ワクチンの調製のためのＢ型肝炎ウイルス表面抗原の発現
ＨＢｓＡｇは、ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において発現され、ここでこのプラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む。このプラスミドはまた、（３）ＬＥＵ２選択マーカー；（４）２μプラスミド配列；および（５）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける機能的な複製起点を含む。ＨＢｓＡｇは、この宿主に発現され得、ワクチンの製造における使用のため、特に組合せワクチンの製造のためおよび新規の一価のＨＢＶワクチン（例えば、アルミニウムアジュバントを含まない）における使用のために精製され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、タンパク質発現の分野、特にワクチンの調製に使用するためのＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を発現させる工程に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ型肝炎ワクチンは、長年利用されており（例えば、参考文献１（非特許文献１）の１６章を参照のこと）、これらの活性成分はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。最初のＨＢＶワクチンは、ヒトの血液から精製されたＨＢｓＡｇを使用したが、組換え発現されたＨＢｓＡｇを基にしたワクチンが、１９９０年代に広く利用されるようになった。次いで、ＨＢｓＡｇはまた、このワクチンの投与が２つ以上の病原体に対して被験体を同時に免疫し得るように、多価ワクチン（すなわち、２つ以上の病原体由来の免疫原の混合物を含むワクチン）の成分として援用されている。これらの多価ワクチンは代表的にＨＢｓＡｇと少なくとも「ＤＴＰ」（ジフテリア、破傷風および百日咳）抗原を含有する。
【０００４】
最初の一価の組換えＨＢＶワクチン、ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭは、水酸化アルミニウムアジュバントを含有する。もっと最近になって、より最新のアジュバントに基づいた一価のＨＢＶワクチンが利用できるようになった（例えば、ＧＳＫの製品ＦＥＮＤＲＩＸＴＭにおける「ＡＳ０４」アジュバント［２（非特許文献２）］、Ｂｅｒｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈの製品ＳＵＰＥＲＶＡＸＴＭにおけるＲＣ−５２９アジュバント、またはＣｏｌｅｙ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＣＰＧ７９０９のようなＣｐＧオリゴヌクレオチドアジュバント［３（非特許文献３）］の使用）。
【０００５】
ＨＢｓＡｇの組換え発現に関して、種々の系が記載されている。使用された発現宿主として、バクテリア、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＨａｎｅｎｓｕｌａおよびＰｉｃｈｉａ種を含む）、哺乳動物細胞の培養物（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｂｕ３細胞を含む）、昆虫細胞（バキュロウイルスベクターを使用する）および植物細胞（例えば、「食用ワクチン」のために）が挙げられる。
【非特許文献１】Ｖａｃｃｉｎｅｓ、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編、第４版、２００４年、ＩＳＢＮ：０−７２１６−９６８８−０
【非特許文献２】Ｄｅｓｏｍｂｅｒｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ、第２０巻、２００２年、２５９７〜２６０２頁
【非特許文献３】Ｃｏｏｐｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、第２４巻、２００４年、６９３〜７０１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＨＢｓＡｇの組換え発現のため、特に組合せワクチン（ＤＴＰ抗原を含有するような）または新たな一価のＨＢＶワクチンに使用されるＨＢｓＡｇを調製するためにさらに改善された系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（本発明の開示）
組換えＨＢｓＡｇ発現の初期の報告は、Ｅ．ｃｏｌｉ［４〜６］、マウス細胞［７］、ヒト細胞［８］、サル細胞［９］および酵母［１０〜１２］に集中した。しかしながら、もっと最近になって、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ［２５、２６］およびＨａｎｅｎｓｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ［２７、２８］酵母において発現を有するように、組換え植物における発現が広い注目を得ている［１３〜２４］。
【０００８】
これら最新の発現系への動きにもかかわらず、本発明に従って、ＨＢｓＡｇはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現される。種々の選択肢がＨＢｓＡｇの酵母に基づいた発現において利用可能であり、これらとしては酵母種および酵母株、培養条件、発現の制御に使用されるプロモーター、遺伝子終止配列、コドンの使用などの選択が挙げられる。本発明に従って、ＨＢｓＡｇは、ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において発現され、ここでこのプラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む。このプラスミドはまた、代表的に（３）ＬＥＵ２選択マーカー；（４）２μプラスミド配列；および（５）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける機能的な複製起点を含む。
【０００９】
ＨＢｓＡｇは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現され得、ワクチンの製造、特に組合せワクチンおよび新たな一価のＨＢＶワクチンの製造において使用するために精製され得る。この酵母で発現された材料は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ＨＢｓＡｇが免疫抑制の可能性を有し得るという参考文献２９の報告にもかかわらず、これら複合体ワクチンの使用に適している。
【００１０】
（多価ワクチン）
従って、本発明は、多価免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは以下の工程（ａ）本発明のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主における発現後、ＨＢｓＡｇを精製することによりＨＢＶ成分を調製する工程；（ｂ）少なくとも１つの非ＨＢＶ成分を調製する工程；および（ｃ）多価組成物を得るためにＨＢＶおよび非ＨＢＶ成分を混合する工程を包含する。
【００１１】
本発明はまた、（ａ）本発明のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において発現されるＨＢｓＡｇを含むＨＢＶ成分；および（ｂ）少なくとも１つの非ＨＢＶ成分を含む多価の免疫原性組成物を提供する。本組成物はまた、代表的に１つ以上のアジュバントを含有する。
【００１２】
これらの多価組成物は、特に子供においてＨＢＶ病原体および非ＨＢＶ病原体による感染に対して同時に保護するのに有用である。代表的な患者は、０歳であり、出生後６週と９週の間にこの組成物の第１の投薬を受ける。さらに２回または３回の投薬は、代表的には約６〜８週の間隔を与えて投与される。この組成物はまた、別のワクチンの最初の免疫スケジュールを完全にするために使用され得る。本組成物はまた追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）として使用され得る（例えば、１〜１６歳の子供において）。
【００１３】
（一価ワクチン）
本発明はまた、一価の免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは以下の工程（ａ）本発明のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主における発現後、ＨＢｓＡｇを精製することによりＨＢＶ成分を調製する工程；（ｂ）免疫原性組成物を得るためにＨＢｓＡｇをアジュバントと合わせる工程を包含する。このアジュバントは、好ましくは水酸化アルミニウムアジュバントではなく、より好ましくは単にアルミニウム塩アジュバントではない。
【００１４】
本発明はまた、（ａ）本発明のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されたＨＢｓＡｇを含むＨＢＶ成分；および（ｂ）アジュバントを含む一価の免疫原性組成物を提供する。
【００１５】
これらの一価の組成物は、既存のアジュバントワクチン（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）（例えば、ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭ製品）が無効である患者においてＢ型肝炎ウイルス感染に対する保護および／または処置に特に有用である。この組成物が特に適している患者の部分群として；免疫不全の患者；血液透析患者；血液透析前の患者；腎機能不全（ｒｅｎａｌ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を有する患者；腎不全（ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）を有する患者；血液透析と必要とする前の早期腎不全を有する患者；肝移植を待っている（例えば、順番待ちリスト上の）患者；末期の腎不全を有する患者；臓器移植（特に肝移植）を受けた患者（例えば、本発明のワクチンの第１の投薬前６ヶ月間に）；Ｂ型肝炎免疫グロブリン（ＨＢＩｇ）処置を受容する患者（または受けた患者、例えば、本発明のワクチンの第１の投薬前６ヶ月間に）；ＨＬＡ ＤＱ２ハプロタイプを有する患者［３０］；ＨＬＡ ＤＲ３ハプロタイプを有する患者［３０］；ＨＬＡ ＤＲ７ハプロタイプを有する患者［３０］；ＨＬＡ対立遺伝子ＤＱＢ１＊０２０２を有する患者［３１］；ＨＩＶに感染した患者；慢性ＨＢＶ保有者；最近輸血を受けた患者；免疫抑制薬を受容する患者；ＡＩＤＳを患っている患者；腹水を有する患者；肝硬変を有する患者；脳症を有する患者；インターフェロン治療、特にｉｆｎ−αを受容する患者；タバコを吸う患者；葉巻を吸う患者；３０ｋｇ／ｍ２以上のボディマス指数を有する患者；ＨＢｓＡｇワクチンを受けたことがあるがセロコンバージョンしていない患者（例えば、標準的な最初の投薬スケジュール（例えば、ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭの３回投与）後、１０ｍＩＵ／ｍｌより少ない血清抗ＨＢｓＡｇ力価を有する）が挙げられる。
【００１６】
これらの患者は、３０ｍｌ／分より小さいクレアチニンクリアランス速度（通常の健常な範囲が男性において、約１００〜１４０ｍｌ／分、女性において、約９０〜１３０ｍｌ／分である）を有し得る。患者は、好ましくは少なくとも１５歳（例えば１５〜４０歳の間、１５〜６０歳の間、４０〜６０歳の間、または６０歳以上）である。５５歳より上の患者は、いずれの内在する病気にも関わらず、有効に処置され得る。
【００１７】
（Ｂ型肝炎表面抗原）
ＨＢＶビリオンは、外部タンパク質被膜またはカプシドにより囲まれた内部コアからなる。カプシドの主要成分は、「ＨＢｓＡｇ」と呼ばれるタンパク質である。既存のすべてのＢ型ワクチンは、ＨＢｓＡｇを含んでおり、この抗原が正常なワクチン被接種者に投与された場合、ＨＢＶ感染を防ぐ抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を刺激する。
【００１８】
ワクチンの製造に関して、ＨＢｓＡｇは、２つの方法で作製され得る。大量のＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ感染中肝臓で合成され、血流に放出されるので、第１の方法は、慢性Ｂ型肝炎の保有者の血漿から微粒子の形態での抗原を精製する工程を包含する。第２の方法は、組換えＤＮＡ法により、タンパク質を発現させる工程を包含する。本発明を用いて使用するためのＨＢｓＡｇは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母で組換え発現される。
【００１９】
天然のＨＢｓＡｇ（すなわち、血漿を精製した製品）と違って、本発明を用いて使用されるＨＢｓＡｇは、グリコシル化されていない。このＨｂｓＡｇの形態が好ましい。なぜなら免疫原性が高く、血液製品の汚染の危険なしに調製され得るからである。
【００２０】
酵母で発現されるＨＢｓＡｇは、有利なことに、実質的に球状の粒子の形態であり（約２０ｎｍの平均直径）、リン脂質を含む脂質マトリックスを含む。血漿由来のＨＢｓＡｇ粒子と違って、この酵母で発現される粒子は、ホスファチジルイノシトールを含み得る。さらに、この脂質マトリックスは、非イオン性の界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）を含み得、これは、酵母で発現される宿主由来の抗原の精製の間にマトリックス中に組み入れられ得る。ＨＢｓＡｇ精製の開始時の組換え酵母細胞の破壊の間、ポリソルベート２０を使用することは、それをＨＢｓＡｇ粒子に導入し得る１つの方法である。このポリソルベート２０は、代表的に１００μｇのＨＢｓＡｇあたり少なくとも５μｇの重量比で存在する。
【００２１】
公知のすべてのＨＢＶサブタイプは共通の決定因子「ａ」を含んでいる。他の決定因子および副決定因子（ｓｕｂｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）と結合されて、９つのサブタイプ：ａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ−およびａｄｒｑ＋が同定されている。これらのサブタイプに加えて、他の変異体が出現した（例えば、免疫された個体で検出されたＨＢＶ変異体「エスケープ（ｅｓｃａｐｅ）変異体」）。いくつかの研究は、非応答者（例えば、血液透析患者）において大多数の血清がａｄｗ４またはａｄｗ３サブタイプで感染されており（例えば、参考文献３２を参照すると、血清の７５％がａｄｗ４であり、ある血液透析患者群においては８８％まで上昇した；参考文献３３を参照すると、血液透析患者から得られた細かく型決定した（ｓｕｂｔｙｐｅｄ）サンプルの５８％がａｙｗ３であった）、本発明を用いる使用のための最も好ましいＨＢＶサブタイプは、ａｄｗ２サブタイプである。このサブタイプは、参考文献３２の単回血液透析患者、ならびに１９９４年の間カリフォルニアおよびネブラスカ［３４］においておよびその後ブラジル［３５、３６］において血液透析患者の間でほんの少数のＨＢＶ感染の発症において発見されたが、９８％より多い血液透析患者において免疫原性が高く効果的であった。
【００２２】
好ましいＨＢｓＡｇは、以下の２２６マーのアミノ酸配列を有する（配列番号３）：
【００２３】
【化１】
本発明は、配列番号３または配列番号３と１０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の単一アミノ酸置換により異なる配列を使用し得る。
【００２４】
ＨＢｓＡｇコード配列は、以下の６７８マーのヌクレオチド配列であり得る（配列番号４）：
【００２５】
【化２】
ＨＢｓＡｇコード配列の最後のコドンに、好ましくはＴＡＡ終止コドン（オーカー）が続く。
【００２６】
「Ｓ」配列に加えて、表面抗原は、プレＳ配列のすべてまたは一部を含み得る（例えば、プレＳ１および／またはプレＳ２配列のすべてまたは一部）。しかしながら、上に示すようなＳ配列のみの使用が好ましい。
【００２７】
（ＧＡＰＤＨプロモーター）
本発明によると、ＨＢｓＡｇは、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子から、特に酵母ＧＡＰＤＨから上流プロモーターを有するプラスミドを保持するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現される［３７〜４０］。このプロモーターは、その転写を調節するためにＨＢｓＡｇコード配列に連結される。
【００２８】
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼは、解糖酵素であり、そのプロモーターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＨＢｓＡｇの発現を制御するのに特に適していることが発見された［４１］。参考文献４１に開示されるＧＡＰＤＨプロモーターは、以下の１０６１マーの配列を有する（配列番号５）。
【００２９】
【化３】
このプロモーターは、本発明に従って使用され得るが、以下の１０６０マーのヌクレオチド配列（配列番号１）を含むプロモーターを使用することが好ましい。：
【００３０】
【化４】
この配列は、以下：（１）ヌクレオチド４２でＡ／Ｃ置換；（２）ヌクレオチド１９４でＴ／Ａ置換；（３）ヌクレオチド３０１でＣ／Ａ変異；（４）ヌクレオチド４７１でＡの挿入；（５）残基５６９でＣ／Ｔ置換；（６）残基５９７でＴ／Ｃ置換；（７）ヌクレオチド６０４でＴの挿入（４つのＴの代わりに５つのＴ）；および（８）単一のＡでの３’ＧＣＴＴ配列の置換：のように配列番号５とは異なる。
【００３１】
本発明は、配列番号１のプロモーター配列または２０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）の点変異により配列番号１と異なる配列を使用し得、各点変異は１つのヌクレオチドの欠失、置換または挿入である。
【００３２】
この１０６０マー配列は、好ましくはＨＢｓＡｇのＮ末端をコードするＡＴＧ開始コドンのすぐ上流である（配列番号２）。例えば：
【００３３】
【化５】
（ＡＲＧ３ターミネーター）
本発明に従って、ＨＢｓＡｇは、ＡＲＧ３から下流の転写ターミネーターを有するプラスミドを保持するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において発現される。このターミネーターは、その転写を調節するために、ＨＢｓＡｇコード配列に連結される。
【００３４】
酵母のＡＲＧ３遺伝子は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ酵素をコードし［４２］、その転写終止配列は、種々の酵母組換え発現系において使用されている［４３〜４５］。これは酵母におけるＨＢｓＡｇ発現の制御、特にＧＡＰＤＨプロモーターとの組合せで有用である。
【００３５】
ＡＲＧ３終止コドンのすぐ下流の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ エントリーＧＩ：１７１０７６に開示されるように、以下の４５０マーである（配列番号６）：
【００３６】
【化６】
このコード配列のさらに後方に２５０ヌクレオチド延ばした場合、このＡＲＧ３遺伝子は、以下の７００マー配列を含む（配列番号７）：
【００３７】
【化７】
配列番号７の転写終止は、下線のＳａｃＩＩ部位の領域で起こる。本発明による使用のために好ましいターミネーターは、コード配列およびＡＲＧ３領域から下流の配列の両方のある部分を含み、特に以下の６８９マーのヌクレオチド配列を含み（配列番号８）、これは配列番号７と同じ３’末端を有する。
【００３８】
【化８】
この配列は、５’末端近くのＥｃｏＲＩ部位（下線）を有用に含み、これは所望される位置へのターミネーターの挿入を容易にする。
【００３９】
さらに、ＡＲＧ３から下流のターミネーター配列がまた存在し得る。ＡＲＧ３から１５００ヌクレオチドまで（すなわち、配列番号７のさらに８００ヌクレオチド下流まで）が含まれ得る（例えば、１２００ヌクレオチドまで、または約１１５０ヌクレオチド）。
【００４０】
本発明は、配列番号８のターミネーター配列または３０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０）の点変異により配列番号８と異なる配列を使用し得、各点変異は１つのヌクレオチドの欠失、置換または挿入である。
【００４１】
６８９マー配列は、好ましくはＨＢｓＡｇのＣ末端で終止コドンのすく下流である（配列番号９）。例えば、
【００４２】
【化９】
（プラスミド）
ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびＡＲＧ３ターミネーターはすべて同じプラスミドの一部として作動的に連結される。本発明のプラスミドはまた、代表的に以下の要素の１つ、２つまたは（このましくは）３つすべてを含む：ＬＥＵ２選択マーカー；２μプラスミド配列；およびＥ．ｃｏｌｉにおける機能的な複製起点。これら３つの構成要素は、以前にＨＢｓＡｇ発現に使用されたプラスミドにおいて示されている［４５］。
【００４３】
ＬＥＵ２選択マーカーは、しばしば酵母遺伝学において使用される。ＬＥＵ２は、３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼをコードし、これはロイシン生合成経路における３番目の酵素である。プラスミドのＬＥＵ２マーカーは、代謝前駆体からロイシンを合成する能力を与え、ロイシン栄養要求株（例えばＬＥＵ２ヌル変異体）である宿主細胞において使用される。従って、このＬＥＵ２マーカーは、通常ロイシン供給なしでは成長できないロイシン栄養要求株を、ロイシン非存在下で成長させることが可能である。
【００４４】
２μプラスミド配列はまた、酵母遺伝学においてよく知られており［４６］、プラスミドのコピー数を増加させるのに使用される。任意の適した２μプラスミド配列は、本発明のプラスミドにおいて使用され得る。このプラスミドは、酵母の複製起点を含み、これは代表的には２μ配列で提供される。
【００４５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能する複製起点を含むことにより、プラスミドは、酵母とＥ．ｃｏｌｉの間のシャトルベクターとして働き得、それにより便宜的にＥ．ｃｏｌｉ系においてプラスミドの操作を可能にする。
【００４６】
従って、発明は以下の要素を含むプラスミドを提供する：（１）ＨＢｓＡｇコード配列；（２）ＨＢｓＡｇコード配列の上流でＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子からのプロモーター；および（３）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーター。このプラスミドはまた、以下の要素を含み得る：（４）ＬＥＵ２選択マーカー；（５）２μプラスミド配列；および（５）Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能的な複製起点。このＨＢｓＡｇコード配列は、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３と１０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の単一アミノ酸置換により異なる配列をもつＨＢｓＡｇをコードする。ＧＡＰＤＨプロモーター配列は、好ましくは配列番号１または２０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）の点変異により配列番号１と異なる配列を含む。ＡＲＧ３ターミネーターは、好ましくは配列番号８または２０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）の点変異により配列番号８と異なる配列を含む。このプラスミドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において維持され得、ＨＢｓＡｇの発現に使用され得る。
【００４７】
１４５００と１５０００ｂｐの間のプラスミドが好ましい（例えば、１４６００と１４７００ｂｐの間）。
【００４８】
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、組換え発現のために広く使用される酵母である。任意の適したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主は、本発明を用いて使用され得る。しかしながら、ＬＥＵ２選択マーカーがプラスミドにおいて使用され得るように、ロイシン要求株である宿主を使用することが好ましい。この宿主細胞は、ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２変異体であり得る。
【００４９】
さらに好ましい酵母宿主の特徴は、ｈｉｓ３および／またはｃａｎ１−１１である。最も好ましい酵母宿主は、ＤＣ５株のようなｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｈｉｓ３ ｃａｎ１−１１である。
【００５０】
本発明は、本発明のプラスミドを保持する酵母を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の製造における酵母の使用を提供する。
【００５１】
（ＨＢｓＡｇ発現および精製）
組換えタンパク質発現のための酵母培養技術は、当該分野において周知である。酵母は、合成培地において培養され得る（例えば、精製されたアミノ酸（代表的には、ＬＥＵ２マーカーを用いる場合ロイシンを除去した）、ビタミン、塩などを含む）。次いでＨＢｓＡｇは、沈降、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過のような工程を含むプロセスにより精製され得る。この精製の間に使用され得る他の工程として、ゲル透過クロマトグラフィーおよび塩化セシウム超遠心が挙げられる。
