説明

ロイコ色素の安定化方法

【課題】本発明の課題は、液状で長期間保存が可能なロイコ型色素の安定化方法ならびに
ロイコ型色素の発色反応時の非特異的発色の軽減方法、及びこれを利用した液状で安定な
試薬組成物を提供することにある。
【解決手段】ロイコ型色素を特定の還元剤と共存させることにより自然発色が抑えられ、
溶液での安定性が格段に向上すること、また、ロイコ型色素を用いた過酸化水素との発色
反応時にロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水
素とは反応しない別の色素を反応液に共存させると、非特異的な発色が抑えられ、試薬ブ
ランク値が下がること、を見出し分析用試薬に応用した。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ロイコ型色素の溶液中での安定化方法及び発色反応時の非特異的発色の軽減
方法、及び前記方法を用いた分析試薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
臨床検査分野において、酵素法による種々の測定法が確立されている。このうち酸化酵
素を用いる場合は生成された過酸化水素を種々の酸化発色剤を用い、パーオキシダーゼ存
在下に酸化的に色素を産生させその吸光度を測定する方法が従来から知られている。例え
ば、4−アミノアンチピリンに代表されるカップラーと各種トリンダー試薬との組み合わ
せが多用されている。一方、より少量の過酸化水素を高感度に検出する方法として、2,
2'−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸(ABTS)などの
ロイコ化合物を用いた方法も知られている。一般に、これらロイコ型色素と総称される高
感度な発色色素は、溶液状態での安定性が悪く自然発色してしまうため、試薬調製後の使
用期間が短く、しかも試薬ブランクが高くなりやすい傾向があり測定精度上に問題点が生
じるため、臨床検査試薬キットなどに実用化されることはほとんどなかった。
これまでに報告されているロイコ型色素の安定化方法として、特許文献1には、シクロ
デキストリン及びその誘導体による10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム(DA−67)の安定化効果につ
いて報告されている。また、特許文献2には、ロイコ型色素N−(カルボキシメチルアミ
ノカルボニル)−4,4−ビス(ジメチルアミノ)ビフェニルアミン(DA−64)を安
定化するために、パーオキシダーゼ又はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを共存させる
方法が開示されている。更に特許文献3にはN,N,N',N',N'',N''−ヘキサ(3−スルフォプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン・6Na(TPM−PS)の安定化方法が開示されている。
特許文献1によれば、短期間(10日以内)での効果は認められているが、長期間保存
した場合の挙動についての記載は一切なく長期保存の効果は疑問である。また特許文献2
は、波長のスペクトルのみから色素が安定であると判断しているが、これを用いて実際に
過酸化水素が定量できたかについての記載は一切ない。更に、特許文献3には特定の緩衝
液及びキレート剤による安定化効果が示されているが、短期間保存後の吸光度を測定し、
これを単純に比例計算して1年後の結果を推定しているため根拠が希薄であり、実際に長
期間保存した場合の効果に疑問があった。
一方、ロイコ型色素単独での安定化ができても、パーオキシダーゼが添加された過酸化
水素発色反応時に色素が非特異的に発色してしまい正確な測定を妨げてしまうという問題
点があった。すなわち、過酸化水素発色反応時にロイコ型色素とパーオキシダーゼが共存
した状態では、過酸化水素が存在しなくても、非特異的な反応により経時的に試薬ブラン
クが増加してしまうという問題があった。
ロイコ型色素は過酸化水素の高感度検出に適しているため、液状で長期間安定なロイコ
型色素の安定化方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開平01−118768号公報
【特許文献2】国際公開第2003/033601号パンフレット
【特許文献3】特開2005−110507号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の課題は、液状で長期間保存が可能なロイコ型色素の安定化方法ならびにロイコ
型色素の発色反応時の非特異的発色の軽減方法、及びこれを利用した液状で安定な試薬組
成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、鋭意検討した結果、ロイコ型色素を特定の還元剤と共存させることによ
り自然発色が抑えられ、溶液での安定性が格段に向上することを見出した。
また、ロイコ型色素を用いた過酸化水素との発色反応時にロイコ型色素の測定波長に影
響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素とは反応しない別の色素を反応液に
共存させると、驚くべきことに非特異的な発色が抑えられ、試薬ブランク値が下がること
、かつ試薬ブランク値のバラツキも大きく軽減し測定精度が飛躍的に向上することを見出
した。
さらに、本発明を、分析試薬へ応用し、糖化蛋白質であるヘモグロビンA1cの酵素的測
定法において、液状で安定な試薬組成物を完成するに到った。
すなわち、本発明は、以下の構成を有する。
(1)ロイコ型色素を、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ば
れた1種以上の還元剤と共存させることを特徴とするロイコ型色素溶液の安定化方法。
(2)ロイコ型色素が10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジ
メチルアミノ)フェノチアジンナトリウム又はN,N,N',N',N'',N''−ヘキサ(3−スルフォプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン 6ナトリウムである前記(1)記載のロイコ型色素溶液の安定化方法。
(3)ロイコ型色素の溶液中での濃度が0.01〜2mMである前記(1)又は(2)に
記載のロイコ型色素溶液の安定化方法。
(4)還元剤の溶液中での濃度が0.005〜10mMである前記(1)〜(3)のいず
れかに記載のロイコ型色素溶液の安定化方法。
(5)還元剤が、システイン、システアミン、N−アセチルシステイン、チオグリセロー
ル、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムからなる群より選ばれ
た1種以上である前記(1)〜(4)のいずれかに記載のロイコ型色素溶液の安定化方法

