ローソニアイントラセルラリスの診断方法
本発明は、動物の健康の分野に関し、特にローソニアイントラセルラリスに関する。特に、本発明は、ローソニアイントラセルラリス感染を診断する方法及びローソニアイントラセルラリス特異的抗体を使用する診断試験キットに関する。本発明はまた、ローソニアイントラセルラリス感染を診断するための、前記方法または試験キットの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物の健康の分野に関し、特にローソニアイントラセルラリスに関する。より詳細には、本発明は、ローソニアイントラセルラリス感染を診断する方法及びローソニアイントラセルラリスに特異的な抗体を使用する診断試験キットに関する。本発明はまた、ローソニアイントラセルラリス感染を診断するための前記方法または試験キットの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚増殖性腸炎（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ（“ＰＰＥ”））の原因病原体であるＬ．イントラセルラリスは、実質的に全ての動物（ヒト、ラビット、フェレット、ハムスター、キツネ、馬及び他の動物並びにオーストリッチ及びエミューのような様々な動物を含む）に影響する。Ｌ．イントラセルラリスは、欧州並びに米国における豚の群れにおける損害の特に大きな要因である。
【０００３】
ＰＰＥの一致した性質は、腸内の感染部位における腸細胞内に、細胞質内非膜結合性湾曲バチルスが存在することである。ＰＰＥに関連する細菌は、“カンピロバクター様微生物”と呼ばれている（Ｓ．ＭｃＯｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．，Ｖｏｌ．２６，２６０−２６４（１９８９））。その後、原因細菌は分類学的に新規な属及び種であると同定され、学名を“Ｉｌｅａｌ ｓｙｍｂｉｏｎｔ（ＩＳ）ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ”と命名された（Ｃ．Ｇｅｂｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．３，５３３−５３８（１９９３））。更に最近、これらの新規な細菌に、分類学的名称ローソニア（またはラウソニア）（Ｌａｗｓｏｎｉａ）（Ｌ．）イントラセルラリスが与えられた（Ｓ．ＭｃＯｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．４，８２０−８２５（１９９５））。これらの三種の名前は本明細書において同じ微生物を意味するのに互換的に使用されている。Ｌ．イントラセルラリスは、偏性細胞内細菌であり、従来の細胞を含まない媒体上で通常の細菌学的な方法により培養することができず、生育のために結合した上皮細胞が必要であると考えられてきた。Ｓ．ＭｃＯｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．１９，４２８６−４２９２（１９９３）及びＧ．Ｌａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．５，１１３６−１１４２（１９９３）には、慣用的に用いられている組織培養フラスコ中でＩＥＣ−１８ラット腸上皮細胞単層を用いたＬ．イントラセルラリスの培養について記載されている。更に、Ｈ．Ｓｔｉｌｌｓ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．５９，Ｎｏ．９，３２２７−３２３６（１９９１）には、慣用的な組織培養フラスコ中で腸４０７ヒト胚性腸細胞単層とＧＰＣ−１６モルモット結腸線癌細胞単層を用いることについて記載されている。
【０００４】
特に、Ｌ．イントラセルラリスは、当該技術分野において公知の方法、好ましくは米国特許第５，７１４，３７５及び５，８８５，８２３に記載の方法により培養することができる。例えば、培養細胞は第一に、Ｌ．イントラセルラリス細菌を含む接種材料を接種して、細胞を細菌感染させてもよい。様々な細胞系を用いて本発明を実施することができ、そのような細胞系としては以下に限定されないが、ＩＥＣ−１８（ＡＴＣＣ１５８９）−ラット腸上皮細胞、ＨＥｐ−２（ＡＴＣＣ２３）−ヒト類表皮カルシノーマ細胞、ＭｃＣｏｙｓ（ＡＴＣＣ１６９６）−マウス（非特定）細胞、ＢＧＭＫ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ ＃７１−１７６）−バッファローミドリザル腎臓細胞、及びブタ腸上皮細胞が上げられる。好ましい培養細胞はＨＥｐ−２、ＭｃＣｏｙｓまたはＩＥＣ−１８細胞である。
【０００５】
接種する前に、培養細胞を用いる場合には、細胞は単層形状であってもよい。単層を形成するには、細胞を慣用的なフラスコ内に播種してもよい。各フラスコには、フラスコまたはローラーボトルの２５、７５、１５０、８５０ｃｍ2あたり、通常１×１０5〜１０×１０5の細胞を、生育媒体と混合して播種する。生育媒体はいずれの生育媒体でもよく、窒素源、選択した培養細胞のために必要な生育因子、及び炭素源（例えば、グルコースまたはラクトース）が挙げられる。他の市販されている媒体でも良好な結果を得られるが、好ましい媒体はハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ１２と１〜５％ウシ胎仔血清で強化されたＤＭＥＭである。
【０００６】
Ｌ．イントラセルラリスの培養は、培養細胞を一定の生育段階に維持することにより、良好に行うことができる。従って、培養細胞単層は接種時の約２０〜約５０％の密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）でなければならない。好ましくは、細胞は接種時の約３０％〜約４０％の密度でなければならず、最も好ましくは、約３０％の密度である。
または、以下に記載するように、接種する前に細胞を懸濁液中で生育させてもよい。好ましくは、細胞は最初に、接着型システム、例えばローラーボトルシステム、中で単層の形態で１００％の密度まで生育させ、次に３〜３０００リットルに移して、懸濁中で生育させる。
接種材料は、感染ブタまたは他の動物から得たＬ．イントラセルラリスの培養物であってもよい。
【０００７】
接種材料は、ＰＰＥに感染したブタまたは他の動物の回腸の粘膜をこすり落とすことにより作成した腸ホモジネートであってもよい。腸ホモジネートを作成する場合には、培養のために選択する回腸動脈部分は、内臓の全体的な肥厚を伴う重篤な障害を示すべきである。細菌は脆弱な性質を有するため、試料は解剖後できるだけ迅速に−７０℃に保存することが好ましい。Ｌ．イントラセルラリスが耐性である抗生物質、例えばバンコマイシン、アンホテリシンＢまたはアミノグリコシド系抗生物質（２〜３例をあげると、ゲンタマイシン及びネオマイシン）を接種材料に添加して、Ｌ．イントラセルラリスの生育を行う間、細菌による汚染を抑制することが好ましい。接種材料は精製された培養であるかまたは腸ホモジネートであり、培養細胞の接種は、当該技術分野で知られている様々な技術により行うことができる。
【０００８】
細菌及び／または接種した培養細胞を次に、低下した溶解Ｏ2濃度の下でインキュベートする。１０％より高い溶解酸素濃度では、Ｌ．イントラセルラリスの生育は、最良よりは低く、この範囲外の酸素濃度で最終的に生じる生育の停止を伴う。好ましくは、細菌および／または接種細胞を、約０％〜約１０％の範囲の溶解酸素濃度でインキュベートする。さらに好ましくは、細菌および／または細胞を、約０％〜約８％の範囲の溶解酸素濃度でインキュベートし、最も好ましくは約０％〜約３．０％の範囲の溶解酸素濃度で行う。
【０００９】
二酸化炭素の適切な濃度も、Ｌ．イントラセルラリス．の適切な生育に重要である。０％より高く、４％より低い二酸化炭素濃度では、最適な生育は起こらず、この範囲外の二酸化炭素濃度において最終的に起こる生育の停止が起こる。好ましくは、二酸化炭素濃度は、約６％〜約１０％であり、最も好ましくは約８．８％である。
【００１０】
更に、細胞を約７３％〜約９６％の水素濃度でインキュベートすることが好ましい。窒素を、存在する水素の一部または全てに置き換えて用いてもよい。細胞を、約０〜約８．０％のＯ2、約８．８％のＣＯ2、及び約８３．２％のＨ2の存在下でインキュベートすることが最も好ましい。
【００１１】
接種した細胞を、適切な水素、酸素及び二酸化炭素濃度を有しかつインキュベーションの間細胞を懸濁状態にさせる、二重ガスインキュベーターまたは他のガスチャンバー中でインキュベートしてもよい。チャンバーは、懸濁液中に接種された細胞を維持するための手段、ガスモニター、及び適切なガス濃度を供給し、維持するための供給源を有していなければならない。インキュベーション温度は、３０℃〜約４５℃の範囲であり、より好ましくは約３６℃〜約３８℃の範囲である。最も好ましくは、温度は約３７℃である。培養と希釈（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）に必要な器具は、本明細書を参照すれば、当該技術分野における当業者あるいは通常の技術者に容易に入手可能である。本発明を行うのに適切な器具の一例は、二重ガスインキュベーター、例えば、懸濁液中に細胞を維持するスピナーフラスコとつないだモデル４８０（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ，Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｐａｒｋ，ＩＬ）である。現時点の好ましい器具としては、媒体を含みかつ適切な濃度のスパージングガスを介してあるいは他の機械的攪拌手段により培養細胞を懸濁液中に維持することができ及び連続的に媒体中の溶解Ｏ2レベルをモニターすることができる、攪拌プレートまたは回転振とう機、発酵槽、バイオリアクターを含む。ニューブルンズウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）、ブラウン（Ｂｒａｕｎ）及び他の企業がこの目的に適切な発酵槽及びバイオリアクターを作成する。
【００１２】
インキュベーションの間、接種した細胞を懸濁状態で維持することにより、細胞、そしてＬ．イントラセルラリスの最大成育を、生育媒体及び水素、酸素及び二酸化炭素の適切な混合物への各細胞の暴露を増加させることにより、達成することができる。培養細胞を攪拌し、当該技術分野において知られている様々な方法により懸濁状態に維持する。そのような方法としては、例えば、培養フラスコ、ローラーボトル、メンブレン培養、バイオバッグ、ウェーブ（ＷＡＶＥTM）バイオリアクターシステム及びスピナーフラスコが挙げられる。内部が二重ガスインキュベーターまたは同様の装置であるスピナーフラスコ中で細胞をインキュベートすることにより、インキュベーションの間、細胞を懸濁状態で維持していもよい。“スピナーフラスコ”という用語は、本明細書では、パドル、プロペラまたは培養物を攪拌して細胞を懸濁状態で維持する他の手段を有するフラスコまたは他の容器を意味する。
【００１３】
または、接種した細胞を、細胞がコンフルエント（集密）となるまでインキュベートし、次に細胞を生育媒体を含むスピナーフラスコ中にいれ、フラスコを回転させながら二重ガスインキュベーター中でインキュベートする。好ましくは、接種した細胞を集めるかまたはトリプシン処理を行い、スピナーフラスコ中へ継代培養する。これは当該技術分野において知られている様々な方法、例えば細胞スクレーパーを用いて細胞を引き離す方法、により行うことができる。一度、細胞をスピナーフラスコに導入すれば、スピナーフラスコのパドルを通常約３０〜６０ｒｐｍの範囲で、磁気攪拌プレート上で攪拌させ、感染細胞を懸濁状態で維持する。
【００１４】
培養したＬ．イントラセルラリスの一部を次に、フレッシュな培養に継代して、Ｌ．イントラセルラリスバクテリアの生産を向上させる。用語“継代”またはその類語は本明細書において、培養したＬ．イントラセルラリスの一部を、フレッシュな培養細胞に移し、フレッシュ細胞を当該バクテリアにより感染させることをいう。用語“フレッシュ”は、本明細書では、Ｌ．イントラセルラリスに感染していない新鮮な細胞を意味する。そのような細胞の日齢は、平均して、約１日より長くないことが好ましい。
【００１５】
懸濁培養中のＬ．イントラセルラリスの継代は、原培養の一部を除去し、それをフレッシュな培養細胞を含む新しいフラスコ中へ添加することにより、行ってもよい。もし、原培養中の１ｍｌのバクテリア数が多い場合、例えば、約１０4バクテリア／ｍｌより多い場合には、フレッシュな細胞を含む新しいフラスコへ、感染フラスコから約１〜１０％（体積／体積）の培養物を添加することが好ましい。これは５０〜１００％の細胞が感染した場合に好ましく行われる。もし、５０％より少ない細胞が感染した場合には、継代は好ましくは、培養を１：２にわけて新しいフラスコへいれ、フレッシュ媒体を添加することにより体積をスケールアップする。いずれの場合も、従来の単層培養の継代と対照的に、細胞溶解及び他の工程を必要としない。
【００１６】
間接蛍光抗体（ＩＦＡ）染色、ＴＣＩＤ50または他の同等の方法により測定することにより、培養細胞の十分な成育及びその後のＬ．イントラセルラリスによる感染の後、少なくとも一部の培養Ｌ．イントラセルラリスバクテリアを次に回収する。本明細書の記載を考慮して、当業者に知られている様々な方法により懸濁液からバクテリアを分離することにより回収工程を行ってもよい。好ましくは、全てまたは一部の懸濁液の内容物を遠心分離して培養細胞のペレットとし、得られた細胞ペレットを再懸濁し、さらに感染細胞を溶解することにより、Ｌ．イントラセルラリスバクテリアを回収してもよい。典型的には、少なくとも一部の含有物を約３０００ｘｇで約２０分間遠心分離し、細胞及びバクテリアをペレット化する。ペレットを次に、例えば、シュークロース−ホスフェート−グルタメート（ＳＰＧ）溶液中に再懸濁し、２５ゲージの針に約２０回通し、細胞を溶解させる。更に精製が必要な場合には、試料を約１４５ｘｇで約５分間遠心分離して、細胞の核と残渣を除去することができる。上澄みを次に約３０００ｘｇで約２０分間遠心分離して、得られたペレットを適する希釈剤（例えばウシ胎児血清を含むＳＰＧ）中に懸濁するか（凍結乾燥、冷凍処理に適した回収バクテリアを作成するため、あるいは接種物として使用するため）、または生育媒体中に懸濁する（フレッシュ細胞への継代により適する採取バクテリアを作成するため）。
【００１７】
上述したように、組織細胞の活性な成育を維持することにより、大スケール生産に有効なＬ．イントラセルラリスの生育が強化される。懸濁培養物を使用することにより、細胞の活性な生育の維持を大きく促進し、連続的な培養拡大及びスケールアップを可能にする。発酵槽と上述した約０〜３％の溶解させたＯ2を用いることにより、１０8バクテリア／ｍｌまでの生育を可能にする。
【００１８】
ＭｃＣｏｙｓまたはＩＥＣ−１８細胞を用いる場合には、ゼラチン、アガロース、コラーゲン、アクリルアミドまたはシリカビーズ、例えば、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅ−Ｇ多孔性マイクロキャリア（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ Ｕｔａｈ）を生育媒体と共に添加することが好ましい。しかし、ＨＥｐ−２細胞及び他の細胞は、本明細書で使用する方法に従ってマイクロキャリアを用いる必要はない。
培養維持の目的において、ＨＥｐ−２培養物を用いる場合、１週間に１度の間隔で、好ましくは２５％〜５０％の培養物を除去し、フレッシュな媒体に置換する。マイクロキャリアまたはビーズと細胞培養物の場合には、１週間に１〜２回の間隔で、好ましくは２５％〜５０％の培養物を除去し、フレッシュな媒体に置換する。スケールアップの目的では、培養物に、追加の２５％〜５０％の媒体、またはマイクロキャリアを含む媒体を添加してもよい。
【００１９】
培養細胞が感染する比率に依存して、フレッシュな細胞への継代は通常、約２〜約７日毎に起こる。培養細胞が２〜７日間に少なくとも７０％が感染するとすれば、好ましくは継代は約５〜７日間毎に起こることが好ましい。
【００２０】
Ｌ．イントラセルラリス抗原の診断は、今日、直接免疫蛍光法及びＰＣＲを用いて行われる。Ｌ．イントラセルラリスに特異的な抗体の診断は、免疫蛍光法を用いて行われる。これらの方法は、面倒であり、時間がかかり、大きなスケールでのスクリーニングには適さない。
【００２１】
ＰＰＥの効果的な診断はまた、原因バクテリアの培養に必要な時間により妨げられてきた。本発明により、ＰＰＥ感受性の豚及び他の動物から採取した生物試料中のＬ．イントラセルラリスの、迅速かつ正確なアッセイを促進する診断ツールの開発が可能になった。
従って、本発明の技術的課題は、改良されたＬ．イントラセルラリス疾病の診断方法を提供することである。
【発明の開示】
【００２２】
本発明の簡単な要約
本発明は、動物の健康の分野、特にローソニアイントラセルラリスに関する。特に、本発明はローソニアイントラセルラリス感染を診断する方法、及びローソニアイントラセルラリス特異的抗体を用いる診断試験キットに関する。本発明はまた、ローソニアイントラセルラリスの感染を診断するための、前記方法または試験キットの使用に関する。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の実施態様の説明の前に、本明細書及び請求項において使用される用語について以下のように定義する。単一のものとして表現される場合でも（英文では“ａ”，“ａｎ”，“ｔｈｅ”を用いて表現されるもの）、文脈から明確にそのように理解できない限り、複数のものを含むものとする。従って、例えば、“バクテリア（単数、ａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）”は複数のバクテリア（ｂａｃｔｅｒｉａ）を含み、“細胞（単数、ｃｅｌｌ）”は一または複数の細胞並びに当業者に既知のその等価物を含む。以下、同様である。他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術者により一般に理解されるものと同じ意味で用いられる。本明細書で記載されるのと同様または等価ないずれの方法及び材料も、本発明の実施または試験において使用することが出来るが、好ましい装置及び材料を以下に述べる。本明細書において述べる全ての文献に報告されているように、細胞系、ベクター、及び方法を記載し開示する目的で、これらの文献を全て本明細書に組み入れるものとする。そのような開示が本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【００２４】
