ワクチンおよび免疫方法
【課題】 プリオンの感染予防に有効である、新規なワクチンおよび免疫方法を提供する。
【解決手段】 異種動物由来、好ましくは異種哺乳動物由来、さらに好ましくはマウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、ヒト由来のプリオン蛋白をワクチンの有効成分とする。特に、抗体のエピトープ（抗原決定基）に相当する中和活性部位を含む、組み替えプリオン蛋白が好ましく用いられる。
【解決手段】 異種動物由来、好ましくは異種哺乳動物由来、さらに好ましくはマウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、ヒト由来のプリオン蛋白をワクチンの有効成分とする。特に、抗体のエピトープ（抗原決定基）に相当する中和活性部位を含む、組み替えプリオン蛋白が好ましく用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なワクチンに関する。また、本発明は、このワクチンを使用する新規な免疫方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝達性海綿状脳症、所謂プリオン病の予防は大きな社会的問題である。伝達性海綿状脳症は、ヒトに於けるクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）及び動物に於けるスクレイピー及び牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含め、異常な感染性物質、所謂プリオンが感染する悪性の神経退行性疾患群である。疫学的な調査からスクレイピープリオンはヒトに感染しないと言われている。事実、異種間におけるプリオンの最初の感染において、潜伏期間の延長或いは非伝達性が実験的に観察されている。異種間のプリオン非伝達は、「種間バリアー」と呼ばれてきた。
【０００３】
しかし、ＢＳＥプリオンは、汚染された食品を介して、ヒトに経口伝染し、若い人に新しい変異型のＣＪＤを発症させることが、最近の多くの証拠から明らかになってきた。また、動物に於ける異なるタイプの病気、すなわち慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）が、北米に生息するミュールジカ及びヘラジカの中で急激に広がり、このＣＷＤプリオンがヒトに伝染する心配から、深刻な問題を引き起こしている。最近、輸血がヒトでのプリオン伝染の危険因子で、輸血を受けた患者がその後ＣＪＤを発症する可能性が報告された。しかしながら、この様なプリオン感染に対する予防法は未だ開発されていない。
【０００４】
免疫の中で、これまで試みられた予防法は、受動免疫とワクチンに分けられる。
受動免疫としては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の投与で、プリオン感染症が予防できる可能性は示唆されている。プリオンは、主にＰｒＰＳｃと表記されるプロテナーゼＫ（ＰＫ）−抵抗性、アミロイド形成性である異常型アイソフォームのプリオン蛋白から構成されていると考えられている。これは、未だ解明されていない翻訳後修飾を介して、正常細胞アイソフォームのプリオン蛋白（ＰｒＰＣ）が構造変換され、生成されると考えられている。ＰｒＰＣは神経細胞に最とも多く発現する、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）に固着する膜性糖蛋白である。したがって、ＰｒＰがプリオンに対する予防方法開発のためのターゲット分子と考えるのは大変合理的である。Ｇａｂｉｚｏｎ等はＰｒＰに対するポリクローナル抗体はハムスタープリオンの感染性を約１００倍減少できると報告した（非特許文献１参照。）。最近、Ｈｅｐｐｎｅｒ等は抗ＰｒＰモノクローナル抗体６Ｈ４を遺伝子導入で発現させたマウスは、マウススクレーピーＲＭＬプリオンの腹腔内接種後の発症に抵抗性を示すことを報告した（非特許文献２参照。）。また、Ｗｈｉｔｅ等は他の２種の抗ＰｒＰモノクローナル抗体、ＩＣＳＭ１８及び３５がマウスでの受動免疫によるプリオン感染を予防できると報告した（非特許文献３参照。）。抗ＰｒＰ抗体によりプリオン感染が有効的に予防できることから、ＰｒＰに対する能動的な免疫すなわちワクチン化がプリオン伝染の予防法として可能性があると思われる。しかし、内因性ＰｒＰＣに対する宿主免疫寛容は、プリオンに対する能動免疫療法の開発にとって大きな障害であった。
【０００５】
一方、ワクチンは、大きくプリオン蛋白および融合プリオン蛋白によるワクチン化の２つに分けられる。マウス組換えプリオン蛋白で免疫（ワクチン化）したマウスに、マウススクレーピー１３９Ａを接種・感染させたモデルにおいて、潜伏期間の延長が報告されている（非特許文献４参照。）。これに反し、マウス組換えプリオン蛋白（２３−２３１）で免疫したマウスに、マウススクレーピーＲＭＬプリオンを接種・感染させたモデルでは、発症予防効果がないと報告されている（非特許文献５参照。）。
【非特許文献１】Ruth Gabizon, Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, 85, 6617-6621
【非特許文献２】Frank L.. Heppner, Science, 2001, 294, 178-182
【非特許文献３】Anthony R. White, Nature, 2003, 422, 80-83
【非特許文献４】Einar M. Sigurdsson, Amer. J. Pathol., 2002, 161, 13-17
【非特許文献５】Magdalini Polymenidou, Proc. Natl. Acad. Sci., 2004, 101, 14670-14676
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、発明者が同様な実験を福岡−１プリオン接種マウスモデルで行い、マウス組換えプリオン蛋白の効果を試験したが、その有効性を見出せなかった。現時点で、マウスプリオン蛋白（同種プリオン蛋白）をマウスに免疫し、プリオン感染が予防できるかどうか明確な解答はなく、むしろ否定的と考えるべきであろう。
このため、これらの課題を解決する、新規なワクチンおよびこのワクチンを使用する新規な免疫方法の開発が望まれている。
【０００７】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、新規なワクチンを提供することを目的とする。
また、本発明は、このワクチンを使用する新規な免疫方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決し、本発明の目的を達成するため、本発明のワクチンは、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有する。
【０００９】
ここで、限定されるわけではないが、動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属することが好ましい。
【００１０】
本発明のワクチンは、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有する。
【００１１】
ここで、限定されるわけではないが、動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属することが好ましい。
【００１２】
本発明のワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有する。
【００１３】
ここで、限定されるわけではないが、哺乳動物は、カモノハシ目、フクロネズミ目、アリクイ目、モグラ目、ツパイ目、ヒヨケザル目、コウモリ目、サル目、ネコ目、ゾウ目、ジュゴン目、ウマ目、イワダヌキ目、ツチブタ目、ウシ目、クジラ目、センザンコウ目、ネズミ目、ウサギ目、またはハネジネズミ目に属することが好ましい。
【００１４】
本発明のワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するワクチンであって、前記哺乳動物は、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトである。
【００１５】
本発明の免疫方法は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンは、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有することを特徴とする。
【００１６】
ここで、限定されるわけではないが、動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属することが好ましい。
【００１７】
本発明の免疫方法は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンは、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有することを特徴とする。
【００１８】
ここで、限定されるわけではないが、動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属することが好ましい。
【００１９】
本発明の免疫方法は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有することを特徴とする。
【００２０】
ここで、限定されるわけではないが、哺乳動物は、カモノハシ目、フクロネズミ目、アリクイ目、モグラ目、ツパイ目、ヒヨケザル目、コウモリ目、サル目、ネコ目、ゾウ目、ジュゴン目、ウマ目、イワダヌキ目、ツチブタ目、ウシ目、クジラ目、センザンコウ目、ネズミ目、ウサギ目、またはハネジネズミ目に属することが好ましい。
【００２１】
本発明の免疫方法は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有し、前記哺乳動物は、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、以下に記載されるような効果を奏する。
【００２３】
本発明は、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００２４】
本発明は、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００２５】
本発明は、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００２６】
本発明は、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するワクチンであって、前記哺乳動物が、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトであるので、新規なワクチンを提供することができる。
【００２７】
本発明は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００２８】
本発明は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００２９】
本発明は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００３０】
本発明は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有し、前記哺乳動物が、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトであるので、新規な免疫方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、ワクチンおよび免疫方法にかかる発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００３２】
