レーザ走査型顕微鏡
【課題】標本へのダメージおよび蛍光の退色を抑制しつつ、環境光による影響を排除して安定した観察を行うことができるレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【解決手段】標本Ａを収容し、内部の温度および湿度を維持可能な培養容器６と、培養容器６に隣接して配置され、培養容器６と光学的に接続された光学系空間５とを備え、光学系空間５に、極短パルスレーザ光を標本Ａ上で２次元的に走査するスキャナ２２と、走査された極短パルスレーザ光を標本Ａに集光させる一方、標本Ａからの光を集光する対物レンズ１５と、スキャナ２２と対物レンズ１５との間に設けられ、標本Ａからの光とレーザ光とを分岐するダイクロイックミラー５３と、分岐された標本Ａからの光を検出する光検出器５５と、光学系空間５を囲うように設けられ、光学系空間５の外部からの光を遮断する外装カバー２とが備えられているレーザ走査型顕微鏡１を採用する。
【解決手段】標本Ａを収容し、内部の温度および湿度を維持可能な培養容器６と、培養容器６に隣接して配置され、培養容器６と光学的に接続された光学系空間５とを備え、光学系空間５に、極短パルスレーザ光を標本Ａ上で２次元的に走査するスキャナ２２と、走査された極短パルスレーザ光を標本Ａに集光させる一方、標本Ａからの光を集光する対物レンズ１５と、スキャナ２２と対物レンズ１５との間に設けられ、標本Ａからの光とレーザ光とを分岐するダイクロイックミラー５３と、分岐された標本Ａからの光を検出する光検出器５５と、光学系空間５を囲うように設けられ、光学系空間５の外部からの光を遮断する外装カバー２とが備えられているレーザ走査型顕微鏡１を採用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生物標本を生かしたまま長時間観察するために、標本を特定の温度・湿度下で収容する培養容器と、標本を観察するための光学系（対物レンズ等）が配置された光学系空間とを備え、該光学系空間が、培養容器内とほぼ同等の温度に恒温化された走査型共焦点顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
また、極短パルスレーザ光を標本面に集光することで、焦点面近傍において光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起させ、鮮明な蛍光画像を取得する多光子励起型のレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２５６９２７号公報
【特許文献２】特開平１１−１４９０４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示されている顕微鏡は、１光子励起観察を行う顕微鏡であるため、蛍光が退色しやすいという不都合がある。また、１光子励起観察は光毒性が高いため、標本として生体組織などの生体標本を用いた場合に、標本にダメージを与えてしまうという不都合がある。
【０００６】
一方、特許文献２に開示されている顕微鏡は、２光子励起観察を行う顕微鏡であり、蛍光も退色しにくく、分解能も高いため、標本の観察精度を向上することができる。また、光毒性も低いため、標本へのダメージを低減することができる。しかしながら、２光子励起観察では、環境光による外部ＰＭＴ（Photomultiplier Tube）への影響が大きく、観察の安定性が低いという不都合がある。
【０００７】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本へのダメージおよび蛍光の退色を抑制しつつ、環境光による影響を排除して安定した観察を行うことができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本を収容し、内部の温度および湿度を維持可能な培養容器と、該培養容器に隣接して配置され、該培養容器と光学的に接続された光学系空間とを備え、該光学系空間に、極短パルスレーザ光を前記標本上で２次元的に走査する光走査手段と、該光走査手段により走査された極短パルスレーザ光を前記標本に集光させる一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、前記光走査手段と前記対物レンズとの間に設けられ、前記標本からの光と前記レーザ光とを分岐する分岐手段と、該分岐手段により分岐された前記標本からの光を検出する光検出部と、前記光学系空間を囲うように設けられ、前記光学系空間の外部からの光を遮断する遮光壁とが備えられているレーザ走査型顕微鏡を採用する。
【０００９】
本発明によれば、培養容器内に収容された標本が、培養容器内を特定の温度に恒温化され、かつ高湿度に維持されることによって、長時間にわたって健全な状態に維持される。この標本に対して、光走査手段により走査された極短パルスレーザ光を集光させることで、多光子励起効果によって蛍光が発生し、この蛍光が対物レンズによって集光される。集光された蛍光は、分岐手段によって極短パルスレーザ光と分岐され、光検出部によって検出される。
【００１０】
このように２光子励起観察を行うことで、標本へのダメージおよび蛍光の退色を抑制することができる。また、この場合において、光検出部は、周囲に設けられた遮光壁によって光学系空間の外部からの光（環境光）が遮断されているため、環境光による影響を排除して安定した観察を行うことができる。
【００１１】
上記発明において、前記光学系空間に、該光学系空間内を前記培養容器内の温度とほぼ同等の温度に恒温化する光学系空間恒温化手段が備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、光学系空間内に設けられた光学系空間恒温化手段の作動により、光学系空間内も培養容器内の温度とほぼ同等の温度に恒温化されるので、光学系空間内の光学系および機械系に、培養容器の温度に基づく温度勾配が発生することが防止される。これにより、光学系および機械系に歪みが発生することを防止でき、得られる画像の低輝度化、不鮮明化を効果的に防止することができる。
【００１２】
上記発明において、前記光学系空間が、前記培養容器に対して湿度的に分離されていることとしてもよい。
光学系空間を培養容器から湿度的に分離することで、培養容器内の高湿度が対物レンズ等の光学系や光走査手段等の機械系に影響を与えることを防止できる。
【００１３】
上記発明において、極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源を収容し、前記光学系空間と光学的に接続されたレーザ空間とを備えることとしてもよい。
このようにすることで、レーザ光源が配置されたレーザ空間と、光検出部等が配置された光学系空間とを、それぞれに応じた温度および湿度に管理することができる。
【００１４】
上記発明において、前記レーザ空間に、該レーザ空間内の湿度を低減する湿度低減手段が備えられていることとしてもよい。
レーザ光源から射出される極短パルスレーザ光は、水分によって特定の波長帯域（例えば９００ｎｍから９５０ｎｍ）が吸収されてしまう。したがって、湿度低減手段によってレーザ空間内の湿度を低減することで、レーザ空間内の水分によって特定の波長帯域が吸収されてしまうことを抑制することができる。極短パルスレーザ光は、帯域幅十数ｎｍ程度で波長が可変であるため、上記のようにすることで、水分による吸収の影響を受けずにどの波長でも極短パルスレーザ光を良好に照射でき、標本の観察精度を向上することができる。
【００１５】
上記発明において、前記湿度低減手段が、前記レーザ空間内の空気を冷却する第１の熱電素子と、該第１の熱電素子により冷却された空気を加温する第２の熱電素子であることとしてもよい。
第１の熱電素子によってレーザ空間内の空気を冷却して結露させ、冷却された空気を第２の熱電素子によって加温することで、レーザ空間内の湿度を低減することができる。