【００５２】
精製プロセスすべてに包含されるために特に好ましい工程は、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００あるいはポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ポリソルベート８０としても公知）またはより好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０としても公知）のようなポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル）の存在下における細胞破砕の工程である。次いでこの破砕された細胞は、ＨＢｓＡｇが認められる上清を得るために遠心され得る。次いでこのタンパク質は、上清から精製される（例えば、参考文献４７に開示されるプロセスを使用して）。
【００５３】
精製後、ＨＢｓＡｇは、透析にかけられ得（例えば、システインを用いて）、これはＨＢｓＡｇ調製の間使用され得るチメロサールのような任意の水銀の保存剤を除去するために使用され得る［４８］。
【００５４】
本発明に従って発現され精製されたＨＢｓＡｇは、さらに非ＨＢＶ抗原と合わされ得、多価ワクチンを調製するか、または新規のアジュバントと合わされ得、改善された一価のワクチンを調製する。
【００５５】
（一価の免疫原性組成物）
本発明に従って発現され、精製されたＨＢｓＡｇは、新しいアジュバントと合わされ得、改善された１価のワクチンを調製する。１価のＨＢＶワクチンにおける使用に関して関心がもたれる３つの特異的アジュバントは：ＣｐＧオリゴヌクレオチド；アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体；およびアルミニウム塩と３ｄ−ＭＰＬとの混合物である。
【００５６】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドアジュバントは、ＣｐＧモチーフ（グアノシンが続く非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含むバクテリアの二本鎖ＲＮＡあるいはオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激を示す。ＣｐＧ’は、ヌクレオチド改変体／ヌクレオチドアナログ（例えば、ホスホロチオアート改変体）を含み得、二本鎖または一本鎖であり得る。必要に応じて、グアノシンは、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンのようなアナログで置換され得る。参考文献４９〜５１は、可能なアナログ置換の例を与える。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、さらに参考文献５２〜５７で議論される。
【００５７】
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴ（配列番号１１）またはＴＴＣＧＴＴ（配列番号１２）のようなＴＬＲ９に関し得る［５８］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ）か、またはＢ細胞応答の誘導により特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献５９〜６１で議論される。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【００５８】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端がレセプター認識可能なように構成される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は「イムノマー」を形成するために３’末端で結合され得る。例えば、参考文献５８および６２〜６４を参照のこと。
【００５９】
アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）誘導体は、ＲＣ−５２９を含み［６５〜６８］、これはＣｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより販売されるアミノアルキルグルコサミニド４ホスフェートである。
【００６０】
ＡＳ０４は、アルミニウム塩アジュバントと３Ｄ−ＭＰＬアジュバントとの混合物である［６９］。ＡＳ０４を使用する場合、ＨＢｓＡｇは、好ましくはアルミニウム塩に吸着される（例えば、参考文献７０に記載されるように）。アルミニウム塩はリン酸塩であり、総ＨＢｓＡｇの少なくとも５０％（重量で）（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上またはそれ以上）がリン酸アルミニウムに吸着されることが好ましい。吸着される割合は、吸着された物質を吸着されていない物質と分けること（例えば遠心により、アルミニウム吸着された抗原は容易にペレットを形成する一方で、吸着されなかった抗原は上清に残る）により都合よく測定され得る。上清中のＨＢｓＡｇの量（例えば、抗−ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡにより測定される）は、組成物中のＨＢｓＡｇの総量から引かれ得、次いで、吸着した割合が計算され得る。ＨＢｓＡｇは完全に吸着されること（すなわち、上清に検出されない）が好ましい。
【００６１】
この３Ｄ−ＭＰＬアジュバントはまた、リン酸アルミニウムに吸着され得る。好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬの少なくとも５０％（重量で）（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上またはそれ以上）が吸着される。吸着される割合は、ＨＢｓＡｇと同様の方法で測定され得る。５０μｇ／ｍｌの総３Ｄ−ＭＰＬ濃度を有する組成物において、吸着されない３Ｄ−ＭＰＬの濃度は、２５μｇ／ｍｌ未満（例えば、２０μｇ／ｍｌ以下、１５μｇ／ｍｌ以下、１０μｇ／ｍｌ以下、５μｇ／ｍｌ以下、２０μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下など）であるべきである。
【００６２】
リン酸アルミニウムアジュバントはより詳細に以下に記載される。
【００６３】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）はまた、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリルリピドＡと称される。この名前は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの位置３が脱アシル化されることを示す。それは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトースのない（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）改変体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そしてＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含む数種のサイトカインの放出を刺激する。３Ｄ−ＭＰＬの調製は、最初は参考文献７１に記載され、そしてその産物は、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって、商標名ＭＰＬＴＭの下で製造および販売されている。さらなる詳細は参考文献７２〜７５に見出され得る。この３Ｄ−ＭＰＬは、トリエタノールアミン、トリエチルアンモニウムまたはトリエチルアミンイオンと組み合わせて含まれ得る。
【００６４】
３Ｄ−ＭＰＬは、それらのアシル化によって変動する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５または６のアシル鎖を有する）関連分子の混合物の形態をとり得る。２つの２−デオキシ−２−アミノ−グルコース単糖は、それらの２位の炭素（すなわち、２位および２’位）でＮ−アシル化され、そしてまた３’位でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は以下に示される：
【００６５】
【化１０】
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましく８〜１６の間であり、より好ましくは９〜１２の間であり、そして最も好ましくは１０である。
【００６６】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は各々独立して：（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４であり得、ここでＲ４は−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ここでｍの値は、好ましくは８〜１６の間であり、そしてより好ましくは１０、１２または１４である。２の位置では、ｍは好ましくは１４である。２’位置では、ｍは好ましくは１０である。３’位置では、ｍは好ましくは１２である。基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は従って好ましくはドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。
【００６７】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈであるとき、上記３Ｄ−ＭＰＬは３つのアシル鎖のみを有する（２、２’および３’位の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’の２つのみが−Ｈである場合、上記３Ｄ−ＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’の１つのみが−Ｈである場合、上記３Ｄ−ＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれもが−Ｈではない場合、上記３Ｄ−ＭＰＬは、６つのアシル基を有し得る。本発明に従って用いられる３Ｄ−ＭＰＬアジュバントは、３〜６つのアシル鎖を備えたこれらの形態の混合物であり得るが、この混合物中に６つのアシル鎖をもつ３Ｄ−ＭＰＬを含むことが好ましく、そして特に６つのアシル鎖形態が総３Ｄ−ＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上またはさらに多くを占めることが好ましい。６つのアシル鎖を備えた３Ｄ−ＭＰＬは、最もアジュバント活性な形態であることが見出された。
【００６８】
従って、本発明の組成物に含めるために３Ｄ−ＭＰＬの最も好ましい形態は、以下に示される式（ＩＩ）を有する。
【００６９】
水性条件では、３Ｄ−ＭＰＬは、異なるサイズを備えた、例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを備えたミセル凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方は、本発明とともに用いられ得、そしてより良好な粒子が通常のアッセイによって選択され得る。より小さな粒子（例えば、３Ｄ−ＭＰＬの透明な水性懸濁物を与えるに十分小さい）が、より優れていることが報告され［７６］、本発明に従う使用に好ましい。好ましい粒子は、２２０ｎｍより小さい、より好ましくは２００ｎｍより小さい、１５０ｎｍより小さい、あるいは１２０ｎｍより小さい平均直径を有する。１００ｎｍより小さい平均直径を有しさえし得る。しかしながら、大部分の事例では、この平均直径は、５０ｎｍより小さくはない。
【００７０】
３Ｄ−ＭＰＬがリン酸アルミニウムに吸着される場合、３Ｄ−ＭＰＬ粒子サイズを直接測定することは可能ではないかも知れないが、粒子サイズは、吸着が起こる前に測定され得る。
【００７１】
粒子直径は、動的光散乱の通常の技法によって評価され得、これは、平均粒子直径を示す。粒子がｘｎｍの平均直径を有するといわれる場合、一般的にはほぼこの平均の粒子の分布が存在するが、粒子の数で少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれより多く）がｘ±２０％の範囲内の直径を有する。
【００７２】
【化１１】
（多価免疫原性組成物）
本発明に従って発現され、精製されたＨＢｓＡｇは、１つ以上の非ＨＢＶ抗原と合わされ得、多価ワクチンを調製する。この非ＨＢＶ抗原は、バクテリア抗原および／またはウイルス抗原を含み得る。本発明に従う使用のための代表的な非ＨＢＶ成分として、
ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）
破傷風トキソイド（「Ｔ」）
百日咳抗原（「Ｐ」）（細胞性（「ｗＰ」）あるいは無細胞性（「ａＰ」）のどちらであってもよい）
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原
結合体化Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型莢膜サッカリド（「Ｈｉｂ」）
不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）
結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清群Ｃ莢膜サッカリド（「ＭｅｎＣ」）
結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清群Ａ莢膜サッカリド（「ＭｅｎＡ」）
結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド（「ＭｅｎＷ１３５」）
結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清群Ｙ莢膜サッカリド（「ＭｅｎＹ」）
結合体化Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 莢膜サッカリド
麻疹ウイルス抗原
ムンプスウイルス抗原
風疹ウイルス抗原
水痘−帯状疱疹ウイルス抗原
インフルエンザウイルス抗原
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
２つ以上のこれら非ＨＢＶ抗原が使用され得る。以下の抗原の組合せが特に好ましい。
【００７４】
２価のワクチン：ＨＢＶ−ＨＡＶ；ＨＢＶ−Ｈｉｂ
３価のワクチン：ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ
４価のワクチン：ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ
５価のワクチン：ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ−Ｈｉｂ；ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ−ＩＰＶ
６価のワクチン：ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ−Ｈｉｂ−ＩＰＶ
７価のワクチン：ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＡ−ＭｅｎＣ；ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ−Ｈｉｂ−ＩＰＶ−ＭｅｎＣ。
【００７５】
ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）は、参考文献１の１３章により詳細に開示される。好ましいジフテリアトキソイドは、ホルムアルデヒド処理により調製される。このジフテリアトキソイドは、ウシの抽出物を添加し得る増殖培地（例えば、Ｆｅｎｔｏｎ培地またはＬｉｎｇｇｏｕｄ ＆ Ｆｅｎｔｏｎ培地）中でＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅを成長させ、続いてホルムアルデヒドで処理し、限外濾過および沈降させることにより得られ得る。次いでこのトキソイド化した物質は、滅菌濾過および／または透析を包含する工程により、処理され得る。ジフテリアトキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で示され得る。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｏｉｄ Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ １９９９」［７７、７８]を提供し、これは、アンプルあたり１６０ ＩＵを含む。ＩＵ系の代替として、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」または「凝集限界量」）は、１国際単位の抗毒素を用いて混合した場合、最適の凝集混合物を産生するトキソイドの量として定義される［７９］。例えば、ＮＩＢＳＣは１アンプルあたり３００ＬＦを含む「Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｏｉｄ， Ｐｌａｉｎ」［８０］を提供し、そしてまた１アンプルあたり９００Ｌｆを含む「Ｔｈｅ １ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｆｏｒ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｏｉｄ Ｆｏｒ Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ」［８１]を提供する。
【００７６】
破傷風トキソイド（「Ｔ」）は、参考文献１の第２７章により詳細に開示される。好ましい破傷風トキソイドは、ホルムアルデヒドで処理されたものである。破傷風トキソイドは、増殖培地（例えば、ウシのカゼイン由来のＬａｔｈａｍ培地）中Ｃ．ｔｅｔａｎｉを成長させ、その後ホルムアルデヒド処理、限外濾過および沈降させることにより得られ得る。次いでこの物質は、滅菌濾過および／または透析を含むプロセスにより処理され得る。破傷風トキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で表わされ得る。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｏｉｄ Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ２０００」［８２、８３］を提供し、これは１アンプルあたり４６９ＩＵを含む。ＩＵ系の代替として、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」または「凝集限界量」）は、１国際単位の抗毒素を用いて混合した場合、最適の凝集混合物を産生するトキソイドの量として定義される［７９］。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｔｈｅ １ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｏｉｄ Ｆｏｒ Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ」［８４]を提供し、これは１アンプルあたり１０００Ｌｆを含む。
【００７７】
百日咳抗原（「Ｐ」）は、細胞性（「ｗＰ」）または無細胞性（「ａＰ」）のいずれかであり得る。細胞性百日咳抗原は、代表的に不活性化されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞の形態をとる。細胞性百日咳抗原の調製は、よくまとめられており（例えば、参考文献１の第２１章を参照のこと）、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのフェーズＩの培養物の熱不活化により得られ得る。ｗＰ抗原の量は、国際単位（ＩＵ）で示され得る。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｆｏｒ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ」［８５］を提供し、これは１アンプルあたり４６ＩＵを含む。各アンプルは、８リットルのＭ／１５ Ｓｏｒｅｎｓｅｎ’ｓ緩衝液ｐＨ７．０で希釈された１０リットルのバクテリア懸濁液（Ｕ．Ｓ． Ｏｐａｃｉｔｙ Ｓｔａｎｄａｒｄに換算して１８０不透明度単位（Ｏｐａｃｉｔｙ Ｕｎｉｔ）に等しい）を含んだ水溶液の２．０ｍｌアリコートの凍結乾燥残渣を含む。ＩＵ系の代替として「ＯＵ」単位（「不透明度単位」）がまた使用される（例えば、４ＯＵが約１ＩＵであり得る）。近年ワクチンに使用されるＡｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原は、百日咳トキソイド（ＰＴ）、線状ヘム凝集素（ＦＨＡ）、ペルタクチン（「６９キロダルトン外膜タンパク質」としても公知）および采（例えば、凝集原２および３）を含む。本発明は、好ましくはＰＴ、ＦＨＡおよびペルタクチンのうちの少なくとも２つ、好ましくは３つすべてを使用する（すなわち、采を使用しない）。これら３つの抗原は、好ましくは改変されたＳｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ液体培地で増殖させたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養物からの単離により調製される。ＰＴおよびＦＨＡは、発酵培養液から単離され得る（例えば、ヒドロキシアパタイトゲルへの吸着により）一方、ペルラクチンは、熱処理および凝集（例えば、塩化バリウムを使用する）により、細胞から抽出され得る。この抗原は、継続的なクロマトグラフィー工程および／または沈降工程で精製され得る。ＰＴおよびＦＨＡは、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーにより精製され得る。ペルトラクチンは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーにより精製され得る。ＦＨＡおよびペルラクチンは、本発明に従って使用される前にホルムアルデヒドで処理され得る。ＰＴは好ましくは、ホルムアルデヒドおよび／またはグルタルアルデヒドで処理され解毒される。化学的解毒手順の代替として、ＰＴは、酵素活性が突然変異により減少されたＰＴ変異体であり得る［８６］が、化学的処理による解毒が好ましい。無細胞の百日咳抗原の量は、代表的にマイクログラムで表わされる。
【００７８】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）ワクチンは、参考文献１の１５章に開示される。好ましいＨＡＶ成分は不活性ウイルスに基づいており、不活性化は、ホルマリン処理により達成され得る。ウイルスは、ヒト胎児肺二倍体線維芽細胞（例えば、ＭＲＣ−５細胞）で増殖され得る。好ましいＨＡＶ株は、ＨＭ１７５であるが、ＣＲ３２６Ｆがまた使用され得る。この細胞は、ウイルスの増殖を可能にする条件下で増殖される。この細胞を溶解し、得られた懸濁液を限外濾過およびゲル透過クロマトグラフィーで精製され得る。
【００７９】
ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ 莢膜サッカリド（「Ｈｉｂ」）結合体は、参考文献１の第１４章に、より詳細に開示される。このＨｉｂ莢膜サッカリドは、その免疫原性を特に子供において増強するためにキャリアタンパク質に結合体化される。ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、血清群Ｂ髄膜炎菌に由来する外膜タンパク質複合体、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤまたは破傷風トキソイドを含む種々のキャリアタンパク質が使用され得る。破傷風トキソイドは好ましいキャリアであり、製品中に使用される場合、一般に「ＰＲＰ−Ｔ」と呼ばれる。ＰＲＰ−Ｔは、臭化シアンを使用するＨｉｂ莢膜ポリサッカリドを活性化し、活性化したサッカリドをアジピン酸リンカー（例えば、（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、代表的には塩酸塩）に結合し、次いでリンカー−サッカリドの実体を破傷風トキソイドキャリアタンパク質と反応させることにより作製され得る。Ｈｉｂ結合体のサッカリド部分は、Ｈｉｂバクテリアから調製されるような全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）を含み得、そして／または全長ＰＲＰの断片を含み得る。サッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）が１：５（すなわち、過剰なタンパク質）と５：１（すなわち、過剰なサッカリド）の間にある結合体が使用され得る（例えば、１：２と５：１の間の比および１：１．２５と１：２．５の間の比）。好ましい結合体において、サッカリドとキャリアタンパク質の重量比は、１：２．５と１：３．５の間である。破傷風トキソイドが抗原およびキャリアタンパク質の両方として存在するワクチンにおいて、結合体中のサッカリドとキャリアタンパク質の重量比は、１：０．３と１：２の間であり得る［８７］。このＨｉｂ結合体の投与は、好ましくは０．１５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１μｇ／ｍｌ以上の抗ＰＲＰ抗体濃度を生じ、これらは標準の受容可能な反応の閾値である。
【００８０】