微生物と宿主抗原間に存在する分子擬態は、自己抗体及び／或いは自己反応性Ｔ細胞産生を介する自己免疫疾患の引き金に関し、良く知られた仮説的な作用機序である。この仮説は、微生物と宿主抗原の間で同じアミノ酸配列すなわち相同性を持つことが分子擬態の初期過程において必須であると言う考えに基づく。ＰｒＰは哺乳類では非常に保存された分子で、アミノ酸配列及びその３次構造において著しい類似性を保っている。したがって、異種ＰｒＰｓが宿主ＰｒＰの擬態的に作用し、プリオン蛋白に対する免疫寛容を解除でき、抗ＰｒＰ抗体を発現しうると、発明者は考えた。
【００３３】
我々は、異種なマムスター、ヒツジ、ウシ、及びヒトの組み換えＰｒＰｓがマウスで強い抗原性を示し、マウスＰｒＰと交差反応する抗体を効率的に産生することを、ここで示す。これに対し、マウスの組み換えＰｒＰはマウスで非常に弱い抗体反応しか引き起こさなかった。また、ウシ及びヒツジで免疫したマウスは、非免疫マウスに比較し、マウスプリオンの腹腔内接種による発病の潜伏期間を延長させたが、マウスＰｒＰではこの様な作用は認められなかった。これらの結果から、分子擬態に基づく新規プリオンワクシンの開発における実験的な基礎が出来たと考える。
【００３４】
本発明のワクチンについて説明する。
【００３５】
本発明のワクチンは、異種動物（異種哺乳動物）由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有する。また、本発明のワクチンは、異種動物（異種哺乳動物）由来のプリオンの中和活性部位を含有する。
【００３６】
動物としては、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属するものを採用することができる。
【００３７】
哺乳動物としては、カモノハシ目、フクロネズミ目、アリクイ目、モグラ目、ツパイ目、ヒヨケザル目、コウモリ目、サル目、ネコ目、ゾウ目、ジュゴン目、ウマ目、イワダヌキ目、ツチブタ目、ウシ目、クジラ目、センザンコウ目、ネズミ目、ウサギ目、またはハネジネズミ目に属するものを採用することができる。
【００３８】
哺乳動物は具体的に、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトを採用することができる。哺乳動物は、これらに限定されるものではない。このほか哺乳動物としては、鹿、ネコ、犬、サル、トラ、ピューマなどを採用することができる。
【００３９】
異種とは、免疫をされる個体と異なる種のことである。
【００４０】
同種とは、免疫をされる個体と同じ種のことである。
【００４１】
プリオン蛋白には、正常型プリオン蛋白のほかに異常型プリオン蛋白を変性したものを含む。異常型プリオン蛋白を変性したものとは、蛋白変性剤や加熱等により変性させた異常型プリオン蛋白である。
【００４２】
プリオンの中和活性部位とは、プリオン感染を抑制できる予防免疫を誘導するプリオン蛋白の部位である。
【００４３】
プリオン蛋白の擬態分子とは、プリオン蛋白と同じあるいは同様なアミノ酸配列を有する分子のことである。
【００４４】
プリオン蛋白、プリオン蛋白の擬態分子、およびプリオンの中和活性部位は、形質転換した大腸菌を培養することにより作製することができる。プリオン蛋白、プリオン蛋白の擬態分子、およびプリオンの中和活性部位の作製方法は、これに限定されるものではない。このほか作製方法としては、真核細胞、人工的に合成などを採用することができる。
【００４５】
本発明の免疫方法について説明する。本発明の免疫方法は、ワクチンを接種する方法である。
【００４６】
免疫において、プリオン蛋白等の摂取量は１〜１０００μｇの範囲内にあることが好ましい。
接種の回数は１〜１０回の範囲内にあることが好ましい。
接種の間隔は１〜５週間の範囲内にあることが好ましい。
【００４７】
接種方法としては、腹腔内接種、表皮接種、皮内接種、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、経口接種、経鼻接種、気管内投与などを採用することができる。
【００４８】
以上のことから、本発明を実施するための最良の形態によれば、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００４９】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００５０】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００５１】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するワクチンであって、前記哺乳動物が、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトであるので、新規なワクチンを提供することができる。
【００５２】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００５３】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００５４】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００５５】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有し、前記哺乳動物が、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトであるので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００５６】
なお、本発明は上述の発明を実施するための最良の形態に限らず本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることはもちろんである。
【実施例】
【００５７】
つぎに、本発明にかかる実施例について具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはもちろんである。
【００５８】
本実施例の方法について説明する。
【００５９】
組み換えプリオン蛋白の免疫原の発現及び精製
マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、或いはヒト、全長組み換えプリオン蛋白（図１〜５参照）を発現させるために、マウスプリオン蛋白２３−２３１残基（ＧｅｎＢａｎｋ、注文番号Ｍ１３６８５）、ハムスタープリオン蛋白２３−２３２残基（ＧｅｎＢａｎｋ、注文番号Ｍ１４０５４）、ヒツジプリオン蛋白２５−２３４残基（ＧｅｎＢａｎｋ、注文番号Ｕ６７９２２）、ウシプリオン蛋白２５−２４２残基（ＧｅｎＢａｎｋ、注文番号ＡＪ２９８８７８）、及びヒトプリオン蛋白残基（ＧｅｎＢａｎｋ、注文番号Ｍ１３８９９）に相当するＤＮＡフラグメントを、表１に示す様に、相当するプライマーペアーを用い、ポリメレース連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた。これらのＰＣＲ産物の配列確認後に、これらのフラグメントはＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用い消化し、ｐＱＥ３０ベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、独国）の中へ挿入し、ｐＱＥ３０−マウスプリオン蛋白、ｐＱＥ３０−ハムスタープリオン蛋白、ｐＱＥ３０−ヒツジプリオン蛋白、ｐＱＥ３０−ウシプリオン蛋白、ｐＱＥ３０−ヒトプリオン蛋白を作製した。ｐＱＥ３０ベクターはＮ末端に６×Ｈｉｓ標識を持つ蛋白を生成するように開発されている。
【００６０】
【表１】
【００６１】
大腸菌（Ｍ１５）は、各プラスミドにより新たに形質転換し、１ｍＭイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含有するＬＢ培地で培養し、５，０００×ｇ、２０分間遠心分離した。この様にして集められた細胞はデオキシリボヌクラーゼＩ存在下、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，米国）用いて溶解させ、その溶解液を２５，０００×ｇ、１０分間遠心分離した。生成した沈査は０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１０ｍｌのＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ中に懸濁させ、室温（ＲＴ）で１５分間、時々攪拌しながらインキュベートした。１：１０に希釈したＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを加え、懸濁液の容量を増やし、２５，０００×ｇ、１０分間遠心分離した。生成した沈査を４０ｍｌの１：１０希釈ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔで３回洗浄し、溶解緩衝液中（８Ｍ 尿素、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４）に懸濁させた。次いで、ＱＩＡＧＥＮ社のプロトコールで推薦されている様に、変性条件化でＮｉ−ＮＴＡカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用い精製した。
【００６２】
６×Ｈｉｓ標識を含まないマウス組み換えプリオン蛋白の精製
６×Ｈｉｓ標識を含まないマウス組み換えプリオン蛋白を発現させるために、マウスプリオン蛋白２３−２３１に相当するＤＮＡフラグメントを適切なプライマーペアー（表１）を用い、ＰＣＲで増幅させた。配列の確認後、このフラグメントをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ用い消化し、ｐＥＴ１１ａ−マウスプリオン蛋白を作製するために、ｐＥＴ１１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ＷＩ、米国）の中へ挿入した。大腸菌（ＢＬ２１）をｐＥＴ１１ａ−マウスプリオン蛋白で形質変換させ、１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地中で培養した。その細胞を５，０００×ｇで２０分間遠心分離し集め、３００μｇ／ｍｌのリゾチームを含有する緩衝液（（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８，１ｍＭ ＥＤＴＡ， １００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁させた。室温で２０分間保温後、８０ｍｇのデオキシコール酸を加え、更に２０分間保温した。次いで、ゲノムＤＮＡをデオキシリボヌクラーゼＩを用い、室温で３０分間消化した。その消化液を２５，０００×ｇ、２０分間遠心分離し、その残渣を緩衝液中（８Ｍ 尿素，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）に懸濁させた。この抽出液をＣＭ−セファローズカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，スエーデン）にかけ、組み換えプリオン蛋白を、上記緩衝液による直線的食塩勾配（０〜５００ｍＭ）を用い溶出した。
【００６３】
ＧＳＴ−融合プリオン蛋白の発現と精製
