レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの製法
【課題】本発明は、レドックスたんぱく質を、ポリマー結合材を使用することなく非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの作製方法を提供することを課題とする。
【解決手段】ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの製法であって、次の工程を含んでいる製法を用いることによって前記課題を解決できる。
(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；
(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；
(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；
(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブを分離する。
【解決手段】ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの製法であって、次の工程を含んでいる製法を用いることによって前記課題を解決できる。
(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；
(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；
(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；
(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブを分離する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学的検知のためのバイオセンサーの分野で役立つレドックスたんぱく質を（ポリマー結合材を使用することなく）非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ナノスケールの物質に基づく酵素バイオセンサーについての多くの努力は、そのバイオ医学的な重要性のゆえに、グルコース・バイオセンサーの創作に向けられている。そのようなグルコース・バイオセンサーは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）とグルコース・オキシダーゼ（ＧＯｘ）との組合せに基づくものであった。グルコース・オキシダーゼとカーボンナノチューブとを、例えば、テフロン（非特許文献１）、鉱油（M.D.Rubianes et al, 2003）、硬エポキシ（B.Perez et al, 2005）、ナフィオン（J.Wang et al, 2004）、ポリピロール（M.Gao et al, 2003; Y.C.Tsai et al, 2006; J.Wang et al, 2005）、キトサン（Y. Liu et al, 2006）、あるいはゾル−ゲル・マトリックス（A.Salimi et al, 2004）中で、物理的に結合（化学的結合ではない）させて、グルコースを検知するバイオ認識／電気化学的システムをつくり出すことにより、有効なグルコース・バイオセンサーが構築されうることが示された。一方、少数ながら、グルコースとカーボンナノチューブとを化学結合により結合させようとする研究もある（F.Patolsky et al, 2004;J.Liu et al, 2005; Y. Lin et al, 2004）。
【０００３】
レドックス酵素バイオセンサーに基づくカーボンナノチューブの分野において公表された印刷物の多くにおいては、酵素とカーボンナノチューブ及び／又はポリマー・マトリックスとの間で何らの化学結合をさせることなく、酵素とカーボンナノチューブとを有機もしくは無機のポリマー結合材の中に取り込んでいることに注目するべきである。しかし、これらバイオセンサーの作製においては、酵素は電極物質（カーボンナノチューブでもポリマー結合材でもない）に共有結合で固定されていないので、結合材の使用が本当に必要であるのか、あるいは、グルコース・オキシダーゼをカーボンナノチューブの上に直接に固定させて、電気化学的グルコース・バイオセンサーをつくり出すことが可能かどうかを知ることは興味深いことであろう。
【０００４】
高度に特異的な電気的バイオセンサーに向けて、非共有結合によってカーボンナノチューブを機能化する本質的・重要な仕事は、これまでにいくつかなされてきたが（M.Shim et al, 2002;R.J.Chenet al, 2004; R.J.Chen et al, 2003; D.-W. Park et al, 2006）、電気化学的バイオセンサーに向けての努力はなされていない。
【０００５】
【非特許文献１】J. Wang, M. Musameh, Anal. Chem. 75, 2075 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、レドックスたんぱく質を、ポリマー結合材を使用することなく非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの作製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
〔発明の概要〕