不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）は、参考文献１の第２４章に、より詳細に開示される。ポリオウイルスは、細胞培養物中で成長され得、好ましい培養物は、サルの腎臓由来のＶｅｒｏ細胞株を使用する。Ｖｅｒｏ細胞は、都合よく培養されたミクロキャリアであり得る。成長後、ビリオンは、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）およびクロマトグラフィのような方法を使用して精製され得る。患者に投与する前に、ポリオウイルスは不活化されなければならず、これはホルムアルデヒドで処理することにより達成され得る。ポリオは、３つの型のポリオウイルスのうちの１つにより引き起こされ得る。この３つの型は類似しており、同一の症状を引き起こすが、これらは免疫原性的に非常に異なっており、１つの型による感染は他の型による感染に対して予防しない。それ故、本発明において、３つのポリオウイルス抗原：１型ポリオウイルス（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ株）、２型ポリオウイルス（例えば、ＭＥＦ−１株）および３型ポリオウイルス（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ株）の使用が好ましい。これらウイルスは、好ましくは個々に成長させ精製し、そして不活化し、次いで合わされ、本発明による使用のために大量の３価の混合物を得る。ＩＰＶの量は、代表的に「ＤＵ」単位（「Ｄ−抗原単位」［８８］）で表わされる。
【００８１】
結合体化髄膜炎菌抗原は、キャリアタンパク質に結合体化されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜サッカリド抗原を含む。血清群Ｃに対する結合体ワクチンが、ヒト使用に関して認可されており、それには、ＭＥＮＪＵＧＡＴＥＴＭ［８９］、ＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣＴＭおよびＮＥＩＳＶＡＣ−ＣＴＭが挙げられる。血清群Ａ＋Ｃに由来する結合体の混合物が、公知であり［９０、９１］、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙに由来する結合体の混合物が、報告され［９２〜９５］、２００５年にＭＥＮＡＣＴＲＡＴＭ製品として認可された。本発明に使用される髄膜炎菌サッカリドは、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうちの１つ以上に由来し得る（例えば、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ）。少なくとも血清群Ｃのサッカリドを使用することが好ましく、血清群ＡおよびＣの両方由来のサッカリドを使用することが好ましい。ＭＥＮＪＵＧＡＴＥＴＭおよびＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣＴＭ製品は、ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質を使用し、このキャリアはまた、本発明に従って使用され得る。ＮＥＩＳＶＡＣ−ＣＴＭ製品は、破傷風トキソイドキャリアタンパク質を使用し、そしてこのキャリアはまた、本発明に従って使用され得、同様に、ジフテリアトキソイドを使用し得る。髄膜炎菌結合体のための特に好ましいキャリアタンパク質は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤであり、これは既存の認可された結合体ワクチンのいずれにも存在しない。この結合体のサッカリド部分は、髄膜炎菌から調製されるような全長サッカリドを含み得、そして／または全長サッカリドの断片を含み得る。血清群Ｃサッカリドは、ＯＡｃ＋またはＯＡｃ−株のいずれかから調製され得る。血清群Ａサッカリドに関して、好ましくは少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上）のマンノサミン残基がＣ−３位でＯ−アセチル化される。サッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）が１：１０（すなわち、過剰なタンパク質）と１０：１（すなわち、過剰なサッカリド）の間にある髄膜炎菌結合体が使用され得る（例えば、１：５と５：１の間の比、１：２．５と２．５：１の間の比または１：１．２５と１．２５：１の間の比）。結合体の投与は、好ましくは関連血清群に関して少なくとも４倍、好ましくは少なくとも８倍の血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）力価の増加を生じる。ＳＢＡ力価は、胎児のウサギの補体またはヒトの補体を使用して測定され得る［９６］。
【００８２】
結合体化肺炎球菌抗原は、キャリアタンパク質に結合体化されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の莢膜サッカリド抗原を含む［例えば、参考文献９７〜９９］。１つよりも多くの血清型のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するサッカリドを含むことが、好ましく、２３種の異なる血清型に由来するポリサッカリドの混合物が、広範に使用され、同様に、５種〜１１種の異なる血清型に由来するポリサッカリドを含む結合体ワクチンも、広範に使用される［１００］。例えば、ＰｒｅｖＮａｒＴＭ［１０１］は、７種の血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ）に由来する抗原を含み、各サッカリドは、還元的アミノ化によってＣＲＭ１９７に個別に結合体化されており、０．５μｌ用量あたり各サッカリド２μｇ（４μｇの血清型６Ｂ）であり、結合体は、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている。本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも血清型６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆを含む。さらに血清型は、好ましくは１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖおよび１８Ｃから選択される。
【００８３】
麻疹ウイルス、ムンプスウイルスおよび風疹ウイルスに対して予防するための抗原は、代表的には生ウイルスであり、公知の１価のワクチンおよび３価のワクチン（「ＭＭＲ」）が見出されている。麻疹ウイルスワクチンは、参考文献１の第１９章に、より詳細に記載される。ムンプスウイルスワクチンは、参考文献１の第２０章に、より詳細に記載される。風疹ウイルスワクチンは、参考文献１の第２６章に、より詳細に記載される。代表的な風疹ウイルス株として、Ｍｏｒａｔｅｎ；Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ；Ｓｃｈｗａｒｚ；Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ−Ｚａｇｒｅｂ；ＣＡＭ−７０；ＡＩＫ−Ｃ；ＴＤ９７；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−１６；Ｓｈａｎｇｈａｉ−１９１などが挙げられる。Ｓｃｈｗａｒｚ株およびＭｏｒａｔｅｎ株がＵＳＡおよびヨーロッパにおいて最も一般的に使用される。代表的なムンプスウイルス株として、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ；ＲＩＴ ４３８５；Ｕｒａｂｅ；Ｈｏｓｈｉｎｏ；Ｒｕｂｉｎｉ；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−３；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−Ｚａｇｒｅｂ；Ｍｉｙａｈａｒａ；Ｔｏｒｉｉ；ＮＫＭ−４６；Ｓ−１２などが挙げられる。Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株、ＲＩＴ４３８５株、Ｕｒａｂｅ株およびＬｅｎｉｎｇｒａｄ−Ｚａｇｒｅｂ株は、最も一般的な世界的な株である。代表的な風疹ウイルス株として、ＲＡ２７／３；Ｍａｔｓｕｂａ；ＴＣＲＢ １９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ；Ｍａｔｓｕｕｒａ；ＴＰ−３３６などが挙げられる。ＲＡ２７／３株が西欧側世界で使用される最も一般的な株である。
【００８４】
水痘に対する予防のためのＶＺＶ抗原は、代表的に生ウイルスであり、このウイルスのＯｋａ株に基づいている。ＶＺＶワクチンは、参考文献１の第２８章に、より詳細に記載される。
【００８５】
インフルエンザウイルス抗原は、参考文献１の第１７章および第１８章に、より詳細に記載される。概して、インフルエンザウイルスワクチンは、生ウイルスまたは不活化ウイルスに基づき得、不活化ワクチンは、完全なウイルスの「スプリット」ウイルスまたは精製された表面抗原（血液凝集素およびノイラミニダーゼを含む）に基づき得る。ワクチンを調製するために使用されるウイルスは、卵または細胞培養物のいずれかで成長され得る。インフルエンザウイルスのワクチン株は、季節から季節へと変化する。最近の大流行の間の期間において、ワクチンは、代表的に２つのインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのインフルエンザＢ株を含み、３価のワクチンが代表的である。本発明はまた、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株（特にインフルエンザＡ株ウイルス）のような流行株由来のウイルスを使用し得（すなわち、ワクチンの受容者および一般的ヒト集団に対する株は、免疫原性的にナイーブである）、流行株に対するインフルエンザワクチンは、１価であり得るか、または流行株により補われた通常な３価のワクチンに基づき得る。このインフルエンザウイルスは、再集合体株であり得、逆方向遺伝学技術により得られ得る。このウイルスは、弱毒化され得る。このウイルスは、温度感受性であり得る。このウイルスは、低温適応性であり得る。
【００８６】
多価の組合せを作製する場合、抗原は連続して個々に組合せられ得るか、またはそれらはあらかじめ混合され、一緒に添加され得る。例えば、４価のＤＴＰ−ＨＢｓＡｇワクチンは、ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰ抗原の容器への連続的な添加を含むプロセス、またはＤ、ＴおよびＰ抗原をあらかじめ混合し、次いでＨＢｓＡｇおよびＤＴＰ混合物を合わせることにより作製され得る。
【００８７】
抗原性成分は、任意の適した順番で合わせられ得る。
【００８８】
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドが本発明の組成物中に含まれる場合、これらは好ましくはＨＢｓＡｇと合わせられる前にあらかじめ混合される。従って、本発明のプロセスは、ＨＢｓＡｇを含む第１の成分をＤ抗原およびＴ抗原の両方を含む第２の成分と合わせる工程を包含する。従って、あらかじめ混合されたＤ−Ｔ成分を使用することが好ましい。この２価の成分は、本発明のプロセスで使用され得る（例えば、ＨＢｓＡｇと合わせられ得、３価のＤ−Ｔ−ＨＢＶ成分を作製する）。代替物として、前もって混合したＤ−Ｔ成分は、さらに非ＨＢＶ抗原（例えば、無細胞性百日咳抗原）と合わせられ得、次いでこの成分は、ＨＢｓＡｇなどと合わせられ得る。
【００８９】
同様に、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび全細胞百日咳抗原が組成物中に含まれる場合、これらは好ましくは前もって混合されるので、本発明の工程は、ＨＢｓＡｇを含む第１の成分をＤ抗原、Ｔ抗原およびＰｗ抗原を含む第２の成分と合わせる工程を包含する。
【００９０】
従って、あらかじめ混合されたＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を使用し、そして本発明のプロセスの間この成分を使用することが好ましい。
【００９１】
アジュバントが本発明の組成物中に含まれる場合、これはまた種々の段階で添加され得る。代表的には、抗原は、本発明のプロセスで使用される前にアジュバントと合わされる（例えば、二価のＤ−Ｔ混合物は、本発明のプロセスで使用される前にアルミニウム塩アジュバントに吸着される）が、抗原が混合された後にアジュバントを添加するか、またはアジュバントに抗原を添加することも可能である（例えば、水性アジュバントを用いて開始し、次いで個々にまたはあらかじめ混合して抗原を添加する）。以下に記載されるように、ＨＢｓＡｇ成分は、好ましくは非ＨＢＶ抗原性成分と合わせられる前にリン酸アルミニウムアジュバントに吸着される。
【００９２】
（ＨＢｓＡｇ融合タンパク質）
ＨＢｓＡｇを発現させるために使用されることに加え、本発明は、同じポリペプチド内にＨＢｓＡｇ配列および非ＨＢｓＡｇ配列を含むハイブリッド抗原を発現させるために使用され得る。非ＨＢｓＡｇ配列は、ＨＢｓＡｇ配列に挿入され得るか、またはＨＢｓＡｇ配列のＮ−末端またはＣ−末端に融合され得る。
【００９３】
ＨＢｓＡｇ配列を異種性の抗原に融合させＨＢｓＡｇの能力を利用し、粒子を組立てることが公知である。例えば、参考文献１０２は、サイズおよび密度の点で天然のＨＢｓＡｇ粒子に似ている（約２５％の脂質組成および粒子あたり約１００の含有量のｇｐ１２０に一致する）、自発的に粒子を組立てるタンパク質を与えるＨＩＶ−１ ｇｐ１２０のＨＢｓＡｇへの融合を報告する。このｇｐ１２０は、この融合において天然の形態に折り込むことができ、その生物学的活性を維持した。同様に、ＨＩＶ ｇｐ４１エピトープは、ＨＢｓＡｇを用いて内部融合を作ることにより改善され、この融合タンパク質は、酵母において２２ｎｍのリポタンパク粒子を自己組立てした［１０３］。
【００９４】
この手法はまた、マラリアワクチンにも使用される。参考文献１０４は、マラリアｇｐ１９０抗原由来の６１ａａまでのエピトープをＨＢｓＡｇ配列に挿入し、発現したハイブリッド粒子は動物において抗ｇｐ１９０免疫応答を惹起したことを報告する。参考文献１０５は、ＨＢｓＡｇを有する融合タンパク質として発現されたスポロゾイド周囲タンパク質の４マー配列の１６回の反復を有するタンパク質を報告する。参考文献１０６は、ＨＢｓＡｇに融合されたＰｆｓ１６から構成されるウイルス様粒子の酵母における産生を報告する。参考文献１０７は、スポロゾイド周囲タンパク質がＨＢｓＡｇに融合されるハイブリッド抗原を開示する。参考文献１０８は、２０〜４５ｎｍサイズの免疫原性粒子を形成したＰ．ｖｉｖａｘのメロゾイト表面タンパク質１のＣ末端領域の融合を開示する。従って、自己組立ての粒子形態においてマラリア抗原を提示するためのＨＢｓＡｇの使用は、当該分野において周知である。
【００９５】
この手法は、特にＨＩＶ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅまたはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ由来の抗原を有するＨＢｓＡｇ配列を融合するのに適している。ＨＢｓＡｇハイブリッドを作製するのに適したＨＩＶ抗原は、外被糖タンパク質ｇｐ１２０またはその抗原性フラグメントを含む［１０２］。ＨＢｓＡｇハイブリッドを作製するのに適したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原は、スポロゾイド周囲表面抗原（「ＣＳＰ」）のサブユニットに基づき得（例えば、そのＮＡＮＰモチーフの３と２０の間の繰返しを含み得る（配列番号１４））、そして／またはＣＳＰのＣ末端領域を含み得る（しかし、代表的にはＣ末端から最後の１２アミノ酸を含まない）。例えば、本発明は、「ＲＴＳ」として公知の抗原を使用し得、これはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＮＦ５４または７Ｇ８単離物由来のＣＳＰのＣ末端の大部分を含み（アミノ酸２１０〜３９８であり、１９個のＮＡＮＰ繰返しおよびアミノ酸３６７〜３９０のＴ細胞エピトープ領域を含む）、ＨＢｓＡｇのｐｒｅＳ２の４アミノ酸によりＨＢｓＡｇのＮ末端に融合される。酵母で発現される場合、タンパク質に加え脂質（主にリン脂質）を含むＲＴＳは粒子を形成する。従って、ＲＴＳの配列は、本明細書の配列番号１５と同様に：（ｉ）Ｎ末端のメチオニン残基；（ｉｉ）Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ；（ｉｉｉ）Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ７Ｇ８由来のＣＳタンパク質のアミノ酸２１０〜３９８かまたはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４由来のＣＳタンパク質のアミノ酸２０７〜３９５のいずれかに相当する１８９アミノ酸；（ｉｖ）ＡｒｇまたはＧｌｙ；（ｖ）Ｂ型肝炎Ｐｒｅ−Ｓ２タンパク質由来のＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ；および（ｖｉ）ＨＢｓＡｇを含む。７Ｇ８単離物由来の完全長ＲＴＳは、参考文献１０９中に配列番号１として与えられる配列を有する（参考文献１１０の図５も参照のこと）：
【００９６】
【化１２】
本ハイブリッド抗原は、配列番号１５をコードする配列を用いて酵母で発現され得る。酵母に正常のＨＢｓＡｇと共にハイブリッドタンパク質を共発現することが好ましい。この手法は、以前にＲＴＳを用いて使用され、この共発現の産生物を「ＲＴＳ，Ｓ」という。約１：４のＲＴＳ：Ｓ比が有用である。
【００９７】
従って、本発明の有用な局面は、（ｉ）ＨＢｓＡｇおよび（ｉｉ）ＲＴＳを共発現させることである。これら抗原のうちの１つまたは両方は、上記のプラスミドを使用して発現され得る。共発現したタンパク質は、粒子抗原を形成し、マラリアワクチン内の活性成分として使用され得る。
【００９８】
（多価ワクチンで使用するためのアジュバント）
ＣｐＧ、ＡＧＰｓおよびＡＳ０４を含む「最新の」アジュバントは、上に記載される。これらは、本発明の多価組成物において使用され得るが、アルミニウム塩を使用するほうが好ましい。これらは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントを含む。これらの名前は、慣習的であるが、便宜上のみに使用され、いずれも存在している実際の化合物の正確な説明でもない［例えば、参考文献１１１の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される「水酸化物」または「リン酸塩」のいずれかのアジュバントを使用し得る。
【００９９】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、代表的には、アルミニウムのオキシヒドロキシド塩であり、これらは、通常、少なくとも部分的に結晶である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光学によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸収帯および３０９０〜３１００ｃｍ−１における強力なショルダーの存在によって水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物と区別され得る［参考文献１１１の第９章］。
【０１００】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、代表的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、しばしば、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）をまた含む。それらは沈殿によって得られ得、そして沈殿の間の反応条件および濃度は、この塩中のヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、一般に、０．３〜１．２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、厳密なＡｌＰＯ４からヒドロキシル基の存在によって区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃に加熱した場合）は、構造的ヒドロキシルの存在を示す［参考文献１１１の第９章］。
【０１０１】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に０．３と１．２の間、好ましくは０．８と１．２の間、そしてより好ましくは０．９５±０．１である。このリン酸アルミニウムは、一般に、特にヒドロキシリン酸塩については非晶質である。代表的なアジュバントは、０．８４と０．９２の間のＰＯ４／Ａｌ３＋モル比を有する非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇＡｌ３＋／ｍｌで含む。このリン酸アルミニウムは、一般に、粒子状である。この粒子の代表的な直径は、任意の抗原の吸着の後、０．５〜２０μｍの範囲（例えば、約５〜１０μｍ）である。
【０１０２】
リン酸アルミニウムのＰＺＣは、ヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に逆に相関し、そしてこの置換の程度は、沈殿によって塩を調製するために用いられる反応条件および反応物の濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離のリン酸イオンの濃度を変化することによるか（より多くのリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液（ＰＺＣをより塩基性にする）のような緩衝液を添加することにより変更される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０と７．０の間、より好ましくは５．０と６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。
【０１０３】
本発明の組成物を調製するために用いられるリン酸アルミニウム溶液は、緩衝剤を含み得るが（例えば、リン酸塩またはヒスチジンまたはＴｒｉｓ緩衝液）、常に必要なわけではない。このリン酸アルミニウム溶液は、好ましくは、滅菌され、そして発熱物質を含まない。このリン酸アルミニウム溶液は、遊離の水性リン酸イオンを含み得る（例えば、１．０と２０ｍＭの間、好ましくは５と１５ｍＭの間、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する）。このリン酸アルミニウム溶液はまた、塩化ナトリウムを含み得る。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲（例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ）であり、そしてより好ましくは約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在は、抗原の吸着前のｐＨの正確な測定を容易にする。
【０１０４】
アルミニウム塩は、ＨＢＶ抗原および非ＨＢＶ抗原のいずれかの吸着に使用され得る。ＨＢｓＡｇは、好ましくはリン酸アルミニウムアジュバントに吸着される［７０］。ジフテリアトキソイドは、好ましくは水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される。破傷風トキソイドは、好ましくは水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されるが、これは必要ではない（例えば、０〜１０％の間の破傷風トキソイドの吸着が使用され得る）。無細胞性の百日咳抗原、特に６９ｋＤの抗原は、好ましくは水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される。結合体化Ｈｉｂ抗原は、リン酸アルミニウムに吸着され得る［１１２、１１３］か、または吸着され得ない。この方法でのＨｉｂ吸着は、特にＤ−Ｔ−Ｐｗ−Ｈｉｂ−ＨＢｓＡｇ抗原を含むワクチンで有用である。他の結合体化抗原（例えば、髄膜炎菌、肺炎球菌）は、同様にアルミニウム塩（リン酸塩）に吸着され得るか、吸着され得ない［１１４］。ＩＰＶ抗原は、代表的に本発明のプロセスにおいて使用される前にいかなるアジュバントにも吸着されないが、他の成分を起源とするアルミニウムアジュバントに吸着されるようになり得る。
【０１０５】
ＨＢｓＡｇ吸着に関して、リン酸アルミニウムアジュバントは、好ましくはＨＢｓＡｇが添加される水溶液の形態で使用される（ＮＢ：「溶液」として水性リン酸アルミニウムをいうことが標準的であるが、厳密な物理化学的観点から、この塩は、不溶性であり、懸濁液を形成する）。リン酸アルミニウムを必要とされる濃度に希釈し、ＨＢｓＡｇの添加前に同種の溶液を確保することが好ましい。ＨＢｓＡｇの添加前のＡｌ３＋の濃度は、一般的に０ｍｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましいＡｌ３＋濃度は、２ｍｇ／ｍｌと６ｍｇ／ｍｌの間である。
【０１０６】
本発明プロセスにおける使用に関して２つの好ましい成分は：（１）水酸化アルミニウムアジュバントを含む二価のＤ−Ｔ成分；および（２）水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む三価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分である。
【０１０７】
（薬学的組成物）
アジュバントおよび抗原成分に加え、本発明の組成物は、さらなる成分を含有し得る。これらの成分は、種々の供給源を有する。例えば、これらは、製造の間に使用される抗原またはアジュバント成分のうちの１つにおいて存在し得るか、または抗原性成分とは別々に添加され得る。