ウシプリオン蛋白１０３−１２１残基、１４３−１６６残基、及び２３１−２４２残基、並びにヒトプリオン蛋白９１−１１０残基、１３２−１５５残基、及び２２０−２３１残基をコード化したＤＮＡフラグメントを適切なプライマーペアー（表１）を用い、ＰＣＲで増幅させた。これらのＰＣＲ産物の配列を確認後、これらのフラグメントをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＧＥＸ−２ＴＫ−ｂｏＰｒＰ１０３−１２１，−ｂｏＰｒＰ１４３−１６６，及び−ｂｏＰｒＰ２３１−２４２並びにｐＧＥＸ−２ＴＫ−ｈｕＰｒＰ−９１−１１０，−ｈｕＰｒＰ１３２−１５５，及び−ｈｕＰｒＰ２２０−２３１プラスミドを作製するために、ｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ、米国）に挿入した。これらのプラスミドを用い、大腸菌（ＤＨ５α）を新たに形質変換させ、１００μｇ／ｍｌ ａｍｐｉｃｉｌｉｎ及び１ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＬＢ培地中で培養した。これらの培養液を、５，０００×ｇ、２０分間、遠心分離した。集められた細胞は、デオキシリボヌクレアーゼＩ存在下、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）を用い溶解し、この溶解液を２５，０００×ｇ、１０分間、遠心分離した。その上清に１％グルタチオンセファローズ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を混合し１時間放置した。この混合液を、１Ｍ尿素を含むＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）で洗浄し、次いで、ＧＳＴ−融合プリオン蛋白を１Ｍ尿素、１０ｍＭ還元グルタチオン及び５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌを含むＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔで溶出した。
【００６４】
免疫及び接種
精製した６×Ｈｉｓ標識を持つ組み換えプリオン蛋白をＰＢＳで透析し、各組み換え蛋白１００μｇを雌性、８週ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ Ｊａｐａｎ，静岡、日本）に、２週間間隔で、初回はｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に、２回目以降はｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）と共に、腹腔内投与し、免疫した。
１％脳ホモジネート（福岡−１プリオン感染マウス）の１００ｕｌを、５回免疫の１週間後に、腹腔内に接種した。
抗血清は、最終免疫後１週間に採取し、使用時まで−２０℃で保存した。
なお、動物は長崎大学動物実験ガイドラインに基づき、取り扱った。
【００６５】
ＥＬＩＳＡ
９６穴ウエル免疫プレート（Ｎｕｎｃ）の各ウエルを５００ｎｇの６×Ｈｉｓ標識を含まない精製マウス組み換えプリオン蛋白或いは６×Ｈｉｓ標識を含む他の組み換えプリオン蛋白で、４℃にて１晩保温し、コートした。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｔ−ＰＢＳ）及び２５％ Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（Ｄａｉｎｉｈｏｎｓｅｉｙａｋｕ Ｃｏ．）を含むＰＢＳで、３７℃、１時間ブロッッキングした。特異的ＩｇＧ抗体を検出するために、連続的に１０倍希釈した抗血清をウエルに加え、３７℃で１時間保温し、非結合抗体をＴ−ＰＢＳで２回洗浄し除去した。免疫複合体は、ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），２ｍＭ ２，２’−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ），及び０．０４％ Ｈ２Ｏ２と複合体を形成した第二次ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。抗プリオン抗体力価は４０５ｎｍにおける吸光度で表現した。
【００６６】
ＣＢＢ染色
蛋白は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧ上で泳動し、Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光）で染色した。
【００６７】
本実施例の結果について説明する。
【００６８】
ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒトの組み換え異種プリオン蛋白はマウスの抗体反応を強力に促進する
我々は、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒトの組み換え異種プリオン蛋白を作製した。これらの組み換え蛋白は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ＧＰＩアンカーシグナルの両方が欠損し、かつＮ末端を６×Ｈｉｓ残基で標識したものである。我々はこれらの蛋白を大腸菌で発現させ、その細胞溶解液のナトリウムドデシルサルフェイト−ポリアクリルゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後、クマシイブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行なった。期待する分子量、〜２５ｋＤ、の組み換えプリオン蛋白が効率的にこれらの細胞に発現された（図６ａ）。次いで、Ｎｉ−ＮＴＡアフニティークロマトグラフィーを用い、これらの蛋白を、変性条件下で精製した。各精製フラクションは単量体プリオン蛋白を大量に含み、２量体及び分解プリオン蛋白は少量であった（図６ｂ）。ＣＢＢ染色では、これらのフラクション中にはその他の蛋白質は検出されなかった（図６ｂ）。
【００６９】
組み換え異種プリオン蛋白がマウスで特異的な抗体反応を起こすかどうかを検討するために、我々はＢＡＬＢ／ｃマウスに各精製組み換えプリオン蛋白（１００μｇ／マウス）を２週間間隔で腹腔内投与し、免疫した。５回免疫後１週間目に抗血清を採取し、それぞれの免疫した組み換えプリオン蛋白に対する特異的なＩｇＧ抗体反応を検出するために、酵素結合免疫吸着検出法（ＥＬＩＳＡ法）を行なった。マウス組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスでは非常に弱い抗体反応しか検出出来なかった。これらのマウスの抗血清は、非免疫マウスに比較し、４０５ｎｍに於ける光学密度値（ＯＤ４０５）を僅かに上昇させただけであった。これに対し、組み換え異種プリオン蛋白は免疫原性を有し、マウスで非常に強力な抗体反応を示した。抗ハムスター組み換えプリオン蛋白血清は、１：１００希釈で、約０．８のＯＤ４０５を示した（図７）。ウシ、ヒツジ及びヒトの組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスの抗血清では、ＯＤ４０５は１．２以上の高値を示した（図７）。
【００７０】
抗プリオン蛋白自己抗体は、組み換え異種プリオン蛋白で免疫したマウスで、効率的に作製される
組み換え異種プリオン蛋白がトレランスを解消し、抗プリオン蛋白自己抗体を生成できるかどうかマウスで確認するために、マウス組み換えプリオン蛋白に対して免疫したマウス血清を用いてＥＬＩＳＡを行なった。組み換え異種プリオン蛋白は６×Ｈｉｓ標識を含んでいる。従って、免疫マウスで生成される可能性がある抗体と標識の免疫反応を除去するために、ＥＬＩＳＡ抗原として標識を含まないマウス組み換えプリオン蛋白を使用した。マウス組み換えプリオン蛋白はマウスにおいてトレラントで、非免疫マウスと比較し、１：１００希釈でＯＤ４０５は僅かに上昇しただけであった（図８）。これに対し、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒトの組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスの抗血清の場合、ＯＤ４０５は、バラツキは見られるが、非免疫マウスと比較し、より高値を示した（図８）。ハムスター或いはヒツジ組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスの中でそれぞれ１匹だけが（計２匹）、マウス組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスと同程度に、低い抗プリオン自己抗体値を示した（図８）。
【００７１】
ウシ及びヒツジ組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスでマウスプリオンの減弱が見られたが、マウス組み換えプリオン蛋白では変化が無かった
組み換え異種プリオン蛋白による免疫が、プリオンの感染に対し予防効果を有するかどうか検討するために、マウス、ウシ、ヒツジ組み換えプリオン蛋白で５回免疫後、マウス福岡−１プリオンをＢＡＬＢマウスに腹腔内投与し、接種（感染）させた。非免疫ＢＡＬＢ／ｃマウスは、接種後２９３．５±１３．４日で発症し、２９５．０±１３．３日で死亡した（表２）。マウス組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスは、同様に、接種後２６９．８±２５．６日に発症し、２７５．０±２５．２日で死亡した（表２）。これらのことから、マウス組み換えプリオン蛋白による免疫はマウスプリオンに対して何ら影響を及ぼさない。対照的に、ウシ及びヒツジプリオン蛋白で免疫したマウスは部分的に発症を抑制し、それぞれ接種後３３２．３±９．０日（ｐ＜０．０１）及び３１６．０±７．５日（ｐ＜０．０５）まで発症を有意に遅延させた（表２）。
【００７２】
【表２】
【００７３】
抗ウシ及び抗ヒトプリオン抗体は、それぞれ抗ＢＳＥ及び抗ヒトプリオンの潜在的なエピトープを認識する
組み換え異種プリオン蛋白による免疫が異種間のプリオン感染に対し予防的かどうか確認するために、ウシ及びヒト組み換えプリオン蛋白に対する産生抗体のエピトープマッピングを行なった。マウスプリオン蛋白の９１−１１０、１４４−１５２、及び１４６−１５９残基は、それぞれ防御的モノクローナル抗体、ＩＣＳＮ３５、６Ｈ４及びＩＣＳＮ１８の標的である。加えて、プリオン感染神経芽細胞種Ｎ２ａ細胞で異常型プリオン蛋白ＰｒＰｓｃ除去能を有する、プリオン蛋白特異的Ｆａｂフラグメント、Ｒ１及びＲ２はマウスプリオン蛋白の２２０−２３１残基に結合した。これらの結果は、他のプリオン蛋白の相当領域も抗プリオンエピトープである可能性が高いことを強力に示唆している。そこで、これらの相当領域、即ちウシプリオン蛋白１０３−１２１、１４３−１６６、及び２３１−２４２残基、並びにヒトプリオン蛋白９１−１１０、１３２−１５５、及び２２０−２３１残基を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として、発現させた。これらの融合蛋白を用い、抗ウシ及び抗ヒトプリオン蛋白血清でウエスタンブロッティングを行なった。融合蛋白は、ＧＳＴ単独の場合に比較し、大腸菌の中で、或いはその精製過程で容易に分解された（図９ａ及び９ｂ）。その理由は現時点では不明である。しかし、各融合蛋白の一部は分解されずに残っていた（図９ａ及び９ｂ）。ＧＳＴ単独及びＧＳＴ−ヒトプリオン蛋白９１−１１０は抗ヒトプリオン蛋白血清で検出できなかった（図９ａ及び９ｂ）。しかし、ＧＳＴ−ヒトプリオン蛋白１３２−１５５及び２２０−２３１は抗ヒトプリオン蛋白血清で充分検出できた（図９ａ）。更に、抗ウシプリオン蛋白血清は全てのウシプリオン融合蛋白と反応した（図９ｂ）。これらの結果は、異種プリオン蛋白での免疫がプリオンの異種間の感染に対して、潜在的な抗プリオンエピトープを認識する抗体を誘導することにより、予防的に働く可能性を強く示唆している。
【００７４】
本実施例に基づく考察を説明する。
【００７５】