(6)0.005〜10mMの還元性チオアルコール類又は還元性硫酸塩類からなる群よ
り選ばれた1種以上の還元剤と、0.01〜2mMの10−(カルボキシメチルアミノカ
ルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム又はN,N,N
',N',N'',N''−ヘキサ(3−スルフォプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン・6ナトリウムからなるロイコ型色素の液状組成物。
(7)還元剤が、システイン、システアミン、N−アセチルシステイン、チオグリセロー
ル、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムからなる群より選ばれ
た1種以上である前記(5)に記載の液状組成物。
(8)ロイコ型色素を用いたパーオキシダーゼ共存下での過酸化水素発色反応において、
ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素とは反
応しない別の色素を共存させることを特徴とするロイコ型色素の非特異発色反応を軽減す
る方法。
(9)ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素
と反応しない別の色素の極大吸収波長が、400nm〜550nmの範囲である前記(8
)に記載のロイコ型色素の非特異発色反応を軽減する方法。
(10)ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水
素と反応しない別の色素が、オレンジG、オレンジII、食用赤色2号、食用赤色3号、
食用赤色40号、食用赤色102号、食用赤色104号、食用赤色106号、食用黄色4
号、食用黄色5号より選ばれた1種以上である前記(8)又は(9)に記載のロイコ型色
素の非特異発色反応を軽減する方法。
(11)ロイコ型色素が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス
(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム又はN,N,N',N',N'',N''−ヘキサ(3−スルフォプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン 6ナトリウムである前記(8)〜(10)のいずれかに記載のロイコ型色素の非特異発色反応を軽減する方法。
(12)ロイコ型色素を、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選
ばれた1種以上の還元剤及びロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを
有しかつ過酸化水素とは反応しない別の色素と、共存させた状態で過酸化水素と反応させ
ることを特徴とする過酸化水素定量方法。
(13)ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水
素とは反応しない別の色素とパーオキシダーゼを含む一の試薬と、還元性チオアルコール
類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤とロイコ型色素を含む一
の試薬を組み合わせたことを特徴とする過酸化水素を定量するための試薬。
(14)前記(13)記載の過酸化水素を定量するための試薬を用いた液状で安定な糖化
蛋白質測定用試薬。
(15)ロイコ型色素として10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビ
ス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム又はN,N,N',N',N'',N''−ヘキサ(3−スルフォプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン 6ナトリウム、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤及び糖化蛋白質に作用するプロテアーゼを含む一の試薬、パーオキシダーゼ、ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素とは反応しない別の色素及びケトアミンオキシダーゼを含む一の試薬を組み合わせてなる前記(14)記載の糖化蛋白質測定用試薬。
(16)糖化蛋白質がヘモグロビンA1cであり、第一試薬で総ヘモグロビンを定量、第
二試薬でヘモグロビンA1cを定量し、総ヘモグロビン量に対するヘモグロビンA1c量
の割合を求めるための前記(14)記載の糖化蛋白質測定用試薬。
(17)プロテアーゼ反応促進剤、1−デオキシフルクトシル−L−バリル−L−ヒスチ
ジンに作用するケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、トリンダー試薬、アスコル
ビン酸酸化酵素及びロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、か
つ過酸化水素と反応しない別の色素を含む第一試薬と、ヘモグロビンA1cの糖化β鎖末
端から1−デオキシフルクトシル−L−バリル−L−ヒスチジンを切り出すことのできる
プロテアーゼ、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチル
アミノ)フェノチアジンナトリウム、シクロデキストリン類及び還元性チオアルコール類
及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤を含む第二試薬とからなる
前記(16)記載の糖化蛋白質測定用試薬。
(18)プロテアーゼ反応促進剤、ヘモグロビンA1cに作用してヘモグロビンA1cの
糖化β鎖末端から1−デオキシフルクトシル−L−バリル−L−ヒスチジンを切り出すこ
とのできるプロテアーゼ、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス
(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム、カタラーゼ、シクロデキストリン類及び
還元剤を含む第一試薬、ケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ及びロイコ型色素の
測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素と反応しない色素を含
む第二試薬とからなる前記(16)記載の糖化蛋白質測定用試薬。
(19)プロテアーゼ反応促進剤が、N−アシルアミノ酸(塩)またはN−アシルタウリ
ン(塩)から選ばれた陰イオン界面活性剤であり、ケトアミンオキシダーゼがネオコスモ
スポラ属またはカーブラリア属由来であり、ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸
収スペクトルを有し、かつ過酸化水素と反応しない色素が黄色4号又は赤40号又は赤1
02号であり、ヘモグロビンA1cに作用してヘモグロビンA1cの糖化β鎖末端から1
−デオキシフルクトシル−L−バリル−L−ヒスチジンを切り出すことのできるプロテア
ーゼがバチルス属又はリゾバクター属由来であり、シクロデキストリン類が2−ヒドロキ
シプロピル−β−シクロデキストリンであり、トリンダー試薬がALPS又はADPSで
あり、還元剤が亜硫酸ナトリウムであり、血球を水により溶血させ、これを検体として用
いることを特徴とする前記(17)記載の糖化蛋白質測定用試薬。
(20)全血中の糖化蛋白質を測定するための測定試薬であって、さらに、第一試薬にケ
トアミンオキシダーゼを含む前記(17)に記載の糖化蛋白質測定用試薬。
【発明の効果】
【0006】
本発明は、ロイコ型色素の溶液中での安定化方法及び発色反応時の非特異的発色の軽減
方法、及び前記方法を用いた糖化蛋白質分析試薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】特許文献12記載のプロテアーゼ反応促進剤による総ヘモグロビンの定量を示すグラフである。
【図2】還元剤有無による総ヘモグロビン量の相関関係を示すグラフである。
【図3】還元剤有無によるHbA1c量の相関関係を示すグラフである。
【図4】還元剤有りの場合における酵素法と免疫法の相関関係を示す式グラフである。
【図5】免疫法と酵素法の相関関係を示す式グラフである(色素なし)。
【図6】免疫法と酵素法の相関関係を示す式グラフである(色素あり)。
【図7】免疫法(血球)と酵素法(全血)の相関関係を示す式グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0008】
以下、本願発明について具体的に説明する。
一般に、還元剤は、ロイコ型色素などの酸化発色色素とパーオキシダーゼによる過酸化
水素の発色反応を阻害し、発色強度の低下を引き起こすことが知られている。従って、還
元剤添加によってロイコ型色素が安定化されても、発色強度が低下してしまい実用的でな
い場合も考えられる。この還元剤による発色阻害の程度は、酸化発色色素の種類によって
異なるので、本発明に用いることのできるロイコ型色素は、安定化剤として加える還元剤
により発色の阻害を受けにくいか、あるいは低濃度の還元剤によっても安定化効果が認め
られるものであることが望ましい。
【0009】
本発明に使用できるロイコ型色素の好適な例としては、10−(カルボキシメチルアミ
ノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム(DA−6
7)又はN,N,N',N',N'',N''−ヘキサ(3−スルフォプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン 6ナトリウム(TPM−PS)が挙げられる。ロイコ型色素の濃度は例えば0.005〜10mM、好ましくは0.02から3mMの範囲、さらに好ましくは0.05から1mMの範囲である。
【0010】
次に、本発明に用いることのできる還元剤として、還元性チオアルコール類や還元性硫
酸塩類が挙げられる。
還元性チオアルコール類としては、チオグリセロール、システイン、N−アセチルシス
テイン、システアミン塩酸塩(2−アミノエタンチオール塩酸塩)が、また、還元性硫酸
塩類としては、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリ
ウム、ニ亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸カリウムなどが挙げられる。これらは、単独、ある
いは組み合わせて用いることができる。
【0011】
これら還元剤の濃度は、選択された還元剤による発色阻害の程度と安定化の程度を実験
的に確認し、対象とする非測定物の濃度範囲を参考にその濃度を設定すればよいが、例え
ば0.005〜10mM、好ましくは0.02から3mMの範囲である。
更に、シクロデキストリン及びその誘導体などの従来から知られている安定化剤と組み
合わせることによって、相乗的な効果も期待できる。
【0012】
このようにロイコ型色素を還元剤と共存することにより、溶液状態で長期間着色しない
ロイコ型色素の安定化が達成された。これにより、実用的でより精度の高い分析試薬への
応用が可能となったが、この場合の好適な例としては2種類の試薬に分け、一方に本発明
のロイコ型色素と還元剤を共存させた溶液を、他方にパーオキシダーゼ溶液を用いればよ
い。
【0013】
一方、先に述べたように、ロイコ型色素の安定化ができても、パーオキシダーゼが添加
された過酸化水素発色反応時にロイコ型色素が非特異的に発色してしまい正確な測定を妨
げてしまうという問題点があった。すなわち、過酸化水素発色反応時のロイコ型色素とパ
ーオキシダーゼが共存した状態で過酸化水素が存在しなくても、非特異的な反応により経
時的に試薬ブランクが増加してしまう。通常、発色強度を定量的に測定するためには、反
応溶液に光を当てて、個々の酸化色素に特有な波長での吸光度を測定する分光分析法が用
いられる。例えば、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメ
チルアミノ)フェノチアジンナトリウム(DA-67)の場合は660nm付近に、また、N
,N,N',N',N'',N''−ヘキサ(3−スルフォプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン・6Na(TPM-PS)の場合は600nm付近に極大吸収波長を持つ。
【0014】
本発明者らは、試薬ブランクが分析装置の光源ランプの強さや光路長などによって大き
く影響を受けるのは、吸光度を測定するために光源として照射する光が、試薬ブランクの
一因になっているのではないかと考え、このことを確認するために仕様が異なる2種類の
自動分析装置を用いて検討したところ、実際に試薬ブランクの値が大きく異なることを見
出した。試薬ブランクの値は、分析装置の仕様、例えば、主に光源ランプの出力、反応液
に照射される光量に大きく左右されることが判明したが、実用上、試薬ブランクが大きけ
れば大きいほど、結果的に測定精度が悪くなってしまうという問題点が生じる。このこと
は、たとえ特定の還元剤を共存させてロイコ型色素を溶液中で安定化させることができて
も、パーオキシダーゼが共存して実際の発色反応が進行する時には、光源ランプを照射し
て分光分析法にて吸光度をモニターする過程で光源ランプの影響を受け、結果として非特
異発色として試薬ブランクが増大し測定精度が悪くなると考えられた。
【0015】
そこで、本発明者らは、鋭意検討を加えた結果、ロイコ型色素を用いた過酸化水素の発
色反応時に測光時の光源ランプの影響を軽減するため、400〜550nm付近に極大吸
収波長を有する色素を反応液に共存させると、驚くべきことにこの非特異的な発色が抑え
られ、試薬ブランク値が下がること、かつ試薬ブランク値のバラツキも大きく軽減し測定
精度が飛躍的に向上することを見出した。
【0016】
本発明でいうロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過
酸化水素とは反応しない色素とは、自らパーオキシダーゼによる酸化発色反応を起こさな
いこと、またロイコ型色素とパーオキシダーゼによる過酸化水素発色反応に影響を及ぼさ
ないこと、つまりロイコ型色素発色時の極大吸収波長と干渉しない色素をいう。具体的に
は、上に示した400〜550nm付近に極大吸収波長を有する色素を適宜選択すればよ
い。
【0017】
本発明に用いることのできる400〜550nm付近に極大吸収波長を有する色素とし
ては、例えば食用色素が挙げられ、このうち合成食用色素として、食用赤色2号(アマラ
ンス、極大吸収波長 508nm)、食用赤色3号(エリスロシン、極大吸収波長 52
6nm)、食用赤色40号(アルラレッドAC、極大吸収波長 499nm)、食用赤色
102号(ニューコクシン、極大吸収波長 428nm)、食用赤色104号(フロキシ