【０１０８】
本発明の好ましい組成物は、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含有する。
【０１０９】
張度を制御するために、生理的塩（例えば、ナトリウム塩）を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。
【０１１０】
組成物は、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となる。浸透圧モル濃度は、ワクチン接種により引き起こされる痛みに対して影響を有しないことが以前に報告されている［１１５］が、この範囲に浸透圧モル濃度を維持することが、やはり好ましい。
【０１１１】
本発明の組成物は、１つ以上の緩衝液を含有し得る。代表的な緩衝液として：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、代表的に５〜２０ｍＭの範囲で含有される。
【０１１２】
本発明の組成物のｐＨは、一般的に５．０と７．５の間、より代表的には至適安定性のため５．０と６．０の間、または６．０と７．０の間である。それ故本発明のプロセスは、包装前のバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。
【０１１３】
本発明の組成物は、好ましくは、滅菌である。
【０１１４】
本発明の組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準測定）、そして好ましくは用量あたり＜０．１ＥＵを含む）。
【０１１５】
本発明の組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１１６】
任意の水性の包装されたワクチン材料のｐＨは、好ましくは５〜８の間（例えば、５．５と６．５の間）である。
【０１１７】
ＨＢｓＡｇの吸着される性質に起因して、最終のワクチン産物は、濁った外観をもつ懸濁液であり得る。この外観は、微生物汚染が容易に見えず、そのためこのワクチンは、好ましくは抗微生物薬剤を含むことを意味する。これは、このワクチンが複数用量容器に包装される場合、特に重要である。含有物として好ましい抗微生物薬剤は、２−フェノキシエタノールおよびチメロサールである。しかし、本発明のプロセスの間に水銀の保存剤（例えば、チメロサール）を用いないことが好ましい。しかし、本発明の組成物を調製するために用いられる前に、ＨＢｓＡｇが、このような保存剤で処理される場合、痕跡量の存在は避けられないかも知れない。しかし、安全性のために、最終組成物が約２５ｎｇ／ｍｌより少ない水銀を含むことが好ましい。より好ましくは、この最終的なワクチン産物は、検出可能なチメロサールを含まない。これは、一般に、本発明のプロセスにおける添加の前に抗原調製物から水銀保存剤を除去するか、組成物を作製するために用いられる成分の調製の間にチメロサールの使用を避けることによって達成される。
【０１１８】
二価のＤ−Ｔ混合物が本発明のプロセス中に使用される場合、チメロサールを含まないはずである。いくつかの実施形態において、Ｄ−Ｔ混合物は、２−フェノキシエタノールを含み得るが、他の実施形態において、チメロサールと２−フェノキシエタノールの両方を含まない。３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ混合物は、本発明のプロセスの間に使用される場合、２−フェノキシエタノールを含み得ないか、チメロサールを含み得る。
【０１１９】
製造の間に、所望の最終濃度を与えるための成分の希釈は、通常、ＷＦＩ（注射用水）で実施される。
【０１２０】
本発明の組成物中のリン酸アルミニウムの濃度は、Ａｌ３＋によって表され、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌより少ない（例えば、４ｍｇ／ｍｌ以下、３ｍｇ／ｍｌ以下、２ｍｇ／ｍｌ以下、１ｍｇ／ｍｌ以下など）。
【０１２１】
本発明の組成物中の任意の３Ｄ−ＭＰＬの濃度は、好ましくは、２００μｇ／ｍｌより少ない（例えば、１５０μｇ／ｍｌ以下、１２５μｇ／ｍｌ以下、１１０μｇ／ｍｌ以下、１００μｇ／ｍｌ以下）。
【０１２２】
本発明の組成物中のＨＢｓＡｇの濃度は、好ましくは、６０μｇ／ｍｌより少ない（例えば、５５μｇ／ｍｌ以下、５０μｇ／ｍｌ以下、４５μｇ／ｍｌ以下、４０μｇ／ｍｌ以下など）。約２０μｇ／ｍｌの濃度が代表的である。
【０１２３】
本発明の組成物中のジフテリアトキソイドの濃度は、代表的には少なくとも５０ＩＵ／ｍｌである。
【０１２４】
本発明の組成物中の破傷風トキソイドの濃度は、代表的には少なくとも１００ＩＵ／ｍｌである。
【０１２５】
本発明の組成物中のジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドの比は、通常２：１と３：１の間（Ｌｆ単位で測定される）、好ましくは、２．４：１と２．６：１の間、より好ましくは２．５：１である。
【０１２６】
細胞性百日咳抗原が使用される場合、代表的に少なくとも８ＩＵ／ｍｌであり；無細胞性抗原が使用される場合、代表的には用量あたり２５〜７５μｇの間のＰＴ、約２５〜７５μｇの間のＦＨＡ、約１０〜２０μｇの間のペルタクチンである。
【０１２７】
サッカリドとして測定される本発明組成物中のＨｉｂ結合体の量は、代表的には１０μｇ／ｍｌと３０μｇ／ｍｌの間である。
【０１２８】
ＥＵ（Ｅｌｉｓａ単位）で測定されるＨＡＶ抗原の量は、代表的には少なくとも６００ＥＵ／ｍｌである。
【０１２９】
ＩＰＶ抗原の量は、株の血清型に依存する。１型ウイルスに関して組成物は、代表的に約８０ＤＵ／ｍｌ含有する。２型ウイルスに関して組成物は、代表的に約１６ＤＵ／ｍｌを含有する。３型ウイルスに関して組成物は、代表的に約６５ＤＵ／ｍｌ含有する。
【０１３０】
サッカリドとして測定される本発明組成物中の髄膜炎菌結合体の量は、代表的に各々の血清群に関して５μｇ／ｍｌと２５μｇ／ｍｌの間である。
【０１３１】
サッカリドとして測定される本発明組成物中の肺炎球菌結合体の量は、代表的に各々の血清群に関して２μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌの間である。
【０１３２】
本発明の組成物は、好ましくは、患者に０．５ｍｌ用量で投与される。０．５ｍｌ用量に関して、通常の分散（例えば、０．５ｍｌ±０．０５ｍｌ）を含むことが理解される。
【０１３３】
本発明は、個々の用量への包装に適したバルク材料を提供し得、次いで患者に投与するために分配され得る。上に挙げられる濃度は、最終的に包装された用量の代表的な濃度であり、そのためバルクワクチン中の濃度はより高くても良い（例えば、希釈によって最終濃度まで減少され得る）。
【０１３４】
本発明の組成物は、一般に、水溶液形態である。
【０１３５】
（本発明の組成物の包装）
ＨＢｓＡｇとアジュバントを合わせた後、本発明のこのプロセスは、抽出する工程および０．５ｍｌ混合物サンプルを容器に包装する工程を包含し得る。複数回投与の状況に関して、複数回投薬量が抽出され１つの容器に一緒に包装される。
【０１３６】
本発明のプロセスは、使用のためにワクチンを容器に包装するさらなる工程を含み得る。適した容器として、バイアルおよび使い捨てシリンジ（好ましくは滅菌されたもの）が挙げられる。
【０１３７】
本発明の組成物が、バイアルに包装される場合、これらは、好ましくは、ガラスまたはプラスチック材料から作製される。このバイアルは、好ましくは、上記組成物がそれに添加される前に滅菌され得る。ラテックス感受性患者にともなう問題を避けるために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーでシールされる。このバイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそれは、２回以上の用量（「複数回用量」バイアル）例えば、１０回用量を含み得る。複数回用量バイアルを用いる場合、各用量は、厳密な無菌状態下で滅菌ニードルおよびシリンジで引き出されるべきであり、バイアル内容物を汚染することを避けるよう注意をする。好ましいバイアルは、色のないガラスから作製される。
【０１３８】
バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得、シリンジの内容物は、バイアル中に排出され得（例えば、その中で凍結乾燥された物質を再構成するため）、バイアル中の内容物は、シリンジに戻され得る。バイアルからシリンジをはずした後、次いで針は患者に添えられ、組成物が投与され得る。このキャップは、好ましくは、シールまたはカバーの内側に位置され、このシールまたはカバーは、キャップが接触され得る前に取り除かれるはずである。
【０１３９】
上記組成物が、シリンジ中に包装される場合、このシリンジは、通常、それに取り付けられたニードルを有さないが、別個のニードルが組み立ておよび使用のためにシリンジとともに提供され得る。安全ニードルが好ましい。１−インチ２３−ゲージ、１−インチ２５−ゲージおよび５／８−インチ２５−ゲージのニードルが代表的である。シリンジには、その上に内容物のロット番号および使用期限日がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。このシリンジ中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に外れることを防ぐ。これらのシリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単回用量のワクチンを含む。このシリンジは、一般に、先端部キャップを有し、この先端部をニードルの取り付けの前にシールし、そしてこの先端部キャップは、好ましくはブチルゴムから作製される。このシリンジとニードルとが別個に包装される場合、次いでこのニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。Ｇｒｅｙブチルゴムが好ましい。好ましいシリンジは、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で販売されるものである。
【０１４０】
ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）が用いられる場合、ソーダ石灰ガラス製のよりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。
【０１４１】
組成物が容器中に包装された後、この容器は、次いで、配布のための箱内、例えば、厚紙の箱の内側に囲われ得、そしてこの箱は、ワクチンの詳細、例えば、その商標名、ワクチン中の抗原のリスト（例えば、「Ｂ型肝炎組換え体」など）、容器の説明（例えば、「使い捨て予備充填Ｔｉｐ−Ｌｏｋシリンジ」または「１０×０．５ｍｌ単回用量バイアル」）、その用量（例えば、「各々１回の０．５ｍｌ用量を含む」）、警告（例えば、「成人使用のみ」または「小児使用のみ」）、使用期限日、適応症（例えば、「腎不全を有する患者（血液透析前および血液透析患者を含む）のためのすべて公知のサブタイプにより引き起こされるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する能動性免疫、１５歳より上」など）、患者番号などでラベルされる。各箱は、２つ以上の包装されたワクチン、例えば、５または１０の包装されたワクチン（特にバイアルについて）を含み得る。このワクチンがシリンジ中に含まれる場合、この包装物は、シリンジの絵を示し得る。
【０１４２】
ワクチンは、ワクチンの詳細、例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細などを含む印刷物とともに一緒に（例えば、同じ箱中に）包装され得る。これらの指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の場合、直ちに利用できるようにアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【０１４３】
この包装されたワクチンは、好ましくは、２℃と８℃との間で貯蔵される。それは、凍結されるべきではない。
【０１４４】
ワクチンは、製造の間に完全な液体形態（すなわち、すべての抗原性成分が水溶液または懸濁液である）で提供され得るか、またはいくつかの成分が液体形態であり、他の成分が凍結乾燥形態である形態で調製され得る。従って、最終的なワクチンは、混合する時点で２つの成分：（ａ）水性抗原を含む第１の成分；および（ｂ）凍結乾燥された抗原を含む第２の成分を混合することにより即座に調製され得る。この２つの成分は、好ましくは別々の容器（例えば、バイアルおよび／またはシリンジ）にあり、本発明は、成分（ａ）および（ｂ）を含むキットを提供する。この形式は、特に結合体成分、特にＨｉｂおよび／または髄膜炎菌結合体を含むワクチンに有用であり、なぜならこれらは凍結乾燥形態でより安定であり得るからである。従って、結合体は本発明による使用の前に凍結乾燥され得る。さらなる成分がまた、凍結乾燥の前に添加され得る（例えば、安定剤として）。含有するための好ましい安定剤は、乳糖、ショ糖およびマンニトールならびにそれらの混合物（例えば、乳糖／ショ糖混合物、ショ糖／マンニトール混合物など）である。従って、最終的なワクチンは、乳糖および／またはショ糖を含み得る。ショ糖／マンニトール混合物を使用することは、乾燥工程をスピードアップし得る。
【０１４５】
従って、本発明は、２つの容器の組合せワクチンを調製するプロセスを提供し、この方法は、以下の工程：
上に記載される水性の組合せワクチンを調製する工程、しかし上記１つ以上の抗原は、結合体化莢膜サッカリド抗原を含まない；
この組合せワクチンを第１の容器（例えば、シリンジ）に包装する工程；
凍結乾燥の形態で、結合体化莢膜サッカリド抗原を調製する工程；
上記凍結乾燥抗原を第２の容器（例えば、バイアル）に包装する工程；および
第１の容器および第２の容器を一緒にキット中に包装する工程
を含む。
【０１４６】
次いで本キットは、医師に配布され得る。
【０１４７】
Ｄ、Ｔ、ＰおよびＨＢｓＡｇ成分は、好ましくは液体形態である。
【０１４８】
（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、そして本発明は、患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
【０１４９】
本発明はまた、薬剤における使用のための本発明の組成物を提供する。
【０１５０】
本発明はまた、患者への投与のための医薬の製造における（ｉ）本発明に従って発現されたＨＢｓＡｇ；および（ｉｉ）１つ以上の非ＨＢＶ抗原の使用を提供する。
【０１５１】
この発明はまた、患者への投与のための医薬の製造における（ｉ）本発明に従って発現されたＨＢｓＡｇおよび（ｉｉ）水酸化アルミニウム以外のアジュバントの使用を提供する。この医薬は、好ましくは１価のワクチンである。このワクチンを受ける好ましい患者群は、上に挙げられる。
【０１５２】
本発明の免疫原性組成物は、本発明の使用および／または少なくともＢ型肝炎ウイルス感染の処置に関して好ましくはワクチンである。本発明の組成物を受容している患者は、好ましくは第１の免疫から６週目で測定される血清抗ＨＢｓＡｇ ＧＭ力価が５００ｍＩＵ／ｍｌ以上を有する。より好ましくは、１２ヶ月後に測定されたときこの力価が５００ｍＩＵ／ｍｌ以上である。
【０１５３】
十分な効力のために、小児のための代表的な免疫スケジュールは、２回以上の投薬を投与する工程を包含する。例えば、投薬が、０および６ヶ月目（時間０が第１の投薬）；０、１、２および６ヶ月目；０、２１日目および第３の投薬が６ヶ月と１２ヶ月の間；または０、１、２、６および１２ヶ月目であり得る。
【０１５４】
本発明の組成物は、例えば、腕または脚への筋肉内注射により投与され得る。
【０１５５】
本発明により産生されるワクチンは、別の肺炎球菌結合体ワクチン（例えば、ＰｒｅｖｎａｒＴＭ）と同時に患者に投与され得る。
【０１５６】
本発明の組成物が、アルミニウムベースのアジュバントを含む場合、成分の沈殿が貯蔵の間に生じ得る。それ故、この組成物は、患者への投与の前に振盪しなければならない。振盪された組成物は、不透明な白い懸濁液である。
【０１５７】
（好ましいワクチン）
本発明の特異的な多価免疫原性組成物は：
ＨＢｓＡｇおよびＨＡＶを含む２価の組成物。このワクチンは、水性の形態である。水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨｂｓＡｇは、リン酸アルミニウムに吸着される。ＨＡＶは、水酸化アルミニウムに吸着される。１ｍｌあたりの量：約７２０ＥＬＩＳＡ単位ＨＡＶ；約２０μｇ ＨＢｓＡｇ。用量：約１ｍｌ。事前に充填されたシリンジに与えられ得る。
【０１５８】
ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰａおよびＩＰＶを含む五価の組成物。このワクチンは水性形態である。これは、水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇは、リン酸アルミニウムに吸着される。Ｄ、ＴおよびＰａは、水酸化アルミニウムに吸着される。１ｍｌあたりの量：約５０Ｌｆジフテリアトキソイド；約２０Ｌｆ破傷風トキソイド；約５０μｇＰＴ；約５０μｇ ＦＨＡ；約１６μｇペルタクチン；約２０μｇ ＨＢｓＡｇ；約８０ＤＵ １型ポリオウイルス；約１６ＤＵ ２型ポリオウイルス；約６４ＤＵ ３型ポリオウイルス。用量：約０．５ｍｌ。事前に充填されたシリンジに与えられ得る。
【０１５９】
ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰａおよびＩＰＶを含む五価の組成物。このワクチンは水性形態である。これは、水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇは、リン酸アルミニウムに吸着される。Ｄ、ＴおよびＰａは、水酸化アルミニウムに吸着される。１ｍｌあたりの量：少なくとも６０ＩＵジフテリアトキソイド；少なくとも８０ＩＵ破傷風トキソイド；約５０μｇＰＴ；約５０μｇ ＦＨＡ；約１６μｇペルタクチン；約２０μｇ ＨＢｓＡｇ；約８０ＤＵ １型ポリオウイルス；約１６ＤＵ ２型ポリオウイルス；約６４ＤＵ ３型ポリオウイルス。用量：約０．５ｍｌ。事前に充填されたシリンジに与えられ得る。
【０１６０】
ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗを含む四価の組成物。この成分は水性形態である。これは、水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇは、リン酸アルミニウムに吸着される。ＤおよびＴは、水酸化アルミニウムに吸着される。この組成物はチメロサールを含むが、好ましくは２−フェノキシエタノールを含まない。１ｍｌあたりの量：少なくとも６０ＩＵジフテリアトキソイド；少なくとも１２０ＩＵ破傷風トキソイド；少なくとも８ＩＵ Ｐｗ；約２０μｇ ＨＢｓＡｇ。用量：約０．５ｍｌ。
【０１６１】
ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰｗおよびＨｉｂ−Ｔ結合体を含む五価の組成物。このＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗ成分は、水性形態であり；Ｈｉｂ−Ｔは凍結乾燥される。これは、水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＤおよびＴは、水酸化アルミニウムに吸着される。ＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ−Ｔは、リン酸アルミニウムに吸着される。凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔは乳糖を含む。この水性成分は、チメロサールを含み得る。１ｍｌあたりの量：少なくとも６０ＩＵジフテリアトキソイド；少なくとも１２０ＩＵ破傷風トキソイド（それに加えてＨｉｂ−Ｔ中のキャリアとして５〜２５μｇの間の破傷風トキソイド）；少なくとも８ＩＵ Ｐｗ；約２０μｇ ＨＢｓＡｇ；サッカリドとして測定され約５μｇ Ｈｉｂ−Ｔ。用量：約０．５ｍｌ。
【０１６２】
これらの組成物は、別々に使用され得るか、またはさらなるワクチンの成分として使用され得る。例えば、本発明は、上記の五価のＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＩＰＶ組成物に加え凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔ結合体を含む六価の組成物を提供する。この凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔは、好ましくは、アルミニウム塩に吸着されない。本発明はまた、上記の四価のＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ組成物に加え凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔ結合体を含む五価の組成物を提供する。本発明はまた、上記の四価のＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ組成物に加え凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔ結合体、ＭｅｎＡ結合体およびＭｅｎＣ結合体の混合物を含む七価の組成物を提供する。最終的なワクチンは、使用時に水性ＨＢｓＡｇ含有物質を用いて凍結乾燥された物質を再構成することにより調製され得、この凍結乾燥された成分および水性成分は、好ましくは上記のように一緒にキットに包装される。
【０１６３】
本発明の特異的な一価の免疫原性組成物は：
リン酸アルミニウムアジュバントおよび３Ｄ−ＭＰＬアジュバントと組み合わせたＨＢｓＡｇであり、ここでＨＢｓＡｇおよび３Ｄ−ＭＰＬの両方、リン酸アルミニウムに吸着される。１ｍｌあたりの量：約２０μｇ ＨＢｓＡｇ、約５０μｇ ３Ｄ−ＭＰＬ、約０．５ｍｇ Ａｌ３＋。
【０１６４】
本発明の特定のプロセスとしては、以下の工程を含むプロセスが挙げられる：
本発明による発現後のＨＢｓＡｇの精製；リン酸アルミニウムアジュバントにＨＢｓＡｇを吸着させる；水酸化アルミニウムアジュバントを有するチメロサールを含まない二価のＤ−Ｔ混合物を得る；Ｐａ成分としてＰＴ、ＦＨＡおよびペルタクチンを得る；プールされた１型、２型および３型として、好ましくはアルミニウム塩アジュバントなしのＩＰＶ抗原を得る；任意の順番でＤ−Ｔ、Ｐａ、ＩＰＶおよびＨＢｓＡｇを合わせ、最終的な五価の組合せを与える；必要に応じて、シリンジに包装する。
【０１６５】
本発明による発現後のＨＢｓＡｇの精製；リン酸アルミニウムアジュバントにＨＢｓＡｇを吸着させる；水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの、２−フェノキシエタノールを含まずチメロサールを含む三価のＤ−Ｔ−Ｐｗ混合物を得る；Ｄ−Ｔ−ＰｗおよびＨＢｓＡｇを合わせ、最終的な四価の組合せを与え；必要に応じて、シリンジに包装する；必要に応じて凍結乾燥された結合体成分（例えば、Ｈｉｂ−Ｔ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ）と組合せて包装する。
【０１６６】
本発明による発現後のＨＢｓＡｇの精製；リン酸アルミニウムアジュバントにＨＢｓＡｇを吸着する；水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの、２−フェノキシエタノールを含ずチメロサールを含む三価のＤ−Ｔ−Ｐｗ混合物を得る；凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔ結合体を得る；Ｄ−Ｔ−ＰｗおよびＨＢｓＡｇを合わせ、水性の四価の成分を与える；水性の四価の成分をガラスバイアルに包装する；凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔをガラスバイアルに包装する；２つのバイアルを合わせ、再構成のための１つのキットに与えられ、五価の組合せワクチンを与える；このガラスバイアルは、Ｉ型ガラスであり、ゴムのブチルストッパーを有し得る。
【０１６７】
本発明による発現後のＨＢｓＡｇの精製；リン酸アルミニウムアジュバントにＨＢｓＡｇを吸着する；水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの、２−フェノキシエタノールを含まずチメロサールを含む三価のＤ−Ｔ−Ｐｗ混合物を得る；プールされた１型、２型および３型として、好ましくはアルミニウム塩アジュバントなしのＩＰＶ抗原を得る；Ｄ−Ｔ−Ｐｗ、ＩＰＶおよびＨＢｓＡｇを任意の順番で合わせ、最終的な五価の組み合わせを与える；必要に応じて、シリンジに包装する；必要に応じて凍結乾燥された結合体成分（例えば、Ｈｉｂ−Ｔ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ）と組合せて包装する。
【０１６８】
さらなる成分は、任意の段階で加えられ得る（例えば、塩化ナトリウム、アジュバント、保存剤など）。例えば、上記のワクチンを調製するために、これらのプロセスが使用され得る。
【０１６９】
この異なるプロセスの工程は、実質的に同時に実施され得るか、または別々に実施され得る。これらは、同じ場所または異なる場所、異なる国でさえ実施され得る（例えば、ＨＢｓＡｇ発現がＨｉｂ−Ｔ結合体の凍結乾燥と異なる場所で実施され得る）。
【０１７０】
（結合体のためのキャリアタンパク質）
結合体化サッカリド抗原は、キャリアタンパク質を含み、このサッカリドは直接またはリンカーを介してのいずれかでこのキャリアタンパク質に共有結合される。結合体化技術についての一般的な情報は、参考文献１１６に見出され得る。
【０１７１】