本研究において、異種ＰｒＰｓが、分子擬態機序を介してＰｒＰに対する宿主免疫寛容を打破できる可能性を仮説とした。この考えに一致し、異種ハムスター、ウシ、ヒツジ、及びヒト組み換えＰｒＰがマウスで強い抗原性を示し、強力に抗体反応を促進した。一方、同種マウスＰｒＰではその様な作用は見られなかった。ウシ及びヒト組み換えＰｒＰで免疫したマウスは、それぞれ抗ＢＳＥ及び抗ヒトプリオンに対するエピトープを認識する抗体を誘導した。このことから、異種組み換えＰｒＰｓによる免疫は、例えばウシからヒトへの感染の様な、異種間のプリオン感染に対し予防的に作用する可能性が示唆された。更に、異種組み換えＰｒＰで免疫したマウスは、自己免疫疾患に関連する症状を発現することなく、効率的にマウスＰｒＰに対する自己抗体を生成した。また、ヒツジ及びウシ組み換えＰｒＰで免疫したマウスは、福岡−１マウスプリオンを感染させると、有意に延長した発症潜伏期間を示した。これらの結果は、異種組み換えＰｒＰの免疫が同種間のプリオン感染に対しも予防的である可能性を示している。まとめると、異種組み換えＰｒＰによる免疫は別種間及び同種間のプリオン感染に対し予防的な免疫性を発現する可能性がある。
【００７６】
ウシ及びヒツジで免疫したマウスにおけるプリオン病の潜伏期間の延長は、それぞれの血清中の抗ＰｒＰ自己抗体の存在と関連していた。ＰｒＰに対する抗体を用いたマウスの受動免疫では、プリオン感染を効率的に阻止することが報告された。更に、抗ＰｒＰ自己抗体の力価は、マウスプリオンを接種されたマウスにおける症状発現までの時間と良く相関することが報告されている。したがって、異種組み換えＰｒＰで免疫したマウスにおける福岡−１プリオン感染の減弱化は、自己抗体を介する液性免疫に基づくと思われる。しかし、ケイホール リンペット ヘモシアニンとＰｒＰ由来ペプチドの複合体でＰｒＰ欠損マウスを免疫するとことによって、細胞毒性を示すＴ細胞様クローンが単利されたと言う報告がある。したがって、細胞性免疫がプリオン感染の予防に関与する可能性も考えられる。
【００７７】
以前、Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ等は、組み換えマウスＰｒＰが抗マウスＰｒＰ自己抗体を生成する免疫原性を持ち、マウスＡ１３９プリオンで感染後、免疫したマウスでの発症を僅かに遅延させることを報告している［１］。しかし、我々は、マウス組み換えＰｒＰで免疫したマウスにおいて、福岡−１プリオンに対する抗ＰｒＰ自己抗体の効果的な誘導も、発症予防的な効果も見出せなかった。また、Ｐｏｌｌｙｍｅｎｉｄｏｕ等は組み換えマウスＰｒＰはマウスで抗ＰｒＰ自己抗体を誘導出来なかったと報告している［２］。これらの結果は、異種組み換えＰｒＰは、同種ＰｒＰより、プリオンに対する防御的免疫を促進する作用が強力である可能性を示している。熱ショック蛋白ＤｎａＫとマウスＰｒＰの融合蛋白の投与あるいはＣｐＧ−オリゴヌクレオチドとマウスＰｒＰの同時投与はマウスでプリオンに対する免疫原性を高め、ＰｒＰに対する自己抗体を産生することが報告されている［３，４］。そこで、異種組み換えＰｒＰの免疫原性がＤｎａｋとの融合であるいはＣｐＧゴリゴヌクレオチドとの併用投与により高められるかどうか興味のあるところである。
【００７８】
Ｇｉｌｃｈ等は、マウス組み換えＰｒＰでマウスを免疫することにより抗ＰｒＰ自己抗体を産生出来ると報告している。また、彼等は、組み換えマウスＰｒＰ二量体が、プリオンに持続感染しているマウスの神経細胞芽腫瘍Ｎ２ａ細胞のプリオン感染を治療する自己抗体を誘導できるという興味ある報告を出している。しかし、この組み換えＰｒＰはヒトあるいはハムスター由来の３Ｆ４エピトープを相当する領域に挿入されているため、マウスＰｒＰと２個のアミノ酸が異なる組み換えＰｒＰとなっている。したがって、この組み換えＰｒＰはマウスで異種ＰｒＰ様免疫原性を獲得し、そのことにより抗ＰｒＰ自己抗体を誘導したと考えられる。我々は、単量体異種ＰｒＰで免疫したマウスの血清中に、この様な治療効果のある抗体を検出できなかた。したがって、異種組み換えＰｒＰを２量体にすることにより、この様な治療活性を有する抗体を産生するかどうか興味のあるところである。
【００７９】
マウス、ハムスター、ウシ、羊、ヒトの組み換えＰｒＰは９０％以上のアミノ酸が同じである。ハムスター、ウシ、ヒツジ、ヒト組み換えＰｒＰは、マウスの組み換えＰｒＰと、それぞれ９個、１９個、２１個、１７個のアミノ酸が異なるだけである。したがって、マウスにおける異種ＰｒＰによる抗ＰｒＰ自己抗体の産生は分子擬態機序に基づくと考えるのが妥当であろう。しかし、我々は現時点で他の可能性を否定するものではない。以前、Ｗｕｃｈｅｒｐｈｅｎｎｉｇ及びＳｔｒｏｍｉｎｇｅｒは、神経変性障害である多発性硬化症の自己抗原である可能性が指摘されている、ミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）のある部位に相同性を示す種々のウイルス由来ペプチドが、その強さに差は有るが、ＭＢＰ特異的なＴ細胞を刺激出来ることを示した。興味あることに、これらのペプチドの中で、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス由来のペプチドは、ＭＢＰペプチドと同程度或いはそれ以上にＴ細胞を活性化した。これらの結果を総合的考え、我々の今回の結果は、同種間及び異種間の両プリオン感染に対し予防的である免疫反応を有効的に引き起こす、分子擬態に基づく新しいプリオンワクチン開発の魅力的な可能性を強く示した。
【００８０】
以上のことから、本実施例によれば、異種（ハムスター、ウシ、ヒツジ、ヒト）組換えプリオン蛋白でマウスを免疫した場合、免疫したそれぞれの異種プリオン蛋白に対する抗体が産生され、異種組換えプリオン蛋白で免疫することにより、異種間プリオン感染を予防でき、プリオンワクチンの開発に道を開くことができる。
【００８１】
この時、マウスの血清中の抗プリオン自己抗体が増加していた。また、異種（ウシ、ヒツジ）組換えプリオン蛋白で免疫したマウスに福岡−１マウスプリオンを感染させたモデルにおいて、有意に潜伏（生存）期間の延長が認められ、感染を予防する効果が示された。このことから、異種（ハムスター、ウシ、ヒツジ、ヒト）組換えプリオン蛋白による免疫は同種間のプリオン感染をも予防・防止できると考えられる。
【００８２】
［参考文献］
［１］Einar M. Sigurdsson, Amer. J. Pathol., 2002, 161, 13-17
［２］Magdalini Polymenidou, Proc. Natl. Acad. Sci., 2004, 101, 14670-14676
［３］Michael F. Koller, J. Neuroimmunol., 2002, 132, 113-116
［４］Martine Bruley Rosset, J. Immuno., 2004, 172, 5168-5174
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】マウスについての、核酸配列とアミノ酸配列である。
【図２】ハムスターについての、核酸配列とアミノ酸配列である。
【図３】ウシについての、核酸配列とアミノ酸配列である。
【図４】ヒツジについての、核酸配列とアミノ酸配列である。
【図５】ヒトについての、核酸配列とアミノ酸配列である。
【図６】（ａ）ＩＰＴＧ処理の有（＋）無（−）における、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒトプリオン蛋白を発現した大腸菌のコマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を示し、（ｂ）精製したマウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒトプリオン蛋白のＣＢＢ染色を示す図である。
【図７】マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒト組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスにおける特異的抗体反応を示す図である。５匹のマウスを各精製蛋白で免疫した。抗体力価は４０５ｎｍにおける特異的な吸光度として表現した。
【図８】マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒト組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスにおける抗マウスプリオン蛋白自己抗体を示す図である。免疫したマウスの各抗血清は１：１００に希釈し、マウス組み換えプリオン蛋白に対するＥＬＩＳＡを行なった。抗体力価は４０５ｎｍにおける特異的な吸光度として表現した。図中の横軸及び縦軸は、それぞれ平均及び標準偏差を示す。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１
【図９】抗ヒト（ａ）及び抗ウシ（ｂ）プリオン蛋白抗体のエピトープマッピングを示す図である。ヒト及びウシプリオン蛋白のペプチドと融合したＧＳＴ並びに融合しないＧＳＴを精製し、抗ヒトプリオン蛋白、抗ウシオウリオン蛋白及び抗ＧＳＴ抗体を用いウエスタンブロッティングを行なった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なワクチンに関する。また、本発明は、このワクチンを使用する新規な免疫方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝達性海綿状脳症、所謂プリオン病の予防は大きな社会的問題である。伝達性海綿状脳症は、ヒトに於けるクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）及び動物に於けるスクレイピー及び牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含め、異常な感染性物質、所謂プリオンが感染する悪性の神経退行性疾患群である。疫学的な調査からスクレイピープリオンはヒトに感染しないと言われている。事実、異種間におけるプリオンの最初の感染において、潜伏期間の延長或いは非伝達性が実験的に観察されている。異種間のプリオン非伝達は、「種間バリアー」と呼ばれてきた。
【０００３】
しかし、ＢＳＥプリオンは、汚染された食品を介して、ヒトに経口伝染し、若い人に新しい変異型のＣＪＤを発症させることが、最近の多くの証拠から明らかになってきた。また、動物に於ける異なるタイプの病気、すなわち慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）が、北米に生息するミュールジカ及びヘラジカの中で急激に広がり、このＣＷＤプリオンがヒトに伝染する心配から、深刻な問題を引き起こしている。最近、輸血がヒトでのプリオン伝染の危険因子で、輸血を受けた患者がその後ＣＪＤを発症する可能性が報告された。しかしながら、この様なプリオン感染に対する予防法は未だ開発されていない。
【０００４】
免疫の中で、これまで試みられた予防法は、受動免疫とワクチンに分けられる。
受動免疫としては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の投与で、プリオン感染症が予防できる可能性は示唆されている。プリオンは、主にＰｒＰＳｃと表記されるプロテナーゼＫ（ＰＫ）−抵抗性、アミロイド形成性である異常型アイソフォームのプリオン蛋白から構成されていると考えられている。これは、未だ解明されていない翻訳後修飾を介して、正常細胞アイソフォームのプリオン蛋白（ＰｒＰＣ）が構造変換され、生成されると考えられている。ＰｒＰＣは神経細胞に最とも多く発現する、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）に固着する膜性糖蛋白である。したがって、ＰｒＰがプリオンに対する予防方法開発のためのターゲット分子と考えるのは大変合理的である。Ｇａｂｉｚｏｎ等はＰｒＰに対するポリクローナル抗体はハムスタープリオンの感染性を約１００倍減少できると報告した（非特許文献１参照。）。最近、Ｈｅｐｐｎｅｒ等は抗ＰｒＰモノクローナル抗体６Ｈ４を遺伝子導入で発現させたマウスは、マウススクレーピーＲＭＬプリオンの腹腔内接種後の発症に抵抗性を示すことを報告した（非特許文献２参照。）。また、Ｗｈｉｔｅ等は他の２種の抗ＰｒＰモノクローナル抗体、ＩＣＳＭ１８及び３５がマウスでの受動免疫によるプリオン感染を予防できると報告した（非特許文献３参照。）。抗ＰｒＰ抗体によりプリオン感染が有効的に予防できることから、ＰｒＰに対する能動的な免疫すなわちワクチン化がプリオン伝染の予防法として可能性があると思われる。しかし、内因性ＰｒＰＣに対する宿主免疫寛容は、プリオンに対する能動免疫療法の開発にとって大きな障害であった。