【００１６】
上記発明において、前記レーザ空間に、該レーザ空間内の温度を制御する温度制御手段が備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、発熱体であるレーザ光源を冷却して、極短パルスレーザ光を安定して射出させることができる。また、光学系空間とレーザ空間との温度差を所定の範囲内とすることができ、光学系空間内における結露を防止することができる。
【００１７】
上記発明において、前記レーザ空間と前記光学系空間とが分離され、前記レーザ空間と前記光学系空間との間に極短パルスレーザ光を導光するファイバが設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、レーザ走査型顕微鏡の本体を小型化することができる。また、ファイバを繋ぎ替えることで、複数の顕微鏡本体でレーザ光源を兼用することができる。
【００１８】
上記発明において、前記光検出部を囲むカバーと、該カバー内部を冷却する冷却手段とが備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、カバー内に配置された光検出部を冷却して熱ノイズの発生を防止することができ、光検出部による標本からの光の検出精度を向上することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、標本へのダメージおよび蛍光の退色を抑制しつつ、環境光による影響を排除して安定した観察を行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。
【図２】図１のレーザ走査型顕微鏡の第１の変形例を示す全体構成図である。
【図３】図１のレーザ走査型顕微鏡の第２の変形例を示す全体構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、直方体の箱状の断熱材からなる外装カバー（遮光壁）２の内部は、水平に配された区画壁３および区画壁５２によって３つの空間（観察空間４、光学系空間５、レーザ空間５１）に仕切られている。
【００２２】
上部の観察空間４には、培養容器６と、培養容器６を支持する電動ステージ７と、ヒータ８とが備えられている。
培養容器６は、標本Ａを収容し、内部の温度および湿度を維持可能な容器である。培養容器６は、電動ステージ７上に搭載されており、電動ステージ７の作動によって、例えば水平方向に移動可能となっている。
【００２３】
培養容器６の底面、電動ステージ７および区画壁３には、上下方向に貫通し、培養容器６内の空間と光学系空間５とを連通する貫通孔９が設けられている。また、培養容器６内には、標本Ａを収容する透明な材質からなる、例えば、シャーレ１０ａの平坦な底面にカバーガラス厚相当のガラス１０ｂを貼ったものやウェルプレート等の標本容器１０が収容されている。標本容器１０は、培養容器６の底面に設けられた貫通孔９に重なる位置に配置されることにより、貫通孔９を閉塞し、培養容器６内空間と、光学系空間５とを湿度的に分離するようになっている。
【００２４】
培養容器６内には、該培養容器６内の温度を検出する温度センサ１１が配置されている。また、培養容器６には、温度３７℃、湿度９０〜１００％、ＣＯ２濃度５％に調節された空気を循環させる環境制御部１２がチューブ１３を介して接続されている。
観察空間４の内壁面に設けられたヒータ８は、観察空間４内の温度を培養容器６の温度と同等の温度に加温するようになっている。
【００２５】
光学系空間５は、培養容器６に隣接して配置され、培養容器６と光学的に接続された空間である。
光学系空間５には、顕微鏡本体１４が配置されている。顕微鏡本体１４は、標本容器１０の底面下方に間隔をあけて対向配置され光軸を鉛直方向に配置された対物レンズ１５と、該対物レンズ１５を光軸方向に駆動制御する焦点調節機構１６と、走査光学系１７と、第１の波長のレーザ光を出射する第１の半導体レーザ１８ａと、第２の波長のレーザ光を出射する第２の半導体レーザ１８ｂと、これらの半導体レーザ１８ａ，１８ｂからのレーザ光を略平行光にするコリメートレンズ１９ａ，１９ｂと、これらのレーザ光を同一の光路に合流させるミラー２０およびダイクロイックミラー２１と、レーザ光を２次元的に走査するガルバノミラーからなるスキャナ（光走査手段）２２とを備えている。
【００２６】
また、顕微鏡本体１４は、対物レンズ１５、走査光学系１７、スキャナ２２を介して戻る標本Ａからの蛍光を透過する一方、レーザ光を反射するダイクロイックミラー２３と、ダイクロイックミラー２３を透過した蛍光を集光する共焦点レンズ２４と、共焦点レンズ２４の焦点位置に配置された共焦点ピンホール２５と、共焦点ピンホール２５を通過した蛍光内に含まれるレーザ光を遮断するバリアフィルタ２６と、バリアフィルタ２６を透過した蛍光を検出する光検出器２７とを備えている。図中符号２８はミラーである。
【００２７】
また、光学系空間５には、該光学系空間５内の温度を検出する温度センサ２９と、光学系空間５内の空気を加温するヒータ（光学系空間恒温化手段）３０とが備えられている。
また、光学系空間５内には、コントロールユニット３１が配置されている。
【００２８】
走査光学系１７は、２次元的に走査されたレーザ光を集光させて中間像を結像させる瞳投影レンズ１７ａと、中間像を結像したレーザ光を略平行光にして対物レンズ１５に入射させる結像レンズ１７ｂとを備えている。
ダイクロイックミラー２３は、回転可能なターレット３２に複数搭載され、ステッピングモータ３３の作動により、任意のダイクロイックミラー２３が択一的に光路上に配置されるようになっている。
共焦点ピンホール２５は、ピンホール位置駆動手段３４により、光軸と直交する２次元方向に位置調節可能に設けられている。
【００２９】
ダイクロイックミラー２３を切り替えると、各ダイクロイックミラー２３毎の微妙な角度差によって共焦点レンズ２４による焦点位置がずれるので、ダイクロイックミラー２３毎に共焦点ピンホールの位置を補正することができるように、ピンホール位置駆動手段３４による駆動位置をダイクロイックミラー２３毎に対応づけてコントロールユニット３１内の図示しないメモリに記憶している。
【００３０】
コントロールユニット３１は、半導体レーザ１８ａ，１８ｂ、スキャナ２２、光検出器２７、電動ステージ７のモータ３５、焦点調節機構１６のモータ３６、ターレット３２のステッピングモータ３３およびピンホール位置駆動手段３４を駆動するようになっている。また、各機器を駆動する際には、コントロールユニット３１が記憶している調整パラメータに従って駆動するようになっている。
【００３１】
ここで、調整パラメータとは、各機器を正しく作動させるために必要とされる制御値であり、製造誤差を補正するためのもので個々の装置毎に相違している。
調整パラメータの具体例としては、例えば、半導体レーザ１８ａ，１８ｂの駆動電流と明るさの関係、スキャナ２２による走査中心および走査幅、ダイクロイックミラー２３毎の共焦点ビンホール２５の位置、光検出器２７である光電子増倍管のアナログオフセット等があり、これらは、光学系空間５内の各部位が使用時の温度に恒温化された状態で設定調整されている。
【００３２】
また、この設定調整作業は、工場出荷時、または、納入場所に装置を最初にセットアップしたとき、あるいは保守点検時に行われるのが一般的である。
また、光学系空間５の恒温化温度を可変設定できる場合には、温度毎に最適化された調整パラメータを予め作成、保持しておき、使用時に設定された温度に対応する調整パラメータを読み出して使用してもよい。
【００３３】
また、コントロールユニット３１は、培養容器６内に配置された温度センサ１１、光学系空間５内に配置された温度センサ２９、およびレーザ空間５１内に配置された温度センサ６４（後述）による検出信号に基づいて、ヒータ８，３０を駆動し、各温度センサ１１，２９により検出される温度が３７℃となるようにヒータ８，３０を制御するようになっている。