本明細書において、用語“Ｌ．イントラセルラリス”は、細胞内湾曲グラム陰性バクテリア（Ｃ．Ｇｅｂｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．３，５３３−５３８（１９９３）及びＳ．ＭｃＯｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．４，８２０−８２５（１９９５）にその詳細が開示されている。これらの文献を全て本明細書に組み入れるものとする。）；当業技術分野及び本明細書に開示される、ＰＰＥ感染豚または他の動物から得られる原因バクテリア；及び自然あるいは人工的に得られる、上記バクテリアの変異体若しくは変異株、並びにＤＮＡ、ＲＮＡ及びＬ．イントラセルラリスに特異的なバクテリアタンパク質（ベクター中あるいはインビボ適用後に発現されたタンパク質を含む）、及びさらにＬ．イントラセルラリスのフラグメントまたは抗原性の誘導体、を含む。この用語はまた、以下に定義する、改変単離体及び弱毒化単離体を含む。
【００２５】
本明細書において、用語“改変単離体”は、細胞培養または他の技術における培養及び継代技術に従い製造され、抗原製造のために複製したＬ．イントラセルラリス単離体を意味する。本明細書において、用語“弱毒化単離体”は、細胞培養または他の技術における培養及び継代技術に従い製造され、宿主動物に投与した場合、免疫原性を維持しながら弱毒化を達成するＬ．イントラセルラリス単離体を意味する。
【００２６】
本明細書において、用語“大スケール培養”は、Ｌ．イントラセルラリスの培養レベルが、約２．０〜３．０リットルより多い場合を意味し、１００リットル以上のスケールの生産を含む。本明細書において“培養”は、Ｌ．イントラセルラリスの生育、再生産および／または増殖を促進するプロセスを意味する。
【００２７】
発明の開示
上記技術課題は、請求項中の記載及び実施態様により解決される。
本発明の目的は、臨床前（病状発現前）または臨床におけるＬ．イントラセルラリス感染の診断方法を提供することである。さらに、Ｌ．イントラセルラリスの免疫応答を検出すること、及びＬ．イントラセルラリス疫学のためのツールを提供することである。
【００２８】
上記目的は、本明細書及び請求項の観点に従う本発明、すなわち臨床前または臨床におけるＬ．イントラセルラリス感染の診断方法、により達成された。
本発明は、Ｌ．イントラセルラリスに対する抗体の検出、及びＬ．イントラセルラリスそれ自身の検出に関する。そのような抗体は、当業者に既知のいずれの抗体型をも含み、特にサブタイプＩｇＡ、可溶性ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）、及び更にＩｇＤ、ＩｇＥである免疫グロブリンを含む。
本発明に従って、Ｌ．イントラセルラリスに特異的な抗体を検出するには、前記方法は下記の事実を基礎とする。
ａ）液体試料を哺乳類から採取する。
ｂ）そのような液体試料のＬ．イントラセルラリス抗原への特異的結合を検出する。
ｃ）得られた結果をコントロールと比較する。
【００２９】
上述したように、Ｌ．イントラセルラリスは、Ｌ．イントラセルラリスのフラグメントまたは抗原性誘導体を含み、それらは上記方法において使用してもよい。
同様に、本発明に従えば、Ｌ．イントラセルラリスを検出するためには、下記の事実を基礎とする。
ａ）液体試料を哺乳類から採取する。
ｂ）そのような液体試料のＬ．イントラセルラリス抗体への特異的結合を検出する。
ｃ）得られた結果をコントロールと比較する。
【００３０】
液体試料は、唾液、汗、尿、血液、分泌物、排出物、または当業技術分野の専門家に既知の他の体液試料を含む、いずれの体液を含んでいてもよい。好ましい実施態様において、液体試料は、採集容器（尿または他の液体用）、シリンジ／収集チューブ（血液用）またはある種の収集綿棒（唾液、汗、等）のいずれかを用いて収集される。もし工程中の試料がａ）血液である場合には、血清またはプラズマをその血液試料から単離し、工程ｂ）を、液体試料の代わりに血清またはプラズマで行うことが好ましい。次に工程ｃ）を上述したように行う。
【００３１】
好ましい実施態様において、本発明の方法は免疫試験である。免疫試験では、Ｌ．イントラセルラリスに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清を用いる。本発明の免疫試験は、ＥＬＩＳＡ試験（酵素結合した免疫吸着剤アッセイ）またはいわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡ試験、ドットブロット、免疫ブロット、放射線免疫試験（放射線免疫アッセイ、ＲＩＡ）、拡散−ベースのオークタロニー試験またはロケット免疫蛍光アッセイのような当業技術において既知の検出方法を含む。他の免疫試験は、間接または直接免疫蛍光抗体試験（“ＩＦＡ”）である。他の免疫試験は、いわゆるウェスタンブロット法（ウェスタン転写法またはウェスタンブロッティング法ともいう）である。ウェスタンブロット法の目的は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したタンパク質またはポリペプチドを、ニトロセルロースフィルターまたは他の適切な担体上に転写し、同時にゲル電気泳動から得られるタンパク質またはポリペプチドの相対位置を保持することである。ウェスタンブロット法は、次に、検討中のタンパク質またはポリペプチドに特異的に結合する抗体とインキュベートを行う。平均的な当業者はこれらの検出方法を用いて、本発明を実施することができる。当業者が上記方法及び他の検出方法を見出すことができる文献は以下のとおりである：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（アムステルダム、オランダ）（１９８６）； Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（オーランド、フロリダ）Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）； Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（アムステルダム、オランダ）（１９８５）。固形及び液体タンパク質チップ技術またはラベル化または非ラベル化試薬を用いるマイクロアレー技術もまた、本発明に従う免疫試験法である。そのような試験は、例えば、下記文献に広く記載されている：Ｋｏｚａｋ ＫＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｓｅ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００３ Ｏｃｔ １４；１００（２１）：１２３４３−８（２００３），またはｂｙ Ｆｕｌｔｏｎ，ＲＪ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＦｌｏｗＭｅｔｒｉｘ（ＴＭ）ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（９），１７４９−１７５６（１９９７）。
【００３２】
本発明は、Ｌ．イントラセルラリス感染を検出する診断試験キットに関連する。前記キットは、本明細書において述べる臨床前または臨床におけるＬ．イントラセルラリス感染の診断方法を行うのに必要な全ての要素を含む。本発明は更に、Ｌ．イントラセルラリスに特異的な抗体を含む診断試験キットに関する。
本発明は更に、本発明の抗体がポリクローナルである診断試験キットに関する。
本発明はまた、本発明の抗体がモノクローナルである診断試験キットに関する。
【００３３】
診断試験キットは、本発明に従う診断法のための全ての成分を集めたものである。本発明の方法を行うための他の要素の例としては（網羅的なリストではない）、９６ウェルプレートまたはマイクロタイタープレート、テストチューブ等の容器、他の適切な容器、面及び支持体、ニトロセルロースフィルターのようなメンブレン、洗浄試薬及びバッファーが挙げられる。診断試験キットは、結合した抗体を検出しえる試薬を含んでいてもよい。試薬の例としては、ラベル化二次抗体、発色団、酵素（例えば、抗体と結合したもの）及びその基質または抗体を結合しえる他の基質が挙げられる。
【００３４】
本明細書に記載の、あるいは当業者に既知の、Ｌ．イントラセルラリスバクテリア、またはそのバクテリアから誘導される成分を、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイ（たておば、免疫蛍光抗体試験（“ＩＦＡ”）の抗原として用いて、当該バクテリアに感染していると疑われる動物の血清または他の体液中のＬ．イントラセルラリスに対する抗体を検出することができる。本発明において好ましい免疫アッセイは、下記例で示すようにＩＦＡである。または、本発明のバクテリアをウェスタンブロットアッセイにおいて用いることができる。
【００３５】
好ましいウェスタンブロットプロトコールは以下のとおりである。
１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、好ましくは１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で抗原を泳動させ、ニトロセルロースメンブレン上へ転写する。
２．メンブレンをブロッキングバッファー中に２時間置く。
３．ブロッキングバッファーを除き、ＰＢＳで１分間リンスする。
４．ブロッキングバッファーにより血清を希釈し、メンブレンへ添加する。室温で２時間インキュベートする。
５．洗浄バッファーで３回洗浄する（各洗浄につき５分間）。
６．ブロッキングバッファーにより、結合した抗Ｌ．イントラセルラリス特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体を希釈し、メンブレンへ添加する。室温で１時間インキュベートする。
７．洗浄バッファーで３回洗浄する。
８．１０分間または強力なバンドが生じるまで基質を添加する
９．ＰＢＳでリンスする。
１０．風乾し、暗室に保存する。
抗体に結合させたコンジュゲートは、例えば、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）のような酵素である。または、発色団あるいは他の基質存在下に定量化できる検出可能な物質である。
【００３６】
本発明の最も好ましい免疫試験はＥＬＩＳＡ法である。最も好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（＝捕捉ＥＬＩＳＡ法）である。そのようなＥＬＩＳＡ法は、同じ抗原上の二つの異なるエピトープに特異的な二つの抗体を検出できるので、より特異的である。サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、非ラベル化抗体をミクロタイタープレート上に被覆する。抗原であるＬ．イントラセルラリスを次に添加する。洗浄工程後、結合したＬ．イントラセルラリス抗原を、Ｌ．イントラセルラリスの異なるエピトープと反応性の第二のラベル化Ｌ．イントラセルラリス−特異的抗体で検出する。
被覆工程の例は以下のとおりである。例えば、ｄｄＨ2Ｏ溶液中の１０％シュークロース／１０％正常ウマ血清中の、非ラベル化抗体でプレートを被覆し、ローソニアイントラセルラリス抗原と共にインキュベートする。プレートを次に乾燥し、密閉し、３７℃で保存する。または、抗体被覆プレートを保存し、ＥＬＩＳＡを行う際に抗原を添加する。
【００３７】
本発明の好ましいＥＬＩＳＡプロトコールは以下のとおりである（抗体被覆プレートの使用）。
１．被覆バッファーで希釈した抗原０．１ｍｌ／ウェルを添加する。４℃で１８時間インキュベートする。
２．ＰＢＳで３回洗浄する。
３．プレートの各ウェルに０．２５ｍｌのブロッキングバッファーを添加する。３７℃で１〜２時間インキュベートする。
４．洗浄バッファーで３回洗浄する。
５．ブロッキングバッファーで血清を希釈し、プレートの第一ウェルに０．１ｍｌ添加する。プレートにわたって連続的に１：２希釈を作成する。３７℃で１時間インキュベートする。
６．洗浄バッファーで３〜５回洗浄する。
７．結合した抗−Ｌ．イントラセルラリス特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体、をブロッキングバッファーで希釈し、プレートのウェルに０．１ｍｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
８．洗浄バッファーで３〜５回洗浄する。
９．基質を添加する。
１０．分光光度計により光の吸収を測定する。
１１．抗原を添加しなかったウェルをブランクとして用いる。
１２．また各試験において、陽性及び陰性コントロール豚血清を使用しなければならない。
【００３８】
好ましいＥＬＩＳＡ法は以下のとおり行う。例えばｄｄＨ2Ｏ溶液中の１０％シュークロース／１０％正常ウマ血清被覆中の非ラベル化抗体で、プレートを被覆し、ローソニアイントラセルラリス抗原と共にインキュベートする。プレートを次に乾燥し、密閉し、３７℃で保存する。
１．９０μｌバッファーを全てのウェルに添加する。
２．選択したウェル中に１０μｌの血清を添加する。
３．３７℃で１時間プレートをインキュベートする。
４．ＰＢＳＴにより３回プレートを洗浄する。
５．ＣＤＳ−Ｃ＋０．５Ｍ ＮａＣｌで希釈した、ＨＲＰが結合した抗−Ｌ．イントラセルラリス特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体、１００μｌ／ウェルを添加する。
６．３７℃で１時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴで３回プレートを洗浄する。
８．基質１００μｌ／ウェルを添加し、室温で１０分間インキュベートする。
９．５０μｌの停止液（ｓｔｏｐ）／ウェルを添加する。
１０．分光光度計により４５０ｎｍでプレートを読む。
【００３９】
本発明に従う、最も好ましいサンドイッチＥＬＩＳＡプロトコールは以下のとおりである。
１．被覆バッファーで希釈した０．１ｍｌ／ウェルのｍＡｂを添加する。４℃で１８時間インキュベートする。
２．ＰＢＳにより３回洗浄する。
３．バッファーに希釈した０．１ｍｌ／ウェル抗原を、プレートの各ウェルに添加する。３７℃で１〜２時間インキュベートする。
４．洗浄バッファーにより３回洗浄し、および／または０．２５ｍｌのブロッキングバッファーをプレートの各ウェルに直接添加する。３７℃で１〜２時間インキュベートする。
５．洗浄バッファーにより３回洗浄する。
６．ブロッキングバッファーで血清を希釈し、プレートの第一ウェルに０．１ｍｌを添加する。プレートを横方向に、連続１：２希釈を行う。３７℃で１時間インキュベートする。
７．洗浄バッファーで３〜５回洗浄する。
８．結合した抗Ｌ．イントラセルラリス特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体、をブロッキングバッファーにより希釈し、プレートのウェルへ０．１ｍｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
９．洗浄バッファーにより３〜５回洗浄する。
１０．基質を添加する。
１１．分光光度計により光の吸収を測定する。
１２．抗原を添加していないウェルをブランクとして使用する。
１３．陽性及び陰性コントロール豚血清を、各試験において使用する。
【００４０】
本明細書における抗原は、上記で定義したＬ．イントラセルラリスである。ｍＡｂは、Ｌ．イントラセルラリスに特異的なモノクローナル抗体に関する。好ましくは、そのような抗体は後述する抗体である。
驚くべきことに、顕著な抗体が産生され、本発明のＥＬＩＳＡ法において使用された。抗体は、下記番号を有する：３０１：３９、２８７：６、２６８：２９、１１０：９、１１３：２及び２６８：１８。全ての抗体は、Ｌ．イントラセルラリスバクテリア抗原に特異的である。好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける捕捉抗体は、１１０：９、１１３：２または２８７：６であり、結合抗体としては２６８：１８、２６８：２９または２８７：６である。捕捉抗体としては抗体１１０：９が、結合抗体としては抗体２６８：２９が、最も好ましい。上述した抗体の全ての特性を有する抗体もまた好ましい。すなわち、上述した抗体とほとんど同じ結合特性を有するか、および／または上述した抗体と比較して同じローソニアイントラセルラリス抗原に対するものか、および／または上述した抗体と比較して同じエピトープを認識するものに関する。
【００４１】