上記目的を達成するため、どのようにすればポリマー結合材を要することなく、グルコース・オキシダーゼ（ＧＯｘ）がカーボンナノチューブのネットワークに固定されうるのか、我々は種々検討した。そして、カーボンナノチューブ上にレドックスたんぱく質ＧＯｘを非共有結合的に吸着させることに成功し、また、得られたＣＮＴ／ＧＯｘハイブリッドはグルコースの検出に好都合な性質を示すものであった。
【０００８】
すなわち、本発明は、 ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブ（すなわち、カーボンナノチューブ／レドックスたんぱく質のハイブリッド）を提供する。
【０００９】
また、本発明は、（ポリマー結合材を使用することなく）レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した前記生体反応性カーボンナノチューブの製法も提供するもの
であり、その製法は以下の工程を含んでいる：
(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；
(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；
(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；
(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブ（固体）を分離する。
【００１０】
＜略号＞
用いた略号の意味は次の通り。
ＣＮＴ：カーボンナノチューブ
ＤＷＣＮＴ：二層（double walled）カーボンナノチューブ
ＧＯｘ：グルコース・オキシダーゼ
【発明の効果】
【００１１】
本発明の、（ポリマー結合材なしで）レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブは、バイオセンサーを容易に構築する場合に扉を開くものである。これらは、例えば、電気化学的バイオセンサー（例：グルコースセンサー）として用いることができる。
[発明の実施の形態]
【００１２】
〔発明の更に詳しい説明〕
次に、本発明を更に詳細に説明する。
先に述べたように、本発明は、ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブを提供するものであり、言い換えれば、ポリマー結合材のない生体反応性カーボンナノチューブ／レドックスたんぱく質・ハイブリッドを提供するものである。
【００１３】
ここで、本発明における「カーボンナノチューブ」は、炭素の異型（allotype）の一つである。これは、その直径が２ｎｍ〜１００ｎｍの柱状分子の形態を有しており、グラファイト・シートを丸めた形状をしている。そのカーボンナノチューブとして、単層カーボンナノチューブ、二層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブいずれも使用できるが、好ましくは二層カーボンナノチューブ又は多層カーボンナノチューブである。
【００１４】
また、本発明における「非共有結合で結合させ機能化した」とは、“物理的に機能化した（させた）”ことを意味し、これには静電力、水素結合力、疎水性力あるいはπ−π相互作用力のような多くの型の非共有結合力（M. Shim et al, Nano Lett. 2, 285 (2002); R. J. Chen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 4984 (2003); D. Cui, J. Nanosci. Nanotech. 7, 1298 (2007)）を含んでいる。
【００１５】
また、本発明における「レドックスたんぱく質」とは、基質から（又は基質へ）電子を交換（注入、又は引抜き）する生体認識の実行が可能なたんぱく質を意味する。上記レドックスたんぱく質として、基本的に種々のオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ及びレダクターゼが使える。例えば、グルコース・オキシダーゼ、西洋ワサビ・パーオキシダーゼ、アルゼネート・レダクターゼ（アズリン）、アルコール・オキシダーゼ、アルコール・デヒドロゲナーゼ等である。中でも、グルコース・オキシダーゼが最も好ましく用いられる。
【００１６】
また、本発明における「ポリマー結合材」とは、ポリマー・マトリックスを意味する。
【００１７】
先に述べたように、本発明は、また、前記生体反応性ハイブリッドの製法にも関係するものであり、その製法は以下の工程を含んでいる：
(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；
(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；
(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；
(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブ（固体）を分離する。
【００１８】
ここで、この方法の工程（ｉ）における「高温」とは、７０℃ないしは９０℃の範囲中の一定温度に維持することを意味する。また、この高温処理は反応が終わるまで、例えば、１２〜３６時間をかけて行なわれる。
工程（ｉｉ）における「酸化型ＣＮＴの所定濃度」とは、０．１−１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を意味する。
工程（ｉｉｉ）における「レドックスたんぱく質の所定濃度」とは、０．０４−０．４ｍｇ／ｍＬの濃度を意味する。