【００３４】
スキャナ２２と対物レンズ１５との間、より具体的には結像レンズ１７ｂと対物レンズ１５との間には、スキャナ２２を介さずに標本Ａからの蛍光を検出するノンディスキャン検出ユニット５７が設けられている。
【００３５】
ノンディスキャン検出ユニット５７は、結像レンズ１７ｂと対物レンズ１５との間に配置されたダイクロイックミラー（分岐手段）５３と、ダイクロイックミラー５３により反射された光を結像する結像レンズ５４と、結像レンズ５４により結像された光を検出する光検出器５５とを備えている。また、光検出器５５の周囲を囲うように配置された筒状の光検出器カバー５６を備えているようにしてもよい。
【００３６】
ダイクロイックミラー５３は、標本Ａからの蛍光を反射する一方、スキャナ２２により走査されたレーザ光を透過させることで、標本Ａからの蛍光とレーザ光とを分岐するようになっている。
【００３７】
光検出器５５は、例えば光電子増倍管（Photomultiplier Tube）であり、外装カバー２の内部に配置されている。
外装カバー２は、遮光性を有する材料で構成されており、光学系空間５の外部からの光（環境光）を遮断するようになっている。これにより、光検出器５５への環境光の影響を防止するようになっている。なお、光検出器カバー５６に遮光機能は必要ないが、遮光機能を持たせてもよい。
【００３８】
レーザ空間５１には、２光子励起観察用のレーザ光源６１と、揺動可能に設けられたミラー６２と、レーザ光源６１とミラー６２との間に設けられた音響光学素子（ＡＯＭ）６３と、温度センサ６４とが配置されている。
【００３９】
レーザ光源６１は、例えばフェムト秒パルスレーザ光等の極短パルスレーザ光を射出するようになっている。
ミラー６２は、アライメント制御が可能となっており、ミラーの角度を変化させることで、レーザ光源６１からの極短パルスレーザ光を後述する光学窓６５に入射するように反射するようになっている。
【００４０】
光学系空間５とレーザ空間５１とを仕切る区画壁５２には、光学系空間５とレーザ空間５１と光学的に接続する光学窓６５が設けられている。これにより、レーザ光源６１から射出された極短パルスレーザ光は、音響光学素子６３およびミラー６２を介して光学窓６５を透過し、光学系空間５内のミラー２０に導光されるようになっている。ミラー２０に導光された極短パルスレーザ光は、ミラー２０を透過して、ダイクロイックミラー２１によって反射されるようになっている。これにより、レーザ光源６１から射出された極短パルスレーザ光は、半導体レーザ１８ａ，１８ｂからのレーザ光と同じ光路を通るようになっている。
【００４１】
また、レーザ空間５１には、レーザ空間５１内の空気を冷却するペルチェ素子（第１の熱電素子）６６と、ペルチェ素子６６により冷却された空気を加温するペルチェ素子（第２の熱電素子）６７とが設けられている。ペルチェ素子６６およびペルチェ素子６７は、具体的には、例えばレーザ空間５１内の湿度が１０％以下、温度が２２±２℃となるように制御される。
【００４２】
ペルチェ素子６６によってレーザ空間５１内の空気を冷却して結露させ、冷却された空気をペルチェ素子６７によって加温することで、レーザ空間５１内の湿度を低減することができる。すなわち、ペルチェ素子６６およびペルチェ素子６７は、レーザ空間５１内の湿度を低減する湿度低減手段として機能する。
【００４３】
ここで、レーザ光源６１から射出される極短パルスレーザ光は、水分によって特定の波長帯域（例えば９００ｎｍから９５０ｎｍ）が吸収されてしまう。したがって、ペルチェ素子６６およびペルチェ素子６７によってレーザ空間５１内の湿度を低減することで、レーザ空間５１内の水分によって特定の波長帯域が吸収されてしまうことを抑制することができる。極短パルスレーザ光は、帯域幅十数ｎｍ程度で波長が可変であるため、上記のようにすることで、水分による吸収の影響を受けずにどの波長でも極短パルスレーザ光を良好に照射でき、標本Ａの観察精度を向上することができる。なお、図１に示すように、レーザ空間５１内に、例えばシリカゲル等の乾燥剤６８を配置することにより、レーザ空間５１内の除湿効果を向上することができる。
【００４４】
また、ペルチェ素子６６およびペルチェ素子６７は、レーザ空間５１内の温度を制御する温度制御手段としても機能する。これにより、発熱体であるレーザ光源６１を冷却して、極短パルスレーザ光を安定して射出させることができる。また、光学系空間５とレーザ空間５１との温度差を所定の範囲内とすることができ、光学系空間５内における結露を防止することができる。
【００４５】
このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の作用について、以下に説明する。
まず、半導体レーザ１８ａ，１８ｂを用いた１光子励起観察について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１を用いて標本Ａの観察を行うには、標本容器１０の底面に生細胞等の標本Ａを接着させた状態として、標本容器１０を培養容器６内に収容し、標本容器１０の底面によって電動ステージ７の貫通孔９を閉塞する。
【００４６】
この状態で、環境制御部１２を作動させ、培養容器６内に培養環境に適した空気、すなわち、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の空気を循環させる。
また、コントロールユニット３１を作動させ、ヒータ８，３０の作動により培養容器６内および光学系空間５内の温度センサ１１，２９の出力が３７℃となるようにそれぞれ加温する。
【００４７】
そして、観察空間４内および光学系空間５内が３７℃に恒温化された状態で、半導体レーザ１８ａ，１８ｂを作動させてレーザ光を出射させ、ダイクロイックミラー２３によって反射させ、スキャナ２２によって２次元的に走査させ、瞳投影レンズ１７ａ、結像レンズ１７ｂおよび対物レンズ１５により集光して、標本容器１０底面に配置されている標本Ａに対してレーザ光を照射する。
【００４８】
レーザ光が照射された標本Ａ上の各位置においては、蛍光物質が励起されることにより蛍光が発せられる。発生した蛍光は、対物レンズ１５によって集光されるとともに、結像レンズ１７ｂ、瞳投影レンズ１７ａおよびスキャナ２２を介して戻り、ダイクロイックミラー２３によりレーザ光から分岐されて共焦点レンズ２４によって集光される。そして、集光された蛍光のうち、対物レンズ１５の焦点面において発生した蛍光のみが共焦点ピンホール２５を通過して光検出器２７により検出される。
【００４９】
コントロールユニット３１には、光検出器２７により検出された蛍光の輝度情報が入力されてくるので、その輝度情報が検出された時点におけるスキャナ２２による走査位置情報と対応づけて記憶していくことにより、２次元的なフレーム画像を取得することができる。
【００５０】
次に、レーザ光源６１を用いた２光子励起観察について説明する。
まず、コントロールユニット３１を作動させ、ヒータ８，３０の作動により培養容器６内および光学系空間５内の温度センサ１１，２９の出力が３７℃となるようにそれぞれ加温する。また、ペルチェ素子６６およびペルチェ素子６７を作動させ、レーザ空間５１内の湿度が１０％以下、温度が２２±２℃となるように制御する。
【００５１】
この状態で、レーザ光源６１を作動させて極短パルスレーザ光を出射させると、極短パルスレーザ光は、音響光学素子６３およびミラー６２を介して光学窓６５を透過し、光学系空間５内のミラー２０に導光される。そして、極短パルスレーザ光は、ミラー２０を透過し、ダイクロイックミラー２３によって反射され、スキャナ２２によって２次元的に走査される。その後、極短パルスレーザ光は、瞳投影レンズ１７ａ、結像レンズ１７ｂおよび対物レンズ１５により集光され、標本容器１０底面に配置されている標本Ａに照射される。
【００５２】
