ロウソニア・イントラセルラリス（ＬＡＷＳＯＮＩＡＩＮＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲＩＳ）を培養する方法
本発明は一般に非哺乳動物細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの生育および大規模での細菌の生産に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に非哺乳動物細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの生育および大規模での細菌の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚増殖性回腸炎は時には豚増殖性腸炎（ＰＰＥ）とも呼ばれ、米国（ＵＳ）養豚産業における主要な問題である。増殖性回腸炎は腺窩過形成および細胞内でのカンピロバクター様微生物の存在によって特徴付けられるブタの腸疾患症候群である。疾患の認識は過去１０年間に劇的に増加し、発生率は２０％にも及び、損失はＵＳだけで年間５千万ドルと推測される。とりわけ心配なことは種豚保存産業における明らかな発生率の増加である。該疾患は世界中で見出されていて、通常６から２０週齢の離乳ブタを冒す。増殖性回腸炎に冒されたブタの臨床徴候には、間欠性下痢、食欲不振、顕著な遅鈍および感情鈍麻、ならびに消耗症候群が挙げられる。死亡は一般的でなく、しばしば腸に出血をもたらす。４種の異なる疾患の形態が記載されているが、文献の大部分は病変を急性と、時には壊死性と呼ばれる慢性の２つの形態に分類する。効果的な増殖性回腸炎管理手段は限定されている。基本的な試行錯誤治療計画には経口および非経口広域スペクトル抗生物質、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、ニトロイミダゾール、およびビタミンＢ群の使用が挙げられるが、それらは通常非常に費用がかかり、典型的に有効であることがわかる。
【０００３】
罹患した動物の上皮の腺窩における細胞内細菌の存在は、該疾患の病因が細菌であることを裏付ける。そのような動物から分離された細菌は形態学的にカンピロバクター種に類似するが、種々のカンピロバクター系統を使用したハイブリダイゼーション研究および
再生実験は、この微生物が病原体ではないことを証明している。ＪｏｅｎｓとＧｌｏｃｋ（米国特許第５，６１０，０５９号）は、以前にＰＰＥ‐病原体、回腸炎病原体、ＩＬ−Ａ、ＡＴＣＣ Ｎｏ．５５３７０と呼ばれ、現在ロウソニア・イントラセルラリスとして公知のＰＰＥ微生物の分離および性状解析ならびに該微生物を使用した疾患の再現を記載し、主張する。初期の分離物は増殖性回腸炎疾患を再現することが示された。この初期の報告以後、少なくとも４種の付加的な分離物が得られ、ＡＴＣＣ ５５３７０と同じ生育特性を実証することが示され、ＡＴＣＣ ５５３７０がプロトタイプ微生物であることを確証している。
【０００４】
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／３０２８４は、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ハムスター細胞、ヒト細胞、ウマ細胞、魚類細胞、ウシ細胞、およびブタ細胞からなる群から選択される組織培養物中でＬ．イントラセルラリスを生育させることによって調製される増殖性回腸炎ワクチンを記載する。デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）ファミリー中のグラム陰性絶対細胞内細菌であるＬ．イントラセルラリスは、野外試料から分離すること、および動物細胞中で生育させることが困難である。従って、ワクチン開発および生産における使用のために非哺乳動物細胞中で大量のＬ．イントラセルラリスを生育させる必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，６１０，０５９号
【特許文献２】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／３０２８４
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、非哺乳動物細胞、とりわけ昆虫細胞および鳥類細胞中で、そしてワクチンの工業的生産に有用な大規模でロウソニア・イントラセルラリスを生育させるための方法を開発している。
【０００７】
本発明に従って、非哺乳動物細胞は適切な培地を含む容器に播種され、その後Ｌ．イントラセルラリスを接種される。細胞はＬ．イントラセルラリスの生育および増殖に適合すると本明細書で確認された条件下で培養される。細胞は採取後破壊されて、Ｌ．イントラセルラリスを放出する。
【０００８】
本発明の方法における使用に適切な細胞には、昆虫細胞、シュナイダー細胞、および鳥類細胞が挙げられる。好ましい態様では、細胞はＳｆ９細胞、ＳＦ２１細胞、ＳＦ＋細胞、Ｈｉ−Ｆｉｖｅ細胞、および昆虫幼生細胞のような昆虫細胞である。別の好ましい態様では、細胞は鳥類細胞、とりわけＣＥＶ−１細胞である。
【０００９】
本発明は接種前に播種される細胞の適切な密度、接種物中のＬ．イントラセルラリスの量、および感染多重度を確認している。接種された細胞は係留システムで、または懸濁液中で培養することができる。適切な培養培地、温度、大気条件、およびインキュベーション期間も記載される。
【００１０】
本発明の方法は非哺乳動物細胞中におけるロウソニア・イントラセルラリスの増殖、およびワクチンの工業的生産のための大規模での細菌の生産を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＳＦ２１昆虫細胞における細胞内Ｌ．イントラセルラリスを示す免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、非哺乳動物細胞における病原性および／または非病原性ロウソニア・イントラセルラリスの生育および大規模での細菌の生産のための方法を提供する。本発明の方法は一般に：１）培地を含む容器を利用し、そして組織接着のための基質を使用して感受性のある組織培養物中でロウソニア・イントラセルラリス微生物を生育させること、または組織培養細胞の懸濁液中でＬ．イントラセルラリスを生育させること；２）生育したＬ．イントラセルラリス微生物を組織培養容器から除去することによってＬ．イントラセルラリスを採取すること；および３）Ｌ．イントラセルラリス微生物を純化することを含む。
【００１３】
非哺乳動物細胞、とりわけ昆虫細胞中でのロウソニア・イントラセルラリスの生育に対する顕著な障害は、そのような細胞がそのような微生物の天然の宿主ではないことであり、従って、任意の生育、すなわち大規模な生育が達成可能であることは予想されないであろう。本発明が直面する別の障害は、ロウソニア・イントラセルラリスが典型的には哺乳動物宿主では３５℃〜３９℃の範囲で生育することである。しかし、昆虫細胞は２５℃〜２９℃で生育し、３５℃〜３９℃では速やかに死亡する。本発明は、非哺乳動物細胞中での病原性および／または非病原性ロウソニア・イントラセルラリスの生育および大規模での該細菌の生産のための方法を初めて提供する。その上、哺乳動物細胞を増殖させる、そしてウイルスおよび／または細菌にとっての安定因子を提供するために動物血清が一般に使用されるが、一態様では、驚くべきことに本発明は血清の非存在下で昆虫細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの非常に高い発現を達成する。ロウソニア・イントラセルラリスの生育および高レベルでの発現は予想外であり、本発明の注目すべき業績であった。
【００１４】
別の態様では、本発明は鳥類細胞系におけるロウソニアの生育を提供する。
［定義］
本発明を記載することにおいて、以下の定義が使用される：
“好気性微生物（ａｅｒｏｂｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）”、“好気性菌（ａｅｒｏｂｅ）”、および、“好気性微生物（ａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）”という用語は酸素を基礎にした代謝を有する微生物を表す。“好気性条件”という用語は、酸素濃度が大気に存在する濃度（すなわち約２０％）とほぼ同じである条件を表す。
【００１５】
“嫌気性微生物（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）”および“嫌気性菌（ａｎａｅｒｏｂｅ）”という用語は生育に酸素を必要としない微生物を表す。
“係留（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）システム”などの用語は細胞を培養するためのシステムを意味し、該システムでは細胞はシートを形成して容器の内壁または基質に係留されるか、または細胞は単層を形成して容器または基質に接着する。
【００１６】
“継代性細胞系”という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで限定された細胞分裂の回数（およそ３０回まで）の間、または無期限に維持されうる細胞系を意味する。
“培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）”および“培養すること（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）”という用語はＬ．イントラセルラリス微生物の生育、再生、および／または増殖を促進するプロセスを意味する。
【００１７】
細胞に言及する場合、“新鮮（ｆｒｅｓｈ）”という用語は、Ｌ．イントラセルラリスに感染していない細胞を意味し、培地を指す場合、その中に細胞を有していない培地を意味する。
【００１８】
“生育（ｇｒｏｗｔｈ）”という用語は、適切な温度および一時的な条件下で、非哺乳動物細胞中のＬ．イントラセルラリスの抗原性マス（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍａｓｓ）または細胞密度において生じた増加を意味する。生育は、ＰＣＲ、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体染色法（ＦＡ）、および間接蛍光抗体染色法（ＩＦＡ）を含むがそれらに限定されない、当該技術分野で認められた多くの手段によって測定することができる。
【００１９】
“大規模培養”および“工業的生産”という用語はおよそ２〜３リットル（Ｌ）より多いＬ．イントラセルラリスの培養のレベルを意味し、少なくとも１００リットル、そして好ましくは４００リットル、またはいっそう好ましくは１０００リットルのスケールでの生産を含む。
【００２０】
“マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）条件”という用語は様々な条件の評価を意味し、最適方法を明らかにするために実施される完全な実験の要因または交差力価測定（ｃｈｅｃｋｂｏａｒｄ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）（変化の影響をはっきりさせるために、１項目がｙ軸で滴定され、１項目がｘ軸で滴定される）を含むがそれらに限定されない。
【００２１】
“微好気性微生物”という用語は、低い（低大気圧の）酸素圧力において生育する微生物を表す。それらは生存するために酸素を必要とするが、大気に存在するよりも低いレベルの酸素を含む環境を必要とするか、またはそのような環境に耐えることができる。“微好気性条件”という用語は酸素濃度が大気（約２０％）中に存在するよりも低い条件を表す。
【００２２】
“マイクロキャリア”という用語は、感受性のある細胞が接着するビーズ様構造を意味する。それらは一般に、攪拌された反応器中で均質な懸濁液の状態で保持されうる。
“感染多重度”（ＭＯＩ）という用語は、細胞毎の微生物の数の比を表し、該用語は与えられた感染物中でどのくらいの接種物が使用されることになるかを詳述する。
【００２３】
“継代”などの用語は細胞培養物の一部を新鮮な培地に移すプロセスを意味する。
“初代細胞系”という用語は、限定された期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持されうる細胞系を意味する。
【００２４】
“懸濁液”という用語は細胞を培養するためのシステムを意味し、その中では単一細胞または細胞の凝集塊のいずれかとして培地中に細胞が浮遊する。
“スピナーフラスコ”という用語は、培養物を攪拌し、その中に含まれる細胞を懸濁液の状態で維持するためにパドル、プロペラ、攪拌棒、または他の手段を利用するフラスコまたは他の容器を意味する。
【００２５】
“感受性のある培養物”という用語は、免疫原が改変または変更されずに、微生物の抗原性マスが生み出されるように、組織培養物が特に選択され、クローニングされるか、または確立され、Ｌ．イントラセルラリス微生物を生育させ、微生物の免疫原を発現させることを意味する。
【００２６】
Ｌ．イントラセルラリスを生育させるために有用な感受性のある組織培養物は初代細胞系または継代細胞系のいずれかであってよく、そしてシュナイダー（ショウジョウバエ）細胞、昆虫細胞、昆虫幼生細胞、鳥類細胞、鳥類胚細胞、および鳥類卵子を含むがそれらに限定されない、多様な非哺乳動物細胞型を使用して確立することができる。一態様では、感受性のある組織培養物は、Ｓｆ９、ＳＦ２１、ＳＦ＋、およびＨｉ−Ｆｉｖｅ細胞のような昆虫細胞の培養物である。特定の態様では、感受性のある組織培養物はＳｆ９細胞の培養物である。別の態様では、感受性のある組織培養物は鳥類細胞、たとえばＣＥＶ−１鳥類細胞系の細胞の培養物である。
【００２７】
感受性のある組織培養物中でＬ．イントラセルラリス微生物を生育させるために多様なマトリックス条件が使用されうる。形態学的には、感受性のある組織培養物は懸濁液として、容器の内壁もしくは基質に係留した細胞シートとして、容器もしくは基質（マイクロキャリア）に接着したコンフルエントな単層として、または接着した細胞と懸濁細胞の混合した集団が存在する部分的接着細胞として生育されてもよい。係留システムは固定床（ｆｉｘｅｄ−ｂｅｄ）、微小流動床（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ）、ウェーブ（Ｗａｖｅ）リアクター、積層モジュール、またはエアリフト（ａｉｒ ｌｉｆｔ）であってもよい。感受性のある組織培養物を生育させるための容器は、培地を含み、組織培養物接着のために容器表面、ビーズ、または他の基質を使用する、フラスコ、Ｔフラスコ、スピナーフラスコ、ローラーボトル、セルトレイ、およびバイオリアクターでありうるが、それらに限定されない。
【００２８】
懸濁液中で感受性のある組織培養物を生育させる場合、容器は培地を含む、フラスコ、Ｔフラスコ、スピナーフラスコ、ウェーブリアクター、発酵器、およびバイオリアクターでありうるが、それらに限定されない。培地が混合されうるいずれのサイズの容器が使用されてもよいが、容器は一般に約５０ｍｌから約９００Ｌまでのサイズである。好ましくは、容器容量の（５０％）約１／３が培地を含むが、ヘッドスペースに対して他の割合の培地部分が使用されてもよい。感受性のある細胞は小規模（たとえば、約５０ｍｌから約１０Ｌまでの培地を含む容器）、大規模（たとえば、約１，０００Ｌから約１０，０００Ｌまでの培地を含む容器）、または中規模（たとえば、約１０Ｌから約１，０００Ｌまでの培地を含む容器）で生育させることができる。一態様では、約１００Ｌから約６００Ｌまでの培地を含む容器が使用される。別の態様では、約１００Ｌから約４００Ｌまでの培地を含む容器が使用される。さらに別の態様では、約１５０Ｌから約２５０Ｌまでの培地を含む容器が使用される。
【００２９】
懸濁液中で細胞を生育させる場合、細胞密度は一般に１ｍｌにつき約１００，０００から約１０，０００，０００細胞の範囲である。一態様では、細胞密度は１ｍｌにつき約２００，０００から約５，０００，０００細胞の範囲である。別の態様では、細胞密度は１ｍｌにつき約５００，０００から約１，５００，０００細胞の範囲である。懸濁システムでは、細胞は１分間に約２５から約２５０回転の速度で混合されうる。一態様では、細胞は１分間に約５０から約１５０回転の速度で混合される。別の態様では、それらは１分間に約８０から約１２０回転の速度で混合される。
【００３０】
係留システムで細胞を生育させる場合、細胞系の培養、およびＬ．イントラセルラリス増殖のための容器の一形態は積層モジュールシステムである。積層モジュールは約２１，０００ｃｍ２から約３４０，０００ｃｍ２までの表面積を有することができる。あるいは、使用に適した容器の他の形態には、約１５０ｃｍ２から約４２０ｃｍ２までの表面積を有していてもよいフラスコ、および約１７６０ｃｍ２の表面積を有していてもよいが、約８５０ｃｍ２から約４２５０ｃｍ２まで変動しうるローラーボトルが挙げられる。
【００３１】
係留システムで細胞を生育させる場合、細胞密度は一般に１ｃｍ２につき約１０，０００から約１，０００，０００細胞の範囲にある。一態様では、細胞密度は１ｃｍ２につき約２０，０００から約５００，０００細胞の範囲にある。別の態様では、細胞密度は１ｃｍ２につき約６０，０００から約２５０，０００細胞の範囲にある。係留システムでは、ローラーボトルは１時間につき約０．１から約１００回転の速度で回転させることができるが、セルトレイおよび固定床リアクターでは培地は容器の中を循環する。
【００３２】
細胞系の培養、およびＬ．イントラセルラリス増殖のために適切な培地処方は、使用される細胞の型に対して当業者に一般に公知の典型的な組織培養培地のいずれかであり得る。培地は一般に選択された培養細胞にとって必要な成長因子である、窒素源、およびグルコースまたはラクトースのような炭素源を含むことになる。細胞系を培養するための培地処方の限定的でないいくつかの例には、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４０５、ＴＮＭ−ＦＨ昆虫培養培地（Ｇｅｎｔａｕｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｂｖｂａ）、ＩＰＬ−４１昆虫培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）、Ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標）無血清細胞培養培地（（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）およびＬ−グルタミンを加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２ １：１）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、それらに限定されない。一態様では、細胞培養培地処方はＬ−グルタミンを加えた昆虫細胞のためのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０無血清培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。別の態様では、細胞培養培地処方はＬ−グルタミンを加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２ １：１）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【００３３】
細胞培養培地は動物由来成分の非存在下または存在下で使用することができる。使用することができる動物由来成分は最終濃度が０．５〜１０％の範囲のガンマ−照射血清である。そのような成分の例としてはＳＥＲ−ＴＡＩＮ（登録商標）プロセスによってガンマ照射された米国提供ウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。一般に、動物蛋白質を含まない培地は懸濁液で生育する昆虫細胞培養物にとって好ましいが、動物蛋白質を含む培地は係留システムで生育する昆虫細胞培養物にとって好ましい。