種々のタンパク質は、キャリアとしての使用が公知であり、好ましいキャリアタンパク質は、バクテリアトキシンまたはバクテリアトキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。他の適したキャリアタンパク質としては、ジフテリアトキシンのＣＲＭ１９７変異体［１１７−１１９］、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質［１２０］、合成ペプチド［１２１、１２２］、熱ショックタンパク質［１２３、１２４］、百日咳タンパク質［１２５、１２６］、サイトカイン［１２７］、リンホカイン［１２７］、ホルモン［１２７］、成長因子［１２７］、種々の病原体から誘導された抗原由来の複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［１２８］（例えば、Ｎ１９［１２９］）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［１３０、１３１］、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ［１３２］、ニューモライシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）［１３３］、鉄取り込みタンパク質［１３４］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のトキシンＡまたはトキシンＢ［１３５］、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅタンパク質［１３６］などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
キャリアへのサッカリドの結合は、好ましくは−ＮＨ２基（例えば、キャリアタンパク質中のリシン残基の側鎖、またはアルギニン残基の側鎖）を介する。−ＳＨ基への結合（例えば、システインの側鎖）がまた可能である。
【０１７３】
１：５（すなわち、タンパク質過剰）および５：１（すなわち、サッカリド過剰）の間のサッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する結合体が好ましい。
【０１７４】
組成物は、少量の遊離キャリアを含み得る。別個の抗原として含まれるあらゆるキャリアを無視する場合、結合されないキャリアは、好ましくは全体として組成物中のキャリアタンパク質の総量の５％以下であり、より好ましくは２％重量未満である。
【０１７５】
組成物中に１つより多い型のキャリアタンパク質を含むことは可能である（例えば、キャリア抑制の危険を減少させる）。
【０１７６】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ結合体に使用されるこのキャリアタンパク質は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＤタンパク質であり得る。このタンパク質は、参考文献１３７および１３８に詳細に記載され、結合体中キャリアタンパク質としてのその使用は参考文献１３９に記載される。用語「プロテインＤ」は、参考文献１３９に開示されるように天然の完全長タンパク質のフラグメント、および完全長プロテインＤまたはこれらのフラグメントのいずれかを含む融合タンパク質（例えば、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質のフラグメントとプロテインＤのフラグメントとの融合）を含む。これらのフラグメントは、それらに結合体化される場合、Ｔ非依存性のサッカリド抗原をＴ依存性の抗原に変換する能力を保持する。代表的なフラグメントは、プロテインＤのＮ末端の少なくとも１／３を含む。このタンパク質は、都合よくＥ．ｃｏｌｉに発現され得［１３８］、この組換え材料は、本発明での使用に好ましい［１３９］。
【０１７７】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１７８】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１７９】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１８０】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。それ故、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。
【０１８１】
抗原がアジュバントに「吸着される」と記載される場合、少なくとも５０％の抗原が吸着されることが好ましい（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上）。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドは両方とも完全に吸着されることが好ましい（すなわち、上清に検出されない）。ＨＢｓＡｇの完全な吸着がまた好ましい。
【０１８２】
イオン化可能な基は、明細書中の式に示される中性の形態で存在し得るか、または荷電した形態で存在し得る（例えば、ｐＨに依存して）ことが理解される。従って、ホスフェート基は、−Ｐ−Ｏ−（ＯＨ）２として示され得、この式は、単に代表的な中性ホスフェート基であり、他の荷電した形態は、本発明により包含される。同様に、糖環は、開いた形態または閉じた形態で存在し得、閉じた形態は、本明細書中の構造式で示されるが、開いた形態もまた、本発明により包含される。
【０１８３】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から取得しなければならない。
【０１８４】
【化１３】
【実施例】
【０１８５】
（本発明を実施するための様式）
（プラスミドの調製）
プラスミドは、以下の順で種々の要素を含み構成される：酵母ＧＡＰＤＨプロモーター；ＨＢｓＡｇコード配列；酵母ＡＲＧ３転写ターミネーターを含む領域；Ｅ．ｃｏｌｉベクターｐＢＲ３２７由来のＤＮＡ；ＬＥＵ２マーカーを有する酵母ＤＮＡ；Ｅ．ｃｏｌｉベクターｐＢＲ３２７由来のＤＮＡ；酵素２μプラスミド配列；Ｅ．ｃｏｌｉベクターｐＢＲ３２７由来のＤＮＡ。ｐＢＲ３２７配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能的なｏｒｉを含む。このプラスミドは、全体で１４６００ｂｐと１４７００ｂｐの間の長さである。
【０１８６】
ＧＡＰＤＨプロモーター配列は、以下の１０６０−マーを含む（配列番号１）：
【０１８７】
【化１４】
ＨＢｓＡｇコード配列は、以下のとおりであり（配列番号４）、オーカー終止コドンが続く：
【０１８８】
【化１５】
この配列は、以下の配列番号３のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする：
【０１８９】
【化１６】
このＡＲＧ３配列は、以下の６８９−マー配列（配列番号８）を下流領域またはＡＲＧ３由来の付加的な配列と一緒に含む：
【０１９０】
【化１７】
従って、このプラスミドは、発現カセット中、以下の２４３０−マーを含む（配列番号１３）：
【０１９１】
【化１８】
（プラスミドの要素の配列解析）
ＧＡＰＤＨプロモーター配列（配列番号１）は、いくつかの位置で参考文献４１で開示されるＧＡＰＤＨプロモーター配列（配列番号５）と異なる：
【０１９２】
【化１９】
配列番号１を、２００５年４月７日にフィルタリングなしで「すべてのＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ配列（ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、環境サンプルまたは第０相、１相または２相のＨＴＧＳ配列ではない）」に対して検索した。この検索において最大のヒットは、以下のように配列番号１とともに並べる：
【０１９３】
【化２０】
従って、配列番号１は、最も近い適合の逆方向相補体に比較して、２つのヌクレオチドで異なる。
【０１９４】
ＨＢｓＡｇコード配列（配列番号４）を、同様の方法でＧｎｅＢａｎｋ配列に対して解析した。配列番号４は、最も近いデータベース適合（ＡＹ５７６４２６．１）とヌクレオチド３５０（Ａ／Ｇ）でのみ異なる。この違いは、Ｓｅｒ／Ａｓｎコドン変化を生じる。
【０１９５】
このコードされた配列（配列番号３）を、２００５年４月４日に「環境性サンプルを除く非重複性ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ 翻訳＋ＰＤＢ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ＋ＰＲＦ」データベースを使用してフィルタリングなしでＢＬＡＳＴＰにより解析した。配列番号３は、最も近いデータベース適合とアミノ酸１１７で異なり、ＳｅｒよりもＡｓｎを有する。最大のヒットは、エントリーＣＡＡ８４７９２．１（配列番号１０）であった。
【０１９６】
【化２１】
ＡＲＧ３の下流配列（配列番号８）のＢＬＡＳＴＮ解析は、データーベースエントリーＭ２８３０１．１と１００％同一であることを明らかにするが、配列番号８のヌクレオチド７で始まる６８３マーしか重複しない。配列番号８の５’末端での７ヌクレオチドを含むこれら２つの配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを、以下に与える：
【０１９７】
【化２２】
（ＨＢｓＡｇ発現および吸着）
このプラスミドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母（ＤＣ５）のｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｈｉｓ３ ｃａｎ１−１１株を形質変換させるために使用される。この酵母は、精製アミノ酸（ロイシンを除く）ビタミンおよび適した塩を含む合成培地で培養される。発現したＨＢｓＡｇは、細胞の回収、沈降、限外濾過、ゲル浸透、イオン交換、超遠心および脱塩を包含する工程により精製される。
【０１９８】
精製した抗原は、グリコシル化されておらず、実質的に球状粒子の形態が見られ得る（平均直径約２０ｎｍ）。
【０１９９】
等張化生理食塩水中のリン酸アルミニウムの懸濁液は、精製したＨＢｓＡｇ濃縮物と混合される。ｐＨを５．２と６．０の間に調整後、この混合物を攪拌しながら１日、室温に放置する。アジュバントへの抗原の吸着は、このときに実施される。
【０２００】
（一価のワクチン）
一価のワクチンを作製するために、３Ｄ−ＭＰＬを吸着されたＨＢｓＡｇに添加し、２０μｇ／ｍｌの最終ＨＢｓＡｇ濃度を与えるための希釈を、注射用水および滅菌生理食塩水を使用して得る。次いでこの大量のワクチンを、バイアルまたは使い捨てシリンジのいずれかに個々の用量で包装する。
【０２０１】
（多価のワクチン）
組合せワクチンを作製するために、ＤＴＰｗ抗原の混合物をドイツ、マールブルクのＣｈｉｒｏｎ Ｂｅｈｒｉｎｇから得る。この混合物を吸着されたＨＢｓＡｇとともに混合し、四価のワクチン製品を与える。この４価の製品は、それ自身で使用され得るか、または（ａ）リン酸アルミニウムアジュバントに吸着される凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔ結合体または（ｂ）Ｈｉｂ、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣ由来の凍結乾燥された結合体の３価の混合物のいずれかを再構成するために使用され得る。
【０２０２】
本発明は、例系のみによって記載され、改変は、本発明の範囲および精神の中にあるままでもなされ得る。
【０２０３】
【化２３】
【０２０４】
【化２４】
【０２０５】
【化２５】
【技術分野】
【０００１】
明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、タンパク質発現の分野、特にワクチンの調製に使用するためのＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を発現させる工程に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ型肝炎ワクチンは、長年利用されており（例えば、参考文献１（非特許文献１）の１６章を参照のこと）、これらの活性成分はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。最初のＨＢＶワクチンは、ヒトの血液から精製されたＨＢｓＡｇを使用したが、組換え発現されたＨＢｓＡｇを基にしたワクチンが、１９９０年代に広く利用されるようになった。次いで、ＨＢｓＡｇはまた、このワクチンの投与が２つ以上の病原体に対して被験体を同時に免疫し得るように、多価ワクチン（すなわち、２つ以上の病原体由来の免疫原の混合物を含むワクチン）の成分として援用されている。これらの多価ワクチンは代表的にＨＢｓＡｇと少なくとも「ＤＴＰ」（ジフテリア、破傷風および百日咳）抗原を含有する。
【０００４】
最初の一価の組換えＨＢＶワクチン、ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭは、水酸化アルミニウムアジュバントを含有する。もっと最近になって、より最新のアジュバントに基づいた一価のＨＢＶワクチンが利用できるようになった（例えば、ＧＳＫの製品ＦＥＮＤＲＩＸＴＭにおける「ＡＳ０４」アジュバント［２（非特許文献２）］、Ｂｅｒｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈの製品ＳＵＰＥＲＶＡＸＴＭにおけるＲＣ−５２９アジュバント、またはＣｏｌｅｙ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＣＰＧ７９０９のようなＣｐＧオリゴヌクレオチドアジュバント［３（非特許文献３）］の使用）。
【０００５】
ＨＢｓＡｇの組換え発現に関して、種々の系が記載されている。使用された発現宿主として、バクテリア、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＨａｎｅｎｓｕｌａおよびＰｉｃｈｉａ種を含む）、哺乳動物細胞の培養物（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｂｕ３細胞を含む）、昆虫細胞（バキュロウイルスベクターを使用する）および植物細胞（例えば、「食用ワクチン」のために）が挙げられる。
【非特許文献１】Ｖａｃｃｉｎｅｓ、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編、第４版、２００４年、ＩＳＢＮ：０−７２１６−９６８８−０
【非特許文献２】Ｄｅｓｏｍｂｅｒｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ、第２０巻、２００２年、２５９７〜２６０２頁
【非特許文献３】Ｃｏｏｐｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、第２４巻、２００４年、６９３〜７０１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＨＢｓＡｇの組換え発現のため、特に組合せワクチン（ＤＴＰ抗原を含有するような）または新たな一価のＨＢＶワクチンに使用されるＨＢｓＡｇを調製するためにさらに改善された系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（本発明の開示）
組換えＨＢｓＡｇ発現の初期の報告は、Ｅ．ｃｏｌｉ［４〜６］、マウス細胞［７］、ヒト細胞［８］、サル細胞［９］および酵母［１０〜１２］に集中した。しかしながら、もっと最近になって、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ［２５、２６］およびＨａｎｅｎｓｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ［２７、２８］酵母において発現を有するように、組換え植物における発現が広い注目を得ている［１３〜２４］。
【０００８】
これら最新の発現系への動きにもかかわらず、本発明に従って、ＨＢｓＡｇはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現される。種々の選択肢がＨＢｓＡｇの酵母に基づいた発現において利用可能であり、これらとしては酵母種および酵母株、培養条件、発現の制御に使用されるプロモーター、遺伝子終止配列、コドンの使用などの選択が挙げられる。本発明に従って、ＨＢｓＡｇは、ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において発現され、ここでこのプラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む。このプラスミドはまた、代表的に（３）ＬＥＵ２選択マーカー；（４）２μプラスミド配列；および（５）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける機能的な複製起点を含む。
【０００９】
ＨＢｓＡｇは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現され得、ワクチンの製造、特に組合せワクチンおよび新たな一価のＨＢＶワクチンの製造において使用するために精製され得る。この酵母で発現された材料は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ＨＢｓＡｇが免疫抑制の可能性を有し得るという参考文献２９の報告にもかかわらず、これら複合体ワクチンの使用に適している。
【００１０】
（多価ワクチン）
従って、本発明は、多価免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは以下の工程（ａ）本発明のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主における発現後、ＨＢｓＡｇを精製することによりＨＢＶ成分を調製する工程；（ｂ）少なくとも１つの非ＨＢＶ成分を調製する工程；および（ｃ）多価組成物を得るためにＨＢＶおよび非ＨＢＶ成分を混合する工程を包含する。
【００１１】
本発明はまた、（ａ）本発明のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において発現されるＨＢｓＡｇを含むＨＢＶ成分；および（ｂ）少なくとも１つの非ＨＢＶ成分を含む多価の免疫原性組成物を提供する。本組成物はまた、代表的に１つ以上のアジュバントを含有する。
【００１２】
これらの多価組成物は、特に子供においてＨＢＶ病原体および非ＨＢＶ病原体による感染に対して同時に保護するのに有用である。代表的な患者は、０歳であり、出生後６週と９週の間にこの組成物の第１の投薬を受ける。さらに２回または３回の投薬は、代表的には約６〜８週の間隔を与えて投与される。この組成物はまた、別のワクチンの最初の免疫スケジュールを完全にするために使用され得る。本組成物はまた追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）として使用され得る（例えば、１〜１６歳の子供において）。
【００１３】
（一価ワクチン）
本発明はまた、一価の免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは以下の工程（ａ）本発明のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主における発現後、ＨＢｓＡｇを精製することによりＨＢＶ成分を調製する工程；（ｂ）免疫原性組成物を得るためにＨＢｓＡｇをアジュバントと合わせる工程を包含する。このアジュバントは、好ましくは水酸化アルミニウムアジュバントではなく、より好ましくは単にアルミニウム塩アジュバントではない。
【００１４】
本発明はまた、（ａ）本発明のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されたＨＢｓＡｇを含むＨＢＶ成分；および（ｂ）アジュバントを含む一価の免疫原性組成物を提供する。
【００１５】
これらの一価の組成物は、既存のアジュバントワクチン（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）（例えば、ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭ製品）が無効である患者においてＢ型肝炎ウイルス感染に対する保護および／または処置に特に有用である。この組成物が特に適している患者の部分群として；免疫不全の患者；血液透析患者；血液透析前の患者；腎機能不全（ｒｅｎａｌ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を有する患者；腎不全（ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）を有する患者；血液透析と必要とする前の早期腎不全を有する患者；肝移植を待っている（例えば、順番待ちリスト上の）患者；末期の腎不全を有する患者；臓器移植（特に肝移植）を受けた患者（例えば、本発明のワクチンの第１の投薬前６ヶ月間に）；Ｂ型肝炎免疫グロブリン（ＨＢＩｇ）処置を受容する患者（または受けた患者、例えば、本発明のワクチンの第１の投薬前６ヶ月間に）；ＨＬＡ ＤＱ２ハプロタイプを有する患者［３０］；ＨＬＡ ＤＲ３ハプロタイプを有する患者［３０］；ＨＬＡ ＤＲ７ハプロタイプを有する患者［３０］；ＨＬＡ対立遺伝子ＤＱＢ１＊０２０２を有する患者［３１］；ＨＩＶに感染した患者；慢性ＨＢＶ保有者；最近輸血を受けた患者；免疫抑制薬を受容する患者；ＡＩＤＳを患っている患者；腹水を有する患者；肝硬変を有する患者；脳症を有する患者；インターフェロン治療、特にｉｆｎ−αを受容する患者；タバコを吸う患者；葉巻を吸う患者；３０ｋｇ／ｍ２以上のボディマス指数を有する患者；ＨＢｓＡｇワクチンを受けたことがあるがセロコンバージョンしていない患者（例えば、標準的な最初の投薬スケジュール（例えば、ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭの３回投与）後、１０ｍＩＵ／ｍｌより少ない血清抗ＨＢｓＡｇ力価を有する）が挙げられる。
【００１６】
これらの患者は、３０ｍｌ／分より小さいクレアチニンクリアランス速度（通常の健常な範囲が男性において、約１００〜１４０ｍｌ／分、女性において、約９０〜１３０ｍｌ／分である）を有し得る。患者は、好ましくは少なくとも１５歳（例えば１５〜４０歳の間、１５〜６０歳の間、４０〜６０歳の間、または６０歳以上）である。５５歳より上の患者は、いずれの内在する病気にも関わらず、有効に処置され得る。
【００１７】
（Ｂ型肝炎表面抗原）
ＨＢＶビリオンは、外部タンパク質被膜またはカプシドにより囲まれた内部コアからなる。カプシドの主要成分は、「ＨＢｓＡｇ」と呼ばれるタンパク質である。既存のすべてのＢ型ワクチンは、ＨＢｓＡｇを含んでおり、この抗原が正常なワクチン被接種者に投与された場合、ＨＢＶ感染を防ぐ抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を刺激する。
【００１８】
ワクチンの製造に関して、ＨＢｓＡｇは、２つの方法で作製され得る。大量のＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ感染中肝臓で合成され、血流に放出されるので、第１の方法は、慢性Ｂ型肝炎の保有者の血漿から微粒子の形態での抗原を精製する工程を包含する。第２の方法は、組換えＤＮＡ法により、タンパク質を発現させる工程を包含する。本発明を用いて使用するためのＨＢｓＡｇは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母で組換え発現される。
【００１９】
天然のＨＢｓＡｇ（すなわち、血漿を精製した製品）と違って、本発明を用いて使用されるＨＢｓＡｇは、グリコシル化されていない。このＨｂｓＡｇの形態が好ましい。なぜなら免疫原性が高く、血液製品の汚染の危険なしに調製され得るからである。
【００２０】
酵母で発現されるＨＢｓＡｇは、有利なことに、実質的に球状の粒子の形態であり（約２０ｎｍの平均直径）、リン脂質を含む脂質マトリックスを含む。血漿由来のＨＢｓＡｇ粒子と違って、この酵母で発現される粒子は、ホスファチジルイノシトールを含み得る。さらに、この脂質マトリックスは、非イオン性の界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）を含み得、これは、酵母で発現される宿主由来の抗原の精製の間にマトリックス中に組み入れられ得る。ＨＢｓＡｇ精製の開始時の組換え酵母細胞の破壊の間、ポリソルベート２０を使用することは、それをＨＢｓＡｇ粒子に導入し得る１つの方法である。このポリソルベート２０は、代表的に１００μｇのＨＢｓＡｇあたり少なくとも５μｇの重量比で存在する。
【００２１】
公知のすべてのＨＢＶサブタイプは共通の決定因子「ａ」を含んでいる。他の決定因子および副決定因子（ｓｕｂｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）と結合されて、９つのサブタイプ：ａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ−およびａｄｒｑ＋が同定されている。これらのサブタイプに加えて、他の変異体が出現した（例えば、免疫された個体で検出されたＨＢＶ変異体「エスケープ（ｅｓｃａｐｅ）変異体」）。いくつかの研究は、非応答者（例えば、血液透析患者）において大多数の血清がａｄｗ４またはａｄｗ３サブタイプで感染されており（例えば、参考文献３２を参照すると、血清の７５％がａｄｗ４であり、ある血液透析患者群においては８８％まで上昇した；参考文献３３を参照すると、血液透析患者から得られた細かく型決定した（ｓｕｂｔｙｐｅｄ）サンプルの５８％がａｙｗ３であった）、本発明を用いる使用のための最も好ましいＨＢＶサブタイプは、ａｄｗ２サブタイプである。このサブタイプは、参考文献３２の単回血液透析患者、ならびに１９９４年の間カリフォルニアおよびネブラスカ［３４］においておよびその後ブラジル［３５、３６］において血液透析患者の間でほんの少数のＨＢＶ感染の発症において発見されたが、９８％より多い血液透析患者において免疫原性が高く効果的であった。
