ロイコ色素の安定化方法
【課題】 ロイコ色素の長期における自己発色抑制を行うための安定化方法および安定化剤を提供する。
【解決手段】 ロイコ色素をアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体からなる群より選ばれる一種以上の酸化防止剤と共存させることを特徴とするロイコ色素安定化方法。
【解決手段】 ロイコ色素をアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体からなる群より選ばれる一種以上の酸化防止剤と共存させることを特徴とするロイコ色素安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロイコ色素の安定化方法に関する。更に詳しくは、ロイコ色素を用いた分析試薬組成物におけるロイコ色素の安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野では、酵素法により様々な項目の測定が行われている。例えばグルコースオキシダーゼ等の酸化酵素を用いて過酸化水素を発生させ、ペルオキシダーゼと色素の存在下で発色後の吸光度を測定し、物質の濃度を定量化する方法が従来から知られている。
この際用いられる色素の種類としてはトリンダー試薬と呼ばれる色素またはロイコ色素と呼ばれる色素が存在する。トリンダー試薬とは４−アミノアンチピリンなどのカップラーと各種トリンダー試薬との２種からなる色素であり、特徴としては光や熱に対して安定な色素である。感度に関しては過酸化水素２分子に反応する。一方ロイコ色素は１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７）やＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ−６４）などがあり過酸化水素１分子に対して反応するため高感度の測定が可能だが、光や熱に対して不安定なため、測定前のブランクが高くなるなどの問題があり、ロイコ色素の自己発色抑制に関して様々な検討が行われている。
【０００３】
特許文献１では発色試薬にシクロデキストリン又は及びその誘導体を共存させることにより液体系の試薬でのロイコ色素ＤＡ６７の自己発色抑制について検討されている。１０日以内の短期間の効果は認められているが、長期間保存した場合の挙動についての記載が一切なく長期保存の効果は不明である。
【０００４】
特許文献２ではＤＡ６７と界面活性剤やフラボノイド系色素を安定化剤として用いて色素の安定化をする試みがなされており、バックグラウンドの抑制を達成しているが、その後の主反応である酸化反応の精度への影響について記載がなく効果は不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０１―１１８７６８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００９／１１６５７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ロイコ色素の長期における自己発色抑制を行うための安定化方法および安定化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らが鋭意検討した結果、ロイコ色素と酸化防止剤を共存させることにより、ロイコ色素の自己発色を長期に亘って抑制できることを見出した。さらに検討を進めた結果、アスコルビン酸およびグルタチオンが極めて顕著な効果をもたらすことを見出し、本発明を完成するに至った。アスコルビン酸は、血中に含むアスコルビン酸（還元剤）が酸化発色反応に影響を及ぼし精度に悪影響するという問題が知られていた。本発明は従来反応の阻害物質とされていた物質に効果を見出したものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）ロイコ色素をアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体からなる群より選ばれる一種以上の酸化防止剤と共存させることを特徴とするロイコ色素安定化方法。
（２）酸化防止剤に対する色素のモル比が０．００３以上０．１１以下である、（１）に記載のロイコ色素安定化方法。
（３）ロイコ色素が１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７）である、（１）もしくは（２）に記載のロイコ色素安定化方法。
（４）アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体からなる群より少なくとも１種選ばれる、ロイコ色素安定化剤。
【発明の効果】
【０００９】
ロイコ色素は他の色素と比べて感度が高く、精度の求められる測定系への使用が期待される半面、自己発色による保存安定性の低さが問題であった。本発明に因れば、比較的長期間、色素の自己発色を抑制することができ、安定的に色素の性能を発揮させることができる。本発明を応用すれば、とりわけ生化学分析の分野でロイコ色素を使用することができるようになり、より精度の高い生化学分析測定に資することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明によるロイコ色素は、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）等が挙げられる。
【００１１】
これらの中でも、モル吸光係数が高く、極大吸収波長が高波長側にあり、血液中の共存物質の波長を回避でき、かつ色素の波長を検出しやすいという理由から、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）が好ましい。
【００１２】
本発明のロイコ色素安定化方法では、一種以上の酸化防止剤と共存させることを特徴とする。酸化防止剤には、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体が好ましく用いられる。より好ましくは、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体が用いられる。酸化防止剤のないロイコ色素単体の状態では空気による酸化劣化し、反応前に感度が低下するという問題がある。アスコルビン酸やグルタチオンのような酸化防止剤は還元作用が強く、共存させることにより不安定なロイコ色素を還元し、酸化劣化を防ぐことができる。ロイコ色素と共存させる酸化防止剤は２種以上を混合し共存させてもよい。
【００１３】
本発明のロイコ色素安定化方法では酸化防止剤に対する色素のモル比が０．００３以上０．１１以下であることを特徴とする。モル比が０．１１を超えると還元力が不十分であり、ロイコ色素の酸化劣化が進み自己発色する。またモル比が０．００３未満であると酸化防止剤の添加量が過剰になり吸光度測定時に、酸化防止剤によるバックグラウンド上昇がお起こりこのましくない。