本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞により生産される。本発明の前記ハイブリドーマ細胞は、アプライドマイクロビオロジーアンドリサーチセンター（ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＡＭＲ））と欧州細胞培養コレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ＯＪＧ，ＵＫ）に、ブダペスト条約に従って寄託されている。寄託日は、２００４年５月１１日である。ハイブリドーマセルライン（ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ ＣＥＬＬ ＬＩＮＥ）１１０：９は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０４として登録されている。ハイブリドーマセルライン１１３：２は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０１として登録されている。ハイブリドーマセルライン２６８：１８は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０２として登録されている。ハイブリドーマセルライン２６８：２９は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０６として登録されている。ハイブリドーマセルライン２８７：６は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０３として登録されている。ハイブリドーマセルライン３０１：３９は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０５として登録されている。
【００４２】
本発明は更に、下記実施例により説明される。下記実施例は、例示の目的においてのみ示されるものであって限定するものではない。本発明の他の改変は、当業者に自明である。本明細書で引用する全ての文献及び特許文献を本明細書に全て組み入れるものとする。
【実施例】
【００４３】
実施例１
１．０ 材料
抗ローソニアハイブリドーマ細胞系：３７２：１３，１１３：２，２６８：１８，２８７：６，１１０：９，２６８：２９，３０１：３９．
ハイブリドーマ細胞培養のための器具と媒体
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の精製とＨＲＰ結合のための器具とバッファー
ＥＬＩＳＡのための器具と溶液
ローソニア抗原ＳＦ１２８９ Ｎ３４３ １２／２０／００
ローソニア陽性血清：ｌｏｔ＃０５２９０２ｐｉｇ＃２６（実験的感染）
ｌｏｔ＃０５２９０２ｐｉｇ＃６９（ワクチン接種）
ローソニア陰性血清：ｐ ２５．８＃２７３ Ｄａｙ ５２ ６−３０−９５
１１６７０５
【００４４】
１．１ 方法
モノクローナル抗体の作成を、スバノババイオテック（Ｓｖａｎｏｖａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）における標準操作方法に従い、行った。
１．１．１ ハイブリドーマ細胞の培養とＨＲＰ結合モノクローナル抗体の作成
−ハイブリドーマ細胞系を確保するために、各細胞系につき１５バイアルづつ作成し、−１３５℃で保存した。
−各ハイブリドーマ細胞系の１バイアルを解凍し、細胞を細胞培養フラスコ中で生育させた。
−各細胞系からの５００ｍｌ〜１０００ ｍｌの上澄みを精製し、ホースラディッシュパーオキダーゼに結合した。
【００４５】
１．１．２ ブロッキングＥＬＩＳＡ法
精製し、かつＨＲＰ結合したｍＡＢについて、ＥＬＩＳＡ法によりローソニア陽性豚血清によりブロックされる能力を試験した。
−ＥＬＩＳＡプレートを、希釈率１／２００、１００μｌ／ウェルでローソニア抗体により被覆した。
−豚血清を１／１０、１００μｌ／ウェルに希釈した。
−ＨＲＰ結合ｍＡｂを希釈し、添加した（１００μｌ／ウェル）
結果を、下記式に従う抑制率（ＰＩ）で表した。
ＰＩ＝１−（ＯＤ試料／ＯＤｍＡｂ）ｘ１００．
【００４６】
１．２ 結果
１．２．１ ハイブリドーマ細胞の培養とＨＲＰ結合モノクローナル抗体の作成
−１つを除き、全てのｍＡｂを首尾よく精製し、ＨＲＰと結合した。これらは良好な生産能力を有していた。
−ｍＡｂ３７２：１３は低い生産能力を有していた。このｍＡｂはＨＲＰと結合できず、そのためブロッキングＥＬＩＳＡ法において試験できなかった。
１．２．２ ブロッキングＥＬＩＳＡ法
−二つの陽性血清（＃２６，＃６９）及び二つの陰性血清（２５．８＃２７３，１１６７０５）を実験で使用した。
−実験的に感染した血清（＃２６）は、全ての６つのＨＲＰ結合ｍＡｂを抑制したが、それぞれ異なるレベルであった。ワクチン接種した豚からの血清はｍＡｂをより低い程度で抑制した。
−陰性血清は全く抑制しないか非常に低い抑制を示した。
結果を下記表及び図１に示す。
【００４７】
ｍＡｂ
血清 ３０１:３９ １１０:９ ２６８:２９ ２８７:６ １１３:２ ２６８:１８
＃２６（実験的）
＋ ５７ ４５ ７８ ７４ ４２ ７２
＃６９（ワクチン接種）
＋ １８ ２３ ５２ ４３ ４５ ２５
２５．８＃２７３
− ７ ３ ２７ ２０ １４ ２１
１１６７０５
− −７ −９ −２４ −１３ １８ −１９
【００４８】
１．３ ディスカッション
本研究の結果は、試験したモノクローナル抗体の一以上がローソニアイントラセルラリスに対するブロッキングＥＬＩＳＡ試験に適することを明確に示している。ＭＡｂ２６８：２９，２８７：６及び２６８：１８は、陽性及び陰性血清の間の最も明確な差異を示している。すなわち、これらはブロッキングＥＬＩＳＡの開発における強力な候補である。
【００４９】
実施例２
２．０ 要約
ローソニアイントラセルラリスに対する抗体検出のための、サンドイッチｂ−ＥＬＩＳＡプロトタイプの開発及び確立：
免疫蛍光試験ＩＦＡを標準として使用して、感度及び特異性を計算した後、以下を結論付けることができる。
−捕捉ｍＡｂ１１０：９は、陽性及び陰性試料間に明確な差異を与える。
−検出ｍＡｂ２６８：２９ ＨＲＰは、陽性及び陰性血清間に明確な差異を与え、１００％の感度と特異性を示す。
−プロトタイプは下記を推奨する：
−ヌンクマキシソープストリップＣ−８（Ｎｕｎｃ ｍａｘｉ−ｓｏｒｐ ｓｔｒｉｐｓ Ｃ−８）で被覆した、ｍＡｂ１１０：９を捕捉ｍＡｂとする。
−抗原（Ａｇ）：ローソニアイントラセルラリス培養物（好ましくはＲ＆Ｄ、Ｂｌで製造された濃縮物）
−０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴで１／１０に希釈された血清試料。３７℃で１時間インキュベートする。
−０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＣＤＳ−Ｃバッファー中で凍結乾燥された、ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９。３７℃で１時間インキュベートする。
−基質Ｋ−Ｂｌｕｅ Ｍａｘ。室温で１０分間インキュベートする。
−スバノバ停止液。
【００５０】
２．１ 材料及び方法
ＥＬＩＳＡ法を下記手順に従い、行った。
２．１．０ ＥＬＩＳＡ法
−９０μｌのバッファーを全てのウェルに添加する。
−１０μｌの血清を選択したウェルに添加する。
−プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
−プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
−ＣＤＳ−Ｃ＋０．５Ｍ ＮａＣｌで希釈したＨＲＰ結合ｍＡｂを１００μｌ／ウェルの濃度で添加する。
−３７℃で１時間プレートをインキュベートする。
−ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。
−基質を１００μｌ／ウェルの濃度で添加し、室温で１０分間インキュベートする。
−５０μｌ／ウェルの停止液を添加する。
−プレートについて分光光度計により４５０ｎｍの吸収を測定する。
結果を１−ＯＤ値または２−ＰＩ（抑制率）値、すなわち、１００−試料ＯＤ／ｍＡｂＯＤ×１００、として示した。
【００５１】
２．１．１ 試験１（ＥＬＩＳＡ０３０９２２，０３０９２３ｘ２）
ｍＡｂ １１０：９，１１３：２，３０１：３９，２８７：６，２６８：２９、３００ｎｇ／ウェルにより被覆したＣ−８マキシストリップ。
１０％ ２２５１ ＨＡＳ（正常ウマ血清），１０％シュークロース／ＵＨＰ Ｈ2Ｏによるストリップのブロッキング。１５０μｌ／ウェル、室温で３０分間インキュベート。
ＰＢＳＴにより１／１０に希釈したＡｇ＃０３０６１９、１００μｌ／ウェル。４℃で３時間インキュベート。
３７℃で３時間乾燥したストリップ。４℃に保存。
血清：ＩＦＡ陽性：＃２６，＃６９。ＩＦＡ陰性：＃６，Ｃ１，Ｄ１，Ｅ１。０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴにより１／１０に希釈。
結合体：２６８：１８，１１３：２，３０１：３９，１１０：９，２８７：６，２６８：２９ ＨＲＰ ０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴ中に希釈。
全捕捉ｍＡｂを、それ自身を除く全てのＨＲＰ結合ｍＡｂに対して試験した。
【００５２】
２．１．２ 試験２（ＥＬＩＳＡ０３０９２４）
試験１に従い、１１０：９，１１３：２及び２８７：６により被覆したストリップ。
血清：ＩＦＡ陽性：＃２６，＃６９。ＩＦＡ陰性：＃６，Ｃ１，Ｄ１，Ｅ１。０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴ中に１／１０に希釈した。
ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：１８，２６８：２９，２８７：６。０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＣＤＳ−Ｃ（結合体を凍結乾燥するための標準バッファー（生産におけるスバノバとして））中に希釈。
【００５３】
２．１．３ 試験３（ＥＬＩＳＡ０３０９２５）
試験１に従い、１１０：９，１１３：２及び２８７：６により被覆したストリップ。
血清：２４血清（ＩＦＡ陽性１０，ＩＦＡ陰性１０及び不明４）を試験した。希釈：０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴ中１／１０。
結合体：２６８：１８ ＨＲＰ ０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＣＤＳ−Ｃ中に希釈。
【００５４】
２．１．４ 試験４（ＥＬＩＳＡ０３０９３０，０３１００２，０３１００８）
試験１に従い、１１０：９により被覆したストリップ。
血清：２１ ＩＦＡ陽性及び６９ ＩＦＡ陰性。希釈：０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴにより１／１０に希釈。
結合体：ＨＲＰ結合２６８：１８及びＨＲＰ結合２６８：２９を０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＣＤＳ−Ｃで希釈。
【００５５】
２．２ 結果
２．２．１ 試験１（ＥＬＩＳＡ０３０９２２，０３０９２３ｘ２）
結合体２６８：１８、２６８：２９、２８７：６を伴う捕捉ｍＡｂ１１０：９，１１３：２及び２８７：６は、サンドイッチｂ−ＥＬＩＳＡに対する最良の候補と考えられる。これらの組合せは、陽性血清への最良のブロッキング容量を示したからである。血清番号＃６は、ほとんどの試験において陽性を示した。以前に開発されたｂ−ＥＬＩＳＡプロトタイプにおいてこの血清が陽性を示したことからこのことが推測された。
【００５６】
２．２．２ 試験２（ＥＬＩＳＡ０３０９２４）
この試験は、結合体の凍結乾燥に使用された標準バッファーを使用できることを確認するために、主に行われた。結果は、ブロッキングが陽性血清により達成されることを示している。最良のブロッキングは、検出ｍＡｂ２６８：１８または２６８：２９によるものであった。
【００５７】
２．２．３ 試験３（ＥＬＩＳＡ０３０９２５）
捕捉ｍＡｂ１１０：９は、陽性及び陰性試料を最も明確な区別するため、最良の選択であることが見いだされた。
【００５８】
２．２．４ 試験４（ＥＬＩＳＡ０３０９３０，０３１００２，０３１００８）
得られたＯＤ及びＰＩ値は添付５に記載されている。ＯＤ値をＩＦＡの結果に対してプロットすると、ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９は、１００％感度及び特異性で陽性と陰性を最も明確に区別する。ｍＡｂ２６８：１８もまた、１００％の感度と特異性を示すが、陽性と陰性試料の面積が小さい。ＰＩ値をプロットすると、ｍＡｂ２６８：１８はカットオフ２０．９において、感度が９５．７であり、特異性が１００％である。一方ｍＡｂ２６８：２９は、カットオフ２８．６において、感度及び特異性共に１００％である。
【００５９】
２．３．ディスカッション
免疫蛍光試験ＩＦＡに対する感度及び特異性を計算した後、以下を結論づけることができる。
−捕捉ｍＡｂ１１０：９は、陽性及び陰性試料の間の明確な差異を与えるため、最良の選択である。
−ＨＲＰを結合した検出ｍＡｂ２６８：２９は、１００％の感度及び特異性をもって、陽性と陰性の明確な区別を与えるので、最良の選択である。
プロトタイプは下記を推奨する。
−捕捉ｍＡｂとしてｍＡｂ１１０：９。ヌンクマキシ−ソープストリップＣ−８で被覆したもの。
−Ａｇ：ローソニアイントラセルラリス培養物（好ましくはＲ＆Ｄ、Ｂｌで製造された濃縮物）
−０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴにより１／１０に希釈した血清試料。３７℃で１時間インキュベート。
−ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９。０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＣＤＳ−Ｃバッファー中で凍結乾燥したもの。３７℃で１時間インキュベート。
−基質Ｋ−Ｂｌｕｅ Ｍａｘ。室温で１０分間インキュベート。
−スバノバ停止液
【００６０】
実施例３
３．１要約
加速安定性試験は、ローソニアイントラセルラリス抗原が捕捉されたＥＬＩＳＡプレートが、少なくとも一年の安定性を有すること、及びローソニアＨＲＰ結合体２６８：２９が凍結乾燥形態で６〜１２ヶ月の安定性を有することを示している。
【００６１】
３．２ 導入部
将来のローソニアイントラセルラリスＥＬＩＳＡキットの成分の安定性を評価するために、加速安定性試験を行う必要がある。試験すべき成分を３７℃で４週間保存し、その後、ＥＬＩＳＡにおいて試験を行い、４℃で保存した成分と比較した。３７℃における４週間の安定性は、約１２ヶ月の貯蔵寿命を示す。この報告は、抗原捕捉ＥＬＩＳＡプレートとＨＲＰ結合体について行った加速安定性試験について述べたものである。
【００６２】
３．３ 材料及び方法
プレート上での加速安定性（ＥＬＩＳＡ０３１０２４）
プレートをｄｄＨ2Ｏ中の１０％シュークロース／１０％正常ウマ血清でブロックしたローソニアのｍＡｂ １１０：９で被覆し、ローソニア抗原でインキュベートした。プレートを乾燥し、密閉し、３７℃に置いた。プレートを３７℃から第１週、第２週、第３週、及び第４週において取り出し、冷蔵庫内で保存した。また、参照として、全ての試験期間にわたって４℃に保存したプレートを用意した。
陽性血清＃２６，＃６９及び＃０６、及び陰性Ｃ２、Ｄ１及びＥ２を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡの性能をチェックした。
ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９ ｌｏｔ＃０３０１２０を使用した。
【００６３】
凍結乾燥結合体（ＥＬＩＳＡ０３１０２７）上の加速安定性
ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９ ｌｏｔ＃０３０１２０を、ガラスビン中でＣＤＳ−Ｃバッファーにより１／１０００に希釈し、標準方法により凍結乾燥を行った。４つの凍結乾燥ビンを３７℃で、１週間、２週間、３週間及び４週間保存した。また４℃で保存したビンも用意した。各ビンをサンドイッチＥＬＩＳＡで試験した。
陽性血清＃２６と陰性血清０３０９２６を使用した。
結合抗体の１／１０００希釈（“結合体希釈”）により、試験において高すぎるＯＤ値が得られることがわかった。結合抗体はそのため、試験において正しいシグナルが得られるようにプレート中で滴定した。
【００６４】
３．４．結果
プレート上での加速安定性
４℃に保存したストリップのＯＤ値と比較して、ＯＤ値の大幅な低下は第１週の後に見られた。第１週と第４週を比べても大きな差異はない。４℃におけるＰＩ値を見ると、第１週〜第４週の間、有意性は見られなかった。
凍結乾燥結合体の加速安定性
１／８０００の“結合体希釈”において、血清＃２６は４週間後、０．５４７から０．３９８への低下を示し、血清０３０９２６は４週間後、１．６５４から０．９９へ低下した。
【００６５】
３．５．ディスカッション
行った加速安定性試験は、ローソニアイントラセルラリスＥＬＩＳＡプレートが、少なくとも１年の安定性を有することを示している。抗ローソニアＨＲＰ結合２６８：２９抗体は、４週間後、陰性血清に対してＯＤ値において４０％減少を示した。これは、結合体の不安定性を示していると考えられる。ＯＤ値を計算した場合、１年後に、１．５ミーンズにおけるシグナルと０．９のＯＤ値の４０％減少は、依然として許容できる範囲である。
【００６６】
実施例４
４．１．要約
プロトタイプの開発が行われた際に使用した５０試料を使用することにより、プロトタイプの検証（プレートバッチ０４０１０７）を行った。検証されたバッチにおいて、陽性血清は１００％の一致を示したが、一方、検証バッチでは２５陰性血清のうち２つが陽性と示された。
豚血清の代わりに、正常ウマ血清がＣＤＳ−Ｃバッファー中で使用できることが見出された。
０．０４２％ＰＶＰを含むＰＢＳＴがＰＢＳＴタブレット（ＰＶＰを含む）を用いた場合と同様な結果を示すことが見出された。
【００６７】
４．２．導入部
サンドイッチＥＬＩＳＡプロトタイプを検証するために、より多数の血清を大スケールで生産したプレートバッチで試験しなければならない。試験を、プレートバッチ０４０１０７で行った。このバッチを、プロトタイプを開発するために以前に使用された５０血清試料を検査することにより試験した。
ＨＲＰ結合体を凍結乾燥する際にバッファーＣＤＳ−Ｃを保存剤として使用する。このバッファーは豚血清を含む。ＣＤＳ−Ｃバッファー中で使用されるべきローソニア陰性血清を見つけることが困難な場合には、代わりのものを試験するべきである。この試験において、正常ウマ血清及び胎児ウシ血清を試験した。
