい。また適当な固定化材料に固定化して用いてもよい。
【発明の効果】
【００５０】
本発明によれば、レジン分解能及びアスファルテン分解能を有する微生物Candida boidinii GB01株が提供される。
【００５１】
レジン及びアスファルテンは難分解性であり、環境中に長期間残留するため、環境浄化における難点の一つであった。特に環境浄化技術の中でも微生物の分解能を利用したバイオレメディエーションは、現場での効率のよい浄化を可能にするため、着目を集め、研究開発が進められているが、従来、レジン及びアスファルテンの分解に利用可能な菌は知られていなかった。
【００５２】
これに対し、本発明によれば、レジン及びアスファルテンに対して優れた分解能力を有する微生物が提供される。本発明の微生物を用いれば、従来バイオレメディエーションでは処理が困難であったレジン及びアスファルテンを効率よく処理することが可能となる。
【００５３】
更に、本発明によれば、当該微生物を用いた汚染環境の浄化方法、並びに、レジン及びアスファルテンの分解方法が提供される。これにより、レジン及びアスファルテンを微生物で処理する方法が提供される。
【００５４】
このように、本発明は、微生物による環境浄化技術を向上させる新たな手段を提供するものであり、バイオレメディエーション等の微生物を用いた環境浄化の促進及び実用化に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】イアトロスキャンにより渣油及びアスファルトの組成成分を解析した結果を示す図面である。Aは渣油、Bはアスファルトの結果を示す。
【図２】イアトロスキャンにより菌株の液体培養によるアスファルトの分解を解析した結果を示す図面である。Aは未植菌の場合、BはC. boidinii GB01株を投与した場合の結果を示す図面である。
【図３】GB01株によるアスファルトに含まれる各成分の分解率を示した図面である。
【図４】イアトロスキャンにより菌株の液体培養によるアスファルト分解の経時変化を解析した結果を示す図面である。Aは未植菌の場合の結果を示す。BはGB01株投与後5日間培養した結果を示す。Cは GB01株投与後10日間培養した結果を示す。DはGB01株投与後15日間培養した結果を示す。
【図５】GB01株の液体培養によるアスファルトに含まれる各成分の分解率を示した図面である。
【図６】イアトロスキャンにより菌株を模擬汚染土壌に投与した場合によるアスファルト分解の経時変化を解析した結果を示す図面である。Aは未植菌の場合の結果を示す。Bは GB01株投与後5日間培養した結果を示す。Cは GB01株投与後10日間培養した結果を示す。Dは GB01株投与後15日間培養した結果を示す。Eは GB01株投与後20日間培養した結果を示す。Fは GB01株投与後25日間培養した結果を示す。
【図７】GB01株の土壌培養によるアスファルトに含まれる各成分の分解率を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下に実施例及び比較例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５７】
尚、下記実施例及び比較例において、「％」は、特に断らない限り、「重量％」を意味する。
【実施例】
【００５８】
１．解析方法
（1）総油分分解率
下記実施例及び試験例において、総油分分解率は、下記クロロホルム・メタノール抽出法により算出した。
【００５９】
培養液100 mlに対して、クロロホルム：メタノール（混合比＝3：1、vol）混合溶液を30 ml添加して十分混合することにより残存する油分をクロロホルム層に抽出した。混合液を250 ml容有機溶媒耐性遠心チューブに移し、himac CR22G（日立工機、東京）を用いて20℃、4,000×gで30分間遠心分離した。水層を除去し、クロロホルム層を50 ml容有機溶媒耐性遠心チューブに移した。これを20℃、10,000×gで10分間遠心分離した後、クロロホルム層5.0 mlをあらかじめ重量を測定したシャーレに注ぎ、室温で24時間乾燥させて溶媒を除去した。乾燥後、重量を測定して残存油分量を算出し、未植菌で同様の操作を行ったブランクと比較して油分分解率を以下の式１より算出した。
＜式１＞
【００６０】
【数１】
【００６１】
尚、式１において、ブランク値(g) = 0.231とした。
【００６２】
（2）イアトロスキャン分析法（TLC-FID）
実施例及び試験例で行ったイアトロスキャンは下記の条件で測定した。
クロロホルム・メタノール抽出法により得られた油分抽出サンプルを、クロマロッド（三菱化学ヤトロン、東京）に1 μlスポットし、風乾した後、n−ヘキサンで展開した（10 cm）。このクロマロッドを風乾させた後、アセトンで展開した（5 cm）。再度、風乾させた後、n−ヘキサン・アセトン混合溶液（混合比＝1：1、vol）で展開した（2 cm）。これを風乾させた後、イアトロスキャンMK-6s（三菱化学ヤトロン、東京）で解析し、ピーク面積比から炭化水素成分の構成比（飽和炭化水素、芳香族炭化水素、レジン、及びアスファルテン）を算出した。イアトロスキャンの分析条件を表２に示す。なお、各成分の保持時間は、A重油の分析結果を基準として決定した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