レーザ光が照射された標本Ａ上の焦点位置においては、２光子励起効果により、蛍光物質が励起されて蛍光が発せられる。発生した蛍光は、対物レンズ１５によって集光され、ダイクロイックミラー５３により反射されて、結像レンズ５４を介して光検出器５５により検出される。
【００５３】
コントロールユニット３１には、光検出器５５により検出された蛍光の輝度情報が入力されてくるので、その輝度情報が検出された時点におけるスキャナ２２による走査位置情報と対応づけて記憶していくことにより、２次元的なフレーム画像を取得することができる。
【００５４】
上記のように、標本Ａから発生した蛍光をスキャナ２２に戻さずに光検出器５５により検出することで、各光学部品における信号の減衰を最小限に抑え、２光子蛍光のＳ／Ｎ比を向上させることができる。ここで、ノンディスキャン検出では共焦点ピンホールにより標本Ａの焦点面において発生した２光子蛍光のみを切り出すことはできないが、２光子励起による蛍光は極短パルスレーザ光の集光位置（ピント位置）のごく近傍でしか生じないので、共焦点ピンホールがなくても標本Ａの光学的断面画像を取得することができる。
【００５５】
以上のように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、培養容器６内に収容された標本Ａは、培養容器６内の温度が約３７℃に恒温化され、かつ湿度が９０％〜１００％に維持されることによって、長時間にわたって健全な状態に維持される。この標本Ａに対して、スキャナ２２により走査された極短パルスレーザ光を集光させることで、多光子励起効果によって蛍光が発生し、この蛍光が対物レンズ１５によって集光される。集光された蛍光は、ダイクロイックミラー５３によって極短パルスレーザ光と分岐され、光検出器５５によって検出される。
【００５６】
このように２光子励起観察を行うことで、標本Ａへのダメージおよび蛍光の退色を抑制することができる。また、この場合において、光検出器５５は、周囲に設けられた外装カバー２によって光学系空間５の外部からの光（環境光）が遮断されているため、環境光による影響を排除して安定した観察を行うことができる。
【００５７】
また、光学系空間５に、光学系空間５内を培養容器６内の温度とほぼ同等の温度に恒温化するヒータ３０を備えることで、光学系空間５内も培養容器６内の温度とほぼ同等の温度に恒温化されるので、光学系空間５内の光学系および機械系に、培養容器６の温度に基づく温度勾配が発生することが防止される。これにより、光学系および機械系に歪みが発生することを防止でき、得られる画像の低輝度化、不鮮明化を効果的に防止することができる。
【００５８】
また、光学系空間５を培養容器６から湿度的に分離することで、培養容器６内の高湿度が、対物レンズ１５等の光学系やスキャナ２２等の機械系に影響を与えることを防止できる。
【００５９】
なお、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第１の変形例として、図２に示すように、ノンディスキャン検出ユニット５７（光検出器カバー５６）の一部を外装カバー２の外部に突出させ、この突出した部分に光検出器５５を配置するとともに、ペルチェ素子（冷却部）７２を設け、光検出器５５から発生する熱を排出することとしてもよい。この場合、光検出器カバー５６にも遮光性を持たせ、外装カバー２から出た部分に関しても環境光を遮断する。
本変形例に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、光検出器カバー５６内に配置された光検出器５５を冷却して熱ノイズの発生を防止することができ、光検出器５５による標本Ａからの光の検出精度を向上することができる。
【００６０】
また、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第２の変形例として、図３に示すように、レーザ空間５１と光学系空間５とが分離され、レーザ空間５１と光学系空間５との間に極短パルスレーザ光を導光するファイバ７５を設けることとしてもよい。
このようにすることで、レーザ走査型顕微鏡１の本体（観察空間４および光学系空間５）を小型化することができる。また、ファイバ７５を繋ぎ替えることで、複数のレーザ走査型顕微鏡１でレーザ光源６１を兼用することができる。
【００６１】
なお、本実施形態および上記の各変形例に係るレーザ走査型顕微鏡１において、除湿用のペルチェ素子６６を省略し、乾燥剤６８と温度調整用のペルチェ素子６７をレーザ空間５１に設けることとしてもよい。
この場合には、乾燥剤６８によってレーザ空間５１内の空気の湿度を低減させ、この空気が２２±２℃となるように、ペルチェ素子６７によって温度を調整する。
【符号の説明】
【００６２】
Ａ 標本
１ レーザ走査型顕微鏡
２ 外装カバー（遮光壁）
３ 区画壁
４ 観察空間
５ 光学系空間
６ 培養容器
８ ヒータ（加温手段、観察空間恒温化手段）
９ 貫通孔
１０ 標本容器
１５ 対物レンズ
１６ 焦点調節機構
１７ 走査光学系
１８ａ，１８ｂ 半導体レーザ
２０ ミラー
２１ ダイクロイックミラー
２２ スキャナ（光走査手段）
２３ ダイクロイックミラー
２５ 共焦点ピンホール
３０ ヒータ（光学系空間恒温化手段）
３１ コントロールユニット
５１ レーザ空間
５２ 区画壁
５３ ダイクロイックミラー（分岐手段）
５５ 光検出器（光検出部）
５６ 光検出器カバー
５７ ノンディスキャン検出ユニット
６１ レーザ光源
６２ ミラー
６３ 音響光学素子（ＡＯＭ）
６４ 温度センサ
６５ 光学窓
６６ ペルチェ素子（第１の熱電素子）
６７ ペルチェ素子（第２の熱電素子）
６８ 乾燥剤
７２ ペルチェ素子（冷却手段）
７５ ファイバ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生物標本を生かしたまま長時間観察するために、標本を特定の温度・湿度下で収容する培養容器と、標本を観察するための光学系（対物レンズ等）が配置された光学系空間とを備え、該光学系空間が、培養容器内とほぼ同等の温度に恒温化された走査型共焦点顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
また、極短パルスレーザ光を標本面に集光することで、焦点面近傍において光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起させ、鮮明な蛍光画像を取得する多光子励起型のレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２５６９２７号公報
【特許文献２】特開平１１−１４９０４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示されている顕微鏡は、１光子励起観察を行う顕微鏡であるため、蛍光が退色しやすいという不都合がある。また、１光子励起観察は光毒性が高いため、標本として生体組織などの生体標本を用いた場合に、標本にダメージを与えてしまうという不都合がある。
【０００６】
一方、特許文献２に開示されている顕微鏡は、２光子励起観察を行う顕微鏡であり、蛍光も退色しにくく、分解能も高いため、標本の観察精度を向上することができる。また、光毒性も低いため、標本へのダメージを低減することができる。しかしながら、２光子励起観察では、環境光による外部ＰＭＴ（Photomultiplier Tube）への影響が大きく、観察の安定性が低いという不都合がある。
