ローヤルゼリー分解酵素含有物
【課題】ローヤルゼリーから、機能性ペプチド等の生理活性の高い分解物を効率よく得るために最適なローヤルゼリー分解酵素、及び、該ローヤルゼリー分解酵素含有物の提供。
【解決手段】西洋ミツバチ (Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ) の２〜３日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物；（ａ）前記女王蜂幼虫の体組織懸濁物を６℃以下で遠心処理することにより、白色固形の上層、溶液の中層、沈殿による下層の３層に分離する工程（ｂ）前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程、該ローヤルゼリー分解酵素含有物に含有されることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素、該ローヤルゼリー分解酵素含有物又は該ローヤルゼリー分解酵素を用いて調製されたローヤルゼリー分解物、及び、該ローヤルゼリー分解酵素含有物又は該ローヤルゼリー分解酵素を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法。
【解決手段】西洋ミツバチ (Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ) の２〜３日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物；（ａ）前記女王蜂幼虫の体組織懸濁物を６℃以下で遠心処理することにより、白色固形の上層、溶液の中層、沈殿による下層の３層に分離する工程（ｂ）前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程、該ローヤルゼリー分解酵素含有物に含有されることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素、該ローヤルゼリー分解酵素含有物又は該ローヤルゼリー分解酵素を用いて調製されたローヤルゼリー分解物、及び、該ローヤルゼリー分解酵素含有物又は該ローヤルゼリー分解酵素を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、西洋ミツバチ (Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ) の２〜３日齢の女王蜂幼虫から調製したローヤルゼリー分解酵素含有物、該ローヤルゼリー分解酵素含有物に含有されるローヤルゼリー分解酵素、該ローヤルゼリー分解酵素含有物又は該ローヤルゼリー分解酵素を用いて調製することを特徴とするローヤルゼリー分解物、並びに、該ローヤルゼリー分解酵素含有物又は該ローヤルゼリー分解酵素を用いるローヤルゼリーの分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ローヤルゼリーは、女王蜂幼虫を生育させるために、働き蜂が下咽頭腺と大腮腺から分泌する乳白色ゼリー状の栄養物質である。女王蜂は働き蜂と遺伝的に同質であるため、ローヤルゼリー中には、女王蜂への分化を誘導する何らかの制御因子が含まれていると考えられているが、該物質は未だ明らかにされてはいない。該制御因子及び女王蜂への分化誘導機構の解明は、女王蜂の人工生産の効率化等に有用であり、世界中の研究者によって研究が進められている。
【０００３】
ローヤルゼリーは、蜂群や品種、ミツバチが花蜜や花粉等を採取する花の種類等により変動するが、通常、生重量の約２／３が水分であり、タンパク質、糖質、及び脂肪酸を主成分とする。その他にも、ビタミンやミネラル等も多く含有されており、非常に栄養価に優れている。また、科学的に立証されてはいないものの、昔から、疲労回復作用、抗アレルギー作用、抗癌作用、免疫増強作用等の多くの薬理作用を有すると考えられている。このため、栄養補助食品や医薬品原料として広く用いられている。
【０００４】
近年、ローヤルゼリーの乾燥重量の約４０％を占めるタンパク質が、ローヤルゼリーの主要な生理活性物質として、注目されてきている。特に、ローヤルゼリータンパク質分解物の生理活性を用いた発明が、多く報告されている。例えば、（１）ローヤルゼリー中の蛋白質をプロテアーゼによって分解して得られる分子量３，０００以下のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする感染防御機能増強剤に係る発明が報告されている（例えば、特許文献１参照。）。該発明は、プロテアーゼによるローヤルゼリータンパク質分解物が、未分解のローヤルゼリータンパク質よりも感染防御機能が優れている上に、低粘度かつ水溶性であり、安定性に優れているため、食品への添加及び経口摂取が容易である、という知見に基づいた発明である。また、（２）ローヤルゼリー素材をトリプシンで処理してなるアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する蛋白分解物に係る発明も報告されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
その他、食品としての利用におけるローヤルゼリー分解物に係る発明として、（３）アレルギー性が低減された低アレルゲン化ローヤルゼリーであって、１０−ハイドロキシデセン酸及びローヤルゼリー由来のペプチド性成分を含有し、該ペプチド性成分は分子量４．５ｋＤａ以下の成分から構成されていることを特徴とする低アレルゲン化ローヤルゼリーも報告されている（例えば、特許文献３参照。）。該発明は、蛋白質分解酵素処理と、β−マンノシダーゼを用いた糖分解酵素処理により、ローヤルゼリー由来のペプチド性成分のうち、アレルギーを引き起こしやすい分子量４．５ｋＤａを超える成分が分解除去されることから、アレルギー性を低減させることが容易となる、という知見に基づいた発明である。
【０００６】
このように、ローヤルゼリー分解物、特にローヤルゼリータンパク質分解物が有する多種多様な生理活性については、多くの報告があるが、具体的な生理活性物質や、その詳細な作用機序までもが解明されているものは非常に少ない。生理活性物質の特定や作用機序の解明は、ミツバチの分化機構の解明や、ヒト等の動物にとってより有効な医薬品や機能性食品等の開発に寄与するものであるから、ローヤルゼリー分解物についてのさらなる調査・研究が強く望まれている。そして、ローヤルゼリー分解物の調査等を効果的に行うためには、機能性ペプチド等の生理活性の高い分解物を豊富に含有するローヤルゼリー分解物を得ることが肝要である。
【特許文献１】特開平８−５９４９９号公報
【特許文献２】特開２００５−２５５６７０号公報
【特許文献３】特開２００５−２８７４１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記（１）の方法をはじめ、現在用いられている方法の多くは、ローヤルゼリータンパク質を汎用されているプロテアーゼ等を用いて適当に分解しているにすぎない。該汎用プロテアーゼ等は、ローヤルゼリーを本来の基質としているものではないため、不適当な箇所での分解により、本来有用であるペプチドの機能を失活させているおそれがある。ローヤルゼリーを基質とするプロテアーゼ等を用いることにより、該おそれは解決できるが、そのような酵素は未だ見つかってはいない。
【０００８】
本発明は、ローヤルゼリーから、機能性ペプチド等の生理活性の高い分解物を効率よく得るために最適なローヤルゼリー分解酵素、及び、該ローヤルゼリー分解酵素含有物を提供することを目的とする。
また、本発明は、該ローヤルゼリー分解酵素含有物等を用いて調製することを特徴とするローヤルゼリー分解物、並びに、該ローヤルゼリー分解酵素含有物等を用いるローヤルゼリーの分解方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ローヤルゼリーを主食とし、かつ、ローヤルゼリーの摂食により女王蜂への分化が制御されている女王蜂幼虫は、先天的にローヤルゼリーの分解に最適な分解酵素を有していると考え、女王蜂幼虫の幼虫体液抽出物から、ローヤルゼリータンパク質の分解活性を有する酵素を含有する画分を分離することにより、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、西洋ミツバチ (Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ) の２〜３日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物を提供するものである。
（ａ）前記女王蜂幼虫の体組織懸濁物を６℃以下で遠心処理することにより、白色固形の上層、溶液の中層、沈殿による下層の３層に分離する工程。
（ｂ）前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。
また、本発明は、前記遠心処理が、８，０００〜１２，０００×ｇ、５分以上の遠心処理であることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素含有物を提供するものである。
また、本発明は、西洋ミツバチの２〜３日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物を提供するものである。
（ａ’）前記女王蜂幼虫を氷冷生理食塩水にて洗浄した後、裏ごしすることにより、乳白色の体組織懸濁物を調製する工程。
（ｂ’）前記体組織懸濁物をｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈した後、１０，０００×ｇ、５℃で１０分間の遠心処理をすることにより、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の３層に分離する工程。
（ｃ’）前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて調製されたローヤルゼリー分解物を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られる、下記の特徴を有するローヤルゼリー分解物を提供するものである。
（１）神経細胞に対する非特異的な細胞変性作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも軽減していること、
（２）アミロイドによる神経細胞死誘導に対する抑制作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分とほぼ同等であること、
（３）グリア細胞に対する細胞増殖作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること、
（４）ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする抗酸化剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする細胞増殖剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする感染阻害剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする神経細胞死誘導抑制剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法を提供するものである。
また、本発明は、いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物に含有されることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素を提供するものである。
また、本発明は、酵素活性の至適ｐＨが７又は９であることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素を用いて調製されたローヤルゼリー分解物を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のローヤルゼリー分解酵素含有物及びローヤルゼリー分解酵素により、ローヤルゼリーに含有されている機能性ペプチド等が有する生理活性を損なうおそれなく、ローヤルゼリーを分解することができる。
また、本発明のローヤルゼリー分解酵素含有物等により分解されたローヤルゼリー分解物は、生理活性の高い機能性ペプチド等を豊富に含有するため、ローヤルゼリーの生理活性の調査・研究において、非常に効率の良い試料を提供し得る。さらに、本発明のローヤルゼリー分解物を用いることにより、従来食されているローヤルゼリー含有食品等よりも、機能性と消化吸収性に優れた食品等を提供することができる。
その他、本発明のローヤルゼリー分解方法により、ローヤルゼリーを効率よく分解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明における女王蜂幼虫は、西洋ミツバチの２〜３日齢の女王蜂幼虫であれば、特に限定されるものではない。生きている新鮮な幼虫であってもよく、冷凍保存後の幼虫であってもよい。ローヤルゼリー（以下、ＲＪと略記する。）分解酵素等の活性が高いと考えられるため、生きている新鮮な幼虫を用いることが好ましい。幼虫の冷凍保存は、常法により行うことができるが、ＲＪ分解酵素の失活を防止するために、液体窒素等を用いて急冷後、−８０℃で保存することが好ましい。
【００１３】
本発明における体組織懸濁物とは、幼虫の体組織、主に内臓及び体液を懸濁したものを意味する。該内臓等は特に限定されるものではないが、幼虫個体の体組織全体を懸濁したものであることが好ましい。
【００１４】
幼虫から体組織懸濁物を調製する方法は、通常、動物等から組織懸濁液を調製する方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、幼虫の体組織全体や内臓、又は体液を、メッシュ等を用いて裏ごししてもよく、すり鉢やミキサー、ホモジナイザー等を用いて調製してもよい。緩和な条件下で体組織懸濁物を調製することができるため、メッシュ等を用いて裏ごしすることが好ましい。該メッシュは、網目の粗さが、８０メッシュ〜１２０メッシュであることが好ましい。ミキサー等を用いる場合には、熱の過剰発生を防止するために、生理食塩水等を添加して行うことが好ましい。なお、不純物の混入を防止するため、幼虫は、体組織懸濁物調製前に、冷凍保存する場合には保存前に、予め生理食塩水等で洗浄しておくことが好ましい。
【００１５】
本発明のＲＪ分解酵素含有物を調製するためには、まず、工程（ａ）として、女王蜂幼虫の体組織懸濁物を、６℃以下で遠心処理をすることにより、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の３層に分離する。遠心処理をする前に、中性かつ低濃度の緩衝液等を用いて希釈することにより、体組織懸濁物の粘度や濃度を適宜調整することが好ましい。体組織懸濁物の粘性や濃度が高い場合には、ＲＪ分解酵素の抽出効率が低下するおそれや、作業性が悪化するおそれがあるためである。該緩衝液として、例えば、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）や生理食塩水等がある。なお、該上層は脂質成分であり、該下層は体組織の不溶性成分と推定される。
【００１６】
該遠心処理の条件は、体組織懸濁物を３層に遠心分離することが可能である限り、特に限定されるものではないが、８，０００〜１２，０００×ｇ、６℃以下で５分以上の遠心処理であることが好ましい。１０，０００×ｇ、５℃で１０分間の遠心処理をすることが特に好ましい。遠心速度が低い場合や、遠心時間が短い場合には、３層にきれいに分離しないおそれがある。
【００１７】
次に、工程（ｂ）として、３層のうちの中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収することにより、本発明のＲＪ分解酵素含有物を調製することができる。該回収方法は、常法により行うことができる。抽出の精度を高めるため、該中層を工程（ａ）と同じ条件で再度遠心処理をすることが好ましい。
【００１８】
工程（ｂ）の後、該中層に混入した不溶性の組織片等の不溶物を取り除くため、該中層を濾過することが好ましい。微生物等によるコンタミネーションも防止できることから、該濾過には、０．２μｍのフィルター等を用いることが好ましい。
【００１９】
なお、幼虫体液抽出物の調製や、幼虫体液抽出物からのローヤルゼリー分解酵素含有物の調製は、幼虫体液抽出物に含まれている酵素が失活するおそれがあるため、遠心処理は３〜６℃で行うことが好ましい。また、その他の操作は氷冷下において行うことが好ましい。
【００２０】
本発明のＲＪ分解物は、本発明のＲＪの分解方法により、すなわち、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いることにより、調製することができる。該ＲＪは、生のＲＪであってもよく、乾燥粉末ＲＪを還元したものであってもよい。また、該ＲＪは、いずれの産地のものであってもよく、いずれの蜂種が産生したものであってもよい。さらに、該ＲＪは、ＲＪから常法により分画したタンパク質であってもよい。特にＲＪの水溶性タンパク質であることが好ましい。生理活性を有する物質が多く含有されていることが期待できるためである。
【００２１】
ＲＪの水溶性タンパク質の分画は、水溶性のタンパク質と疎水性のタンパク質を分離することができる方法であれば、いずれの方法を用いてもよい。該方法として、例えば、水溶性溶媒とＲＪを混合した懸濁液を、酢酸エチルやブタノール等の有機溶媒で分配処理して抽出精製する方法や、該懸濁液を、静置した後遠心処理をすることにより上清を得る方法等がある。
【００２２】
例えば、ＲＪやＲＪの水溶性タンパク質に、本発明のＲＪ分解酵素含有物を添加して、インキュベートする方法により、ＲＪ分解物を調製することができる。ＲＪ等は、予めリン酸緩衝液等を用いて希釈しておいてもよい。また、リン酸緩衝液等を用いてタンパク質濃度や粘度を調製したＲＪ分解酵素含有物を用いてもよい。
【００２３】
