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ワクチンとしての変異型パルボウイルス構造タンパク質
説明

ワクチンとしての変異型パルボウイルス構造タンパク質

本発明は、抗原に対する結合剤に特異的に結合し得るパルボウイルス変異構造タンパク質を同定する方法、パルボウイルスにとって異種である少なくとも1つのB細胞エピトープを含むパルボウイルス変異構造タンパク質、該タンパク質を含む多量体構造、該タンパク質をコードする核酸、該タンパク質を含むウイルスまたは細胞、該タンパク質を調製する方法、該タンパク質、核酸、または多量体構造を含む薬剤およびその使用に関する。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の段階を含む、抗原の結合剤に特異的に結合し得るパルボウイルス変異構造タンパク質を同定する方法:
a) 少なくとも1つの変異型パルボウイルス構造タンパク質を発現するパルボウイルスビリオンのライブラリーを提供する段階、
b) 抗原の結合剤を提供する段階、
c) 結合剤に特異的に結合する少なくとも1つのパルボウイルスビリオンを選択する段階、および
d) 段階c)で選択されたパルボウイルスビリオンの
i) パルボウイルス変異構造タンパク質もしくその変異部分、または
ii)パルボウイルス変異構造タンパク質をコードする遺伝子もしくはその変異部分
を同定する段階。
【請求項2】
段階c)で選択される少なくとも1つのパルボウイルスビリオンを、適切な条件下での産生細胞におけるウイルス複製およびそれに続くパッケージングにより増幅し、段階b)〜c)を少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回、好ましくは1、2、3、4、または5回繰り返す、請求項1記載の方法。
【請求項3】
好ましくは直接、またはリンカーを介して担体上に固定化された結合剤を用いて選択段階を行う、請求項1または2のいずれか一項記載の方法。
【請求項4】
選択段階を懸濁状態の結合剤を用いて行い、かつ任意に、結合剤に特異的に結合している少なくとも1つのパルボウイルスビリオンを沈殿させる、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項5】
選択段階が洗浄段階を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項6】
選択されたパルボウイルスビリオンを、第2の結合剤に対する非結合に関してさらに選択する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項7】
以下の段階をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法:
e) パルボウイルス変異構造タンパク質をコードする遺伝子をランダム化する段階、
f) ランダム化遺伝子をパルボウイルスのさらなるライブラリー中にパッケージングする段階、および
g) 段階a)〜d)を繰り返す段階。
【請求項8】
パルボウイルス変異構造タンパク質が、各パルボウイルス野生型構造タンパク質と比較して、少なくとも1つのランダム変異をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項9】
パルボウイルスが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ウシAAV(b-AAV)、イヌAAV(CAAV)、イヌパルボウイルス(CPV)、マウスパルボウイルス、マウスの微小ウイルス(MVM)、B19、H1、トリAAV(AAAV)、ネコ汎白血球減少症ウイルス(FPV)、およびガチョウパルボウイルス(GPV)からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項10】
AAVが、AAV-1、AAV-2、AAV-3b、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、またはAAV-12であり、特にAAV-2である、請求項8または9記載の方法。
【請求項11】
遺伝子型/表現型連関ライブラリーをもたらす、100ゲノム/細胞以下、好ましくは10ゲノム/細胞以下、より好ましくは1ゲノム/細胞以下の低コピー数のウイルスゲノムを用いる適切な条件下で、プラスミドライブラリーを産生細胞にトランスフェクトすることにより、パルボウイルスビリオンのライブラリーを作製する、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項12】
細胞当たりのゲノムの比が5〜5,000、好ましくは10〜1,000、より好ましくは50〜300、特に約100である適切な条件下でライブラリーを産生細胞に導入すること、および、特に飲作用および/または食作用を介した非特異的取り込みによる、感染経路から独立している導入条件を選択することにより、遺伝子型/表現型が連関したパルボウイルスライブラリーを作製する、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項13】
パルボウイルスビリオンライブラリーの導入を、固定化パルボウイルスビリオン上に播種した産生細胞を用いて行う、請求項12記載の方法。
【請求項14】
細胞当たりのゲノムの比が10〜10,000、好ましくは50〜5,000、より好ましくは100〜3,000、特に約1,000である適切な条件下で、ライブラリーを産生細胞に導入し、遺伝子型/表現型連関ライブラリーをもたらす、好ましくは特異的受容体結合を介した感染経路に依存する導入条件を選択することにより、パルボウイルスビリオンのライブラリーを作製する、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項15】
産生細胞をビリオンライブラリーと共にインキュベートするが、ライブラリーのビリオンは固定化されていないという導入条件を適用する、請求項14記載の方法。
【請求項16】
ライブラリーが、少なくとも5%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%、特に少なくとも90%の遺伝子型/表現型連関を有する、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項17】
ライブラリーが、105を超える、好ましくは106を超える、特に107を超えるパルボウイルス変異体の多重度を有する、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項18】