【０００７】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本へのダメージおよび蛍光の退色を抑制しつつ、環境光による影響を排除して安定した観察を行うことができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本を収容し、内部の温度および湿度を維持可能な培養容器と、該培養容器に隣接して配置され、該培養容器と光学的に接続された光学系空間とを備え、該光学系空間に、極短パルスレーザ光を前記標本上で２次元的に走査する光走査手段と、該光走査手段により走査された極短パルスレーザ光を前記標本に集光させる一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、前記光走査手段と前記対物レンズとの間に設けられ、前記標本からの光と前記レーザ光とを分岐する分岐手段と、該分岐手段により分岐された前記標本からの光を検出する光検出部と、前記光学系空間を囲うように設けられ、前記光学系空間の外部からの光を遮断する遮光壁とが備えられているレーザ走査型顕微鏡を採用する。
【０００９】
本発明によれば、培養容器内に収容された標本が、培養容器内を特定の温度に恒温化され、かつ高湿度に維持されることによって、長時間にわたって健全な状態に維持される。この標本に対して、光走査手段により走査された極短パルスレーザ光を集光させることで、多光子励起効果によって蛍光が発生し、この蛍光が対物レンズによって集光される。集光された蛍光は、分岐手段によって極短パルスレーザ光と分岐され、光検出部によって検出される。
【００１０】
このように２光子励起観察を行うことで、標本へのダメージおよび蛍光の退色を抑制することができる。また、この場合において、光検出部は、周囲に設けられた遮光壁によって光学系空間の外部からの光（環境光）が遮断されているため、環境光による影響を排除して安定した観察を行うことができる。
【００１１】
上記発明において、前記光学系空間に、該光学系空間内を前記培養容器内の温度とほぼ同等の温度に恒温化する光学系空間恒温化手段が備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、光学系空間内に設けられた光学系空間恒温化手段の作動により、光学系空間内も培養容器内の温度とほぼ同等の温度に恒温化されるので、光学系空間内の光学系および機械系に、培養容器の温度に基づく温度勾配が発生することが防止される。これにより、光学系および機械系に歪みが発生することを防止でき、得られる画像の低輝度化、不鮮明化を効果的に防止することができる。
【００１２】
上記発明において、前記光学系空間が、前記培養容器に対して湿度的に分離されていることとしてもよい。
光学系空間を培養容器から湿度的に分離することで、培養容器内の高湿度が対物レンズ等の光学系や光走査手段等の機械系に影響を与えることを防止できる。
【００１３】
上記発明において、極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源を収容し、前記光学系空間と光学的に接続されたレーザ空間とを備えることとしてもよい。
このようにすることで、レーザ光源が配置されたレーザ空間と、光検出部等が配置された光学系空間とを、それぞれに応じた温度および湿度に管理することができる。
【００１４】
上記発明において、前記レーザ空間に、該レーザ空間内の湿度を低減する湿度低減手段が備えられていることとしてもよい。
レーザ光源から射出される極短パルスレーザ光は、水分によって特定の波長帯域（例えば９００ｎｍから９５０ｎｍ）が吸収されてしまう。したがって、湿度低減手段によってレーザ空間内の湿度を低減することで、レーザ空間内の水分によって特定の波長帯域が吸収されてしまうことを抑制することができる。極短パルスレーザ光は、帯域幅十数ｎｍ程度で波長が可変であるため、上記のようにすることで、水分による吸収の影響を受けずにどの波長でも極短パルスレーザ光を良好に照射でき、標本の観察精度を向上することができる。
【００１５】
上記発明において、前記湿度低減手段が、前記レーザ空間内の空気を冷却する第１の熱電素子と、該第１の熱電素子により冷却された空気を加温する第２の熱電素子であることとしてもよい。
第１の熱電素子によってレーザ空間内の空気を冷却して結露させ、冷却された空気を第２の熱電素子によって加温することで、レーザ空間内の湿度を低減することができる。
【００１６】
上記発明において、前記レーザ空間に、該レーザ空間内の温度を制御する温度制御手段が備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、発熱体であるレーザ光源を冷却して、極短パルスレーザ光を安定して射出させることができる。また、光学系空間とレーザ空間との温度差を所定の範囲内とすることができ、光学系空間内における結露を防止することができる。
【００１７】
上記発明において、前記レーザ空間と前記光学系空間とが分離され、前記レーザ空間と前記光学系空間との間に極短パルスレーザ光を導光するファイバが設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、レーザ走査型顕微鏡の本体を小型化することができる。また、ファイバを繋ぎ替えることで、複数の顕微鏡本体でレーザ光源を兼用することができる。
【００１８】
上記発明において、前記光検出部を囲むカバーと、該カバー内部を冷却する冷却手段とが備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、カバー内に配置された光検出部を冷却して熱ノイズの発生を防止することができ、光検出部による標本からの光の検出精度を向上することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、標本へのダメージおよび蛍光の退色を抑制しつつ、環境光による影響を排除して安定した観察を行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。
【図２】図１のレーザ走査型顕微鏡の第１の変形例を示す全体構成図である。
【図３】図１のレーザ走査型顕微鏡の第２の変形例を示す全体構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、直方体の箱状の断熱材からなる外装カバー（遮光壁）２の内部は、水平に配された区画壁３および区画壁５２によって３つの空間（観察空間４、光学系空間５、レーザ空間５１）に仕切られている。
【００２２】
上部の観察空間４には、培養容器６と、培養容器６を支持する電動ステージ７と、ヒータ８とが備えられている。
培養容器６は、標本Ａを収容し、内部の温度および湿度を維持可能な容器である。培養容器６は、電動ステージ７上に搭載されており、電動ステージ７の作動によって、例えば水平方向に移動可能となっている。
【００２３】
培養容器６の底面、電動ステージ７および区画壁３には、上下方向に貫通し、培養容器６内の空間と光学系空間５とを連通する貫通孔９が設けられている。また、培養容器６内には、標本Ａを収容する透明な材質からなる、例えば、シャーレ１０ａの平坦な底面にカバーガラス厚相当のガラス１０ｂを貼ったものやウェルプレート等の標本容器１０が収容されている。標本容器１０は、培養容器６の底面に設けられた貫通孔９に重なる位置に配置されることにより、貫通孔９を閉塞し、培養容器６内空間と、光学系空間５とを湿度的に分離するようになっている。
【００２４】
培養容器６内には、該培養容器６内の温度を検出する温度センサ１１が配置されている。また、培養容器６には、温度３７℃、湿度９０〜１００％、ＣＯ２濃度５％に調節された空気を循環させる環境制御部１２がチューブ１３を介して接続されている。
観察空間４の内壁面に設けられたヒータ８は、観察空間４内の温度を培養容器６の温度と同等の温度に加温するようになっている。
【００２５】
光学系空間５は、培養容器６に隣接して配置され、培養容器６と光学的に接続された空間である。
光学系空間５には、顕微鏡本体１４が配置されている。顕微鏡本体１４は、標本容器１０の底面下方に間隔をあけて対向配置され光軸を鉛直方向に配置された対物レンズ１５と、該対物レンズ１５を光軸方向に駆動制御する焦点調節機構１６と、走査光学系１７と、第１の波長のレーザ光を出射する第１の半導体レーザ１８ａと、第２の波長のレーザ光を出射する第２の半導体レーザ１８ｂと、これらの半導体レーザ１８ａ，１８ｂからのレーザ光を略平行光にするコリメートレンズ１９ａ，１９ｂと、これらのレーザ光を同一の光路に合流させるミラー２０およびダイクロイックミラー２１と、レーザ光を２次元的に走査するガルバノミラーからなるスキャナ（光走査手段）２２とを備えている。