ン、極大吸収波長 538nm)、食用赤色106号(アシッドレッド、極大吸収波長
508nm)、食用黄色4号(タートラジン、極大吸収波長 428nm)、食用黄色5
号(サンセットイエローFCF、極大吸収波長 482nm)などが、また、食用色素以
外の色素でも、オレンジG(極大吸収波長 480nm)、オレンジII(極大吸収波長
480nm)などを用いてもよい。更に、天然食用色素として知られているコチニール
色素、タマネギ色素、ベニバナ黄色素、クチナシ赤色素等を用いることもできる。
【0018】
これら400〜550nm付近に極大吸収波長を有する色素の好適な濃度は、例えば0
.005〜3mM、好ましくは0.02から1mMの範囲であるが、これに限定されるも
のではない。また、2種以上の色素を組み合わせて用いることもできる。
【0019】
これら400〜550nm付近に極大吸収波長を有する色素は、本発明に用いる還元剤
により安定化されたロイコ型色素溶液と共存させても、またパーオキシダーゼ溶液と共存
させてもよい。
【0020】
発明者らは上記記載のように、鋭意検討した結果、(1)還元剤を共存させることによ
って液状でのロイコ型色素の安定化が達成され、さらに(2)ロイコ型色素の吸光度測定
波長に影響を与えない400〜550nm付近に極大吸収波長を有する別の色素を発色反
応時の液に共存させることにより、ロイコ型色素の非特異的な発色を抑止し、これにより
測定精度の高く実用性にすぐれた液状で長期間安定なロイコ型色素を含む過酸化水素定量
用試薬組成物を完成するに到った。
【0021】
本発明による分析試薬組成物への応用については、測定対象物が定量的に過酸化水素に
変換できる反応系であれば特に限定はされない。
ここでは、好適な例として 糖化蛋白質であるヘモグロビンA1cの酵素的な測定法へ
の応用を挙げる。ヘモグロビンA1cの酵素的な測定法及び測定用酵素についてはこれま
でに以下のとおり種々報告されている。
【特許文献4】特許第303468公報
【特許文献5】国際公開第2002/06519号パンフレット
【特許文献6】国際公開第2005/56823号パンフレット
【特許文献7】特開2001−95598号公報
【特許文献8】特開2003−235585号公報
【特許文献9】特開2005−110657号公報
【特許文献10】国際公開第2005/49857号パンフレット
【特許文献11】国際公開第2004/104203号パンフレット
【特許文献12】国際公開第2006/013921号パンフレット
【非特許文献1】Clinical Chemistry 49(2):269−274(2003)
【非特許文献2】Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 40(1):78−89(2002)
【非特許文献3】臨床検査 46(6):729−734(2002)
【0022】
<糖化ヘモグロビン>
ヘモグロビンがメイラード反応により糖化されたアマドリ化合物のことをさし、α鎖及
びβ鎖N末端のバリンのα−アミノ基や分子内のリジンのε−アミノ基が糖化されている
と言われている。糖化ヘモグロビンのフラグメントとは糖化ヘモグロビンが分解されるこ
とによりできるペプチドのことをいう。
<ヘモグロビンA1c>
国際的に標準とされる定義において、ヘモグロビンA1cとはヘモグロビンβ鎖N末端
のバリンのα−アミノ基が糖化されたヘモグロビンであるとされている(非特許文献2)
<ケトアミンオキシダーゼ>
ケトアミン構造をもつ化合物に作用して過酸化水素を発生させる酵素のことで、別名フ
ルクトシルアミンオキシダーゼともいう。
【0023】
一般的にヘモグロビンA1cはプロテアーゼ、ケトアミンオキシダーゼを用いて定量さ
れるが、国際的に標準とされる定義において、ヘモグロビンA1cとはヘモグロビンβ鎖
N末端のバリンのα−アミノ基が糖化されたヘモグロビンであるとされているため、その
特異性が課題となる。ヘモグロビンにおいて、β鎖N末端のバリン以外にα鎖N末端のバ
リンや、分子内のリジンのε−アミノ基が糖化されているため、これらのものを測定せず
に、ヘモグロビンA1cのヘモグロビンβ鎖N末端の糖化バリン部位のみを選択的に定量
しなければならない。このための酵素として、ある特定の生成物を切り出すプロテアーゼ
又はある特定のペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼが数多く見出されている。
しかしながら特定の生成物を切り出すプロテアーゼといっても、ヘモグロビンを基質と
した場合、目的とする生成物以外にも多かれ少なかれ通常は他のペプチド又はアミノ酸も
生成する。ある特定のペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼについても同様で、作
用する基質はその他複数種あるのが通常である。すなわちこれらの特異性の高いといわれ
る酵素を用いても、ヘモグロビンからプロテアーゼにより切り出される生成物は複数種あ
るため、プロテアーゼ単独の特異性もしくは、ケトアミンオキシダーゼ単独の特異性のみ
でヘモグロビンA1のβ鎖N末端の糖化バリン部位だけを測り分けたという報告はこれま
でにはなく、特定のプロテアーゼと特定のケトアミンオキシダーを組み合わせて用いるこ
とによって実質的にヘモグロビンβ鎖N末端の糖化バリン部位に対する特異性を高めた方
法が報告されている。
例えば、特許文献7〜12には、プロテアーゼによりヘモグロビンβ鎖N末端より糖化
バリルヒスチジンを切り出し、これに作用するケトアミンオキシダーゼを用いて測定する
方法が開示されている。また、特許文献11によれば、プロテアーゼの基質特異性の確認
方法として、例えばヘモグロビンのα鎖N末端及びβ鎖N末端5残基の糖化ペプチドを用
いて、β鎖N末端の糖化ペプチド、例えば糖化バリルヒスチジン、糖化バリルヒスチジル
ロイシン、糖化バリルヒスチジルロイシルスレオニンのみが生成され、α鎖N末端由来の
糖化バリルロイシン、糖化バリルロイシルセリン、糖化バリルロイシルセリルプロリンを
生じないプロテアーゼが挙げられる。
またヘモグロビンA1cは、糖化されないものに対する糖化されたものの割合(%)と
して測定されるため、前記ヘモグロビンA1c濃度の測定のみならず、総ヘモグロビンの
測定も必須である。
こうして測定された、総ヘモグロビン濃度、HbA1c濃度の比からヘモグロビンA1
cの割合、すなわちヘモグロビンA1c(%)が計算される。
総ヘモグロビンについては、シアンメトヘモグロビン法等、これまでに種々の測定法が
報告されているのでヘモグロビンA1c濃度の測定とは別個に測定することもできるが、
望ましくは、同一反応槽で測定できることである。
例えば、特許文献12にはヘモグロビンを変性させその色調を変化させるプロテアーゼ
反応促進剤及びこれをプロテアーゼ、ケトアミンオキシダーと組み合わせた同一反応槽で
のHbA1c測定例が記載されている。
【0024】
我々は、本発明を上記特異的なヘモグロビンA1c (以下、HbA1cということが
ある)測定方法と組み合わせることにより実用性にすぐれたHbA1c測定試薬を完成す
るに到った。すなわち、例えば特許文献11記載の特異性の高いプロテアーゼ及びケトア
ミンオキシダーゼを用いて、一方の試薬に過酸化水素と反応しない色素、パーオキシダー
ゼ及びケトアミンオキシダーゼを含有させ、他方に還元剤、ロイコ型色素及びプロテアー
ゼを含有させた2種類の試薬から構成される液状で安定なHbA1c定量用試薬を完成す
るに到った。
【0025】
以下、より好適な例を述べる。HbA1c定量用試薬は、2種類の液状試薬から構成さ
れ、以下の組み合わせ方が挙げられる。
(組み合わせ1)
第一試薬:
プロテアーゼ反応促進剤
1−デオキシフルクトシル−L−バリル−L−ヒスチジンに作用するケトアミンオキシ
ダーゼ
パーオキシダーゼ
トリンダー試薬
過酸化水素と反応しない色素
第二試薬:
HbA1cの糖化β鎖末端から1−デオキシフルクトシル−L−バリル−L−ヒスチジ
ンを切り出すことのできるプロテアーゼ
10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェ
ノチアジンナトリウム
シクロデキストリン類
還元剤
(組み合わせ2)
第一試薬:
プロテアーゼ反応促進剤
HbA1cに作用してHbA1cの糖化β鎖末端から1−デオキシフルクトシル−L−
バリル−L−ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼ
10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェ
ノチアジンナトリウム
カタラーゼ
シクロデキストリン類
還元剤
第二試薬:
フルクトシルアミンオキシダーゼ
パーオキシダーゼ
過酸化水素と反応しない色素
【0026】
本発明のHbA1c定量用試薬は、上記組み合わせのいずれかの組成物を用いることが
でき、第一試薬で総ヘモグロビンを定量し、第二試薬で糖化されたβ鎖N末端から切り出
された1−デオキシフルクトシル−バリン−L−ヒスチジンを定量することにより、総ヘ
モグロビン量に対するヘモグロビンA1cの割合を求め、HbA1cに特異的な液状で安
定な測定試薬を完成させるに到った。
なお、ここで、ロイコ型色素として、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−
3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウムの代わりにN,N,N',N',N'',N''−ヘキサ(3−スルフォプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン・6ナトリウムを用いることも出来る。
【0027】
ここで、プロテアーゼ反応促進剤とは、酢酸基を含む化合物又はその塩、N−アシルタ
ウリン又はその塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩であり
、より具体的には特許文献12に記載されている。好適な例としては、ラウロイルサルコ
シンナトリウム(商品名:サルコシネートLN、日光ケミカル株式会社)、ミリストイル
サルコシンナトリウム(サルコシネートMN)ラウロイルメチルアラニンナトリウム(ア
ラニネート LN−30)などが挙げられる。
【0028】
また、組み合わせ1におけるトリンダー試薬は、第一試薬中に持ち込まれる過酸化物を
消去し、試薬ブランクを軽減させるためのものであり、例えば、N,N−ビス(4−スル
ホブチル)−3−メチルアニリン(TODB)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル
)−3−メトキシアニリン(ADPS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)アニ
リン(ALPS)、MAPS、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メチルア
ニリン(TOPS)、N−(3−スルホプロピル)アニリン(HALPS)、N−エチル
−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン(ADOS)、
ALOS、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチ
ルアニリン(MAOS)、N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(
DAPS)、HDAPS、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−
3,5−ジメトキシアニリン(DAOS)などを用いることができ、その添加濃度として
は、0.05〜1mMである。また、組み合わせ1において、アスコルビン酸の影響を軽
減するためにアスコルビン酸オキシダーゼを添加することもでき、また胆汁酸塩などの界
面活性剤や塩を適宜加えることもできる。
【0029】
また、組み合わせ2において、カタラーゼは、過酸化物を消去し試薬ブランクを軽減さ
せるためのものであり、容易に入手が可能な牛肝臓由来の市販酵素(シグマなど)を用い
ればよく、その好適な濃度は、100〜2000u/mlである。
【0030】
このようにして調製された液状試薬を用い糖化ヘモグロビンA1cの糖化されていない
ヘモグロビンに対する割合を測定するためには、抗凝固剤入り採血管で採取された血液を
遠心分離して血球部分を沈降させ、これを市販の溶血希釈混和装置などを用いて、水
で適宜希釈することにより溶血させたものを検体として用い、測定すればよい。
また、特に、組み合わせ1の場合は、全血を測定する場合に妨害物質の影響を回避でき
て望ましい。すなわち、血漿からの想定される妨害成分として、アスコルビン酸、ビリル
ビン、乳びの他に内在性の糖化ペプチドが挙げられる。従って、血漿成分からのアスコル
ビン酸等の影響を回避するためにアスコルビン酸酸化酵素及びケトアミンオキシダーゼを
第一試薬に加えることにより、内在性の糖化ペプチド、アスコルビン酸を処理することが
でき血漿成分に混入する妨害成分の影響を回避できる。
このように本発明によれば、遠心分離血球だけでなく、全血そのものでの測定も可能で
あり、これにより遠心分離操作が不要な簡便な測定も可能となる。
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明はなんらこれにより限定されるもの
でない。
【実施例】
【0031】
〔実施例1〕 還元剤の効果
ロイコ型色素溶液として0.2mM DA−67を含んだ40mM Tris−HCl
(pH7.1)溶液(以下、DA−67溶液ということがある)に、還元剤としてN−ア
セチルシステイン、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、チオグリセロール、チオ硫
酸ナトリウム、2メルカプトエタノール、ジチオスレイトールを各々1mMおよび10m
Mになるように加え(ジチオスレイトールのみ1mMだけ)37℃にて4日間遮光保存し
た。これらの溶液について調製直後と37℃、4日保存後の660nmの吸光度を測定す
ることにより、保存前後のロイコ型色素溶液そのものの着色度を判定した。
また別に、10u/mlのパーオキシダーゼ(シグマ社製)を含む40mM Tris
−HCl(pH7.1)溶液を調製し、これに50μMの過酸化水素溶液を添加し予め3
7℃に5分加温した後660nmの吸光度を測定し、上記還元剤を添加したDA−67溶
液0.2mlを加え、混合後5分後の吸光度から差し引いた値を発色強度として観測した
。ここで、過酸化水素を添加しないものを試薬ブランクとした。結果を表1に示す。
表1からわかるように、還元剤の添加がない場合のDA−67単独溶液の初期吸光度は
4日後に1934(mAbs)であったのに対して、各還元剤添加系においては発色強度
が小さかった。尚、過酸化水素発色強度の相対%は0日目の還元剤無添加の発色強度を1
00%としたときのものである。
【0032】
【表1】