パルボウイルス変異体構造タンパク質が、4〜30アミノ酸、好ましくは5〜20アミノ酸、特に5〜15アミノ酸の挿入を少なくとも1つ含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項19】
挿入が、ジスルフィド結合を形成して、挿入アミノ酸からなるループを形成し得る2つのシステインを含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項20】
パルボウイルス変異構造タンパク質が、点突然変異、内部または末端欠失、第2の挿入、および置換から選択される少なくとも1つのさらなる変異を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項21】
第2の挿入が内部にあるかまたはN末端もしくはC末端融合であり、該挿入が4〜40アミノ酸、好ましくは5〜30アミノ酸、最も好ましくは7〜20アミノ酸の長さを有する、請求項20記載の方法。
【請求項22】
第2の挿入がリガンドに対する結合に有用なタグである、請求項20または21記載の方法。
【請求項23】
a) 挿入が、I-1、I-34、I-138、I-139、I-161、I-261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-453、I-459、I-471、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I-591、I-657、I-664、I-713、およびI-716、からなる群より選択される1つまたは複数の位置、より好ましくはI-261、I-453、I-534、I-570、I-573、およびI-587からなる群より選択される1つまたは複数の位置、特にI-587に、挿入されるか;または
b) 挿入が、I-261、I-453、I-534、I-570、I-573、およびI-587からなる群より選択される2つの位置、好ましくはI-261とI-587の組み合わせおよびI-261とI-453の組み合わせに挿入される、
請求項18〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項24】
請求項1〜23のいずれか一項記載の方法によって得られ得るパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項25】
パルボウイルスにとって異種である少なくとも1つのB細胞エピトープを含むパルボウイルス変異構造タンパク質であって、B細胞エピトープがウイルスの表面上に位置するパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項26】
B細胞エピトープが、病原体と、特に病原体のB細胞エピトープと同一ではない、請求項24または25記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項27】
哺乳動物または病原体B細胞エピトープと同一ではないが、哺乳動物またはB細胞エピトープの機能的誘導体である、パルボウイルスにとって異種である少なくとも1つのB細胞エピトープを含む、請求項24または25のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項28】
請求項9、10、または18〜23のいずれか一項に記載される通りにさらに特徴づけられる、請求項24〜27のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項29】
B細胞エピトープが寛容原由来エピトープである、請求項24〜28のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項30】
B細胞エピトープが、腫瘍抗原、誤って折りたたまれたタンパク質、血清タンパク質、膜タンパク質、TNFファミリーメンバー、およびインターロイキンからなる群より選択されるタンパク質の一部である、請求項24〜29のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項31】
B細胞エピトープが、CETP、CD20、アセチルコリン受容体、IL13R、EGFR、IgE、Melan A、HMW MAA、CA125、Her2/NEU、L1細胞接着分子、VEGF、EGFR、CD20、TNF-α、IL-6、IL9、IL-13、IL-17、およびβ-アミロイドからなる群より選択されるタンパク質の一部である、請求項30記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項32】
B細胞エピトープが、ヒトβ-アミロイドの一部またはヒトβ-アミロイドミモトープである、請求項30記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項33】
B細胞エピトープが、ヒトIgEの一部またはヒトIgEミモトープである、請求項30記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項34】
B細胞エピトープが、ヒトCETPの一部またはヒトCETPミモトープである、請求項30記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項35】
B細胞エピトープが、ヒトTNF-αの一部またはヒトTNF-αミモトープである、請求項30記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項36】
B細胞エピトープが、ヒトIL-6の一部またはヒトIL-6ミモトープである、請求項30記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項37】
B細胞エピトープが、ヒトIL-17の一部またはヒトIL-17ミモトープである、請求項30記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項38】
B細胞エピトープが、特に配列QMWAPQWGPDまたはそのパラトープもしくはミモトープを含むかまたは有する、ヒトHER2/neuの一部またはヒトHER2/neuミモトープである、請求項30記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項39】
B細胞エピトープが、