【００２６】
また、顕微鏡本体１４は、対物レンズ１５、走査光学系１７、スキャナ２２を介して戻る標本Ａからの蛍光を透過する一方、レーザ光を反射するダイクロイックミラー２３と、ダイクロイックミラー２３を透過した蛍光を集光する共焦点レンズ２４と、共焦点レンズ２４の焦点位置に配置された共焦点ピンホール２５と、共焦点ピンホール２５を通過した蛍光内に含まれるレーザ光を遮断するバリアフィルタ２６と、バリアフィルタ２６を透過した蛍光を検出する光検出器２７とを備えている。図中符号２８はミラーである。
【００２７】
また、光学系空間５には、該光学系空間５内の温度を検出する温度センサ２９と、光学系空間５内の空気を加温するヒータ（光学系空間恒温化手段）３０とが備えられている。
また、光学系空間５内には、コントロールユニット３１が配置されている。
【００２８】
走査光学系１７は、２次元的に走査されたレーザ光を集光させて中間像を結像させる瞳投影レンズ１７ａと、中間像を結像したレーザ光を略平行光にして対物レンズ１５に入射させる結像レンズ１７ｂとを備えている。
ダイクロイックミラー２３は、回転可能なターレット３２に複数搭載され、ステッピングモータ３３の作動により、任意のダイクロイックミラー２３が択一的に光路上に配置されるようになっている。
共焦点ピンホール２５は、ピンホール位置駆動手段３４により、光軸と直交する２次元方向に位置調節可能に設けられている。
【００２９】
ダイクロイックミラー２３を切り替えると、各ダイクロイックミラー２３毎の微妙な角度差によって共焦点レンズ２４による焦点位置がずれるので、ダイクロイックミラー２３毎に共焦点ピンホールの位置を補正することができるように、ピンホール位置駆動手段３４による駆動位置をダイクロイックミラー２３毎に対応づけてコントロールユニット３１内の図示しないメモリに記憶している。
【００３０】
コントロールユニット３１は、半導体レーザ１８ａ，１８ｂ、スキャナ２２、光検出器２７、電動ステージ７のモータ３５、焦点調節機構１６のモータ３６、ターレット３２のステッピングモータ３３およびピンホール位置駆動手段３４を駆動するようになっている。また、各機器を駆動する際には、コントロールユニット３１が記憶している調整パラメータに従って駆動するようになっている。
【００３１】
ここで、調整パラメータとは、各機器を正しく作動させるために必要とされる制御値であり、製造誤差を補正するためのもので個々の装置毎に相違している。
調整パラメータの具体例としては、例えば、半導体レーザ１８ａ，１８ｂの駆動電流と明るさの関係、スキャナ２２による走査中心および走査幅、ダイクロイックミラー２３毎の共焦点ビンホール２５の位置、光検出器２７である光電子増倍管のアナログオフセット等があり、これらは、光学系空間５内の各部位が使用時の温度に恒温化された状態で設定調整されている。
【００３２】
また、この設定調整作業は、工場出荷時、または、納入場所に装置を最初にセットアップしたとき、あるいは保守点検時に行われるのが一般的である。
また、光学系空間５の恒温化温度を可変設定できる場合には、温度毎に最適化された調整パラメータを予め作成、保持しておき、使用時に設定された温度に対応する調整パラメータを読み出して使用してもよい。
【００３３】
また、コントロールユニット３１は、培養容器６内に配置された温度センサ１１、光学系空間５内に配置された温度センサ２９、およびレーザ空間５１内に配置された温度センサ６４（後述）による検出信号に基づいて、ヒータ８，３０を駆動し、各温度センサ１１，２９により検出される温度が３７℃となるようにヒータ８，３０を制御するようになっている。
【００３４】
スキャナ２２と対物レンズ１５との間、より具体的には結像レンズ１７ｂと対物レンズ１５との間には、スキャナ２２を介さずに標本Ａからの蛍光を検出するノンディスキャン検出ユニット５７が設けられている。
【００３５】
ノンディスキャン検出ユニット５７は、結像レンズ１７ｂと対物レンズ１５との間に配置されたダイクロイックミラー（分岐手段）５３と、ダイクロイックミラー５３により反射された光を結像する結像レンズ５４と、結像レンズ５４により結像された光を検出する光検出器５５とを備えている。また、光検出器５５の周囲を囲うように配置された筒状の光検出器カバー５６を備えているようにしてもよい。
【００３６】
ダイクロイックミラー５３は、標本Ａからの蛍光を反射する一方、スキャナ２２により走査されたレーザ光を透過させることで、標本Ａからの蛍光とレーザ光とを分岐するようになっている。
【００３７】
光検出器５５は、例えば光電子増倍管（Photomultiplier Tube）であり、外装カバー２の内部に配置されている。
外装カバー２は、遮光性を有する材料で構成されており、光学系空間５の外部からの光（環境光）を遮断するようになっている。これにより、光検出器５５への環境光の影響を防止するようになっている。なお、光検出器カバー５６に遮光機能は必要ないが、遮光機能を持たせてもよい。
【００３８】
レーザ空間５１には、２光子励起観察用のレーザ光源６１と、揺動可能に設けられたミラー６２と、レーザ光源６１とミラー６２との間に設けられた音響光学素子（ＡＯＭ）６３と、温度センサ６４とが配置されている。
【００３９】
レーザ光源６１は、例えばフェムト秒パルスレーザ光等の極短パルスレーザ光を射出するようになっている。
ミラー６２は、アライメント制御が可能となっており、ミラーの角度を変化させることで、レーザ光源６１からの極短パルスレーザ光を後述する光学窓６５に入射するように反射するようになっている。
【００４０】
光学系空間５とレーザ空間５１とを仕切る区画壁５２には、光学系空間５とレーザ空間５１と光学的に接続する光学窓６５が設けられている。これにより、レーザ光源６１から射出された極短パルスレーザ光は、音響光学素子６３およびミラー６２を介して光学窓６５を透過し、光学系空間５内のミラー２０に導光されるようになっている。ミラー２０に導光された極短パルスレーザ光は、ミラー２０を透過して、ダイクロイックミラー２１によって反射されるようになっている。これにより、レーザ光源６１から射出された極短パルスレーザ光は、半導体レーザ１８ａ，１８ｂからのレーザ光と同じ光路を通るようになっている。
【００４１】
また、レーザ空間５１には、レーザ空間５１内の空気を冷却するペルチェ素子（第１の熱電素子）６６と、ペルチェ素子６６により冷却された空気を加温するペルチェ素子（第２の熱電素子）６７とが設けられている。ペルチェ素子６６およびペルチェ素子６７は、具体的には、例えばレーザ空間５１内の湿度が１０％以下、温度が２２±２℃となるように制御される。
【００４２】
ペルチェ素子６６によってレーザ空間５１内の空気を冷却して結露させ、冷却された空気をペルチェ素子６７によって加温することで、レーザ空間５１内の湿度を低減することができる。すなわち、ペルチェ素子６６およびペルチェ素子６７は、レーザ空間５１内の湿度を低減する湿度低減手段として機能する。
【００４３】
ここで、レーザ光源６１から射出される極短パルスレーザ光は、水分によって特定の波長帯域（例えば９００ｎｍから９５０ｎｍ）が吸収されてしまう。したがって、ペルチェ素子６６およびペルチェ素子６７によってレーザ空間５１内の湿度を低減することで、レーザ空間５１内の水分によって特定の波長帯域が吸収されてしまうことを抑制することができる。極短パルスレーザ光は、帯域幅十数ｎｍ程度で波長が可変であるため、上記のようにすることで、水分による吸収の影響を受けずにどの波長でも極短パルスレーザ光を良好に照射でき、標本Ａの観察精度を向上することができる。なお、図１に示すように、レーザ空間５１内に、例えばシリカゲル等の乾燥剤６８を配置することにより、レーザ空間５１内の除湿効果を向上することができる。