モル比の計算については以下の式１もしくは式２によって行った。
（式１）モル比＝単位量あたりの色素ｍｏｌ量（ｍｏｌ／Ｌ）／単位量あたりの酸化防止剤のｍｏｌ量（ｍｏｌ／Ｌ）
（式２）モル比＝単位面積あたりの色素ｍｏｌ量（ｍｏｌ／ｃｍ２）／単位面積あたりの酸化防止剤のｍｏｌ量（ｍｏｌ／ｃｍ２）
【００１４】
本発明における生化学分析とは、生体由来の検体に存在する有機・無機化合物を測定するために行われる分析のことをいい、臨床検査に用いられる測定項目の分析を指しても用いられる。生化学分析が用いられる臨床検査としては、血液検査、尿・糞便検査等があり、本発明は、血液検査に属する生化学分析に好適に使用される。血液検査における生化学分析における分析対象項目の例としては、血糖（グルコース）、ヘモグロビンＡ１ｃ、グリコアルブミン、インスリン、総タンパク質、アルブミン、コリンエステラーゼ、乳酸脱水素酵素（ＬＤ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ＝ＧＰＴ）、アスパラギン酸アミノトラスフェラーゼ（ＡＳＴ＝ＧＯＴ）、γ−グルタミントランスペプチダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ビルビリン、アミラーゼ、クレアチニン、クレアチンキナーゼ、総コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、尿酸がある。
【００１５】
生化学分析が乾式試薬の場合、例えば前記酸化防止剤とロイコ色素が共存した乾燥体が上げられる。作成方法としては前記酸化防止剤と色素を溶媒に溶解した後、溶媒を除去することで調整できる。前記ドライ系の発色試薬は例えばパウダー状であって容器等に収容されてもよいし、例えば基材に担持された測定チップや試験片のような状態であってもよい。
【００１６】
生化学分析が液体試薬の場合、例えば前記酸化防止剤とロイコ色素とを溶媒に溶解、懸濁または分散させることで調整できる。前記溶媒としては特に限定されないが、例えば、水、緩衝液等の水系溶媒等が挙げられ、また水系溶媒と有機溶媒との混合液等も使用できる。前記緩衝液としては一般的なものが使用できる。
【実施例】
【００１７】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。本実施例は、色素や酸化防止剤を乾燥状態で固定させた多層構造からなる乾式の試験片を用いて試験を行ったが、本発明は本実施例に限定されるものではなく、溶液状態での試薬でも同様の結果を得られる。
【００１８】
（試験片作成方法）
繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成した。酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）と東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））と色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））と酸化防止剤をバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。酵素や色素、酸化防止剤の量については表１、２中に示す。
【００１９】
（フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）の活性測定）
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、糖化バリルヒスチジンと糖化アミノ酸オキシダーゼとの反応で生成した過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、その吸光度変化から算出した。ここで、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．５）で、３７℃−1分あたり、フルクトシルバリルヒスチジンを加水分解し、１．０μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００２０】
（ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の活性測定）
ペルオキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素とピロガロール（Ｐ
ｙｒｏｇａｌｌｏｌ）とを反応させ、生成したプルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌ
ｉｎ）に由来する吸光度の変化から算出した。ここで、ペルオキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．０）で、２０℃−２０秒あたり、１．０ｍｇのプルプロガリン（Ｐｕｒ
ｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）に相当する呈色を生ずる酵素量を１Ｕと定義した。
【００２１】
（吸光度評価、自己発色抑制効果の確認方法）
上記の方法で作成した試験片の発色抑制状態を反射光測定装置（島津製作所社製クロマトスキャナー ＣＳ−９３００ＰＣ）によって、測定温度は２０℃で、光源としては１ｍｍ×５ｍｍで行い、色素のλｍａｘ＝６６６ｎｍの吸光度を測定した。なお測定については、スライド作成後、２００ルクス２０℃の条件で保管し、1日後、３日後、８日後の吸光度を測定し、自己発色の有無について評価を行った。
【００２２】
（実施例１）
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．３ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００２３】
２００ルクス２０℃の条件で保管し、保管開始から1日後、３日後、８日後の吸光度評価を行った。その結果を表１に示す。
【００２４】
なお表１、表２、表３、表４中の評価欄において、記号の表す意味は以下の通りである。
◎ ６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
○ ６６６ｎｍ付近において自己発色抑制効果がみられた。
△ ６６６ｎｍ付近において自己発色抑制効果がみられたが不十分である。
× ６６６ｎｍ付近において自己発色抑制効果がみられなかった。
【００２５】
表１の吸光度測定結果から明らかな通り、酸化防止剤アスコルビン酸０．３ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００２６】
（実施例２）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００２７】
試験片の試薬組成については表１に示す。酸化防止剤アスコルビン酸０．５ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００２８】