【0033】
〔実施例2〕 還元剤の効果
ロイコ色素溶液として0.1mM TPM−PS(同仁化学製)を含む40mM PI
PES緩衝液(pH7.0)に各種還元剤を加え、37℃にて半年間、遮光保存した。T
PM−PSによる過酸化水素発色の極大波長付近である600nmの吸光度を測定し、表
2の結果を得た。検討に用いた還元剤のなかで、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム
、チオ硫酸ナトリウムに非特異的な発色を抑制する顕著な効果が認められた。
【0034】
【表2】

【0035】
〔実施例3〕 還元剤の効果
ロイコ型色素溶液として0.2mM DA−67(以下、DA−67溶液ということがあ
る)および2%ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリンを含んだ40mMPIP
ES(pH6.5)溶液に、還元剤としてN−アセチルシステイン、亜硫酸ナトリウム、
二亜硫酸ナトリウム、チオグリセロールを各々1mM、2mM、5mMおよび10mMに
なるように加え37度にて7日間遮光保存した。これらの溶液について調製直後と37℃
、7日保存後の660nmの吸光度を測定することにより、保存前後のロイコ型色素溶液
そのものの着色度を判定した。次に、日立7170S型自動分析装置を用いて、試薬ブラ
ンクと発色強度を調べた。すなわち、10u/mlのパーオキシダーゼ(シグマ社製)、
5u/mlケトアミンオキシダーゼ(カーブラリア・クラベータYH923由来)を含む
40mM Tris−HCl(pH7.5)溶液0.18mlに、50μMの糖化バリル
ヒスチジン(F−VH:ペプチド研究所)0.02mlを加え、37℃に5分加温した後
660nmの吸光度を測定した(A1)。次に上記各濃度の還元剤を含むDA−67溶液
0.045mlを加え、混合後5分後の吸光度A2からA1を差し引いた値を発色強度と
して観測した。ここで、F−VHを添加しないものを試薬ブランクとした。結果を表3に
示す。
表3からわかるように、F−VH を基質とした場合のDA−67溶液の発色強度は、
還元剤を添加したものでは、還元剤の濃度依存的に小さくなる傾向を示した。10mMの
二亜硫酸ナトリウムを除き、いずれの還元剤についてもその濃度が10mMまでは、発色
強度は還元剤無添加のときを100%とした場合に、80%以上であった。また、37℃
4日後の試薬ブランクは還元剤無添加に比べ、いずれの還元剤についてもその濃度依存的
に小さくなることが示された。尚、F−VHの相対%は0日目の還元剤無添加の発色強度
を100%としたときのものである。
【0036】
【表3】

【0037】
〔実施例4〕 還元剤の効果
(第一試薬)
40mM Tris−HCl(pH7.5)
0.2% OP−10FF−0(日光ケミカルズ株式会社)
0.04mM DA−67
1mM 塩化カルシウム
400u/ml カタラーゼ
2% ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン
各種還元剤
(第二試薬)
40mM Tris−HCl(pH7.5)
30u/ml FOD(ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオ
キシダーゼ)
90u/ml パーオキシダーゼ
日立7170S型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。

(DA−67溶液の着色度測定)
検体に蒸留水を用いて、検体/第一試薬:2μl/200μlで混合。測光ポイントは
8ポイント目の1ポイント測定。主波長660nm。

(糖化バリルヒスチジンの感度(発色強度)測定(F−VHの定量))
検体/第一試薬/第二試薬:20μl/180μl/45μl。測光ポイントは16、
34ポイントの2ポイント。主波長660nm、副波長800nm。

(操作)
DA−67を含む第一試薬に各種還元剤を加え、茶褐色のガラス容器に入れ、37℃で
保存する。第一試薬に還元剤としてそれぞれチオグリセロール(2mM)、N−アセチル
システイン(2mM)、チオ硫酸ナトリウム(5mM)を添加した。還元剤添加後3日目
、7日目にサンプリングし、着色度、試薬ブランク、糖化バリルヒスチジン(F−VH
)の感度(発色強度)を測定した。
表4に示したように、第一試薬の着色度は、還元剤非添加のものに比べて、還元剤を添
加したものが、チオ硫酸ナトリウム、チオグリセロール、N−アセチルシステインの順に
低くなった。一方、試薬ブランクについても還元剤の添加効果が認められ、チオ硫酸ナト
リウムにその効果が最も大きかった。還元剤添加時の、糖化バリルヒスチジンの発色強度
は、還元剤非添加のそれを100%とした場合、75〜89%を示した。
【0038】
【表4】

【0039】
〔実施例5〕 還元剤の組み合わせの効果
(第一試薬)
40mM Tris−HCl(pH7.5)
0.02mM DA−67
1mM 塩化カルシウム
800u/ml カタラーゼ
4% ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン
還元剤
(第二試薬)
40mM Tris−HCl(pH7.5)
30u/ml FOD(ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオ
キシダーゼ)
90u/ml パーオキシダーゼ