【０００５】
一方、ワクチンは、大きくプリオン蛋白および融合プリオン蛋白によるワクチン化の２つに分けられる。マウス組換えプリオン蛋白で免疫（ワクチン化）したマウスに、マウススクレーピー１３９Ａを接種・感染させたモデルにおいて、潜伏期間の延長が報告されている（非特許文献４参照。）。これに反し、マウス組換えプリオン蛋白（２３−２３１）で免疫したマウスに、マウススクレーピーＲＭＬプリオンを接種・感染させたモデルでは、発症予防効果がないと報告されている（非特許文献５参照。）。
【非特許文献１】Ruth Gabizon, Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, 85, 6617-6621
【非特許文献２】Frank L.. Heppner, Science, 2001, 294, 178-182
【非特許文献３】Anthony R. White, Nature, 2003, 422, 80-83
【非特許文献４】Einar M. Sigurdsson, Amer. J. Pathol., 2002, 161, 13-17
【非特許文献５】Magdalini Polymenidou, Proc. Natl. Acad. Sci., 2004, 101, 14670-14676
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、発明者が同様な実験を福岡−１プリオン接種マウスモデルで行い、マウス組換えプリオン蛋白の効果を試験したが、その有効性を見出せなかった。現時点で、マウスプリオン蛋白（同種プリオン蛋白）をマウスに免疫し、プリオン感染が予防できるかどうか明確な解答はなく、むしろ否定的と考えるべきであろう。
このため、これらの課題を解決する、新規なワクチンおよびこのワクチンを使用する新規な免疫方法の開発が望まれている。
【０００７】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、新規なワクチンを提供することを目的とする。
また、本発明は、このワクチンを使用する新規な免疫方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決し、本発明の目的を達成するため、本発明のワクチンは、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有する。
【０００９】
ここで、限定されるわけではないが、動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属することが好ましい。
【００１０】
本発明のワクチンは、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有する。
【００１１】
ここで、限定されるわけではないが、動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属することが好ましい。
【００１２】
本発明のワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有する。
【００１３】
ここで、限定されるわけではないが、哺乳動物は、カモノハシ目、フクロネズミ目、アリクイ目、モグラ目、ツパイ目、ヒヨケザル目、コウモリ目、サル目、ネコ目、ゾウ目、ジュゴン目、ウマ目、イワダヌキ目、ツチブタ目、ウシ目、クジラ目、センザンコウ目、ネズミ目、ウサギ目、またはハネジネズミ目に属することが好ましい。
【００１４】
本発明のワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するワクチンであって、前記哺乳動物は、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトである。
【００１５】
本発明の免疫方法は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンは、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有することを特徴とする。
【００１６】
ここで、限定されるわけではないが、動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属することが好ましい。
【００１７】
本発明の免疫方法は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンは、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有することを特徴とする。
【００１８】
ここで、限定されるわけではないが、動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属することが好ましい。
【００１９】
本発明の免疫方法は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有することを特徴とする。
【００２０】
ここで、限定されるわけではないが、哺乳動物は、カモノハシ目、フクロネズミ目、アリクイ目、モグラ目、ツパイ目、ヒヨケザル目、コウモリ目、サル目、ネコ目、ゾウ目、ジュゴン目、ウマ目、イワダヌキ目、ツチブタ目、ウシ目、クジラ目、センザンコウ目、ネズミ目、ウサギ目、またはハネジネズミ目に属することが好ましい。
【００２１】
本発明の免疫方法は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有し、前記哺乳動物は、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、以下に記載されるような効果を奏する。
【００２３】
本発明は、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００２４】
本発明は、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００２５】
本発明は、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００２６】
本発明は、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するワクチンであって、前記哺乳動物が、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトであるので、新規なワクチンを提供することができる。
【００２７】
本発明は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００２８】
本発明は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００２９】
本発明は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００３０】
本発明は、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有し、前記哺乳動物が、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトであるので、新規な免疫方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、ワクチンおよび免疫方法にかかる発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００３２】
微生物と宿主抗原間に存在する分子擬態は、自己抗体及び／或いは自己反応性Ｔ細胞産生を介する自己免疫疾患の引き金に関し、良く知られた仮説的な作用機序である。この仮説は、微生物と宿主抗原の間で同じアミノ酸配列すなわち相同性を持つことが分子擬態の初期過程において必須であると言う考えに基づく。ＰｒＰは哺乳類では非常に保存された分子で、アミノ酸配列及びその３次構造において著しい類似性を保っている。したがって、異種ＰｒＰｓが宿主ＰｒＰの擬態的に作用し、プリオン蛋白に対する免疫寛容を解除でき、抗ＰｒＰ抗体を発現しうると、発明者は考えた。
【００３３】
我々は、異種なマムスター、ヒツジ、ウシ、及びヒトの組み換えＰｒＰｓがマウスで強い抗原性を示し、マウスＰｒＰと交差反応する抗体を効率的に産生することを、ここで示す。これに対し、マウスの組み換えＰｒＰはマウスで非常に弱い抗体反応しか引き起こさなかった。また、ウシ及びヒツジで免疫したマウスは、非免疫マウスに比較し、マウスプリオンの腹腔内接種による発病の潜伏期間を延長させたが、マウスＰｒＰではこの様な作用は認められなかった。これらの結果から、分子擬態に基づく新規プリオンワクシンの開発における実験的な基礎が出来たと考える。
【００３４】
本発明のワクチンについて説明する。
【００３５】
本発明のワクチンは、異種動物（異種哺乳動物）由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有する。また、本発明のワクチンは、異種動物（異種哺乳動物）由来のプリオンの中和活性部位を含有する。
【００３６】
動物としては、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属するものを採用することができる。
【００３７】
哺乳動物としては、カモノハシ目、フクロネズミ目、アリクイ目、モグラ目、ツパイ目、ヒヨケザル目、コウモリ目、サル目、ネコ目、ゾウ目、ジュゴン目、ウマ目、イワダヌキ目、ツチブタ目、ウシ目、クジラ目、センザンコウ目、ネズミ目、ウサギ目、またはハネジネズミ目に属するものを採用することができる。
【００３８】
哺乳動物は具体的に、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトを採用することができる。哺乳動物は、これらに限定されるものではない。このほか哺乳動物としては、鹿、ネコ、犬、サル、トラ、ピューマなどを採用することができる。
【００３９】
異種とは、免疫をされる個体と異なる種のことである。
【００４０】
同種とは、免疫をされる個体と同じ種のことである。
【００４１】
プリオン蛋白には、正常型プリオン蛋白のほかに異常型プリオン蛋白を変性したものを含む。異常型プリオン蛋白を変性したものとは、蛋白変性剤や加熱等により変性させた異常型プリオン蛋白である。
【００４２】
プリオンの中和活性部位とは、プリオン感染を抑制できる予防免疫を誘導するプリオン蛋白の部位である。
【００４３】
プリオン蛋白の擬態分子とは、プリオン蛋白と同じあるいは同様なアミノ酸配列を有する分子のことである。
【００４４】
プリオン蛋白、プリオン蛋白の擬態分子、およびプリオンの中和活性部位は、形質転換した大腸菌を培養することにより作製することができる。プリオン蛋白、プリオン蛋白の擬態分子、およびプリオンの中和活性部位の作製方法は、これに限定されるものではない。このほか作製方法としては、真核細胞、人工的に合成などを採用することができる。
【００４５】
本発明の免疫方法について説明する。本発明の免疫方法は、ワクチンを接種する方法である。
【００４６】
免疫において、プリオン蛋白等の摂取量は１〜１０００μｇの範囲内にあることが好ましい。
接種の回数は１〜１０回の範囲内にあることが好ましい。
接種の間隔は１〜５週間の範囲内にあることが好ましい。
【００４７】
接種方法としては、腹腔内接種、表皮接種、皮内接種、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、経口接種、経鼻接種、気管内投与などを採用することができる。
【００４８】