該インキュベートの温度や時間は、本発明のＲＪ分解酵素含有物のＲＪ分解活性が阻害されない条件であれば、特に限定されるものではないが、反応温度条件は３０〜４０℃が好ましく、３４〜３８℃が特に好ましい。また、ｐＨ６．５〜１０が好ましく、ｐＨ７〜９．５が特に好ましい。ｐＨ７〜７．５の反応条件で行う場合には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で約５１ｋＤａの位置にバンドとして表れるタンパク質が主に分解され、ｐＨ８．５〜９の反応条件で行う場合には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約４６ｋＤａの位置にバンドとして表れるタンパク質が主に分解される。
【００２４】
以下、本発明のＲＪの分解方法について、さらに詳細に説明する。
まず、後記実施例１に記載する方法により調製したＲＪ分解酵素含有物のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準物質としてＬｏｗｒｙ法を用いて測定した後、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈することにより、６ｍｇ／ｍＬのＲＪ分解酵素溶液を調製した。
次に、８ｍＬの緩衝液に、１ｍＬの後記参考例２に記載する方法により調製したＲＪタンパク質溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）と、１ｍＬの該ＲＪ分解酵素溶液（６ｍｇ／ｍＬ）を添加して混合した酵素反応液を調製した。該酵素反応液を３７℃で反応させ、氷冷して反応を停止させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＲＪタンパク質の変化を確認した。分離したＲＪタンパク質は、ＣＢＢ Ｒ−２５０を用いて染色した。緩衝液は、ｐＨ４、５、及び５．５の５０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ６、６．５、７、及び７．５の５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８及び９の５０ｍＭのＴｒｉ−ＨＣｌ緩衝液を、それぞれ用いた。
【００２５】
図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、ｐＨ毎に示した図である。（ａ）はｐＨ４、（ｂ）はｐＨ５、（ｃ）はｐＨ６、（ｄ）はｐＨ６．５、（ｅ）はｐＨ７、（ｆ）はｐＨ７．５、（ｇ）はｐＨ８、及び（ｈ）はｐＨ９である。各図のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を表している。また、Ｍは分子量マーカーを示している。後記参考例２に記載する方法により調製したＲＪタンパク質溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥすると、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａの位置に強いバンドが検出された。矢印アが約５１ｋＤａのバンドを示し、矢印イが約４６ｋＤａのバンドを示している。この結果、ＲＪタンパク質がＲＪ分解酵素溶液による処理によって減少していること、及び、ｐＨの上昇に伴い、分解速度が上がっていることが分かった。特に、ｐＨ７〜７．５の反応条件では、主に約５１ｋＤａのタンパク質が分解され、ｐＨ８．５〜９の反応条件では、主に約４６ｋＤａのタンパク質が分解されることが確認された。すなわち、後記実施例１に記載する方法により調製したＲＪ分解酵素含有物中には、ＲＪタンパク質を分解する酵素が含有されていることが、図１の結果から明らかである。また、中性条件下とアルカリ性条件下で該ＲＪ分解酵素含有物によるＲＪタンパク質分解パターンが異なっていることから、該ＲＪ分解酵素含有物には少なくとも２種類の分解酵素が存在していると推定される。
【００２６】
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ＲＪをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られたＲＪ分解物は、種々の生理活性を有している。該生理活性は、未酵素処理のＲＪ水溶性画分が有する生理活性と比べて、幾つかの特徴を有している。例えば、該ＲＪ分解物は、アミロイドによる神経細胞死誘導に対する抑制作用が、未酵素処理のＲＪ水溶性画分とほぼ同等であるが、神経細胞に対する非特異的な細胞変性作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも軽減している。また、グリア細胞に対する細胞増殖作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大している。その他、ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大している。
【００２７】
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ＲＪをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られたＲＪ分解物は、抗酸化活性をも有している。したがって、該ＲＪ分解物は抗酸化剤としても用いることができる。例えば、該ＲＪ分解物は、その抗酸化活性により、一酸化塩素（ＣｌＯ・）等のラジカルによるタンパク質分解を抑制することができる。ＲＪは古くから摂食されている食品であることから、該ＲＪ分解物も非常に安全であり、アスコルビン酸等と同様に、飲食品へ添加される抗酸化剤や、生体を酸化ストレスから保護することを目的として接食されるサプリメントの有効成分等としても有用であることが期待できる。
【００２８】
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ＲＪをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られたＲＪ分解物は、上記のような生理活性を有しているため、抗酸化剤、細胞増殖剤、感染阻害剤、神経細胞死誘導抑制剤等の有効成分とすることができる。これらの生理活性剤は、サプリメント等の飲食品として単独で摂食されてもよく、他の飲食用組成物や医薬用組成物と同様に、飲食品や医薬品への添加剤として用いることもできる。
【００２９】
該ＲＪ分解物を有効成分としたこれらの生理活性剤の製造方法は、該ＲＪ分解物の生理活性を阻害しないものであれば特に限定されるものではなく、通常、ＲＪ又はＲＪ分解物を含有する飲食用組成物又は医薬用組成物を製造する場合に使用される方法を用いて製造することができる。これらの生理活性剤の剤型は、特に限定されるものではないが、経口剤に適した剤型であることが好ましい。例えば、ソフトカプセル剤であってもよく、ハードカプセル剤であってもよく、錠剤であってもよく、シロップ剤等であってもよい。また、これらの生理活性剤に含まれる該ＲＪ分解物量は、該ＲＪ分解物の生理活性が作用効果を奏し得る量であれば、特に限定されるものではなく、原料とするＲＪの種類、期待する該ＲＪ分解物の生理活性、剤型等を考慮して、適宜決定することができる。
【００３０】
該ＲＪ分解物を有効成分としたこれらの生理活性剤の摂取量は、該ＲＪ分解物の生理活性が作用効果を奏し得る量であれば、特に限定されるものではなく、摂取する人や動物の体重、年齢、性別等により適宜決定することができる。例えば、一日当たり３００ｍｇ〜３ｇを、１度に又は数回に分けて摂取することが好ましい。
【実施例】
【００３１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３２】
［参考例１］ 幼虫懸濁物の調製
約１５ｇの３日齢の西洋ミツバチの女王蜂幼虫を、採取した後、氷冷した生理食塩水で洗浄した。その後、ポリエステル製の平均１００メッシュの布（「テトロン」、東レ社製）を用いて女王蜂幼虫を裏ごしすることで、幼虫の表皮を破り、体液及び内臓を搾り出した。これにより、乳白色の幼虫懸濁物を調製した。
【００３３】
［参考例２］ＲＪタンパク質溶液の調製
ＲＪ（中国産）１０ｍＬに、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液２０ｍＬを加えて混合して、ＲＪ希釈溶液を調製した。該ＲＪ希釈溶液を、２５，０００×ｇ、５℃で２０分間遠心した後、不溶性成分を除去し、上清を回収した。その後、該上清を、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈し、３０ｍｇ／ｍＬのＲＪタンパク質溶液を調製した。
【００３４】
［実施例１］
１．ＲＪ分解酵素含有物の調製
参考例１に記載する方法により調製した幼虫懸濁物を、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて２倍希釈した後、１０，０００×ｇ、５℃で１０分間遠心した。該遠心処理により、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の３層に分離された。該上層は脂質分、該下層は不溶性の体組織等と推定される。該中層を回収した後、さらに１０，０００×ｇ、５℃で１０分間遠心して３層に分離し、中層をＲＪ分解酵素含有物として回収した。該ＲＪ分解酵素含有物を、除去しきれなかった不溶性の組織片を除去し、かつ滅菌するために、０．２μｍのセルロースアセテート系フィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過した。これにより、黄色透明なＲＪ分解酵素含有物を得た。
【００３５】
２．ＲＪタンパク質の分解
該ＲＪ分解酵素含有物のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準物質としてＬｏｗｒｙ法を用いて測定し、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて、３ｍｇ／ｍＬのＲＪ分解酵素溶液を調製した。
８ｍＬの緩衝液に、１ｍＬの前記参考例２に記載する方法により調製したＲＪタンパク質溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）と、前記実施例１に記載する方法により調製した１ｍＬのＲＪ分解酵素溶液（６ｍｇ／ｍＬ）を添加して混合した酵素反応液を調製した。該緩衝液として、ｐＨ７の５０ｍＭのリン酸緩衝液、若しくは、ｐＨ９の５０ｍＭのＴｒｉ−ＨＣｌ緩衝液を用いた。該酵素反応液を３７℃で反応させ、氷冷して反応を停止させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＲＪタンパク質を分離した。ＣＢＢ Ｒ−２５０を用いて染色したゲルを乾燥させた後、蛍光スキャナーＴｙｐｈｏｏｎ ９４００（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて染色像を得た。
【００３６】
図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、ｐＨ毎に示した図である。（ａ）はｐＨ７、（ｂ）はｐＨ９の染色像である。各図のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を、Ｍは分子量マーカーを表している。矢印アが約５１ｋＤａ、矢印イが約４６ｋＤａ、矢印ウが約３３ｋＤａ、及び矢印エが約２５ｋＤａのバンドをそれぞれ示している。この結果、ｐＨ７及び９の双方において、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａのタンパク質が分解されていることが確認された。特に、ｐＨ９において、反応開始後４時間という短時間において、約４６ｋＤａのタンパク質が、検出できない程分解されていることが分かった。また、ｐＨ７において、反応時間の経過と共に、約３３ｋＤａと約２５ｋＤａのタンパク質が検出されるようになった。
【００３７】
画像解析ソフトＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、図２の染色像の各バンドのバンド強度を定量した。図３は、反応開始０時間でのバンド強度を１として、反応時間経過に伴うバンド強度の変化を示したものである。（ａ）は約５１ｋＤａのバンドの強度比を、（ｂ）は約４６ｋＤａのバンドの強度比を、（ｃ）は約３３ｋＤａ及び約２５ｋＤａのバンドの強度比を、それぞれ示したものである。（ａ）と（ｂ）の図中の●はｐＨ７のバンドを、○はｐＨ９のバンドを、それぞれ示している。また、（ｃ）の図中の△はｐＨ７における約３３ｋＤａのバンドを、▲はｐＨ７における約２５ｋＤａのバンドを、それぞれ示している。
【００３８】
図３の（ａ）と（ｂ）で示されているように、ｐＨ７及び９の双方において、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａのタンパク質が分解されていることが、定量的にも確認することができた。また、図３の（ｃ）の結果から、ｐＨ７において、反応開始後１６時間まで、約３３ｋＤａと約２５ｋＤａのタンパク質が増加していることが確認された。この結果から、約３３ｋＤａと約２５ｋＤａのタンパク質は、約５１ｋＤａ又は約４６ｋＤａのタンパク質が、ＲＪ分解酵素溶液中に含有されているＲＪ分解酵素により、分解されてできた分解物である可能性が示唆される。
【００３９】
［実施例２］
反応時間を６０分までとした以外は、全て実施例１のｐＨ９の条件下における反応と同様にして、ＲＪタンパク質を分解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＲＪタンパク質を分離して、各バンドの強度を定量した。図４の（ａ）はゲルの染色像を、（ｂ）は約４６ｋＤａのバンドの強度比を、それぞれ示したものである。図中のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を、Ｍは分子量マーカーを表している。また、矢印アが約５１ｋＤａ、矢印イが約４６ｋＤａをそれぞれ示している。
【００４０】
この結果、約４６ｋＤａのタンパク質が、ＲＪ分解酵素溶液中に含有されているＲＪ分解酵素により、反応開始後１時間という短時間に、およそ８０％が分解されていることが確認された。なお、図（ｂ）により、反応開始後５分の時点では、分解がほとんど生じていない結果となったが、これは、ＲＪ分解酵素による酵素反応を開始する前に、ＲＪタンパク質溶液を３７℃でプレインキュベートしなかったために、酵素反応が開始するまでにタイムラグが発生してしまったためではないかと推察される。
【００４１】
［実施例３］
反応時間を２４時間までとした以外は、全て実施例１のｐＨ７の条件下における反応と同様にして、ＲＪタンパク質を分解した。その後、氷冷して反応を停止させた酵素反応液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、該酵素反応溶液中に含有されるタンパク質を分画した。ゲル濾過クロマトグラフィーは、溶離液として０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いて、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、５℃の条件で行った。分画されたタンパク質を検出するために、ＵＶ検出器を用いて２８０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４２】
図５は、実施例３において測定した２８０ｎｍの吸光度の結果を表した図である。（ａ）は反応開始前、（ｂ）は反応開始後８時間、（ｃ）は反応開始後１６時間、及び（ｄ）は反応開始後２４時間の結果である。また、図中の矢印アが約３５０ｋＤａ、矢印イが約６０ｋＤａ、矢印ウが約５ｋＤａ、矢印エが約３ｋＤａ、及び範囲オが数百Ｄａのタンパク質の画分をそれぞれ示している。
反応時間の経過に伴い、約３５０ｋＤａ及び約６０ｋＤａのタンパク質が減少する一方、約５ｋＤａ、約３ｋＤａ、及び数百Ｄａのタンパク質が増加していることが、図５の結果から明らかである。増加している約５ｋＤａ等のタンパク質は、約３５０ｋＤａ等のタンパク質の分解物であることが推察される。つまり、本発明のＲＪ分解酵素含有物により、ＲＪの高分子タンパク質が分解されることが、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分画の結果からも確認できた。
【００４３】
［実施例４］
参考例２と同様にしてＲＪタンパク質溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。また、希釈後の濃度を３ｍｇ／ｍＬとした以外は全て実施例１と同様にしてＲＪ分解酵素溶液（３ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
８ｍＬの緩衝液に、１ｍＬの該ＲＪタンパク質溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）と、１ｍＬの該ＲＪ分解酵素溶液（３ｍｇ／ｍＬ）を添加して混合した酵素反応液を調製した。該緩衝液として、ｐＨ７の５０ｍＭのリン酸緩衝液、若しくは、ｐＨ９の５０ｍＭのＴｒｉ−ＨＣｌ緩衝液を用いた。該酵素反応液を４、２０、３７、及び５０℃で、それぞれ反応させ、氷冷して反応を停止させた。各温度の恒温槽で該酵素反応液を混合した時点を反応開始時点とし、反応時間を４、１６、２４時間とした。氷冷後の該酵素反応液を、実施例１と同様にＲＪタンパク質を分離することにより、反応温度の影響を観察した。
【００４４】
この結果、３７℃では、実施例２と同様に、ｐＨ７及び９の双方において、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａのタンパク質の分解が観察された。特に、ｐＨ９においては、反応開始４時間の時点で約４６ｋＤａのタンパク質は検出限界以下まで分解され、約５１ｋＤａのタンパク質も反応開始１６時間の時点で検出限界以下まで分解された。
これに対し、４℃では、ｐＨ７及び９の双方において、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａのタンパク質の分解はほとんど観察されなかった。２０℃では、３７℃の場合と比較し、分解反応の進行はゆるやかであったものの、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａのタンパク質の分解が観察された。一方、５０℃では、３７℃よりもさらに分解反応は速やかであり、ｐＨ７及び９の双方において、反応開始４時間の時点で大部分のタンパク質が分解されていることが確認された。
【００４５】