（実施例３）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸３．０ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００２９】
試験片の試薬組成については表１に示す。酸化防止剤アスコルビン酸３．０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００３０】
（実施例４）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸５．０ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３１】
試験片の試薬組成については表１に示す。酸化防止剤アスコルビン酸５．０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００３２】
（実施例５）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオン０．４ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３３】
試験片の試薬組成については表１に示す。酸化防止剤グルタチオン０．４ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００３４】
（実施例６）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオン０．６ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３５】
試験片の試薬組成については表１に示す。酸化防止剤グルタチオン０．６ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００３６】
（実施例７）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオン３．０ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３７】
試験片の試薬組成については表２に示す。酸化防止剤グルタチオン３．０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００３８】
（実施例８）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオン５．０ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３９】
試験片の試薬組成については表２に示す。酸化防止剤グルタチオン５．０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００４０】
（実施例９）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素(東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．３ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００４１】
試験片の試薬組成については表２に示す。酸化防止剤グルタチオン０．３ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と酵素ペルオキシダーゼ１種を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００４２】
（実施例１０）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．３ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００４３】
試験片の試薬組成については表２に示す。酸化防止剤グルタチオン０．３ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と酵素フルクトシルアミノ酸オキダーゼ１種を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００４４】
（実施例１１）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．３ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００４５】
試験片の試薬組成については表２に示す。酸化防止剤グルタチオン０．３ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７のみを添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００４６】
（比較例１）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００４７】
試験片の試薬組成については表３に示す。酸化防止剤は使用せず、ＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００４８】
（比較例２）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０U／ｃｍ２と色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００４９】
試験片の試薬組成については表３に示す。酸化防止剤アスコルビン酸０．０５ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００５０】
（比較例３）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．１ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００５１】
試験片の試薬組成については表３に示す。酸化防止剤アスコルビン酸０．１０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００５２】
（比較例４）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオンン０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００５３】
試験片の試薬組成については表３に示す。酸化防止剤グルタチオン０．０５ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００５４】