実施例4で、DA−67含有試薬の着色度抑制効果の大きかったN−アセチルシステイ
ンと、試薬ブランク抑制効果の高いチオ硫酸ナトリウムの組み合わせ効果を確認した。還
元剤は第一試薬に含まれる。
日立7170S型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。

(DA−67溶液の着色度測定)
検体に蒸留水を用いて、検体/第一試薬:2μl/200μl、測光ポイントは8ポイ
ント目の1ポイント測定。主波長660nm。

(糖化バリルヒスチジンの定量)
検体/第一試薬/第二試薬:20μl/180μl/45μl。測光ポイントは16、
34ポイントの2ポイント。主波長660nm、副波長800nm。

(操作)
DA−67を含む第一試薬に還元剤としてN−アセチルシステインとチオ硫酸ナトリウ
ムの濃度をそれぞれ0.5〜2mM、3〜9mMになるように組み合わせて加え、茶褐色
のガラス容器に入れ、37℃で保存する。調製初日、7日目にサンプリングし、着色度、
試薬ブランク、糖化VHの感度を測定した。表5に示したように、還元剤無添加の反応液
に比べて、N−アセチルシステインとチオ硫酸ナトリウムの組み合わせは、いずれの系列
においても顕著な効果を示した。最適な濃度は、N−アセチルシステインが1.5または
2mMでチオ硫酸ナトリウムが5mMの時であった。
【0040】
【表5】

【0041】
〔実施例6〕 還元剤以外の他の安定化剤との組み合わせの効果
(第一試薬)
40mM Tris−HCl(pH7.5)
0.02mM DA−67
1mM 塩化カルシウム
1% MMT(日光ケミカル株式会社)
800u/ml カタラーゼ
10% エチレングリコール
5ku/ml ニュートラルプロテアーゼ(バチラス・エスピー由来:東洋紡社製)
還元剤、ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン
(第二試薬)
40mM Tris−HCl(pH7.5)
30u/ml FOD(ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオ
キシダーゼ)
90u/ml パーオキシダーゼ

還元剤としてN−アセチルシステインと、チオ硫酸ナトリウムを用い、更にヒドロキシ
プロピル−β−サイクロデキストリンを組み合わせて用いた。還元剤およびヒドロキシプ
ロピル−β−サイクロデキストリンは第一試薬に含まれる。日立7170S型自動分析装
置を用い、以下のパラメータで測定した。

(DA−67溶液の着色度測定)
検体に蒸留水を用いて、検体/第一試薬:2μl/200μl、測光ポイントは8ポイン
ト目の1ポイント測定。主波長660nm。

(糖化−バリルヒスチジンの定量)
検体/第一試薬/第二試薬:20μl/180μl/45μl 測光ポイントは16、3
4ポイントの2ポイント。主波長660nm、副波長800nm。

(ヘモグロビンβ鎖N末端糖化ペンタペプチドの定量)
ヘモグロビンβ鎖N末端のアミノ酸配列を参考に、5アミノ酸からなる1−デオキシフル
クトシル−L−バリル−L−ヒスチジル−L−ロイシル−L−トレオニル−L−プロリン
(以下、ヘモグロビンβ鎖N末端糖化ペンタペプチド(糖化VHLTP)ともいう)を合
成し、これを基質として用いた。

(操作)
DA−67を含み、N−アセチルシステインとチオ硫酸ナトリウムの濃度が2mM、5
mMを含む第一試薬に、ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン濃度が2〜5%
になるように加え、茶褐色のガラス容器に入れ、37℃で保存する。調製初日、3日目、
7日目にサンプリングし、着色度、試薬ブランク、糖化VH、糖化VHLTPの感度を測
定した。表6に示したように、還元剤無添加の反応液に比べて、還元剤としてN−アセチ
ルシステインとチオ硫酸ナトリウムを用いたものは対照に比べて試薬の着色が殆ど認めら
れなかった。また、還元剤と組み合わせれば、ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキス
トリンの量は2%以上であれば充分であった。
【0042】
【表6】

【0043】
〔実施例7〕 亜硫酸ナトリウム量の検討
(第一試薬)
40mM Tris−HCl (pH7.5)
500mM NaCl
1.0mM CaCl2
0.05% NaN3
0.1mM ADPS
3.0% アラニネートLN−30(日光ケミカル株式会社)
10u/mL パーオキシダーゼ
15u/mL FOD(ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオ
キシダーゼ
(第二試薬)
100mM HEPES(8.0)
2.0% ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン( HP−β−CD)
0.05% NaN3
10mM Cholic acid
0〜3.0mM 亜硫酸 Na
0.10mM DA−67
12ku/mL サーモリシン(Bacillus stearothermophi
lus由来:大和化成)

日立7170S型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。
測定モードとして、「2ポイント」を選択し、第二試薬添加後のHbA1c濃度または糖
化VHLTP濃度を測定した。測光ポイントは16、34ポイントの2ポイント。主波長
660nm、副波長800nm。

(第二試薬の着色度の測定)
検体に蒸留水を用いて、検体/第二試薬:20μl/200μl、測光ポイントは8ポイ
ント目の1ポイント測定とした。主波長660nm。(ヘモグロビンコントロールの定量

亜硫酸ナトリウムを3mMまで変化させた第二試薬を用いて、市販のヘモグロビンコン
トロールL(4.8%)、ヘモグロビンコントロールH(10.5%)、および50μM
の糖化VHLTPをサンプルに用い、着色度、試薬ブランク、HbA1cまたは糖化VH
LTPの感度を試薬調製初日、冷蔵および37℃で10日間まで保存したものを、測定し
た吸光度変化量を表7に示した。亜硫酸ナトリウム濃度依存的に、DA−67の安定化が
図れた。一方、感度も亜硫酸ナトリウム濃度依存的に低下したが、亜硫酸3mMのときの
感度低下率は約25%と実用上問題はなかった。
【0044】
【表7】

〔実施例8〕 長期保存における還元剤の効果
(第一試薬)
実施例7に同じ
(第二試薬)
100mM HEPES(8.0)
2.0% ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン( HP−β−CD)
0.05% NaN3
10mM Cholic acid
無添加 または 2mM 亜硫酸Na
0.10mM DA−67
12ku/mL サーモリシン(Bacillus stearothermophil
us由来:大和化成)
日立7170S型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。
測定モードとして、「3ポイント」を選択し、第一反応で総Hb濃度を、第二反応でHb
A1c濃度を測定する。測定結果は、吸光度で表した。

(総Hb濃度、HbA1c濃度の測定)
検体に市販のヘモグロビンコントロールを用い、検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞ
れ18μl/180μl/36μLとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントは、14
ポイント、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用いた。主波長は6
60nm、副波長は800nm。

(第二試薬の着色度の測定)
第二試薬の着色度の測定は、主波長660nmで、検体に蒸留水を用いて、検体/第二試
薬:20μl/200μl、測光ポイントは8ポイント目の1ポイント測定とした。
DA−67を含む第二試薬に、亜硫酸ナトリウムを2mM加えたものと加えないものを
調製し、遮光ボトルに入れ、冷蔵(5℃)にて6ヶ月保存した。
市販のヘモグロビンコントロールL(4.8%)、ヘモグロビンコントロールH(10
.5%)をサンプルとして用い、試薬ブランク、感度を2mM亜硫酸ナトリウムを含む試
薬の調製初日の測定値を対照に、測定した。Hb濃度に対応する14ポイントの測定値、
HbA1c濃度に対応する16、34ポイントの測定値を用いた吸光度変化量の結果を表
8に示した。総Hb測定値については、亜硫酸ナトリウムの有無に関わらず、6ヵ月後の
感度低下は認められなかった。
一方、試薬ブランクについて、2mM亜硫酸ナトリウムでは、総ヘモグロビン、HbA
1c(HbA1cの場合の試薬ブランクは調製直後で9.7mAbs、冷蔵半年後で8.
8mAbs)ともに6ヶ月間の変化は殆どなかった。
一方、亜硫酸ナトリウム非添加の試薬は、HbA1cについて50.6mAbsと調製
時の2倍以上に上昇していた。更に、コントロール測定結果において、試薬ブランクを差
し引いた値も若干低めになっていた。このことから、DA−67含有試薬の長期保存にも
亜硫酸ナトリウムの効果が顕著に表れていることが確認できた。尚、試薬自体の着色度は
、亜硫酸ナトリウム添加の場合、肉眼的には全く変化なかった。
【0045】
【表8】

【0046】
〔参考例〕 特許文献12記載のプロテアーゼ反応促進剤による総ヘモグロビンの定量
(反応液)
40mM PIPES−NaOH (pH6.0)
6% アラニネートLN−30
4.5u/ml パーオキシダーゼ
2mM 塩化カルシウム
1mM TODB(N,N−ビス(4−スルホブチル)−3−メチルアニリン
:同仁化学)