つまり、２０〜５０℃の温度範囲においては、本発明のＲＪ分解酵素含有物はＲＪを分解することができること、及び、該温度範囲においては、温度が高くなればなるほど、本発明のＲＪ分解酵素含有物によるＲＪの分解反応の進行は速やかであることが明らかである。但し、一般的に、５０℃においては、ＲＪの褐変化やＲＪタンパク質の変性等が起こる可能性がある。このため、本発明のＲＪ分解酵素含有物によりＲＪを分解する場合には、３７℃付近の温度で行うことが好ましい。
【００４６】
［実施例５］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する、脳神経細胞への生理活性を調べた。具体的には、初代培養したマウス胎児海馬神経細胞の、アミロイドによる神経細胞死誘導に対するＲＪ分解物の影響を調べた。なお、マウス胎児海馬神経細胞は、マウス胎児から常法により採取した海馬神経細胞を、グリア細胞を培養した９６穴マルチウェルプレートに、４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにまき、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。細胞培養液として、Ｂ２７サプリメント含有ニューロバーサルメディウム（ギブコ社製）を用いた。実験には、培養後１週間経過後の細胞を用いた。
【００４７】
まず、ＲＪ（中国産）５ｍＬに、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液１５ｍＬを加えて混合して、ＲＪ希釈溶液を調製した。該ＲＪ希釈溶液を、２５，０００×ｇ、５℃で２０分間遠心した後、不溶性成分を除去し、上清を回収した。その後、該上清を凍結乾燥することにより、ＲＪ水溶性粗分画を得た。該ＲＪ水溶性粗分画を、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈し、３０ｍｇ／ｍＬのＲＪ水溶性粗分画溶液を調製した。
次に、前記参考例２に記載する方法により調製したＲＪタンパク質溶液に代えて、該ＲＪ水溶性粗分画溶液を用いたこと、及び、反応時間を４時間としたこと以外は、全て実施例１と同様にして、該ＲＪ水溶性粗分画溶液中に含有されるＲＪタンパク質を分解し、ＲＪ分解物を得た。
【００４８】
マウス胎児海馬神経細胞が培養された９６穴マルチウェルプレートに、アミロイドペプチド（ペプチド研究所製）とＲＪ水溶性粗分画溶液又はＲＪ分解物を添加した後、４８時間培養した。アミロイドペプチドは、２ｍｇ／ｍＬの濃度で３７℃、４８時間保温した後、最終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように添加した。また、ＲＪ水溶性粗分画溶液、ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物、又はｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物は、各タンパク質の細胞培養液中の最終濃度が、それぞれ０、３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００、又は１，０００μｇ／ｍＬとなるように添加した。アミロイドペプチドとＲＪ分解物等のいずれも添加せず、等量の細胞培養液を添加したものをコントロールとして用いた。
その後、抗Ｍａｐ２抗体を用いた免疫染色やヘキスト３３３４２色素染色により死細胞を識別し、各ディッシュ中のマウス胎児海馬神経細胞の生存数、グリア細胞の生存数をそれぞれ測定した。さらに、顕微鏡観察により、細胞変形が観察されたマウス胎児海馬神経細胞数を測定した。なお、細胞変形とは、神経細胞が、樹状突起を有する細胞体と軸索からなる神経細胞特有の形態から変化することを意味する。該変化には、例えば、突起形成、軸索の萎縮、多軸索化、神経細胞同士の凝集、神経細胞の死滅等がある。
【００４９】
【表１】
【００５０】
表１は、マウス胎児海馬神経細胞数等の測定結果を示したものである。生存神経細胞数及び変性神経細胞数は、コントロールの神経細胞数を１００％として、また、グリア細胞数は、コントロールのグリア細胞数を１００％として、それぞれ表している。初代培養したマウス胎児海馬神経細胞に、アミロイドペプチドを添加すると、約６０％の神経細胞が死滅し、生存率は約４０％であった。アミロイドペプチドと共にＲＪ水溶性粗分画溶液を添加すると、ＲＪ水溶性粗分画溶液は、アミロイドによる神経細胞死誘導を容量依存的に阻害した。最大生存率は、６０〜７０％にまで回復した。ＲＪ水溶性粗分画溶液による該効果は、６２．５〜２５０μｇ／ｍＬの低濃度においても認められた。但し、１，０００μｇ／ｍＬ以上のＲＪ水溶性粗分画溶液を添加すると、非特異的な神経細胞変形作用が観察された。
【００５１】
ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物を添加した場合には、ＲＪ水溶性粗分画溶液を添加した場合とほぼ同様の効果が観察された。一方、ｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物を添加した場合にも、ＲＪ水溶性粗分画溶液と同様に、アミロイドによる神経細胞死誘導阻害効果が観察された。さらに、ＲＪ水溶性粗分画溶液等と比較し、非特異的な神経細胞変形作用が低下し、グリア細胞への細胞増殖作用が増大していた。これは、グリア細胞等の増殖が促進される結果、神経保護効果がより強く発揮されるため、ＲＪ水溶性粗分画溶液が有する非特異的な神経細胞変形作用が低下するためではないかと推察される。
【００５２】
表１の結果から、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ｐＨ９で４時間以上で酵素処理をすることにより得られるＲＪ分解物は、アミロイドによる神経細胞死誘導に対する抑制作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分とほぼ同等であり、神経細胞に対する非特異的な細胞変性作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも著しく軽減しており、かつ、グリア細胞に対する細胞増殖作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大している、という特徴を有していることが明らかである。
【００５３】
［実施例６］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する、ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害活性を調べるため、中和活性試験を行った。具体的には、アカゲザルの胎児腎臓由来のＭＡ１０４細胞の細胞培養液中に、ヒトロタウィルスと共に、ＲＪ若しくはＲＪ分解物を添加することにより、ヒトロタウィルス感染に対するＲＪ分解物の影響を観察した。ＲＪとして、実施例４と同様にして調製したＲＪ水溶性粗分画溶液を用いた。また、ＲＪ分解物として、反応時間を２４時間とした以外は全て実施例４と同様にして調製したｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物、又はｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物を、それぞれ用いた。なお、ＭＡ１０４細胞は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。細胞培養液として、１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）及び１０％ＴＰＢ（トリプトースホスフェートブロース）含有Ｅａｇｌｅ’ ＭＥＭ培地（日水製薬社製）に、若干量の抗生物質等を添加したものを用いた。
【００５４】
まず、２４ｃｍ２ＴＣフラスコに５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋとなるようにまいて５日間培養したＭＡ１０４細胞を用いて調製した細胞懸濁液に、ヒトロタウィルス溶液（宮城がんセンター製）と、ＲＪ水溶性粗分画溶液又はＲＪ分解物を添加した。ヒトロタウィルス溶液は、最終濃度が６．５×１０４ＦＣＦＵ／ｍＬとなるように添加した。また、ＲＪ水溶性粗分画溶液、ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物、又はｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物は、各タンパク質の細胞培養液中の最終濃度が表２記載の濃度となるようにそれぞれ添加した。ＲＪ分解物等に代えて、等量の細胞培養液を添加したものをコントロールとして用いた。その後、２２時間培養した後、一次抗体としてハトロタウィルス株ＰＯ−１３ ＶＰ６を認識するＰ３−１を、二次抗体としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを、それぞれ用いた間接蛍光抗体法により、ヒトロタウィルスに感染したＭＡ１０４細胞数を測定した。
【００５５】
【表２】
【００５６】
表２は、ヒトロタウィルスの中和活性試験の結果を示した図である。感染細胞数は、コントロールの感染細胞数を１００％として、それぞれ表している。ＲＪ水溶性粗分画溶液を添加した場合には、約３００μｇ／ｍＬ以上の濃度でウィルス感染が促進され、約３００μｇ／ｍＬ以下の濃度ではウィルス感染が抑制される傾向が観察された。つまり、高濃度では感染を促進し、低濃度では感染を抑制するという、作用の二面性を有する可能性が示唆された。
【００５７】
一方、ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物は、３７μｇ／ｍＬ以上の濃度でウィルス感染が促進され、１８．５μｇ／ｍＬ以下の濃度ではウィルス感染が抑制される傾向が観察された。つまり、ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物は、ＲＪ水溶性粗分画溶液と同様に、高濃度では感染を促進し、低濃度では感染を抑制するが、感染抑制から促進へ転換するタンパク質濃度が低濃度側にシフトしていた。これに対して、４０μｇ／ｍＬ以下の濃度のｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物を添加した場合には、ＲＪ水溶性粗分画溶液を添加した場合よりも大きな感染阻害効果を示した。特に、ｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物は、１６．５μｇ／ｍＬ以下の濃度では、タンパク質濃度依存的に感染阻害効果を示した。また、反応時間が４時間以上である場合には、反応時間が長いＲＪ分解物ほど、低濃度における感染抑制効果の濃度依存性が顕著であった。
【００５８】
表２の結果から、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ｐＨ９で４時間以上で酵素処理をすることにより得られるＲＪ分解物は、ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大している、という特徴を有していることが明らかである。
【００５９】
［実施例７］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する、細胞増殖活性を調べるため、ラットの小腸由来のＩＥＣ−６細胞を用いてＷＳＴ−１法を行った。具体的には、ＩＥＣ−６細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにまいて２４時間培養した後、培養液をＲＪ分解物含有培養液に交換して、さらに２４時間培養する。その後、培養液中に、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（和光純薬工業社製）を添加して２時間培養した後、細胞培養液の４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、フォルマザン産物の産生量を測定した。ＲＪ分解物として、反応時間を２４時間とした以外は全て実施例４と同様にして調製したｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物、又はｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物を、それぞれ用いた。なお、ＩＥＣ−６細胞の培養は常法により行った。
この結果、ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物では、ＲＪ分解物の濃度が１ｍｇ／ｍＬ以下である場合には、細胞増殖促進傾向が、１ｍｇ／ｍＬ以上である場合には、細胞増殖抑制傾向が、それぞれ観察された。
【００６０】
実施例６及び７の結果から、実施例６においてＲＪタンパク質の濃度依存的にウィルス感染の促進及び抑制という二面性が観察された理由の一つとして、ＲＪタンパク質の細胞増殖促進効果による可能性があると推察される。つまり、細胞増殖のコントロールを一因として、ＲＪタンパク質及びそのペプチドフラグメントが、ヒトロタウィルス感染をコントロールする作用を示す可能性が示唆された。
【００６１】
［実施例８］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する細胞増殖活性をより詳細に解析するために、ＲＪ分解物を脱塩処理した後の細胞増殖活性を調べた。
１．脱塩処理
まず、反応時間を２４時間とした以外は全て実施例４と同様にして、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ｐＨ７で酵素処理して得たＲＪ分解物（以下、ＲＪ分解物（ｐＨ７）ということがある。）、及びｐＨ９で酵素処理して得たＲＪ分解物（以下、ＲＪ分解物（ｐＨ９）ということがある。）を、それぞれ調製した。
得られたＲＪ分解物（ｐＨ７）とＲＪ分解物（ｐＨ９）を、それぞれ、Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてサイズ分画を行った。吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定して得られた溶出パターンに従って、脱塩したフラクション（以下、フラクションＤ１）と塩を含むフラクション（以下、フラクションＤ２）の２つのフラクションを分取した。
図６は、Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにおいて、吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の吸光度、点線がＲＪ分解物（ｐＨ７）の吸光度、二点鎖線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の伝導率、一点鎖線がＲＪ分解物（ｐＨ７）の伝導率を、それぞれ示している。図中、「Ｄ１」がフラクションＤ１として分取した画分であり、「Ｄ２」がフラクションＤ２として分取した画分である。
【００６２】
２．細胞増殖活性の測定
細胞の培養液として、ＦＣＳ等の増殖因子を含有しない培養液（対照培養液）にＲＪ分解物（ｐＨ９）のフラクションＤ１（フラクションＤ１（ｐＨ９））を含有させた培養液又は対照培養液にＲＪ分解物（ｐＨ７）のフラクションＤ１（フラクションＤ１（ｐＨ７））を含有させた培養液を用いた以外は、実施例７と同様にして、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。ポジティブコントロールとして１０％ＦＣＳ含有培養液を、ネガティブコントロールとして対照培養液を、それぞれ用いた。各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量は、対照培養液を添加した場合に産生されたフォルマザン産物量に対する、各培養液を添加した場合に産生されたフォルマザン産物量の比率で表した。
図７は、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。図７（ａ）は、フラクションＤ１（ｐＨ９）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果であり、図７（ｂ）は、フラクションＤ１（ｐＨ７）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を、「ＰＣ」は１０％ＦＣＳ含有培養液を、それぞれ示している。また、各濃度は、各培養液中のフラクションＤ１由来のタンパク質濃度を示している。
図７（ａ）の結果に示されるように、培養液中のフラクションＤ１（ｐＨ９）濃度依存的に、細胞増殖量が増大することが分かった。特にフラクションＤ１（ｐＨ９）濃度が５０．５μｇ／ｍＬの培養液を用いて培養した場合には、１０％ＦＣＳ含有培養液を用いた場合とほぼ同程度に細胞増殖が促進されていた。但し、フラクションＤ１（ｐＨ９）濃度が８４．２μｇ／ｍＬ以上の培養液の場合には、濃度依存的に細胞増殖量が減少する傾向が観察されたことから、フラクションＤ１（ｐＨ９）による細胞増殖促進効果（細胞増殖活性）には、至適濃度があることが示唆された。
一方で、図７（ｂ）の結果に示されるように、培養液にフラクションＤ１（ｐＨ７）を含有させた場合には、細胞増殖量はほとんど変化せず、フラクションＤ１（ｐＨ７）は細胞増殖に著しい影響を与えることはないことが明らかになった。
すなわち、実施例８の結果からも、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ｐＨ９で酵素処理して得たＲＪ分解物は細胞増殖活性を有することが明らかである。
【００６３】
［実施例９］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する細胞増殖活性をより詳細に解析するために、ＲＪ分解物を粗精製した後の細胞増殖活性を調べた。
１．粗精製
実施例８において調製したＲＪ分解物（ｐＨ９）のフラクションＤ２（フラクションＤ２（ｐＨ９））及びＲＪ分解物（ｐＨ７）のフラクションＤ２（フラクションＤ２（ｐＨ７））を、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲカラム（ナカライテスク社製）を用いて、粗精製を行った。吸着バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液を、溶出バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル溶液を、それぞれ用いた。吸光度（２１５ｎｍ及び２８０ｎｍ）及び伝導率を測定して得られた溶出パターンに従って、非吸着フラクション（以下、フラクションＣ１）と吸着フラクション（以下、フラクションＣ２）の２つのフラクションを分取した。