（比較例５）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオンン０．１０ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００５５】
試験片の試薬組成については表４に示す。酸化防止剤グルタチオン０．１０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００５６】
（比較例６）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００５７】
試験片の試薬組成については表４に示す。酸化防止剤は使用せずとＤＡ６７と酵素フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ１種のみを添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００５８】
（比較例７）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００５９】
試験片の試薬組成については表４に示す。酸化防止剤は使用せずとＤＡ６７と酵素ペルオキシダーゼ１種のみを添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００６０】
（比較例８）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００６１】
試験片の試薬組成については表４に示す。酸化防止剤は使用せずとＤＡ６７のみを添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
【表３】
【００６５】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明により感度の高い色素を安定的に使用可能となり、安定した酵素反応性が得られる。そのため糖尿病診断や様々な病気の診断時に測定精度の向上が可能になり、病気の予防や診断など産業界に大きく寄与することが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロイコ色素の安定化方法に関する。更に詳しくは、ロイコ色素を用いた分析試薬組成物におけるロイコ色素の安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野では、酵素法により様々な項目の測定が行われている。例えばグルコースオキシダーゼ等の酸化酵素を用いて過酸化水素を発生させ、ペルオキシダーゼと色素の存在下で発色後の吸光度を測定し、物質の濃度を定量化する方法が従来から知られている。
この際用いられる色素の種類としてはトリンダー試薬と呼ばれる色素またはロイコ色素と呼ばれる色素が存在する。トリンダー試薬とは４−アミノアンチピリンなどのカップラーと各種トリンダー試薬との２種からなる色素であり、特徴としては光や熱に対して安定な色素である。感度に関しては過酸化水素２分子に反応する。一方ロイコ色素は１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７）やＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ−６４）などがあり過酸化水素１分子に対して反応するため高感度の測定が可能だが、光や熱に対して不安定なため、測定前のブランクが高くなるなどの問題があり、ロイコ色素の自己発色抑制に関して様々な検討が行われている。
【０００３】
特許文献１では発色試薬にシクロデキストリン又は及びその誘導体を共存させることにより液体系の試薬でのロイコ色素ＤＡ６７の自己発色抑制について検討されている。１０日以内の短期間の効果は認められているが、長期間保存した場合の挙動についての記載が一切なく長期保存の効果は不明である。
【０００４】
特許文献２ではＤＡ６７と界面活性剤やフラボノイド系色素を安定化剤として用いて色素の安定化をする試みがなされており、バックグラウンドの抑制を達成しているが、その後の主反応である酸化反応の精度への影響について記載がなく効果は不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０１―１１８７６８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００９／１１６５７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ロイコ色素の長期における自己発色抑制を行うための安定化方法および安定化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らが鋭意検討した結果、ロイコ色素と酸化防止剤を共存させることにより、ロイコ色素の自己発色を長期に亘って抑制できることを見出した。さらに検討を進めた結果、アスコルビン酸およびグルタチオンが極めて顕著な効果をもたらすことを見出し、本発明を完成するに至った。アスコルビン酸は、血中に含むアスコルビン酸（還元剤）が酸化発色反応に影響を及ぼし精度に悪影響するという問題が知られていた。本発明は従来反応の阻害物質とされていた物質に効果を見出したものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）ロイコ色素をアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体からなる群より選ばれる一種以上の酸化防止剤と共存させることを特徴とするロイコ色素安定化方法。
（２）酸化防止剤に対する色素のモル比が０．００３以上０．１１以下である、（１）に記載のロイコ色素安定化方法。
（３）ロイコ色素が１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７）である、（１）もしくは（２）に記載のロイコ色素安定化方法。
（４）アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体からなる群より少なくとも１種選ばれる、ロイコ色素安定化剤。
【発明の効果】
【０００９】
ロイコ色素は他の色素と比べて感度が高く、精度の求められる測定系への使用が期待される半面、自己発色による保存安定性の低さが問題であった。本発明に因れば、比較的長期間、色素の自己発色を抑制することができ、安定的に色素の性能を発揮させることができる。本発明を応用すれば、とりわけ生化学分析の分野でロイコ色素を使用することができるようになり、より精度の高い生化学分析測定に資することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明によるロイコ色素は、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）等が挙げられる。
【００１１】
これらの中でも、モル吸光係数が高く、極大吸収波長が高波長側にあり、血液中の共存物質の波長を回避でき、かつ色素の波長を検出しやすいという理由から、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）が好ましい。