【００６８】
このＥＬＩＳＡにおける実験室的作業の殆どは、ＰＢＳＴタブレットを用いて行ってきた。スバノバキットに含まれる２０×ｃｏｎｃ．ＰＢＳＴは、試験が陽性及び陰性試料を正確に区別できないので、使用することができない。タブレットと２０×ｃｏｎｃ．ＰＢＳＴの処方を比較すると、全ての成分は、安定因子としてタブレット中に含まれる０．０４２％ＰＶＰ（ポリビニルピロリドンＫ２５）を除いて、同じであった。ＰＶＰを２０×ＰＢＳＴに添加すると、タブレットと同じ結果が得られることが実験により示された。
【００６９】
４．３．材料と方法
プロトタイプの検証（ＥＬＩＳＡ０４０３１２）
プロトタイプＥＬＩＳＡで予め試験した５０血清（バイオスクリーンから入手した）を、大スケールプレートバッチ＃０４０１０７で試験を行った。０．０４２％ＰＶＰを含むＰＢＳＴ ２０×ｃｏｎｃバッファーを用いた。凍結乾燥した結合体バッチ０４０３０８を用いた。
【００７０】
正常ウマ血清を含むＣＤＳ−Ｃバッファー
試験 ＥＬＩＳＡ０４０２０３
ＣＤＳ−Ｃバッファーを以下の成分と共に製造した：１−ブタ血清（ＴＪ４／０５Ｆと同様）、２−正常ウマ血清、及び３−胎児ウシ血清。バッファーをＥＬＩＳＡの結合バッファーとして試験した。試験した血清は、グリス（ｇｒｉｓ）２，４，１３及び１７，１−２９６６４，３−２９６６４，Ａ−２７２３９，Ｂ−２７２３９，＃２６及びＣ２であった。ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９ ｌｏｔ＃０３０３１８を用いた。０．０４２％ＰＶＰを含む２０×ｃｏｎｃＰＢＳＴを用いた。
【００７１】
試験 ＥＬＩＳＡ０４０３１１
正常ウマ血清含有ＣＤＳ−Ｃバッファーを用いて、二つの場合（０４０２１１，０４０３０８）における凍結乾燥した結合体を製造した。結合体を製造し、１／２０ｋ，１／２５ｋ及び１／３０ｋに最終的に希釈した。新たに製造した結合体を同時に試験した。血清＃２６，１−２９６６４，３−２９６６４，Ａ−２７２３９，Ｂ−２７２３９，陽性プール０３０９２６及び陰性プール０３０９２６を用いた。ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９ ｌｏｔ＃０３０３１８を用いた。０．０４２％ＰＶＰを含む２０×ｃｏｎｃＰＢＳＴを用いた。
【００７２】
ＰＶＰ含有ＰＢＳＴ（ＥＬＩＳＡ０４０３０１）
ＰＢＳＴバッファー２０×濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）を１／２０に希釈し、最終濃度０．０４２％のＰＶＰを添加した。このバッファーを同時に、１／２０に希釈した２０×ｃｏｎｃＰＢＳＴとＰＢＳＴタブレット（既にＰＶＰを含む）とを用いて試験した。このバッファーを全ての工程、すなわち、試料及び結合体の希釈バッファー並びに洗浄バッファーにおいて用いた。
血清＃２６，Ｅ１，１−２９６６４，３−２９６６４，Ａ−２７２３９，Ｂ−２７２３９及びグリス１３を用いた。ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９ ｌｏｔ＃０３０３１８を用いた。結合体バッファーとして豚血清を含むＣＤＳ−Ｃを用いた。
【００７３】
４．４．結果
プロトタイプの検証
結果は、以前に陽性であった２５の全ての血清が、検証バッチにおいて陽性であることを示す。以前に陰性であった２５のうち二つは陽性を示した。
正常ウマ血清を含むＣＤＳ−Ｃバッファー
正常ウマ血清を含む当該バッファーは、豚血清を含むものと同様の結果を示した。
凍結乾燥されたＨＲＰ結合ｍＡｂの値は、新たに製造した結合体と比較して、０．４ＯＤで最も低下した。この低下は、凍結結合体の両方のバッチで認められた。得られたＯＤ値に関係なく計算されたＰＩ値はよく一致するので、試験の性能に影響していない。
ＰＶＰ含有ＰＢＳＴ
結果は、０．０４２％のＰＶＰを添加した、１／２０希釈した２０×濃縮ＰＢＳＴは、ＰＢＳＴタブレットと同様の結果を示した。一方、ＰＶＰを含まず、１／２０希釈された２０×濃縮ＰＢＳＴは誤った陰性結果を示した。
【００７４】
４．５．ディスカッション
プロトタイプを開発する際に以前に使用した５０血清を試験することによりプロトタイプ（プレートバッチ０４０１０７）の検証を行った。検証試験では、陽性血清については１００％一致した。一方、２５陰性血清のうち２つが検証バッチにおいて陽性を示した。この試験の主として重要な点は陽性試料の検出であるから、“誤った”陰性結果は許容しうる。また、以前の試験の結果が本当に正しいかはわかっていない。
【００７５】
０．０４２％ＰＶＰを含むＰＢＳＴが、ＰＢＳＴタブレット（ＰＶＰを含む）を用いた場合と同様の結果を示した。従って、将来のキットはこのバッファーを含む。ＰＶＰを含むＰＢＳＴの２０×ｃｏｎｃの安定性試験は、このキットの有効性を保証するために行われるべきである。
【００７６】
実施例５
５．１ 導入部と目的
ローソニアイントラセルラリスに対する血清抗体の検出は、現在までＩＦＡ試験の使用により行われてきた（１）。これらの試験は、結果の解釈において、各個人の高い主観的判断によるものである。最近、Ｌ．イントラセルラリスに対する高特異的モノクローナル抗体を用いたサンドイッチブロッキングＥＬＩＳＡが開発された。この試験のデータを、目的別に試験し、評価することができ、これにより再生産性、再現性及び比較分析を改良できる。この研究において、ＩＦＡ試験に対する第一比較データが示されており、これは新試験の適切さと性能を示している。
【００７７】
５．２ 材料と方法
ＭｃＣｏｙ細胞培養上で生育され、マイクロタイタープレート上で特異的なモノクローナル抗体により捕捉されたＬ．イントラセルラリス抗原を用いて、豚血清試料中のＬ．イントラセルラリスに対する抗体を検出した。血清を１〜１０倍に希釈して試験を行った。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳツイン液で洗浄し、ホースラディッシュパーオキシダーゼラベル化モノクローナル抗体（捕捉抗体とは異なる）を添加した。プレートを３７℃で更に１時間インキュベートした。非結合抗体を洗浄により除去した。ＴＭＢ基質と共に室温で１０分間インキュベーションを行った後、停止液を添加することにより反応を停止した。分光計で各ウェルについてＯＤ４５０を測定した。結果を血清を含まないコントロールの抑制率として計算した。
【００７８】
Ｌ．イントラセルラリスに対する抗体について、確認されたＩＦＡ試験（２）で試験された実地の３０１血清を用いて、新ＥＬＩＳＡ法を評価した。更に、既知の回腸炎を伴う二つの農場と回腸炎が疑われる一つの農場からの横断的試料（９歳の群から１０試料づつ）を用いて、ＩＦＡと比較した、ＥＬＩＳＡの診断値を示した。
【００７９】
５．３ 結果
多くの陰性血清が、陰性抑制値を示した。従って、最も低い測定値を０にセットし、全ての他の値はこれに関連づけられた。これらのデータを“相対ＥＬＩＳＡ値”と呼ぶ。
３０１の実地の血清の結果を図２に要約した。ＥＬＩＳＡは明らかに、陰性（平均相対ＥＬＩＳＡ値 ３６）と陽性（平均相対ＥＬＩＳＡ値 ８９）血清を区別した。ＩＦＡにおいて疑わしい点数の試料の大部分は、ＥＬＩＳＡで陽性であった。
３つの農場からの横断的スクリーニングの結果を図３に示す。両試験により、３つの農場におけるＬ．イントラセルラリスに対する抗体を明確に検出できた。
【００８０】
５．４ ディスカッション
ＩＦＡ試験結果と比較して、ＥＬＩＳＡ法は高い感度であった。３つの試験された農場のある群では、ＥＬＩＳＡの結果がＩＦＡ試験のそれよりも、非常に明確であった。蛍光試験が非特異的であったため、前記事実は多くの疑問を与えた。３つの群れにおける血清学的プロファイルは、以前に刊行された欧州の群れからのデータ（３，４）によく対応している。１０週齢と１６週齢の豚の群の間のＥＬＩＳＡ値の上昇をＩＦＡ試験のものと比較すると、５５より多い相対ＥＬＩＳＡ値を有する血清は陽性と判断することができることを示している。
この新試験は、ルーチン試料の回腸炎の診断の改良に役立つものである。新規ブロッキング回腸炎ＥＬＩＳＡ法は、客観的な基礎に基づく、大量の試料の迅速かつ高感度のスクリーニングのためのツールを提供する。
【００８１】
参考文献
１．Ｇｕｅｄｅｓ ＲＭＣ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｃａｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ６６：９９−１０７．
２．Ｋｎｉｔｔｅｌ ＪＰ ｅｔ ａｌ．，１９９８．ＡＪＶＲ ５９：７２２−７２６．
３．Ｂｉｋｓｉ Ｉ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｐｒｏｃ．１７th ＩＰＶＳ，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ
４．ｖａｎ Ａｋｅｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｐｒｏｃ．１７th ＩＰＶＳ，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ．
【００８２】
実施例６
６．１ 導入部と目的
現在まで、回腸炎特有の診断は、糞便中または腸組織試料中の抗体検出についてはＩＦＡ試験（１，２）またはＰＣＲ（３，４）により、抗原検出については組織学的及び免疫学的染色法（２，５，６）により行われてきた。全てのこれらの方法は、特異性、汚染リスクまたは作業負荷に関して特有の不利益点があり、大きなスケールで行う群れのルーチンスクリーニングには適さない。ほとんどの診断試験は、群れからの２、３の豚のみについて行われる。開発されたブロッキングＥＬＩＳＡ法の使用により、血清学試験はより容易となり、より確実になり、また群れのプロファイリングにより適するものとなる。独国の２２農場を横断するスクリーニングを新試験の診断性能を示すために行った。
【００８３】
６．２ 材料と方法
２２の独国農場にわたる試料をＥＬＩＳＡで試験した。各農場から、４，７，１０，１３，１６，２０及び２４週齢の若雌豚（ｇｉｌｔｓ）、雌豚（ｓｏｗｓ）及び豚（ｐｉｇｓ）の試料を採取した（各週齢につき１０試料づつ）。ＥＬＩＳＡを実施例５に記載のように行った。
【００８４】
６．３ 結果
図４に、全ての２２農場の平均相対ＥＬＩＳＡ値を示した。若雌豚（ｇｉｌｔ）及び雌豚（ｓｏｗ）からの血清は、ＥＬＩＳＡにおいて非常に反応性であったのに対し、４〜１０週齢のフラットデック豚（ｆｌａｔｄｅｃｋ ｐｉｇｌｅｔ）は低かった。肥育者（ｆａｔｔｅｎｅｒｓ）ではＥＬＩＳＡ値は、１３〜２４週に上昇した。
図５において、平均相対ＥＬＩＳＡ値は、農場の臨床症状と相関している。農場番号５，６及び１５は、試料採集の時、臨床的な腸の問題はなかった。農場番号３では、４〜１３週の子豚は、腸に問題があり、Ｅ．ｃｏｌｉ性下痢と診断された。農場番号１８では、以前の血清学試験が、農場内で臨床的な症状を示さないローソニアイントラセルラリスの存在を示した。農場番号１，２，７，８，９，１０，１１，１２，１９，２１及び２２では、この研究のための資料採集の前に回腸炎と診断された。農場番号４，１３，１４，１６及び２０では、飼育者と肥育者における腸の問題が報告された。農場番号４及び１３では、回腸炎が臨床的に疑われた。農場番号１７では、下痢の臨床的な徴候はなかったが、飼育者において、及び肥育の初期において抗生物質が使用された。
【００８５】
６．４ ディスカッション
２２農場からの要約された血清プロファイルは、雌豚及び若雌豚において高い反応性を示し、１３週から２４週までに抗体反応が産生されることを示す。これらの知見は、現在までに回腸炎に関して報告された血清学的データと一致する（７，８，９）。下痢を伴わない農場（Ｎｏ．５，６，１５及び１８）からの豚、及びＥ．ｃｏｌｉ性下痢を伴う農場（Ｎｏ．３）の豚は、ＥＬＩＳＡにおいて、顕著な血清変換を示さなかった。既知の回腸炎を伴う農場（Ｎｏ．１，２，７，８，９，１０，１１，１２，１９，２１及び２２）では、７週と１３週の間において、明確な血清変換を検出することができた。興味深いことに、ほとんどの雌豚及び若雌豚の群からの試料は、ＥＬＩＳＡにおいて非常に反応性であったが、これらの豚のほとんどは、明確な腸の疾病がなかった。これは、ローソニアイントラセルラリスの無症状感染によると考えられる。農場番号１７の結果は、無症状回腸炎を示しているようである。
【００８６】
本発明の新規なＥＬＩＳＡは、大きな試料サイズおよび群れの横断的スクリーニングのためのルーチン試験に適する、回腸炎の血清学的診断のための強力なツールを提供する。
【００８７】
参考文献
１．Ｋｎｉｔｔｅｌ ＪＰ ｅｔ ａｌ．，１９９８．ＡＪＶＲ ５９：７２２−７２６．
２．Ｇｕｅｄｅｓ ＲＭＣ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｃａｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ６６：９９−１０７．
３．Ｊｏｎｅｓ ＧＦ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３１：２６１１−２６１５．
４．Ｓｕｈ−ＤＫ ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ １：３３−３７．
５．ＭｃＯｒｉｓｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９．Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ ２６：２６０−２６４．
６．Ｈｕｅｒｔａ Ｂ ｅｔ ａｌ．，２００３．Ｊ Ｃｏｍｐ Ｐａｔｈ １２９：１７９−１８５．
７．Ｂｉｋｓｉ Ｉ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｐｒｏｃ．１７th ＩＰＶＳ，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ ８．ｖａｎ Ａｋｅｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｐｒｏｃ．１７th ＩＰＶＳ，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ ９．Ｈｏｌｙｏａｋｅ ＰＫ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２：１９８０−１９８５．
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明に従うブロッキングＥＬＩＳＡの結果を表す。
【図２】ＩＦＡとＥＬＩＳＡの比較における３０１の実地の血清の結果を表す。
【図３】回腸炎ブロッキングＥＬＩＳＡ−３農場（飼育場）横断スクリーニングの結果を表す。
【図４】回腸炎ＥＬＩＳＡ−２２の独国農場（飼育場）の結果を表す。
【図５】臨床症状とＥＬＩＳＡの結果との相関関係を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物の健康の分野に関し、特にローソニアイントラセルラリスに関する。より詳細には、本発明は、ローソニアイントラセルラリス感染を診断する方法及びローソニアイントラセルラリスに特異的な抗体を使用する診断試験キットに関する。本発明はまた、ローソニアイントラセルラリス感染を診断するための前記方法または試験キットの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚増殖性腸炎（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ（“ＰＰＥ”））の原因病原体であるＬ．イントラセルラリスは、実質的に全ての動物（ヒト、ラビット、フェレット、ハムスター、キツネ、馬及び他の動物並びにオーストリッチ及びエミューのような様々な動物を含む）に影響する。Ｌ．イントラセルラリスは、欧州並びに米国における豚の群れにおける損害の特に大きな要因である。
【０００３】
ＰＰＥの一致した性質は、腸内の感染部位における腸細胞内に、細胞質内非膜結合性湾曲バチルスが存在することである。ＰＰＥに関連する細菌は、“カンピロバクター様微生物”と呼ばれている（Ｓ．ＭｃＯｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．，Ｖｏｌ．２６，２６０−２６４（１９８９））。その後、原因細菌は分類学的に新規な属及び種であると同定され、学名を“Ｉｌｅａｌ ｓｙｍｂｉｏｎｔ（ＩＳ）ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ”と命名された（Ｃ．Ｇｅｂｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．３，５３３−５３８（１９９３））。更に最近、これらの新規な細菌に、分類学的名称ローソニア（またはラウソニア）（Ｌａｗｓｏｎｉａ）（Ｌ．）イントラセルラリスが与えられた（Ｓ．ＭｃＯｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．４，８２０−８２５（１９９５））。これらの三種の名前は本明細書において同じ微生物を意味するのに互換的に使用されている。Ｌ．イントラセルラリスは、偏性細胞内細菌であり、従来の細胞を含まない媒体上で通常の細菌学的な方法により培養することができず、生育のために結合した上皮細胞が必要であると考えられてきた。Ｓ．ＭｃＯｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．１９，４２８６−４２９２（１９９３）及びＧ．Ｌａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．５，１１３６−１１４２（１９９３）には、慣用的に用いられている組織培養フラスコ中でＩＥＣ−１８ラット腸上皮細胞単層を用いたＬ．イントラセルラリスの培養について記載されている。更に、Ｈ．Ｓｔｉｌｌｓ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．５９，Ｎｏ．９，３２２７−３２３６（１９９１）には、慣用的な組織培養フラスコ中で腸４０７ヒト胚性腸細胞単層とＧＰＣ−１６モルモット結腸線癌細胞単層を用いることについて記載されている。