図８は、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにおいて、吸光度（２１５ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がフラクションＤ２（ｐＨ９）の吸光度、点線がフラクションＤ２（ｐＨ７）の吸光度、二点鎖線がフラクションＤ２（ｐＨ９）の伝導率、一点鎖線がフラクションＤ２（ｐＨ７）の伝導率を、それぞれ示している。図中、「Ｃ１（ｐＨ７）」がフラクションＣ１（ｐＨ７）として、「Ｃ１（ｐＨ９）」がフラクションＣ１（ｐＨ９）として、「Ｃ２（ｐＨ７）」がフラクションＣ２（ｐＨ７）として、「Ｃ２（ｐＨ９）」がフラクションＣ２（ｐＨ９）として、それぞれ分取した画分である。
【００６４】
２．フラクションＣ１の細胞増殖活性の測定
細胞の培養液として、フラクションＤ２（ｐＨ９）のフラクションＣ１（フラクションＣ１（ｐＨ９））を希釈した培養液又はフラクションＤ２（ｐＨ７）のフラクションＣ１（フラクションＣ１（ｐＨ７））を希釈した培養液を用いた以外は、実施例７と同様にして、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。なお、フラクションＣ１（ｐＨ９）又はフラクションＣ１（ｐＨ７）の希釈には、対照培養液を用いた。
図９は、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。図９（ａ）は、フラクションＣ１（ｐＨ９）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果であり、図９（ｂ）は、フラクションＣ１（ｐＨ７）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を、「ＰＣ」は１０％ＦＣＳ含有培養液を、それぞれ示している。
図９（ａ）と（ｂ）の結果に示されるように、フラクションＣ１（ｐＨ９）とフラクションＣ１（ｐＨ７）のいずれを含有させた培養液においても、細胞増殖が促進されていた。両者を比較すると、フラクションＣ１（ｐＨ７）を含有させた場合よりも、フラクションＣ１（ｐＨ９）を含有させた場合のほうが、細胞増殖促進効果が高い傾向が観察された。
【００６５】
３．フラクションＣ２の細胞増殖活性の測定
細胞の培養液として、対照培養液にフラクションＤ２（ｐＨ９）のフラクションＣ２（フラクションＣ２（ｐＨ９））を含有させた培養液又は対照培養液にフラクションＤ２（ｐＨ７）のフラクションＣ２（フラクションＣ２（ｐＨ７））を含有させた培養液を用いた以外は、実施例７と同様にして、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。
図１０は、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。図１０（ａ）は、フラクションＣ２（ｐＨ９）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果であり、図１０（ｂ）は、フラクションＣ２（ｐＨ７）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を示している。また、各濃度は、各培養液中のフラクションＣ２由来のタンパク質濃度を示している。
この結果、培養液にフラクションＣ２（ｐＨ９）を含有させた場合には、培養液中の濃度が３．４２μｇ／ｍＬ以下では、濃度依存的に細胞増殖量が増大し、３．４２μｇ／ｍＬ超では、濃度依存的に細胞増殖量が減少する傾向が観察された。一方、培養液にフラクションＣ２（ｐＨ７）を含有させた場合には、培養液中の濃度が４．６７μｇ／ｍＬ以下では、濃度依存的に細胞増殖量が増大し、４．６７μｇ／ｍＬ超では、濃度依存的に細胞増殖量が減少する傾向が観察された。また、両者を比較すると、フラクションＣ２（ｐＨ７）を含有させた場合よりも、フラクションＣ２（ｐＨ９）を含有させた場合のほうが、細胞増殖促進効果が高い傾向が観察された。
【００６６】
したがって、実施例９の結果から、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて酵素処理して得たＲＪ分解物は細胞増殖活性を有すること、及び、ｐＨ７の反応条件で酵素処理して得たＲＪ分解物よりも、ｐＨ９の反応条件で酵素処理して得たＲＪ分解物のほうが、高い細胞増殖活性を有することが明らかである。
【００６７】
［実施例１０］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する抗酸化活性を調べた。
１．ＲＪ分解物の調製
ＲＪ（中国産）に純水を加えて懸濁したものを、孔径１０ｋＤの透析膜を用いて、純水にて７２時間透析した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥した後、再び純水に懸濁し、３０ｍｇ／ｍＬのＲＪタンパク質溶液を調製した。
１ｍＬの該ＲＪタンパク質溶液に、１ｍＬのＲＪ分解酵素含有物（３ｍｇ／ｍＬ）、８ｍＬのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ９．０）を加え、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、孔径５００Ｄａの透析膜を用いて、純水にて５日間透析した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥したものを、ＲＪ分解物とした。なお、ＲＪ分解酵素含有物は、実施例１と同様にして調製したものを用いた。
【００６８】
２．抗酸化活性測定
ＲＪ分解物の抗酸化活性は、柳内ら（日本食品科学工学会誌、第５１巻第５号、第２３８〜２４６ページ、２００４年）の方法に従い、一酸化塩素（ＣｌＯ・）によるＢＳＡ分解に対するＲＪ分解物の影響を調べることにより測定した。
具体的には、まず、ＢＳＡ含有ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に、ＰＢＳを用いて希釈したＲＪ分解物を添加することにより、ＢＳＡ（最終濃度４０μｇ／ｍＬ）及びＲＪ分解物（最終濃度０、０．３、０．５、１．０、又は２．０μｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳ試料溶液を調製した。該ＰＢＳ試料溶液に、最終濃度１．７ｍＭとなるように次亜塩素酸ナトリウムを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＰＢＳ試料溶液中のタンパク質を分離し、ＣＢＢ染色することにより検出した。ＣＢＢ染色像をスキャナーで取り込んだ後、ＢＳＡに相当するバンドの濃度を解析した。各ＰＢＳ試料溶液のＢＳＡ濃度は、次亜塩素酸ナトリウムを添加しなかったＰＢＳ試料溶液をブランクとし、ブランクのＢＳＡ濃度を１とした場合の相対濃度を調べた。なお、バンドの濃度解析は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）が提供する解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて行った。また、ＲＪ分解物に代えて、公知の抗酸化剤であるアスコルビン酸（最終濃度０、３．０、４．０、５．０、又は７．５ｍＭ）又はカルノシン（最終濃度０、２．５、５．０、７．５、又は１０．０ｍＭ）を添加したＰＢＳ試料溶液についても、同様にＢＳＡ濃度を調べた。
図１１は、各ＰＢＳ試料溶液のＢＳＡ濃度の結果を示した図である。図１１（ａ）はＲＪ分解物を添加した場合の結果であり、図１１（ｂ）はアスコルビン酸を添加した場合の結果であり、図１１（ｃ）はカルノシンを添加した場合の結果である。この結果、ＲＪ分解物を添加しなかった場合には、ＢＳＡはＣＢＢ染色によりバンドが検出されず、ほぼ全てのＢＳＡが、分解されていた。これに対して、ＲＪ分解物を添加した場合には、アスコルビン酸やカルノシンと同様に、ＰＢＳ試料溶液への添加量依存的にＢＳＡの相対濃度は大きくなった。これは、次亜塩素酸ナトリウムから産生された一酸化塩素によるＢＳＡの分解が、ＲＪ分解物により抑制されたためであると推察される。
また、図１１の結果を元に、一酸化塩素によるＢＳＡ分解を５０％まで抑制する濃度を算出したところ、ＲＪ分解物では０．９２±０．２４ｍｇ／ｍＬであり、アスコルビン酸では０．６７±０．０１ｍｇ／ｍＬ（３．８３±０．０８ｍＭ）であり、カルノシンでは０．８４±０．１０ｍｇ／ｍＬ（３．６５±０．３２ｍＭ）であった。すなわち、一酸化塩素によるＢＳＡ分解に対する抗酸化力において、ＲＪ分解物は混合物であるにもかかわらず、公知の抗酸化剤であるアスコルビン酸やカルノシンに匹敵する抗酸化力を有していることが認められた。
これら実施例１０の結果から、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ｐＨ９で酵素処理して得たＲＪ分解物は抗酸化活性を有することが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のＲＪ分解酵素含有物は、女王蜂幼虫が有する、ＲＪを本来の基質とするＲＪ分解酵素が含有されているものであり、ＲＪの分解に最適であることから、ＲＪの生理活性の研究や、ＲＪを用いた医薬品及又は食品の開発等の分野で利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＲＪタンパク質溶液と該ＲＪ分解酵素溶液を添加して混合した酵素反応液を、３７℃で反応させた後、該酵素反応液中のＲＪタンパク質を分離するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥをした結果得られた染色像を、ｐＨ毎に示した図である。（ａ）はｐＨ４、（ｂ）はｐＨ５、（ｃ）はｐＨ６、（ｄ）はｐＨ６．５、（ｅ）はｐＨ７、（ｆ）はｐＨ７．５、（ｇ）はｐＨ８、及び（ｈ）はｐＨ９である。各図のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を表している。また、Ｍは分子量マーカーを示している。矢印アは約５１ｋＤａのバンドを、矢印イは約４６ｋＤａのバンドを、それぞれ示している。
【図２】実施例１において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、ｐＨ毎に示した図である。（ａ）はｐＨ７、（ｂ）はｐＨ９の染色像である。各図のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を、Ｍは分子量マーカーを表している。矢印アが約５１ｋＤａ、矢印イが約４６ｋＤａ、矢印ウが約３３ｋＤａ、及び矢印エが約２５ｋＤａのバンドをそれぞれ示している。
【図３】実施例１において、図２の染色像のバンドの強度を測定し、反応開始０時間でのバンド強度を１として、反応時間経過に伴うバンド強度の変化を示したものである。（ａ）は約５１ｋＤａのバンドの強度比を、（ｂ）は約４６ｋＤａのバンドの強度比を、（ｃ）は約３３ｋＤａ及び約２５ｋＤａのバンドの強度比を、それぞれ示したものである。（ａ）と（ｂ）の図中の●はｐＨ７のバンドを、○はｐＨ９のバンドを、それぞれ示している。また、（ｃ）の図中の△はｐＨ７における約３３ｋＤａのバンドを、▲はｐＨ７における約２５ｋＤａのバンドを、それぞれ示している。
【図４】実施例２において、ｐＨ９の条件下においてＲＪタンパク質を分解した結果を表した図である。（ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果得られたゲルの染色像を、（ｂ）は約４６ｋＤａのバンドの強度比を、それぞれ示したものである。図（ａ）中のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を、Ｍは分子量マーカーを表している。また、矢印アが約５１ｋＤａ、矢印イが約４６ｋＤａをそれぞれ示している。
【図５】実施例３において、測定した２８０ｎｍの吸光度の結果を表した図である。（ａ）は反応開始前、（ｂ）は反応開始後８時間、（ｃ）は反応開始後１６時間、及び（ｄ）は反応開始後２４時間の結果である。また、図中の矢印アが約３５０ｋＤａ、矢印イが約６０ｋＤａ、矢印ウが約５ｋＤａ、矢印エが約３ｋＤａ、及び範囲オが数百Ｄａのタンパク質の画分をそれぞれ示している。
【図６】実施例８のＨｉ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにおいて、吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の吸光度、点線がＲＪ分解物（ｐＨ７）の吸光度、二点鎖線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の伝導率、一点鎖線がＲＪ分解物（ｐＨ７）の伝導率を、それぞれ示している。図中、「Ｄ１」がフラクションＤ１として分取した画分であり、「Ｄ２」がフラクションＤ２として分取した画分である。
【図７】実施例８において、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。（ａ）は、フラクションＤ１（ｐＨ９）を含有させた培養液を添加した場合の結果であり、（ｂ）は、フラクションＤ１（ｐＨ７）を含有させた培養液を添加した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を、「ＰＣ」は１０％ＦＣＳ含有培養液を、それぞれ示している。また、各濃度は、各培養液中のフラクションＤ１由来のタンパク質濃度を示している。
【図８】実施例９のＣｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにおいて、吸光度（２１５ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がフラクションＤ２（ｐＨ９）の吸光度、点線がフラクションＤ２（ｐＨ７）の吸光度、二点鎖線がフラクションＤ２（ｐＨ９）の伝導率、一点鎖線がフラクションＤ２（ｐＨ７）の伝導率を、それぞれ示している。図中、「Ｃ１（ｐＨ７）」がフラクションＣ１（ｐＨ７）として、「Ｃ１（ｐＨ９）」がフラクションＣ１（ｐＨ９）として、「Ｃ２（ｐＨ７）」がフラクションＣ２（ｐＨ７）として、「Ｃ２（ｐＨ９）」がフラクションＣ２（ｐＨ９）として、それぞれ分取した画分である。
【図９】実施例９において、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。（ａ）は、フラクションＣ１（ｐＨ９）を含有させた培養液を添加した場合の結果であり、（ｂ）は、フラクションＣ１（ｐＨ７）を含有させた培養液を添加した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を、「ＰＣ」は１０％ＦＣＳ含有培養液を、それぞれ示している。
【図１０】実施例９において、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。（ａ）は、フラクションＣ２（ｐＨ９）を含有させた培養液を添加した場合の結果であり、（ｂ）は、フラクションＣ２（ｐＨ７）を含有させた培養液を添加した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を示している。また、各濃度は、各培養液中のフラクションＣ２由来のタンパク質濃度を示している。
【図１１】実施例１０において、各ＰＢＳ試料溶液のＢＳＡ濃度の結果を示した図である。（ａ）はＲＪ分解物を添加した場合の結果であり、（ｂ）はアスコルビン酸を添加した場合の結果であり、（ｃ）はカルノシンを添加した場合の結果である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、西洋ミツバチ (Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ) の２〜３日齢の女王蜂幼虫から調製したローヤルゼリー分解酵素含有物、該ローヤルゼリー分解酵素含有物に含有されるローヤルゼリー分解酵素、該ローヤルゼリー分解酵素含有物又は該ローヤルゼリー分解酵素を用いて調製することを特徴とするローヤルゼリー分解物、並びに、該ローヤルゼリー分解酵素含有物又は該ローヤルゼリー分解酵素を用いるローヤルゼリーの分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ローヤルゼリーは、女王蜂幼虫を生育させるために、働き蜂が下咽頭腺と大腮腺から分泌する乳白色ゼリー状の栄養物質である。女王蜂は働き蜂と遺伝的に同質であるため、ローヤルゼリー中には、女王蜂への分化を誘導する何らかの制御因子が含まれていると考えられているが、該物質は未だ明らかにされてはいない。該制御因子及び女王蜂への分化誘導機構の解明は、女王蜂の人工生産の効率化等に有用であり、世界中の研究者によって研究が進められている。
【０００３】
ローヤルゼリーは、蜂群や品種、ミツバチが花蜜や花粉等を採取する花の種類等により変動するが、通常、生重量の約２／３が水分であり、タンパク質、糖質、及び脂肪酸を主成分とする。その他にも、ビタミンやミネラル等も多く含有されており、非常に栄養価に優れている。また、科学的に立証されてはいないものの、昔から、疲労回復作用、抗アレルギー作用、抗癌作用、免疫増強作用等の多くの薬理作用を有すると考えられている。このため、栄養補助食品や医薬品原料として広く用いられている。
【０００４】
近年、ローヤルゼリーの乾燥重量の約４０％を占めるタンパク質が、ローヤルゼリーの主要な生理活性物質として、注目されてきている。特に、ローヤルゼリータンパク質分解物の生理活性を用いた発明が、多く報告されている。例えば、（１）ローヤルゼリー中の蛋白質をプロテアーゼによって分解して得られる分子量３，０００以下のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする感染防御機能増強剤に係る発明が報告されている（例えば、特許文献１参照。）。該発明は、プロテアーゼによるローヤルゼリータンパク質分解物が、未分解のローヤルゼリータンパク質よりも感染防御機能が優れている上に、低粘度かつ水溶性であり、安定性に優れているため、食品への添加及び経口摂取が容易である、という知見に基づいた発明である。また、（２）ローヤルゼリー素材をトリプシンで処理してなるアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する蛋白分解物に係る発明も報告されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