また、我々は、本発明の（レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した）生体反応性カーボンナノチューブで修飾した電極を使用して「バイオセンサー」（生体物質を検出する装置）を構築することができる。
【００１９】
図１は、二層カーボンナノチューブ上に、非共有結合で固定化させたグルコース・オキシダーゼによるグルコースの酸化と、それに続くシグナル変換とを示す模式図である。グルコース・オキシダーゼ（たんぱく質）とカーボンナノチューブとの相互作用は複雑であり、例えば、上述したように、静電力、水素結合力、疎水性力、π−π相互作用等の種々の非共有結合力を含んでいる。
【実施例】
【００２０】
本発明で用いた実験方法は、以下の通り。
＜装置＞
電圧電流実験はすべて、パソコンに接続され、一般目的電気化学システムｖ．４．９ソフトウェアで制御されたμオートラブIII（Ecochemie社, ユトレヒト、 オランダ）を用いて行なった。電気化学実験は、電圧電流セル（５ｍＬ）中、室温（２５℃）で三つの電極を配置した形で行なった。補助電極として白金電極が供され、参照電極として飽和Ａｇ／ＡｇＣｌが供された。電気化学的電位は全てＡｇ／ＡｇＣｌに対するものである。スキャンＴＥＭモード（ＳＴＥＭ；スポットサイズは０．７ｎｍ、加速電圧は２００ｋＶ）でＴＥＭイメージを得るためには、２００ｋＶで作動するJEM 2100F電界放出透過型電子顕微鏡（ＪＯＥＬ，東京，日本）を用いた。比表面積は多点ＢＥＴ法を用いたオートソーブ１装置（Quantachrome Instruments, Boynton beach, FL, USA）によって測定し、窒素が吸着物質に用いられた。試料は吸着実験の前に、真空で、２５０℃で１６ｈ処理して脱水した。
【００２１】
＜材料＞
二層カーボンナノチューブ（ＤＷＣＮＴ，カタログｎｏ．６３７３５１，純度９０％以上）、グラファイト粉末、過酸化水素（３０％水溶液）、グルコース、グルコース・オキシダーゼ、二塩基性リン酸カリウム及びリン酸は、シグマ−アルドリッチ社（日本）から購入した。
【００２２】
実施例１
（ｉ）ポリマー結合材を使用せずに、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの調製
二層カーボンナノチューブ（ＤＷＣＮＴ）は、濃硝酸（６Ｍ）中、８０℃で、２４ｈ処理し、酸化させた。得られた酸／ＤＷＣＮＴ混合物は次に蒸留水で洗浄し、遠沈し、水溶液のｐＨが中性になるまでこの操作を数回繰り返した。次に、上記酸化カーボンナノチューブを、孔の大きさ０．２μｍの膜（Nuclepore Track-Etch Membrane, Whatman, UK）を用い、フィルム状(又はシート状）カーボンナノチューブを形成させつつ、真空で濾過した。
引き続いて、１ｍｌ当たりＧＯｘ０．２ｍｇ及び（上で得た）酸化ＤＷＣＮＴ０．５ｍｇ（対照として、同量のグラファイト・パウダーを使用）をバイアル中に分散させ、これを７５分間、かき混ぜた。このようにして、ポリマー結合材を使用せずに、グルコース・オキシダーゼを非共有結合で結合させて機能化した生体反応性二層カーボンナノチューブを得た。
【００２３】
（ｉｉ）評価
電気化学的測定のために、得られた上記ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ（対照：グラファイト／ＧＯｘ）を、研磨布に載せた０．０５μｍのアルミナ粒子を用いて予め研磨したガラス状カーボン電極（直径３ｍｍ）の表面上に落とした。このＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ（対照：グラファイト／ＧＯｘ）を先ず、蒸留水で１ｍｇ／ｍｌの濃度に分散させ、次にその分散液をウルトラソニック・バスの中に１分間置き、その後、処理された分散液のうちの５μLをガラス状カーボン電極の表面から吸い取った。その分散液を室温に置き蒸発させると、ガラス状カーボン電極表面上でランダムな分布のフィルムとなった。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、適切な電圧範囲で毎秒５０ｍＶのスキャン速度で、サイクリック・ボルタメトリー実験を行なった。ＴＥＭの測定のためには、濃度１ｍｇ／ｍｌのＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ（対照：グラファイト／ＧＯｘ）１μＬを銅のＴＥＭグリッド上に落とし、そのまま放置し空気中で乾燥させた。
【００２４】
図２は、得られたＤＷＣＮＴ／ＧＯｘハイブリッドのＴＥＭ像を示すものである。このＴＥＭによってはＧＯｘ分子を直接に観察することは難しいけれども、ＤＷＣＮＴは相互に連絡された濃いナノチューブ・ネットワークを形成していることは明らかである（図２の右側部分では明らかに視認できる）。他方、グラファイト粉は粒構造である（図示せず）。ＤＷＣＮＴとグラファイトの形態上の相違は、電気化学的測定から分かるように、ＧＯｘ分子の物理的捕捉に深く影響する（図３参照）。
【００２５】
図３Ａは５ｍＭ過酸化水素に対するサイクリックボルタモグラムで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ膜電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極を用いた場合である。この図から、ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極を用いた場合、過酸化水素の酸化は約＋０．６Ｖで始まるが、グラファイト／ＧＯｘ膜電極を用いた場合は過酸化水素の酸化は約＋０．８Ｖで始まることは明かである。この電気化学的測定の結果から、ＤＷＣＮＴを基礎とする電極はグラファイトを基礎とする電極に比べて表面積が大きく、過酸化水素（グルコース・オキシダーゼ酵素によるグルコース酸化の副生物）の低濃度検出に有利であることを示している（ＤＷＣＮＴの表面積／電気化学的容量は、M. Pumera, Nanoscale Res. Lett. 2, 87 (2007)参照)。この観察は、ＢＥＴ法によって測定されたＤＷＣＮＴ及びグラファイトの各々の比表面積（ＤＷＣＮＴ：58.55 m2／g 、グラファイト：11.07 m2／g）と整合している。