【００３４】
昆虫細胞系の培養、およびＬ．イントラセルラリスの増殖のための温度は一般に、約２０から約３９℃の範囲にある。別の態様では、温度は約２３から３４℃の範囲にあり、さらに別の態様では、範囲は約２５から約２９℃である。鳥類細胞系の培養、およびＬ．イントラセルラリスの増殖のための温度は一般に約２５から約４５℃の範囲にある。別の態様では、温度は約３０から４０℃の範囲にあり、さらに別の態様では、範囲は約３５から約３９℃である。
【００３５】
細胞系の培養、およびＬ．イントラセルラリスの増殖のための大気条件は好気性または微好気性であってよい。一態様では、細胞系は約１０％水素、約１０％ＣＯ２および約８０％窒素の混合物を含む微好気性条件で培養される。
【００３６】
Ｌ．イントラセルラリスの増殖の場合、細胞は選択された容器に播種（ｓｅｅｄ）される。容器は一般に１ｍｌにつき約１００，０００から約１０，０００，０００細胞の間で播種される。別の態様では、容器は一般に、１ｍｌにつき約２００，０００から約５，０００，０００細胞の間で播種される。０から約２０回まで継代されている細胞がＬ．イントラセルラリス微生物の増殖のために使用することができる。一態様では、約１０から約２０回まで継代されている細胞が増殖のために使用される。
【００３７】
細胞培養物は、初めに、細胞に細菌を感染させるためにＬ．イントラセルラリス菌を含む接種物を接種される。Ｌ．イントラセルラリスの接種物は、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）寄託番号５５６７２、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅ （ＮＣＴＣ，Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ，Ｌｏｎｄｏｎ）寄託番号１２６５６もしくは１２６５７（米国特許第５，８８５，８２３号を参照されたい）から、または当業者に公知の分離および精製技術を使用して感染したブタまたは他の動物から得られた、純粋な培養物でありうる。接種物の量は１ｍｌにつき約１００から約１，０００，０００の範囲のロウソニアコピーであってよい。特定の態様では、接種物の量は１ｍｌにつき約２００から約５００，０００の範囲のロウソニアコピーである。別の態様では、そのような量は１ｍｌにつき約４００から約２５０，０００の範囲のロウソニアコピーである。
【００３８】
細胞培養物は容器に細胞を播種したとき、または播種後約５日目までＬ．イントラセルラリス微生物を接種されうる。別の態様では、細胞培養物は播種後約２日目まで接種される。
【００３９】
感染多重度（ＭＯＩ）は、蛍光抗体染色法（ＦＡ）、間接蛍光抗体染色法（ＩＦＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む、当業者に公知の標準技術を使用して測定することができる。そのような技術の２種の限定的でない例としてはｑＲＴ−ＰＣＲおよびＴＣＩＤ５０が挙げられる。Ｌ．イントラセルラリスの増殖に対するＭＯＩは一般に定量リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して約０．０００００１から約１０の範囲にある。別の態様では、ＭＯＩはｑＲＴ−ＰＣＲを使用して約０．００００１から約１０の範囲にある。さらに別の態様では、ＭＯＩはｑＲＴ−ＰＣＲを使用して約０．０００１から約１０の範囲にある。
【００４０】
細胞培養物は、Ｌ．イントラセルラリス微生物の感染後所望する量のＬ．イントラセルラリスの生育が見出されるまで、一定期間（インキュベーション期間）インキュベーションされる。インキュベーション期間は一般にＬ．イントラセルラリス微生物を細胞培養物に接種後約５日から約２５日までの間で変化しうる。インキュベーション期間はまた、約５日から約１５日まで変化してもよい。昆虫細胞に対する特定の態様では、インキュベーション期間は約９日から約１３日まで変化する。鳥類細胞に対する別の態様では、インキュベーション期間は約３日から約１３日まで変化する。生育の量は当業者に公知の標準技術を使用して測定することができる。生育の量を評価するために使用することができる定量的アッセイの２種の例としては、定量リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）および５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）が挙げられる。
【００４１】
インキュベーション期間中、細胞培養物は所望する場合、新鮮な培地を補充されてもよい。これは一般に感染後約５日から約９日の間、または好ましくは感染後約６日から約８日の間に行われてもよい。細胞培養物はインキュベーション期間中、１回より多く補充されてもよく、補充の間は約３日から約９日である。
【００４２】
インキュベーション期間はまた、プロセスをスケールアップするためのステップを含んでいてもよい。たとえば、細胞培養物は小さな感染容器（たとえば約５Ｌのサイズ）に播種され、一定期間（約１週間）生育させることができる。培養物はその後より大きな容器（たとえば、約３０Ｌの大きさ）に移され、新鮮な培地を補充されてよい。このプロセスは所望する細胞培養物の量が得られるまで継続することができる。
【００４３】
インキュベーション期間後、培養物の一部またはすべてが採取される。採取プロセスは容器からの流動体の除去を必要とする。流動体はＬ．イントラセルラリスに加えて、細胞片または全部の組織培養細胞を含んでいてもよい。採取は当業者に公知の標準技術を使用して達成され、そのような技術は組織培養細胞を壊してＬ．イントラセルラリス微生物を放出させるための凍結−解凍ステップ、酵素もしくは界面活性剤による処理、または高圧による処理を含むがそれらに限定されない。その上、採取は遠心分離、連続流遠心分離、カラムクロマトグラフィー、限外濾過、デッドエンド深層濾過、または濾過のような当該技術分野で公知の技術を使用した、バルク生成物中の細胞片を伴った、または細胞片を伴わない濃縮を含んでいてもよい。たとえば、一態様では細胞は容器から採取され、そしてＰＣＲを使用して、Ｌ．イントラセルラリス細菌の収量を量る。
【００４４】
一例では、Ｌ．イントラセルラリス細菌は、懸濁液のすべてまたは一部の内容物を遠心分離して培養細胞をペレットにし、生じた細胞ペレットを再懸濁し、そして感染した細胞を溶解することにより採取される。細胞が係留システムで生育される場合、細胞は初めに破壊されて懸濁液を形成する。典型的には細胞および細菌をペレットにするために、少なくとも内容物の一部は約３０００ｘｇで約２０分間遠心分離される。その後ペレットは、たとえば新鮮な培地またはスクロース−リン酸―グルタミン酸（ＳＰＧ）溶液中に再懸濁され、細胞を溶解するために２５ゲージ針をおよそ４回通される。それ以上の精製が所望される場合、細胞核および細胞片を除去するために試料は約１４５ｘｇで約５分間遠心分離することができる。その後上清は約３０００ｘｇで約２０分間、遠心分離され、生じたペレットは、（凍結にとって、または接種物としての使用にとって適した採取細菌を調製するための）ウシ胎児血清を含む、または血清を含まない新鮮な培地もしくはＳＰＧ、または（新鮮な細胞への継代にいっそう適した、採取細菌を調製するための）生育培地のような適切な希釈剤に再懸濁されてもよい。
【００４５】
別の例では、連続流遠心分離を使用して培養細胞を集めてもよく、その後細胞内細菌を遊離させるためのホモゲナイゼーションステップが続く。
一態様では、本発明はＬ．イントラセルラリス種、たとえばＡＴＣＣ５５３７０ならびに類似の免疫原性特性を有するすべての系統およびその変異体によって引き起こされる増殖性回腸炎から保護するワクチンに関する。“免疫原性特性”は、増殖性回腸炎から動物、たとえばブタを保護するための能力を意味する。企図されたワクチンには、弱毒化ワクチン、不活性化ワクチン、改変生ワクチン、サブユニットワクチンおよび組換えワクチンが挙げられるが、それらに限定されない。本発明のワクチンは十分に高レベルの免疫原を生み出す場合、保護的および／または治療的であり、そしてアジュバント、安定化剤、および／または賦形剤を含んでいてもよい。Ｌ．イントラセルラリスの不活性化は好都合には微生物をＢＥＩ（バイナリーエチレンイミン）、ＢＰＬ（ベータ−プロピオラクトン）、ホルマリン、ホルムアルデヒド、加熱またはいずれか他の当該技術分野で公知の薬剤によって処理することによって達成することができる。企図されたアジュバントには、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（登録商標）、Ｐｏｌｙｇｅｎ（登録商標）、Ｃａｒｂｏｐｕｌ（登録商標）水酸化アルミニウム、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、イズコム（Ｉｓｃｏｍ）などが挙げられる。弱毒化ワクチンは、たとえば組織培養物中で連続継代することによって生産することができる。ワクチンはたとえば筋肉内、皮下、鼻腔内、蛍光、経皮または局所投与することができる。
【００４６】
本発明はまた、動物における増殖性回腸炎の存在を検出するための診断試験を企図する。従って、本発明は増殖性回腸炎を診断するか、または検出するために利用することができるモノクローナル抗体を提供する。
【００４７】
当業者は、先の説明を使用して本発明を最も完全な程度にまで実行することができると考えられる。本発明はさらに以下の詳細な実施例によって例証されるが、それらは例証のためだけに提供され、いずれのやり方においても先の開示を限定するものと解釈するべきではない。以下に続く実施例で利用されるロウソニア・イントラセルラリスは病原性であっても、非病原性であってもよい。
【実施例】
【００４８】
実施例１．温度および大気条件を変化させるＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験
［目的］ この実験の目的は、摂氏（Ｃ）２７°（自然の昆虫温度）対３７℃において、およびＣＯ２対特殊気体雰囲気条件下で、Ｓｆ９（スポドプテラ・フルギペルダ）細胞系を使用してロウソニア・イントラセルラリスの生育を評価することであった。
【００４９】
［材料と方法］
【００５０】
【表１】
【００５１】
細胞および培地情報。細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育培地はＬ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１４４２０、項目番号１４４２０−１０００Ｍ）であった。種培養物には改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌が含まれた。
【００５２】
細胞数および播種情報。１ｍｌにつき４．５４ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む３００−ｍｌ保存懸濁液が使用された。４日齢の細胞が１０００−ｍｌスピナーフラスコに移された。全部で２２２ｍｌの新鮮な培地がそれぞれのスピナーフラスコに注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（保存懸濁液２７．５ｍｌ）が培地に播種され、およそ全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。
【００５３】
変数の説明。
【００５４】
【表２】
【００５５】
容器の形状。すべての容器は、深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。容器１および２の場合、温度は２７℃に維持された。容器３および４の場合、温度は３７℃に維持された。すべての容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。容器１および３の特殊気体雰囲気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターにより濾過された、１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後、容器は鉗子で閉じられた。５％ＣＯ２環境で維持された容器２および４は、鉗子で閉じない０．１μｍフィルターハウジングを有した。それゆえ、フィルターハウジングを通して、５％ＣＯ２環境と自由な気体交換が起こりえた。
【００５６】
感染。Ｓｆ９細胞は容器に播種されてから１日後（１日目）に感染した。種培養物は１：２０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌１２．５ｍｌ）で容器に導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【００５７】
培地補充。すべての容器は容器にＳｆ９細胞を播種後８日目に２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０を補充された。
採取。試料は容器にＳｆ９細胞を播種後、０、１、４、７、８（補充前）、９、１０、１１、１４、１５、および１７日目に採取された。播種後１１日目に、試料は容器３および４から得られた。細胞生存能力および細胞密度が非常に低かったため、それ以上の試料は採取されず、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。播種後１７日目に、試料は容器１および２から得られ、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。
【００５８】
［結果］ Ｓｆ９細胞は３７℃でよりも２７℃でよく生育した（表１を参照されたい）。ロウソニア・イントラセルラリスは２７℃および特殊気体（微好気性）条件の環境において、ならびにＣＯ２条件下（しかし、微好気性が優れていた）で生育した（表２を参照されたい）。
【００５９】
【表３】
【００６０】
【表４】
【００６１】
実施例２．温度、血清の存在、感染多重度（ＭＯＩ）およびロウソニア・イントラセルラリスの継代を変化させるＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験。
［目的］ この実験の目的は２７℃対３２℃においてＳｆ９（スポドプテラフルギペルダ）細胞系を使用したロウソニア・イントラセルラリスの生育を評価することであった。該目的はまた、２７℃対３２℃における５％血清の添加の影響を評価することであった。それはまた、２７℃対３２℃における感染多重度（ＭＯＩ）を増加させる影響を評価することであった。最後に、該目的は２７℃でのＳｆ９細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの２回目の継代を評価することであった。
【００６２】
［材料と方法］
【００６３】
【表５】
【００６４】
細胞および培地情報。細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育および維持培地はＬ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１４４２０、項目番号１４４２０−１０００Ｍ）であった。血清を含む容器のための生育および維持培地は、ＳＥＲ−ＴＡＩＮ（登録商標）プロセスによってガンマ照射された米国提供５％ウシ胎児血清を含む、Ｌ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１２１０７、項目番号１２１０７−１０００Ｍ）であった。種培養物には改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌が含まれた。
【００６５】
細胞数および播種情報。１ｍｌにつき５．２０ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む３００−ｍｌ保存懸濁液が使用された。３日齢の細胞が１０００−ｍｌスピナーフラスコに移された。全部で２２６ｍｌの新鮮な培地がそれぞれのスピナーフラスコに注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（保存懸濁液２４ｍｌ）が培地に播種され、およそ全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。
【００６６】
変数の説明。
【００６７】
【表６】
【００６８】
容器の形状。すべての容器は深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。容器１、３、５、および７の場合、温度は２７℃に維持された。容器２、４、および６の場合、温度は３２℃に維持された。すべての容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。すべての容器中の培地上方の大気は特殊気体であった。容器中の大気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターを通して濾過された、１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後容器は鉗子で閉じられた。
【００６９】
感染。Ｓｆ９細胞は容器に播種（０日目）された時に感染した。種培養物は１：４０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌６．２５ｍｌ）の比で容器１、２、３および４に導入された。種培養物はおよそ１：１１．４の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌２２ｍｌ）の比で容器５および６に導入された。種培養物は容器７に導入されなかった。正確に言えば、上記の実施例１の容器１から播種後１７日目に採取された試料３５．７ｍｌが（接種物対容器播種容量１：７の比で）容器７に導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【００７０】
培地補充。すべての容器は容器にＳｆ９細胞を播種後６日目に、２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０または２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０プラスウシ胎児血清を適宜補充された。
【００７１】
採取。試料は容器にＳｆ９細胞を播種後、０、１、４、６（補充前）、８、１１、１３、１５、１８、および２０日目に採取された。２０日目の試料を容器２、４、６、および７から得た後、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。試料は２５日目に容器１、３、および５（それらは２７℃に維持された）から採取され、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。
【００７２】
［結果］ Ｓｆ９細胞は３２℃でよりも２７℃でよく生育した（表３を参照されたい）。表４で認められるように、ロウソニアは、実施例１の接種物（すなわち継代２回目）を接種された容器７の場合を除いてすべての条件で生育した。これはおそらく実施例１に由来する生育不能な接種物に起因する。一般に、ロウソニアは２７℃で、血清を含まずに生育させる場合、より高いレベルの生育を成し遂げた。高いＭＯＩを使用した場合、最高の１ｍｌ毎のロウソニアコピーが観察されたが、収量の逓減があるように見える（すなわち、より高いＭＯＩでの４６倍の収量に比較して、より低いＭＯＩでは投資の１００倍の収量が認められた−表５を参照されたい）。ロウソニアは３２℃に維持した場合生育した；しかし、これらの感染物はロウソニアを速やかに生産することを特徴とするが、強い生育を維持することを特徴としなかった。
【００７３】
【表７】
【００７４】
【表８】
【００７５】
【表９】
【００７６】