その他、食品としての利用におけるローヤルゼリー分解物に係る発明として、（３）アレルギー性が低減された低アレルゲン化ローヤルゼリーであって、１０−ハイドロキシデセン酸及びローヤルゼリー由来のペプチド性成分を含有し、該ペプチド性成分は分子量４．５ｋＤａ以下の成分から構成されていることを特徴とする低アレルゲン化ローヤルゼリーも報告されている（例えば、特許文献３参照。）。該発明は、蛋白質分解酵素処理と、β−マンノシダーゼを用いた糖分解酵素処理により、ローヤルゼリー由来のペプチド性成分のうち、アレルギーを引き起こしやすい分子量４．５ｋＤａを超える成分が分解除去されることから、アレルギー性を低減させることが容易となる、という知見に基づいた発明である。
【０００６】
このように、ローヤルゼリー分解物、特にローヤルゼリータンパク質分解物が有する多種多様な生理活性については、多くの報告があるが、具体的な生理活性物質や、その詳細な作用機序までもが解明されているものは非常に少ない。生理活性物質の特定や作用機序の解明は、ミツバチの分化機構の解明や、ヒト等の動物にとってより有効な医薬品や機能性食品等の開発に寄与するものであるから、ローヤルゼリー分解物についてのさらなる調査・研究が強く望まれている。そして、ローヤルゼリー分解物の調査等を効果的に行うためには、機能性ペプチド等の生理活性の高い分解物を豊富に含有するローヤルゼリー分解物を得ることが肝要である。
【特許文献１】特開平８−５９４９９号公報
【特許文献２】特開２００５−２５５６７０号公報
【特許文献３】特開２００５−２８７４１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記（１）の方法をはじめ、現在用いられている方法の多くは、ローヤルゼリータンパク質を汎用されているプロテアーゼ等を用いて適当に分解しているにすぎない。該汎用プロテアーゼ等は、ローヤルゼリーを本来の基質としているものではないため、不適当な箇所での分解により、本来有用であるペプチドの機能を失活させているおそれがある。ローヤルゼリーを基質とするプロテアーゼ等を用いることにより、該おそれは解決できるが、そのような酵素は未だ見つかってはいない。
【０００８】
本発明は、ローヤルゼリーから、機能性ペプチド等の生理活性の高い分解物を効率よく得るために最適なローヤルゼリー分解酵素、及び、該ローヤルゼリー分解酵素含有物を提供することを目的とする。
また、本発明は、該ローヤルゼリー分解酵素含有物等を用いて調製することを特徴とするローヤルゼリー分解物、並びに、該ローヤルゼリー分解酵素含有物等を用いるローヤルゼリーの分解方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ローヤルゼリーを主食とし、かつ、ローヤルゼリーの摂食により女王蜂への分化が制御されている女王蜂幼虫は、先天的にローヤルゼリーの分解に最適な分解酵素を有していると考え、女王蜂幼虫の幼虫体液抽出物から、ローヤルゼリータンパク質の分解活性を有する酵素を含有する画分を分離することにより、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、西洋ミツバチ (Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ) の２〜３日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物を提供するものである。
（ａ）前記女王蜂幼虫の体組織懸濁物を６℃以下で遠心処理することにより、白色固形の上層、溶液の中層、沈殿による下層の３層に分離する工程。
（ｂ）前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。
また、本発明は、前記遠心処理が、８，０００〜１２，０００×ｇ、５分以上の遠心処理であることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素含有物を提供するものである。
また、本発明は、西洋ミツバチの２〜３日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物を提供するものである。
（ａ’）前記女王蜂幼虫を氷冷生理食塩水にて洗浄した後、裏ごしすることにより、乳白色の体組織懸濁物を調製する工程。
（ｂ’）前記体組織懸濁物をｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈した後、１０，０００×ｇ、５℃で１０分間の遠心処理をすることにより、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の３層に分離する工程。
（ｃ’）前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて調製されたローヤルゼリー分解物を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られる、下記の特徴を有するローヤルゼリー分解物を提供するものである。
（１）神経細胞に対する非特異的な細胞変性作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも軽減していること、
（２）アミロイドによる神経細胞死誘導に対する抑制作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分とほぼ同等であること、
（３）グリア細胞に対する細胞増殖作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること、
（４）ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする抗酸化剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする細胞増殖剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする感染阻害剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする神経細胞死誘導抑制剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法を提供するものである。
また、本発明は、いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物に含有されることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素を提供するものである。
また、本発明は、酵素活性の至適ｐＨが７又は９であることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素を用いて調製されたローヤルゼリー分解物を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のローヤルゼリー分解酵素含有物及びローヤルゼリー分解酵素により、ローヤルゼリーに含有されている機能性ペプチド等が有する生理活性を損なうおそれなく、ローヤルゼリーを分解することができる。
また、本発明のローヤルゼリー分解酵素含有物等により分解されたローヤルゼリー分解物は、生理活性の高い機能性ペプチド等を豊富に含有するため、ローヤルゼリーの生理活性の調査・研究において、非常に効率の良い試料を提供し得る。さらに、本発明のローヤルゼリー分解物を用いることにより、従来食されているローヤルゼリー含有食品等よりも、機能性と消化吸収性に優れた食品等を提供することができる。
その他、本発明のローヤルゼリー分解方法により、ローヤルゼリーを効率よく分解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明における女王蜂幼虫は、西洋ミツバチの２〜３日齢の女王蜂幼虫であれば、特に限定されるものではない。生きている新鮮な幼虫であってもよく、冷凍保存後の幼虫であってもよい。ローヤルゼリー（以下、ＲＪと略記する。）分解酵素等の活性が高いと考えられるため、生きている新鮮な幼虫を用いることが好ましい。幼虫の冷凍保存は、常法により行うことができるが、ＲＪ分解酵素の失活を防止するために、液体窒素等を用いて急冷後、−８０℃で保存することが好ましい。
【００１３】
本発明における体組織懸濁物とは、幼虫の体組織、主に内臓及び体液を懸濁したものを意味する。該内臓等は特に限定されるものではないが、幼虫個体の体組織全体を懸濁したものであることが好ましい。
【００１４】
幼虫から体組織懸濁物を調製する方法は、通常、動物等から組織懸濁液を調製する方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、幼虫の体組織全体や内臓、又は体液を、メッシュ等を用いて裏ごししてもよく、すり鉢やミキサー、ホモジナイザー等を用いて調製してもよい。緩和な条件下で体組織懸濁物を調製することができるため、メッシュ等を用いて裏ごしすることが好ましい。該メッシュは、網目の粗さが、８０メッシュ〜１２０メッシュであることが好ましい。ミキサー等を用いる場合には、熱の過剰発生を防止するために、生理食塩水等を添加して行うことが好ましい。なお、不純物の混入を防止するため、幼虫は、体組織懸濁物調製前に、冷凍保存する場合には保存前に、予め生理食塩水等で洗浄しておくことが好ましい。
【００１５】
本発明のＲＪ分解酵素含有物を調製するためには、まず、工程（ａ）として、女王蜂幼虫の体組織懸濁物を、６℃以下で遠心処理をすることにより、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の３層に分離する。遠心処理をする前に、中性かつ低濃度の緩衝液等を用いて希釈することにより、体組織懸濁物の粘度や濃度を適宜調整することが好ましい。体組織懸濁物の粘性や濃度が高い場合には、ＲＪ分解酵素の抽出効率が低下するおそれや、作業性が悪化するおそれがあるためである。該緩衝液として、例えば、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）や生理食塩水等がある。なお、該上層は脂質成分であり、該下層は体組織の不溶性成分と推定される。
【００１６】
該遠心処理の条件は、体組織懸濁物を３層に遠心分離することが可能である限り、特に限定されるものではないが、８，０００〜１２，０００×ｇ、６℃以下で５分以上の遠心処理であることが好ましい。１０，０００×ｇ、５℃で１０分間の遠心処理をすることが特に好ましい。遠心速度が低い場合や、遠心時間が短い場合には、３層にきれいに分離しないおそれがある。
【００１７】
次に、工程（ｂ）として、３層のうちの中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収することにより、本発明のＲＪ分解酵素含有物を調製することができる。該回収方法は、常法により行うことができる。抽出の精度を高めるため、該中層を工程（ａ）と同じ条件で再度遠心処理をすることが好ましい。
【００１８】
工程（ｂ）の後、該中層に混入した不溶性の組織片等の不溶物を取り除くため、該中層を濾過することが好ましい。微生物等によるコンタミネーションも防止できることから、該濾過には、０．２μｍのフィルター等を用いることが好ましい。
【００１９】
なお、幼虫体液抽出物の調製や、幼虫体液抽出物からのローヤルゼリー分解酵素含有物の調製は、幼虫体液抽出物に含まれている酵素が失活するおそれがあるため、遠心処理は３〜６℃で行うことが好ましい。また、その他の操作は氷冷下において行うことが好ましい。
【００２０】
本発明のＲＪ分解物は、本発明のＲＪの分解方法により、すなわち、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いることにより、調製することができる。該ＲＪは、生のＲＪであってもよく、乾燥粉末ＲＪを還元したものであってもよい。また、該ＲＪは、いずれの産地のものであってもよく、いずれの蜂種が産生したものであってもよい。さらに、該ＲＪは、ＲＪから常法により分画したタンパク質であってもよい。特にＲＪの水溶性タンパク質であることが好ましい。生理活性を有する物質が多く含有されていることが期待できるためである。
【００２１】
ＲＪの水溶性タンパク質の分画は、水溶性のタンパク質と疎水性のタンパク質を分離することができる方法であれば、いずれの方法を用いてもよい。該方法として、例えば、水溶性溶媒とＲＪを混合した懸濁液を、酢酸エチルやブタノール等の有機溶媒で分配処理して抽出精製する方法や、該懸濁液を、静置した後遠心処理をすることにより上清を得る方法等がある。
【００２２】
例えば、ＲＪやＲＪの水溶性タンパク質に、本発明のＲＪ分解酵素含有物を添加して、インキュベートする方法により、ＲＪ分解物を調製することができる。ＲＪ等は、予めリン酸緩衝液等を用いて希釈しておいてもよい。また、リン酸緩衝液等を用いてタンパク質濃度や粘度を調製したＲＪ分解酵素含有物を用いてもよい。
【００２３】
該インキュベートの温度や時間は、本発明のＲＪ分解酵素含有物のＲＪ分解活性が阻害されない条件であれば、特に限定されるものではないが、反応温度条件は３０〜４０℃が好ましく、３４〜３８℃が特に好ましい。また、ｐＨ６．５〜１０が好ましく、ｐＨ７〜９．５が特に好ましい。ｐＨ７〜７．５の反応条件で行う場合には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で約５１ｋＤａの位置にバンドとして表れるタンパク質が主に分解され、ｐＨ８．５〜９の反応条件で行う場合には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約４６ｋＤａの位置にバンドとして表れるタンパク質が主に分解される。
【００２４】
以下、本発明のＲＪの分解方法について、さらに詳細に説明する。
まず、後記実施例１に記載する方法により調製したＲＪ分解酵素含有物のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準物質としてＬｏｗｒｙ法を用いて測定した後、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈することにより、６ｍｇ／ｍＬのＲＪ分解酵素溶液を調製した。
次に、８ｍＬの緩衝液に、１ｍＬの後記参考例２に記載する方法により調製したＲＪタンパク質溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）と、１ｍＬの該ＲＪ分解酵素溶液（６ｍｇ／ｍＬ）を添加して混合した酵素反応液を調製した。該酵素反応液を３７℃で反応させ、氷冷して反応を停止させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＲＪタンパク質の変化を確認した。分離したＲＪタンパク質は、ＣＢＢ Ｒ−２５０を用いて染色した。緩衝液は、ｐＨ４、５、及び５．５の５０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ６、６．５、７、及び７．５の５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８及び９の５０ｍＭのＴｒｉ−ＨＣｌ緩衝液を、それぞれ用いた。
【００２５】
図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、ｐＨ毎に示した図である。（ａ）はｐＨ４、（ｂ）はｐＨ５、（ｃ）はｐＨ６、（ｄ）はｐＨ６．５、（ｅ）はｐＨ７、（ｆ）はｐＨ７．５、（ｇ）はｐＨ８、及び（ｈ）はｐＨ９である。各図のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を表している。また、Ｍは分子量マーカーを示している。後記参考例２に記載する方法により調製したＲＪタンパク質溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥすると、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａの位置に強いバンドが検出された。矢印アが約５１ｋＤａのバンドを示し、矢印イが約４６ｋＤａのバンドを示している。この結果、ＲＪタンパク質がＲＪ分解酵素溶液による処理によって減少していること、及び、ｐＨの上昇に伴い、分解速度が上がっていることが分かった。特に、ｐＨ７〜７．５の反応条件では、主に約５１ｋＤａのタンパク質が分解され、ｐＨ８．５〜９の反応条件では、主に約４６ｋＤａのタンパク質が分解されることが確認された。すなわち、後記実施例１に記載する方法により調製したＲＪ分解酵素含有物中には、ＲＪタンパク質を分解する酵素が含有されていることが、図１の結果から明らかである。また、中性条件下とアルカリ性条件下で該ＲＪ分解酵素含有物によるＲＪタンパク質分解パターンが異なっていることから、該ＲＪ分解酵素含有物には少なくとも２種類の分解酵素が存在していると推定される。
【００２６】
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ＲＪをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られたＲＪ分解物は、種々の生理活性を有している。該生理活性は、未酵素処理のＲＪ水溶性画分が有する生理活性と比べて、幾つかの特徴を有している。例えば、該ＲＪ分解物は、アミロイドによる神経細胞死誘導に対する抑制作用が、未酵素処理のＲＪ水溶性画分とほぼ同等であるが、神経細胞に対する非特異的な細胞変性作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも軽減している。また、グリア細胞に対する細胞増殖作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大している。その他、ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大している。
【００２７】