【００２６】
グルコースに対するＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極（対照：グラファイト／ＧＯｘ膜電極）の応答を調べた。図３Ｂは１０ｍＭグルコースに対するハイドロダイナミックボルタモグラムである。グラファイト／ＧＯｘ膜電極では、グルコース・オキシダーゼ酵素がグラファイトのミクロ粒子に有意に捕捉若しくは吸着されなかったためか、グルコースに対するレドックス反応が何ら観察されなかった。ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極の場合は、状況は劇的に異なっている。グルコースに対し、約＋０．６Ｖで始まるかなりの酸化電流がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極で観察される。図３の結果は、ＧＯｘレドックス酵素がＤＷＣＮＴを、優れた信号変換器として作用するＤＷＣＮＴへと機能付与させたことを示している。
【００２７】
次に、ＤＷＣＮＴネットワークに固定されたＧＯｘの安定性を調べた。図４は、２．５ｍＭグルコースに対するＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極の電流応答を連続的に約１５分間記録したものである。図示されるように、この時間における応答電流の減少は観察されていない。ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極の長時間の安定性を見るため、ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を４℃、乾燥状態で一ヶ月保存した場合には、応答電流は４０％減少していた。この数字は、報告されたカーボンナノチューブ／ポリマー複合物／ＧＯｘ電極における数字（J. Wang, Electroanalysis13, 983 (2001); A. Salimi et al, Anal. Biochem. 333, 49 (2004)）よりも少し低いが、この相違の理由は現在のところ不明である。
【００２８】
図５は、グルコースの添加（濃度範囲は１．４〜１８．５ｍＭ）に対するグラファイト／ＧＯｘ電極（ａ）及びＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極（ｂ）の電流応答を示すものである。濃度と応答の間の関係は、酵素系についての典型的ミカエリスーメンテン曲線である。見かけのミカエリスーメンテン定数（KMapp）は、ラインウィーバー−バーク・プロットから１４．１４ｍＭと計算された。この値は、文献値（H. Zhou et al, Sens. Actuators B 101, 224 (2004)）と整合する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】二層カーボンナノチューブ上に、非共有結合で固定化させたグルコース・オキシダーゼによるグルコースの酸化と、それに続くシグナル変換とを示す模式図。
【図２】ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘハイブリッドのＴＥＭ像；加速電圧は２００ｋＶ。
【図３】（上図、Ａ）５ｍＭ過酸化水素水に対するサイクリックボルタモグラムで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を用いた場合。条件：スキャンスピードは５０ｍＶ／ｓ；支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）。 （下図、Ｂ）１０ｍＭグルコースに対するハイドロダイナミックボルタモグラムで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を用いた場合。支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）、撹拌速度は約５５０ｒｐｍ。
【図４】２．５ｍＭグルコースに対するＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極の応答安定性を示すグラフ。条件：支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）、撹拌速度は約５５０ｒｐｍ、検出電位は＋０．８５Ｖ。