【００２２】
好ましいＨＢｓＡｇは、以下の２２６マーのアミノ酸配列を有する（配列番号３）：
【００２３】
【化１】
本発明は、配列番号３または配列番号３と１０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の単一アミノ酸置換により異なる配列を使用し得る。
【００２４】
ＨＢｓＡｇコード配列は、以下の６７８マーのヌクレオチド配列であり得る（配列番号４）：
【００２５】
【化２】
ＨＢｓＡｇコード配列の最後のコドンに、好ましくはＴＡＡ終止コドン（オーカー）が続く。
【００２６】
「Ｓ」配列に加えて、表面抗原は、プレＳ配列のすべてまたは一部を含み得る（例えば、プレＳ１および／またはプレＳ２配列のすべてまたは一部）。しかしながら、上に示すようなＳ配列のみの使用が好ましい。
【００２７】
（ＧＡＰＤＨプロモーター）
本発明によると、ＨＢｓＡｇは、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子から、特に酵母ＧＡＰＤＨから上流プロモーターを有するプラスミドを保持するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現される［３７〜４０］。このプロモーターは、その転写を調節するためにＨＢｓＡｇコード配列に連結される。
【００２８】
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼは、解糖酵素であり、そのプロモーターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＨＢｓＡｇの発現を制御するのに特に適していることが発見された［４１］。参考文献４１に開示されるＧＡＰＤＨプロモーターは、以下の１０６１マーの配列を有する（配列番号５）。
【００２９】
【化３】
このプロモーターは、本発明に従って使用され得るが、以下の１０６０マーのヌクレオチド配列（配列番号１）を含むプロモーターを使用することが好ましい。：
【００３０】
【化４】
この配列は、以下：（１）ヌクレオチド４２でＡ／Ｃ置換；（２）ヌクレオチド１９４でＴ／Ａ置換；（３）ヌクレオチド３０１でＣ／Ａ変異；（４）ヌクレオチド４７１でＡの挿入；（５）残基５６９でＣ／Ｔ置換；（６）残基５９７でＴ／Ｃ置換；（７）ヌクレオチド６０４でＴの挿入（４つのＴの代わりに５つのＴ）；および（８）単一のＡでの３’ＧＣＴＴ配列の置換：のように配列番号５とは異なる。
【００３１】
本発明は、配列番号１のプロモーター配列または２０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）の点変異により配列番号１と異なる配列を使用し得、各点変異は１つのヌクレオチドの欠失、置換または挿入である。
【００３２】
この１０６０マー配列は、好ましくはＨＢｓＡｇのＮ末端をコードするＡＴＧ開始コドンのすぐ上流である（配列番号２）。例えば：
【００３３】
【化５】
（ＡＲＧ３ターミネーター）
本発明に従って、ＨＢｓＡｇは、ＡＲＧ３から下流の転写ターミネーターを有するプラスミドを保持するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において発現される。このターミネーターは、その転写を調節するために、ＨＢｓＡｇコード配列に連結される。
【００３４】
酵母のＡＲＧ３遺伝子は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ酵素をコードし［４２］、その転写終止配列は、種々の酵母組換え発現系において使用されている［４３〜４５］。これは酵母におけるＨＢｓＡｇ発現の制御、特にＧＡＰＤＨプロモーターとの組合せで有用である。
【００３５】
ＡＲＧ３終止コドンのすぐ下流の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ エントリーＧＩ：１７１０７６に開示されるように、以下の４５０マーである（配列番号６）：
【００３６】
【化６】
このコード配列のさらに後方に２５０ヌクレオチド延ばした場合、このＡＲＧ３遺伝子は、以下の７００マー配列を含む（配列番号７）：
【００３７】
【化７】
配列番号７の転写終止は、下線のＳａｃＩＩ部位の領域で起こる。本発明による使用のために好ましいターミネーターは、コード配列およびＡＲＧ３領域から下流の配列の両方のある部分を含み、特に以下の６８９マーのヌクレオチド配列を含み（配列番号８）、これは配列番号７と同じ３’末端を有する。
【００３８】
【化８】
この配列は、５’末端近くのＥｃｏＲＩ部位（下線）を有用に含み、これは所望される位置へのターミネーターの挿入を容易にする。
【００３９】
さらに、ＡＲＧ３から下流のターミネーター配列がまた存在し得る。ＡＲＧ３から１５００ヌクレオチドまで（すなわち、配列番号７のさらに８００ヌクレオチド下流まで）が含まれ得る（例えば、１２００ヌクレオチドまで、または約１１５０ヌクレオチド）。
【００４０】
本発明は、配列番号８のターミネーター配列または３０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０）の点変異により配列番号８と異なる配列を使用し得、各点変異は１つのヌクレオチドの欠失、置換または挿入である。
【００４１】
６８９マー配列は、好ましくはＨＢｓＡｇのＣ末端で終止コドンのすく下流である（配列番号９）。例えば、
【００４２】
【化９】
（プラスミド）
ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびＡＲＧ３ターミネーターはすべて同じプラスミドの一部として作動的に連結される。本発明のプラスミドはまた、代表的に以下の要素の１つ、２つまたは（このましくは）３つすべてを含む：ＬＥＵ２選択マーカー；２μプラスミド配列；およびＥ．ｃｏｌｉにおける機能的な複製起点。これら３つの構成要素は、以前にＨＢｓＡｇ発現に使用されたプラスミドにおいて示されている［４５］。
【００４３】
ＬＥＵ２選択マーカーは、しばしば酵母遺伝学において使用される。ＬＥＵ２は、３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼをコードし、これはロイシン生合成経路における３番目の酵素である。プラスミドのＬＥＵ２マーカーは、代謝前駆体からロイシンを合成する能力を与え、ロイシン栄養要求株（例えばＬＥＵ２ヌル変異体）である宿主細胞において使用される。従って、このＬＥＵ２マーカーは、通常ロイシン供給なしでは成長できないロイシン栄養要求株を、ロイシン非存在下で成長させることが可能である。
【００４４】
２μプラスミド配列はまた、酵母遺伝学においてよく知られており［４６］、プラスミドのコピー数を増加させるのに使用される。任意の適した２μプラスミド配列は、本発明のプラスミドにおいて使用され得る。このプラスミドは、酵母の複製起点を含み、これは代表的には２μ配列で提供される。
【００４５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能する複製起点を含むことにより、プラスミドは、酵母とＥ．ｃｏｌｉの間のシャトルベクターとして働き得、それにより便宜的にＥ．ｃｏｌｉ系においてプラスミドの操作を可能にする。
【００４６】
従って、発明は以下の要素を含むプラスミドを提供する：（１）ＨＢｓＡｇコード配列；（２）ＨＢｓＡｇコード配列の上流でＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子からのプロモーター；および（３）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーター。このプラスミドはまた、以下の要素を含み得る：（４）ＬＥＵ２選択マーカー；（５）２μプラスミド配列；および（５）Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能的な複製起点。このＨＢｓＡｇコード配列は、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３と１０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の単一アミノ酸置換により異なる配列をもつＨＢｓＡｇをコードする。ＧＡＰＤＨプロモーター配列は、好ましくは配列番号１または２０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）の点変異により配列番号１と異なる配列を含む。ＡＲＧ３ターミネーターは、好ましくは配列番号８または２０個まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）の点変異により配列番号８と異なる配列を含む。このプラスミドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において維持され得、ＨＢｓＡｇの発現に使用され得る。
【００４７】
１４５００と１５０００ｂｐの間のプラスミドが好ましい（例えば、１４６００と１４７００ｂｐの間）。
【００４８】
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、組換え発現のために広く使用される酵母である。任意の適したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主は、本発明を用いて使用され得る。しかしながら、ＬＥＵ２選択マーカーがプラスミドにおいて使用され得るように、ロイシン要求株である宿主を使用することが好ましい。この宿主細胞は、ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２変異体であり得る。
【００４９】
さらに好ましい酵母宿主の特徴は、ｈｉｓ３および／またはｃａｎ１−１１である。最も好ましい酵母宿主は、ＤＣ５株のようなｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｈｉｓ３ ｃａｎ１−１１である。
【００５０】
本発明は、本発明のプラスミドを保持する酵母を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の製造における酵母の使用を提供する。
【００５１】
（ＨＢｓＡｇ発現および精製）
組換えタンパク質発現のための酵母培養技術は、当該分野において周知である。酵母は、合成培地において培養され得る（例えば、精製されたアミノ酸（代表的には、ＬＥＵ２マーカーを用いる場合ロイシンを除去した）、ビタミン、塩などを含む）。次いでＨＢｓＡｇは、沈降、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過のような工程を含むプロセスにより精製され得る。この精製の間に使用され得る他の工程として、ゲル透過クロマトグラフィーおよび塩化セシウム超遠心が挙げられる。
【００５２】
精製プロセスすべてに包含されるために特に好ましい工程は、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００あるいはポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ポリソルベート８０としても公知）またはより好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０としても公知）のようなポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル）の存在下における細胞破砕の工程である。次いでこの破砕された細胞は、ＨＢｓＡｇが認められる上清を得るために遠心され得る。次いでこのタンパク質は、上清から精製される（例えば、参考文献４７に開示されるプロセスを使用して）。
【００５３】
精製後、ＨＢｓＡｇは、透析にかけられ得（例えば、システインを用いて）、これはＨＢｓＡｇ調製の間使用され得るチメロサールのような任意の水銀の保存剤を除去するために使用され得る［４８］。
【００５４】
本発明に従って発現され精製されたＨＢｓＡｇは、さらに非ＨＢＶ抗原と合わされ得、多価ワクチンを調製するか、または新規のアジュバントと合わされ得、改善された一価のワクチンを調製する。
【００５５】
（一価の免疫原性組成物）
本発明に従って発現され、精製されたＨＢｓＡｇは、新しいアジュバントと合わされ得、改善された１価のワクチンを調製する。１価のＨＢＶワクチンにおける使用に関して関心がもたれる３つの特異的アジュバントは：ＣｐＧオリゴヌクレオチド；アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体；およびアルミニウム塩と３ｄ−ＭＰＬとの混合物である。
【００５６】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドアジュバントは、ＣｐＧモチーフ（グアノシンが続く非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含むバクテリアの二本鎖ＲＮＡあるいはオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激を示す。ＣｐＧ’は、ヌクレオチド改変体／ヌクレオチドアナログ（例えば、ホスホロチオアート改変体）を含み得、二本鎖または一本鎖であり得る。必要に応じて、グアノシンは、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンのようなアナログで置換され得る。参考文献４９〜５１は、可能なアナログ置換の例を与える。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、さらに参考文献５２〜５７で議論される。
【００５７】
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴ（配列番号１１）またはＴＴＣＧＴＴ（配列番号１２）のようなＴＬＲ９に関し得る［５８］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ）か、またはＢ細胞応答の誘導により特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献５９〜６１で議論される。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【００５８】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端がレセプター認識可能なように構成される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は「イムノマー」を形成するために３’末端で結合され得る。例えば、参考文献５８および６２〜６４を参照のこと。
【００５９】
アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）誘導体は、ＲＣ−５２９を含み［６５〜６８］、これはＣｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより販売されるアミノアルキルグルコサミニド４ホスフェートである。
【００６０】
ＡＳ０４は、アルミニウム塩アジュバントと３Ｄ−ＭＰＬアジュバントとの混合物である［６９］。ＡＳ０４を使用する場合、ＨＢｓＡｇは、好ましくはアルミニウム塩に吸着される（例えば、参考文献７０に記載されるように）。アルミニウム塩はリン酸塩であり、総ＨＢｓＡｇの少なくとも５０％（重量で）（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上またはそれ以上）がリン酸アルミニウムに吸着されることが好ましい。吸着される割合は、吸着された物質を吸着されていない物質と分けること（例えば遠心により、アルミニウム吸着された抗原は容易にペレットを形成する一方で、吸着されなかった抗原は上清に残る）により都合よく測定され得る。上清中のＨＢｓＡｇの量（例えば、抗−ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡにより測定される）は、組成物中のＨＢｓＡｇの総量から引かれ得、次いで、吸着した割合が計算され得る。ＨＢｓＡｇは完全に吸着されること（すなわち、上清に検出されない）が好ましい。
【００６１】
この３Ｄ−ＭＰＬアジュバントはまた、リン酸アルミニウムに吸着され得る。好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬの少なくとも５０％（重量で）（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上またはそれ以上）が吸着される。吸着される割合は、ＨＢｓＡｇと同様の方法で測定され得る。５０μｇ／ｍｌの総３Ｄ−ＭＰＬ濃度を有する組成物において、吸着されない３Ｄ−ＭＰＬの濃度は、２５μｇ／ｍｌ未満（例えば、２０μｇ／ｍｌ以下、１５μｇ／ｍｌ以下、１０μｇ／ｍｌ以下、５μｇ／ｍｌ以下、２０μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下など）であるべきである。
【００６２】
リン酸アルミニウムアジュバントはより詳細に以下に記載される。
【００６３】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）はまた、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリルリピドＡと称される。この名前は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの位置３が脱アシル化されることを示す。それは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトースのない（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）改変体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そしてＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含む数種のサイトカインの放出を刺激する。３Ｄ−ＭＰＬの調製は、最初は参考文献７１に記載され、そしてその産物は、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって、商標名ＭＰＬＴＭの下で製造および販売されている。さらなる詳細は参考文献７２〜７５に見出され得る。この３Ｄ−ＭＰＬは、トリエタノールアミン、トリエチルアンモニウムまたはトリエチルアミンイオンと組み合わせて含まれ得る。
【００６４】
３Ｄ−ＭＰＬは、それらのアシル化によって変動する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５または６のアシル鎖を有する）関連分子の混合物の形態をとり得る。２つの２−デオキシ−２−アミノ−グルコース単糖は、それらの２位の炭素（すなわち、２位および２’位）でＮ−アシル化され、そしてまた３’位でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は以下に示される：
【００６５】
【化１０】
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましく８〜１６の間であり、より好ましくは９〜１２の間であり、そして最も好ましくは１０である。
【００６６】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は各々独立して：（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４であり得、ここでＲ４は−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ここでｍの値は、好ましくは８〜１６の間であり、そしてより好ましくは１０、１２または１４である。２の位置では、ｍは好ましくは１４である。２’位置では、ｍは好ましくは１０である。３’位置では、ｍは好ましくは１２である。基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は従って好ましくはドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。
【００６７】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈであるとき、上記３Ｄ−ＭＰＬは３つのアシル鎖のみを有する（２、２’および３’位の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’の２つのみが−Ｈである場合、上記３Ｄ−ＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’の１つのみが−Ｈである場合、上記３Ｄ−ＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれもが−Ｈではない場合、上記３Ｄ−ＭＰＬは、６つのアシル基を有し得る。本発明に従って用いられる３Ｄ−ＭＰＬアジュバントは、３〜６つのアシル鎖を備えたこれらの形態の混合物であり得るが、この混合物中に６つのアシル鎖をもつ３Ｄ−ＭＰＬを含むことが好ましく、そして特に６つのアシル鎖形態が総３Ｄ−ＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上またはさらに多くを占めることが好ましい。６つのアシル鎖を備えた３Ｄ−ＭＰＬは、最もアジュバント活性な形態であることが見出された。
【００６８】
従って、本発明の組成物に含めるために３Ｄ−ＭＰＬの最も好ましい形態は、以下に示される式（ＩＩ）を有する。
【００６９】
水性条件では、３Ｄ−ＭＰＬは、異なるサイズを備えた、例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを備えたミセル凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方は、本発明とともに用いられ得、そしてより良好な粒子が通常のアッセイによって選択され得る。より小さな粒子（例えば、３Ｄ−ＭＰＬの透明な水性懸濁物を与えるに十分小さい）が、より優れていることが報告され［７６］、本発明に従う使用に好ましい。好ましい粒子は、２２０ｎｍより小さい、より好ましくは２００ｎｍより小さい、１５０ｎｍより小さい、あるいは１２０ｎｍより小さい平均直径を有する。１００ｎｍより小さい平均直径を有しさえし得る。しかしながら、大部分の事例では、この平均直径は、５０ｎｍより小さくはない。
【００７０】
３Ｄ−ＭＰＬがリン酸アルミニウムに吸着される場合、３Ｄ−ＭＰＬ粒子サイズを直接測定することは可能ではないかも知れないが、粒子サイズは、吸着が起こる前に測定され得る。
【００７１】
粒子直径は、動的光散乱の通常の技法によって評価され得、これは、平均粒子直径を示す。粒子がｘｎｍの平均直径を有するといわれる場合、一般的にはほぼこの平均の粒子の分布が存在するが、粒子の数で少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれより多く）がｘ±２０％の範囲内の直径を有する。
【００７２】
【化１１】
（多価免疫原性組成物）
本発明に従って発現され、精製されたＨＢｓＡｇは、１つ以上の非ＨＢＶ抗原と合わされ得、多価ワクチンを調製する。この非ＨＢＶ抗原は、バクテリア抗原および／またはウイルス抗原を含み得る。本発明に従う使用のための代表的な非ＨＢＶ成分として、
ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）
破傷風トキソイド（「Ｔ」）
百日咳抗原（「Ｐ」）（細胞性（「ｗＰ」）あるいは無細胞性（「ａＰ」）のどちらであってもよい）
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原
結合体化Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型莢膜サッカリド（「Ｈｉｂ」）
不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）
結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清群Ｃ莢膜サッカリド（「ＭｅｎＣ」）
結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清群Ａ莢膜サッカリド（「ＭｅｎＡ」）
結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド（「ＭｅｎＷ１３５」）
結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清群Ｙ莢膜サッカリド（「ＭｅｎＹ」）
結合体化Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 莢膜サッカリド
麻疹ウイルス抗原
ムンプスウイルス抗原
風疹ウイルス抗原
水痘−帯状疱疹ウイルス抗原
インフルエンザウイルス抗原
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
２つ以上のこれら非ＨＢＶ抗原が使用され得る。以下の抗原の組合せが特に好ましい。
【００７４】
２価のワクチン：ＨＢＶ−ＨＡＶ；ＨＢＶ−Ｈｉｂ
３価のワクチン：ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ
４価のワクチン：ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ
５価のワクチン：ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ−Ｈｉｂ；ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ−ＩＰＶ