実施例３．温度、感染多重度（ＭＯＩ）、および培地の補充を変化させる、温度適応を評価する、ならびに種々の採取時点でのＳｆ９細菌種菌を生み出すＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験。
【００７７】
［目的］ この実験の目的は、Ｓｆ９（スポドプテラフルギペルダ）細胞系を使用して、摂氏（Ｃ）２７°、２９．５℃、および３２℃でロウソニア・イントラセルラリスの生育を評価することであった。該目的はまた、２７℃で感染多重度（ＭＯＩ）を変化させる影響を評価することであった。それはまた、２７℃における種々の時点での反復した補充を評価することであった。該目的はまた、２７℃から２９．５℃まで、その後３２℃までのＳｆ９細胞の温度適応の評価を含んだ。それはまた、０〜６日の間の３２℃でのロウソニア・イントラセルラリスの生育、その後６日から完了までの間の２９．５℃での生育の評価を含んだ。最後に、該目的は後の接種のために種々の採取時点でロウソニア・イントラセルラリス種菌を生み出し、継代実行可能性を確証することであった。
【００７８】
［材料と方法］
【００７９】
【表１０】
【００８０】
細胞および培地情報。３種の細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育および維持培地はＬ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１４４２０、項目番号１４４２０−１０００Ｍ）であった。種培養物は改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌を含んだ。
【００８１】
細胞数および播種情報。保存溶液が使用された。第１の溶液は、１ｍｌにつき３．９９ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む、２７℃に維持された３００−ｍｌ保存懸濁液であった（８７．３％の生存能力）。第２の溶液は、１ｍｌにつき１．９６ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む、２９．５℃に維持された３００−ｍｌ保存懸濁液であった（７７．６％の生存能力）。第３の溶液は、１ｍｌにつき０．９ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む、３２℃に維持された３００−ｍｌ保存懸濁液であった（５２．８％の生存能力）。３日齢の細胞が１０００−ｍｌスピナーフラスコに移された。全部で２１９ｍｌの新鮮な培地がスピナーフラスコ番号１〜４に注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（２７℃の保存懸濁液３１．０ｍｌ）が培地に播種され、全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。全部で１８６ｍｌの新鮮な培地がスピナーフラスコ番号５および６に注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（２９．５℃の保存懸濁液６４．０ｍｌ）が培地に播種され、全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。全部で１１２ｍｌの新鮮な培地がスピナーフラスコ番号７に注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（３２℃の保存懸濁液１３８．０ｍｌ）が培地に播種され、全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。
【００８２】
【表１１】
【００８３】
容器の形状。すべての容器は深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。容器１、２、３、および４の場合、温度は２７℃に維持された。容器５の場合、温度は２９．５℃に維持された。容器６の場合、親培地の温度は２９．５℃であった。それは０日に３２℃にまで上げられ、０日〜６日までこの温度を維持され、その後６日から２４日まで２９．５℃に下げられた。容器７の場合、温度は３２℃に維持された。容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。すべての容器中の培地上方の大気は特殊気体であった。容器中の大気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターを通して濾過された、１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後、器は鉗子で閉じられた。
【００８４】
感染。Ｓｆ９細胞は容器に播種（０日）された時に感染した。種培養物は１：４０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌６．２５ｍｌ）の比で容器１、４、５、６、および７に導入された。種培養物はおよそ１：１６０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌１．５６ｍｌ）の比で容器２に導入された。種培養物はおよそ１：６４０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌０．４ｍｌ）の比で容器３に導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【００８５】
培地補充。容器１、２、３、４、５、６、および７は容器にＳｆ９細胞を播種後６日目に、２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０を補充された。容器４の場合、容器にＳｆ９細胞を播種後１３および１９日目に、２５０ｍｌの細胞培養物が空の１０００ｍｌ容器に移され、付加的なＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０を２５０ｍｌ補充された。
【００８６】
採取。試料は容器にＳｆ９細胞を播種後、０、３、５、６（補充前）、７、１０、１３、１７、１９、２０、２４および２７日目に採取された。しかし、２０、２４および２７日目には容器７から採取されなかった。容器４の場合、２５ｍｌの培地および細胞が６、１３、１９および２４日目（６、１３、および１９日目の培地の補充前）に採取され、凍結された。容器７から１９日目の試料、および容器１〜６から２７日目の試料を得た後、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。
【００８７】
［結果］ 容器１および容器４の条件は容器４が１３日目および１９日目に付加的に補充されたことを除いて同様であった。細胞密度および生存能力（表６および７を参照されたい）によって測定されるように、この付加的な補充により、より健康なＳｆ９細胞、およびロウソニア収量のより高い全体的増加を生じた（表８を参照されたい）。ロウソニアの収量の増加は、２７℃に維持された容器１〜４で達成された。
【００８８】
容器１、５、６、および７の条件は、親細胞の温度および／またはロウソニア生育中の温度を除いて同様であった。ロウソニア増殖は、３２℃で実施された場合（容器６）、初期の感染期間（０〜６日）の間促進された。このことは、おそらく感染時でのＳｆ９の低い生存能力（５０％）に起因して、容器７では再現されなかった。従って、２７℃でのロウソニアの増殖は最大生育を達成するためにはより長い時間がかかるが、より多い総収量が達成された。
【００８９】
【表１２】
【００９０】
【表１３】
【００９１】
【表１４】
【００９２】
【表１５】
【００９３】
実施例４．採取日を変化させることによる、試料のロウソニア・イントラセルラリス細菌生育およびロウソニア・イントラセルラリス温度適応を評価するＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験。
【００９４】
［目的］ この実験の目的は、摂氏（Ｃ）２７°でのＳｆ９（スポドプテラフルギペルダ）細胞系の感染後、４種の異なる時点で採取されたロウソニア・イントラセルラリス細菌の生育を評価すること、およびＳｆ９細胞中で増殖したロウソニアが新規なＳｆ９細胞培養物に再感染できることを保証することであった。該目的はまた、３２℃での０〜６日の間のロウソニア・イントラセルラリス細菌の生育、その後２７℃での６日から完了までの間の生育を評価することであった。
【００９５】
［材料と方法］
【００９６】
【表１６】
【００９７】
細胞および培地情報。細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育および維持培地はＬ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１４４２０、項目番号１４４２０−１０００Ｍ）であった。改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌を含む種培養物は実施例３の間に得られた。先に記載のように、２５ｍｌの試料が６、１３、１９および２４日目に容器４から採取され、−８０℃で凍結された。細胞数および播種情報。１０００Ｌスピナーフラスコ中に２７℃で維持された３００−ｍｌ保存懸濁液が使用された。播種後６日目において容器はＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地中、１ｍｌにつき６．４ｘ１０６のＳｆ９細胞（９９．７％の生存能力）を含んだ。６日齢の細胞が５個の新規な５００−ｍｌスピナーフラスコに移された。全部で２３０．５ｍｌの新鮮な培地がそれぞれのスピナーフラスコに注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（保存懸濁液１９．５ｍｌ）が培地に播種され、全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。
【００９８】
変数の説明。
【００９９】
【表１７】
【０１００】
容器の形状。すべての容器は深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。容器１、２、３、および４の場合、温度は２７℃に維持された。容器５の場合、温度は０〜６日まで３２℃に維持され、その後６〜２９日まで２７℃に下げられた。すべての容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。すべての容器中の培地上方の大気は特殊気体であった。容器中の大気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターを通して濾過された１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後、器は鉗子で閉じられた。
【０１０１】
感染。すべての容器に対して、Ｓｆ９細胞は容器に播種（０日目）された時に感染した。感染時において、ロウソニア・イントラセルラリス細菌による感染多重度（ＭＯＩ）は実施例３のｑＲＴ−ＰＣＲの結果を使用して計算された。
【０１０２】
【表１８】
【０１０３】
目標感染量は容器毎にＬ．イントラセルラリス３．１５ｘ１０８コピーであった。容器１は２５．０ｍｌの６日目の種菌（３．１５ｘ１０８コピー／１．２６ｘ１０７コピー／ｍｌ）に感染した。容器２および５は３．３ｍｌの１３日目の種菌（３．１５ｘ１０８コピー／９．６ｘ１０７コピー／ｍｌ）に感染した。容器３は１９日目の種菌（３．１５ｘ１０８コピー／５．０ｘ１０７コピー／ｍｌ）６．３ｍｌに感染した。容器４は２４日目の種菌（３．１５ｘ１０８コピー／２．６ｘ１０７コピー／ｍｌ）１２．１ｍｌに感染した。
【０１０４】
培地補充。容器にＳｆ９細胞を播種後６日目に、すべての容器は２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０を補充された。
採取。試料は容器にＳｆ９細胞を播種後、０、３、６（補充前）、８、１０、１４、１７、２１、２５および２９日目に採取された。しかし、細胞数が少なかったため、２９日目の容器５から試料は採取されなかった。容器５から２５日目の試料、および容器１〜４から２９日目の試料を得た後、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。
【０１０５】
［結果］ 結果は、以前に昆虫細胞で継代されたロウソニアが採取されて、新規な昆虫細胞を感染させるために使用されうることを実証する（表１０、１１、および１２を参照されたい）。２４日目の種菌の６７倍の増加は、より初期の実施例で使用された新鮮な種菌に対して観察されている８０〜１００倍の収量に匹敵する。初期ロウソニア増殖バーストは、３２℃で始まり、２７℃に変更された培養物で観察されたが、これらの培養物は実験全体に対して２７℃に維持された培養物で観察された生育レベルを維持しなかった。最後に、６、１３、１９および２４日目の種菌の標準化された感染が“同一の”収量増加を達成しなかった理由は不明である。
【０１０６】
【表１９】
【０１０７】
【表２０】
【０１０８】
【表２１】
【０１０９】
実施例５．分析のために、培地の型、感染多重度（ＭＯＩ）、および感染Ｓｆ９細胞対非感染Ｓｆ９細胞を比較するＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験。
［目的］ この実験の目的は、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地またはＩＰＬ−４１培地のいずれかにおけるＳｆ９（スポドプテラフルギペルダ）細胞系を使用したロウソニア・イントラセルラリスの生育を比較することであった。該目的はまた、およそ３１用量でのＳｆ９細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの感染多重度（ＭＯＩ）を評価することであった。最後に、該目的は、生化学的分析および質量分析中に、Ｓｆ９陰性対照（非感染細胞）とロウソニア・イントラセルラリスに感染したＳｆ９細胞を比較することであった。
【０１１０】
［材料と方法］
【０１１１】
【表２２】
【０１１２】
細胞および培地情報。細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育および維持培地はＬ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１４４２０、項目番号１４４２０−１０００Ｍ）であった。コンパレータ（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）生育および維持培地はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｉ７７６０；ロット番号７５Ｋ２３７０のＩＰＬ−４１昆虫培地であった。種培養物は改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌を含んだ。
【０１１３】
細胞数および播種情報。２種の保存溶液が使用された。第１の溶液は、ＩＰＬ−４１培地中、１ｍｌにつき３．１８ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む、２７℃で維持された３００−ｍｌ保存懸濁液であった（９１．４％の生存能力）。第２の溶液は、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地中、１ｍｌにつき１．７８ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む、２７℃に維持された３００−ｍｌ保存懸濁液であった（９７．８％の生存能力）。６日齢の細胞が５００−ｍｌスピナーフラスコに移された。全部で１７９．８ｍｌの新鮮なＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地がスピナーフラスコ番号１および２に注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０保存懸濁液７０．２ｍｌ）が培地に播種され、全容量およそ２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。全部で２１０．７ｍｌの新鮮なＩＰＬ−４１培地がスピナーフラスコ番号３および４に入れられ、１．２５ｘ１０８細胞（ＩＰＬ−４１保存懸濁液３９．３ｍｌ）が培地に播種され、全容量およそ２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。
【０１１４】
変数の説明。
【０１１５】
【表２３】
【０１１６】
容器の形状。すべての容器は深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。温度はすべての容器に対して２７℃に維持された。容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。容器１および３の大気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターを通して濾過された、１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後、器は鉗子で閉じられた。周囲条件のままにしておく容器２および４は、鉗子で閉じられない０．１μｍフィルターハウジングを有した。それゆえ通常の大気条件下で、フィルターハウジングを通して自由な気体交換が起こりえた。
【０１１７】
感染。容器１および３の場合、Ｓｆ９細胞は容器に播種された時（０日、０時）に感染した。種培養物は１：４０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌６．２５ｍｌ）の比で導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【０１１８】
培地補充。容器１と２は容器にＳｆ９細胞を播種後７日目に、２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０を補充され、容器３と４はＩＰＬ−４１を補充された。
採取。試料は容器にＳｆ９細胞を播種後、０、３、４、７（補充前）、９、１１、および１４日目に採取された。容器から１４日目の試料を得た後、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。
【０１１９】
［結果］ Ｓｆ９細胞はＩＰＬ−４１培地に比較してＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地において有意によく生育した（表１３を参照されたい）。ロウソニア・イントラセルラリスは両方の培地で培養することが可能であった（表１４および１５を参照されたい）が、ＩＰＬ−４１培地に対し、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地においてより高い収量が得られた（２１２倍対４．４倍）。
【０１２０】
【表２４】
【０１２１】
【表２５】
【０１２２】
【表２６】
【０１２３】
実施例６．密度を変化させたフラスコ中のＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験
［目的］ この実験の目的は、係留システムにおいて、３種の異なる密度で播種されたＳｆ９（スポドプテラフルギペルダ）細胞系を使用してロウソニア・イントラセルラリスの生育を比較することであった。
【０１２４】
［材料と方法］
【０１２５】
【表２７】
【０１２６】
細胞および培地情報。細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育および維持培地は、ＳＥＲ−ＴＡＩＮ（登録商標）プロセスによってガンマ照射された米国提供５％ウシ胎児血清を含む、Ｌ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１２１０７、項目番号１２１０７−１０００Ｍ）であった。種培養物には改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌を含んだ。種培養物は元のワクチンのサブアリコートであった。