【図５】グルコースの濃度に対する電流依存性を示すグラフで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を用いた場合。条件：支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）、撹拌速度は約５５０ｒｐｍ、検出電位は＋０．８５Ｖ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学的検知のためのバイオセンサーの分野で役立つレドックスたんぱく質を（ポリマー結合材を使用することなく）非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ナノスケールの物質に基づく酵素バイオセンサーについての多くの努力は、そのバイオ医学的な重要性のゆえに、グルコース・バイオセンサーの創作に向けられている。そのようなグルコース・バイオセンサーは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）とグルコース・オキシダーゼ（ＧＯｘ）との組合せに基づくものであった。グルコース・オキシダーゼとカーボンナノチューブとを、例えば、テフロン（非特許文献１）、鉱油（M.D.Rubianes et al, 2003）、硬エポキシ（B.Perez et al, 2005）、ナフィオン（J.Wang et al, 2004）、ポリピロール（M.Gao et al, 2003; Y.C.Tsai et al, 2006; J.Wang et al, 2005）、キトサン（Y. Liu et al, 2006）、あるいはゾル−ゲル・マトリックス（A.Salimi et al, 2004）中で、物理的に結合（化学的結合ではない）させて、グルコースを検知するバイオ認識／電気化学的システムをつくり出すことにより、有効なグルコース・バイオセンサーが構築されうることが示された。一方、少数ながら、グルコースとカーボンナノチューブとを化学結合により結合させようとする研究もある（F.Patolsky et al, 2004;J.Liu et al, 2005; Y. Lin et al, 2004）。
【０００３】
レドックス酵素バイオセンサーに基づくカーボンナノチューブの分野において公表された印刷物の多くにおいては、酵素とカーボンナノチューブ及び／又はポリマー・マトリックスとの間で何らの化学結合をさせることなく、酵素とカーボンナノチューブとを有機もしくは無機のポリマー結合材の中に取り込んでいることに注目するべきである。しかし、これらバイオセンサーの作製においては、酵素は電極物質（カーボンナノチューブでもポリマー結合材でもない）に共有結合で固定されていないので、結合材の使用が本当に必要であるのか、あるいは、グルコース・オキシダーゼをカーボンナノチューブの上に直接に固定させて、電気化学的グルコース・バイオセンサーをつくり出すことが可能かどうかを知ることは興味深いことであろう。
【０００４】
高度に特異的な電気的バイオセンサーに向けて、非共有結合によってカーボンナノチューブを機能化する本質的・重要な仕事は、これまでにいくつかなされてきたが（M.Shim et al, 2002;R.J.Chenet al, 2004; R.J.Chen et al, 2003; D.-W. Park et al, 2006）、電気化学的バイオセンサーに向けての努力はなされていない。
【０００５】
【非特許文献１】J. Wang, M. Musameh, Anal. Chem. 75, 2075 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、レドックスたんぱく質を、ポリマー結合材を使用することなく非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの作製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
〔発明の概要〕
上記目的を達成するため、どのようにすればポリマー結合材を要することなく、グルコース・オキシダーゼ（ＧＯｘ）がカーボンナノチューブのネットワークに固定されうるのか、我々は種々検討した。そして、カーボンナノチューブ上にレドックスたんぱく質ＧＯｘを非共有結合的に吸着させることに成功し、また、得られたＣＮＴ／ＧＯｘハイブリッドはグルコースの検出に好都合な性質を示すものであった。
【０００８】
すなわち、本発明は、 ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブ（すなわち、カーボンナノチューブ／レドックスたんぱく質のハイブリッド）を提供する。
【０００９】
また、本発明は、（ポリマー結合材を使用することなく）レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した前記生体反応性カーボンナノチューブの製法も提供するもの
であり、その製法は以下の工程を含んでいる：
(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；
(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；
(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；
(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブ（固体）を分離する。
【００１０】
＜略号＞
用いた略号の意味は次の通り。
ＣＮＴ：カーボンナノチューブ
ＤＷＣＮＴ：二層（double walled）カーボンナノチューブ
ＧＯｘ：グルコース・オキシダーゼ
【発明の効果】
【００１１】
本発明の、（ポリマー結合材なしで）レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブは、バイオセンサーを容易に構築する場合に扉を開くものである。これらは、例えば、電気化学的バイオセンサー（例：グルコースセンサー）として用いることができる。
[発明の実施の形態]
【００１２】
〔発明の更に詳しい説明〕
次に、本発明を更に詳細に説明する。
先に述べたように、本発明は、ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブを提供するものであり、言い換えれば、ポリマー結合材のない生体反応性カーボンナノチューブ／レドックスたんぱく質・ハイブリッドを提供するものである。