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ＲＪをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られたＲＪ分解物は、抗酸化活性をも有している。したがって、該ＲＪ分解物は抗酸化剤としても用いることができる。例えば、該ＲＪ分解物は、その抗酸化活性により、一酸化塩素（ＣｌＯ・）等のラジカルによるタンパク質分解を抑制することができる。ＲＪは古くから摂食されている食品であることから、該ＲＪ分解物も非常に安全であり、アスコルビン酸等と同様に、飲食品へ添加される抗酸化剤や、生体を酸化ストレスから保護することを目的として接食されるサプリメントの有効成分等としても有用であることが期待できる。
【００２８】
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ＲＪをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られたＲＪ分解物は、上記のような生理活性を有しているため、抗酸化剤、細胞増殖剤、感染阻害剤、神経細胞死誘導抑制剤等の有効成分とすることができる。これらの生理活性剤は、サプリメント等の飲食品として単独で摂食されてもよく、他の飲食用組成物や医薬用組成物と同様に、飲食品や医薬品への添加剤として用いることもできる。
【００２９】
該ＲＪ分解物を有効成分としたこれらの生理活性剤の製造方法は、該ＲＪ分解物の生理活性を阻害しないものであれば特に限定されるものではなく、通常、ＲＪ又はＲＪ分解物を含有する飲食用組成物又は医薬用組成物を製造する場合に使用される方法を用いて製造することができる。これらの生理活性剤の剤型は、特に限定されるものではないが、経口剤に適した剤型であることが好ましい。例えば、ソフトカプセル剤であってもよく、ハードカプセル剤であってもよく、錠剤であってもよく、シロップ剤等であってもよい。また、これらの生理活性剤に含まれる該ＲＪ分解物量は、該ＲＪ分解物の生理活性が作用効果を奏し得る量であれば、特に限定されるものではなく、原料とするＲＪの種類、期待する該ＲＪ分解物の生理活性、剤型等を考慮して、適宜決定することができる。
【００３０】
該ＲＪ分解物を有効成分としたこれらの生理活性剤の摂取量は、該ＲＪ分解物の生理活性が作用効果を奏し得る量であれば、特に限定されるものではなく、摂取する人や動物の体重、年齢、性別等により適宜決定することができる。例えば、一日当たり３００ｍｇ〜３ｇを、１度に又は数回に分けて摂取することが好ましい。
【実施例】
【００３１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３２】
［参考例１］ 幼虫懸濁物の調製
約１５ｇの３日齢の西洋ミツバチの女王蜂幼虫を、採取した後、氷冷した生理食塩水で洗浄した。その後、ポリエステル製の平均１００メッシュの布（「テトロン」、東レ社製）を用いて女王蜂幼虫を裏ごしすることで、幼虫の表皮を破り、体液及び内臓を搾り出した。これにより、乳白色の幼虫懸濁物を調製した。
【００３３】
［参考例２］ＲＪタンパク質溶液の調製
ＲＪ（中国産）１０ｍＬに、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液２０ｍＬを加えて混合して、ＲＪ希釈溶液を調製した。該ＲＪ希釈溶液を、２５，０００×ｇ、５℃で２０分間遠心した後、不溶性成分を除去し、上清を回収した。その後、該上清を、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈し、３０ｍｇ／ｍＬのＲＪタンパク質溶液を調製した。
【００３４】
［実施例１］
１．ＲＪ分解酵素含有物の調製
参考例１に記載する方法により調製した幼虫懸濁物を、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて２倍希釈した後、１０，０００×ｇ、５℃で１０分間遠心した。該遠心処理により、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の３層に分離された。該上層は脂質分、該下層は不溶性の体組織等と推定される。該中層を回収した後、さらに１０，０００×ｇ、５℃で１０分間遠心して３層に分離し、中層をＲＪ分解酵素含有物として回収した。該ＲＪ分解酵素含有物を、除去しきれなかった不溶性の組織片を除去し、かつ滅菌するために、０．２μｍのセルロースアセテート系フィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過した。これにより、黄色透明なＲＪ分解酵素含有物を得た。
【００３５】
２．ＲＪタンパク質の分解
該ＲＪ分解酵素含有物のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準物質としてＬｏｗｒｙ法を用いて測定し、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて、３ｍｇ／ｍＬのＲＪ分解酵素溶液を調製した。
８ｍＬの緩衝液に、１ｍＬの前記参考例２に記載する方法により調製したＲＪタンパク質溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）と、前記実施例１に記載する方法により調製した１ｍＬのＲＪ分解酵素溶液（６ｍｇ／ｍＬ）を添加して混合した酵素反応液を調製した。該緩衝液として、ｐＨ７の５０ｍＭのリン酸緩衝液、若しくは、ｐＨ９の５０ｍＭのＴｒｉ−ＨＣｌ緩衝液を用いた。該酵素反応液を３７℃で反応させ、氷冷して反応を停止させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＲＪタンパク質を分離した。ＣＢＢ Ｒ−２５０を用いて染色したゲルを乾燥させた後、蛍光スキャナーＴｙｐｈｏｏｎ ９４００（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて染色像を得た。
【００３６】
図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、ｐＨ毎に示した図である。（ａ）はｐＨ７、（ｂ）はｐＨ９の染色像である。各図のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を、Ｍは分子量マーカーを表している。矢印アが約５１ｋＤａ、矢印イが約４６ｋＤａ、矢印ウが約３３ｋＤａ、及び矢印エが約２５ｋＤａのバンドをそれぞれ示している。この結果、ｐＨ７及び９の双方において、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａのタンパク質が分解されていることが確認された。特に、ｐＨ９において、反応開始後４時間という短時間において、約４６ｋＤａのタンパク質が、検出できない程分解されていることが分かった。また、ｐＨ７において、反応時間の経過と共に、約３３ｋＤａと約２５ｋＤａのタンパク質が検出されるようになった。
【００３７】
画像解析ソフトＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、図２の染色像の各バンドのバンド強度を定量した。図３は、反応開始０時間でのバンド強度を１として、反応時間経過に伴うバンド強度の変化を示したものである。（ａ）は約５１ｋＤａのバンドの強度比を、（ｂ）は約４６ｋＤａのバンドの強度比を、（ｃ）は約３３ｋＤａ及び約２５ｋＤａのバンドの強度比を、それぞれ示したものである。（ａ）と（ｂ）の図中の●はｐＨ７のバンドを、○はｐＨ９のバンドを、それぞれ示している。また、（ｃ）の図中の△はｐＨ７における約３３ｋＤａのバンドを、▲はｐＨ７における約２５ｋＤａのバンドを、それぞれ示している。
【００３８】
図３の（ａ）と（ｂ）で示されているように、ｐＨ７及び９の双方において、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａのタンパク質が分解されていることが、定量的にも確認することができた。また、図３の（ｃ）の結果から、ｐＨ７において、反応開始後１６時間まで、約３３ｋＤａと約２５ｋＤａのタンパク質が増加していることが確認された。この結果から、約３３ｋＤａと約２５ｋＤａのタンパク質は、約５１ｋＤａ又は約４６ｋＤａのタンパク質が、ＲＪ分解酵素溶液中に含有されているＲＪ分解酵素により、分解されてできた分解物である可能性が示唆される。
【００３９】
［実施例２］
反応時間を６０分までとした以外は、全て実施例１のｐＨ９の条件下における反応と同様にして、ＲＪタンパク質を分解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＲＪタンパク質を分離して、各バンドの強度を定量した。図４の（ａ）はゲルの染色像を、（ｂ）は約４６ｋＤａのバンドの強度比を、それぞれ示したものである。図中のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を、Ｍは分子量マーカーを表している。また、矢印アが約５１ｋＤａ、矢印イが約４６ｋＤａをそれぞれ示している。
【００４０】
この結果、約４６ｋＤａのタンパク質が、ＲＪ分解酵素溶液中に含有されているＲＪ分解酵素により、反応開始後１時間という短時間に、およそ８０％が分解されていることが確認された。なお、図（ｂ）により、反応開始後５分の時点では、分解がほとんど生じていない結果となったが、これは、ＲＪ分解酵素による酵素反応を開始する前に、ＲＪタンパク質溶液を３７℃でプレインキュベートしなかったために、酵素反応が開始するまでにタイムラグが発生してしまったためではないかと推察される。
【００４１】
［実施例３］
反応時間を２４時間までとした以外は、全て実施例１のｐＨ７の条件下における反応と同様にして、ＲＪタンパク質を分解した。その後、氷冷して反応を停止させた酵素反応液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、該酵素反応溶液中に含有されるタンパク質を分画した。ゲル濾過クロマトグラフィーは、溶離液として０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いて、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、５℃の条件で行った。分画されたタンパク質を検出するために、ＵＶ検出器を用いて２８０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４２】
図５は、実施例３において測定した２８０ｎｍの吸光度の結果を表した図である。（ａ）は反応開始前、（ｂ）は反応開始後８時間、（ｃ）は反応開始後１６時間、及び（ｄ）は反応開始後２４時間の結果である。また、図中の矢印アが約３５０ｋＤａ、矢印イが約６０ｋＤａ、矢印ウが約５ｋＤａ、矢印エが約３ｋＤａ、及び範囲オが数百Ｄａのタンパク質の画分をそれぞれ示している。
反応時間の経過に伴い、約３５０ｋＤａ及び約６０ｋＤａのタンパク質が減少する一方、約５ｋＤａ、約３ｋＤａ、及び数百Ｄａのタンパク質が増加していることが、図５の結果から明らかである。増加している約５ｋＤａ等のタンパク質は、約３５０ｋＤａ等のタンパク質の分解物であることが推察される。つまり、本発明のＲＪ分解酵素含有物により、ＲＪの高分子タンパク質が分解されることが、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分画の結果からも確認できた。
【００４３】
［実施例４］
参考例２と同様にしてＲＪタンパク質溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。また、希釈後の濃度を３ｍｇ／ｍＬとした以外は全て実施例１と同様にしてＲＪ分解酵素溶液（３ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
８ｍＬの緩衝液に、１ｍＬの該ＲＪタンパク質溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）と、１ｍＬの該ＲＪ分解酵素溶液（３ｍｇ／ｍＬ）を添加して混合した酵素反応液を調製した。該緩衝液として、ｐＨ７の５０ｍＭのリン酸緩衝液、若しくは、ｐＨ９の５０ｍＭのＴｒｉ−ＨＣｌ緩衝液を用いた。該酵素反応液を４、２０、３７、及び５０℃で、それぞれ反応させ、氷冷して反応を停止させた。各温度の恒温槽で該酵素反応液を混合した時点を反応開始時点とし、反応時間を４、１６、２４時間とした。氷冷後の該酵素反応液を、実施例１と同様にＲＪタンパク質を分離することにより、反応温度の影響を観察した。
【００４４】
この結果、３７℃では、実施例２と同様に、ｐＨ７及び９の双方において、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａのタンパク質の分解が観察された。特に、ｐＨ９においては、反応開始４時間の時点で約４６ｋＤａのタンパク質は検出限界以下まで分解され、約５１ｋＤａのタンパク質も反応開始１６時間の時点で検出限界以下まで分解された。
これに対し、４℃では、ｐＨ７及び９の双方において、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａのタンパク質の分解はほとんど観察されなかった。２０℃では、３７℃の場合と比較し、分解反応の進行はゆるやかであったものの、約５１ｋＤａと約４６ｋＤａのタンパク質の分解が観察された。一方、５０℃では、３７℃よりもさらに分解反応は速やかであり、ｐＨ７及び９の双方において、反応開始４時間の時点で大部分のタンパク質が分解されていることが確認された。
【００４５】
つまり、２０〜５０℃の温度範囲においては、本発明のＲＪ分解酵素含有物はＲＪを分解することができること、及び、該温度範囲においては、温度が高くなればなるほど、本発明のＲＪ分解酵素含有物によるＲＪの分解反応の進行は速やかであることが明らかである。但し、一般的に、５０℃においては、ＲＪの褐変化やＲＪタンパク質の変性等が起こる可能性がある。このため、本発明のＲＪ分解酵素含有物によりＲＪを分解する場合には、３７℃付近の温度で行うことが好ましい。
【００４６】
［実施例５］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する、脳神経細胞への生理活性を調べた。具体的には、初代培養したマウス胎児海馬神経細胞の、アミロイドによる神経細胞死誘導に対するＲＪ分解物の影響を調べた。なお、マウス胎児海馬神経細胞は、マウス胎児から常法により採取した海馬神経細胞を、グリア細胞を培養した９６穴マルチウェルプレートに、４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにまき、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。細胞培養液として、Ｂ２７サプリメント含有ニューロバーサルメディウム（ギブコ社製）を用いた。実験には、培養後１週間経過後の細胞を用いた。
【００４７】
まず、ＲＪ（中国産）５ｍＬに、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液１５ｍＬを加えて混合して、ＲＪ希釈溶液を調製した。該ＲＪ希釈溶液を、２５，０００×ｇ、５℃で２０分間遠心した後、不溶性成分を除去し、上清を回収した。その後、該上清を凍結乾燥することにより、ＲＪ水溶性粗分画を得た。該ＲＪ水溶性粗分画を、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈し、３０ｍｇ／ｍＬのＲＪ水溶性粗分画溶液を調製した。
次に、前記参考例２に記載する方法により調製したＲＪタンパク質溶液に代えて、該ＲＪ水溶性粗分画溶液を用いたこと、及び、反応時間を４時間としたこと以外は、全て実施例１と同様にして、該ＲＪ水溶性粗分画溶液中に含有されるＲＪタンパク質を分解し、ＲＪ分解物を得た。
【００４８】
マウス胎児海馬神経細胞が培養された９６穴マルチウェルプレートに、アミロイドペプチド（ペプチド研究所製）とＲＪ水溶性粗分画溶液又はＲＪ分解物を添加した後、４８時間培養した。アミロイドペプチドは、２ｍｇ／ｍＬの濃度で３７℃、４８時間保温した後、最終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように添加した。また、ＲＪ水溶性粗分画溶液、ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物、又はｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物は、各タンパク質の細胞培養液中の最終濃度が、それぞれ０、３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００、又は１，０００μｇ／ｍＬとなるように添加した。アミロイドペプチドとＲＪ分解物等のいずれも添加せず、等量の細胞培養液を添加したものをコントロールとして用いた。
その後、抗Ｍａｐ２抗体を用いた免疫染色やヘキスト３３３４２色素染色により死細胞を識別し、各ディッシュ中のマウス胎児海馬神経細胞の生存数、グリア細胞の生存数をそれぞれ測定した。さらに、顕微鏡観察により、細胞変形が観察されたマウス胎児海馬神経細胞数を測定した。なお、細胞変形とは、神経細胞が、樹状突起を有する細胞体と軸索からなる神経細胞特有の形態から変化することを意味する。該変化には、例えば、突起形成、軸索の萎縮、多軸索化、神経細胞同士の凝集、神経細胞の死滅等がある。
【００４９】
【表１】
【００５０】
表１は、マウス胎児海馬神経細胞数等の測定結果を示したものである。生存神経細胞数及び変性神経細胞数は、コントロールの神経細胞数を１００％として、また、グリア細胞数は、コントロールのグリア細胞数を１００％として、それぞれ表している。初代培養したマウス胎児海馬神経細胞に、アミロイドペプチドを添加すると、約６０％の神経細胞が死滅し、生存率は約４０％であった。アミロイドペプチドと共にＲＪ水溶性粗分画溶液を添加すると、ＲＪ水溶性粗分画溶液は、アミロイドによる神経細胞死誘導を容量依存的に阻害した。最大生存率は、６０〜７０％にまで回復した。ＲＪ水溶性粗分画溶液による該効果は、６２．５〜２５０μｇ／ｍＬの低濃度においても認められた。但し、１，０００μｇ／ｍＬ以上のＲＪ水溶性粗分画溶液を添加すると、非特異的な神経細胞変形作用が観察された。
【００５１】
ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物を添加した場合には、ＲＪ水溶性粗分画溶液を添加した場合とほぼ同様の効果が観察された。一方、ｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物を添加した場合にも、ＲＪ水溶性粗分画溶液と同様に、アミロイドによる神経細胞死誘導阻害効果が観察された。さらに、ＲＪ水溶性粗分画溶液等と比較し、非特異的な神経細胞変形作用が低下し、グリア細胞への細胞増殖作用が増大していた。これは、グリア細胞等の増殖が促進される結果、神経保護効果がより強く発揮されるため、ＲＪ水溶性粗分画溶液が有する非特異的な神経細胞変形作用が低下するためではないかと推察される。
【００５２】
表１の結果から、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ｐＨ９で４時間以上で酵素処理をすることにより得られるＲＪ分解物は、アミロイドによる神経細胞死誘導に対する抑制作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分とほぼ同等であり、神経細胞に対する非特異的な細胞変性作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも著しく軽減しており、かつ、グリア細胞に対する細胞増殖作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大している、という特徴を有していることが明らかである。
【００５３】
［実施例６］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する、ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害活性を調べるため、中和活性試験を行った。具体的には、アカゲザルの胎児腎臓由来のＭＡ１０４細胞の細胞培養液中に、ヒトロタウィルスと共に、ＲＪ若しくはＲＪ分解物を添加することにより、ヒトロタウィルス感染に対するＲＪ分解物の影響を観察した。ＲＪとして、実施例４と同様にして調製したＲＪ水溶性粗分画溶液を用いた。また、ＲＪ分解物として、反応時間を２４時間とした以外は全て実施例４と同様にして調製したｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物、又はｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物を、それぞれ用いた。なお、ＭＡ１０４細胞は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。細胞培養液として、１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）及び１０％ＴＰＢ（トリプトースホスフェートブロース）含有Ｅａｇｌｅ’ ＭＥＭ培地（日水製薬社製）に、若干量の抗生物質等を添加したものを用いた。
【００５４】
まず、２４ｃｍ２ＴＣフラスコに５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋとなるようにまいて５日間培養したＭＡ１０４細胞を用いて調製した細胞懸濁液に、ヒトロタウィルス溶液（宮城がんセンター製）と、ＲＪ水溶性粗分画溶液又はＲＪ分解物を添加した。ヒトロタウィルス溶液は、最終濃度が６．５×１０４ＦＣＦＵ／ｍＬとなるように添加した。また、ＲＪ水溶性粗分画溶液、ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物、又はｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物は、各タンパク質の細胞培養液中の最終濃度が表２記載の濃度となるようにそれぞれ添加した。ＲＪ分解物等に代えて、等量の細胞培養液を添加したものをコントロールとして用いた。その後、２２時間培養した後、一次抗体としてハトロタウィルス株ＰＯ−１３ ＶＰ６を認識するＰ３−１を、二次抗体としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを、それぞれ用いた間接蛍光抗体法により、ヒトロタウィルスに感染したＭＡ１０４細胞数を測定した。
【００５５】
【表２】
【００５６】
表２は、ヒトロタウィルスの中和活性試験の結果を示した図である。感染細胞数は、コントロールの感染細胞数を１００％として、それぞれ表している。ＲＪ水溶性粗分画溶液を添加した場合には、約３００μｇ／ｍＬ以上の濃度でウィルス感染が促進され、約３００μｇ／ｍＬ以下の濃度ではウィルス感染が抑制される傾向が観察された。つまり、高濃度では感染を促進し、低濃度では感染を抑制するという、作用の二面性を有する可能性が示唆された。
【００５７】
一方、ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物は、３７μｇ／ｍＬ以上の濃度でウィルス感染が促進され、１８．５μｇ／ｍＬ以下の濃度ではウィルス感染が抑制される傾向が観察された。つまり、ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物は、ＲＪ水溶性粗分画溶液と同様に、高濃度では感染を促進し、低濃度では感染を抑制するが、感染抑制から促進へ転換するタンパク質濃度が低濃度側にシフトしていた。これに対して、４０μｇ／ｍＬ以下の濃度のｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物を添加した場合には、ＲＪ水溶性粗分画溶液を添加した場合よりも大きな感染阻害効果を示した。特に、ｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物は、１６．５μｇ／ｍＬ以下の濃度では、タンパク質濃度依存的に感染阻害効果を示した。また、反応時間が４時間以上である場合には、反応時間が長いＲＪ分解物ほど、低濃度における感染抑制効果の濃度依存性が顕著であった。
【００５８】
表２の結果から、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ｐＨ９で４時間以上で酵素処理をすることにより得られるＲＪ分解物は、ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大している、という特徴を有していることが明らかである。
【００５９】
［実施例７］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する、細胞増殖活性を調べるため、ラットの小腸由来のＩＥＣ−６細胞を用いてＷＳＴ−１法を行った。具体的には、ＩＥＣ−６細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにまいて２４時間培養した後、培養液をＲＪ分解物含有培養液に交換して、さらに２４時間培養する。その後、培養液中に、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（和光純薬工業社製）を添加して２時間培養した後、細胞培養液の４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、フォルマザン産物の産生量を測定した。ＲＪ分解物として、反応時間を２４時間とした以外は全て実施例４と同様にして調製したｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物、又はｐＨ９で分解して得たＲＪ分解物を、それぞれ用いた。なお、ＩＥＣ−６細胞の培養は常法により行った。
この結果、ｐＨ７で分解して得たＲＪ分解物では、ＲＪ分解物の濃度が１ｍｇ／ｍＬ以下である場合には、細胞増殖促進傾向が、１ｍｇ／ｍＬ以上である場合には、細胞増殖抑制傾向が、それぞれ観察された。
【００６０】
実施例６及び７の結果から、実施例６においてＲＪタンパク質の濃度依存的にウィルス感染の促進及び抑制という二面性が観察された理由の一つとして、ＲＪタンパク質の細胞増殖促進効果による可能性があると推察される。つまり、細胞増殖のコントロールを一因として、ＲＪタンパク質及びそのペプチドフラグメントが、ヒトロタウィルス感染をコントロールする作用を示す可能性が示唆された。
【００６１】
［実施例８］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する細胞増殖活性をより詳細に解析するために、ＲＪ分解物を脱塩処理した後の細胞増殖活性を調べた。
１．脱塩処理
まず、反応時間を２４時間とした以外は全て実施例４と同様にして、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ｐＨ７で酵素処理して得たＲＪ分解物（以下、ＲＪ分解物（ｐＨ７）ということがある。）、及びｐＨ９で酵素処理して得たＲＪ分解物（以下、ＲＪ分解物（ｐＨ９）ということがある。）を、それぞれ調製した。
得られたＲＪ分解物（ｐＨ７）とＲＪ分解物（ｐＨ９）を、それぞれ、Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてサイズ分画を行った。吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定して得られた溶出パターンに従って、脱塩したフラクション（以下、フラクションＤ１）と塩を含むフラクション（以下、フラクションＤ２）の２つのフラクションを分取した。
図６は、Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにおいて、吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の吸光度、点線がＲＪ分解物（ｐＨ７）の吸光度、二点鎖線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の伝導率、一点鎖線がＲＪ分解物（ｐＨ７）の伝導率を、それぞれ示している。図中、「Ｄ１」がフラクションＤ１として分取した画分であり、「Ｄ２」がフラクションＤ２として分取した画分である。
【００６２】
２．細胞増殖活性の測定
細胞の培養液として、ＦＣＳ等の増殖因子を含有しない培養液（対照培養液）にＲＪ分解物（ｐＨ９）のフラクションＤ１（フラクションＤ１（ｐＨ９））を含有させた培養液又は対照培養液にＲＪ分解物（ｐＨ７）のフラクションＤ１（フラクションＤ１（ｐＨ７））を含有させた培養液を用いた以外は、実施例７と同様にして、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。ポジティブコントロールとして１０％ＦＣＳ含有培養液を、ネガティブコントロールとして対照培養液を、それぞれ用いた。各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量は、対照培養液を添加した場合に産生されたフォルマザン産物量に対する、各培養液を添加した場合に産生されたフォルマザン産物量の比率で表した。
図７は、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。図７（ａ）は、フラクションＤ１（ｐＨ９）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果であり、図７（ｂ）は、フラクションＤ１（ｐＨ７）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を、「ＰＣ」は１０％ＦＣＳ含有培養液を、それぞれ示している。また、各濃度は、各培養液中のフラクションＤ１由来のタンパク質濃度を示している。
図７（ａ）の結果に示されるように、培養液中のフラクションＤ１（ｐＨ９）濃度依存的に、細胞増殖量が増大することが分かった。特にフラクションＤ１（ｐＨ９）濃度が５０．５μｇ／ｍＬの培養液を用いて培養した場合には、１０％ＦＣＳ含有培養液を用いた場合とほぼ同程度に細胞増殖が促進されていた。但し、フラクションＤ１（ｐＨ９）濃度が８４．２μｇ／ｍＬ以上の培養液の場合には、濃度依存的に細胞増殖量が減少する傾向が観察されたことから、フラクションＤ１（ｐＨ９）による細胞増殖促進効果（細胞増殖活性）には、至適濃度があることが示唆された。
一方で、図７（ｂ）の結果に示されるように、培養液にフラクションＤ１（ｐＨ７）を含有させた場合には、細胞増殖量はほとんど変化せず、フラクションＤ１（ｐＨ７）は細胞増殖に著しい影響を与えることはないことが明らかになった。
すなわち、実施例８の結果からも、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ｐＨ９で酵素処理して得たＲＪ分解物は細胞増殖活性を有することが明らかである。
【００６３】
［実施例９］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する細胞増殖活性をより詳細に解析するために、ＲＪ分解物を粗精製した後の細胞増殖活性を調べた。
１．粗精製
実施例８において調製したＲＪ分解物（ｐＨ９）のフラクションＤ２（フラクションＤ２（ｐＨ９））及びＲＪ分解物（ｐＨ７）のフラクションＤ２（フラクションＤ２（ｐＨ７））を、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲカラム（ナカライテスク社製）を用いて、粗精製を行った。吸着バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液を、溶出バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル溶液を、それぞれ用いた。吸光度（２１５ｎｍ及び２８０ｎｍ）及び伝導率を測定して得られた溶出パターンに従って、非吸着フラクション（以下、フラクションＣ１）と吸着フラクション（以下、フラクションＣ２）の２つのフラクションを分取した。
図８は、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにおいて、吸光度（２１５ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がフラクションＤ２（ｐＨ９）の吸光度、点線がフラクションＤ２（ｐＨ７）の吸光度、二点鎖線がフラクションＤ２（ｐＨ９）の伝導率、一点鎖線がフラクションＤ２（ｐＨ７）の伝導率を、それぞれ示している。図中、「Ｃ１（ｐＨ７）」がフラクションＣ１（ｐＨ７）として、「Ｃ１（ｐＨ９）」がフラクションＣ１（ｐＨ９）として、「Ｃ２（ｐＨ７）」がフラクションＣ２（ｐＨ７）として、「Ｃ２（ｐＨ９）」がフラクションＣ２（ｐＨ９）として、それぞれ分取した画分である。
【００６４】
２．フラクションＣ１の細胞増殖活性の測定
細胞の培養液として、フラクションＤ２（ｐＨ９）のフラクションＣ１（フラクションＣ１（ｐＨ９））を希釈した培養液又はフラクションＤ２（ｐＨ７）のフラクションＣ１（フラクションＣ１（ｐＨ７））を希釈した培養液を用いた以外は、実施例７と同様にして、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。なお、フラクションＣ１（ｐＨ９）又はフラクションＣ１（ｐＨ７）の希釈には、対照培養液を用いた。
図９は、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。図９（ａ）は、フラクションＣ１（ｐＨ９）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果であり、図９（ｂ）は、フラクションＣ１（ｐＨ７）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を、「ＰＣ」は１０％ＦＣＳ含有培養液を、それぞれ示している。
図９（ａ）と（ｂ）の結果に示されるように、フラクションＣ１（ｐＨ９）とフラクションＣ１（ｐＨ７）のいずれを含有させた培養液においても、細胞増殖が促進されていた。両者を比較すると、フラクションＣ１（ｐＨ７）を含有させた場合よりも、フラクションＣ１（ｐＨ９）を含有させた場合のほうが、細胞増殖促進効果が高い傾向が観察された。
【００６５】
３．フラクションＣ２の細胞増殖活性の測定
細胞の培養液として、対照培養液にフラクションＤ２（ｐＨ９）のフラクションＣ２（フラクションＣ２（ｐＨ９））を含有させた培養液又は対照培養液にフラクションＤ２（ｐＨ７）のフラクションＣ２（フラクションＣ２（ｐＨ７））を含有させた培養液を用いた以外は、実施例７と同様にして、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。
図１０は、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。図１０（ａ）は、フラクションＣ２（ｐＨ９）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果であり、図１０（ｂ）は、フラクションＣ２（ｐＨ７）を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を示している。また、各濃度は、各培養液中のフラクションＣ２由来のタンパク質濃度を示している。
この結果、培養液にフラクションＣ２（ｐＨ９）を含有させた場合には、培養液中の濃度が３．４２μｇ／ｍＬ以下では、濃度依存的に細胞増殖量が増大し、３．４２μｇ／ｍＬ超では、濃度依存的に細胞増殖量が減少する傾向が観察された。一方、培養液にフラクションＣ２（ｐＨ７）を含有させた場合には、培養液中の濃度が４．６７μｇ／ｍＬ以下では、濃度依存的に細胞増殖量が増大し、４．６７μｇ／ｍＬ超では、濃度依存的に細胞増殖量が減少する傾向が観察された。また、両者を比較すると、フラクションＣ２（ｐＨ７）を含有させた場合よりも、フラクションＣ２（ｐＨ９）を含有させた場合のほうが、細胞増殖促進効果が高い傾向が観察された。
【００６６】
したがって、実施例９の結果から、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて酵素処理して得たＲＪ分解物は細胞増殖活性を有すること、及び、ｐＨ７の反応条件で酵素処理して得たＲＪ分解物よりも、ｐＨ９の反応条件で酵素処理して得たＲＪ分解物のほうが、高い細胞増殖活性を有することが明らかである。
【００６７】
［実施例１０］
本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて得られたＲＪ分解物が有する抗酸化活性を調べた。
１．ＲＪ分解物の調製