【０１２７】
細胞数および播種情報。
【０１２８】
【表２８】
【０１２９】
プロセスパラメータ。温度はすべての容器に対して２７℃に維持された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。容器１から４までにおいて特殊気体雰囲気を確立する場合、７５ｃｍ２フラスコはＢＢＬ（登録商標） ＧａｓＰａｋ（登録商標） Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に入れ、容器は密閉された。その後該容器は真空にされ、１０％ＣＯ２、１０％水素および８０％窒素で再び満たした。拡散を防ぐために、気体を満たした後、器は鉗子で閉じられた。
【０１３０】
感染。Ｓｆ９細胞は容器に播種後２時間未満、感染した。種培養物は１：４０の容器播種容量（すなわち、容量５０ｍｌにつき種菌１．２５ｍｌ）の比で導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【０１３１】
培地補充。この実験中、培地は補充されなかった。
採取。Ｓｆ９細胞を容器に播種後０、７、１０、および１３日目に試料が採取された。
［結果］ 評価されたＳｆ９細胞密度のそれぞれはロウソニア・イントラセルラリスの有意な生育をもたらした（表１６を参照されたい）。２Ｅ＋７、１Ｅ＋７、および５Ｅ＋７細胞密度で播種された容器はそれぞれ、１５．３、２４．５および２７．９倍の増加をもたらした。
【０１３２】
【表２９】
【０１３３】
実施例７．大気条件を変化させた鳥類細胞におけるＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験
［目的］ この実験の目的はＣＥＶ−１鳥類細胞系を使用して、ＣＯ２対特殊気体雰囲気条件下での摂氏（Ｃ）３７°のロウソニア・イントラセルラリスの生育を評価することであった。
【０１３４】
［材料と方法］
【０１３５】
【表３０】
【０１３６】
細胞および培地情報。ＣＥＶ−１細胞はＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．において維持された保存培養物から得られた。生育および維持培地は、ＳＥＲ−ＴＡＩＮ（登録商標）プロセスによってガンマ照射された米国提供１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡカタログ番号１２１０７，項目番号１２１０７−１０００Ｍ）を含む、Ｌ−グルタミンを加えたＤＭＥＭ：Ｆ１２ １：１（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ；カタログ番号２１０４１−０２５）であった。種培養物は改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌を含んだ。
【０１３７】
細胞数および播種情報。１ｍｌにつき２．７ｅ６のＣＥＶ−１細胞を含む２０−ｍｌ保存懸濁液が使用された。親細胞（継代前）は４日齢であった。０日齢の細胞は５００−ｍｌのスピナーフラスコに移した。全部で２４０ｍｌの新鮮な培地がそれぞれのスピナーフラスコに注がれ、２．５ｅ７細胞（保存懸濁液１０ｍｌ）が培地に播種され、全容量およそ２５０ｍｌ、１００，０００細胞／ｍｌとなった。
【０１３８】
変数の説明。
【０１３９】
【表３１】
【０１４０】
容器の形状。すべての容器は深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。両方の容器に対して、温度は３７℃に維持された。両方の容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。容器１における特殊気体雰囲気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターを通して濾過された、１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後、容器は鉗子で閉じられた。５％ＣＯ２環境で維持される容器２は、鉗子で閉じられない０．１μｍフィルターハウジングを有した。それゆえ、フィルターハウジングを通して、５％ＣＯ２環境と自由な気体交換が起こりえた。
【０１４１】
感染。ＣＥＶ−１細胞は容器に播種された後（１日目）２４時間感染した。種培養物は１：２０の容器播種容量の比（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌１２．５ｍｌ）で容器に導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【０１４２】
培地補充。すべての容器は容器にＣＥＶ−１細胞を播種後８日目に２５０ｍｌのＤＭＥＭ Ｆ１２ １０％ＩＦＢＳを補充された。
採取。試料は容器にＣＥＶ−１細胞を播種後、１、４、７、８（補充前および補充後の両方）、９、１０、１１、および１４日目に採取された。
【０１４３】
［結果］ ＣＥＶ−１細胞は細胞密度および生存能力によって測定されたように、この研究の条件下でよく生育した（表１７および１８を参照されたい）。ロウソニア・イントラセルラリスは３７℃の環境および特殊気体（微好気性）条件においてＣＥＶ−１鳥類細胞中で生育した（表１９を参照されたい）。特殊気体中で維持されたＣＥＶ−１細胞は、容器へのＣＥＶ−１細胞の播種後１〜１４日までに７．９倍の増加を生じた。ＣＯ２環境中で維持された培養物はこの同じ期間中にロウソニア・イントラセルラリスの増加を生じなかった。
【０１４４】
【表３２】
【０１４５】
【表３３】
【０１４６】
【表３４】
【０１４７】
本明細書に開示され、主張された方法はすべて本開示の観点から過度な実験をせずに計画し、実行することができる。本発明の方法は異なる態様の見地から記載されているが、本発明の概念、意図および範囲から逸脱せずに、本明細書に記載の方法に対して、ならびに方法のステップまたはステップの順序において変形が適用されてもよいことは、当業者には明らかであろう。より明確には、同じかまたは類似の結果が達成される限り、化学的および生理学的の両方に関連するある種の作用物質が、本明細書に記載の作用物質と交換されてもよいことは明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代替物および改変のすべては、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の意図、範囲および概念の範囲内であると見なされる。
実施例８．Ｓｆ−２１昆虫細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの培養
［材料と方法］ グレース（Ｇｒａｃｅ）昆虫細胞培地（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１６０５−０９４）の一瓶を使用前に３０分間、２７℃に温めた。１ｍｌにつき１０６のＳｆ−２１細胞を含む１ｍｌのクライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）が得られ、凍結した懸濁物がすべて消失したことを確実にするために、３７℃で１５分間解凍された。細胞懸濁物のためのグレース培地中１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＪＲＨ カタログ番号１２１０３−５００Ｍ）プラス１％のＬ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔ；Ｇｉｂｃｏ カタログ番号２５０３０−０８１）。
【０１４８】
細胞を含むクリオバイアルは解凍されると、内容物は１０ｍｌのグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔに再懸濁され、８００ｒｐｍで５分間遠心分離されて、細胞からＤＭＳＯ凍結溶液が除去された。完了後、上清溶液は除去され、廃棄され、その後細胞は１０ｍｌのグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔに静かに再懸濁された。
【０１４９】
再懸濁された細胞１０ｍｌすべてはＣｏｒｎｉｎｇ Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ（カタログ番号４３０６４１；ベントキャップ（ｖｅｎｔ ｃａｐ））に移され、グレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔをさらに５ｍｌ添加して、培養フラスコ中の容量を１５ｍｌにした。フラスコは２７℃で１時間インキュベーションされ、グレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔを完全に再供給された。該プロセスは、死細胞または非接着Ｓｆ−２１細胞をいずれも除去することを意味した。生じた単層は、その日の終わりまでにはおよそ４０〜４５％に達した。このプロセスは１回目のフラスコ再供給後もう１回１時間繰り返された。
【０１５０】
Ｓｆ−２１細胞が対数増殖期（８０〜９５％コンフルエント単層）に到達するには４８時間かかった。この時点で細胞は上清培地で静かに洗浄された。培地および細胞は１，０００ｇで５分間遠心分離され、その後上清培地は廃棄され、その後の増殖のためにグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔ５ｍｌの中に細胞を静かに再懸濁した。
【０１５１】
生じた細胞懸濁液はグレース培地中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔ２５ｍｌの中に希釈され、２つのＴ−７５ｃｍ２培養フラスコに分割された。フラスコは再び２７℃で１時間インキュベーションされ、その後以前と同じ培地調製物を再供給され、再び生存可能でない細胞または死細胞をいずれも除去した。該プロセスは１時間後に再び繰り返され、細胞は少なくとも４時間妨害されずにインキュベーションされ、その後感染した。
【０１５２】
感染することになるＴ−７５ｃｍ２フラスコ毎に上清ロウソニア・イントラセルラリス（１０５〜１０６Ｌｉ／ｍｌ）を含むクリオバイアル１個が３７℃で解凍された。１つのフラスコは細胞増殖のために保持され、他の１つはＬｉによる感染のために使用された。
【０１５３】
クリオバイアルは完全に解凍されると、およそ２０〜３０％コンフルエントなＳｆ−２１細胞の単層に添加された。好ましい感染時点は感染していないＳｆ−２１細胞の２回目の再供給後４〜６時間であった。
【０１５４】
それぞれ感染したフラスコは５００ｍｍＨｇにまで減圧し、およそ３０秒間１００％Ｈ２で満たし、その後２７℃のインキュベーターに移した。Ｓｆ−２１昆虫細胞の分裂サイクルはおよそ４８〜６０時間であり、結果として培養物は増殖するか、そのような時期に分裂を停止する。感染後４０〜４２時間頃のある時点で、Ｓｆ−２１細胞の感染率を評価するためにＳｆ−２１細胞単層ははがされ、以下のＩＰＸ（モノクローナルまたはポリクローナル）染色技術に従って染色された。
【０１５５】
実施例９．単層生育に適応したＳｆ−２１昆虫細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの培養
［材料と方法］ 約１０６のＳｆ−２１細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＪＲＨ カタログ番号１２１０３−５００Ｍ）プラス１％のＬ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔ；Ｇｉｂｃｏ カタログ番号２５０３０−０８１）を含む１０ｍｌのグレース昆虫細胞培地（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１６０５−０９４）に添加された。再懸濁された細胞１０ｍｌすべてはＣｏｒｎｉｎｇ Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ（カタログ番号４３０６４１；ベントキャップ）に移され、付加的な５ｍｌのグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔを添加して、培養フラスコ中の容量を１５ｍｌにした。フラスコは２７℃で１時間インキュベーションされ、１５ｍｌのグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔを完全に再供給し、死細胞または非接着Ｓｆ−２１細胞をいずれも除去した。
【０１５６】
Ｓｆ−２１細胞が対数増殖期（８０〜９５％コンフルエント単層）に到達するには４８時間かかった。この時点で細胞は上清培地で静かに洗浄された。培地および細胞は１，０００ｇで５分間遠心分離され、続いて上清培地は廃棄され、その後の増殖のために５ｍｌのグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔの中に細胞を静かに再懸濁した。
【０１５７】
生じた細胞懸濁液はグレース培地中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔ２５ｍｌにまで希釈され、２つのＴ−７５ｃｍ２培養フラスコに分割された。フラスコは再び２７℃で１時間インキュベーションされ、再び以前と同じ培地を注がれ、再び生存可能でない細胞または死細胞をいずれも除去した。該プロセスは１時間後に再び繰り返され、細胞は少なくとも４時間妨害されずにインキュベーションされ、その後感染した。
【０１５８】
上清ロウソニア・イントラセルラリス（１０５Ｌｉ／ｍｌ）を含むクリオバイアル１個は感染することになるＴ−７５ｃｍ２フラスコ毎に３７℃で解凍された。クリオバイアルは完全に解凍されると、およそ２０〜３０％コンフルエントなＳｆ−２１細胞の単層に添加された。好ましい感染時点は非感染Ｓｆ−２１細胞の２回目の再供給後４〜６時間であった。
【０１５９】
それぞれ感染したフラスコは５００ｍｍＨｇにまで減圧し、およそ３０秒間１００％Ｈ２で満たし、その後２７℃のインキュベーターに移した。感染後４０〜４２時間頃の時点でＳｆ−２１細胞の感染率を評価するために、Ｓｆ−２１細胞単層ははがされ、ＩＰＸ（モノクローナルまたはポリクローナル）染色技術に従って染色された。
【０１６０】
［結果］ 約１０〜１５％のＳｆ−２１単層は、細胞毎に３０より多いＬｉに感染し、Ｔ−７５フラスコ毎に約１０６〜１０７のＬｉを生じた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に非哺乳動物細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの生育および大規模での細菌の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚増殖性回腸炎は時には豚増殖性腸炎（ＰＰＥ）とも呼ばれ、米国（ＵＳ）養豚産業における主要な問題である。増殖性回腸炎は腺窩過形成および細胞内でのカンピロバクター様微生物の存在によって特徴付けられるブタの腸疾患症候群である。疾患の認識は過去１０年間に劇的に増加し、発生率は２０％にも及び、損失はＵＳだけで年間５千万ドルと推測される。とりわけ心配なことは種豚保存産業における明らかな発生率の増加である。該疾患は世界中で見出されていて、通常６から２０週齢の離乳ブタを冒す。増殖性回腸炎に冒されたブタの臨床徴候には、間欠性下痢、食欲不振、顕著な遅鈍および感情鈍麻、ならびに消耗症候群が挙げられる。死亡は一般的でなく、しばしば腸に出血をもたらす。４種の異なる疾患の形態が記載されているが、文献の大部分は病変を急性と、時には壊死性と呼ばれる慢性の２つの形態に分類する。効果的な増殖性回腸炎管理手段は限定されている。基本的な試行錯誤治療計画には経口および非経口広域スペクトル抗生物質、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、ニトロイミダゾール、およびビタミンＢ群の使用が挙げられるが、それらは通常非常に費用がかかり、典型的に有効であることがわかる。
【０００３】
罹患した動物の上皮の腺窩における細胞内細菌の存在は、該疾患の病因が細菌であることを裏付ける。そのような動物から分離された細菌は形態学的にカンピロバクター種に類似するが、種々のカンピロバクター系統を使用したハイブリダイゼーション研究および
再生実験は、この微生物が病原体ではないことを証明している。ＪｏｅｎｓとＧｌｏｃｋ（米国特許第５，６１０，０５９号）は、以前にＰＰＥ‐病原体、回腸炎病原体、ＩＬ−Ａ、ＡＴＣＣ Ｎｏ．５５３７０と呼ばれ、現在ロウソニア・イントラセルラリスとして公知のＰＰＥ微生物の分離および性状解析ならびに該微生物を使用した疾患の再現を記載し、主張する。初期の分離物は増殖性回腸炎疾患を再現することが示された。この初期の報告以後、少なくとも４種の付加的な分離物が得られ、ＡＴＣＣ ５５３７０と同じ生育特性を実証することが示され、ＡＴＣＣ ５５３７０がプロトタイプ微生物であることを確証している。
【０００４】
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／３０２８４は、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ハムスター細胞、ヒト細胞、ウマ細胞、魚類細胞、ウシ細胞、およびブタ細胞からなる群から選択される組織培養物中でＬ．イントラセルラリスを生育させることによって調製される増殖性回腸炎ワクチンを記載する。デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）ファミリー中のグラム陰性絶対細胞内細菌であるＬ．イントラセルラリスは、野外試料から分離すること、および動物細胞中で生育させることが困難である。従って、ワクチン開発および生産における使用のために非哺乳動物細胞中で大量のＬ．イントラセルラリスを生育させる必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，６１０，０５９号
【特許文献２】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／３０２８４
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、非哺乳動物細胞、とりわけ昆虫細胞および鳥類細胞中で、そしてワクチンの工業的生産に有用な大規模でロウソニア・イントラセルラリスを生育させるための方法を開発している。
【０００７】
本発明に従って、非哺乳動物細胞は適切な培地を含む容器に播種され、その後Ｌ．イントラセルラリスを接種される。細胞はＬ．イントラセルラリスの生育および増殖に適合すると本明細書で確認された条件下で培養される。細胞は採取後破壊されて、Ｌ．イントラセルラリスを放出する。
【０００８】
本発明の方法における使用に適切な細胞には、昆虫細胞、シュナイダー細胞、および鳥類細胞が挙げられる。好ましい態様では、細胞はＳｆ９細胞、ＳＦ２１細胞、ＳＦ＋細胞、Ｈｉ−Ｆｉｖｅ細胞、および昆虫幼生細胞のような昆虫細胞である。別の好ましい態様では、細胞は鳥類細胞、とりわけＣＥＶ−１細胞である。
【０００９】
本発明は接種前に播種される細胞の適切な密度、接種物中のＬ．イントラセルラリスの量、および感染多重度を確認している。接種された細胞は係留システムで、または懸濁液中で培養することができる。適切な培養培地、温度、大気条件、およびインキュベーション期間も記載される。
【００１０】
本発明の方法は非哺乳動物細胞中におけるロウソニア・イントラセルラリスの増殖、およびワクチンの工業的生産のための大規模での細菌の生産を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＳＦ２１昆虫細胞における細胞内Ｌ．イントラセルラリスを示す免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、非哺乳動物細胞における病原性および／または非病原性ロウソニア・イントラセルラリスの生育および大規模での細菌の生産のための方法を提供する。本発明の方法は一般に：１）培地を含む容器を利用し、そして組織接着のための基質を使用して感受性のある組織培養物中でロウソニア・イントラセルラリス微生物を生育させること、または組織培養細胞の懸濁液中でＬ．イントラセルラリスを生育させること；２）生育したＬ．イントラセルラリス微生物を組織培養容器から除去することによってＬ．イントラセルラリスを採取すること；および３）Ｌ．イントラセルラリス微生物を純化することを含む。