【００１３】
ここで、本発明における「カーボンナノチューブ」は、炭素の異型（allotype）の一つである。これは、その直径が２ｎｍ〜１００ｎｍの柱状分子の形態を有しており、グラファイト・シートを丸めた形状をしている。そのカーボンナノチューブとして、単層カーボンナノチューブ、二層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブいずれも使用できるが、好ましくは二層カーボンナノチューブ又は多層カーボンナノチューブである。
【００１４】
また、本発明における「非共有結合で結合させ機能化した」とは、“物理的に機能化した（させた）”ことを意味し、これには静電力、水素結合力、疎水性力あるいはπ−π相互作用力のような多くの型の非共有結合力（M. Shim et al, Nano Lett. 2, 285 (2002); R. J. Chen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 4984 (2003); D. Cui, J. Nanosci. Nanotech. 7, 1298 (2007)）を含んでいる。
【００１５】
また、本発明における「レドックスたんぱく質」とは、基質から（又は基質へ）電子を交換（注入、又は引抜き）する生体認識の実行が可能なたんぱく質を意味する。上記レドックスたんぱく質として、基本的に種々のオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ及びレダクターゼが使える。例えば、グルコース・オキシダーゼ、西洋ワサビ・パーオキシダーゼ、アルゼネート・レダクターゼ（アズリン）、アルコール・オキシダーゼ、アルコール・デヒドロゲナーゼ等である。中でも、グルコース・オキシダーゼが最も好ましく用いられる。
【００１６】
また、本発明における「ポリマー結合材」とは、ポリマー・マトリックスを意味する。
【００１７】
先に述べたように、本発明は、また、前記生体反応性ハイブリッドの製法にも関係するものであり、その製法は以下の工程を含んでいる：
(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；
(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；
(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；
(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブ（固体）を分離する。
【００１８】
ここで、この方法の工程（ｉ）における「高温」とは、７０℃ないしは９０℃の範囲中の一定温度に維持することを意味する。また、この高温処理は反応が終わるまで、例えば、１２〜３６時間をかけて行なわれる。
工程（ｉｉ）における「酸化型ＣＮＴの所定濃度」とは、０．１−１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を意味する。
工程（ｉｉｉ）における「レドックスたんぱく質の所定濃度」とは、０．０４−０．４ｍｇ／ｍＬの濃度を意味する。
また、我々は、本発明の（レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した）生体反応性カーボンナノチューブで修飾した電極を使用して「バイオセンサー」（生体物質を検出する装置）を構築することができる。
【００１９】
図１は、二層カーボンナノチューブ上に、非共有結合で固定化させたグルコース・オキシダーゼによるグルコースの酸化と、それに続くシグナル変換とを示す模式図である。グルコース・オキシダーゼ（たんぱく質）とカーボンナノチューブとの相互作用は複雑であり、例えば、上述したように、静電力、水素結合力、疎水性力、π−π相互作用等の種々の非共有結合力を含んでいる。
【実施例】
【００２０】
本発明で用いた実験方法は、以下の通り。
＜装置＞
電圧電流実験はすべて、パソコンに接続され、一般目的電気化学システムｖ．４．９ソフトウェアで制御されたμオートラブIII（Ecochemie社, ユトレヒト、 オランダ）を用いて行なった。電気化学実験は、電圧電流セル（５ｍＬ）中、室温（２５℃）で三つの電極を配置した形で行なった。補助電極として白金電極が供され、参照電極として飽和Ａｇ／ＡｇＣｌが供された。電気化学的電位は全てＡｇ／ＡｇＣｌに対するものである。スキャンＴＥＭモード（ＳＴＥＭ；スポットサイズは０．７ｎｍ、加速電圧は２００ｋＶ）でＴＥＭイメージを得るためには、２００ｋＶで作動するJEM 2100F電界放出透過型電子顕微鏡（ＪＯＥＬ，東京，日本）を用いた。比表面積は多点ＢＥＴ法を用いたオートソーブ１装置（Quantachrome Instruments, Boynton beach, FL, USA）によって測定し、窒素が吸着物質に用いられた。試料は吸着実験の前に、真空で、２５０℃で１６ｈ処理して脱水した。
【００２１】
＜材料＞
二層カーボンナノチューブ（ＤＷＣＮＴ，カタログｎｏ．６３７３５１，純度９０％以上）、グラファイト粉末、過酸化水素（３０％水溶液）、グルコース、グルコース・オキシダーゼ、二塩基性リン酸カリウム及びリン酸は、シグマ−アルドリッチ社（日本）から購入した。
【００２２】
実施例１
（ｉ）ポリマー結合材を使用せずに、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの調製