【０００４】
特に、Ｌ．イントラセルラリスは、当該技術分野において公知の方法、好ましくは米国特許第５，７１４，３７５及び５，８８５，８２３に記載の方法により培養することができる。例えば、培養細胞は第一に、Ｌ．イントラセルラリス細菌を含む接種材料を接種して、細胞を細菌感染させてもよい。様々な細胞系を用いて本発明を実施することができ、そのような細胞系としては以下に限定されないが、ＩＥＣ−１８（ＡＴＣＣ１５８９）−ラット腸上皮細胞、ＨＥｐ−２（ＡＴＣＣ２３）−ヒト類表皮カルシノーマ細胞、ＭｃＣｏｙｓ（ＡＴＣＣ１６９６）−マウス（非特定）細胞、ＢＧＭＫ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ ＃７１−１７６）−バッファローミドリザル腎臓細胞、及びブタ腸上皮細胞が上げられる。好ましい培養細胞はＨＥｐ−２、ＭｃＣｏｙｓまたはＩＥＣ−１８細胞である。
【０００５】
接種する前に、培養細胞を用いる場合には、細胞は単層形状であってもよい。単層を形成するには、細胞を慣用的なフラスコ内に播種してもよい。各フラスコには、フラスコまたはローラーボトルの２５、７５、１５０、８５０ｃｍ2あたり、通常１×１０5〜１０×１０5の細胞を、生育媒体と混合して播種する。生育媒体はいずれの生育媒体でもよく、窒素源、選択した培養細胞のために必要な生育因子、及び炭素源（例えば、グルコースまたはラクトース）が挙げられる。他の市販されている媒体でも良好な結果を得られるが、好ましい媒体はハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ１２と１〜５％ウシ胎仔血清で強化されたＤＭＥＭである。
【０００６】
Ｌ．イントラセルラリスの培養は、培養細胞を一定の生育段階に維持することにより、良好に行うことができる。従って、培養細胞単層は接種時の約２０〜約５０％の密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）でなければならない。好ましくは、細胞は接種時の約３０％〜約４０％の密度でなければならず、最も好ましくは、約３０％の密度である。
または、以下に記載するように、接種する前に細胞を懸濁液中で生育させてもよい。好ましくは、細胞は最初に、接着型システム、例えばローラーボトルシステム、中で単層の形態で１００％の密度まで生育させ、次に３〜３０００リットルに移して、懸濁中で生育させる。
接種材料は、感染ブタまたは他の動物から得たＬ．イントラセルラリスの培養物であってもよい。
【０００７】
接種材料は、ＰＰＥに感染したブタまたは他の動物の回腸の粘膜をこすり落とすことにより作成した腸ホモジネートであってもよい。腸ホモジネートを作成する場合には、培養のために選択する回腸動脈部分は、内臓の全体的な肥厚を伴う重篤な障害を示すべきである。細菌は脆弱な性質を有するため、試料は解剖後できるだけ迅速に−７０℃に保存することが好ましい。Ｌ．イントラセルラリスが耐性である抗生物質、例えばバンコマイシン、アンホテリシンＢまたはアミノグリコシド系抗生物質（２〜３例をあげると、ゲンタマイシン及びネオマイシン）を接種材料に添加して、Ｌ．イントラセルラリスの生育を行う間、細菌による汚染を抑制することが好ましい。接種材料は精製された培養であるかまたは腸ホモジネートであり、培養細胞の接種は、当該技術分野で知られている様々な技術により行うことができる。
【０００８】
細菌及び／または接種した培養細胞を次に、低下した溶解Ｏ2濃度の下でインキュベートする。１０％より高い溶解酸素濃度では、Ｌ．イントラセルラリスの生育は、最良よりは低く、この範囲外の酸素濃度で最終的に生じる生育の停止を伴う。好ましくは、細菌および／または接種細胞を、約０％〜約１０％の範囲の溶解酸素濃度でインキュベートする。さらに好ましくは、細菌および／または細胞を、約０％〜約８％の範囲の溶解酸素濃度でインキュベートし、最も好ましくは約０％〜約３．０％の範囲の溶解酸素濃度で行う。
【０００９】
二酸化炭素の適切な濃度も、Ｌ．イントラセルラリス．の適切な生育に重要である。０％より高く、４％より低い二酸化炭素濃度では、最適な生育は起こらず、この範囲外の二酸化炭素濃度において最終的に起こる生育の停止が起こる。好ましくは、二酸化炭素濃度は、約６％〜約１０％であり、最も好ましくは約８．８％である。
【００１０】
更に、細胞を約７３％〜約９６％の水素濃度でインキュベートすることが好ましい。窒素を、存在する水素の一部または全てに置き換えて用いてもよい。細胞を、約０〜約８．０％のＯ2、約８．８％のＣＯ2、及び約８３．２％のＨ2の存在下でインキュベートすることが最も好ましい。
【００１１】
接種した細胞を、適切な水素、酸素及び二酸化炭素濃度を有しかつインキュベーションの間細胞を懸濁状態にさせる、二重ガスインキュベーターまたは他のガスチャンバー中でインキュベートしてもよい。チャンバーは、懸濁液中に接種された細胞を維持するための手段、ガスモニター、及び適切なガス濃度を供給し、維持するための供給源を有していなければならない。インキュベーション温度は、３０℃〜約４５℃の範囲であり、より好ましくは約３６℃〜約３８℃の範囲である。最も好ましくは、温度は約３７℃である。培養と希釈（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）に必要な器具は、本明細書を参照すれば、当該技術分野における当業者あるいは通常の技術者に容易に入手可能である。本発明を行うのに適切な器具の一例は、二重ガスインキュベーター、例えば、懸濁液中に細胞を維持するスピナーフラスコとつないだモデル４８０（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ，Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｐａｒｋ，ＩＬ）である。現時点の好ましい器具としては、媒体を含みかつ適切な濃度のスパージングガスを介してあるいは他の機械的攪拌手段により培養細胞を懸濁液中に維持することができ及び連続的に媒体中の溶解Ｏ2レベルをモニターすることができる、攪拌プレートまたは回転振とう機、発酵槽、バイオリアクターを含む。ニューブルンズウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）、ブラウン（Ｂｒａｕｎ）及び他の企業がこの目的に適切な発酵槽及びバイオリアクターを作成する。
【００１２】
インキュベーションの間、接種した細胞を懸濁状態で維持することにより、細胞、そしてＬ．イントラセルラリスの最大成育を、生育媒体及び水素、酸素及び二酸化炭素の適切な混合物への各細胞の暴露を増加させることにより、達成することができる。培養細胞を攪拌し、当該技術分野において知られている様々な方法により懸濁状態に維持する。そのような方法としては、例えば、培養フラスコ、ローラーボトル、メンブレン培養、バイオバッグ、ウェーブ（ＷＡＶＥTM）バイオリアクターシステム及びスピナーフラスコが挙げられる。内部が二重ガスインキュベーターまたは同様の装置であるスピナーフラスコ中で細胞をインキュベートすることにより、インキュベーションの間、細胞を懸濁状態で維持していもよい。“スピナーフラスコ”という用語は、本明細書では、パドル、プロペラまたは培養物を攪拌して細胞を懸濁状態で維持する他の手段を有するフラスコまたは他の容器を意味する。
【００１３】
または、接種した細胞を、細胞がコンフルエント（集密）となるまでインキュベートし、次に細胞を生育媒体を含むスピナーフラスコ中にいれ、フラスコを回転させながら二重ガスインキュベーター中でインキュベートする。好ましくは、接種した細胞を集めるかまたはトリプシン処理を行い、スピナーフラスコ中へ継代培養する。これは当該技術分野において知られている様々な方法、例えば細胞スクレーパーを用いて細胞を引き離す方法、により行うことができる。一度、細胞をスピナーフラスコに導入すれば、スピナーフラスコのパドルを通常約３０〜６０ｒｐｍの範囲で、磁気攪拌プレート上で攪拌させ、感染細胞を懸濁状態で維持する。
【００１４】
培養したＬ．イントラセルラリスの一部を次に、フレッシュな培養に継代して、Ｌ．イントラセルラリスバクテリアの生産を向上させる。用語“継代”またはその類語は本明細書において、培養したＬ．イントラセルラリスの一部を、フレッシュな培養細胞に移し、フレッシュ細胞を当該バクテリアにより感染させることをいう。用語“フレッシュ”は、本明細書では、Ｌ．イントラセルラリスに感染していない新鮮な細胞を意味する。そのような細胞の日齢は、平均して、約１日より長くないことが好ましい。
【００１５】
懸濁培養中のＬ．イントラセルラリスの継代は、原培養の一部を除去し、それをフレッシュな培養細胞を含む新しいフラスコ中へ添加することにより、行ってもよい。もし、原培養中の１ｍｌのバクテリア数が多い場合、例えば、約１０4バクテリア／ｍｌより多い場合には、フレッシュな細胞を含む新しいフラスコへ、感染フラスコから約１〜１０％（体積／体積）の培養物を添加することが好ましい。これは５０〜１００％の細胞が感染した場合に好ましく行われる。もし、５０％より少ない細胞が感染した場合には、継代は好ましくは、培養を１：２にわけて新しいフラスコへいれ、フレッシュ媒体を添加することにより体積をスケールアップする。いずれの場合も、従来の単層培養の継代と対照的に、細胞溶解及び他の工程を必要としない。
【００１６】
間接蛍光抗体（ＩＦＡ）染色、ＴＣＩＤ50または他の同等の方法により測定することにより、培養細胞の十分な成育及びその後のＬ．イントラセルラリスによる感染の後、少なくとも一部の培養Ｌ．イントラセルラリスバクテリアを次に回収する。本明細書の記載を考慮して、当業者に知られている様々な方法により懸濁液からバクテリアを分離することにより回収工程を行ってもよい。好ましくは、全てまたは一部の懸濁液の内容物を遠心分離して培養細胞のペレットとし、得られた細胞ペレットを再懸濁し、さらに感染細胞を溶解することにより、Ｌ．イントラセルラリスバクテリアを回収してもよい。典型的には、少なくとも一部の含有物を約３０００ｘｇで約２０分間遠心分離し、細胞及びバクテリアをペレット化する。ペレットを次に、例えば、シュークロース−ホスフェート−グルタメート（ＳＰＧ）溶液中に再懸濁し、２５ゲージの針に約２０回通し、細胞を溶解させる。更に精製が必要な場合には、試料を約１４５ｘｇで約５分間遠心分離して、細胞の核と残渣を除去することができる。上澄みを次に約３０００ｘｇで約２０分間遠心分離して、得られたペレットを適する希釈剤（例えばウシ胎児血清を含むＳＰＧ）中に懸濁するか（凍結乾燥、冷凍処理に適した回収バクテリアを作成するため、あるいは接種物として使用するため）、または生育媒体中に懸濁する（フレッシュ細胞への継代により適する採取バクテリアを作成するため）。
【００１７】
上述したように、組織細胞の活性な成育を維持することにより、大スケール生産に有効なＬ．イントラセルラリスの生育が強化される。懸濁培養物を使用することにより、細胞の活性な生育の維持を大きく促進し、連続的な培養拡大及びスケールアップを可能にする。発酵槽と上述した約０〜３％の溶解させたＯ2を用いることにより、１０8バクテリア／ｍｌまでの生育を可能にする。
【００１８】
ＭｃＣｏｙｓまたはＩＥＣ−１８細胞を用いる場合には、ゼラチン、アガロース、コラーゲン、アクリルアミドまたはシリカビーズ、例えば、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅ−Ｇ多孔性マイクロキャリア（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ Ｕｔａｈ）を生育媒体と共に添加することが好ましい。しかし、ＨＥｐ−２細胞及び他の細胞は、本明細書で使用する方法に従ってマイクロキャリアを用いる必要はない。
培養維持の目的において、ＨＥｐ−２培養物を用いる場合、１週間に１度の間隔で、好ましくは２５％〜５０％の培養物を除去し、フレッシュな媒体に置換する。マイクロキャリアまたはビーズと細胞培養物の場合には、１週間に１〜２回の間隔で、好ましくは２５％〜５０％の培養物を除去し、フレッシュな媒体に置換する。スケールアップの目的では、培養物に、追加の２５％〜５０％の媒体、またはマイクロキャリアを含む媒体を添加してもよい。
【００１９】
培養細胞が感染する比率に依存して、フレッシュな細胞への継代は通常、約２〜約７日毎に起こる。培養細胞が２〜７日間に少なくとも７０％が感染するとすれば、好ましくは継代は約５〜７日間毎に起こることが好ましい。
【００２０】
Ｌ．イントラセルラリス抗原の診断は、今日、直接免疫蛍光法及びＰＣＲを用いて行われる。Ｌ．イントラセルラリスに特異的な抗体の診断は、免疫蛍光法を用いて行われる。これらの方法は、面倒であり、時間がかかり、大きなスケールでのスクリーニングには適さない。
【００２１】
ＰＰＥの効果的な診断はまた、原因バクテリアの培養に必要な時間により妨げられてきた。本発明により、ＰＰＥ感受性の豚及び他の動物から採取した生物試料中のＬ．イントラセルラリスの、迅速かつ正確なアッセイを促進する診断ツールの開発が可能になった。
従って、本発明の技術的課題は、改良されたＬ．イントラセルラリス疾病の診断方法を提供することである。
【発明の開示】
【００２２】
本発明の簡単な要約
本発明は、動物の健康の分野、特にローソニアイントラセルラリスに関する。特に、本発明はローソニアイントラセルラリス感染を診断する方法、及びローソニアイントラセルラリス特異的抗体を用いる診断試験キットに関する。本発明はまた、ローソニアイントラセルラリスの感染を診断するための、前記方法または試験キットの使用に関する。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の実施態様の説明の前に、本明細書及び請求項において使用される用語について以下のように定義する。単一のものとして表現される場合でも（英文では“ａ”，“ａｎ”，“ｔｈｅ”を用いて表現されるもの）、文脈から明確にそのように理解できない限り、複数のものを含むものとする。従って、例えば、“バクテリア（単数、ａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）”は複数のバクテリア（ｂａｃｔｅｒｉａ）を含み、“細胞（単数、ｃｅｌｌ）”は一または複数の細胞並びに当業者に既知のその等価物を含む。以下、同様である。他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術者により一般に理解されるものと同じ意味で用いられる。本明細書で記載されるのと同様または等価ないずれの方法及び材料も、本発明の実施または試験において使用することが出来るが、好ましい装置及び材料を以下に述べる。本明細書において述べる全ての文献に報告されているように、細胞系、ベクター、及び方法を記載し開示する目的で、これらの文献を全て本明細書に組み入れるものとする。そのような開示が本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【００２４】
本明細書において、用語“Ｌ．イントラセルラリス”は、細胞内湾曲グラム陰性バクテリア（Ｃ．Ｇｅｂｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．３，５３３−５３８（１９９３）及びＳ．ＭｃＯｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．４，８２０−８２５（１９９５）にその詳細が開示されている。これらの文献を全て本明細書に組み入れるものとする。）；当業技術分野及び本明細書に開示される、ＰＰＥ感染豚または他の動物から得られる原因バクテリア；及び自然あるいは人工的に得られる、上記バクテリアの変異体若しくは変異株、並びにＤＮＡ、ＲＮＡ及びＬ．イントラセルラリスに特異的なバクテリアタンパク質（ベクター中あるいはインビボ適用後に発現されたタンパク質を含む）、及びさらにＬ．イントラセルラリスのフラグメントまたは抗原性の誘導体、を含む。この用語はまた、以下に定義する、改変単離体及び弱毒化単離体を含む。
【００２５】
本明細書において、用語“改変単離体”は、細胞培養または他の技術における培養及び継代技術に従い製造され、抗原製造のために複製したＬ．イントラセルラリス単離体を意味する。本明細書において、用語“弱毒化単離体”は、細胞培養または他の技術における培養及び継代技術に従い製造され、宿主動物に投与した場合、免疫原性を維持しながら弱毒化を達成するＬ．イントラセルラリス単離体を意味する。
【００２６】
本明細書において、用語“大スケール培養”は、Ｌ．イントラセルラリスの培養レベルが、約２．０〜３．０リットルより多い場合を意味し、１００リットル以上のスケールの生産を含む。本明細書において“培養”は、Ｌ．イントラセルラリスの生育、再生産および／または増殖を促進するプロセスを意味する。
【００２７】
発明の開示
上記技術課題は、請求項中の記載及び実施態様により解決される。
本発明の目的は、臨床前（病状発現前）または臨床におけるＬ．イントラセルラリス感染の診断方法を提供することである。さらに、Ｌ．イントラセルラリスの免疫応答を検出すること、及びＬ．イントラセルラリス疫学のためのツールを提供することである。
【００２８】
上記目的は、本明細書及び請求項の観点に従う本発明、すなわち臨床前または臨床におけるＬ．イントラセルラリス感染の診断方法、により達成された。
本発明は、Ｌ．イントラセルラリスに対する抗体の検出、及びＬ．イントラセルラリスそれ自身の検出に関する。そのような抗体は、当業者に既知のいずれの抗体型をも含み、特にサブタイプＩｇＡ、可溶性ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）、及び更にＩｇＤ、ＩｇＥである免疫グロブリンを含む。
本発明に従って、Ｌ．イントラセルラリスに特異的な抗体を検出するには、前記方法は下記の事実を基礎とする。
ａ）液体試料を哺乳類から採取する。