以上のことから、本発明を実施するための最良の形態によれば、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００４９】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００５０】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するので、新規なワクチンを提供することができる。
【００５１】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するワクチンであって、前記哺乳動物が、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトであるので、新規なワクチンを提供することができる。
【００５２】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００５３】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００５４】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００５５】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、ワクチンを接種する免疫方法において、前記ワクチンが、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有し、前記哺乳動物が、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトであるので、新規な免疫方法を提供することができる。
【００５６】
なお、本発明は上述の発明を実施するための最良の形態に限らず本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることはもちろんである。
【実施例】
【００５７】
つぎに、本発明にかかる実施例について具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはもちろんである。
【００５８】
本実施例の方法について説明する。
【００５９】
組み換えプリオン蛋白の免疫原の発現及び精製
マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、或いはヒト、全長組み換えプリオン蛋白（図１〜５参照）を発現させるために、マウスプリオン蛋白２３−２３１残基（ＧｅｎＢａｎｋ、注文番号Ｍ１３６８５）、ハムスタープリオン蛋白２３−２３２残基（ＧｅｎＢａｎｋ、注文番号Ｍ１４０５４）、ヒツジプリオン蛋白２５−２３４残基（ＧｅｎＢａｎｋ、注文番号Ｕ６７９２２）、ウシプリオン蛋白２５−２４２残基（ＧｅｎＢａｎｋ、注文番号ＡＪ２９８８７８）、及びヒトプリオン蛋白残基（ＧｅｎＢａｎｋ、注文番号Ｍ１３８９９）に相当するＤＮＡフラグメントを、表１に示す様に、相当するプライマーペアーを用い、ポリメレース連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた。これらのＰＣＲ産物の配列確認後に、これらのフラグメントはＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用い消化し、ｐＱＥ３０ベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、独国）の中へ挿入し、ｐＱＥ３０−マウスプリオン蛋白、ｐＱＥ３０−ハムスタープリオン蛋白、ｐＱＥ３０−ヒツジプリオン蛋白、ｐＱＥ３０−ウシプリオン蛋白、ｐＱＥ３０−ヒトプリオン蛋白を作製した。ｐＱＥ３０ベクターはＮ末端に６×Ｈｉｓ標識を持つ蛋白を生成するように開発されている。
【００６０】
【表１】
【００６１】
大腸菌（Ｍ１５）は、各プラスミドにより新たに形質転換し、１ｍＭイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含有するＬＢ培地で培養し、５，０００×ｇ、２０分間遠心分離した。この様にして集められた細胞はデオキシリボヌクラーゼＩ存在下、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，米国）用いて溶解させ、その溶解液を２５，０００×ｇ、１０分間遠心分離した。生成した沈査は０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１０ｍｌのＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ中に懸濁させ、室温（ＲＴ）で１５分間、時々攪拌しながらインキュベートした。１：１０に希釈したＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを加え、懸濁液の容量を増やし、２５，０００×ｇ、１０分間遠心分離した。生成した沈査を４０ｍｌの１：１０希釈ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔで３回洗浄し、溶解緩衝液中（８Ｍ 尿素、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４）に懸濁させた。次いで、ＱＩＡＧＥＮ社のプロトコールで推薦されている様に、変性条件化でＮｉ−ＮＴＡカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用い精製した。
【００６２】
６×Ｈｉｓ標識を含まないマウス組み換えプリオン蛋白の精製
６×Ｈｉｓ標識を含まないマウス組み換えプリオン蛋白を発現させるために、マウスプリオン蛋白２３−２３１に相当するＤＮＡフラグメントを適切なプライマーペアー（表１）を用い、ＰＣＲで増幅させた。配列の確認後、このフラグメントをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ用い消化し、ｐＥＴ１１ａ−マウスプリオン蛋白を作製するために、ｐＥＴ１１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ＷＩ、米国）の中へ挿入した。大腸菌（ＢＬ２１）をｐＥＴ１１ａ−マウスプリオン蛋白で形質変換させ、１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地中で培養した。その細胞を５，０００×ｇで２０分間遠心分離し集め、３００μｇ／ｍｌのリゾチームを含有する緩衝液（（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８，１ｍＭ ＥＤＴＡ， １００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁させた。室温で２０分間保温後、８０ｍｇのデオキシコール酸を加え、更に２０分間保温した。次いで、ゲノムＤＮＡをデオキシリボヌクラーゼＩを用い、室温で３０分間消化した。その消化液を２５，０００×ｇ、２０分間遠心分離し、その残渣を緩衝液中（８Ｍ 尿素，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）に懸濁させた。この抽出液をＣＭ−セファローズカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，スエーデン）にかけ、組み換えプリオン蛋白を、上記緩衝液による直線的食塩勾配（０〜５００ｍＭ）を用い溶出した。
【００６３】
ＧＳＴ−融合プリオン蛋白の発現と精製
ウシプリオン蛋白１０３−１２１残基、１４３−１６６残基、及び２３１−２４２残基、並びにヒトプリオン蛋白９１−１１０残基、１３２−１５５残基、及び２２０−２３１残基をコード化したＤＮＡフラグメントを適切なプライマーペアー（表１）を用い、ＰＣＲで増幅させた。これらのＰＣＲ産物の配列を確認後、これらのフラグメントをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＧＥＸ−２ＴＫ−ｂｏＰｒＰ１０３−１２１，−ｂｏＰｒＰ１４３−１６６，及び−ｂｏＰｒＰ２３１−２４２並びにｐＧＥＸ−２ＴＫ−ｈｕＰｒＰ−９１−１１０，−ｈｕＰｒＰ１３２−１５５，及び−ｈｕＰｒＰ２２０−２３１プラスミドを作製するために、ｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ、米国）に挿入した。これらのプラスミドを用い、大腸菌（ＤＨ５α）を新たに形質変換させ、１００μｇ／ｍｌ ａｍｐｉｃｉｌｉｎ及び１ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＬＢ培地中で培養した。これらの培養液を、５，０００×ｇ、２０分間、遠心分離した。集められた細胞は、デオキシリボヌクレアーゼＩ存在下、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）を用い溶解し、この溶解液を２５，０００×ｇ、１０分間、遠心分離した。その上清に１％グルタチオンセファローズ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を混合し１時間放置した。この混合液を、１Ｍ尿素を含むＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）で洗浄し、次いで、ＧＳＴ−融合プリオン蛋白を１Ｍ尿素、１０ｍＭ還元グルタチオン及び５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌを含むＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔで溶出した。
【００６４】
免疫及び接種
精製した６×Ｈｉｓ標識を持つ組み換えプリオン蛋白をＰＢＳで透析し、各組み換え蛋白１００μｇを雌性、８週ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ Ｊａｐａｎ，静岡、日本）に、２週間間隔で、初回はｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に、２回目以降はｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）と共に、腹腔内投与し、免疫した。
１％脳ホモジネート（福岡−１プリオン感染マウス）の１００ｕｌを、５回免疫の１週間後に、腹腔内に接種した。
抗血清は、最終免疫後１週間に採取し、使用時まで−２０℃で保存した。
なお、動物は長崎大学動物実験ガイドラインに基づき、取り扱った。
【００６５】
ＥＬＩＳＡ
９６穴ウエル免疫プレート（Ｎｕｎｃ）の各ウエルを５００ｎｇの６×Ｈｉｓ標識を含まない精製マウス組み換えプリオン蛋白或いは６×Ｈｉｓ標識を含む他の組み換えプリオン蛋白で、４℃にて１晩保温し、コートした。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｔ−ＰＢＳ）及び２５％ Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（Ｄａｉｎｉｈｏｎｓｅｉｙａｋｕ Ｃｏ．）を含むＰＢＳで、３７℃、１時間ブロッッキングした。特異的ＩｇＧ抗体を検出するために、連続的に１０倍希釈した抗血清をウエルに加え、３７℃で１時間保温し、非結合抗体をＴ−ＰＢＳで２回洗浄し除去した。免疫複合体は、ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），２ｍＭ ２，２’−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ），及び０．０４％ Ｈ２Ｏ２と複合体を形成した第二次ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。抗プリオン抗体力価は４０５ｎｍにおける吸光度で表現した。
【００６６】
ＣＢＢ染色