二層カーボンナノチューブ（ＤＷＣＮＴ）は、濃硝酸（６Ｍ）中、８０℃で、２４ｈ処理し、酸化させた。得られた酸／ＤＷＣＮＴ混合物は次に蒸留水で洗浄し、遠沈し、水溶液のｐＨが中性になるまでこの操作を数回繰り返した。次に、上記酸化カーボンナノチューブを、孔の大きさ０．２μｍの膜（Nuclepore Track-Etch Membrane, Whatman, UK）を用い、フィルム状(又はシート状）カーボンナノチューブを形成させつつ、真空で濾過した。
引き続いて、１ｍｌ当たりＧＯｘ０．２ｍｇ及び（上で得た）酸化ＤＷＣＮＴ０．５ｍｇ（対照として、同量のグラファイト・パウダーを使用）をバイアル中に分散させ、これを７５分間、かき混ぜた。このようにして、ポリマー結合材を使用せずに、グルコース・オキシダーゼを非共有結合で結合させて機能化した生体反応性二層カーボンナノチューブを得た。
【００２３】
（ｉｉ）評価
電気化学的測定のために、得られた上記ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ（対照：グラファイト／ＧＯｘ）を、研磨布に載せた０．０５μｍのアルミナ粒子を用いて予め研磨したガラス状カーボン電極（直径３ｍｍ）の表面上に落とした。このＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ（対照：グラファイト／ＧＯｘ）を先ず、蒸留水で１ｍｇ／ｍｌの濃度に分散させ、次にその分散液をウルトラソニック・バスの中に１分間置き、その後、処理された分散液のうちの５μLをガラス状カーボン電極の表面から吸い取った。その分散液を室温に置き蒸発させると、ガラス状カーボン電極表面上でランダムな分布のフィルムとなった。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、適切な電圧範囲で毎秒５０ｍＶのスキャン速度で、サイクリック・ボルタメトリー実験を行なった。ＴＥＭの測定のためには、濃度１ｍｇ／ｍｌのＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ（対照：グラファイト／ＧＯｘ）１μＬを銅のＴＥＭグリッド上に落とし、そのまま放置し空気中で乾燥させた。
【００２４】
図２は、得られたＤＷＣＮＴ／ＧＯｘハイブリッドのＴＥＭ像を示すものである。このＴＥＭによってはＧＯｘ分子を直接に観察することは難しいけれども、ＤＷＣＮＴは相互に連絡された濃いナノチューブ・ネットワークを形成していることは明らかである（図２の右側部分では明らかに視認できる）。他方、グラファイト粉は粒構造である（図示せず）。ＤＷＣＮＴとグラファイトの形態上の相違は、電気化学的測定から分かるように、ＧＯｘ分子の物理的捕捉に深く影響する（図３参照）。
【００２５】
図３Ａは５ｍＭ過酸化水素に対するサイクリックボルタモグラムで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ膜電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極を用いた場合である。この図から、ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極を用いた場合、過酸化水素の酸化は約＋０．６Ｖで始まるが、グラファイト／ＧＯｘ膜電極を用いた場合は過酸化水素の酸化は約＋０．８Ｖで始まることは明かである。この電気化学的測定の結果から、ＤＷＣＮＴを基礎とする電極はグラファイトを基礎とする電極に比べて表面積が大きく、過酸化水素（グルコース・オキシダーゼ酵素によるグルコース酸化の副生物）の低濃度検出に有利であることを示している（ＤＷＣＮＴの表面積／電気化学的容量は、M. Pumera, Nanoscale Res. Lett. 2, 87 (2007)参照)。この観察は、ＢＥＴ法によって測定されたＤＷＣＮＴ及びグラファイトの各々の比表面積（ＤＷＣＮＴ：58.55 m2／g 、グラファイト：11.07 m2／g）と整合している。
【００２６】
グルコースに対するＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極（対照：グラファイト／ＧＯｘ膜電極）の応答を調べた。図３Ｂは１０ｍＭグルコースに対するハイドロダイナミックボルタモグラムである。グラファイト／ＧＯｘ膜電極では、グルコース・オキシダーゼ酵素がグラファイトのミクロ粒子に有意に捕捉若しくは吸着されなかったためか、グルコースに対するレドックス反応が何ら観察されなかった。ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極の場合は、状況は劇的に異なっている。グルコースに対し、約＋０．６Ｖで始まるかなりの酸化電流がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極で観察される。図３の結果は、ＧＯｘレドックス酵素がＤＷＣＮＴを、優れた信号変換器として作用するＤＷＣＮＴへと機能付与させたことを示している。
【００２７】
次に、ＤＷＣＮＴネットワークに固定されたＧＯｘの安定性を調べた。図４は、２．５ｍＭグルコースに対するＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極の電流応答を連続的に約１５分間記録したものである。図示されるように、この時間における応答電流の減少は観察されていない。ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極の長時間の安定性を見るため、ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を４℃、乾燥状態で一ヶ月保存した場合には、応答電流は４０％減少していた。この数字は、報告されたカーボンナノチューブ／ポリマー複合物／ＧＯｘ電極における数字（J. Wang, Electroanalysis13, 983 (2001); A. Salimi et al, Anal. Biochem. 333, 49 (2004)）よりも少し低いが、この相違の理由は現在のところ不明である。