【００１３】
非哺乳動物細胞、とりわけ昆虫細胞中でのロウソニア・イントラセルラリスの生育に対する顕著な障害は、そのような細胞がそのような微生物の天然の宿主ではないことであり、従って、任意の生育、すなわち大規模な生育が達成可能であることは予想されないであろう。本発明が直面する別の障害は、ロウソニア・イントラセルラリスが典型的には哺乳動物宿主では３５℃〜３９℃の範囲で生育することである。しかし、昆虫細胞は２５℃〜２９℃で生育し、３５℃〜３９℃では速やかに死亡する。本発明は、非哺乳動物細胞中での病原性および／または非病原性ロウソニア・イントラセルラリスの生育および大規模での該細菌の生産のための方法を初めて提供する。その上、哺乳動物細胞を増殖させる、そしてウイルスおよび／または細菌にとっての安定因子を提供するために動物血清が一般に使用されるが、一態様では、驚くべきことに本発明は血清の非存在下で昆虫細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの非常に高い発現を達成する。ロウソニア・イントラセルラリスの生育および高レベルでの発現は予想外であり、本発明の注目すべき業績であった。
【００１４】
別の態様では、本発明は鳥類細胞系におけるロウソニアの生育を提供する。
［定義］
本発明を記載することにおいて、以下の定義が使用される：
“好気性微生物（ａｅｒｏｂｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）”、“好気性菌（ａｅｒｏｂｅ）”、および、“好気性微生物（ａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）”という用語は酸素を基礎にした代謝を有する微生物を表す。“好気性条件”という用語は、酸素濃度が大気に存在する濃度（すなわち約２０％）とほぼ同じである条件を表す。
【００１５】
“嫌気性微生物（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）”および“嫌気性菌（ａｎａｅｒｏｂｅ）”という用語は生育に酸素を必要としない微生物を表す。
“係留（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）システム”などの用語は細胞を培養するためのシステムを意味し、該システムでは細胞はシートを形成して容器の内壁または基質に係留されるか、または細胞は単層を形成して容器または基質に接着する。
【００１６】
“継代性細胞系”という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで限定された細胞分裂の回数（およそ３０回まで）の間、または無期限に維持されうる細胞系を意味する。
“培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）”および“培養すること（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）”という用語はＬ．イントラセルラリス微生物の生育、再生、および／または増殖を促進するプロセスを意味する。
【００１７】
細胞に言及する場合、“新鮮（ｆｒｅｓｈ）”という用語は、Ｌ．イントラセルラリスに感染していない細胞を意味し、培地を指す場合、その中に細胞を有していない培地を意味する。
【００１８】
“生育（ｇｒｏｗｔｈ）”という用語は、適切な温度および一時的な条件下で、非哺乳動物細胞中のＬ．イントラセルラリスの抗原性マス（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍａｓｓ）または細胞密度において生じた増加を意味する。生育は、ＰＣＲ、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体染色法（ＦＡ）、および間接蛍光抗体染色法（ＩＦＡ）を含むがそれらに限定されない、当該技術分野で認められた多くの手段によって測定することができる。
【００１９】
“大規模培養”および“工業的生産”という用語はおよそ２〜３リットル（Ｌ）より多いＬ．イントラセルラリスの培養のレベルを意味し、少なくとも１００リットル、そして好ましくは４００リットル、またはいっそう好ましくは１０００リットルのスケールでの生産を含む。
【００２０】
“マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）条件”という用語は様々な条件の評価を意味し、最適方法を明らかにするために実施される完全な実験の要因または交差力価測定（ｃｈｅｃｋｂｏａｒｄ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）（変化の影響をはっきりさせるために、１項目がｙ軸で滴定され、１項目がｘ軸で滴定される）を含むがそれらに限定されない。
【００２１】
“微好気性微生物”という用語は、低い（低大気圧の）酸素圧力において生育する微生物を表す。それらは生存するために酸素を必要とするが、大気に存在するよりも低いレベルの酸素を含む環境を必要とするか、またはそのような環境に耐えることができる。“微好気性条件”という用語は酸素濃度が大気（約２０％）中に存在するよりも低い条件を表す。
【００２２】
“マイクロキャリア”という用語は、感受性のある細胞が接着するビーズ様構造を意味する。それらは一般に、攪拌された反応器中で均質な懸濁液の状態で保持されうる。
“感染多重度”（ＭＯＩ）という用語は、細胞毎の微生物の数の比を表し、該用語は与えられた感染物中でどのくらいの接種物が使用されることになるかを詳述する。
【００２３】
“継代”などの用語は細胞培養物の一部を新鮮な培地に移すプロセスを意味する。
“初代細胞系”という用語は、限定された期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持されうる細胞系を意味する。
【００２４】
“懸濁液”という用語は細胞を培養するためのシステムを意味し、その中では単一細胞または細胞の凝集塊のいずれかとして培地中に細胞が浮遊する。
“スピナーフラスコ”という用語は、培養物を攪拌し、その中に含まれる細胞を懸濁液の状態で維持するためにパドル、プロペラ、攪拌棒、または他の手段を利用するフラスコまたは他の容器を意味する。
【００２５】
“感受性のある培養物”という用語は、免疫原が改変または変更されずに、微生物の抗原性マスが生み出されるように、組織培養物が特に選択され、クローニングされるか、または確立され、Ｌ．イントラセルラリス微生物を生育させ、微生物の免疫原を発現させることを意味する。
【００２６】
Ｌ．イントラセルラリスを生育させるために有用な感受性のある組織培養物は初代細胞系または継代細胞系のいずれかであってよく、そしてシュナイダー（ショウジョウバエ）細胞、昆虫細胞、昆虫幼生細胞、鳥類細胞、鳥類胚細胞、および鳥類卵子を含むがそれらに限定されない、多様な非哺乳動物細胞型を使用して確立することができる。一態様では、感受性のある組織培養物は、Ｓｆ９、ＳＦ２１、ＳＦ＋、およびＨｉ−Ｆｉｖｅ細胞のような昆虫細胞の培養物である。特定の態様では、感受性のある組織培養物はＳｆ９細胞の培養物である。別の態様では、感受性のある組織培養物は鳥類細胞、たとえばＣＥＶ−１鳥類細胞系の細胞の培養物である。
【００２７】
感受性のある組織培養物中でＬ．イントラセルラリス微生物を生育させるために多様なマトリックス条件が使用されうる。形態学的には、感受性のある組織培養物は懸濁液として、容器の内壁もしくは基質に係留した細胞シートとして、容器もしくは基質（マイクロキャリア）に接着したコンフルエントな単層として、または接着した細胞と懸濁細胞の混合した集団が存在する部分的接着細胞として生育されてもよい。係留システムは固定床（ｆｉｘｅｄ−ｂｅｄ）、微小流動床（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ）、ウェーブ（Ｗａｖｅ）リアクター、積層モジュール、またはエアリフト（ａｉｒ ｌｉｆｔ）であってもよい。感受性のある組織培養物を生育させるための容器は、培地を含み、組織培養物接着のために容器表面、ビーズ、または他の基質を使用する、フラスコ、Ｔフラスコ、スピナーフラスコ、ローラーボトル、セルトレイ、およびバイオリアクターでありうるが、それらに限定されない。
【００２８】
懸濁液中で感受性のある組織培養物を生育させる場合、容器は培地を含む、フラスコ、Ｔフラスコ、スピナーフラスコ、ウェーブリアクター、発酵器、およびバイオリアクターでありうるが、それらに限定されない。培地が混合されうるいずれのサイズの容器が使用されてもよいが、容器は一般に約５０ｍｌから約９００Ｌまでのサイズである。好ましくは、容器容量の（５０％）約１／３が培地を含むが、ヘッドスペースに対して他の割合の培地部分が使用されてもよい。感受性のある細胞は小規模（たとえば、約５０ｍｌから約１０Ｌまでの培地を含む容器）、大規模（たとえば、約１，０００Ｌから約１０，０００Ｌまでの培地を含む容器）、または中規模（たとえば、約１０Ｌから約１，０００Ｌまでの培地を含む容器）で生育させることができる。一態様では、約１００Ｌから約６００Ｌまでの培地を含む容器が使用される。別の態様では、約１００Ｌから約４００Ｌまでの培地を含む容器が使用される。さらに別の態様では、約１５０Ｌから約２５０Ｌまでの培地を含む容器が使用される。
【００２９】
懸濁液中で細胞を生育させる場合、細胞密度は一般に１ｍｌにつき約１００，０００から約１０，０００，０００細胞の範囲である。一態様では、細胞密度は１ｍｌにつき約２００，０００から約５，０００，０００細胞の範囲である。別の態様では、細胞密度は１ｍｌにつき約５００，０００から約１，５００，０００細胞の範囲である。懸濁システムでは、細胞は１分間に約２５から約２５０回転の速度で混合されうる。一態様では、細胞は１分間に約５０から約１５０回転の速度で混合される。別の態様では、それらは１分間に約８０から約１２０回転の速度で混合される。
【００３０】
係留システムで細胞を生育させる場合、細胞系の培養、およびＬ．イントラセルラリス増殖のための容器の一形態は積層モジュールシステムである。積層モジュールは約２１，０００ｃｍ２から約３４０，０００ｃｍ２までの表面積を有することができる。あるいは、使用に適した容器の他の形態には、約１５０ｃｍ２から約４２０ｃｍ２までの表面積を有していてもよいフラスコ、および約１７６０ｃｍ２の表面積を有していてもよいが、約８５０ｃｍ２から約４２５０ｃｍ２まで変動しうるローラーボトルが挙げられる。
【００３１】
係留システムで細胞を生育させる場合、細胞密度は一般に１ｃｍ２につき約１０，０００から約１，０００，０００細胞の範囲にある。一態様では、細胞密度は１ｃｍ２につき約２０，０００から約５００，０００細胞の範囲にある。別の態様では、細胞密度は１ｃｍ２につき約６０，０００から約２５０，０００細胞の範囲にある。係留システムでは、ローラーボトルは１時間につき約０．１から約１００回転の速度で回転させることができるが、セルトレイおよび固定床リアクターでは培地は容器の中を循環する。
【００３２】
細胞系の培養、およびＬ．イントラセルラリス増殖のために適切な培地処方は、使用される細胞の型に対して当業者に一般に公知の典型的な組織培養培地のいずれかであり得る。培地は一般に選択された培養細胞にとって必要な成長因子である、窒素源、およびグルコースまたはラクトースのような炭素源を含むことになる。細胞系を培養するための培地処方の限定的でないいくつかの例には、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４０５、ＴＮＭ−ＦＨ昆虫培養培地（Ｇｅｎｔａｕｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｂｖｂａ）、ＩＰＬ−４１昆虫培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）、Ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標）無血清細胞培養培地（（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）およびＬ−グルタミンを加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２ １：１）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、それらに限定されない。一態様では、細胞培養培地処方はＬ−グルタミンを加えた昆虫細胞のためのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０無血清培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。別の態様では、細胞培養培地処方はＬ−グルタミンを加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２ １：１）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【００３３】
細胞培養培地は動物由来成分の非存在下または存在下で使用することができる。使用することができる動物由来成分は最終濃度が０．５〜１０％の範囲のガンマ−照射血清である。そのような成分の例としてはＳＥＲ−ＴＡＩＮ（登録商標）プロセスによってガンマ照射された米国提供ウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。一般に、動物蛋白質を含まない培地は懸濁液で生育する昆虫細胞培養物にとって好ましいが、動物蛋白質を含む培地は係留システムで生育する昆虫細胞培養物にとって好ましい。
【００３４】
昆虫細胞系の培養、およびＬ．イントラセルラリスの増殖のための温度は一般に、約２０から約３９℃の範囲にある。別の態様では、温度は約２３から３４℃の範囲にあり、さらに別の態様では、範囲は約２５から約２９℃である。鳥類細胞系の培養、およびＬ．イントラセルラリスの増殖のための温度は一般に約２５から約４５℃の範囲にある。別の態様では、温度は約３０から４０℃の範囲にあり、さらに別の態様では、範囲は約３５から約３９℃である。
【００３５】
細胞系の培養、およびＬ．イントラセルラリスの増殖のための大気条件は好気性または微好気性であってよい。一態様では、細胞系は約１０％水素、約１０％ＣＯ２および約８０％窒素の混合物を含む微好気性条件で培養される。
【００３６】
Ｌ．イントラセルラリスの増殖の場合、細胞は選択された容器に播種（ｓｅｅｄ）される。容器は一般に１ｍｌにつき約１００，０００から約１０，０００，０００細胞の間で播種される。別の態様では、容器は一般に、１ｍｌにつき約２００，０００から約５，０００，０００細胞の間で播種される。０から約２０回まで継代されている細胞がＬ．イントラセルラリス微生物の増殖のために使用することができる。一態様では、約１０から約２０回まで継代されている細胞が増殖のために使用される。
【００３７】
細胞培養物は、初めに、細胞に細菌を感染させるためにＬ．イントラセルラリス菌を含む接種物を接種される。Ｌ．イントラセルラリスの接種物は、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）寄託番号５５６７２、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅ （ＮＣＴＣ，Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ，Ｌｏｎｄｏｎ）寄託番号１２６５６もしくは１２６５７（米国特許第５，８８５，８２３号を参照されたい）から、または当業者に公知の分離および精製技術を使用して感染したブタまたは他の動物から得られた、純粋な培養物でありうる。接種物の量は１ｍｌにつき約１００から約１，０００，０００の範囲のロウソニアコピーであってよい。特定の態様では、接種物の量は１ｍｌにつき約２００から約５００，０００の範囲のロウソニアコピーである。別の態様では、そのような量は１ｍｌにつき約４００から約２５０，０００の範囲のロウソニアコピーである。
【００３８】
細胞培養物は容器に細胞を播種したとき、または播種後約５日目までＬ．イントラセルラリス微生物を接種されうる。別の態様では、細胞培養物は播種後約２日目まで接種される。
【００３９】
感染多重度（ＭＯＩ）は、蛍光抗体染色法（ＦＡ）、間接蛍光抗体染色法（ＩＦＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む、当業者に公知の標準技術を使用して測定することができる。そのような技術の２種の限定的でない例としてはｑＲＴ−ＰＣＲおよびＴＣＩＤ５０が挙げられる。Ｌ．イントラセルラリスの増殖に対するＭＯＩは一般に定量リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して約０．０００００１から約１０の範囲にある。別の態様では、ＭＯＩはｑＲＴ−ＰＣＲを使用して約０．００００１から約１０の範囲にある。さらに別の態様では、ＭＯＩはｑＲＴ−ＰＣＲを使用して約０．０００１から約１０の範囲にある。
【００４０】
細胞培養物は、Ｌ．イントラセルラリス微生物の感染後所望する量のＬ．イントラセルラリスの生育が見出されるまで、一定期間（インキュベーション期間）インキュベーションされる。インキュベーション期間は一般にＬ．イントラセルラリス微生物を細胞培養物に接種後約５日から約２５日までの間で変化しうる。インキュベーション期間はまた、約５日から約１５日まで変化してもよい。昆虫細胞に対する特定の態様では、インキュベーション期間は約９日から約１３日まで変化する。鳥類細胞に対する別の態様では、インキュベーション期間は約３日から約１３日まで変化する。生育の量は当業者に公知の標準技術を使用して測定することができる。生育の量を評価するために使用することができる定量的アッセイの２種の例としては、定量リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）および５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）が挙げられる。
【００４１】
インキュベーション期間中、細胞培養物は所望する場合、新鮮な培地を補充されてもよい。これは一般に感染後約５日から約９日の間、または好ましくは感染後約６日から約８日の間に行われてもよい。細胞培養物はインキュベーション期間中、１回より多く補充されてもよく、補充の間は約３日から約９日である。
【００４２】
インキュベーション期間はまた、プロセスをスケールアップするためのステップを含んでいてもよい。たとえば、細胞培養物は小さな感染容器（たとえば約５Ｌのサイズ）に播種され、一定期間（約１週間）生育させることができる。培養物はその後より大きな容器（たとえば、約３０Ｌの大きさ）に移され、新鮮な培地を補充されてよい。このプロセスは所望する細胞培養物の量が得られるまで継続することができる。
【００４３】
インキュベーション期間後、培養物の一部またはすべてが採取される。採取プロセスは容器からの流動体の除去を必要とする。流動体はＬ．イントラセルラリスに加えて、細胞片または全部の組織培養細胞を含んでいてもよい。採取は当業者に公知の標準技術を使用して達成され、そのような技術は組織培養細胞を壊してＬ．イントラセルラリス微生物を放出させるための凍結−解凍ステップ、酵素もしくは界面活性剤による処理、または高圧による処理を含むがそれらに限定されない。その上、採取は遠心分離、連続流遠心分離、カラムクロマトグラフィー、限外濾過、デッドエンド深層濾過、または濾過のような当該技術分野で公知の技術を使用した、バルク生成物中の細胞片を伴った、または細胞片を伴わない濃縮を含んでいてもよい。たとえば、一態様では細胞は容器から採取され、そしてＰＣＲを使用して、Ｌ．イントラセルラリス細菌の収量を量る。