【００１２】
本発明のロイコ色素安定化方法では、一種以上の酸化防止剤と共存させることを特徴とする。酸化防止剤には、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体が好ましく用いられる。より好ましくは、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体が用いられる。酸化防止剤のないロイコ色素単体の状態では空気による酸化劣化し、反応前に感度が低下するという問題がある。アスコルビン酸やグルタチオンのような酸化防止剤は還元作用が強く、共存させることにより不安定なロイコ色素を還元し、酸化劣化を防ぐことができる。ロイコ色素と共存させる酸化防止剤は２種以上を混合し共存させてもよい。
【００１３】
本発明のロイコ色素安定化方法では酸化防止剤に対する色素のモル比が０．００３以上０．１１以下であることを特徴とする。モル比が０．１１を超えると還元力が不十分であり、ロイコ色素の酸化劣化が進み自己発色する。またモル比が０．００３未満であると酸化防止剤の添加量が過剰になり吸光度測定時に、酸化防止剤によるバックグラウンド上昇がお起こりこのましくない。
モル比の計算については以下の式１もしくは式２によって行った。
（式１）モル比＝単位量あたりの色素ｍｏｌ量（ｍｏｌ／Ｌ）／単位量あたりの酸化防止剤のｍｏｌ量（ｍｏｌ／Ｌ）
（式２）モル比＝単位面積あたりの色素ｍｏｌ量（ｍｏｌ／ｃｍ２）／単位面積あたりの酸化防止剤のｍｏｌ量（ｍｏｌ／ｃｍ２）
【００１４】
本発明における生化学分析とは、生体由来の検体に存在する有機・無機化合物を測定するために行われる分析のことをいい、臨床検査に用いられる測定項目の分析を指しても用いられる。生化学分析が用いられる臨床検査としては、血液検査、尿・糞便検査等があり、本発明は、血液検査に属する生化学分析に好適に使用される。血液検査における生化学分析における分析対象項目の例としては、血糖（グルコース）、ヘモグロビンＡ１ｃ、グリコアルブミン、インスリン、総タンパク質、アルブミン、コリンエステラーゼ、乳酸脱水素酵素（ＬＤ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ＝ＧＰＴ）、アスパラギン酸アミノトラスフェラーゼ（ＡＳＴ＝ＧＯＴ）、γ−グルタミントランスペプチダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ビルビリン、アミラーゼ、クレアチニン、クレアチンキナーゼ、総コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、尿酸がある。
【００１５】
生化学分析が乾式試薬の場合、例えば前記酸化防止剤とロイコ色素が共存した乾燥体が上げられる。作成方法としては前記酸化防止剤と色素を溶媒に溶解した後、溶媒を除去することで調整できる。前記ドライ系の発色試薬は例えばパウダー状であって容器等に収容されてもよいし、例えば基材に担持された測定チップや試験片のような状態であってもよい。
【００１６】
生化学分析が液体試薬の場合、例えば前記酸化防止剤とロイコ色素とを溶媒に溶解、懸濁または分散させることで調整できる。前記溶媒としては特に限定されないが、例えば、水、緩衝液等の水系溶媒等が挙げられ、また水系溶媒と有機溶媒との混合液等も使用できる。前記緩衝液としては一般的なものが使用できる。
【実施例】
【００１７】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。本実施例は、色素や酸化防止剤を乾燥状態で固定させた多層構造からなる乾式の試験片を用いて試験を行ったが、本発明は本実施例に限定されるものではなく、溶液状態での試薬でも同様の結果を得られる。
【００１８】
（試験片作成方法）
繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成した。酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）と東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））と色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））と酸化防止剤をバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。酵素や色素、酸化防止剤の量については表１、２中に示す。
【００１９】
（フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）の活性測定）
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、糖化バリルヒスチジンと糖化アミノ酸オキシダーゼとの反応で生成した過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、その吸光度変化から算出した。ここで、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．５）で、３７℃−1分あたり、フルクトシルバリルヒスチジンを加水分解し、１．０μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００２０】
（ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の活性測定）
ペルオキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素とピロガロール（Ｐ
ｙｒｏｇａｌｌｏｌ）とを反応させ、生成したプルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌ
ｉｎ）に由来する吸光度の変化から算出した。ここで、ペルオキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．０）で、２０℃−２０秒あたり、１．０ｍｇのプルプロガリン（Ｐｕｒ
ｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）に相当する呈色を生ずる酵素量を１Ｕと定義した。
【００２１】
（吸光度評価、自己発色抑制効果の確認方法）
上記の方法で作成した試験片の発色抑制状態を反射光測定装置（島津製作所社製クロマトスキャナー ＣＳ−９３００ＰＣ）によって、測定温度は２０℃で、光源としては１ｍｍ×５ｍｍで行い、色素のλｍａｘ＝６６６ｎｍの吸光度を測定した。なお測定については、スライド作成後、２００ルクス２０℃の条件で保管し、1日後、３日後、８日後の吸光度を測定し、自己発色の有無について評価を行った。
【００２２】
（実施例１）