【００２８】
図５は、グルコースの添加（濃度範囲は１．４〜１８．５ｍＭ）に対するグラファイト／ＧＯｘ電極（ａ）及びＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極（ｂ）の電流応答を示すものである。濃度と応答の間の関係は、酵素系についての典型的ミカエリスーメンテン曲線である。見かけのミカエリスーメンテン定数（KMapp）は、ラインウィーバー−バーク・プロットから１４．１４ｍＭと計算された。この値は、文献値（H. Zhou et al, Sens. Actuators B 101, 224 (2004)）と整合する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】二層カーボンナノチューブ上に、非共有結合で固定化させたグルコース・オキシダーゼによるグルコースの酸化と、それに続くシグナル変換とを示す模式図。
【図２】ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘハイブリッドのＴＥＭ像；加速電圧は２００ｋＶ。
【図３】（上図、Ａ）５ｍＭ過酸化水素水に対するサイクリックボルタモグラムで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を用いた場合。条件：スキャンスピードは５０ｍＶ／ｓ；支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）。 （下図、Ｂ）１０ｍＭグルコースに対するハイドロダイナミックボルタモグラムで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を用いた場合。支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）、撹拌速度は約５５０ｒｐｍ。
【図４】２．５ｍＭグルコースに対するＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極の応答安定性を示すグラフ。条件：支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）、撹拌速度は約５５０ｒｐｍ、検出電位は＋０．８５Ｖ。
【図５】グルコースの濃度に対する電流依存性を示すグラフで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を用いた場合。条件：支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）、撹拌速度は約５５０ｒｐｍ、検出電位は＋０．８５Ｖ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの製法であって、次の工程を含んでいる製法。
(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；
(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；
(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；
(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブを分離する。
【請求項１】
ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの製法であって、次の工程を含んでいる製法。
(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；
(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；
(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；
(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブを分離する。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−９６９９０（Ｐ２０１２−９６９９０Ａ）
【公開日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４１２７３（Ｐ２０１１−２４１２７３）
【出願日】平成２３年１１月２日（２０１１．１１．２）
【分割の表示】特願２００７−１０３４６４（Ｐ２００７−１０３４６４）の分割
【原出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３０１０２３２３８）独立行政法人物質・材料研究機構 (1,333)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月２日（２０１１．１１．２）
【分割の表示】特願２００７−１０３４６４（Ｐ２００７−１０３４６４）の分割
【原出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３０１０２３２３８）独立行政法人物質・材料研究機構 (1,333)
【Ｆターム（参考）】
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