市販のHbA1cコントロール試料およびヒトヘモグロビン(シグマ製)を用いて、ヘ
モグロビン濃度0〜60 mg/mlの範囲になるようにヘモグロビン試料を調製した。
ラウリル硫酸ナトリウム法を原理とする市販ヘモグロビン測定用試薬「ヘモグロビンB−
テストワコー」にて、ヘモグロビンを測定し、濃度を算出した。次に、上記反応液1.8
mlを37℃にて予備加温後、同一のヘモグロビン試料を0.2ml添加し混和した。5
分後の660nmにおける吸光度を読み取った。試料の代わりに蒸留水を用いたものを試
薬ブランクとし、各々の試料につきこれを差し引き、表9に示した。これをプロットした
図1より明らかなように、ヘモグロビン濃度に対して、本反応液を用いた吸光度差は総ヘ
モグロビン約20mg/mlまで直線関係であった。
【0047】
【表9】

【0048】
〔実施例9〕 総ヘモグロビン、糖化へモグロビンA1cの測定(還元剤有無)
(第一試薬)
40mM Tris−HCl (pH7.5)
0.02mM DA−67
2% HP−β−CD
1 % MMT (日光ケミカル株式会社製 )
0.5mM CaCl2
10% エチレングリコール
5ku/ml ニュートラルプロテイネース(東洋紡製)
800u/ml カタラーゼ
10mM デオキシコール酸ナトリウム(和光純薬製)
(第二試薬)
40mM Tris−HCl (pH7.5)
90u/ml パーオキシダーゼ
0.05 % NaN3
31u/ml FOD ((ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミ
ンオキシダーゼ)

日立7170S型自動分析装置を用い、以下のように測定した。
[H7170 パラメータ]
測定モードとして、「3ポイント」を選択し、第一反応で総Hb濃度を、第二反応でHb
A1c濃度を測定する。測定結果は、吸光度で表した。

(総Hb濃度、HbA1c濃度の測定)
検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ20μl/180μl/45μLとし、総ヘモ
グロビンの測定の測光ポイントは、14ポイント、HbA1cの測光ポイントとしては1
6、34ポイントを用いた。主波長は660nm、副波長は800nm。
試料として、市販HbA1cコントロール(凍結乾燥品および凍結品)を用いて、ヘモ
グロビン濃度がおおよそ0.8〜5mg/mlになるように溶解したものを用いた。第一
試薬に還元剤(1mM N−アセチルシステイン、5mMチオ硫酸ナトリウム)を添加し
たもの、添加しないものそれぞれについて測定を行った。
測定モードとして、「3ポイント」を選択し、第一反応で総Hb濃度を、第二試薬添加
後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ2
0μl/180μl/45μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、14
ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用いた。また、総
ヘモグロビン、HbA1c濃度ともに、主波長660nm、副波長800nmにて測光し
た。濃度への換算は、HbA1cの場合、既知濃度に調製した糖化β−ペンタペプチド(
ペプチド研究所製)より、また総ヘモグロビンは、市販HbA1cコントロールL(BM
L社)の表示値より計算した。
表10および図2、図3より明らかなように、還元剤有無によるHbA1c量、総ヘモ
グロビン量の相関係数はいずれもr=0.99以上と良好であり還元剤を添加しても測定
への影響は認められなかった。
【0049】
【表10】

【0050】
〔実施例10〕 HbA1cの測定 (免疫法との比較)
(第一試薬)
40mM Tris−HCl (pH7.5)
0.02mM DA−67
2% HP−β−CD
1 % MMT (日光ケミカル株式会社製 )
0.5mM CaCl2
10% エチレングリコール
5ku/ml ニュートラルプロテイネース(東洋紡製)
800u/ml カタラーゼ
10mM デオキシコール酸ナトリウム(和光純薬製)
1mM N−アセチルシステイン
5mM チオ硫酸ナトリウム
(第二試薬)
40mM Tris−HCl (pH7.5)
90u/ml パーオキシダーゼ
0.05 % NaN3
31u/ml FOD (ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミン
オキシダーゼ)
日立7170S型自動分析装置を用い、以下のように測定した。

(免疫法)
「デタミナーHbA1c」(協和メデックス株式会社)を用い、添付文書に従い測定した
。検体は血球を所定のHbA1c測定用検体希釈液にて、101倍希釈して測定に用いた


(本発明法)
第一試薬にDA−67と還元剤(N−アセチルシステインおよびチオ硫酸ナトリウム)
とプロテアーゼを、第二試薬にケトアミンオキシダーゼとパーオキシダーゼを含む組成の
試薬を用いた。
測定モードとして、「3ポイント」を選択し、第一反応で総Hb濃度を、第二試薬添加
後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ2
0μl/180μl/45μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、14
ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用いた。また、総
ヘモグロビン、HbA1c濃度ともに、主波長660nm、副波長800nmにて測光し
た。検体は血球を蒸留水で71倍希釈したものを用いた。
濃度への換算は、総ヘモグロビンは、市販HbA1cコントロール(BML社)の表示
値(単位:mg/ml)より、またHbA1c濃度は既知濃度に調製した糖化バリルヒス
チジン(ペプチド研究所製)水溶液の吸光度より求め、HbA1c(%)はHbA1c濃
度を総ヘモグロビン濃度で割ることにより求めた。なお、ヘモグロビン濃度(M)はヘモ
グロビンの分子量を64550として算出した。

(結果)
図4に示したように、22種類の検体を用いた時の相関式 y=1.055x−0.3
917,R2=0.9798と良好であった。
【0051】
〔実施例11〕ヘモグロビンβ鎖N末端配列と同一の糖化ペンタペプチド(1−デオキシ
フルクトシル−L−バリル−L−ヒスチジル−L−ロイシル−L−スレオニル−L−プロ
リン)測定時の色素添加効果)
(第一試薬)
40mM PIPES (pH7.0)
10u/ml POD
0.1mM ADOS(同人化学)
15u/ml FOD (ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミン
オキシダー由来)
(第二試薬)
100mM Tris−HCl (pH7.5)
0.12mM DA−67
2mM 亜硫酸ナトリウム
3ku/ml ニュートラルプロテイネース(東洋紡製)

以下の二種類の製造メーカーの異なる自動分析装置を用いた。
(a)日立自動分析装置7170型
検体/第一試薬/第二試薬:20μl/180μl/45μl 測光ポイントは16、3
4ポイントの2ポイント。主波長660nm、副波長800nm。
(b)日本電子BM12自動分析装置
検体/第一試薬/第二試薬:8μl/72μl/18μl 測光ポイントは44−47、
95−98の2ポイントエンド。主波長658nm、副波長805nm。

上記試薬を用いて、それぞれの自動分析装置で試薬ブランクを20回連続測定し、平均
吸光度、標準偏差(SD)を算出した。次に、50μMヘモグロビンβ鎖N末端配列から
なる糖化ペンタペプチドを測定し、試薬ブランク(20回の平均値)を差し引いた吸光度
を算出した。表11に示したように日本電子BM12の試薬ブランクの平均値58.8m
Absは、日立7170Sの試薬ブランク17.6mAbsの3倍以上の値を示した。一
方、50μM糖化ペンタペプチドの試薬ブランクを差し引いた吸光度はほぼ同じ値を示し
た。また、試薬ブランク値が大きい日本電子装置でより、大きな標準偏差を示し、測定精
度が劣ることが示された。そこで、この反応液の第一試薬に本発明の黄色4号(三栄源エ
フエフアイ)を0.3mMになるように加え、同様の操作を行った。日本電子BM12に
おける試薬ブランクが58.8mAbsから18.8mAbsと劇的に低下し、その標準
偏差も小さくなった。一方、日立7170の場合の試薬ブランクも17.6から13.8
mAbsに低下し、標準偏差も小さくなった。以上より、黄色4号を添加することにより
、添加しない場合に認められた装置間差が解消された。
【0052】
【表11】

【0053】
〔実施例12〕 色素添加の効果
(第一試薬)
40mM Tris−HCl (pH7.5)
500mM NaCl
0.05% NaN3
0.1mM ALPS(同仁化学製)
3.0% アラニネート LN−30(日光ケミカル株式会社)
10u/mL パーオキシダーゼ
10mM コール酸(和光純薬株式会社)
15u/mL FOD(ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオ
キシダーゼ)
各種色素
(第二試薬)
100mM HEPES(8.0)
2.0% ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン( HP−β−CD)
0.05% NaN3
10mM Cholic acid
2mM 亜硫酸ナトリウム
0.12mM DA−67
12Ku/mL サーモリシン(Bacillus stearothermophil
us由来:大和化成)

日本電子BM1650自動分析装置を用いた。
パラメータは、以下のように設定した。
分析方式に「EPA」を選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Hb濃度を、第二試薬添
加後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ
12μl/120μl/24μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、3
8−41ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては44−47、95−98ポイン
トを用いた。測定主波長は658nm、測定副波長は805nm。
また、計算方式にはABSを選び、吸光度値として出力させた。