2．使用基質の検討
レジン、アスファルテン分解菌を分離するためには、レジン、アスファルテンを多く含む基質を使用する必要がある。そこで、レジン、アスファルテンを多く含むと考えられる渣油（日工株式会社より提供）とアスファルト（美松工業株式会社）について、炭化水素成分の構成比をイアトロスキャン（TLC-FID）により解析した（図1）。
【００６５】
図1から、本実験で用いた渣油にはアスファルテンが約9 %含まれていたが、レジンはほとんど含まれていなかった。一方、アスファルトにはレジン、アスファルテンがそれぞれ約8 %、約34 %含まれていた。
【００６６】
レジン又はアスファルテンの存在が確認されたことから、以降の実験では、これらの基質を用いて検討を行った。
【００６７】
3．レジン・アスファルテン分解菌の分離
（1）1次スクリーニング
レジン、アスファルテン分解菌を分離するため、渣油およびアスファルトを基質として1次スクリーニングを行った。0.1 %（w/v）の渣油またはアスファルトを含む改変SW培地に土壌サンプルを植菌し、OD660＞0.7の土壌サンプルを1次スクリーニング通過サンプルとした。128の土壌サンプル中、26サンプルがOD660＞0.7を示した。この培養液をLB寒天培地に塗布し、92菌株を単離した。
【００６８】
（2）2次スクリーニング
2次スクリーニングでは、1次スクリーニングで単離した菌株が、渣油またはアスファルトを含む改変SW培地に単独で生育できるかを確認した。92菌株中24菌株がOD660＞0.5を示したことから、これらを2次スクリーニング通過菌株とした。
【００６９】
（3）3次スクリーニング
3次スクリーニングでは、試験管スケールで基質として渣油を用いてその分解率を測定した。50 ml容試験管に渣油を0.1 %含む改変SW培地5 mlを入れ、121℃、15分オートクレーブ滅菌した。2次スクリーニング通過菌株をLB液体培地で一晩前培養し、前述の培地に植菌後、30℃、200 rpmで振盪培養した。5日後、クロロホルム・メタノール（3：1）混合溶液で残存油分を抽出し、乾燥重量を測定した。重量減少量から渣油の分解率を算出した。総油分分解率を表3に示す。
【００７０】
3次スクリーニングにおいて、下記のように高い分解率を示した菌株GB01を最終取得菌株とした。
【００７１】
【表３】
【００７２】
更に、GB01株について、生理・生化学試験や、26S rDNAの相同性検索などを行い、菌株の同定を行った。
【００７３】
4.GB01株の同定
GB01株について、下記のように26S rDNA-D1/D2の塩基配列を解析した。
【００７４】
Candida boidinii GB01株をLB培地に植菌し、30℃、48時間培養した培養液から、DNeasyTM Plant Mini Kit（QIAGEN、Hilden、Germany）を用いてDNAを精製した。得られたDNA配列を、下記プライマーNL1、NL2、NL3およびNL4（O’Donnell, K. (1993）, CAB International, Wllingford, UK, pp. 225-233）：
NL1 Forward 5'-gcata tcaat aagcg gaga aaag-3'（配列番号2）
NL2 Forward 5'-ctctc ttttc aaagt tcttt tcatc t-3'（配列番号3）
NL3 Reverse 5'-agatg aaaag aactt tgaaa agaga g-3'（配列番号4）
NL4 Reverse 5’-ggtcc gtgtt tcaag acgg-3’（配列番号5）
を用いて、puReTaq Ready-To-GoTM PCR beads（Amersham Biosciences、NJ、USA）を用いたPCRにより増幅し、BigDyeTM Terminator v3.1 Kit（Applied Biosystems、CA、USA）を用いたサイクルシークエンス法によりABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer System（Applied Biosystems、CA、USA）を用いて塩基配列を解析した。更に得られた塩基配列情報を元にChromasPro 1.12（Technelysium Pty Ltd.、Tewantin、AUS）を用いて一本の配列とし、塩基配列を決定した。
【００７５】
その結果、配列表の配列番号１に記載の塩基配列が得られた。
【００７６】
当該塩基配列について、国際塩基配列データベース（GenBank／DDBJ／EMBL）に基づき、相同性検索を行ったところ、下記表4に示す結果となった。
【００７７】
【表４】
【００７８】
上記のように、当該株は、Candida boidiniiと高い相同性を示すことが明らかになった。
【００７９】
更に、当株の最近縁種及び周辺近縁種は、いずれも安全度レベル（BSL）が1の菌種である。一方、当該株と、安全度レベルが2の「Candida albicans」とは、相同率が低く、90 %以下であった。