【００４４】
また、ペルチェ素子６６およびペルチェ素子６７は、レーザ空間５１内の温度を制御する温度制御手段としても機能する。これにより、発熱体であるレーザ光源６１を冷却して、極短パルスレーザ光を安定して射出させることができる。また、光学系空間５とレーザ空間５１との温度差を所定の範囲内とすることができ、光学系空間５内における結露を防止することができる。
【００４５】
このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の作用について、以下に説明する。
まず、半導体レーザ１８ａ，１８ｂを用いた１光子励起観察について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１を用いて標本Ａの観察を行うには、標本容器１０の底面に生細胞等の標本Ａを接着させた状態として、標本容器１０を培養容器６内に収容し、標本容器１０の底面によって電動ステージ７の貫通孔９を閉塞する。
【００４６】
この状態で、環境制御部１２を作動させ、培養容器６内に培養環境に適した空気、すなわち、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の空気を循環させる。
また、コントロールユニット３１を作動させ、ヒータ８，３０の作動により培養容器６内および光学系空間５内の温度センサ１１，２９の出力が３７℃となるようにそれぞれ加温する。
【００４７】
そして、観察空間４内および光学系空間５内が３７℃に恒温化された状態で、半導体レーザ１８ａ，１８ｂを作動させてレーザ光を出射させ、ダイクロイックミラー２３によって反射させ、スキャナ２２によって２次元的に走査させ、瞳投影レンズ１７ａ、結像レンズ１７ｂおよび対物レンズ１５により集光して、標本容器１０底面に配置されている標本Ａに対してレーザ光を照射する。
【００４８】
レーザ光が照射された標本Ａ上の各位置においては、蛍光物質が励起されることにより蛍光が発せられる。発生した蛍光は、対物レンズ１５によって集光されるとともに、結像レンズ１７ｂ、瞳投影レンズ１７ａおよびスキャナ２２を介して戻り、ダイクロイックミラー２３によりレーザ光から分岐されて共焦点レンズ２４によって集光される。そして、集光された蛍光のうち、対物レンズ１５の焦点面において発生した蛍光のみが共焦点ピンホール２５を通過して光検出器２７により検出される。
【００４９】
コントロールユニット３１には、光検出器２７により検出された蛍光の輝度情報が入力されてくるので、その輝度情報が検出された時点におけるスキャナ２２による走査位置情報と対応づけて記憶していくことにより、２次元的なフレーム画像を取得することができる。
【００５０】
次に、レーザ光源６１を用いた２光子励起観察について説明する。
まず、コントロールユニット３１を作動させ、ヒータ８，３０の作動により培養容器６内および光学系空間５内の温度センサ１１，２９の出力が３７℃となるようにそれぞれ加温する。また、ペルチェ素子６６およびペルチェ素子６７を作動させ、レーザ空間５１内の湿度が１０％以下、温度が２２±２℃となるように制御する。
【００５１】
この状態で、レーザ光源６１を作動させて極短パルスレーザ光を出射させると、極短パルスレーザ光は、音響光学素子６３およびミラー６２を介して光学窓６５を透過し、光学系空間５内のミラー２０に導光される。そして、極短パルスレーザ光は、ミラー２０を透過し、ダイクロイックミラー２３によって反射され、スキャナ２２によって２次元的に走査される。その後、極短パルスレーザ光は、瞳投影レンズ１７ａ、結像レンズ１７ｂおよび対物レンズ１５により集光され、標本容器１０底面に配置されている標本Ａに照射される。
【００５２】
レーザ光が照射された標本Ａ上の焦点位置においては、２光子励起効果により、蛍光物質が励起されて蛍光が発せられる。発生した蛍光は、対物レンズ１５によって集光され、ダイクロイックミラー５３により反射されて、結像レンズ５４を介して光検出器５５により検出される。
【００５３】
コントロールユニット３１には、光検出器５５により検出された蛍光の輝度情報が入力されてくるので、その輝度情報が検出された時点におけるスキャナ２２による走査位置情報と対応づけて記憶していくことにより、２次元的なフレーム画像を取得することができる。
【００５４】
上記のように、標本Ａから発生した蛍光をスキャナ２２に戻さずに光検出器５５により検出することで、各光学部品における信号の減衰を最小限に抑え、２光子蛍光のＳ／Ｎ比を向上させることができる。ここで、ノンディスキャン検出では共焦点ピンホールにより標本Ａの焦点面において発生した２光子蛍光のみを切り出すことはできないが、２光子励起による蛍光は極短パルスレーザ光の集光位置（ピント位置）のごく近傍でしか生じないので、共焦点ピンホールがなくても標本Ａの光学的断面画像を取得することができる。
【００５５】
以上のように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、培養容器６内に収容された標本Ａは、培養容器６内の温度が約３７℃に恒温化され、かつ湿度が９０％〜１００％に維持されることによって、長時間にわたって健全な状態に維持される。この標本Ａに対して、スキャナ２２により走査された極短パルスレーザ光を集光させることで、多光子励起効果によって蛍光が発生し、この蛍光が対物レンズ１５によって集光される。集光された蛍光は、ダイクロイックミラー５３によって極短パルスレーザ光と分岐され、光検出器５５によって検出される。
【００５６】
このように２光子励起観察を行うことで、標本Ａへのダメージおよび蛍光の退色を抑制することができる。また、この場合において、光検出器５５は、周囲に設けられた外装カバー２によって光学系空間５の外部からの光（環境光）が遮断されているため、環境光による影響を排除して安定した観察を行うことができる。
【００５７】
また、光学系空間５に、光学系空間５内を培養容器６内の温度とほぼ同等の温度に恒温化するヒータ３０を備えることで、光学系空間５内も培養容器６内の温度とほぼ同等の温度に恒温化されるので、光学系空間５内の光学系および機械系に、培養容器６の温度に基づく温度勾配が発生することが防止される。これにより、光学系および機械系に歪みが発生することを防止でき、得られる画像の低輝度化、不鮮明化を効果的に防止することができる。
【００５８】
また、光学系空間５を培養容器６から湿度的に分離することで、培養容器６内の高湿度が、対物レンズ１５等の光学系やスキャナ２２等の機械系に影響を与えることを防止できる。
【００５９】
なお、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第１の変形例として、図２に示すように、ノンディスキャン検出ユニット５７（光検出器カバー５６）の一部を外装カバー２の外部に突出させ、この突出した部分に光検出器５５を配置するとともに、ペルチェ素子（冷却部）７２を設け、光検出器５５から発生する熱を排出することとしてもよい。この場合、光検出器カバー５６にも遮光性を持たせ、外装カバー２から出た部分に関しても環境光を遮断する。
本変形例に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、光検出器カバー５６内に配置された光検出器５５を冷却して熱ノイズの発生を防止することができ、光検出器５５による標本Ａからの光の検出精度を向上することができる。
【００６０】
また、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第２の変形例として、図３に示すように、レーザ空間５１と光学系空間５とが分離され、レーザ空間５１と光学系空間５との間に極短パルスレーザ光を導光するファイバ７５を設けることとしてもよい。