(操作)
上記組成よりなる第一試薬に、食用赤色2号、赤色102号、黄色4号(三栄源エフエ
フアイ)をそれぞれ0.025mM、0.15mM、0.25mM添加したものを調製し
た。対照に色素を添加しないものをおいて、これら4種類の第一試薬に対して、それぞれ
蒸留水、および市販HbA1cコントロール(HbA1c%が10%。Hb濃度が2mg
/mlになるように溶解)を検体として20回測定した。蒸留水については吸光度を測定
しこれを試薬ブランクとした。また、HbA1cコントロールについては、蒸留水の値を
差し引いた差し引き吸光度を 総ヘモグロビン、HbA1c測定パラメータそれぞれに対
して吸光度値として出力させた。吸光度の最大値、最小値、差平均値、標準偏差、CV%
を算出し、結果を表12に示した。
表12に示したように、総ヘモグロビンの測定値には色素添加の影響はなかった。一方
、HbA1cの測定値については、色素無添加の試薬ブランクが26.4mAbsである
のに対して、色素を添加したものはいずれも12−15mAbsの値と小さく、しかも標
準偏差、CV%ともに、色素無添加のものに比べて小さく、測定精度が向上したことが示
された。また、HbA1cコントロールについて、試薬ブランクを差し引いた吸光度は色
素無添加の約7−8割程度に低下していたが、標準偏差、CV%ともに、色素無添加のも
のに比べて小さかった。
【0054】
【表12】

【0055】
〔実施例13〕
(第一試薬)
40mM Tris−HCl (pH7.5)
500mM NaCl
0.05% NaN3
0.1mM ALPS(同仁化学製)
3.0% アラニネート LN−30(日光ケミカル株式会社)
10u/mL パーオキシダーゼ
10mM コール酸(和光純薬株式会社)
15u/mL FOD(ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオ
キシダーゼ)
各種色素
(第二試薬)
100mM HEPES(8.0)
2.0% ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン( HP−β−CD)
0.05% NaN3
10mM Cholic acid
2mM 亜硫酸 ナトリウム
0.12mM DA−67
12ku/mL サーモリシン(Bacillus stearothermophil
us由来:大和化成)

日本電子BM12自動分析装置を用い、パラメータは実施例12と同様の設定で実施し
た。
第一試薬に、食用赤色40号、黄色4号、およびオレンジGをそれぞれ0.05mM、
0.4mM、1.25mM添加したものを調製した。対照に色素を添加しないものをおい
て、これら4種類の第一試薬に対して、市販超低値HbA1cコントロール(HbA1c
%が1.5%でHb濃度が2mg/ml)を検体として20回測定した。蒸留水を検体の
変わりに測定しこれを試薬ブランクとした。また、HbA1cコントロールについては、
蒸留水の値を差し引いた差し引き吸光度をHbA1c測定パラメータに対して出力させた
。吸光度の最大値、最小値、差平均値、標準偏差、CV%を算出し、結果を表13に示し
た。
HbA1cの測定値について、試薬ブランクは色素無添加の40.5mAbsであるの
に対して、色素を添加したものはいずれも10〜13mAbsの値と小さく、しかも標準
偏差、CV%ともに、色素無添加のものに比べて小さかった。また、超低値HbA1cコ
ントロールについて、試薬ブランクとの差は色素無添加のものは試薬ブランクよりも小さ
くマイナス値となり、標準偏差が0.335であるのに対し、色素添加のものは、試薬ブ
ランクとの吸光度差は試薬ブランクよりも僅かに大きく、標準偏差も小さくなり、測定の
ばらつきが改善されたことが示された。
【0056】
【表13】

【0057】
〔実施例14〕 免疫法との比較(色素添加効果の確認)
(第一試薬)
40mM BES (pH7.2)
0.05% NaN3
0.1 mM ALPS(同仁化学製)
3.0% アラニネート LN−30(日光ケミカル株式会社)
10u/mL パーオキシダーゼ
10mM コール酸(和光純薬株式会社)
15u/mL FOD(ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオ
キシダーゼ)
黄色4号
(第二試薬)
100mM HEPES(8.0)
2.0% ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン(HP−β−CD)
0.05% NaN3
10mM Cholic acid
2mM 亜硫酸ナトリウム
0.12mM DA−67
15ku/mL プロテアーゼ(リゾバクター・エンザイモゲネス YK−366由来)

日立7170S型自動分析装置を用い、フッ化ナトリウム採血管により採取された血液
検体を用い以下のように測定した。

(免疫法)
「デタミナーHbA1c」(協和メデックス株式会社)を用い、添付文書に従い測定した
。検体は血球を所定のHbA1c測定用検体希釈液にて、101倍希釈して測定に用いた


(本発明法)
第一試薬にケトアミンオキシダーゼとパーオキシダーゼを、第二試薬(遮光ボトル容器
を使用)にDA−67と還元剤(亜硫酸ナトリウム)とプロテアーゼを含む組成の試薬を
用いた。試薬ブランクを低下させ、測定精度を保つための色素として、黄色4号を第一試
薬に加えたもの、および加えないものを比較した。
測定モードとして、「3ポイント」を選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Hb濃度
を、第二試薬添加後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬
の量はそれぞれ20μl/180μl/45μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイ
ントとして、14ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを
用いた。また、総ヘモグロビン、HbA1c濃度ともに、主波長660nm、副波長80
0nmにて測光した。検体は遠心分離(1500Gx5分)後の血球を蒸留水で71倍希
釈したものを用いた。
検量は、HbA1c測定用標準物質JCCLS CRM−004a(HECTEF S
RC)を用い、総ヘモグロビン濃度はシアンメト法により、HbA1c濃度はCRM−0
04aのHbA1c(%)表示値と前記ヘモグロビン濃度を用いて計算し、自社キャリブ
レーターに値をトランスファーし、これを用いて計算した。

(結果)
表14に示したように、色素添加により、HbA1cのシグナルは無添加に比べて2〜
3割低下するが、試薬ブランクは、11.5mAbsと約半分に低下する。
20種類の検体を用いた時の免疫法(X)と酵素法(Y)との相関式は 黄色4号無添
加の場合は、y=0.9997x−0.138、R2=0.955、また添加の場合は、
y=0.9927x+0.0246、R2=0.9884であった(図5、6)。免疫法
との相関係数は、本発明の黄色4号添加の方が高いことから、色素添加によりHbA1c
(%)がより正確に測定できることが示された。
【0058】
【表14】

【0059】
〔実施例15〕 液状試薬の安定性過酷試験
(第一試薬)
30mM PIPES−NaOH (pH7.0)
500 mM NaCl
0.05% NaN3
0.1 mM ALPS(同仁化学製)
3.0% アラニネート LN−30(日光ケミカル株式会社)
10u/mL パーオキシダーゼ
10mM コール酸(和光純薬株式会社)
15u/mL FOD(ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミン
オキシダーゼ)
0.6mM 黄色4号(三栄源エフエフアイ)
(第二試薬)
100mM HEPES(8.0)
2.0% ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン(HP−β−CD)
0.05% NaN3
10mM Cholic acid
2mM 亜硫酸 ナトリウム
0.12mM DA−67
12ku/mL サーモリシン(Bacillus stearothermophi
lus由来:大和化成)

測定には、日立7170S型自動分析装置を用い以下のパラメータで測定した。
測定モードとして、「3ポイント」を選択し、第一反応で総Hb濃度を、第二試薬添加後
の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ18
μl/180μl/36μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、14ポ
イントを、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用いた。
測定結果は、吸光度で表した。

(ヘモグロビンコントロールおよびプール検体の感度の変動)
上記反応液(第二試薬は遮光ボトル容器中に保存)を用い、市販のヘモグロビンコント
ロール(VL(3.5%)、L(4.8%)、H(10.5%)、VH(16.8%)お
よびプール検体をサンプルに用い、総ヘモグロビンおよびHbA1cの感度を吸光度とし
て測定した。第一試薬、第二試薬ともに冷蔵または37℃に2週間保存後、37℃に保存
した第一試薬には冷蔵保存した第二試薬(表中、R-2を過酷)を、また37℃に保存し
た第二試薬に対しては冷蔵保存した第一試薬(表中、R-1を過酷)を、また対象には両試
薬ともに冷蔵保存したもの(表中、冷蔵)を用いた。
表15より、総ヘモグロビンのシグナルは99%以上、HbA1cのシグナルも94%
以上残存していた。表15のなかで括弧内の数字はサンプル中のヘモグロビン濃度(mg
/ml)である。また、試薬ブランクについても、ロイコ型色素DA−67を含む第二試
薬を37℃2週間処理した後においても上昇は認められなかった。
【0060】
【表15】

【0061】
〔実施例16〕 液状試薬の安定性
(第一試薬)
30mM PIPES−NaOH (pH7.0)
500mM NaCl
0.05% NaN3
0.5mM 塩化カルシウム
0.1mM ALPS(同仁化学製)
3.0% アラニネート LN−30(日光ケミカル株式会社)
10u/mL パーオキシダーゼ
10mM コール酸(和光純薬株式会社)
15u/mL FOD(ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオ
キシダーゼ)
0.6mM 黄色4号
(第二試薬)
100mM HEPES(8.0)
2.0% ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン( HP−β−CD)
0.05% NaN3
10mM Cholic acid
2mM 亜硫酸ナトリウム
0.12mM DA−67
12Ku/mL サーモリシン(Bacillus stearothermophil
us由来:大和化成)