ＲＪ（中国産）に純水を加えて懸濁したものを、孔径１０ｋＤの透析膜を用いて、純水にて７２時間透析した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥した後、再び純水に懸濁し、３０ｍｇ／ｍＬのＲＪタンパク質溶液を調製した。
１ｍＬの該ＲＪタンパク質溶液に、１ｍＬのＲＪ分解酵素含有物（３ｍｇ／ｍＬ）、８ｍＬのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ９．０）を加え、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、孔径５００Ｄａの透析膜を用いて、純水にて５日間透析した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥したものを、ＲＪ分解物とした。なお、ＲＪ分解酵素含有物は、実施例１と同様にして調製したものを用いた。
【００６８】
２．抗酸化活性測定
ＲＪ分解物の抗酸化活性は、柳内ら（日本食品科学工学会誌、第５１巻第５号、第２３８〜２４６ページ、２００４年）の方法に従い、一酸化塩素（ＣｌＯ・）によるＢＳＡ分解に対するＲＪ分解物の影響を調べることにより測定した。
具体的には、まず、ＢＳＡ含有ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に、ＰＢＳを用いて希釈したＲＪ分解物を添加することにより、ＢＳＡ（最終濃度４０μｇ／ｍＬ）及びＲＪ分解物（最終濃度０、０．３、０．５、１．０、又は２．０μｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳ試料溶液を調製した。該ＰＢＳ試料溶液に、最終濃度１．７ｍＭとなるように次亜塩素酸ナトリウムを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＰＢＳ試料溶液中のタンパク質を分離し、ＣＢＢ染色することにより検出した。ＣＢＢ染色像をスキャナーで取り込んだ後、ＢＳＡに相当するバンドの濃度を解析した。各ＰＢＳ試料溶液のＢＳＡ濃度は、次亜塩素酸ナトリウムを添加しなかったＰＢＳ試料溶液をブランクとし、ブランクのＢＳＡ濃度を１とした場合の相対濃度を調べた。なお、バンドの濃度解析は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）が提供する解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて行った。また、ＲＪ分解物に代えて、公知の抗酸化剤であるアスコルビン酸（最終濃度０、３．０、４．０、５．０、又は７．５ｍＭ）又はカルノシン（最終濃度０、２．５、５．０、７．５、又は１０．０ｍＭ）を添加したＰＢＳ試料溶液についても、同様にＢＳＡ濃度を調べた。
図１１は、各ＰＢＳ試料溶液のＢＳＡ濃度の結果を示した図である。図１１（ａ）はＲＪ分解物を添加した場合の結果であり、図１１（ｂ）はアスコルビン酸を添加した場合の結果であり、図１１（ｃ）はカルノシンを添加した場合の結果である。この結果、ＲＪ分解物を添加しなかった場合には、ＢＳＡはＣＢＢ染色によりバンドが検出されず、ほぼ全てのＢＳＡが、分解されていた。これに対して、ＲＪ分解物を添加した場合には、アスコルビン酸やカルノシンと同様に、ＰＢＳ試料溶液への添加量依存的にＢＳＡの相対濃度は大きくなった。これは、次亜塩素酸ナトリウムから産生された一酸化塩素によるＢＳＡの分解が、ＲＪ分解物により抑制されたためであると推察される。
また、図１１の結果を元に、一酸化塩素によるＢＳＡ分解を５０％まで抑制する濃度を算出したところ、ＲＪ分解物では０．９２±０．２４ｍｇ／ｍＬであり、アスコルビン酸では０．６７±０．０１ｍｇ／ｍＬ（３．８３±０．０８ｍＭ）であり、カルノシンでは０．８４±０．１０ｍｇ／ｍＬ（３．６５±０．３２ｍＭ）であった。すなわち、一酸化塩素によるＢＳＡ分解に対する抗酸化力において、ＲＪ分解物は混合物であるにもかかわらず、公知の抗酸化剤であるアスコルビン酸やカルノシンに匹敵する抗酸化力を有していることが認められた。
これら実施例１０の結果から、本発明のＲＪ分解酵素含有物を用いて、ｐＨ９で酵素処理して得たＲＪ分解物は抗酸化活性を有することが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のＲＪ分解酵素含有物は、女王蜂幼虫が有する、ＲＪを本来の基質とするＲＪ分解酵素が含有されているものであり、ＲＪの分解に最適であることから、ＲＪの生理活性の研究や、ＲＪを用いた医薬品及又は食品の開発等の分野で利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＲＪタンパク質溶液と該ＲＪ分解酵素溶液を添加して混合した酵素反応液を、３７℃で反応させた後、該酵素反応液中のＲＪタンパク質を分離するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥをした結果得られた染色像を、ｐＨ毎に示した図である。（ａ）はｐＨ４、（ｂ）はｐＨ５、（ｃ）はｐＨ６、（ｄ）はｐＨ６．５、（ｅ）はｐＨ７、（ｆ）はｐＨ７．５、（ｇ）はｐＨ８、及び（ｈ）はｐＨ９である。各図のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を表している。また、Ｍは分子量マーカーを示している。矢印アは約５１ｋＤａのバンドを、矢印イは約４６ｋＤａのバンドを、それぞれ示している。
【図２】実施例１において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、ｐＨ毎に示した図である。（ａ）はｐＨ７、（ｂ）はｐＨ９の染色像である。各図のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を、Ｍは分子量マーカーを表している。矢印アが約５１ｋＤａ、矢印イが約４６ｋＤａ、矢印ウが約３３ｋＤａ、及び矢印エが約２５ｋＤａのバンドをそれぞれ示している。
【図３】実施例１において、図２の染色像のバンドの強度を測定し、反応開始０時間でのバンド強度を１として、反応時間経過に伴うバンド強度の変化を示したものである。（ａ）は約５１ｋＤａのバンドの強度比を、（ｂ）は約４６ｋＤａのバンドの強度比を、（ｃ）は約３３ｋＤａ及び約２５ｋＤａのバンドの強度比を、それぞれ示したものである。（ａ）と（ｂ）の図中の●はｐＨ７のバンドを、○はｐＨ９のバンドを、それぞれ示している。また、（ｃ）の図中の△はｐＨ７における約３３ｋＤａのバンドを、▲はｐＨ７における約２５ｋＤａのバンドを、それぞれ示している。
【図４】実施例２において、ｐＨ９の条件下においてＲＪタンパク質を分解した結果を表した図である。（ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果得られたゲルの染色像を、（ｂ）は約４６ｋＤａのバンドの強度比を、それぞれ示したものである。図（ａ）中のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を、Ｍは分子量マーカーを表している。また、矢印アが約５１ｋＤａ、矢印イが約４６ｋＤａをそれぞれ示している。
【図５】実施例３において、測定した２８０ｎｍの吸光度の結果を表した図である。（ａ）は反応開始前、（ｂ）は反応開始後８時間、（ｃ）は反応開始後１６時間、及び（ｄ）は反応開始後２４時間の結果である。また、図中の矢印アが約３５０ｋＤａ、矢印イが約６０ｋＤａ、矢印ウが約５ｋＤａ、矢印エが約３ｋＤａ、及び範囲オが数百Ｄａのタンパク質の画分をそれぞれ示している。
【図６】実施例８のＨｉ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにおいて、吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の吸光度、点線がＲＪ分解物（ｐＨ７）の吸光度、二点鎖線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の伝導率、一点鎖線がＲＪ分解物（ｐＨ７）の伝導率を、それぞれ示している。図中、「Ｄ１」がフラクションＤ１として分取した画分であり、「Ｄ２」がフラクションＤ２として分取した画分である。
【図７】実施例８において、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。（ａ）は、フラクションＤ１（ｐＨ９）を含有させた培養液を添加した場合の結果であり、（ｂ）は、フラクションＤ１（ｐＨ７）を含有させた培養液を添加した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を、「ＰＣ」は１０％ＦＣＳ含有培養液を、それぞれ示している。また、各濃度は、各培養液中のフラクションＤ１由来のタンパク質濃度を示している。
【図８】実施例９のＣｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにおいて、吸光度（２１５ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がフラクションＤ２（ｐＨ９）の吸光度、点線がフラクションＤ２（ｐＨ７）の吸光度、二点鎖線がフラクションＤ２（ｐＨ９）の伝導率、一点鎖線がフラクションＤ２（ｐＨ７）の伝導率を、それぞれ示している。図中、「Ｃ１（ｐＨ７）」がフラクションＣ１（ｐＨ７）として、「Ｃ１（ｐＨ９）」がフラクションＣ１（ｐＨ９）として、「Ｃ２（ｐＨ７）」がフラクションＣ２（ｐＨ７）として、「Ｃ２（ｐＨ９）」がフラクションＣ２（ｐＨ９）として、それぞれ分取した画分である。
【図９】実施例９において、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。（ａ）は、フラクションＣ１（ｐＨ９）を含有させた培養液を添加した場合の結果であり、（ｂ）は、フラクションＣ１（ｐＨ７）を含有させた培養液を添加した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を、「ＰＣ」は１０％ＦＣＳ含有培養液を、それぞれ示している。
【図１０】実施例９において、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。（ａ）は、フラクションＣ２（ｐＨ９）を含有させた培養液を添加した場合の結果であり、（ｂ）は、フラクションＣ２（ｐＨ７）を含有させた培養液を添加した場合の結果である。図中、「ＮＣ」は対照培養液を示している。また、各濃度は、各培養液中のフラクションＣ２由来のタンパク質濃度を示している。
【図１１】実施例１０において、各ＰＢＳ試料溶液のＢＳＡ濃度の結果を示した図である。（ａ）はＲＪ分解物を添加した場合の結果であり、（ｂ）はアスコルビン酸を添加した場合の結果であり、（ｃ）はカルノシンを添加した場合の結果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
西洋ミツバチ (Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ) の２〜３日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物。
（ａ）前記女王蜂幼虫の体組織懸濁物を６℃以下で遠心処理することにより、白色固形の上層、溶液の中層、沈殿による下層の３層に分離する工程。
（ｂ）前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。
【請求項２】
前記遠心処理が、８，０００〜１２，０００×ｇ、５分以上の遠心処理であることを特徴とする請求項１記載のローヤルゼリー分解酵素含有物。
【請求項３】
西洋ミツバチの２〜３日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物。
（ａ’）前記女王蜂幼虫を氷冷生理食塩水にて洗浄した後、裏ごしすることにより、乳白色の体組織懸濁物を調製する工程。
（ｂ’）前記体組織懸濁物をｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈した後、１０，０００×ｇ、５℃で１０分間の遠心処理をすることにより、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の３層に分離する工程。
（ｃ’）前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて調製されたローヤルゼリー分解物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られる、下記の特徴を有するローヤルゼリー分解物。
（１）神経細胞に対する非特異的な細胞変性作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも軽減していること、
（２）アミロイドによる神経細胞死誘導に対する抑制作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分とほぼ同等であること、
（３）グリア細胞に対する細胞増殖作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること、
（４）ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする細胞増殖剤。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする感染阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする神経細胞死誘導抑制剤。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物に含有されることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素。
【請求項１２】
酵素活性の至適ｐＨが７又は９であることを特徴とする請求項１１記載のローヤルゼリー分解酵素。
【請求項１３】
請求項１１又は１２記載のローヤルゼリー分解酵素を用いて調製されたローヤルゼリー分解物。
【請求項１４】
請求項１１又は１２記載のローヤルゼリー分解酵素を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法。
【請求項１】
西洋ミツバチ (Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ) の２〜３日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物。
（ａ）前記女王蜂幼虫の体組織懸濁物を６℃以下で遠心処理することにより、白色固形の上層、溶液の中層、沈殿による下層の３層に分離する工程。
（ｂ）前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。
【請求項２】
前記遠心処理が、８，０００〜１２，０００×ｇ、５分以上の遠心処理であることを特徴とする請求項１記載のローヤルゼリー分解酵素含有物。
【請求項３】
西洋ミツバチの２〜３日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物。
（ａ’）前記女王蜂幼虫を氷冷生理食塩水にて洗浄した後、裏ごしすることにより、乳白色の体組織懸濁物を調製する工程。
（ｂ’）前記体組織懸濁物をｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈した後、１０，０００×ｇ、５℃で１０分間の遠心処理をすることにより、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の３層に分離する工程。
（ｃ’）前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて調製されたローヤルゼリー分解物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られる、下記の特徴を有するローヤルゼリー分解物。
（１）神経細胞に対する非特異的な細胞変性作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも軽減していること、
（２）アミロイドによる神経細胞死誘導に対する抑制作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分とほぼ同等であること、
（３）グリア細胞に対する細胞増殖作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること、
（４）ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする細胞増殖剤。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする感染阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする神経細胞死誘導抑制剤。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物に含有されることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素。
【請求項１２】
酵素活性の至適ｐＨが７又は９であることを特徴とする請求項１１記載のローヤルゼリー分解酵素。
【請求項１３】
請求項１１又は１２記載のローヤルゼリー分解酵素を用いて調製されたローヤルゼリー分解物。
【請求項１４】
請求項１１又は１２記載のローヤルゼリー分解酵素を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−２２８７２７（Ｐ２００８−２２８７２７Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２４４５３（Ｐ２００８−２４４５３）
【出願日】平成２０年２月４日（２００８．２．４）
【出願人】（３９８０６２９９８）株式会社秋田屋本店 (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月４日（２００８．２．４）
【出願人】（３９８０６２９９８）株式会社秋田屋本店 (5)
【Ｆターム（参考）】
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