【００４４】
一例では、Ｌ．イントラセルラリス細菌は、懸濁液のすべてまたは一部の内容物を遠心分離して培養細胞をペレットにし、生じた細胞ペレットを再懸濁し、そして感染した細胞を溶解することにより採取される。細胞が係留システムで生育される場合、細胞は初めに破壊されて懸濁液を形成する。典型的には細胞および細菌をペレットにするために、少なくとも内容物の一部は約３０００ｘｇで約２０分間遠心分離される。その後ペレットは、たとえば新鮮な培地またはスクロース−リン酸―グルタミン酸（ＳＰＧ）溶液中に再懸濁され、細胞を溶解するために２５ゲージ針をおよそ４回通される。それ以上の精製が所望される場合、細胞核および細胞片を除去するために試料は約１４５ｘｇで約５分間遠心分離することができる。その後上清は約３０００ｘｇで約２０分間、遠心分離され、生じたペレットは、（凍結にとって、または接種物としての使用にとって適した採取細菌を調製するための）ウシ胎児血清を含む、または血清を含まない新鮮な培地もしくはＳＰＧ、または（新鮮な細胞への継代にいっそう適した、採取細菌を調製するための）生育培地のような適切な希釈剤に再懸濁されてもよい。
【００４５】
別の例では、連続流遠心分離を使用して培養細胞を集めてもよく、その後細胞内細菌を遊離させるためのホモゲナイゼーションステップが続く。
一態様では、本発明はＬ．イントラセルラリス種、たとえばＡＴＣＣ５５３７０ならびに類似の免疫原性特性を有するすべての系統およびその変異体によって引き起こされる増殖性回腸炎から保護するワクチンに関する。“免疫原性特性”は、増殖性回腸炎から動物、たとえばブタを保護するための能力を意味する。企図されたワクチンには、弱毒化ワクチン、不活性化ワクチン、改変生ワクチン、サブユニットワクチンおよび組換えワクチンが挙げられるが、それらに限定されない。本発明のワクチンは十分に高レベルの免疫原を生み出す場合、保護的および／または治療的であり、そしてアジュバント、安定化剤、および／または賦形剤を含んでいてもよい。Ｌ．イントラセルラリスの不活性化は好都合には微生物をＢＥＩ（バイナリーエチレンイミン）、ＢＰＬ（ベータ−プロピオラクトン）、ホルマリン、ホルムアルデヒド、加熱またはいずれか他の当該技術分野で公知の薬剤によって処理することによって達成することができる。企図されたアジュバントには、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（登録商標）、Ｐｏｌｙｇｅｎ（登録商標）、Ｃａｒｂｏｐｕｌ（登録商標）水酸化アルミニウム、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、イズコム（Ｉｓｃｏｍ）などが挙げられる。弱毒化ワクチンは、たとえば組織培養物中で連続継代することによって生産することができる。ワクチンはたとえば筋肉内、皮下、鼻腔内、蛍光、経皮または局所投与することができる。
【００４６】
本発明はまた、動物における増殖性回腸炎の存在を検出するための診断試験を企図する。従って、本発明は増殖性回腸炎を診断するか、または検出するために利用することができるモノクローナル抗体を提供する。
【００４７】
当業者は、先の説明を使用して本発明を最も完全な程度にまで実行することができると考えられる。本発明はさらに以下の詳細な実施例によって例証されるが、それらは例証のためだけに提供され、いずれのやり方においても先の開示を限定するものと解釈するべきではない。以下に続く実施例で利用されるロウソニア・イントラセルラリスは病原性であっても、非病原性であってもよい。
【実施例】
【００４８】
実施例１．温度および大気条件を変化させるＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験
［目的］ この実験の目的は、摂氏（Ｃ）２７°（自然の昆虫温度）対３７℃において、およびＣＯ２対特殊気体雰囲気条件下で、Ｓｆ９（スポドプテラ・フルギペルダ）細胞系を使用してロウソニア・イントラセルラリスの生育を評価することであった。
【００４９】
［材料と方法］
【００５０】
【表１】
【００５１】
細胞および培地情報。細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育培地はＬ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１４４２０、項目番号１４４２０−１０００Ｍ）であった。種培養物には改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌が含まれた。
【００５２】
細胞数および播種情報。１ｍｌにつき４．５４ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む３００−ｍｌ保存懸濁液が使用された。４日齢の細胞が１０００−ｍｌスピナーフラスコに移された。全部で２２２ｍｌの新鮮な培地がそれぞれのスピナーフラスコに注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（保存懸濁液２７．５ｍｌ）が培地に播種され、およそ全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。
【００５３】
変数の説明。
【００５４】
【表２】
【００５５】
容器の形状。すべての容器は、深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。容器１および２の場合、温度は２７℃に維持された。容器３および４の場合、温度は３７℃に維持された。すべての容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。容器１および３の特殊気体雰囲気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターにより濾過された、１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後、容器は鉗子で閉じられた。５％ＣＯ２環境で維持された容器２および４は、鉗子で閉じない０．１μｍフィルターハウジングを有した。それゆえ、フィルターハウジングを通して、５％ＣＯ２環境と自由な気体交換が起こりえた。
【００５６】
感染。Ｓｆ９細胞は容器に播種されてから１日後（１日目）に感染した。種培養物は１：２０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌１２．５ｍｌ）で容器に導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【００５７】
培地補充。すべての容器は容器にＳｆ９細胞を播種後８日目に２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０を補充された。
採取。試料は容器にＳｆ９細胞を播種後、０、１、４、７、８（補充前）、９、１０、１１、１４、１５、および１７日目に採取された。播種後１１日目に、試料は容器３および４から得られた。細胞生存能力および細胞密度が非常に低かったため、それ以上の試料は採取されず、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。播種後１７日目に、試料は容器１および２から得られ、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。
【００５８】
［結果］ Ｓｆ９細胞は３７℃でよりも２７℃でよく生育した（表１を参照されたい）。ロウソニア・イントラセルラリスは２７℃および特殊気体（微好気性）条件の環境において、ならびにＣＯ２条件下（しかし、微好気性が優れていた）で生育した（表２を参照されたい）。
【００５９】
【表３】
【００６０】
【表４】
【００６１】
実施例２．温度、血清の存在、感染多重度（ＭＯＩ）およびロウソニア・イントラセルラリスの継代を変化させるＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験。
［目的］ この実験の目的は２７℃対３２℃においてＳｆ９（スポドプテラフルギペルダ）細胞系を使用したロウソニア・イントラセルラリスの生育を評価することであった。該目的はまた、２７℃対３２℃における５％血清の添加の影響を評価することであった。それはまた、２７℃対３２℃における感染多重度（ＭＯＩ）を増加させる影響を評価することであった。最後に、該目的は２７℃でのＳｆ９細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの２回目の継代を評価することであった。
【００６２】
［材料と方法］
【００６３】
【表５】
【００６４】
細胞および培地情報。細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育および維持培地はＬ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１４４２０、項目番号１４４２０−１０００Ｍ）であった。血清を含む容器のための生育および維持培地は、ＳＥＲ−ＴＡＩＮ（登録商標）プロセスによってガンマ照射された米国提供５％ウシ胎児血清を含む、Ｌ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１２１０７、項目番号１２１０７−１０００Ｍ）であった。種培養物には改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌が含まれた。
【００６５】
細胞数および播種情報。１ｍｌにつき５．２０ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む３００−ｍｌ保存懸濁液が使用された。３日齢の細胞が１０００−ｍｌスピナーフラスコに移された。全部で２２６ｍｌの新鮮な培地がそれぞれのスピナーフラスコに注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（保存懸濁液２４ｍｌ）が培地に播種され、およそ全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。
【００６６】
変数の説明。
【００６７】
【表６】
【００６８】
容器の形状。すべての容器は深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。容器１、３、５、および７の場合、温度は２７℃に維持された。容器２、４、および６の場合、温度は３２℃に維持された。すべての容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。すべての容器中の培地上方の大気は特殊気体であった。容器中の大気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターを通して濾過された、１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後容器は鉗子で閉じられた。
【００６９】
感染。Ｓｆ９細胞は容器に播種（０日目）された時に感染した。種培養物は１：４０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌６．２５ｍｌ）の比で容器１、２、３および４に導入された。種培養物はおよそ１：１１．４の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌２２ｍｌ）の比で容器５および６に導入された。種培養物は容器７に導入されなかった。正確に言えば、上記の実施例１の容器１から播種後１７日目に採取された試料３５．７ｍｌが（接種物対容器播種容量１：７の比で）容器７に導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【００７０】
培地補充。すべての容器は容器にＳｆ９細胞を播種後６日目に、２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０または２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０プラスウシ胎児血清を適宜補充された。
【００７１】
採取。試料は容器にＳｆ９細胞を播種後、０、１、４、６（補充前）、８、１１、１３、１５、１８、および２０日目に採取された。２０日目の試料を容器２、４、６、および７から得た後、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。試料は２５日目に容器１、３、および５（それらは２７℃に維持された）から採取され、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。
【００７２】
［結果］ Ｓｆ９細胞は３２℃でよりも２７℃でよく生育した（表３を参照されたい）。表４で認められるように、ロウソニアは、実施例１の接種物（すなわち継代２回目）を接種された容器７の場合を除いてすべての条件で生育した。これはおそらく実施例１に由来する生育不能な接種物に起因する。一般に、ロウソニアは２７℃で、血清を含まずに生育させる場合、より高いレベルの生育を成し遂げた。高いＭＯＩを使用した場合、最高の１ｍｌ毎のロウソニアコピーが観察されたが、収量の逓減があるように見える（すなわち、より高いＭＯＩでの４６倍の収量に比較して、より低いＭＯＩでは投資の１００倍の収量が認められた−表５を参照されたい）。ロウソニアは３２℃に維持した場合生育した；しかし、これらの感染物はロウソニアを速やかに生産することを特徴とするが、強い生育を維持することを特徴としなかった。
【００７３】
【表７】
【００７４】
【表８】
【００７５】
【表９】
【００７６】
実施例３．温度、感染多重度（ＭＯＩ）、および培地の補充を変化させる、温度適応を評価する、ならびに種々の採取時点でのＳｆ９細菌種菌を生み出すＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験。
【００７７】
［目的］ この実験の目的は、Ｓｆ９（スポドプテラフルギペルダ）細胞系を使用して、摂氏（Ｃ）２７°、２９．５℃、および３２℃でロウソニア・イントラセルラリスの生育を評価することであった。該目的はまた、２７℃で感染多重度（ＭＯＩ）を変化させる影響を評価することであった。それはまた、２７℃における種々の時点での反復した補充を評価することであった。該目的はまた、２７℃から２９．５℃まで、その後３２℃までのＳｆ９細胞の温度適応の評価を含んだ。それはまた、０〜６日の間の３２℃でのロウソニア・イントラセルラリスの生育、その後６日から完了までの間の２９．５℃での生育の評価を含んだ。最後に、該目的は後の接種のために種々の採取時点でロウソニア・イントラセルラリス種菌を生み出し、継代実行可能性を確証することであった。
【００７８】
［材料と方法］
【００７９】
【表１０】
【００８０】
細胞および培地情報。３種の細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育および維持培地はＬ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１４４２０、項目番号１４４２０−１０００Ｍ）であった。種培養物は改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌を含んだ。
【００８１】
細胞数および播種情報。保存溶液が使用された。第１の溶液は、１ｍｌにつき３．９９ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む、２７℃に維持された３００−ｍｌ保存懸濁液であった（８７．３％の生存能力）。第２の溶液は、１ｍｌにつき１．９６ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む、２９．５℃に維持された３００−ｍｌ保存懸濁液であった（７７．６％の生存能力）。第３の溶液は、１ｍｌにつき０．９ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む、３２℃に維持された３００−ｍｌ保存懸濁液であった（５２．８％の生存能力）。３日齢の細胞が１０００−ｍｌスピナーフラスコに移された。全部で２１９ｍｌの新鮮な培地がスピナーフラスコ番号１〜４に注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（２７℃の保存懸濁液３１．０ｍｌ）が培地に播種され、全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。全部で１８６ｍｌの新鮮な培地がスピナーフラスコ番号５および６に注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（２９．５℃の保存懸濁液６４．０ｍｌ）が培地に播種され、全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。全部で１１２ｍｌの新鮮な培地がスピナーフラスコ番号７に注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（３２℃の保存懸濁液１３８．０ｍｌ）が培地に播種され、全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。
【００８２】
【表１１】
【００８３】
容器の形状。すべての容器は深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。容器１、２、３、および４の場合、温度は２７℃に維持された。容器５の場合、温度は２９．５℃に維持された。容器６の場合、親培地の温度は２９．５℃であった。それは０日に３２℃にまで上げられ、０日〜６日までこの温度を維持され、その後６日から２４日まで２９．５℃に下げられた。容器７の場合、温度は３２℃に維持された。容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。すべての容器中の培地上方の大気は特殊気体であった。容器中の大気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターを通して濾過された、１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後、器は鉗子で閉じられた。
【００８４】
感染。Ｓｆ９細胞は容器に播種（０日）された時に感染した。種培養物は１：４０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌６．２５ｍｌ）の比で容器１、４、５、６、および７に導入された。種培養物はおよそ１：１６０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌１．５６ｍｌ）の比で容器２に導入された。種培養物はおよそ１：６４０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌０．４ｍｌ）の比で容器３に導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【００８５】
培地補充。容器１、２、３、４、５、６、および７は容器にＳｆ９細胞を播種後６日目に、２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０を補充された。容器４の場合、容器にＳｆ９細胞を播種後１３および１９日目に、２５０ｍｌの細胞培養物が空の１０００ｍｌ容器に移され、付加的なＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０を２５０ｍｌ補充された。
【００８６】