測定には、日立7170S型自動分析装置を用い以下のパラメータで測定した。
測定モードとして、「3ポイント」を選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Hb濃度を
、第二試薬添加後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の
量はそれぞれ18μl/180μl/36μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイン
トとして、14ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用
いた。

(ヘモグロビンコントロールおよびプール検体の感度の変動)
上記反応液(第二試薬は遮光ボトル容器中に保存)を用い、市販のヘモグロビンコント
ロール(VL(3.5%)、L(4.8%)、H(10.5%)、VH(16.8%)お
よびプール検体をサンプルに用い、総ヘモグロビンおよびHbA1cの感度を測定した。
第一試薬、第二試薬を調製直後、そして冷蔵状態で6ヶ月保存した後の2回測定した。検
量はHbA1c測定用標準物質JCCLS CRM−004a(HECTEF SRC)
を用い、総ヘモグロビン濃度はシアンメト法により、HbA1c濃度はCRM−004a
のHbA1c(%)表示値と前記ヘモグロビン濃度を用いて計算し、自社キャリブレータ
ーに値をトランスファーし、これを用いて計算した。
表16より明らかなように、6ヶ月保存後の値は、総ヘモグロビン濃度、HbA1c濃
度、HbA1c(%)ともに、調製直後の値と同等であった。また、試薬ブランクも上昇
していなかった。
【0062】
【表16】

【0063】
〔実施例17〕 全血を用いた測定
(第一試薬)
30mM PIPES−NaOH (pH7.0)
500mM NaCl
0.05% NaN3
0.5mM 塩化カルシウム
0.1mM ALPS(同仁化学製)
3.0% アラニネート LN−30(日光ケミカル株式会社)
10u/mL パーオキシダーゼ
10mM コール酸(和光純薬株式会社)
15u/mL FOD(ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ474由来ケトアミン
オキシダーゼ)
0.6mM 黄色4号
10u/ml アスコルビン酸オキシダーゼ(ASOB:ロシュ)
(第二試薬)
100 mM POPSO(8.0)
2.0% ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン( HP−β−CD

0.05% NaN3
10mM Cholic acid
2mM 亜硫酸ナトリウム
0.12mM DA−67
12ku/mL サーモリシン(Bacillus stearothermophi
lus由来:大和化成)
日本電子の自動分析装置BM9020を用いた。

(免疫法)
「デタミナーHbA1c」(協和メデックス株式会社)を用い、添付文書に従い測定した
。遠心分離後の血球を用いた検体の希釈は、BM9020装置の希釈機構を用い、蒸留水
にて、101倍希釈して測定に用いた。

(本法)
分析方式に「EPA」を選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Hb濃度を、第二試薬
添加後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞ
れ12μl/120μl/24μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、
26−28ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては29−32、62−65ポイ
ントを用いた。測定主波長は、Hbは596nmを、HbA1cは658nmを用い、測
定副波長は805nmとした。
上記反応液(第二試薬は遮光ボトル容器中に保存)を用い、血糖用採血管で採血した検
体を用いた。検体は測定前に転倒混和した後装置にセットし、装置の希釈機構により蒸留
水にて34倍に希釈した。検量はHbA1c測定用標準物質JCCLS CRM−004
a(HECTEF SRC)を用い、総ヘモグロビン濃度はシアンメト法により、HbA
1c濃度はCRM−004aのHbA1c(%)表示値と前記ヘモグロビン濃度を用いて
計算し、自社キャリブレーターに値をトランスファーし、これを用いて計算した。
表17、図7より明らかなように、免疫法(血球を使用)と酵素法(全血を使用)の相
関係数はy=0.9924x+0.1145、R2=0.98と大変良好であった。この
ことにより、遠心分離後の血球のみならず、遠心分離前の全血での状態でも測定が可能で
あることが示された。
【0064】
【表17】

【産業上の利用可能性】
【0065】
本発明によれば、ロイコ型色素の溶液中での安定化方法及び発色反応時の非特異的発色
の軽減方法、及び前記方法を用いた糖化蛋白質分析試薬組成物を提供することができ、糖
化蛋白質の正確な測定が可能となる。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の1)〜5)を含み、5)は1)と一の試薬であり、2)と3)は一の試薬であることを特徴とする過酸化水素を定量するための試薬。
1)ロイコ型色素
2)極大吸収波長が400nm〜550nmの範囲であって、かつ過酸化水素とは反
応しないロイコ型色素と別の色素
3)パーオキシダーゼ
4)シクロデキストリン類
5)還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の
還元剤
【請求項2】
極大吸収波長が400nm〜550nmの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しな
いロイコ型色素と別の色素が、オレンジG、オレンジII、食用赤色2号、食用赤色3号
、食用赤色40号、食用赤色102号、食用赤色104号、食用赤色106号、食用黄色
4号、食用黄色5号より選ばれた1種以上である請求項1に記載の試薬。
【請求項3】
ロイコ型色素が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメ
チルアミノ)フェノチアジンナトリウム又はN,N,N',N',N'',N''−ヘキサ(3
−スルフォプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン6ナトリウムで
ある請求項1または2に記載の試薬。
【請求項4】
請求項1〜3のいずれかに記載の過酸化水素を定量するための試薬を用いた液状で安定な糖化蛋白質測定用試薬。
【請求項5】
ロイコ型色素として10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジ
メチルアミノ)フェノチアジンナトリウム又はN,N,N',N',N'',N''−ヘキサ(
3−スルフォプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン6ナトリウム
、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤
、シクロデキストリン類及び糖化蛋白質に作用するプロテアーゼを含む一の試薬、パーオキシダーゼ、極大吸収波長が400nm〜550nmの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素及びケトアミンオキシダーゼを含む一の試薬を組み合わせてなる糖化蛋白質測定用試薬。
【請求項6】
糖化蛋白質がヘモグロビンA1cであり、総ヘモグロビンを定量する第一試薬、ヘモグロビンA1cを定量する第二試薬を含み、総ヘモグロビン量に対するヘモグロビンA1c量の割合を求める請求項4に記載の糖化蛋白質測定用試薬であって、
第一試薬が、プロテアーゼ反応促進剤、1−デオキシフルクトシル−L−バリル−L−ヒスチジンに作用するケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、トリンダー試薬、アスコルビン酸酸化酵素及び極大吸収波長が400nm〜550nmの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素を含み、
第二試薬が、ヘモグロビンA1cの糖化β鎖末端から1−デオキシフルクトシル−L−バリル−L−ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼ、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム、シクロデキストリン類及び還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤を含む、
糖化蛋白質測定用試薬。
【請求項7】
プロテアーゼ反応促進剤、ヘモグロビンA1cに作用してヘモグロビンA1cの糖化β
鎖末端から1−デオキシフルクトシル−L−バリル−L−ヒスチジンを切り出すことので
きるプロテアーゼ、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメ
チルアミノ)フェノチアジンナトリウム、カタラーゼ、シクロデキストリン類及び還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤を含む第一試薬、ケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ及び極大吸収波長が400nm〜550nmの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素を含む第二試薬とからなる請求項6に記載の糖化蛋白質測定用試薬。
【請求項8】
プロテアーゼ反応促進剤が、N−アシルアミノ酸(塩)またはN−アシルタウリン(塩
)から選ばれた陰イオン界面活性剤であり、ケトアミンオキシダーゼがネオコスモスポラ
属またはカーブラリア属由来であり、極大吸収波長が400nm〜550nmの範囲であ
って、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素が黄色4号又は赤40号又
は赤102号であり、ヘモグロビンA1cに作用してヘモグロビンA1cの糖化β鎖末端
から1−デオキシフルクトシル−L−バリル−L−ヒスチジンを切り出すことのできるプ
ロテアーゼがバチルス属又はリゾバクター属由来であり、シクロデキストリン類が2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンであり、トリンダー試薬がALPS又はAD
PSであり、還元剤が亜硫酸ナトリウムであり、血球を水により溶血させ、これを検体と
して用いることを特徴とする請求項6または7に記載の糖化蛋白質測定用試薬。
【請求項9】
全血中の糖化蛋白質を測定するための測定試薬であって、さらに、第一試薬にケトアミ
ンオキシダーゼを含む請求項6〜8のいずれかに記載の糖化蛋白質測定用試薬。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【公開番号】特開2011−120599(P2011−120599A)
【公開日】平成23年6月23日(2011.6.23)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−14758(P2011−14758)
【出願日】平成23年1月27日(2011.1.27)
【分割の表示】特願2007−41551(P2007−41551)の分割
【原出願日】平成19年2月22日(2007.2.22)
【出願人】(303046299)旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Fターム(参考)】