蛋白は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧ上で泳動し、Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光）で染色した。
【００６７】
本実施例の結果について説明する。
【００６８】
ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒトの組み換え異種プリオン蛋白はマウスの抗体反応を強力に促進する
我々は、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒトの組み換え異種プリオン蛋白を作製した。これらの組み換え蛋白は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ＧＰＩアンカーシグナルの両方が欠損し、かつＮ末端を６×Ｈｉｓ残基で標識したものである。我々はこれらの蛋白を大腸菌で発現させ、その細胞溶解液のナトリウムドデシルサルフェイト−ポリアクリルゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後、クマシイブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行なった。期待する分子量、〜２５ｋＤ、の組み換えプリオン蛋白が効率的にこれらの細胞に発現された（図６ａ）。次いで、Ｎｉ−ＮＴＡアフニティークロマトグラフィーを用い、これらの蛋白を、変性条件下で精製した。各精製フラクションは単量体プリオン蛋白を大量に含み、２量体及び分解プリオン蛋白は少量であった（図６ｂ）。ＣＢＢ染色では、これらのフラクション中にはその他の蛋白質は検出されなかった（図６ｂ）。
【００６９】
組み換え異種プリオン蛋白がマウスで特異的な抗体反応を起こすかどうかを検討するために、我々はＢＡＬＢ／ｃマウスに各精製組み換えプリオン蛋白（１００μｇ／マウス）を２週間間隔で腹腔内投与し、免疫した。５回免疫後１週間目に抗血清を採取し、それぞれの免疫した組み換えプリオン蛋白に対する特異的なＩｇＧ抗体反応を検出するために、酵素結合免疫吸着検出法（ＥＬＩＳＡ法）を行なった。マウス組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスでは非常に弱い抗体反応しか検出出来なかった。これらのマウスの抗血清は、非免疫マウスに比較し、４０５ｎｍに於ける光学密度値（ＯＤ４０５）を僅かに上昇させただけであった。これに対し、組み換え異種プリオン蛋白は免疫原性を有し、マウスで非常に強力な抗体反応を示した。抗ハムスター組み換えプリオン蛋白血清は、１：１００希釈で、約０．８のＯＤ４０５を示した（図７）。ウシ、ヒツジ及びヒトの組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスの抗血清では、ＯＤ４０５は１．２以上の高値を示した（図７）。
【００７０】
抗プリオン蛋白自己抗体は、組み換え異種プリオン蛋白で免疫したマウスで、効率的に作製される
組み換え異種プリオン蛋白がトレランスを解消し、抗プリオン蛋白自己抗体を生成できるかどうかマウスで確認するために、マウス組み換えプリオン蛋白に対して免疫したマウス血清を用いてＥＬＩＳＡを行なった。組み換え異種プリオン蛋白は６×Ｈｉｓ標識を含んでいる。従って、免疫マウスで生成される可能性がある抗体と標識の免疫反応を除去するために、ＥＬＩＳＡ抗原として標識を含まないマウス組み換えプリオン蛋白を使用した。マウス組み換えプリオン蛋白はマウスにおいてトレラントで、非免疫マウスと比較し、１：１００希釈でＯＤ４０５は僅かに上昇しただけであった（図８）。これに対し、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒトの組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスの抗血清の場合、ＯＤ４０５は、バラツキは見られるが、非免疫マウスと比較し、より高値を示した（図８）。ハムスター或いはヒツジ組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスの中でそれぞれ１匹だけが（計２匹）、マウス組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスと同程度に、低い抗プリオン自己抗体値を示した（図８）。
【００７１】
ウシ及びヒツジ組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスでマウスプリオンの減弱が見られたが、マウス組み換えプリオン蛋白では変化が無かった
組み換え異種プリオン蛋白による免疫が、プリオンの感染に対し予防効果を有するかどうか検討するために、マウス、ウシ、ヒツジ組み換えプリオン蛋白で５回免疫後、マウス福岡−１プリオンをＢＡＬＢマウスに腹腔内投与し、接種（感染）させた。非免疫ＢＡＬＢ／ｃマウスは、接種後２９３．５±１３．４日で発症し、２９５．０±１３．３日で死亡した（表２）。マウス組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスは、同様に、接種後２６９．８±２５．６日に発症し、２７５．０±２５．２日で死亡した（表２）。これらのことから、マウス組み換えプリオン蛋白による免疫はマウスプリオンに対して何ら影響を及ぼさない。対照的に、ウシ及びヒツジプリオン蛋白で免疫したマウスは部分的に発症を抑制し、それぞれ接種後３３２．３±９．０日（ｐ＜０．０１）及び３１６．０±７．５日（ｐ＜０．０５）まで発症を有意に遅延させた（表２）。
【００７２】
【表２】
【００７３】
抗ウシ及び抗ヒトプリオン抗体は、それぞれ抗ＢＳＥ及び抗ヒトプリオンの潜在的なエピトープを認識する
組み換え異種プリオン蛋白による免疫が異種間のプリオン感染に対し予防的かどうか確認するために、ウシ及びヒト組み換えプリオン蛋白に対する産生抗体のエピトープマッピングを行なった。マウスプリオン蛋白の９１−１１０、１４４−１５２、及び１４６−１５９残基は、それぞれ防御的モノクローナル抗体、ＩＣＳＮ３５、６Ｈ４及びＩＣＳＮ１８の標的である。加えて、プリオン感染神経芽細胞種Ｎ２ａ細胞で異常型プリオン蛋白ＰｒＰｓｃ除去能を有する、プリオン蛋白特異的Ｆａｂフラグメント、Ｒ１及びＲ２はマウスプリオン蛋白の２２０−２３１残基に結合した。これらの結果は、他のプリオン蛋白の相当領域も抗プリオンエピトープである可能性が高いことを強力に示唆している。そこで、これらの相当領域、即ちウシプリオン蛋白１０３−１２１、１４３−１６６、及び２３１−２４２残基、並びにヒトプリオン蛋白９１−１１０、１３２−１５５、及び２２０−２３１残基を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として、発現させた。これらの融合蛋白を用い、抗ウシ及び抗ヒトプリオン蛋白血清でウエスタンブロッティングを行なった。融合蛋白は、ＧＳＴ単独の場合に比較し、大腸菌の中で、或いはその精製過程で容易に分解された（図９ａ及び９ｂ）。その理由は現時点では不明である。しかし、各融合蛋白の一部は分解されずに残っていた（図９ａ及び９ｂ）。ＧＳＴ単独及びＧＳＴ−ヒトプリオン蛋白９１−１１０は抗ヒトプリオン蛋白血清で検出できなかった（図９ａ及び９ｂ）。しかし、ＧＳＴ−ヒトプリオン蛋白１３２−１５５及び２２０−２３１は抗ヒトプリオン蛋白血清で充分検出できた（図９ａ）。更に、抗ウシプリオン蛋白血清は全てのウシプリオン融合蛋白と反応した（図９ｂ）。これらの結果は、異種プリオン蛋白での免疫がプリオンの異種間の感染に対して、潜在的な抗プリオンエピトープを認識する抗体を誘導することにより、予防的に働く可能性を強く示唆している。
【００７４】
本実施例に基づく考察を説明する。
【００７５】
本研究において、異種ＰｒＰｓが、分子擬態機序を介してＰｒＰに対する宿主免疫寛容を打破できる可能性を仮説とした。この考えに一致し、異種ハムスター、ウシ、ヒツジ、及びヒト組み換えＰｒＰがマウスで強い抗原性を示し、強力に抗体反応を促進した。一方、同種マウスＰｒＰではその様な作用は見られなかった。ウシ及びヒト組み換えＰｒＰで免疫したマウスは、それぞれ抗ＢＳＥ及び抗ヒトプリオンに対するエピトープを認識する抗体を誘導した。このことから、異種組み換えＰｒＰｓによる免疫は、例えばウシからヒトへの感染の様な、異種間のプリオン感染に対し予防的に作用する可能性が示唆された。更に、異種組み換えＰｒＰで免疫したマウスは、自己免疫疾患に関連する症状を発現することなく、効率的にマウスＰｒＰに対する自己抗体を生成した。また、ヒツジ及びウシ組み換えＰｒＰで免疫したマウスは、福岡−１マウスプリオンを感染させると、有意に延長した発症潜伏期間を示した。これらの結果は、異種組み換えＰｒＰの免疫が同種間のプリオン感染に対しも予防的である可能性を示している。まとめると、異種組み換えＰｒＰによる免疫は別種間及び同種間のプリオン感染に対し予防的な免疫性を発現する可能性がある。
【００７６】
ウシ及びヒツジで免疫したマウスにおけるプリオン病の潜伏期間の延長は、それぞれの血清中の抗ＰｒＰ自己抗体の存在と関連していた。ＰｒＰに対する抗体を用いたマウスの受動免疫では、プリオン感染を効率的に阻止することが報告された。更に、抗ＰｒＰ自己抗体の力価は、マウスプリオンを接種されたマウスにおける症状発現までの時間と良く相関することが報告されている。したがって、異種組み換えＰｒＰで免疫したマウスにおける福岡−１プリオン感染の減弱化は、自己抗体を介する液性免疫に基づくと思われる。しかし、ケイホール リンペット ヘモシアニンとＰｒＰ由来ペプチドの複合体でＰｒＰ欠損マウスを免疫するとことによって、細胞毒性を示すＴ細胞様クローンが単利されたと言う報告がある。したがって、細胞性免疫がプリオン感染の予防に関与する可能性も考えられる。
【００７７】
以前、Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ等は、組み換えマウスＰｒＰが抗マウスＰｒＰ自己抗体を生成する免疫原性を持ち、マウスＡ１３９プリオンで感染後、免疫したマウスでの発症を僅かに遅延させることを報告している［１］。しかし、我々は、マウス組み換えＰｒＰで免疫したマウスにおいて、福岡−１プリオンに対する抗ＰｒＰ自己抗体の効果的な誘導も、発症予防的な効果も見出せなかった。また、Ｐｏｌｌｙｍｅｎｉｄｏｕ等は組み換えマウスＰｒＰはマウスで抗ＰｒＰ自己抗体を誘導出来なかったと報告している［２］。これらの結果は、異種組み換えＰｒＰは、同種ＰｒＰより、プリオンに対する防御的免疫を促進する作用が強力である可能性を示している。熱ショック蛋白ＤｎａＫとマウスＰｒＰの融合蛋白の投与あるいはＣｐＧ−オリゴヌクレオチドとマウスＰｒＰの同時投与はマウスでプリオンに対する免疫原性を高め、ＰｒＰに対する自己抗体を産生することが報告されている［３，４］。そこで、異種組み換えＰｒＰの免疫原性がＤｎａｋとの融合であるいはＣｐＧゴリゴヌクレオチドとの併用投与により高められるかどうか興味のあるところである。
【００７８】
Ｇｉｌｃｈ等は、マウス組み換えＰｒＰでマウスを免疫することにより抗ＰｒＰ自己抗体を産生出来ると報告している。また、彼等は、組み換えマウスＰｒＰ二量体が、プリオンに持続感染しているマウスの神経細胞芽腫瘍Ｎ２ａ細胞のプリオン感染を治療する自己抗体を誘導できるという興味ある報告を出している。しかし、この組み換えＰｒＰはヒトあるいはハムスター由来の３Ｆ４エピトープを相当する領域に挿入されているため、マウスＰｒＰと２個のアミノ酸が異なる組み換えＰｒＰとなっている。したがって、この組み換えＰｒＰはマウスで異種ＰｒＰ様免疫原性を獲得し、そのことにより抗ＰｒＰ自己抗体を誘導したと考えられる。我々は、単量体異種ＰｒＰで免疫したマウスの血清中に、この様な治療効果のある抗体を検出できなかた。したがって、異種組み換えＰｒＰを２量体にすることにより、この様な治療活性を有する抗体を産生するかどうか興味のあるところである。
【００７９】