採取。試料は容器にＳｆ９細胞を播種後、０、３、５、６（補充前）、７、１０、１３、１７、１９、２０、２４および２７日目に採取された。しかし、２０、２４および２７日目には容器７から採取されなかった。容器４の場合、２５ｍｌの培地および細胞が６、１３、１９および２４日目（６、１３、および１９日目の培地の補充前）に採取され、凍結された。容器７から１９日目の試料、および容器１〜６から２７日目の試料を得た後、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。
【００８７】
［結果］ 容器１および容器４の条件は容器４が１３日目および１９日目に付加的に補充されたことを除いて同様であった。細胞密度および生存能力（表６および７を参照されたい）によって測定されるように、この付加的な補充により、より健康なＳｆ９細胞、およびロウソニア収量のより高い全体的増加を生じた（表８を参照されたい）。ロウソニアの収量の増加は、２７℃に維持された容器１〜４で達成された。
【００８８】
容器１、５、６、および７の条件は、親細胞の温度および／またはロウソニア生育中の温度を除いて同様であった。ロウソニア増殖は、３２℃で実施された場合（容器６）、初期の感染期間（０〜６日）の間促進された。このことは、おそらく感染時でのＳｆ９の低い生存能力（５０％）に起因して、容器７では再現されなかった。従って、２７℃でのロウソニアの増殖は最大生育を達成するためにはより長い時間がかかるが、より多い総収量が達成された。
【００８９】
【表１２】
【００９０】
【表１３】
【００９１】
【表１４】
【００９２】
【表１５】
【００９３】
実施例４．採取日を変化させることによる、試料のロウソニア・イントラセルラリス細菌生育およびロウソニア・イントラセルラリス温度適応を評価するＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験。
【００９４】
［目的］ この実験の目的は、摂氏（Ｃ）２７°でのＳｆ９（スポドプテラフルギペルダ）細胞系の感染後、４種の異なる時点で採取されたロウソニア・イントラセルラリス細菌の生育を評価すること、およびＳｆ９細胞中で増殖したロウソニアが新規なＳｆ９細胞培養物に再感染できることを保証することであった。該目的はまた、３２℃での０〜６日の間のロウソニア・イントラセルラリス細菌の生育、その後２７℃での６日から完了までの間の生育を評価することであった。
【００９５】
［材料と方法］
【００９６】
【表１６】
【００９７】
細胞および培地情報。細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育および維持培地はＬ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１４４２０、項目番号１４４２０−１０００Ｍ）であった。改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌を含む種培養物は実施例３の間に得られた。先に記載のように、２５ｍｌの試料が６、１３、１９および２４日目に容器４から採取され、−８０℃で凍結された。細胞数および播種情報。１０００Ｌスピナーフラスコ中に２７℃で維持された３００−ｍｌ保存懸濁液が使用された。播種後６日目において容器はＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地中、１ｍｌにつき６．４ｘ１０６のＳｆ９細胞（９９．７％の生存能力）を含んだ。６日齢の細胞が５個の新規な５００−ｍｌスピナーフラスコに移された。全部で２３０．５ｍｌの新鮮な培地がそれぞれのスピナーフラスコに注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（保存懸濁液１９．５ｍｌ）が培地に播種され、全容量２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。
【００９８】
変数の説明。
【００９９】
【表１７】
【０１００】
容器の形状。すべての容器は深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。容器１、２、３、および４の場合、温度は２７℃に維持された。容器５の場合、温度は０〜６日まで３２℃に維持され、その後６〜２９日まで２７℃に下げられた。すべての容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。すべての容器中の培地上方の大気は特殊気体であった。容器中の大気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターを通して濾過された１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後、器は鉗子で閉じられた。
【０１０１】
感染。すべての容器に対して、Ｓｆ９細胞は容器に播種（０日目）された時に感染した。感染時において、ロウソニア・イントラセルラリス細菌による感染多重度（ＭＯＩ）は実施例３のｑＲＴ−ＰＣＲの結果を使用して計算された。
【０１０２】
【表１８】
【０１０３】
目標感染量は容器毎にＬ．イントラセルラリス３．１５ｘ１０８コピーであった。容器１は２５．０ｍｌの６日目の種菌（３．１５ｘ１０８コピー／１．２６ｘ１０７コピー／ｍｌ）に感染した。容器２および５は３．３ｍｌの１３日目の種菌（３．１５ｘ１０８コピー／９．６ｘ１０７コピー／ｍｌ）に感染した。容器３は１９日目の種菌（３．１５ｘ１０８コピー／５．０ｘ１０７コピー／ｍｌ）６．３ｍｌに感染した。容器４は２４日目の種菌（３．１５ｘ１０８コピー／２．６ｘ１０７コピー／ｍｌ）１２．１ｍｌに感染した。
【０１０４】
培地補充。容器にＳｆ９細胞を播種後６日目に、すべての容器は２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０を補充された。
採取。試料は容器にＳｆ９細胞を播種後、０、３、６（補充前）、８、１０、１４、１７、２１、２５および２９日目に採取された。しかし、細胞数が少なかったため、２９日目の容器５から試料は採取されなかった。容器５から２５日目の試料、および容器１〜４から２９日目の試料を得た後、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。
【０１０５】
［結果］ 結果は、以前に昆虫細胞で継代されたロウソニアが採取されて、新規な昆虫細胞を感染させるために使用されうることを実証する（表１０、１１、および１２を参照されたい）。２４日目の種菌の６７倍の増加は、より初期の実施例で使用された新鮮な種菌に対して観察されている８０〜１００倍の収量に匹敵する。初期ロウソニア増殖バーストは、３２℃で始まり、２７℃に変更された培養物で観察されたが、これらの培養物は実験全体に対して２７℃に維持された培養物で観察された生育レベルを維持しなかった。最後に、６、１３、１９および２４日目の種菌の標準化された感染が“同一の”収量増加を達成しなかった理由は不明である。
【０１０６】
【表１９】
【０１０７】
【表２０】
【０１０８】
【表２１】
【０１０９】
実施例５．分析のために、培地の型、感染多重度（ＭＯＩ）、および感染Ｓｆ９細胞対非感染Ｓｆ９細胞を比較するＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験。
［目的］ この実験の目的は、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地またはＩＰＬ−４１培地のいずれかにおけるＳｆ９（スポドプテラフルギペルダ）細胞系を使用したロウソニア・イントラセルラリスの生育を比較することであった。該目的はまた、およそ３１用量でのＳｆ９細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの感染多重度（ＭＯＩ）を評価することであった。最後に、該目的は、生化学的分析および質量分析中に、Ｓｆ９陰性対照（非感染細胞）とロウソニア・イントラセルラリスに感染したＳｆ９細胞を比較することであった。
【０１１０】
［材料と方法］
【０１１１】
【表２２】
【０１１２】
細胞および培地情報。細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育および維持培地はＬ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１４４２０、項目番号１４４２０−１０００Ｍ）であった。コンパレータ（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）生育および維持培地はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｉ７７６０；ロット番号７５Ｋ２３７０のＩＰＬ−４１昆虫培地であった。種培養物は改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌を含んだ。
【０１１３】
細胞数および播種情報。２種の保存溶液が使用された。第１の溶液は、ＩＰＬ−４１培地中、１ｍｌにつき３．１８ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む、２７℃で維持された３００−ｍｌ保存懸濁液であった（９１．４％の生存能力）。第２の溶液は、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地中、１ｍｌにつき１．７８ｘ１０６のＳｆ９細胞を含む、２７℃に維持された３００−ｍｌ保存懸濁液であった（９７．８％の生存能力）。６日齢の細胞が５００−ｍｌスピナーフラスコに移された。全部で１７９．８ｍｌの新鮮なＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地がスピナーフラスコ番号１および２に注がれ、１．２５ｘ１０８細胞（Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０保存懸濁液７０．２ｍｌ）が培地に播種され、全容量およそ２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。全部で２１０．７ｍｌの新鮮なＩＰＬ−４１培地がスピナーフラスコ番号３および４に入れられ、１．２５ｘ１０８細胞（ＩＰＬ−４１保存懸濁液３９．３ｍｌ）が培地に播種され、全容量およそ２５０ｍｌ、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌとなった。
【０１１４】
変数の説明。
【０１１５】
【表２３】
【０１１６】
容器の形状。すべての容器は深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。温度はすべての容器に対して２７℃に維持された。容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。容器１および３の大気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターを通して濾過された、１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後、器は鉗子で閉じられた。周囲条件のままにしておく容器２および４は、鉗子で閉じられない０．１μｍフィルターハウジングを有した。それゆえ通常の大気条件下で、フィルターハウジングを通して自由な気体交換が起こりえた。
【０１１７】
感染。容器１および３の場合、Ｓｆ９細胞は容器に播種された時（０日、０時）に感染した。種培養物は１：４０の容器播種容量（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌６．２５ｍｌ）の比で導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【０１１８】
培地補充。容器１と２は容器にＳｆ９細胞を播種後７日目に、２５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０を補充され、容器３と４はＩＰＬ−４１を補充された。
採取。試料は容器にＳｆ９細胞を播種後、０、３、４、７（補充前）、９、１１、および１４日目に採取された。容器から１４日目の試料を得た後、容器内容物の残余は大きなプラスチック容器に分注され、マイナス８０℃で凍結された。
【０１１９】
［結果］ Ｓｆ９細胞はＩＰＬ−４１培地に比較してＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地において有意によく生育した（表１３を参照されたい）。ロウソニア・イントラセルラリスは両方の培地で培養することが可能であった（表１４および１５を参照されたい）が、ＩＰＬ−４１培地に対し、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０培地においてより高い収量が得られた（２１２倍対４．４倍）。
【０１２０】
【表２４】
【０１２１】
【表２５】
【０１２２】
【表２６】
【０１２３】
実施例６．密度を変化させたフラスコ中のＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験
［目的］ この実験の目的は、係留システムにおいて、３種の異なる密度で播種されたＳｆ９（スポドプテラフルギペルダ）細胞系を使用してロウソニア・イントラセルラリスの生育を比較することであった。
【０１２４】
［材料と方法］
【０１２５】
【表２７】
【０１２６】
細胞および培地情報。細胞培養物はＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。生育および維持培地は、ＳＥＲ−ＴＡＩＮ（登録商標）プロセスによってガンマ照射された米国提供５％ウシ胎児血清を含む、Ｌ−グルタミンを加えたＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）４２０昆虫用無血清培地（ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１２１０７、項目番号１２１０７−１０００Ｍ）であった。種培養物には改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌を含んだ。種培養物は元のワクチンのサブアリコートであった。
【０１２７】
細胞数および播種情報。
【０１２８】
【表２８】
【０１２９】
プロセスパラメータ。温度はすべての容器に対して２７℃に維持された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。容器１から４までにおいて特殊気体雰囲気を確立する場合、７５ｃｍ２フラスコはＢＢＬ（登録商標） ＧａｓＰａｋ（登録商標） Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に入れ、容器は密閉された。その後該容器は真空にされ、１０％ＣＯ２、１０％水素および８０％窒素で再び満たした。拡散を防ぐために、気体を満たした後、器は鉗子で閉じられた。
【０１３０】
感染。Ｓｆ９細胞は容器に播種後２時間未満、感染した。種培養物は１：４０の容器播種容量（すなわち、容量５０ｍｌにつき種菌１．２５ｍｌ）の比で導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【０１３１】
培地補充。この実験中、培地は補充されなかった。
採取。Ｓｆ９細胞を容器に播種後０、７、１０、および１３日目に試料が採取された。
［結果］ 評価されたＳｆ９細胞密度のそれぞれはロウソニア・イントラセルラリスの有意な生育をもたらした（表１６を参照されたい）。２Ｅ＋７、１Ｅ＋７、および５Ｅ＋７細胞密度で播種された容器はそれぞれ、１５．３、２４．５および２７．９倍の増加をもたらした。
【０１３２】
【表２９】
【０１３３】
実施例７．大気条件を変化させた鳥類細胞におけるＰＰＥ伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）実験
［目的］ この実験の目的はＣＥＶ−１鳥類細胞系を使用して、ＣＯ２対特殊気体雰囲気条件下での摂氏（Ｃ）３７°のロウソニア・イントラセルラリスの生育を評価することであった。
【０１３４】
［材料と方法］
【０１３５】
【表３０】
【０１３６】
細胞および培地情報。ＣＥＶ−１細胞はＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．において維持された保存培養物から得られた。生育および維持培地は、ＳＥＲ−ＴＡＩＮ（登録商標）プロセスによってガンマ照射された米国提供１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡカタログ番号１２１０７，項目番号１２１０７−１０００Ｍ）を含む、Ｌ−グルタミンを加えたＤＭＥＭ：Ｆ１２ １：１（Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ；カタログ番号２１０４１−０２５）であった。種培養物は改変された、非病原性ロウソニア・イントラセルラリス生菌を含んだ。
【０１３７】
細胞数および播種情報。１ｍｌにつき２．７ｅ６のＣＥＶ−１細胞を含む２０−ｍｌ保存懸濁液が使用された。親細胞（継代前）は４日齢であった。０日齢の細胞は５００−ｍｌのスピナーフラスコに移した。全部で２４０ｍｌの新鮮な培地がそれぞれのスピナーフラスコに注がれ、２．５ｅ７細胞（保存懸濁液１０ｍｌ）が培地に播種され、全容量およそ２５０ｍｌ、１００，０００細胞／ｍｌとなった。
【０１３８】
変数の説明。
【０１３９】
【表３１】
【０１４０】
容器の形状。すべての容器は深さの８０％までの１つの固定長のドロップチューブと０．１μｍ滅菌フィルターのついた２ポートＳＳＴアセンブリーにより形成された。
プロセスパラメータ。両方の容器に対して、温度は３７℃に維持された。両方の容器は１００ｒｐｍで攪拌された。酸素（Ｏ２）レベルは可変であった。ｐＨレベルはモニターされないか、または管理された。容器１における特殊気体雰囲気を確立する場合、容器は、汚染を防ぐために０．１μｍのフィルターを通して濾過された、１０％水素、１０％ＣＯ２および８０％窒素を含む特殊気体を散布された。培地２５０ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を１分間であった。培地５００ｍｌに対して散布速度は５〜１０ｃｃ／秒を２分間であった。拡散を防ぐために、気体を満たした後、容器は鉗子で閉じられた。５％ＣＯ２環境で維持される容器２は、鉗子で閉じられない０．１μｍフィルターハウジングを有した。それゆえ、フィルターハウジングを通して、５％ＣＯ２環境と自由な気体交換が起こりえた。
【０１４１】
感染。ＣＥＶ−１細胞は容器に播種された後（１日目）２４時間感染した。種培養物は１：２０の容器播種容量の比（すなわち、容量２５０ｍｌにつき種菌１２．５ｍｌ）で容器に導入された。感染多重度（ＭＯＩ）は測定されなかった。
【０１４２】
培地補充。すべての容器は容器にＣＥＶ−１細胞を播種後８日目に２５０ｍｌのＤＭＥＭ Ｆ１２ １０％ＩＦＢＳを補充された。
採取。試料は容器にＣＥＶ−１細胞を播種後、１、４、７、８（補充前および補充後の両方）、９、１０、１１、および１４日目に採取された。
【０１４３】
［結果］ ＣＥＶ−１細胞は細胞密度および生存能力によって測定されたように、この研究の条件下でよく生育した（表１７および１８を参照されたい）。ロウソニア・イントラセルラリスは３７℃の環境および特殊気体（微好気性）条件においてＣＥＶ−１鳥類細胞中で生育した（表１９を参照されたい）。特殊気体中で維持されたＣＥＶ−１細胞は、容器へのＣＥＶ−１細胞の播種後１〜１４日までに７．９倍の増加を生じた。ＣＯ２環境中で維持された培養物はこの同じ期間中にロウソニア・イントラセルラリスの増加を生じなかった。
【０１４４】
【表３２】
【０１４５】
【表３３】
【０１４６】
【表３４】
【０１４７】