【００８０】
従って、Candida boidiniiとの相同性が高い本菌株は、安全度レベル1菌種であり、安全度レベル2には該当しないと判断した。
【００８１】
更に、本菌株の形態観察を行った。形態観察は、光学顕微鏡BX50F4（オリンパス、東京）及びマウント液（ラクトフェノールコットンブルー）を使用して、測定倍率1,500倍で行った。
【００８２】
その結果、LB寒天培地（Polypeptone 10 g/L、Extract Yeast Dried 5 g/L、NaCl 5 g/L、Agar 20 g/L）上で30℃下、培養3日間において、コロニーは以下の性状を示した。
【００８３】
直径：1〜2 mm
色調：クリーム色
形 ： 円形
隆起状態：扁平状
周縁：全縁
表面の形状等：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：バター様
【００８４】
上記塩基配列解析及び形状的特徴の結果から、本菌株はCandida boidiniiに属せしめるのが適当であると認められた。更に、下記実施例に示すように、本菌株は優れたレジン及びアスファルテン分解能を有している。Candida boidiniiに属する菌株においてこのような特性を有する菌はこれまで知られていないことから、本菌を新菌株と認定し、Candida boidinii GB01株と命名した。
【００８５】
5. 液体培養によるレジン、アスファルテン分解率の解析
GB01株について、基質におけるレジン、アスファルテン画分の分解を解析するため、アスファルト0.1%（w/v）を含有する改変SW培地に分離菌株の前培養液を1 %（v/v）植菌し、イアトロスキャンを用いてアスファルトに含まれる各成分の分解率を解析した。結果を図2に示す。AはGB01株を植菌しない以外は同様とした場合の結果を示す。また、BはGB01株を植菌した場合の結果を示す。
【００８６】
イアトロスキャンにおける保持時間0.40付近のピークはレジン分、また0.46付近のピークがアスファルテン分と考えられる。
【００８７】
図2の対比から明らかなように、未植菌におけるレジン分及びアスファルテン分の検出強度は、GB01株の植菌により、減少した。特に、アスファルテン分の減少が顕著であった。
【００８８】
また、図2におけるイアトロスキャンの結果及び総油分量を測定した結果から求めた、アスファルトに含まれる各成分の分解率を図3に示す。
【００８９】
GB01株では、レジン及びアスファルテンの減少が確認された。一方で、飽和分、芳香族分が増加していたが、これはレジン及びアスファルテンが分解され、飽和分、芳香族分に該当する分解産物が生成したのではないかと考えられた。
【００９０】
また、GB01株によるアスファルトの総油分分解率、またGB01株によるアスファルト中のレジン分解率及びアスファルテン分解率を表5に示す。
【００９１】
レジン分解率は、イアトロスキャン分析で算出したレジンの成分割合を、クロロホルム−メタノール抽出法により測定した総油分量に乗じ、レジンの残存量を算出し、これを下記式により未植菌の系と比較して、算出した。
【００９２】
【数２】
【００９３】
またアスファルテン分解率は、イアトロスキャン分析で算出したアスファルテンの成分割合を、クロロホルム−メタノール抽出法により測定した総油分量に乗じ、アスファルテンの残存量を算出し、これを下記式により未植菌の系と比較して、算出した。
【００９４】
【数３】
【００９５】
以下、レジン分解率及びアスファルテン分解率とは、上記と同様に算出された値を示す。
【００９６】
【表５】
【００９７】
上記のように、GB01株は、アスファルテン及びレジンの両者に対して優れた分解能を有することがわかった。
【００９８】
6. 液体培養の経時変化におけるレジン、アスファルテン分解能の解析
レジン、アスファルテンの経時的な分解を解析するため、アスファルト濃度0.1%(w/v)を含む改変SW培地にCandida boidinii GB01株を1 %（v/v）投与し、アスファルト分解を経時的にイアトロスキャンで解析した。結果を図4に示す。AはGB01株を投与しない以外は同様に試験した場合の結果を示す。BはGB01株投与後5日目の結果を示す。CはGB01株投与後10日目の結果を示す。DはGB01株投与後15日目の結果を示す。
【００９９】
また、GB01株の液体培養によるアスファルトに含まれる各成分の分解率を図5に示す。
【０１００】
図5に示されるように、Candida boidinii GB01株におけるアスファルテン分解率は、培養15日目において80.7%であった。また、レジン分解率は、培養15日目において、45.7%を示した。
【０１０１】
このように、Candida boidinii GB01株はレジン分解能及びアスファルテン分解能が非常に高いことが示された。
【０１０２】
7. 土壌中でのレジン、アスファルテン分解率の解析