ｂ）そのような液体試料のＬ．イントラセルラリス抗原への特異的結合を検出する。
ｃ）得られた結果をコントロールと比較する。
【００２９】
上述したように、Ｌ．イントラセルラリスは、Ｌ．イントラセルラリスのフラグメントまたは抗原性誘導体を含み、それらは上記方法において使用してもよい。
同様に、本発明に従えば、Ｌ．イントラセルラリスを検出するためには、下記の事実を基礎とする。
ａ）液体試料を哺乳類から採取する。
ｂ）そのような液体試料のＬ．イントラセルラリス抗体への特異的結合を検出する。
ｃ）得られた結果をコントロールと比較する。
【００３０】
液体試料は、唾液、汗、尿、血液、分泌物、排出物、または当業技術分野の専門家に既知の他の体液試料を含む、いずれの体液を含んでいてもよい。好ましい実施態様において、液体試料は、採集容器（尿または他の液体用）、シリンジ／収集チューブ（血液用）またはある種の収集綿棒（唾液、汗、等）のいずれかを用いて収集される。もし工程中の試料がａ）血液である場合には、血清またはプラズマをその血液試料から単離し、工程ｂ）を、液体試料の代わりに血清またはプラズマで行うことが好ましい。次に工程ｃ）を上述したように行う。
【００３１】
好ましい実施態様において、本発明の方法は免疫試験である。免疫試験では、Ｌ．イントラセルラリスに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清を用いる。本発明の免疫試験は、ＥＬＩＳＡ試験（酵素結合した免疫吸着剤アッセイ）またはいわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡ試験、ドットブロット、免疫ブロット、放射線免疫試験（放射線免疫アッセイ、ＲＩＡ）、拡散−ベースのオークタロニー試験またはロケット免疫蛍光アッセイのような当業技術において既知の検出方法を含む。他の免疫試験は、間接または直接免疫蛍光抗体試験（“ＩＦＡ”）である。他の免疫試験は、いわゆるウェスタンブロット法（ウェスタン転写法またはウェスタンブロッティング法ともいう）である。ウェスタンブロット法の目的は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したタンパク質またはポリペプチドを、ニトロセルロースフィルターまたは他の適切な担体上に転写し、同時にゲル電気泳動から得られるタンパク質またはポリペプチドの相対位置を保持することである。ウェスタンブロット法は、次に、検討中のタンパク質またはポリペプチドに特異的に結合する抗体とインキュベートを行う。平均的な当業者はこれらの検出方法を用いて、本発明を実施することができる。当業者が上記方法及び他の検出方法を見出すことができる文献は以下のとおりである：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（アムステルダム、オランダ）（１９８６）； Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（オーランド、フロリダ）Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）； Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（アムステルダム、オランダ）（１９８５）。固形及び液体タンパク質チップ技術またはラベル化または非ラベル化試薬を用いるマイクロアレー技術もまた、本発明に従う免疫試験法である。そのような試験は、例えば、下記文献に広く記載されている：Ｋｏｚａｋ ＫＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｓｅ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００３ Ｏｃｔ １４；１００（２１）：１２３４３−８（２００３），またはｂｙ Ｆｕｌｔｏｎ，ＲＪ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＦｌｏｗＭｅｔｒｉｘ（ＴＭ）ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（９），１７４９−１７５６（１９９７）。
【００３２】
本発明は、Ｌ．イントラセルラリス感染を検出する診断試験キットに関連する。前記キットは、本明細書において述べる臨床前または臨床におけるＬ．イントラセルラリス感染の診断方法を行うのに必要な全ての要素を含む。本発明は更に、Ｌ．イントラセルラリスに特異的な抗体を含む診断試験キットに関する。
本発明は更に、本発明の抗体がポリクローナルである診断試験キットに関する。
本発明はまた、本発明の抗体がモノクローナルである診断試験キットに関する。
【００３３】
診断試験キットは、本発明に従う診断法のための全ての成分を集めたものである。本発明の方法を行うための他の要素の例としては（網羅的なリストではない）、９６ウェルプレートまたはマイクロタイタープレート、テストチューブ等の容器、他の適切な容器、面及び支持体、ニトロセルロースフィルターのようなメンブレン、洗浄試薬及びバッファーが挙げられる。診断試験キットは、結合した抗体を検出しえる試薬を含んでいてもよい。試薬の例としては、ラベル化二次抗体、発色団、酵素（例えば、抗体と結合したもの）及びその基質または抗体を結合しえる他の基質が挙げられる。
【００３４】
本明細書に記載の、あるいは当業者に既知の、Ｌ．イントラセルラリスバクテリア、またはそのバクテリアから誘導される成分を、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイ（たておば、免疫蛍光抗体試験（“ＩＦＡ”）の抗原として用いて、当該バクテリアに感染していると疑われる動物の血清または他の体液中のＬ．イントラセルラリスに対する抗体を検出することができる。本発明において好ましい免疫アッセイは、下記例で示すようにＩＦＡである。または、本発明のバクテリアをウェスタンブロットアッセイにおいて用いることができる。
【００３５】
好ましいウェスタンブロットプロトコールは以下のとおりである。
１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、好ましくは１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で抗原を泳動させ、ニトロセルロースメンブレン上へ転写する。
２．メンブレンをブロッキングバッファー中に２時間置く。
３．ブロッキングバッファーを除き、ＰＢＳで１分間リンスする。
４．ブロッキングバッファーにより血清を希釈し、メンブレンへ添加する。室温で２時間インキュベートする。
５．洗浄バッファーで３回洗浄する（各洗浄につき５分間）。
６．ブロッキングバッファーにより、結合した抗Ｌ．イントラセルラリス特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体を希釈し、メンブレンへ添加する。室温で１時間インキュベートする。
７．洗浄バッファーで３回洗浄する。
８．１０分間または強力なバンドが生じるまで基質を添加する
９．ＰＢＳでリンスする。
１０．風乾し、暗室に保存する。
抗体に結合させたコンジュゲートは、例えば、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）のような酵素である。または、発色団あるいは他の基質存在下に定量化できる検出可能な物質である。
【００３６】
本発明の最も好ましい免疫試験はＥＬＩＳＡ法である。最も好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（＝捕捉ＥＬＩＳＡ法）である。そのようなＥＬＩＳＡ法は、同じ抗原上の二つの異なるエピトープに特異的な二つの抗体を検出できるので、より特異的である。サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、非ラベル化抗体をミクロタイタープレート上に被覆する。抗原であるＬ．イントラセルラリスを次に添加する。洗浄工程後、結合したＬ．イントラセルラリス抗原を、Ｌ．イントラセルラリスの異なるエピトープと反応性の第二のラベル化Ｌ．イントラセルラリス−特異的抗体で検出する。
被覆工程の例は以下のとおりである。例えば、ｄｄＨ2Ｏ溶液中の１０％シュークロース／１０％正常ウマ血清中の、非ラベル化抗体でプレートを被覆し、ローソニアイントラセルラリス抗原と共にインキュベートする。プレートを次に乾燥し、密閉し、３７℃で保存する。または、抗体被覆プレートを保存し、ＥＬＩＳＡを行う際に抗原を添加する。
【００３７】
本発明の好ましいＥＬＩＳＡプロトコールは以下のとおりである（抗体被覆プレートの使用）。
１．被覆バッファーで希釈した抗原０．１ｍｌ／ウェルを添加する。４℃で１８時間インキュベートする。
２．ＰＢＳで３回洗浄する。
３．プレートの各ウェルに０．２５ｍｌのブロッキングバッファーを添加する。３７℃で１〜２時間インキュベートする。
４．洗浄バッファーで３回洗浄する。
５．ブロッキングバッファーで血清を希釈し、プレートの第一ウェルに０．１ｍｌ添加する。プレートにわたって連続的に１：２希釈を作成する。３７℃で１時間インキュベートする。
６．洗浄バッファーで３〜５回洗浄する。
７．結合した抗−Ｌ．イントラセルラリス特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体、をブロッキングバッファーで希釈し、プレートのウェルに０．１ｍｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
８．洗浄バッファーで３〜５回洗浄する。
９．基質を添加する。
１０．分光光度計により光の吸収を測定する。
１１．抗原を添加しなかったウェルをブランクとして用いる。
１２．また各試験において、陽性及び陰性コントロール豚血清を使用しなければならない。
【００３８】
好ましいＥＬＩＳＡ法は以下のとおり行う。例えばｄｄＨ2Ｏ溶液中の１０％シュークロース／１０％正常ウマ血清被覆中の非ラベル化抗体で、プレートを被覆し、ローソニアイントラセルラリス抗原と共にインキュベートする。プレートを次に乾燥し、密閉し、３７℃で保存する。
１．９０μｌバッファーを全てのウェルに添加する。
２．選択したウェル中に１０μｌの血清を添加する。
３．３７℃で１時間プレートをインキュベートする。
４．ＰＢＳＴにより３回プレートを洗浄する。
５．ＣＤＳ−Ｃ＋０．５Ｍ ＮａＣｌで希釈した、ＨＲＰが結合した抗−Ｌ．イントラセルラリス特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体、１００μｌ／ウェルを添加する。
６．３７℃で１時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴで３回プレートを洗浄する。
８．基質１００μｌ／ウェルを添加し、室温で１０分間インキュベートする。
９．５０μｌの停止液（ｓｔｏｐ）／ウェルを添加する。
１０．分光光度計により４５０ｎｍでプレートを読む。
【００３９】
本発明に従う、最も好ましいサンドイッチＥＬＩＳＡプロトコールは以下のとおりである。
１．被覆バッファーで希釈した０．１ｍｌ／ウェルのｍＡｂを添加する。４℃で１８時間インキュベートする。
２．ＰＢＳにより３回洗浄する。
３．バッファーに希釈した０．１ｍｌ／ウェル抗原を、プレートの各ウェルに添加する。３７℃で１〜２時間インキュベートする。
４．洗浄バッファーにより３回洗浄し、および／または０．２５ｍｌのブロッキングバッファーをプレートの各ウェルに直接添加する。３７℃で１〜２時間インキュベートする。
５．洗浄バッファーにより３回洗浄する。
６．ブロッキングバッファーで血清を希釈し、プレートの第一ウェルに０．１ｍｌを添加する。プレートを横方向に、連続１：２希釈を行う。３７℃で１時間インキュベートする。
７．洗浄バッファーで３〜５回洗浄する。
８．結合した抗Ｌ．イントラセルラリス特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体、をブロッキングバッファーにより希釈し、プレートのウェルへ０．１ｍｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
９．洗浄バッファーにより３〜５回洗浄する。
１０．基質を添加する。
１１．分光光度計により光の吸収を測定する。
１２．抗原を添加していないウェルをブランクとして使用する。
１３．陽性及び陰性コントロール豚血清を、各試験において使用する。
【００４０】
本明細書における抗原は、上記で定義したＬ．イントラセルラリスである。ｍＡｂは、Ｌ．イントラセルラリスに特異的なモノクローナル抗体に関する。好ましくは、そのような抗体は後述する抗体である。
驚くべきことに、顕著な抗体が産生され、本発明のＥＬＩＳＡ法において使用された。抗体は、下記番号を有する：３０１：３９、２８７：６、２６８：２９、１１０：９、１１３：２及び２６８：１８。全ての抗体は、Ｌ．イントラセルラリスバクテリア抗原に特異的である。好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける捕捉抗体は、１１０：９、１１３：２または２８７：６であり、結合抗体としては２６８：１８、２６８：２９または２８７：６である。捕捉抗体としては抗体１１０：９が、結合抗体としては抗体２６８：２９が、最も好ましい。上述した抗体の全ての特性を有する抗体もまた好ましい。すなわち、上述した抗体とほとんど同じ結合特性を有するか、および／または上述した抗体と比較して同じローソニアイントラセルラリス抗原に対するものか、および／または上述した抗体と比較して同じエピトープを認識するものに関する。
【００４１】
本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞により生産される。本発明の前記ハイブリドーマ細胞は、アプライドマイクロビオロジーアンドリサーチセンター（ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＡＭＲ））と欧州細胞培養コレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ＯＪＧ，ＵＫ）に、ブダペスト条約に従って寄託されている。寄託日は、２００４年５月１１日である。ハイブリドーマセルライン（ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ ＣＥＬＬ ＬＩＮＥ）１１０：９は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０４として登録されている。ハイブリドーマセルライン１１３：２は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０１として登録されている。ハイブリドーマセルライン２６８：１８は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０２として登録されている。ハイブリドーマセルライン２６８：２９は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０６として登録されている。ハイブリドーマセルライン２８７：６は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０３として登録されている。ハイブリドーマセルライン３０１：３９は、ＥＣＡＣＣ Ａｃｅ．Ｎｏ．０４０９２２０５として登録されている。
【００４２】
本発明は更に、下記実施例により説明される。下記実施例は、例示の目的においてのみ示されるものであって限定するものではない。本発明の他の改変は、当業者に自明である。本明細書で引用する全ての文献及び特許文献を本明細書に全て組み入れるものとする。
【実施例】
【００４３】
実施例１
１．０ 材料
抗ローソニアハイブリドーマ細胞系：３７２：１３，１１３：２，２６８：１８，２８７：６，１１０：９，２６８：２９，３０１：３９．
ハイブリドーマ細胞培養のための器具と媒体
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の精製とＨＲＰ結合のための器具とバッファー
ＥＬＩＳＡのための器具と溶液
ローソニア抗原ＳＦ１２８９ Ｎ３４３ １２／２０／００
ローソニア陽性血清：ｌｏｔ＃０５２９０２ｐｉｇ＃２６（実験的感染）
ｌｏｔ＃０５２９０２ｐｉｇ＃６９（ワクチン接種）
ローソニア陰性血清：ｐ ２５．８＃２７３ Ｄａｙ ５２ ６−３０−９５
１１６７０５
【００４４】
１．１ 方法
モノクローナル抗体の作成を、スバノババイオテック（Ｓｖａｎｏｖａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）における標準操作方法に従い、行った。
１．１．１ ハイブリドーマ細胞の培養とＨＲＰ結合モノクローナル抗体の作成
−ハイブリドーマ細胞系を確保するために、各細胞系につき１５バイアルづつ作成し、−１３５℃で保存した。
−各ハイブリドーマ細胞系の１バイアルを解凍し、細胞を細胞培養フラスコ中で生育させた。
−各細胞系からの５００ｍｌ〜１０００ ｍｌの上澄みを精製し、ホースラディッシュパーオキダーゼに結合した。
【００４５】
１．１．２ ブロッキングＥＬＩＳＡ法
精製し、かつＨＲＰ結合したｍＡＢについて、ＥＬＩＳＡ法によりローソニア陽性豚血清によりブロックされる能力を試験した。
−ＥＬＩＳＡプレートを、希釈率１／２００、１００μｌ／ウェルでローソニア抗体により被覆した。
−豚血清を１／１０、１００μｌ／ウェルに希釈した。
−ＨＲＰ結合ｍＡｂを希釈し、添加した（１００μｌ／ウェル）
結果を、下記式に従う抑制率（ＰＩ）で表した。
ＰＩ＝１−（ＯＤ試料／ＯＤｍＡｂ）ｘ１００．
【００４６】
１．２ 結果
１．２．１ ハイブリドーマ細胞の培養とＨＲＰ結合モノクローナル抗体の作成
−１つを除き、全てのｍＡｂを首尾よく精製し、ＨＲＰと結合した。これらは良好な生産能力を有していた。
−ｍＡｂ３７２：１３は低い生産能力を有していた。このｍＡｂはＨＲＰと結合できず、そのためブロッキングＥＬＩＳＡ法において試験できなかった。