本明細書に開示され、主張された方法はすべて本開示の観点から過度な実験をせずに計画し、実行することができる。本発明の方法は異なる態様の見地から記載されているが、本発明の概念、意図および範囲から逸脱せずに、本明細書に記載の方法に対して、ならびに方法のステップまたはステップの順序において変形が適用されてもよいことは、当業者には明らかであろう。より明確には、同じかまたは類似の結果が達成される限り、化学的および生理学的の両方に関連するある種の作用物質が、本明細書に記載の作用物質と交換されてもよいことは明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代替物および改変のすべては、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の意図、範囲および概念の範囲内であると見なされる。
実施例８．Ｓｆ−２１昆虫細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの培養
［材料と方法］ グレース（Ｇｒａｃｅ）昆虫細胞培地（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１６０５−０９４）の一瓶を使用前に３０分間、２７℃に温めた。１ｍｌにつき１０６のＳｆ−２１細胞を含む１ｍｌのクライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）が得られ、凍結した懸濁物がすべて消失したことを確実にするために、３７℃で１５分間解凍された。細胞懸濁物のためのグレース培地中１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＪＲＨ カタログ番号１２１０３−５００Ｍ）プラス１％のＬ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔ；Ｇｉｂｃｏ カタログ番号２５０３０−０８１）。
【０１４８】
細胞を含むクリオバイアルは解凍されると、内容物は１０ｍｌのグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔに再懸濁され、８００ｒｐｍで５分間遠心分離されて、細胞からＤＭＳＯ凍結溶液が除去された。完了後、上清溶液は除去され、廃棄され、その後細胞は１０ｍｌのグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔに静かに再懸濁された。
【０１４９】
再懸濁された細胞１０ｍｌすべてはＣｏｒｎｉｎｇ Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ（カタログ番号４３０６４１；ベントキャップ（ｖｅｎｔ ｃａｐ））に移され、グレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔをさらに５ｍｌ添加して、培養フラスコ中の容量を１５ｍｌにした。フラスコは２７℃で１時間インキュベーションされ、グレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔを完全に再供給された。該プロセスは、死細胞または非接着Ｓｆ−２１細胞をいずれも除去することを意味した。生じた単層は、その日の終わりまでにはおよそ４０〜４５％に達した。このプロセスは１回目のフラスコ再供給後もう１回１時間繰り返された。
【０１５０】
Ｓｆ−２１細胞が対数増殖期（８０〜９５％コンフルエント単層）に到達するには４８時間かかった。この時点で細胞は上清培地で静かに洗浄された。培地および細胞は１，０００ｇで５分間遠心分離され、その後上清培地は廃棄され、その後の増殖のためにグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔ５ｍｌの中に細胞を静かに再懸濁した。
【０１５１】
生じた細胞懸濁液はグレース培地中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔ２５ｍｌの中に希釈され、２つのＴ−７５ｃｍ２培養フラスコに分割された。フラスコは再び２７℃で１時間インキュベーションされ、その後以前と同じ培地調製物を再供給され、再び生存可能でない細胞または死細胞をいずれも除去した。該プロセスは１時間後に再び繰り返され、細胞は少なくとも４時間妨害されずにインキュベーションされ、その後感染した。
【０１５２】
感染することになるＴ−７５ｃｍ２フラスコ毎に上清ロウソニア・イントラセルラリス（１０５〜１０６Ｌｉ／ｍｌ）を含むクリオバイアル１個が３７℃で解凍された。１つのフラスコは細胞増殖のために保持され、他の１つはＬｉによる感染のために使用された。
【０１５３】
クリオバイアルは完全に解凍されると、およそ２０〜３０％コンフルエントなＳｆ−２１細胞の単層に添加された。好ましい感染時点は感染していないＳｆ−２１細胞の２回目の再供給後４〜６時間であった。
【０１５４】
それぞれ感染したフラスコは５００ｍｍＨｇにまで減圧し、およそ３０秒間１００％Ｈ２で満たし、その後２７℃のインキュベーターに移した。Ｓｆ−２１昆虫細胞の分裂サイクルはおよそ４８〜６０時間であり、結果として培養物は増殖するか、そのような時期に分裂を停止する。感染後４０〜４２時間頃のある時点で、Ｓｆ−２１細胞の感染率を評価するためにＳｆ−２１細胞単層ははがされ、以下のＩＰＸ（モノクローナルまたはポリクローナル）染色技術に従って染色された。
【０１５５】
実施例９．単層生育に適応したＳｆ−２１昆虫細胞におけるロウソニア・イントラセルラリスの培養
［材料と方法］ 約１０６のＳｆ−２１細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＪＲＨ カタログ番号１２１０３−５００Ｍ）プラス１％のＬ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔ；Ｇｉｂｃｏ カタログ番号２５０３０−０８１）を含む１０ｍｌのグレース昆虫細胞培地（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１６０５−０９４）に添加された。再懸濁された細胞１０ｍｌすべてはＣｏｒｎｉｎｇ Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ（カタログ番号４３０６４１；ベントキャップ）に移され、付加的な５ｍｌのグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔを添加して、培養フラスコ中の容量を１５ｍｌにした。フラスコは２７℃で１時間インキュベーションされ、１５ｍｌのグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔを完全に再供給し、死細胞または非接着Ｓｆ−２１細胞をいずれも除去した。
【０１５６】
Ｓｆ−２１細胞が対数増殖期（８０〜９５％コンフルエント単層）に到達するには４８時間かかった。この時点で細胞は上清培地で静かに洗浄された。培地および細胞は１，０００ｇで５分間遠心分離され、続いて上清培地は廃棄され、その後の増殖のために５ｍｌのグレース中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔの中に細胞を静かに再懸濁した。
【０１５７】
生じた細胞懸濁液はグレース培地中１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔ２５ｍｌにまで希釈され、２つのＴ−７５ｃｍ２培養フラスコに分割された。フラスコは再び２７℃で１時間インキュベーションされ、再び以前と同じ培地を注がれ、再び生存可能でない細胞または死細胞をいずれも除去した。該プロセスは１時間後に再び繰り返され、細胞は少なくとも４時間妨害されずにインキュベーションされ、その後感染した。
【０１５８】
上清ロウソニア・イントラセルラリス（１０５Ｌｉ／ｍｌ）を含むクリオバイアル１個は感染することになるＴ−７５ｃｍ２フラスコ毎に３７℃で解凍された。クリオバイアルは完全に解凍されると、およそ２０〜３０％コンフルエントなＳｆ−２１細胞の単層に添加された。好ましい感染時点は非感染Ｓｆ−２１細胞の２回目の再供給後４〜６時間であった。
【０１５９】
それぞれ感染したフラスコは５００ｍｍＨｇにまで減圧し、およそ３０秒間１００％Ｈ２で満たし、その後２７℃のインキュベーターに移した。感染後４０〜４２時間頃の時点でＳｆ−２１細胞の感染率を評価するために、Ｓｆ−２１細胞単層ははがされ、ＩＰＸ（モノクローナルまたはポリクローナル）染色技術に従って染色された。
【０１６０】
［結果］ 約１０〜１５％のＳｆ−２１単層は、細胞毎に３０より多いＬｉに感染し、Ｔ−７５フラスコ毎に約１０６〜１０７のＬｉを生じた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａからｄを含む、非哺乳動物細胞においてロウソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を生育させるための方法：
ａ．適切な培地を含む容器に細胞を播種すること；
ｂ．該細胞にＬ．イントラセルラリスを接種すること；
ｃ．接種された細胞を生育させること；および
ｄ．Ｌ．イントラセルラリスを採取すること。
【請求項２】
細胞が昆虫細胞、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）細胞、および鳥類細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記昆虫細胞がＳｆ９細胞、ＳＦ２１細胞、ＳＦ＋細胞、Ｈｉ−Ｆｉｖｅ細胞、または昆虫幼生細胞から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞がＳｆ９昆虫細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記鳥類細胞がＣＥＶ−１細胞または鳥類胚細胞から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
培地が動物蛋白質を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培地が動物蛋白質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生育が約２０℃から約３９℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が昆虫細胞であり、そして生育が約２５℃から約２９℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が鳥類細胞であり、そして培養が約３５℃から約３９℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
容器が微好気性または好気性条件を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
微好気性条件が約１０％水素、約１０％ＣＯ２および約８０％窒素からなる気体の混合物を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
定量リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって測定される感染多重度（ＭＯＩ）が約０．０００００１から約１０までである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用するＭＯＩが約０．０００１から約１０までである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞にＬ．イントラセルラリスを接種後、Ｌ．イントラセルラリスが約５日から約２５日まで採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞にＬ．イントラセルラリスを接種後、Ｌ．イントラセルラリスが約９日から約１５日まで採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が１ｍｌにつき約１００，０００から約１０，０００，０００細胞までの密度で播種される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が１ｍｌにつき約５００，０００細胞から１ｍｌにつき約１，５００，０００細胞までの密度で播種される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
培地が動物蛋白質を含まない、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が約１０，０００から約１，０００，０００までの密度で播種される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞が１ｃｍ２につき約６０，０００から約２５０，０００細胞までの密度で播種される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
培地が動物蛋白質を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
動物蛋白質が約０．５％から約１０％までの濃度で存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
接種された細胞が少なくとも２から３リットルの容量の培地で生育される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
接種された細胞が少なくとも１００リットルの容量の培地で生育される、請求項２４に記載の方法。
【請求項１】
以下のａからｄを含む、非哺乳動物細胞においてロウソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を生育させるための方法：
ａ．適切な培地を含む容器に細胞を播種すること；
ｂ．該細胞にＬ．イントラセルラリスを接種すること；
ｃ．接種された細胞を生育させること；および
ｄ．Ｌ．イントラセルラリスを採取すること。
【請求項２】
細胞が昆虫細胞、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）細胞、および鳥類細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記昆虫細胞がＳｆ９細胞、ＳＦ２１細胞、ＳＦ＋細胞、Ｈｉ−Ｆｉｖｅ細胞、または昆虫幼生細胞から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞がＳｆ９昆虫細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記鳥類細胞がＣＥＶ−１細胞または鳥類胚細胞から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
培地が動物蛋白質を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培地が動物蛋白質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生育が約２０℃から約３９℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が昆虫細胞であり、そして生育が約２５℃から約２９℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が鳥類細胞であり、そして培養が約３５℃から約３９℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
容器が微好気性または好気性条件を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
微好気性条件が約１０％水素、約１０％ＣＯ２および約８０％窒素からなる気体の混合物を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
定量リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって測定される感染多重度（ＭＯＩ）が約０．０００００１から約１０までである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用するＭＯＩが約０．０００１から約１０までである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞にＬ．イントラセルラリスを接種後、Ｌ．イントラセルラリスが約５日から約２５日まで採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞にＬ．イントラセルラリスを接種後、Ｌ．イントラセルラリスが約９日から約１５日まで採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が１ｍｌにつき約１００，０００から約１０，０００，０００細胞までの密度で播種される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が１ｍｌにつき約５００，０００細胞から１ｍｌにつき約１，５００，０００細胞までの密度で播種される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
培地が動物蛋白質を含まない、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が約１０，０００から約１，０００，０００までの密度で播種される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞が１ｃｍ２につき約６０，０００から約２５０，０００細胞までの密度で播種される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
培地が動物蛋白質を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
動物蛋白質が約０．５％から約１０％までの濃度で存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
接種された細胞が少なくとも２から３リットルの容量の培地で生育される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
接種された細胞が少なくとも１００リットルの容量の培地で生育される、請求項２４に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１１−５０００３４（Ｐ２０１１−５０００３４Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２９１４６（Ｐ２０１０−５２９１４６）
【出願日】平成２０年１０月１４日（２００８．１０．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９７８３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４９３０６
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【出願人】（５１００９９８３３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１４日（２００８．１０．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９７８３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４９３０６
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【出願人】（５１００９９８３３）
【Ｆターム（参考）】
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