からなる群より選択されない、請求項24〜38のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項40】
B細胞エピトープが、インテグリン、特にaβ1、β3、avβ3、またはavβ5インテグリン、およびCD13ではない、請求項24〜39のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項41】
エピトープが構造タンパク質のN末端に融合されていない、請求項24〜40のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項42】
標的抗原に結合し得る免疫グロブリンを誘導することができる、請求項24〜41のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項43】
B細胞エピトープが、抗IgE抗体の抗イディオタイプエピトープ/ミモトープ、および/またはIgE寛容原由来エピトープ/ミモトープを含む、請求項24〜42のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項44】
B細胞エピトープが、最初のG、W、およびVが保存されており、かつシステイン残基Cがジスルフィド架橋によりペプチドの環状型を媒介している

のミモトープ配列を含む、請求項24、25、28〜30、31、33、42、または43のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項45】
B細胞エピトープが、

またはそのパラトープもしくはミモトープからなる群より選択される配列を含むかまたは有する、請求項24、25、28〜31、33、42、または43のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項46】
B細胞エピトープが、

またはそのパラトープもしくはミモトープからなる群より選択される配列を含むかまたは有する、請求項24、25、28〜31、34、または42のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項47】
B細胞エピトープが、

またはそのパラトープもしくはミモトープからなる群より選択される配列を含むかまたは有する、請求項24、25、28〜31、35〜37、または42のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項48】
B細胞エピトープが、特に配列DAEFRHDSGを含むかまたは有する、β-アミロイドエピトープまたはβ-アミロイドミモトープである、請求項24、25、28〜32、および42のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項49】
B細胞エピトープがI-453および/またはI-587、特にAAV-1、AAV-2、またはAAV-6のI-453および/またはI-587に挿入される、請求項24、25、28〜30、42〜48のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項50】
第2のタンパク質またはペプチドに融合させた、請求項24〜49のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質。
【請求項51】
請求項24〜50のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質を含む多量体構造。
【請求項52】
キャプソメア、ウイルス様粒子、またはウイルスである、請求項51記載の多量体構造。
【請求項53】
構造タンパク質少なくとも5個、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも30個、最も好ましくは少なくとも60個の凝集体である、請求項51または52記載の多量体構造。
【請求項54】
パルボウイルスにとって異種であるB細胞エピトープが多量体構造の表面上に位置する、請求項51〜53のいずれか一項記載の多量体構造。
【請求項55】
請求項24〜50のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質をコードする核酸。
【請求項56】
請求項24〜50のいずれか一項記載のパルボウイルス変異構造タンパク質、および/または請求項55記載の核酸を含むウイルス。
【請求項57】
請求項55記載の核酸を含む細胞。
【請求項58】
細菌、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項57記載の細胞。