１．２．２ ブロッキングＥＬＩＳＡ法
−二つの陽性血清（＃２６，＃６９）及び二つの陰性血清（２５．８＃２７３，１１６７０５）を実験で使用した。
−実験的に感染した血清（＃２６）は、全ての６つのＨＲＰ結合ｍＡｂを抑制したが、それぞれ異なるレベルであった。ワクチン接種した豚からの血清はｍＡｂをより低い程度で抑制した。
−陰性血清は全く抑制しないか非常に低い抑制を示した。
結果を下記表及び図１に示す。
【００４７】
ｍＡｂ
血清 ３０１:３９ １１０:９ ２６８:２９ ２８７:６ １１３:２ ２６８:１８
＃２６（実験的）
＋ ５７ ４５ ７８ ７４ ４２ ７２
＃６９（ワクチン接種）
＋ １８ ２３ ５２ ４３ ４５ ２５
２５．８＃２７３
− ７ ３ ２７ ２０ １４ ２１
１１６７０５
− −７ −９ −２４ −１３ １８ −１９
【００４８】
１．３ ディスカッション
本研究の結果は、試験したモノクローナル抗体の一以上がローソニアイントラセルラリスに対するブロッキングＥＬＩＳＡ試験に適することを明確に示している。ＭＡｂ２６８：２９，２８７：６及び２６８：１８は、陽性及び陰性血清の間の最も明確な差異を示している。すなわち、これらはブロッキングＥＬＩＳＡの開発における強力な候補である。
【００４９】
実施例２
２．０ 要約
ローソニアイントラセルラリスに対する抗体検出のための、サンドイッチｂ−ＥＬＩＳＡプロトタイプの開発及び確立：
免疫蛍光試験ＩＦＡを標準として使用して、感度及び特異性を計算した後、以下を結論付けることができる。
−捕捉ｍＡｂ１１０：９は、陽性及び陰性試料間に明確な差異を与える。
−検出ｍＡｂ２６８：２９ ＨＲＰは、陽性及び陰性血清間に明確な差異を与え、１００％の感度と特異性を示す。
−プロトタイプは下記を推奨する：
−ヌンクマキシソープストリップＣ−８（Ｎｕｎｃ ｍａｘｉ−ｓｏｒｐ ｓｔｒｉｐｓ Ｃ−８）で被覆した、ｍＡｂ１１０：９を捕捉ｍＡｂとする。
−抗原（Ａｇ）：ローソニアイントラセルラリス培養物（好ましくはＲ＆Ｄ、Ｂｌで製造された濃縮物）
−０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴで１／１０に希釈された血清試料。３７℃で１時間インキュベートする。
−０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＣＤＳ−Ｃバッファー中で凍結乾燥された、ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９。３７℃で１時間インキュベートする。
−基質Ｋ−Ｂｌｕｅ Ｍａｘ。室温で１０分間インキュベートする。
−スバノバ停止液。
【００５０】
２．１ 材料及び方法
ＥＬＩＳＡ法を下記手順に従い、行った。
２．１．０ ＥＬＩＳＡ法
−９０μｌのバッファーを全てのウェルに添加する。
−１０μｌの血清を選択したウェルに添加する。
−プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
−プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
−ＣＤＳ−Ｃ＋０．５Ｍ ＮａＣｌで希釈したＨＲＰ結合ｍＡｂを１００μｌ／ウェルの濃度で添加する。
−３７℃で１時間プレートをインキュベートする。
−ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。
−基質を１００μｌ／ウェルの濃度で添加し、室温で１０分間インキュベートする。
−５０μｌ／ウェルの停止液を添加する。
−プレートについて分光光度計により４５０ｎｍの吸収を測定する。
結果を１−ＯＤ値または２−ＰＩ（抑制率）値、すなわち、１００−試料ＯＤ／ｍＡｂＯＤ×１００、として示した。
【００５１】
２．１．１ 試験１（ＥＬＩＳＡ０３０９２２，０３０９２３ｘ２）
ｍＡｂ １１０：９，１１３：２，３０１：３９，２８７：６，２６８：２９、３００ｎｇ／ウェルにより被覆したＣ−８マキシストリップ。
１０％ ２２５１ ＨＡＳ（正常ウマ血清），１０％シュークロース／ＵＨＰ Ｈ2Ｏによるストリップのブロッキング。１５０μｌ／ウェル、室温で３０分間インキュベート。
ＰＢＳＴにより１／１０に希釈したＡｇ＃０３０６１９、１００μｌ／ウェル。４℃で３時間インキュベート。
３７℃で３時間乾燥したストリップ。４℃に保存。
血清：ＩＦＡ陽性：＃２６，＃６９。ＩＦＡ陰性：＃６，Ｃ１，Ｄ１，Ｅ１。０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴにより１／１０に希釈。
結合体：２６８：１８，１１３：２，３０１：３９，１１０：９，２８７：６，２６８：２９ ＨＲＰ ０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴ中に希釈。
全捕捉ｍＡｂを、それ自身を除く全てのＨＲＰ結合ｍＡｂに対して試験した。
【００５２】
２．１．２ 試験２（ＥＬＩＳＡ０３０９２４）
試験１に従い、１１０：９，１１３：２及び２８７：６により被覆したストリップ。
血清：ＩＦＡ陽性：＃２６，＃６９。ＩＦＡ陰性：＃６，Ｃ１，Ｄ１，Ｅ１。０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴ中に１／１０に希釈した。
ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：１８，２６８：２９，２８７：６。０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＣＤＳ−Ｃ（結合体を凍結乾燥するための標準バッファー（生産におけるスバノバとして））中に希釈。
【００５３】
２．１．３ 試験３（ＥＬＩＳＡ０３０９２５）
試験１に従い、１１０：９，１１３：２及び２８７：６により被覆したストリップ。
血清：２４血清（ＩＦＡ陽性１０，ＩＦＡ陰性１０及び不明４）を試験した。希釈：０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴ中１／１０。
結合体：２６８：１８ ＨＲＰ ０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＣＤＳ−Ｃ中に希釈。
【００５４】
２．１．４ 試験４（ＥＬＩＳＡ０３０９３０，０３１００２，０３１００８）
試験１に従い、１１０：９により被覆したストリップ。
血清：２１ ＩＦＡ陽性及び６９ ＩＦＡ陰性。希釈：０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴにより１／１０に希釈。
結合体：ＨＲＰ結合２６８：１８及びＨＲＰ結合２６８：２９を０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＣＤＳ−Ｃで希釈。
【００５５】
２．２ 結果
２．２．１ 試験１（ＥＬＩＳＡ０３０９２２，０３０９２３ｘ２）
結合体２６８：１８、２６８：２９、２８７：６を伴う捕捉ｍＡｂ１１０：９，１１３：２及び２８７：６は、サンドイッチｂ−ＥＬＩＳＡに対する最良の候補と考えられる。これらの組合せは、陽性血清への最良のブロッキング容量を示したからである。血清番号＃６は、ほとんどの試験において陽性を示した。以前に開発されたｂ−ＥＬＩＳＡプロトタイプにおいてこの血清が陽性を示したことからこのことが推測された。
【００５６】
２．２．２ 試験２（ＥＬＩＳＡ０３０９２４）
この試験は、結合体の凍結乾燥に使用された標準バッファーを使用できることを確認するために、主に行われた。結果は、ブロッキングが陽性血清により達成されることを示している。最良のブロッキングは、検出ｍＡｂ２６８：１８または２６８：２９によるものであった。
【００５７】
２．２．３ 試験３（ＥＬＩＳＡ０３０９２５）
捕捉ｍＡｂ１１０：９は、陽性及び陰性試料を最も明確な区別するため、最良の選択であることが見いだされた。
【００５８】
２．２．４ 試験４（ＥＬＩＳＡ０３０９３０，０３１００２，０３１００８）
得られたＯＤ及びＰＩ値は添付５に記載されている。ＯＤ値をＩＦＡの結果に対してプロットすると、ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９は、１００％感度及び特異性で陽性と陰性を最も明確に区別する。ｍＡｂ２６８：１８もまた、１００％の感度と特異性を示すが、陽性と陰性試料の面積が小さい。ＰＩ値をプロットすると、ｍＡｂ２６８：１８はカットオフ２０．９において、感度が９５．７であり、特異性が１００％である。一方ｍＡｂ２６８：２９は、カットオフ２８．６において、感度及び特異性共に１００％である。
【００５９】
２．３．ディスカッション
免疫蛍光試験ＩＦＡに対する感度及び特異性を計算した後、以下を結論づけることができる。
−捕捉ｍＡｂ１１０：９は、陽性及び陰性試料の間の明確な差異を与えるため、最良の選択である。
−ＨＲＰを結合した検出ｍＡｂ２６８：２９は、１００％の感度及び特異性をもって、陽性と陰性の明確な区別を与えるので、最良の選択である。
プロトタイプは下記を推奨する。
−捕捉ｍＡｂとしてｍＡｂ１１０：９。ヌンクマキシ−ソープストリップＣ−８で被覆したもの。
−Ａｇ：ローソニアイントラセルラリス培養物（好ましくはＲ＆Ｄ、Ｂｌで製造された濃縮物）
−０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳＴにより１／１０に希釈した血清試料。３７℃で１時間インキュベート。
−ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９。０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＣＤＳ−Ｃバッファー中で凍結乾燥したもの。３７℃で１時間インキュベート。
−基質Ｋ−Ｂｌｕｅ Ｍａｘ。室温で１０分間インキュベート。
−スバノバ停止液
【００６０】
実施例３
３．１要約
加速安定性試験は、ローソニアイントラセルラリス抗原が捕捉されたＥＬＩＳＡプレートが、少なくとも一年の安定性を有すること、及びローソニアＨＲＰ結合体２６８：２９が凍結乾燥形態で６〜１２ヶ月の安定性を有することを示している。
【００６１】
３．２ 導入部
将来のローソニアイントラセルラリスＥＬＩＳＡキットの成分の安定性を評価するために、加速安定性試験を行う必要がある。試験すべき成分を３７℃で４週間保存し、その後、ＥＬＩＳＡにおいて試験を行い、４℃で保存した成分と比較した。３７℃における４週間の安定性は、約１２ヶ月の貯蔵寿命を示す。この報告は、抗原捕捉ＥＬＩＳＡプレートとＨＲＰ結合体について行った加速安定性試験について述べたものである。
【００６２】
３．３ 材料及び方法
プレート上での加速安定性（ＥＬＩＳＡ０３１０２４）
プレートをｄｄＨ2Ｏ中の１０％シュークロース／１０％正常ウマ血清でブロックしたローソニアのｍＡｂ １１０：９で被覆し、ローソニア抗原でインキュベートした。プレートを乾燥し、密閉し、３７℃に置いた。プレートを３７℃から第１週、第２週、第３週、及び第４週において取り出し、冷蔵庫内で保存した。また、参照として、全ての試験期間にわたって４℃に保存したプレートを用意した。
陽性血清＃２６，＃６９及び＃０６、及び陰性Ｃ２、Ｄ１及びＥ２を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡの性能をチェックした。
ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９ ｌｏｔ＃０３０１２０を使用した。
【００６３】
凍結乾燥結合体（ＥＬＩＳＡ０３１０２７）上の加速安定性
ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９ ｌｏｔ＃０３０１２０を、ガラスビン中でＣＤＳ−Ｃバッファーにより１／１０００に希釈し、標準方法により凍結乾燥を行った。４つの凍結乾燥ビンを３７℃で、１週間、２週間、３週間及び４週間保存した。また４℃で保存したビンも用意した。各ビンをサンドイッチＥＬＩＳＡで試験した。
陽性血清＃２６と陰性血清０３０９２６を使用した。
結合抗体の１／１０００希釈（“結合体希釈”）により、試験において高すぎるＯＤ値が得られることがわかった。結合抗体はそのため、試験において正しいシグナルが得られるようにプレート中で滴定した。
【００６４】
３．４．結果
プレート上での加速安定性
４℃に保存したストリップのＯＤ値と比較して、ＯＤ値の大幅な低下は第１週の後に見られた。第１週と第４週を比べても大きな差異はない。４℃におけるＰＩ値を見ると、第１週〜第４週の間、有意性は見られなかった。
凍結乾燥結合体の加速安定性
１／８０００の“結合体希釈”において、血清＃２６は４週間後、０．５４７から０．３９８への低下を示し、血清０３０９２６は４週間後、１．６５４から０．９９へ低下した。
【００６５】
３．５．ディスカッション
行った加速安定性試験は、ローソニアイントラセルラリスＥＬＩＳＡプレートが、少なくとも１年の安定性を有することを示している。抗ローソニアＨＲＰ結合２６８：２９抗体は、４週間後、陰性血清に対してＯＤ値において４０％減少を示した。これは、結合体の不安定性を示していると考えられる。ＯＤ値を計算した場合、１年後に、１．５ミーンズにおけるシグナルと０．９のＯＤ値の４０％減少は、依然として許容できる範囲である。
【００６６】
実施例４
４．１．要約
プロトタイプの開発が行われた際に使用した５０試料を使用することにより、プロトタイプの検証（プレートバッチ０４０１０７）を行った。検証されたバッチにおいて、陽性血清は１００％の一致を示したが、一方、検証バッチでは２５陰性血清のうち２つが陽性と示された。
豚血清の代わりに、正常ウマ血清がＣＤＳ−Ｃバッファー中で使用できることが見出された。
０．０４２％ＰＶＰを含むＰＢＳＴがＰＢＳＴタブレット（ＰＶＰを含む）を用いた場合と同様な結果を示すことが見出された。
【００６７】
４．２．導入部
サンドイッチＥＬＩＳＡプロトタイプを検証するために、より多数の血清を大スケールで生産したプレートバッチで試験しなければならない。試験を、プレートバッチ０４０１０７で行った。このバッチを、プロトタイプを開発するために以前に使用された５０血清試料を検査することにより試験した。
ＨＲＰ結合体を凍結乾燥する際にバッファーＣＤＳ−Ｃを保存剤として使用する。このバッファーは豚血清を含む。ＣＤＳ−Ｃバッファー中で使用されるべきローソニア陰性血清を見つけることが困難な場合には、代わりのものを試験するべきである。この試験において、正常ウマ血清及び胎児ウシ血清を試験した。
【００６８】
このＥＬＩＳＡにおける実験室的作業の殆どは、ＰＢＳＴタブレットを用いて行ってきた。スバノバキットに含まれる２０×ｃｏｎｃ．ＰＢＳＴは、試験が陽性及び陰性試料を正確に区別できないので、使用することができない。タブレットと２０×ｃｏｎｃ．ＰＢＳＴの処方を比較すると、全ての成分は、安定因子としてタブレット中に含まれる０．０４２％ＰＶＰ（ポリビニルピロリドンＫ２５）を除いて、同じであった。ＰＶＰを２０×ＰＢＳＴに添加すると、タブレットと同じ結果が得られることが実験により示された。
【００６９】
４．３．材料と方法
プロトタイプの検証（ＥＬＩＳＡ０４０３１２）
プロトタイプＥＬＩＳＡで予め試験した５０血清（バイオスクリーンから入手した）を、大スケールプレートバッチ＃０４０１０７で試験を行った。０．０４２％ＰＶＰを含むＰＢＳＴ ２０×ｃｏｎｃバッファーを用いた。凍結乾燥した結合体バッチ０４０３０８を用いた。
【００７０】
正常ウマ血清を含むＣＤＳ−Ｃバッファー
試験 ＥＬＩＳＡ０４０２０３
ＣＤＳ−Ｃバッファーを以下の成分と共に製造した：１−ブタ血清（ＴＪ４／０５Ｆと同様）、２−正常ウマ血清、及び３−胎児ウシ血清。バッファーをＥＬＩＳＡの結合バッファーとして試験した。試験した血清は、グリス（ｇｒｉｓ）２，４，１３及び１７，１−２９６６４，３−２９６６４，Ａ−２７２３９，Ｂ−２７２３９，＃２６及びＣ２であった。ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９ ｌｏｔ＃０３０３１８を用いた。０．０４２％ＰＶＰを含む２０×ｃｏｎｃＰＢＳＴを用いた。
【００７１】
試験 ＥＬＩＳＡ０４０３１１
正常ウマ血清含有ＣＤＳ−Ｃバッファーを用いて、二つの場合（０４０２１１，０４０３０８）における凍結乾燥した結合体を製造した。結合体を製造し、１／２０ｋ，１／２５ｋ及び１／３０ｋに最終的に希釈した。新たに製造した結合体を同時に試験した。血清＃２６，１−２９６６４，３−２９６６４，Ａ−２７２３９，Ｂ−２７２３９，陽性プール０３０９２６及び陰性プール０３０９２６を用いた。ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９ ｌｏｔ＃０３０３１８を用いた。０．０４２％ＰＶＰを含む２０×ｃｏｎｃＰＢＳＴを用いた。
【００７２】
ＰＶＰ含有ＰＢＳＴ（ＥＬＩＳＡ０４０３０１）
ＰＢＳＴバッファー２０×濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）を１／２０に希釈し、最終濃度０．０４２％のＰＶＰを添加した。このバッファーを同時に、１／２０に希釈した２０×ｃｏｎｃＰＢＳＴとＰＢＳＴタブレット（既にＰＶＰを含む）とを用いて試験した。このバッファーを全ての工程、すなわち、試料及び結合体の希釈バッファー並びに洗浄バッファーにおいて用いた。
血清＃２６，Ｅ１，１−２９６６４，３−２９６６４，Ａ−２７２３９，Ｂ−２７２３９及びグリス１３を用いた。ＨＲＰ結合ｍＡｂ２６８：２９ ｌｏｔ＃０３０３１８を用いた。結合体バッファーとして豚血清を含むＣＤＳ−Ｃを用いた。
【００７３】
４．４．結果
プロトタイプの検証
結果は、以前に陽性であった２５の全ての血清が、検証バッチにおいて陽性であることを示す。以前に陰性であった２５のうち二つは陽性を示した。
正常ウマ血清を含むＣＤＳ−Ｃバッファー
正常ウマ血清を含む当該バッファーは、豚血清を含むものと同様の結果を示した。