このようにすることで、レーザ走査型顕微鏡１の本体（観察空間４および光学系空間５）を小型化することができる。また、ファイバ７５を繋ぎ替えることで、複数のレーザ走査型顕微鏡１でレーザ光源６１を兼用することができる。
【００６１】
なお、本実施形態および上記の各変形例に係るレーザ走査型顕微鏡１において、除湿用のペルチェ素子６６を省略し、乾燥剤６８と温度調整用のペルチェ素子６７をレーザ空間５１に設けることとしてもよい。
この場合には、乾燥剤６８によってレーザ空間５１内の空気の湿度を低減させ、この空気が２２±２℃となるように、ペルチェ素子６７によって温度を調整する。
【符号の説明】
【００６２】
Ａ 標本
１ レーザ走査型顕微鏡
２ 外装カバー（遮光壁）
３ 区画壁
４ 観察空間
５ 光学系空間
６ 培養容器
８ ヒータ（加温手段、観察空間恒温化手段）
９ 貫通孔
１０ 標本容器
１５ 対物レンズ
１６ 焦点調節機構
１７ 走査光学系
１８ａ，１８ｂ 半導体レーザ
２０ ミラー
２１ ダイクロイックミラー
２２ スキャナ（光走査手段）
２３ ダイクロイックミラー
２５ 共焦点ピンホール
３０ ヒータ（光学系空間恒温化手段）
３１ コントロールユニット
５１ レーザ空間
５２ 区画壁
５３ ダイクロイックミラー（分岐手段）
５５ 光検出器（光検出部）
５６ 光検出器カバー
５７ ノンディスキャン検出ユニット
６１ レーザ光源
６２ ミラー
６３ 音響光学素子（ＡＯＭ）
６４ 温度センサ
６５ 光学窓
６６ ペルチェ素子（第１の熱電素子）
６７ ペルチェ素子（第２の熱電素子）
６８ 乾燥剤
７２ ペルチェ素子（冷却手段）
７５ ファイバ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本を収容し、内部の温度および湿度を維持可能な培養容器と、
該培養容器に隣接して配置され、該培養容器と光学的に接続された光学系空間とを備え、
該光学系空間に、
極短パルスレーザ光を前記標本上で２次元的に走査する光走査手段と、
該光走査手段により走査された極短パルスレーザ光を前記標本に集光させる一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、
前記光走査手段と前記対物レンズとの間に設けられ、前記標本からの光と前記レーザ光とを分岐する分岐手段と、
該分岐手段により分岐された前記標本からの光を検出する光検出部と、
前記光学系空間を囲うように設けられ、前記光学系空間の外部からの光を遮断する遮光壁とが備えられているレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記光学系空間に、該光学系空間内を前記培養容器内の温度とほぼ同等の温度に恒温化する光学系空間恒温化手段が備えられている請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記光学系空間が、前記培養容器に対して湿度的に分離されている請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源を収容し、前記光学系空間と光学的に接続されたレーザ空間とを備える請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記レーザ空間に、該レーザ空間内の湿度を低減する湿度低減手段が備えられている請求項４に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記湿度低減手段が、前記レーザ空間内の空気を冷却する第１の熱電素子と、該第１の熱電素子により冷却された空気を加温する第２の熱電素子である請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記レーザ空間に、該レーザ空間内の温度を制御する温度制御手段が備えられている請求項４から請求項６のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記レーザ空間と前記光学系空間とが分離され、前記レーザ空間と前記光学系空間との間に極短パルスレーザ光を導光するファイバが設けられている請求項４から請求項７のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記光検出器を囲むカバーと、該カバー内部を冷却する冷却手段とが備えられている請求項１から請求項８のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１】
標本を収容し、内部の温度および湿度を維持可能な培養容器と、
該培養容器に隣接して配置され、該培養容器と光学的に接続された光学系空間とを備え、
該光学系空間に、
極短パルスレーザ光を前記標本上で２次元的に走査する光走査手段と、
該光走査手段により走査された極短パルスレーザ光を前記標本に集光させる一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、
前記光走査手段と前記対物レンズとの間に設けられ、前記標本からの光と前記レーザ光とを分岐する分岐手段と、
該分岐手段により分岐された前記標本からの光を検出する光検出部と、
前記光学系空間を囲うように設けられ、前記光学系空間の外部からの光を遮断する遮光壁とが備えられているレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記光学系空間に、該光学系空間内を前記培養容器内の温度とほぼ同等の温度に恒温化する光学系空間恒温化手段が備えられている請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記光学系空間が、前記培養容器に対して湿度的に分離されている請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源を収容し、前記光学系空間と光学的に接続されたレーザ空間とを備える請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記レーザ空間に、該レーザ空間内の湿度を低減する湿度低減手段が備えられている請求項４に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記湿度低減手段が、前記レーザ空間内の空気を冷却する第１の熱電素子と、該第１の熱電素子により冷却された空気を加温する第２の熱電素子である請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記レーザ空間に、該レーザ空間内の温度を制御する温度制御手段が備えられている請求項４から請求項６のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記レーザ空間と前記光学系空間とが分離され、前記レーザ空間と前記光学系空間との間に極短パルスレーザ光を導光するファイバが設けられている請求項４から請求項７のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記光検出器を囲むカバーと、該カバー内部を冷却する冷却手段とが備えられている請求項１から請求項８のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１０２９７０（Ｐ２０１１−１０２９７０Ａ）
【公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２６４２０（Ｐ２０１０−２２６４２０）
【出願日】平成２２年１０月６日（２０１０．１０．６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月６日（２０１０．１０．６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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