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．３ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００２３】
２００ルクス２０℃の条件で保管し、保管開始から1日後、３日後、８日後の吸光度評価を行った。その結果を表１に示す。
【００２４】
なお表１、表２、表３、表４中の評価欄において、記号の表す意味は以下の通りである。
◎ ６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
○ ６６６ｎｍ付近において自己発色抑制効果がみられた。
△ ６６６ｎｍ付近において自己発色抑制効果がみられたが不十分である。
× ６６６ｎｍ付近において自己発色抑制効果がみられなかった。
【００２５】
表１の吸光度測定結果から明らかな通り、酸化防止剤アスコルビン酸０．３ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００２６】
（実施例２）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００２７】
試験片の試薬組成については表１に示す。酸化防止剤アスコルビン酸０．５ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００２８】
（実施例３）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸３．０ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００２９】
試験片の試薬組成については表１に示す。酸化防止剤アスコルビン酸３．０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００３０】
（実施例４）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸５．０ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３１】
試験片の試薬組成については表１に示す。酸化防止剤アスコルビン酸５．０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００３２】
（実施例５）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオン０．４ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３３】
試験片の試薬組成については表１に示す。酸化防止剤グルタチオン０．４ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００３４】
（実施例６）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオン０．６ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３５】
試験片の試薬組成については表１に示す。酸化防止剤グルタチオン０．６ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００３６】
（実施例７）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオン３．０ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３７】
試験片の試薬組成については表２に示す。酸化防止剤グルタチオン３．０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００３８】
（実施例８）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオン５．０ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３９】
試験片の試薬組成については表２に示す。酸化防止剤グルタチオン５．０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００４０】
（実施例９）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素(東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．３ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００４１】
試験片の試薬組成については表２に示す。酸化防止剤グルタチオン０．３ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と酵素ペルオキシダーゼ１種を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００４２】
（実施例１０）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．３ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００４３】
試験片の試薬組成については表２に示す。酸化防止剤グルタチオン０．３ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と酵素フルクトシルアミノ酸オキダーゼ１種を添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００４４】
（実施例１１）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．３ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００４５】
試験片の試薬組成については表２に示す。酸化防止剤グルタチオン０．３ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７のみを添加した場合、経時的な自己発色がなく、６６６ｎｍ付近において十分な自己発色抑制効果がみられた。
【００４６】
（比較例１）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００４７】
試験片の試薬組成については表３に示す。酸化防止剤は使用せず、ＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００４８】
（比較例２）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０U／ｃｍ２と色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００４９】