６価のワクチン：ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ−Ｈｉｂ−ＩＰＶ
７価のワクチン：ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＡ−ＭｅｎＣ；ＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐ−Ｈｉｂ−ＩＰＶ−ＭｅｎＣ。
【００７５】
ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）は、参考文献１の１３章により詳細に開示される。好ましいジフテリアトキソイドは、ホルムアルデヒド処理により調製される。このジフテリアトキソイドは、ウシの抽出物を添加し得る増殖培地（例えば、Ｆｅｎｔｏｎ培地またはＬｉｎｇｇｏｕｄ ＆ Ｆｅｎｔｏｎ培地）中でＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅを成長させ、続いてホルムアルデヒドで処理し、限外濾過および沈降させることにより得られ得る。次いでこのトキソイド化した物質は、滅菌濾過および／または透析を包含する工程により、処理され得る。ジフテリアトキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で示され得る。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｏｉｄ Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ １９９９」［７７、７８]を提供し、これは、アンプルあたり１６０ ＩＵを含む。ＩＵ系の代替として、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」または「凝集限界量」）は、１国際単位の抗毒素を用いて混合した場合、最適の凝集混合物を産生するトキソイドの量として定義される［７９］。例えば、ＮＩＢＳＣは１アンプルあたり３００ＬＦを含む「Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｏｉｄ， Ｐｌａｉｎ」［８０］を提供し、そしてまた１アンプルあたり９００Ｌｆを含む「Ｔｈｅ １ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｆｏｒ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｏｉｄ Ｆｏｒ Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ」［８１]を提供する。
【００７６】
破傷風トキソイド（「Ｔ」）は、参考文献１の第２７章により詳細に開示される。好ましい破傷風トキソイドは、ホルムアルデヒドで処理されたものである。破傷風トキソイドは、増殖培地（例えば、ウシのカゼイン由来のＬａｔｈａｍ培地）中Ｃ．ｔｅｔａｎｉを成長させ、その後ホルムアルデヒド処理、限外濾過および沈降させることにより得られ得る。次いでこの物質は、滅菌濾過および／または透析を含むプロセスにより処理され得る。破傷風トキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で表わされ得る。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｏｉｄ Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ２０００」［８２、８３］を提供し、これは１アンプルあたり４６９ＩＵを含む。ＩＵ系の代替として、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」または「凝集限界量」）は、１国際単位の抗毒素を用いて混合した場合、最適の凝集混合物を産生するトキソイドの量として定義される［７９］。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｔｈｅ １ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｏｉｄ Ｆｏｒ Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ」［８４]を提供し、これは１アンプルあたり１０００Ｌｆを含む。
【００７７】
百日咳抗原（「Ｐ」）は、細胞性（「ｗＰ」）または無細胞性（「ａＰ」）のいずれかであり得る。細胞性百日咳抗原は、代表的に不活性化されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞の形態をとる。細胞性百日咳抗原の調製は、よくまとめられており（例えば、参考文献１の第２１章を参照のこと）、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのフェーズＩの培養物の熱不活化により得られ得る。ｗＰ抗原の量は、国際単位（ＩＵ）で示され得る。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｆｏｒ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ」［８５］を提供し、これは１アンプルあたり４６ＩＵを含む。各アンプルは、８リットルのＭ／１５ Ｓｏｒｅｎｓｅｎ’ｓ緩衝液ｐＨ７．０で希釈された１０リットルのバクテリア懸濁液（Ｕ．Ｓ． Ｏｐａｃｉｔｙ Ｓｔａｎｄａｒｄに換算して１８０不透明度単位（Ｏｐａｃｉｔｙ Ｕｎｉｔ）に等しい）を含んだ水溶液の２．０ｍｌアリコートの凍結乾燥残渣を含む。ＩＵ系の代替として「ＯＵ」単位（「不透明度単位」）がまた使用される（例えば、４ＯＵが約１ＩＵであり得る）。近年ワクチンに使用されるＡｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原は、百日咳トキソイド（ＰＴ）、線状ヘム凝集素（ＦＨＡ）、ペルタクチン（「６９キロダルトン外膜タンパク質」としても公知）および采（例えば、凝集原２および３）を含む。本発明は、好ましくはＰＴ、ＦＨＡおよびペルタクチンのうちの少なくとも２つ、好ましくは３つすべてを使用する（すなわち、采を使用しない）。これら３つの抗原は、好ましくは改変されたＳｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ液体培地で増殖させたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養物からの単離により調製される。ＰＴおよびＦＨＡは、発酵培養液から単離され得る（例えば、ヒドロキシアパタイトゲルへの吸着により）一方、ペルラクチンは、熱処理および凝集（例えば、塩化バリウムを使用する）により、細胞から抽出され得る。この抗原は、継続的なクロマトグラフィー工程および／または沈降工程で精製され得る。ＰＴおよびＦＨＡは、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーにより精製され得る。ペルトラクチンは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーにより精製され得る。ＦＨＡおよびペルラクチンは、本発明に従って使用される前にホルムアルデヒドで処理され得る。ＰＴは好ましくは、ホルムアルデヒドおよび／またはグルタルアルデヒドで処理され解毒される。化学的解毒手順の代替として、ＰＴは、酵素活性が突然変異により減少されたＰＴ変異体であり得る［８６］が、化学的処理による解毒が好ましい。無細胞の百日咳抗原の量は、代表的にマイクログラムで表わされる。
【００７８】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）ワクチンは、参考文献１の１５章に開示される。好ましいＨＡＶ成分は不活性ウイルスに基づいており、不活性化は、ホルマリン処理により達成され得る。ウイルスは、ヒト胎児肺二倍体線維芽細胞（例えば、ＭＲＣ−５細胞）で増殖され得る。好ましいＨＡＶ株は、ＨＭ１７５であるが、ＣＲ３２６Ｆがまた使用され得る。この細胞は、ウイルスの増殖を可能にする条件下で増殖される。この細胞を溶解し、得られた懸濁液を限外濾過およびゲル透過クロマトグラフィーで精製され得る。
【００７９】
ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ 莢膜サッカリド（「Ｈｉｂ」）結合体は、参考文献１の第１４章に、より詳細に開示される。このＨｉｂ莢膜サッカリドは、その免疫原性を特に子供において増強するためにキャリアタンパク質に結合体化される。ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、血清群Ｂ髄膜炎菌に由来する外膜タンパク質複合体、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤまたは破傷風トキソイドを含む種々のキャリアタンパク質が使用され得る。破傷風トキソイドは好ましいキャリアであり、製品中に使用される場合、一般に「ＰＲＰ−Ｔ」と呼ばれる。ＰＲＰ−Ｔは、臭化シアンを使用するＨｉｂ莢膜ポリサッカリドを活性化し、活性化したサッカリドをアジピン酸リンカー（例えば、（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、代表的には塩酸塩）に結合し、次いでリンカー−サッカリドの実体を破傷風トキソイドキャリアタンパク質と反応させることにより作製され得る。Ｈｉｂ結合体のサッカリド部分は、Ｈｉｂバクテリアから調製されるような全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）を含み得、そして／または全長ＰＲＰの断片を含み得る。サッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）が１：５（すなわち、過剰なタンパク質）と５：１（すなわち、過剰なサッカリド）の間にある結合体が使用され得る（例えば、１：２と５：１の間の比および１：１．２５と１：２．５の間の比）。好ましい結合体において、サッカリドとキャリアタンパク質の重量比は、１：２．５と１：３．５の間である。破傷風トキソイドが抗原およびキャリアタンパク質の両方として存在するワクチンにおいて、結合体中のサッカリドとキャリアタンパク質の重量比は、１：０．３と１：２の間であり得る［８７］。このＨｉｂ結合体の投与は、好ましくは０．１５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１μｇ／ｍｌ以上の抗ＰＲＰ抗体濃度を生じ、これらは標準の受容可能な反応の閾値である。
【００８０】
不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）は、参考文献１の第２４章に、より詳細に開示される。ポリオウイルスは、細胞培養物中で成長され得、好ましい培養物は、サルの腎臓由来のＶｅｒｏ細胞株を使用する。Ｖｅｒｏ細胞は、都合よく培養されたミクロキャリアであり得る。成長後、ビリオンは、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）およびクロマトグラフィのような方法を使用して精製され得る。患者に投与する前に、ポリオウイルスは不活化されなければならず、これはホルムアルデヒドで処理することにより達成され得る。ポリオは、３つの型のポリオウイルスのうちの１つにより引き起こされ得る。この３つの型は類似しており、同一の症状を引き起こすが、これらは免疫原性的に非常に異なっており、１つの型による感染は他の型による感染に対して予防しない。それ故、本発明において、３つのポリオウイルス抗原：１型ポリオウイルス（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ株）、２型ポリオウイルス（例えば、ＭＥＦ−１株）および３型ポリオウイルス（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ株）の使用が好ましい。これらウイルスは、好ましくは個々に成長させ精製し、そして不活化し、次いで合わされ、本発明による使用のために大量の３価の混合物を得る。ＩＰＶの量は、代表的に「ＤＵ」単位（「Ｄ−抗原単位」［８８］）で表わされる。
【００８１】
結合体化髄膜炎菌抗原は、キャリアタンパク質に結合体化されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜サッカリド抗原を含む。血清群Ｃに対する結合体ワクチンが、ヒト使用に関して認可されており、それには、ＭＥＮＪＵＧＡＴＥＴＭ［８９］、ＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣＴＭおよびＮＥＩＳＶＡＣ−ＣＴＭが挙げられる。血清群Ａ＋Ｃに由来する結合体の混合物が、公知であり［９０、９１］、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙに由来する結合体の混合物が、報告され［９２〜９５］、２００５年にＭＥＮＡＣＴＲＡＴＭ製品として認可された。本発明に使用される髄膜炎菌サッカリドは、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうちの１つ以上に由来し得る（例えば、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ）。少なくとも血清群Ｃのサッカリドを使用することが好ましく、血清群ＡおよびＣの両方由来のサッカリドを使用することが好ましい。ＭＥＮＪＵＧＡＴＥＴＭおよびＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣＴＭ製品は、ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質を使用し、このキャリアはまた、本発明に従って使用され得る。ＮＥＩＳＶＡＣ−ＣＴＭ製品は、破傷風トキソイドキャリアタンパク質を使用し、そしてこのキャリアはまた、本発明に従って使用され得、同様に、ジフテリアトキソイドを使用し得る。髄膜炎菌結合体のための特に好ましいキャリアタンパク質は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤであり、これは既存の認可された結合体ワクチンのいずれにも存在しない。この結合体のサッカリド部分は、髄膜炎菌から調製されるような全長サッカリドを含み得、そして／または全長サッカリドの断片を含み得る。血清群Ｃサッカリドは、ＯＡｃ＋またはＯＡｃ−株のいずれかから調製され得る。血清群Ａサッカリドに関して、好ましくは少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上）のマンノサミン残基がＣ−３位でＯ−アセチル化される。サッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）が１：１０（すなわち、過剰なタンパク質）と１０：１（すなわち、過剰なサッカリド）の間にある髄膜炎菌結合体が使用され得る（例えば、１：５と５：１の間の比、１：２．５と２．５：１の間の比または１：１．２５と１．２５：１の間の比）。結合体の投与は、好ましくは関連血清群に関して少なくとも４倍、好ましくは少なくとも８倍の血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）力価の増加を生じる。ＳＢＡ力価は、胎児のウサギの補体またはヒトの補体を使用して測定され得る［９６］。
【００８２】
結合体化肺炎球菌抗原は、キャリアタンパク質に結合体化されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の莢膜サッカリド抗原を含む［例えば、参考文献９７〜９９］。１つよりも多くの血清型のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するサッカリドを含むことが、好ましく、２３種の異なる血清型に由来するポリサッカリドの混合物が、広範に使用され、同様に、５種〜１１種の異なる血清型に由来するポリサッカリドを含む結合体ワクチンも、広範に使用される［１００］。例えば、ＰｒｅｖＮａｒＴＭ［１０１］は、７種の血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ）に由来する抗原を含み、各サッカリドは、還元的アミノ化によってＣＲＭ１９７に個別に結合体化されており、０．５μｌ用量あたり各サッカリド２μｇ（４μｇの血清型６Ｂ）であり、結合体は、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている。本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも血清型６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆを含む。さらに血清型は、好ましくは１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖおよび１８Ｃから選択される。
【００８３】
麻疹ウイルス、ムンプスウイルスおよび風疹ウイルスに対して予防するための抗原は、代表的には生ウイルスであり、公知の１価のワクチンおよび３価のワクチン（「ＭＭＲ」）が見出されている。麻疹ウイルスワクチンは、参考文献１の第１９章に、より詳細に記載される。ムンプスウイルスワクチンは、参考文献１の第２０章に、より詳細に記載される。風疹ウイルスワクチンは、参考文献１の第２６章に、より詳細に記載される。代表的な風疹ウイルス株として、Ｍｏｒａｔｅｎ；Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ；Ｓｃｈｗａｒｚ；Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ−Ｚａｇｒｅｂ；ＣＡＭ−７０；ＡＩＫ−Ｃ；ＴＤ９７；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−１６；Ｓｈａｎｇｈａｉ−１９１などが挙げられる。Ｓｃｈｗａｒｚ株およびＭｏｒａｔｅｎ株がＵＳＡおよびヨーロッパにおいて最も一般的に使用される。代表的なムンプスウイルス株として、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ；ＲＩＴ ４３８５；Ｕｒａｂｅ；Ｈｏｓｈｉｎｏ；Ｒｕｂｉｎｉ；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−３；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−Ｚａｇｒｅｂ；Ｍｉｙａｈａｒａ；Ｔｏｒｉｉ；ＮＫＭ−４６；Ｓ−１２などが挙げられる。Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株、ＲＩＴ４３８５株、Ｕｒａｂｅ株およびＬｅｎｉｎｇｒａｄ−Ｚａｇｒｅｂ株は、最も一般的な世界的な株である。代表的な風疹ウイルス株として、ＲＡ２７／３；Ｍａｔｓｕｂａ；ＴＣＲＢ １９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ；Ｍａｔｓｕｕｒａ；ＴＰ−３３６などが挙げられる。ＲＡ２７／３株が西欧側世界で使用される最も一般的な株である。
【００８４】
水痘に対する予防のためのＶＺＶ抗原は、代表的に生ウイルスであり、このウイルスのＯｋａ株に基づいている。ＶＺＶワクチンは、参考文献１の第２８章に、より詳細に記載される。
【００８５】
インフルエンザウイルス抗原は、参考文献１の第１７章および第１８章に、より詳細に記載される。概して、インフルエンザウイルスワクチンは、生ウイルスまたは不活化ウイルスに基づき得、不活化ワクチンは、完全なウイルスの「スプリット」ウイルスまたは精製された表面抗原（血液凝集素およびノイラミニダーゼを含む）に基づき得る。ワクチンを調製するために使用されるウイルスは、卵または細胞培養物のいずれかで成長され得る。インフルエンザウイルスのワクチン株は、季節から季節へと変化する。最近の大流行の間の期間において、ワクチンは、代表的に２つのインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのインフルエンザＢ株を含み、３価のワクチンが代表的である。本発明はまた、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株（特にインフルエンザＡ株ウイルス）のような流行株由来のウイルスを使用し得（すなわち、ワクチンの受容者および一般的ヒト集団に対する株は、免疫原性的にナイーブである）、流行株に対するインフルエンザワクチンは、１価であり得るか、または流行株により補われた通常な３価のワクチンに基づき得る。このインフルエンザウイルスは、再集合体株であり得、逆方向遺伝学技術により得られ得る。このウイルスは、弱毒化され得る。このウイルスは、温度感受性であり得る。このウイルスは、低温適応性であり得る。
【００８６】
多価の組合せを作製する場合、抗原は連続して個々に組合せられ得るか、またはそれらはあらかじめ混合され、一緒に添加され得る。例えば、４価のＤＴＰ−ＨＢｓＡｇワクチンは、ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰ抗原の容器への連続的な添加を含むプロセス、またはＤ、ＴおよびＰ抗原をあらかじめ混合し、次いでＨＢｓＡｇおよびＤＴＰ混合物を合わせることにより作製され得る。
【００８７】
抗原性成分は、任意の適した順番で合わせられ得る。
【００８８】
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドが本発明の組成物中に含まれる場合、これらは好ましくはＨＢｓＡｇと合わせられる前にあらかじめ混合される。従って、本発明のプロセスは、ＨＢｓＡｇを含む第１の成分をＤ抗原およびＴ抗原の両方を含む第２の成分と合わせる工程を包含する。従って、あらかじめ混合されたＤ−Ｔ成分を使用することが好ましい。この２価の成分は、本発明のプロセスで使用され得る（例えば、ＨＢｓＡｇと合わせられ得、３価のＤ−Ｔ−ＨＢＶ成分を作製する）。代替物として、前もって混合したＤ−Ｔ成分は、さらに非ＨＢＶ抗原（例えば、無細胞性百日咳抗原）と合わせられ得、次いでこの成分は、ＨＢｓＡｇなどと合わせられ得る。
【００８９】
同様に、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび全細胞百日咳抗原が組成物中に含まれる場合、これらは好ましくは前もって混合されるので、本発明の工程は、ＨＢｓＡｇを含む第１の成分をＤ抗原、Ｔ抗原およびＰｗ抗原を含む第２の成分と合わせる工程を包含する。
【００９０】
従って、あらかじめ混合されたＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を使用し、そして本発明のプロセスの間この成分を使用することが好ましい。
【００９１】
アジュバントが本発明の組成物中に含まれる場合、これはまた種々の段階で添加され得る。代表的には、抗原は、本発明のプロセスで使用される前にアジュバントと合わされる（例えば、二価のＤ−Ｔ混合物は、本発明のプロセスで使用される前にアルミニウム塩アジュバントに吸着される）が、抗原が混合された後にアジュバントを添加するか、またはアジュバントに抗原を添加することも可能である（例えば、水性アジュバントを用いて開始し、次いで個々にまたはあらかじめ混合して抗原を添加する）。以下に記載されるように、ＨＢｓＡｇ成分は、好ましくは非ＨＢＶ抗原性成分と合わせられる前にリン酸アルミニウムアジュバントに吸着される。
【００９２】
（ＨＢｓＡｇ融合タンパク質）
ＨＢｓＡｇを発現させるために使用されることに加え、本発明は、同じポリペプチド内にＨＢｓＡｇ配列および非ＨＢｓＡｇ配列を含むハイブリッド抗原を発現させるために使用され得る。非ＨＢｓＡｇ配列は、ＨＢｓＡｇ配列に挿入され得るか、またはＨＢｓＡｇ配列のＮ−末端またはＣ−末端に融合され得る。
【００９３】
ＨＢｓＡｇ配列を異種性の抗原に融合させＨＢｓＡｇの能力を利用し、粒子を組立てることが公知である。例えば、参考文献１０２は、サイズおよび密度の点で天然のＨＢｓＡｇ粒子に似ている（約２５％の脂質組成および粒子あたり約１００の含有量のｇｐ１２０に一致する）、自発的に粒子を組立てるタンパク質を与えるＨＩＶ−１ ｇｐ１２０のＨＢｓＡｇへの融合を報告する。このｇｐ１２０は、この融合において天然の形態に折り込むことができ、その生物学的活性を維持した。同様に、ＨＩＶ ｇｐ４１エピトープは、ＨＢｓＡｇを用いて内部融合を作ることにより改善され、この融合タンパク質は、酵母において２２ｎｍのリポタンパク粒子を自己組立てした［１０３］。
【００９４】
この手法はまた、マラリアワクチンにも使用される。参考文献１０４は、マラリアｇｐ１９０抗原由来の６１ａａまでのエピトープをＨＢｓＡｇ配列に挿入し、発現したハイブリッド粒子は動物において抗ｇｐ１９０免疫応答を惹起したことを報告する。参考文献１０５は、ＨＢｓＡｇを有する融合タンパク質として発現されたスポロゾイド周囲タンパク質の４マー配列の１６回の反復を有するタンパク質を報告する。参考文献１０６は、ＨＢｓＡｇに融合されたＰｆｓ１６から構成されるウイルス様粒子の酵母における産生を報告する。参考文献１０７は、スポロゾイド周囲タンパク質がＨＢｓＡｇに融合されるハイブリッド抗原を開示する。参考文献１０８は、２０〜４５ｎｍサイズの免疫原性粒子を形成したＰ．ｖｉｖａｘのメロゾイト表面タンパク質１のＣ末端領域の融合を開示する。従って、自己組立ての粒子形態においてマラリア抗原を提示するためのＨＢｓＡｇの使用は、当該分野において周知である。
【００９５】