マウス、ハムスター、ウシ、羊、ヒトの組み換えＰｒＰは９０％以上のアミノ酸が同じである。ハムスター、ウシ、ヒツジ、ヒト組み換えＰｒＰは、マウスの組み換えＰｒＰと、それぞれ９個、１９個、２１個、１７個のアミノ酸が異なるだけである。したがって、マウスにおける異種ＰｒＰによる抗ＰｒＰ自己抗体の産生は分子擬態機序に基づくと考えるのが妥当であろう。しかし、我々は現時点で他の可能性を否定するものではない。以前、Ｗｕｃｈｅｒｐｈｅｎｎｉｇ及びＳｔｒｏｍｉｎｇｅｒは、神経変性障害である多発性硬化症の自己抗原である可能性が指摘されている、ミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）のある部位に相同性を示す種々のウイルス由来ペプチドが、その強さに差は有るが、ＭＢＰ特異的なＴ細胞を刺激出来ることを示した。興味あることに、これらのペプチドの中で、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス由来のペプチドは、ＭＢＰペプチドと同程度或いはそれ以上にＴ細胞を活性化した。これらの結果を総合的考え、我々の今回の結果は、同種間及び異種間の両プリオン感染に対し予防的である免疫反応を有効的に引き起こす、分子擬態に基づく新しいプリオンワクチン開発の魅力的な可能性を強く示した。
【００８０】
以上のことから、本実施例によれば、異種（ハムスター、ウシ、ヒツジ、ヒト）組換えプリオン蛋白でマウスを免疫した場合、免疫したそれぞれの異種プリオン蛋白に対する抗体が産生され、異種組換えプリオン蛋白で免疫することにより、異種間プリオン感染を予防でき、プリオンワクチンの開発に道を開くことができる。
【００８１】
この時、マウスの血清中の抗プリオン自己抗体が増加していた。また、異種（ウシ、ヒツジ）組換えプリオン蛋白で免疫したマウスに福岡−１マウスプリオンを感染させたモデルにおいて、有意に潜伏（生存）期間の延長が認められ、感染を予防する効果が示された。このことから、異種（ハムスター、ウシ、ヒツジ、ヒト）組換えプリオン蛋白による免疫は同種間のプリオン感染をも予防・防止できると考えられる。
【００８２】
［参考文献］
［１］Einar M. Sigurdsson, Amer. J. Pathol., 2002, 161, 13-17
［２］Magdalini Polymenidou, Proc. Natl. Acad. Sci., 2004, 101, 14670-14676
［３］Michael F. Koller, J. Neuroimmunol., 2002, 132, 113-116
［４］Martine Bruley Rosset, J. Immuno., 2004, 172, 5168-5174
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】マウスについての、核酸配列とアミノ酸配列である。
【図２】ハムスターについての、核酸配列とアミノ酸配列である。
【図３】ウシについての、核酸配列とアミノ酸配列である。
【図４】ヒツジについての、核酸配列とアミノ酸配列である。
【図５】ヒトについての、核酸配列とアミノ酸配列である。
【図６】（ａ）ＩＰＴＧ処理の有（＋）無（−）における、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒトプリオン蛋白を発現した大腸菌のコマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を示し、（ｂ）精製したマウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒトプリオン蛋白のＣＢＢ染色を示す図である。
【図７】マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒト組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスにおける特異的抗体反応を示す図である。５匹のマウスを各精製蛋白で免疫した。抗体力価は４０５ｎｍにおける特異的な吸光度として表現した。
【図８】マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ及びヒト組み換えプリオン蛋白で免疫したマウスにおける抗マウスプリオン蛋白自己抗体を示す図である。免疫したマウスの各抗血清は１：１００に希釈し、マウス組み換えプリオン蛋白に対するＥＬＩＳＡを行なった。抗体力価は４０５ｎｍにおける特異的な吸光度として表現した。図中の横軸及び縦軸は、それぞれ平均及び標準偏差を示す。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１
【図９】抗ヒト（ａ）及び抗ウシ（ｂ）プリオン蛋白抗体のエピトープマッピングを示す図である。ヒト及びウシプリオン蛋白のペプチドと融合したＧＳＴ並びに融合しないＧＳＴを精製し、抗ヒトプリオン蛋白、抗ウシオウリオン蛋白及び抗ＧＳＴ抗体を用いウエスタンブロッティングを行なった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有するワクチン。
【請求項２】
動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属する
請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有するワクチン。
【請求項４】
動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属する
請求項３記載のワクチン。
【請求項５】
異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するワクチン。
【請求項６】
哺乳動物は、カモノハシ目、フクロネズミ目、アリクイ目、モグラ目、ツパイ目、ヒヨケザル目、コウモリ目、サル目、ネコ目、ゾウ目、ジュゴン目、ウマ目、イワダヌキ目、ツチブタ目、ウシ目、クジラ目、センザンコウ目、ネズミ目、ウサギ目、またはハネジネズミ目に属する
請求項５記載のワクチン。
【請求項７】
異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するワクチンであって、
前記哺乳動物は、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトである
ワクチン。
【請求項８】
ワクチンを接種する免疫方法において、
前記ワクチンは、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有する
ことを特徴とする免疫方法。
【請求項９】
動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属する
ことを特徴とする請求項８記載の免疫方法。
【請求項１０】
ワクチンを接種する免疫方法において、
前記ワクチンは、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有する
ことを特徴とする免疫方法。
【請求項１１】
動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属する
ことを特徴とする請求項１０記載の免疫方法。
【請求項１２】
ワクチンを接種する免疫方法において、
前記ワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有する
ことを特徴とする免疫方法。
【請求項１３】
哺乳動物は、カモノハシ目、フクロネズミ目、アリクイ目、モグラ目、ツパイ目、ヒヨケザル目、コウモリ目、サル目、ネコ目、ゾウ目、ジュゴン目、ウマ目、イワダヌキ目、ツチブタ目、ウシ目、クジラ目、センザンコウ目、ネズミ目、ウサギ目、またはハネジネズミ目に属する
ことを特徴とする請求項１２記載の免疫方法。
【請求項１４】
ワクチンを接種する免疫方法において、
前記ワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有し、
前記哺乳動物は、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトである
ことを特徴とする免疫方法。
【請求項１】
異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有するワクチン。
【請求項２】
動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属する
請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有するワクチン。
【請求項４】
動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属する
請求項３記載のワクチン。
【請求項５】
異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するワクチン。
【請求項６】
哺乳動物は、カモノハシ目、フクロネズミ目、アリクイ目、モグラ目、ツパイ目、ヒヨケザル目、コウモリ目、サル目、ネコ目、ゾウ目、ジュゴン目、ウマ目、イワダヌキ目、ツチブタ目、ウシ目、クジラ目、センザンコウ目、ネズミ目、ウサギ目、またはハネジネズミ目に属する
請求項５記載のワクチン。
【請求項７】
異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有するワクチンであって、
前記哺乳動物は、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトである
ワクチン。
【請求項８】
ワクチンを接種する免疫方法において、
前記ワクチンは、異種動物由来のプリオン蛋白またはその擬態分子を含有する
ことを特徴とする免疫方法。
【請求項９】
動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属する
ことを特徴とする請求項８記載の免疫方法。
【請求項１０】
ワクチンを接種する免疫方法において、
前記ワクチンは、異種動物由来のプリオンの中和活性部位を含有する
ことを特徴とする免疫方法。
【請求項１１】
動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属する
ことを特徴とする請求項１０記載の免疫方法。
【請求項１２】
ワクチンを接種する免疫方法において、
前記ワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有する
ことを特徴とする免疫方法。
【請求項１３】
哺乳動物は、カモノハシ目、フクロネズミ目、アリクイ目、モグラ目、ツパイ目、ヒヨケザル目、コウモリ目、サル目、ネコ目、ゾウ目、ジュゴン目、ウマ目、イワダヌキ目、ツチブタ目、ウシ目、クジラ目、センザンコウ目、ネズミ目、ウサギ目、またはハネジネズミ目に属する
ことを特徴とする請求項１２記載の免疫方法。
【請求項１４】
ワクチンを接種する免疫方法において、
前記ワクチンは、異種の哺乳動物に由来するプリオン蛋白を含有し、
前記哺乳動物は、マウス、ハムスター、ウシ、ヒツジ、またはヒトである
ことを特徴とする免疫方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図６】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図６】
【図９】
【公開番号】特開２００８−２０１６７４（Ｐ２００８−２０１６７４Ａ）
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１５７９３１（Ｐ２００５−１５７９３１）
【出願日】平成１７年５月３０日（２００５．５．３０）
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月３０日（２００５．５．３０）
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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