【請求項59】
以下の段階を含む、請求項24〜50のいずれか一項記載の構造タンパク質を調製する方法:
a) 適切な条件下で、請求項57または58記載の細胞を培養することにより、パルボウイルス変異構造タンパク質をコードする核酸を発現させる段階、および
b) 段階a)の発現されたパルボウイルス変異構造タンパク質を単離する段階。
【請求項60】
請求項24〜50のいずれか以降記載の少なくとも1つのパルボウイルス変異構造タンパク質および/または請求項55記載の核酸、好ましくは請求項51〜54のいずれか一項記載の少なくとも1つの多量体構造を含む薬剤。
【請求項61】
ワクチンである、請求項60記載の薬剤。
【請求項62】
自己免疫疾患、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、代謝疾患、炎症性疾患、神経疾患を予防もしくは治療するため、または眼科において用いるための、請求項60または61記載の薬剤。
【請求項63】
免疫寛容を破壊するための、請求項60〜62のいずれか一項記載の薬剤。
【請求項64】
疾患が感染症ではない、請求項60〜63のいずれか一項記載の薬剤。
【請求項65】
パルボウイルス変異構造タンパク質が、遺伝子療法においてベクターとして用いられない、請求項60〜62または64のいずれか一項記載の薬剤。
【請求項66】
好ましくは、自己免疫疾患および/もしくは慢性炎症性疾患、好ましくは関節リウマチおよび/もしくはクローン病、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、喘息、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、代謝疾患、炎症性疾患、神経疾患を予防もしくは治療するため、または眼科において用いるためのワクチンを製造するための、パルボウイルスにとって異種である少なくとも1つのB細胞エピトープを含むパルボウイルス変異構造タンパク質の使用であって、特に薬剤が請求項60〜65のいずれか一項に定義される通りである使用。
【請求項67】
以下の治療および/または予防のための、請求項60〜65のいずれか一項記載の薬剤:
a) アレルギー性疾患および/または喘息、この場合のB細胞エピトープは、抗IgE抗体の抗イディオタイプエピトープ/ミモトープおよび/もしくはIgEエピトープ/ミモトープ、特に、最初のG、W、およびVが保存されており、かつシステイン残基Cがジスルフィド架橋によりペプチドの環状型を媒介している

の配列のミモトープ、または特に、

、およびそれらの機能的活性変種からなる群より選択されるエピトープを含む;
b) アルツハイマー病、この場合のB細胞エピトープは、特に配列DAEFRHDSGまたはその機能的活性変種を含むかまたは有する、β-アミロイドエピトープまたはミモトープを含む;
c) アテローム性動脈硬化症、この場合のB細胞エピトープは、CETPエピトープまたはミモトープ、特に、

、およびそれらの機能的活性変種からなる群より選択されるエピトープを含む;
d) 腫瘍疾患、この場合のB細胞エピトープは、増殖因子受容体または増殖因子のエピトープまたはミモトープ、特にHER2/neuエピトープまたはミモトープ、特にエピトープQMWAPQWGPDまたはその機能的活性変種を含む;
e) 自己免疫疾患および/または慢性炎症性疾患、好ましくは関節リウマチおよび/またはクローン病、この場合のB細胞エピトープは、サイトカインの、好ましくはTNF-α、IL-6、および/またはIL-17のエピトープまたはミモトープ、特に、

、およびそれらの機能的活性変種からなる群より選択されるエピトープを含む;または
f) 感染症、好ましくはHIV感染症、この場合のB細胞エピトープは、ウイルス受容体の、好ましくはCCR5のエピトープまたはミモトープ、特に、

、およびそれらの機能的活性変種からなる群より選択されるエピトープを含む。

【公表番号】特表2010−530737(P2010−530737A)
【公表日】平成22年9月16日(2010.9.16)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−509748(P2010−509748)
【出願日】平成20年6月2日(2008.6.2)
【国際出願番号】PCT/EP2008/004366
【国際公開番号】WO2008/145401
【国際公開日】平成20年12月4日(2008.12.4)
【出願人】(509327817)メディジーン アーゲー (3)
【出願人】(509327828)ルドウィグ‐マクシミリアンズ‐ユニバーシタット (1)
【出願人】(509327851)ユニバーシタット ツ ケルン (2)
【Fターム(参考)】