凍結乾燥されたＨＲＰ結合ｍＡｂの値は、新たに製造した結合体と比較して、０．４ＯＤで最も低下した。この低下は、凍結結合体の両方のバッチで認められた。得られたＯＤ値に関係なく計算されたＰＩ値はよく一致するので、試験の性能に影響していない。
ＰＶＰ含有ＰＢＳＴ
結果は、０．０４２％のＰＶＰを添加した、１／２０希釈した２０×濃縮ＰＢＳＴは、ＰＢＳＴタブレットと同様の結果を示した。一方、ＰＶＰを含まず、１／２０希釈された２０×濃縮ＰＢＳＴは誤った陰性結果を示した。
【００７４】
４．５．ディスカッション
プロトタイプを開発する際に以前に使用した５０血清を試験することによりプロトタイプ（プレートバッチ０４０１０７）の検証を行った。検証試験では、陽性血清については１００％一致した。一方、２５陰性血清のうち２つが検証バッチにおいて陽性を示した。この試験の主として重要な点は陽性試料の検出であるから、“誤った”陰性結果は許容しうる。また、以前の試験の結果が本当に正しいかはわかっていない。
【００７５】
０．０４２％ＰＶＰを含むＰＢＳＴが、ＰＢＳＴタブレット（ＰＶＰを含む）を用いた場合と同様の結果を示した。従って、将来のキットはこのバッファーを含む。ＰＶＰを含むＰＢＳＴの２０×ｃｏｎｃの安定性試験は、このキットの有効性を保証するために行われるべきである。
【００７６】
実施例５
５．１ 導入部と目的
ローソニアイントラセルラリスに対する血清抗体の検出は、現在までＩＦＡ試験の使用により行われてきた（１）。これらの試験は、結果の解釈において、各個人の高い主観的判断によるものである。最近、Ｌ．イントラセルラリスに対する高特異的モノクローナル抗体を用いたサンドイッチブロッキングＥＬＩＳＡが開発された。この試験のデータを、目的別に試験し、評価することができ、これにより再生産性、再現性及び比較分析を改良できる。この研究において、ＩＦＡ試験に対する第一比較データが示されており、これは新試験の適切さと性能を示している。
【００７７】
５．２ 材料と方法
ＭｃＣｏｙ細胞培養上で生育され、マイクロタイタープレート上で特異的なモノクローナル抗体により捕捉されたＬ．イントラセルラリス抗原を用いて、豚血清試料中のＬ．イントラセルラリスに対する抗体を検出した。血清を１〜１０倍に希釈して試験を行った。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳツイン液で洗浄し、ホースラディッシュパーオキシダーゼラベル化モノクローナル抗体（捕捉抗体とは異なる）を添加した。プレートを３７℃で更に１時間インキュベートした。非結合抗体を洗浄により除去した。ＴＭＢ基質と共に室温で１０分間インキュベーションを行った後、停止液を添加することにより反応を停止した。分光計で各ウェルについてＯＤ４５０を測定した。結果を血清を含まないコントロールの抑制率として計算した。
【００７８】
Ｌ．イントラセルラリスに対する抗体について、確認されたＩＦＡ試験（２）で試験された実地の３０１血清を用いて、新ＥＬＩＳＡ法を評価した。更に、既知の回腸炎を伴う二つの農場と回腸炎が疑われる一つの農場からの横断的試料（９歳の群から１０試料づつ）を用いて、ＩＦＡと比較した、ＥＬＩＳＡの診断値を示した。
【００７９】
５．３ 結果
多くの陰性血清が、陰性抑制値を示した。従って、最も低い測定値を０にセットし、全ての他の値はこれに関連づけられた。これらのデータを“相対ＥＬＩＳＡ値”と呼ぶ。
３０１の実地の血清の結果を図２に要約した。ＥＬＩＳＡは明らかに、陰性（平均相対ＥＬＩＳＡ値 ３６）と陽性（平均相対ＥＬＩＳＡ値 ８９）血清を区別した。ＩＦＡにおいて疑わしい点数の試料の大部分は、ＥＬＩＳＡで陽性であった。
３つの農場からの横断的スクリーニングの結果を図３に示す。両試験により、３つの農場におけるＬ．イントラセルラリスに対する抗体を明確に検出できた。
【００８０】
５．４ ディスカッション
ＩＦＡ試験結果と比較して、ＥＬＩＳＡ法は高い感度であった。３つの試験された農場のある群では、ＥＬＩＳＡの結果がＩＦＡ試験のそれよりも、非常に明確であった。蛍光試験が非特異的であったため、前記事実は多くの疑問を与えた。３つの群れにおける血清学的プロファイルは、以前に刊行された欧州の群れからのデータ（３，４）によく対応している。１０週齢と１６週齢の豚の群の間のＥＬＩＳＡ値の上昇をＩＦＡ試験のものと比較すると、５５より多い相対ＥＬＩＳＡ値を有する血清は陽性と判断することができることを示している。
この新試験は、ルーチン試料の回腸炎の診断の改良に役立つものである。新規ブロッキング回腸炎ＥＬＩＳＡ法は、客観的な基礎に基づく、大量の試料の迅速かつ高感度のスクリーニングのためのツールを提供する。
【００８１】
参考文献
１．Ｇｕｅｄｅｓ ＲＭＣ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｃａｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ６６：９９−１０７．
２．Ｋｎｉｔｔｅｌ ＪＰ ｅｔ ａｌ．，１９９８．ＡＪＶＲ ５９：７２２−７２６．
３．Ｂｉｋｓｉ Ｉ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｐｒｏｃ．１７th ＩＰＶＳ，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ
４．ｖａｎ Ａｋｅｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｐｒｏｃ．１７th ＩＰＶＳ，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ．
【００８２】
実施例６
６．１ 導入部と目的
現在まで、回腸炎特有の診断は、糞便中または腸組織試料中の抗体検出についてはＩＦＡ試験（１，２）またはＰＣＲ（３，４）により、抗原検出については組織学的及び免疫学的染色法（２，５，６）により行われてきた。全てのこれらの方法は、特異性、汚染リスクまたは作業負荷に関して特有の不利益点があり、大きなスケールで行う群れのルーチンスクリーニングには適さない。ほとんどの診断試験は、群れからの２、３の豚のみについて行われる。開発されたブロッキングＥＬＩＳＡ法の使用により、血清学試験はより容易となり、より確実になり、また群れのプロファイリングにより適するものとなる。独国の２２農場を横断するスクリーニングを新試験の診断性能を示すために行った。
【００８３】
６．２ 材料と方法
２２の独国農場にわたる試料をＥＬＩＳＡで試験した。各農場から、４，７，１０，１３，１６，２０及び２４週齢の若雌豚（ｇｉｌｔｓ）、雌豚（ｓｏｗｓ）及び豚（ｐｉｇｓ）の試料を採取した（各週齢につき１０試料づつ）。ＥＬＩＳＡを実施例５に記載のように行った。
【００８４】
６．３ 結果
図４に、全ての２２農場の平均相対ＥＬＩＳＡ値を示した。若雌豚（ｇｉｌｔ）及び雌豚（ｓｏｗ）からの血清は、ＥＬＩＳＡにおいて非常に反応性であったのに対し、４〜１０週齢のフラットデック豚（ｆｌａｔｄｅｃｋ ｐｉｇｌｅｔ）は低かった。肥育者（ｆａｔｔｅｎｅｒｓ）ではＥＬＩＳＡ値は、１３〜２４週に上昇した。
図５において、平均相対ＥＬＩＳＡ値は、農場の臨床症状と相関している。農場番号５，６及び１５は、試料採集の時、臨床的な腸の問題はなかった。農場番号３では、４〜１３週の子豚は、腸に問題があり、Ｅ．ｃｏｌｉ性下痢と診断された。農場番号１８では、以前の血清学試験が、農場内で臨床的な症状を示さないローソニアイントラセルラリスの存在を示した。農場番号１，２，７，８，９，１０，１１，１２，１９，２１及び２２では、この研究のための資料採集の前に回腸炎と診断された。農場番号４，１３，１４，１６及び２０では、飼育者と肥育者における腸の問題が報告された。農場番号４及び１３では、回腸炎が臨床的に疑われた。農場番号１７では、下痢の臨床的な徴候はなかったが、飼育者において、及び肥育の初期において抗生物質が使用された。
【００８５】
６．４ ディスカッション
２２農場からの要約された血清プロファイルは、雌豚及び若雌豚において高い反応性を示し、１３週から２４週までに抗体反応が産生されることを示す。これらの知見は、現在までに回腸炎に関して報告された血清学的データと一致する（７，８，９）。下痢を伴わない農場（Ｎｏ．５，６，１５及び１８）からの豚、及びＥ．ｃｏｌｉ性下痢を伴う農場（Ｎｏ．３）の豚は、ＥＬＩＳＡにおいて、顕著な血清変換を示さなかった。既知の回腸炎を伴う農場（Ｎｏ．１，２，７，８，９，１０，１１，１２，１９，２１及び２２）では、７週と１３週の間において、明確な血清変換を検出することができた。興味深いことに、ほとんどの雌豚及び若雌豚の群からの試料は、ＥＬＩＳＡにおいて非常に反応性であったが、これらの豚のほとんどは、明確な腸の疾病がなかった。これは、ローソニアイントラセルラリスの無症状感染によると考えられる。農場番号１７の結果は、無症状回腸炎を示しているようである。
【００８６】
本発明の新規なＥＬＩＳＡは、大きな試料サイズおよび群れの横断的スクリーニングのためのルーチン試験に適する、回腸炎の血清学的診断のための強力なツールを提供する。
【００８７】
参考文献
１．Ｋｎｉｔｔｅｌ ＪＰ ｅｔ ａｌ．，１９９８．ＡＪＶＲ ５９：７２２−７２６．
２．Ｇｕｅｄｅｓ ＲＭＣ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｃａｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ６６：９９−１０７．
３．Ｊｏｎｅｓ ＧＦ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３１：２６１１−２６１５．
４．Ｓｕｈ−ＤＫ ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ １：３３−３７．
５．ＭｃＯｒｉｓｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９．Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ ２６：２６０−２６４．
６．Ｈｕｅｒｔａ Ｂ ｅｔ ａｌ．，２００３．Ｊ Ｃｏｍｐ Ｐａｔｈ １２９：１７９−１８５．
７．Ｂｉｋｓｉ Ｉ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｐｒｏｃ．１７th ＩＰＶＳ，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ ８．ｖａｎ Ａｋｅｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｐｒｏｃ．１７th ＩＰＶＳ，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ ９．Ｈｏｌｙｏａｋｅ ＰＫ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２：１９８０−１９８５．
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明に従うブロッキングＥＬＩＳＡの結果を表す。
【図２】ＩＦＡとＥＬＩＳＡの比較における３０１の実地の血清の結果を表す。
【図３】回腸炎ブロッキングＥＬＩＳＡ−３農場（飼育場）横断スクリーニングの結果を表す。
【図４】回腸炎ＥＬＩＳＡ−２２の独国農場（飼育場）の結果を表す。
【図５】臨床症状とＥＬＩＳＡの結果との相関関係を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臨床前または臨床のローソニアイントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染を診断する方法であって、下記工程を含む方法：
ａ）液体試料を哺乳類から採取する工程、ｂ）前記液体試料のローソニアイントラセルラリスへの特異的な結合を検出する工程、ｃ）得られた結果をコントロールと比較する工程。
【請求項２】
方法が免疫試験法である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
方法がＥＬＩＳＡ法である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
方法がブロッキングＥＬＩＳＡ法である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗体３０１：３９、抗体２８７：６、抗体２６８：２９、抗体１１０：９、抗体１１３：２及び抗体２６８：１８からなる群より選択される一または複数のモノクローナル抗体を使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
抗体１１０：９を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０４。
【請求項７】
抗体１１３：２を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０１。
【請求項８】
抗体２６８：１８を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０２。
【請求項９】
抗体２６８：２９を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０６。
【請求項１０】
抗体２８７：３を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０３。
【請求項１１】
抗体３０１：３９を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０５。
【請求項１２】
抗体３０１：３９、抗体２８７：６、抗体２６８：２９、抗体１１０：９、抗体１１３：２及び抗体２６８：１８からなる群より選択されるモノクローナル抗体及び請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法を行うために必要な他の要素を含む部品からなるキット。
【請求項１】
臨床前または臨床のローソニアイントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染を診断する方法であって、下記工程を含む方法：
ａ）液体試料を哺乳類から採取する工程、ｂ）前記液体試料のローソニアイントラセルラリスへの特異的な結合を検出する工程、ｃ）得られた結果をコントロールと比較する工程。
【請求項２】
方法が免疫試験法である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
方法がＥＬＩＳＡ法である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
方法がブロッキングＥＬＩＳＡ法である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗体３０１：３９、抗体２８７：６、抗体２６８：２９、抗体１１０：９、抗体１１３：２及び抗体２６８：１８からなる群より選択される一または複数のモノクローナル抗体を使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
抗体１１０：９を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０４。
【請求項７】
抗体１１３：２を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０１。
【請求項８】
抗体２６８：１８を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０２。
【請求項９】
抗体２６８：２９を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０６。
【請求項１０】
抗体２８７：３を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０３。
【請求項１１】
抗体３０１：３９を分泌するハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９２２０５。
【請求項１２】
抗体３０１：３９、抗体２８７：６、抗体２６８：２９、抗体１１０：９、抗体１１３：２及び抗体２６８：１８からなる群より選択されるモノクローナル抗体及び請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法を行うために必要な他の要素を含む部品からなるキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５０３７３７（Ｐ２００８−５０３７３７Ａ）
【公表日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１７２００（Ｐ２００７−５１７２００）
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００６７８１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１２９４９
【国際公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【出願人】（５０４２２５８９５）ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (34)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００６７８１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１２９４９
【国際公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【出願人】（５０４２２５８９５）ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (34)
【Ｆターム（参考）】
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