試験片の試薬組成については表３に示す。酸化防止剤アスコルビン酸０．０５ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００５０】
（比較例３）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤アスコルビン酸０．１ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００５１】
試験片の試薬組成については表３に示す。酸化防止剤アスコルビン酸０．１０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００５２】
（比較例４）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオンン０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００５３】
試験片の試薬組成については表３に示す。酸化防止剤グルタチオン０．０５ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００５４】
（比較例５）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇと酸化防止剤グルタチオンン０．１０ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００５５】
試験片の試薬組成については表４に示す。酸化防止剤グルタチオン０．１０ｍｇ／ｃｍ２とＤＡ６７と２種の酵素を添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００５６】
（比較例６）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）１０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００５７】
試験片の試薬組成については表４に示す。酸化防止剤は使用せずとＤＡ６７と酵素フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ１種のみを添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００５８】
（比較例７）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、酵素（東洋紡績製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））４０Uと色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００５９】
試験片の試薬組成については表４に示す。酸化防止剤は使用せずとＤＡ６７と酵素ペルオキシダーゼ１種のみを添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００６０】
（比較例８）
試験方法と評価方法は実施例１と同様に行った。
試験片の作成方法については、繊維構造体（織物、平織り、目付け８０ｇ／ｍ２、厚み１１０μm）から１ｃｍ２の試験片を作成し、色素（１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７））０．０５ｍｇをバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ、５０℃の熱風で１５分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００６１】
試験片の試薬組成については表４に示す。酸化防止剤は使用せずとＤＡ６７のみを添加した場合、経時的な自己発色が激しく、６６６ｎｍ付近において吸光度が経時的に上昇し自己発色抑制効果がみられなかった。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
【表３】
【００６５】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明により感度の高い色素を安定的に使用可能となり、安定した酵素反応性が得られる。そのため糖尿病診断や様々な病気の診断時に測定精度の向上が可能になり、病気の予防や診断など産業界に大きく寄与することが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコ色素をアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体からなる群より選ばれる一種以上の酸化防止剤と共存させることを特徴とするロイコ色素安定化方法。
【請求項２】
酸化防止剤に対する色素のモル比が０．００３以上０．１１以下である、請求項１に記載のロイコ色素安定化方法。
【請求項３】
ロイコ色素が１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７）である、請求項１もしくは２に記載のロイコ色素安定化方法。
【請求項４】
アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体からなる群より少なくとも１種選ばれる、ロイコ色素安定化剤。
【請求項１】
ロイコ色素をアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体からなる群より選ばれる一種以上の酸化防止剤と共存させることを特徴とするロイコ色素安定化方法。
【請求項２】
酸化防止剤に対する色素のモル比が０．００３以上０．１１以下である、請求項１に記載のロイコ色素安定化方法。
【請求項３】
ロイコ色素が１０-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-３,７-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム（ＤＡ６７）である、請求項１もしくは２に記載のロイコ色素安定化方法。
【請求項４】
アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、グルタチオン及びグルタチオン誘導体からなる群より少なくとも１種選ばれる、ロイコ色素安定化剤。
【公開番号】特開２０１３−１０４００７（Ｐ２０１３−１０４００７Ａ）
【公開日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４９４８６（Ｐ２０１１−２４９４８６）
【出願日】平成２３年１１月１５日（２０１１．１１．１５）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１５日（２０１１．１１．１５）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]