Candida boidinii GB01株について、レジン、アスファルテン模擬汚染土壌でのアスファルト分解能を解析した。基質としてアスファルト5,000 mg/kg-soil、及び、GB01株1.0×108 cells/g-soilを土壌に投入した。培養期間は、25日とし、5日間ごとにレジン、アスファルテン分解率を解析した。イアトロスキャンの解析結果を図6に示す。AはGB01株を投入しない以外は同様に試験した場合の結果を示す。BはGB01株投与後5日目の結果を示す。CはGB01株投与後10日目の結果を示す。DはGB01株投与後15日目の結果を示す。EはGB01株投与後20日目の結果を示す。FはGB01株投与後25日目の結果を示す。
【０１０３】
また、アスファルトの各成分の経時変化の解析結果を図7に示す。
【０１０４】
図7に示されるように、アスファルト汚染土壌にCandida boidinii GB01株を投入した場合に、経時的に総炭化水素は減少し、炭化水素成分の中でも、アスファルテンが経時的に減少しているのが確認された。
【０１０５】
また培養25日目のアスファルトに対する総油分分解率、アスファルテン分解率、レジン分解率を表6に示す。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
表6に示されるように、土壌培養25日目において、20%を超える総油分量の減少が確認された。また、アスファルトの中でも、アスファルテンの分解率が高く、80.9%を示した。また、レジンについても、35.2%の分解率を示した。
【０１０８】
さらに、芳香族についても、69.6%の分解率が示された。
【０１０９】
一方、飽和炭化水素については、増加が確認されたことから、アスファルテン及びレジン、芳香族が分解され、飽和画分に移行したのではないかと考えられる。
【０１１０】
土壌培養におけるレジンとアスファルテンの分解が確認されたことから、GB01株は、レジン、アスファルテン汚染土壌中の浄化も可能と考えられた。
【０１１１】
8. レジン、アスファルテン分解菌による潤滑油（ベースオイル）の分解解析
更に、GB01株によるレジン、アスファルテン以外の炭化水素の分解能力についても、検討を行った。
【０１１２】
基質として、自動車用エンジンオイルのベースオイル（グレード：SAE10、新日本石油株式会社）を用いた。当該ベースオイルは、約15%の長鎖ノルマルアルカン（炭素数約16〜30）および約60%の長鎖シクロアルカン（側鎖の炭素数約4〜14のアルキルシクロヘキサンや環の数が2以上のシクロアルカン）で構成されている。
【０１１３】
Candida boidinii GB01株をLB培地5 mlに植菌し、30℃、180 rpmで24時間振盪培養した。この前培養液を、0.5 %（w/v）の前記ベースオイルを含む液体培地100 mlに植菌し、30℃、120 rpmで120時間振盪培養した（AT-12R、Thomas、東京）。培養後の残存油分の抽出および分解率の算出は、クロロホルム・メタノール抽出法により行った。
【０１１４】
その結果、ベースオイルの総油分分解率は、6.6 %であった。
【０１１５】
本培養条件において、GB01株が生育するために必要な炭素源・エネルギー源は、ベースオイルを分解することで得られる。従って、GB01株は、ベースオイル中の長鎖ノルマルアルカンや長鎖シクロアルカン等の長鎖炭化水素を分解し、炭素源・エネルギー源として利用できることが示唆される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レジン分解能及びアスファルテン分解能を有するカンジダ・ボイディニー（Candida boidinii） GB01株（受領番号FERM AP-21834）。
【請求項２】
レジン又はアスファルテンで汚染された環境に、請求項１に記載の微生物を接触させることを特徴とする汚染環境の浄化方法。
【請求項３】
請求項１に記載の微生物を用いて、レジン又はアスファルテンを分解することを特徴とする、レジン又はアスファルテンの分解方法。
【請求項１】
レジン分解能及びアスファルテン分解能を有するカンジダ・ボイディニー（Candida boidinii） GB01株（受領番号FERM AP-21834）。
【請求項２】
レジン又はアスファルテンで汚染された環境に、請求項１に記載の微生物を接触させることを特徴とする汚染環境の浄化方法。
【請求項３】
請求項１に記載の微生物を用いて、レジン又はアスファルテンを分解することを特徴とする、レジン又はアスファルテンの分解方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−４１５４５（Ｐ２０１１−４１５４５Ａ）
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９３２４２（Ｐ２００９−１９３２４２）
【出願日】平成２１年８月２４日（２００９．８．２４）
【出願人】（５９３００６６３０）学校法人立命館 (359)
【出願人】（５０９２３８４０９）株式会社グリーンビズ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２４日（２００９．８．２４）
【出願人】（５９３００６６３０）学校法人立命館 (359)
【出願人】（５０９２３８４０９）株式会社グリーンビズ (1)
【Ｆターム（参考）】
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