この手法は、特にＨＩＶ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅまたはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ由来の抗原を有するＨＢｓＡｇ配列を融合するのに適している。ＨＢｓＡｇハイブリッドを作製するのに適したＨＩＶ抗原は、外被糖タンパク質ｇｐ１２０またはその抗原性フラグメントを含む［１０２］。ＨＢｓＡｇハイブリッドを作製するのに適したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原は、スポロゾイド周囲表面抗原（「ＣＳＰ」）のサブユニットに基づき得（例えば、そのＮＡＮＰモチーフの３と２０の間の繰返しを含み得る（配列番号１４））、そして／またはＣＳＰのＣ末端領域を含み得る（しかし、代表的にはＣ末端から最後の１２アミノ酸を含まない）。例えば、本発明は、「ＲＴＳ」として公知の抗原を使用し得、これはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＮＦ５４または７Ｇ８単離物由来のＣＳＰのＣ末端の大部分を含み（アミノ酸２１０〜３９８であり、１９個のＮＡＮＰ繰返しおよびアミノ酸３６７〜３９０のＴ細胞エピトープ領域を含む）、ＨＢｓＡｇのｐｒｅＳ２の４アミノ酸によりＨＢｓＡｇのＮ末端に融合される。酵母で発現される場合、タンパク質に加え脂質（主にリン脂質）を含むＲＴＳは粒子を形成する。従って、ＲＴＳの配列は、本明細書の配列番号１５と同様に：（ｉ）Ｎ末端のメチオニン残基；（ｉｉ）Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ；（ｉｉｉ）Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ７Ｇ８由来のＣＳタンパク質のアミノ酸２１０〜３９８かまたはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４由来のＣＳタンパク質のアミノ酸２０７〜３９５のいずれかに相当する１８９アミノ酸；（ｉｖ）ＡｒｇまたはＧｌｙ；（ｖ）Ｂ型肝炎Ｐｒｅ−Ｓ２タンパク質由来のＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ；および（ｖｉ）ＨＢｓＡｇを含む。７Ｇ８単離物由来の完全長ＲＴＳは、参考文献１０９中に配列番号１として与えられる配列を有する（参考文献１１０の図５も参照のこと）：
【００９６】
【化１２】
本ハイブリッド抗原は、配列番号１５をコードする配列を用いて酵母で発現され得る。酵母に正常のＨＢｓＡｇと共にハイブリッドタンパク質を共発現することが好ましい。この手法は、以前にＲＴＳを用いて使用され、この共発現の産生物を「ＲＴＳ，Ｓ」という。約１：４のＲＴＳ：Ｓ比が有用である。
【００９７】
従って、本発明の有用な局面は、（ｉ）ＨＢｓＡｇおよび（ｉｉ）ＲＴＳを共発現させることである。これら抗原のうちの１つまたは両方は、上記のプラスミドを使用して発現され得る。共発現したタンパク質は、粒子抗原を形成し、マラリアワクチン内の活性成分として使用され得る。
【００９８】
（多価ワクチンで使用するためのアジュバント）
ＣｐＧ、ＡＧＰｓおよびＡＳ０４を含む「最新の」アジュバントは、上に記載される。これらは、本発明の多価組成物において使用され得るが、アルミニウム塩を使用するほうが好ましい。これらは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントを含む。これらの名前は、慣習的であるが、便宜上のみに使用され、いずれも存在している実際の化合物の正確な説明でもない［例えば、参考文献１１１の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される「水酸化物」または「リン酸塩」のいずれかのアジュバントを使用し得る。
【００９９】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、代表的には、アルミニウムのオキシヒドロキシド塩であり、これらは、通常、少なくとも部分的に結晶である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光学によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸収帯および３０９０〜３１００ｃｍ−１における強力なショルダーの存在によって水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物と区別され得る［参考文献１１１の第９章］。
【０１００】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、代表的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、しばしば、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）をまた含む。それらは沈殿によって得られ得、そして沈殿の間の反応条件および濃度は、この塩中のヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、一般に、０．３〜１．２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、厳密なＡｌＰＯ４からヒドロキシル基の存在によって区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃に加熱した場合）は、構造的ヒドロキシルの存在を示す［参考文献１１１の第９章］。
【０１０１】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に０．３と１．２の間、好ましくは０．８と１．２の間、そしてより好ましくは０．９５±０．１である。このリン酸アルミニウムは、一般に、特にヒドロキシリン酸塩については非晶質である。代表的なアジュバントは、０．８４と０．９２の間のＰＯ４／Ａｌ３＋モル比を有する非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇＡｌ３＋／ｍｌで含む。このリン酸アルミニウムは、一般に、粒子状である。この粒子の代表的な直径は、任意の抗原の吸着の後、０．５〜２０μｍの範囲（例えば、約５〜１０μｍ）である。
【０１０２】
リン酸アルミニウムのＰＺＣは、ヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に逆に相関し、そしてこの置換の程度は、沈殿によって塩を調製するために用いられる反応条件および反応物の濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離のリン酸イオンの濃度を変化することによるか（より多くのリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液（ＰＺＣをより塩基性にする）のような緩衝液を添加することにより変更される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０と７．０の間、より好ましくは５．０と６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。
【０１０３】
本発明の組成物を調製するために用いられるリン酸アルミニウム溶液は、緩衝剤を含み得るが（例えば、リン酸塩またはヒスチジンまたはＴｒｉｓ緩衝液）、常に必要なわけではない。このリン酸アルミニウム溶液は、好ましくは、滅菌され、そして発熱物質を含まない。このリン酸アルミニウム溶液は、遊離の水性リン酸イオンを含み得る（例えば、１．０と２０ｍＭの間、好ましくは５と１５ｍＭの間、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する）。このリン酸アルミニウム溶液はまた、塩化ナトリウムを含み得る。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲（例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ）であり、そしてより好ましくは約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在は、抗原の吸着前のｐＨの正確な測定を容易にする。
【０１０４】
アルミニウム塩は、ＨＢＶ抗原および非ＨＢＶ抗原のいずれかの吸着に使用され得る。ＨＢｓＡｇは、好ましくはリン酸アルミニウムアジュバントに吸着される［７０］。ジフテリアトキソイドは、好ましくは水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される。破傷風トキソイドは、好ましくは水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されるが、これは必要ではない（例えば、０〜１０％の間の破傷風トキソイドの吸着が使用され得る）。無細胞性の百日咳抗原、特に６９ｋＤの抗原は、好ましくは水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される。結合体化Ｈｉｂ抗原は、リン酸アルミニウムに吸着され得る［１１２、１１３］か、または吸着され得ない。この方法でのＨｉｂ吸着は、特にＤ−Ｔ−Ｐｗ−Ｈｉｂ−ＨＢｓＡｇ抗原を含むワクチンで有用である。他の結合体化抗原（例えば、髄膜炎菌、肺炎球菌）は、同様にアルミニウム塩（リン酸塩）に吸着され得るか、吸着され得ない［１１４］。ＩＰＶ抗原は、代表的に本発明のプロセスにおいて使用される前にいかなるアジュバントにも吸着されないが、他の成分を起源とするアルミニウムアジュバントに吸着されるようになり得る。
【０１０５】
ＨＢｓＡｇ吸着に関して、リン酸アルミニウムアジュバントは、好ましくはＨＢｓＡｇが添加される水溶液の形態で使用される（ＮＢ：「溶液」として水性リン酸アルミニウムをいうことが標準的であるが、厳密な物理化学的観点から、この塩は、不溶性であり、懸濁液を形成する）。リン酸アルミニウムを必要とされる濃度に希釈し、ＨＢｓＡｇの添加前に同種の溶液を確保することが好ましい。ＨＢｓＡｇの添加前のＡｌ３＋の濃度は、一般的に０ｍｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましいＡｌ３＋濃度は、２ｍｇ／ｍｌと６ｍｇ／ｍｌの間である。
【０１０６】
本発明プロセスにおける使用に関して２つの好ましい成分は：（１）水酸化アルミニウムアジュバントを含む二価のＤ−Ｔ成分；および（２）水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む三価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分である。
【０１０７】
（薬学的組成物）
アジュバントおよび抗原成分に加え、本発明の組成物は、さらなる成分を含有し得る。これらの成分は、種々の供給源を有する。例えば、これらは、製造の間に使用される抗原またはアジュバント成分のうちの１つにおいて存在し得るか、または抗原性成分とは別々に添加され得る。
【０１０８】
本発明の好ましい組成物は、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含有する。
【０１０９】
張度を制御するために、生理的塩（例えば、ナトリウム塩）を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。
【０１１０】
組成物は、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となる。浸透圧モル濃度は、ワクチン接種により引き起こされる痛みに対して影響を有しないことが以前に報告されている［１１５］が、この範囲に浸透圧モル濃度を維持することが、やはり好ましい。
【０１１１】
本発明の組成物は、１つ以上の緩衝液を含有し得る。代表的な緩衝液として：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、代表的に５〜２０ｍＭの範囲で含有される。
【０１１２】
本発明の組成物のｐＨは、一般的に５．０と７．５の間、より代表的には至適安定性のため５．０と６．０の間、または６．０と７．０の間である。それ故本発明のプロセスは、包装前のバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。
【０１１３】
本発明の組成物は、好ましくは、滅菌である。
【０１１４】
本発明の組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準測定）、そして好ましくは用量あたり＜０．１ＥＵを含む）。
【０１１５】
本発明の組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１１６】
任意の水性の包装されたワクチン材料のｐＨは、好ましくは５〜８の間（例えば、５．５と６．５の間）である。
【０１１７】
ＨＢｓＡｇの吸着される性質に起因して、最終のワクチン産物は、濁った外観をもつ懸濁液であり得る。この外観は、微生物汚染が容易に見えず、そのためこのワクチンは、好ましくは抗微生物薬剤を含むことを意味する。これは、このワクチンが複数用量容器に包装される場合、特に重要である。含有物として好ましい抗微生物薬剤は、２−フェノキシエタノールおよびチメロサールである。しかし、本発明のプロセスの間に水銀の保存剤（例えば、チメロサール）を用いないことが好ましい。しかし、本発明の組成物を調製するために用いられる前に、ＨＢｓＡｇが、このような保存剤で処理される場合、痕跡量の存在は避けられないかも知れない。しかし、安全性のために、最終組成物が約２５ｎｇ／ｍｌより少ない水銀を含むことが好ましい。より好ましくは、この最終的なワクチン産物は、検出可能なチメロサールを含まない。これは、一般に、本発明のプロセスにおける添加の前に抗原調製物から水銀保存剤を除去するか、組成物を作製するために用いられる成分の調製の間にチメロサールの使用を避けることによって達成される。
【０１１８】
二価のＤ−Ｔ混合物が本発明のプロセス中に使用される場合、チメロサールを含まないはずである。いくつかの実施形態において、Ｄ−Ｔ混合物は、２−フェノキシエタノールを含み得るが、他の実施形態において、チメロサールと２−フェノキシエタノールの両方を含まない。３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ混合物は、本発明のプロセスの間に使用される場合、２−フェノキシエタノールを含み得ないか、チメロサールを含み得る。
【０１１９】
製造の間に、所望の最終濃度を与えるための成分の希釈は、通常、ＷＦＩ（注射用水）で実施される。
【０１２０】
本発明の組成物中のリン酸アルミニウムの濃度は、Ａｌ３＋によって表され、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌより少ない（例えば、４ｍｇ／ｍｌ以下、３ｍｇ／ｍｌ以下、２ｍｇ／ｍｌ以下、１ｍｇ／ｍｌ以下など）。
【０１２１】
本発明の組成物中の任意の３Ｄ−ＭＰＬの濃度は、好ましくは、２００μｇ／ｍｌより少ない（例えば、１５０μｇ／ｍｌ以下、１２５μｇ／ｍｌ以下、１１０μｇ／ｍｌ以下、１００μｇ／ｍｌ以下）。
【０１２２】
本発明の組成物中のＨＢｓＡｇの濃度は、好ましくは、６０μｇ／ｍｌより少ない（例えば、５５μｇ／ｍｌ以下、５０μｇ／ｍｌ以下、４５μｇ／ｍｌ以下、４０μｇ／ｍｌ以下など）。約２０μｇ／ｍｌの濃度が代表的である。
【０１２３】
本発明の組成物中のジフテリアトキソイドの濃度は、代表的には少なくとも５０ＩＵ／ｍｌである。
【０１２４】
本発明の組成物中の破傷風トキソイドの濃度は、代表的には少なくとも１００ＩＵ／ｍｌである。
【０１２５】
本発明の組成物中のジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドの比は、通常２：１と３：１の間（Ｌｆ単位で測定される）、好ましくは、２．４：１と２．６：１の間、より好ましくは２．５：１である。
【０１２６】
細胞性百日咳抗原が使用される場合、代表的に少なくとも８ＩＵ／ｍｌであり；無細胞性抗原が使用される場合、代表的には用量あたり２５〜７５μｇの間のＰＴ、約２５〜７５μｇの間のＦＨＡ、約１０〜２０μｇの間のペルタクチンである。
【０１２７】
サッカリドとして測定される本発明組成物中のＨｉｂ結合体の量は、代表的には１０μｇ／ｍｌと３０μｇ／ｍｌの間である。
【０１２８】
ＥＵ（Ｅｌｉｓａ単位）で測定されるＨＡＶ抗原の量は、代表的には少なくとも６００ＥＵ／ｍｌである。
【０１２９】
ＩＰＶ抗原の量は、株の血清型に依存する。１型ウイルスに関して組成物は、代表的に約８０ＤＵ／ｍｌ含有する。２型ウイルスに関して組成物は、代表的に約１６ＤＵ／ｍｌを含有する。３型ウイルスに関して組成物は、代表的に約６５ＤＵ／ｍｌ含有する。
【０１３０】
サッカリドとして測定される本発明組成物中の髄膜炎菌結合体の量は、代表的に各々の血清群に関して５μｇ／ｍｌと２５μｇ／ｍｌの間である。
【０１３１】
サッカリドとして測定される本発明組成物中の肺炎球菌結合体の量は、代表的に各々の血清群に関して２μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌの間である。
【０１３２】
本発明の組成物は、好ましくは、患者に０．５ｍｌ用量で投与される。０．５ｍｌ用量に関して、通常の分散（例えば、０．５ｍｌ±０．０５ｍｌ）を含むことが理解される。
【０１３３】
本発明は、個々の用量への包装に適したバルク材料を提供し得、次いで患者に投与するために分配され得る。上に挙げられる濃度は、最終的に包装された用量の代表的な濃度であり、そのためバルクワクチン中の濃度はより高くても良い（例えば、希釈によって最終濃度まで減少され得る）。
【０１３４】
本発明の組成物は、一般に、水溶液形態である。
【０１３５】
（本発明の組成物の包装）
ＨＢｓＡｇとアジュバントを合わせた後、本発明のこのプロセスは、抽出する工程および０．５ｍｌ混合物サンプルを容器に包装する工程を包含し得る。複数回投与の状況に関して、複数回投薬量が抽出され１つの容器に一緒に包装される。
【０１３６】
本発明のプロセスは、使用のためにワクチンを容器に包装するさらなる工程を含み得る。適した容器として、バイアルおよび使い捨てシリンジ（好ましくは滅菌されたもの）が挙げられる。
【０１３７】
本発明の組成物が、バイアルに包装される場合、これらは、好ましくは、ガラスまたはプラスチック材料から作製される。このバイアルは、好ましくは、上記組成物がそれに添加される前に滅菌され得る。ラテックス感受性患者にともなう問題を避けるために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーでシールされる。このバイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそれは、２回以上の用量（「複数回用量」バイアル）例えば、１０回用量を含み得る。複数回用量バイアルを用いる場合、各用量は、厳密な無菌状態下で滅菌ニードルおよびシリンジで引き出されるべきであり、バイアル内容物を汚染することを避けるよう注意をする。好ましいバイアルは、色のないガラスから作製される。
【０１３８】
バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得、シリンジの内容物は、バイアル中に排出され得（例えば、その中で凍結乾燥された物質を再構成するため）、バイアル中の内容物は、シリンジに戻され得る。バイアルからシリンジをはずした後、次いで針は患者に添えられ、組成物が投与され得る。このキャップは、好ましくは、シールまたはカバーの内側に位置され、このシールまたはカバーは、キャップが接触され得る前に取り除かれるはずである。
【０１３９】
上記組成物が、シリンジ中に包装される場合、このシリンジは、通常、それに取り付けられたニードルを有さないが、別個のニードルが組み立ておよび使用のためにシリンジとともに提供され得る。安全ニードルが好ましい。１−インチ２３−ゲージ、１−インチ２５−ゲージおよび５／８−インチ２５−ゲージのニードルが代表的である。シリンジには、その上に内容物のロット番号および使用期限日がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。このシリンジ中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に外れることを防ぐ。これらのシリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単回用量のワクチンを含む。このシリンジは、一般に、先端部キャップを有し、この先端部をニードルの取り付けの前にシールし、そしてこの先端部キャップは、好ましくはブチルゴムから作製される。このシリンジとニードルとが別個に包装される場合、次いでこのニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。Ｇｒｅｙブチルゴムが好ましい。好ましいシリンジは、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で販売されるものである。
【０１４０】
ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）が用いられる場合、ソーダ石灰ガラス製のよりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。
【０１４１】
組成物が容器中に包装された後、この容器は、次いで、配布のための箱内、例えば、厚紙の箱の内側に囲われ得、そしてこの箱は、ワクチンの詳細、例えば、その商標名、ワクチン中の抗原のリスト（例えば、「Ｂ型肝炎組換え体」など）、容器の説明（例えば、「使い捨て予備充填Ｔｉｐ−Ｌｏｋシリンジ」または「１０×０．５ｍｌ単回用量バイアル」）、その用量（例えば、「各々１回の０．５ｍｌ用量を含む」）、警告（例えば、「成人使用のみ」または「小児使用のみ」）、使用期限日、適応症（例えば、「腎不全を有する患者（血液透析前および血液透析患者を含む）のためのすべて公知のサブタイプにより引き起こされるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する能動性免疫、１５歳より上」など）、患者番号などでラベルされる。各箱は、２つ以上の包装されたワクチン、例えば、５または１０の包装されたワクチン（特にバイアルについて）を含み得る。このワクチンがシリンジ中に含まれる場合、この包装物は、シリンジの絵を示し得る。
【０１４２】
ワクチンは、ワクチンの詳細、例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細などを含む印刷物とともに一緒に（例えば、同じ箱中に）包装され得る。これらの指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の場合、直ちに利用できるようにアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【０１４３】
この包装されたワクチンは、好ましくは、２℃と８℃との間で貯蔵される。それは、凍結されるべきではない。
【０１４４】
ワクチンは、製造の間に完全な液体形態（すなわち、すべての抗原性成分が水溶液または懸濁液である）で提供され得るか、またはいくつかの成分が液体形態であり、他の成分が凍結乾燥形態である形態で調製され得る。従って、最終的なワクチンは、混合する時点で２つの成分：（ａ）水性抗原を含む第１の成分；および（ｂ）凍結乾燥された抗原を含む第２の成分を混合することにより即座に調製され得る。この２つの成分は、好ましくは別々の容器（例えば、バイアルおよび／またはシリンジ）にあり、本発明は、成分（ａ）および（ｂ）を含むキットを提供する。この形式は、特に結合体成分、特にＨｉｂおよび／または髄膜炎菌結合体を含むワクチンに有用であり、なぜならこれらは凍結乾燥形態でより安定であり得るからである。従って、結合体は本発明による使用の前に凍結乾燥され得る。さらなる成分がまた、凍結乾燥の前に添加され得る（例えば、安定剤として）。含有するための好ましい安定剤は、乳糖、ショ糖およびマンニトールならびにそれらの混合物（例えば、乳糖／ショ糖混合物、ショ糖／マンニトール混合物など）である。従って、最終的なワクチンは、乳糖および／またはショ糖を含み得る。ショ糖／マンニトール混合物を使用することは、乾燥工程をスピードアップし得る。
【０１４５】
従って、本発明は、２つの容器の組合せワクチンを調製するプロセスを提供し、この方法は、以下の工程：
上に記載される水性の組合せワクチンを調製する工程、しかし上記１つ以上の抗原は、結合体化莢膜サッカリド抗原を含まない；
この組合せワクチンを第１の容器（例えば、シリンジ）に包装する工程；
凍結乾燥の形態で、結合体化莢膜サッカリド抗原を調製する工程；
上記凍結乾燥抗原を第２の容器（例えば、バイアル）に包装する工程；および
第１の容器および第２の容器を一緒にキット中に包装する工程
を含む。
【０１４６】
次いで本キットは、医師に配布され得る。
【０１４７】
Ｄ、Ｔ、ＰおよびＨＢｓＡｇ成分は、好ましくは液体形態である。
【０１４８】
（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、そして本発明は、患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
【０１４９】
本発明はまた、薬剤における使用のための本発明の組成物を提供する。
【０１５０】
本発明はまた、患者への投与のための医薬の製造における（ｉ）本発明に従って発現されたＨＢｓＡｇ；および（ｉｉ）１つ以上の非ＨＢＶ抗原の使用を提供する。
【０１５１】
この発明はまた、患者への投与のための医薬の製造における（ｉ）本発明に従って発現されたＨＢｓＡｇおよび（ｉｉ）水酸化アルミニウム以外のアジュバントの使用を提供する。この医薬は、好ましくは１価のワクチンである。このワクチンを受ける好ましい患者群は、上に挙げられる。
【０１５２】
本発明の免疫原性組成物は、本発明の使用および／または少なくともＢ型肝炎ウイルス感染の処置に関して好ましくはワクチンである。本発明の組成物を受容している患者は、好ましくは第１の免疫から６週目で測定される血清抗ＨＢｓＡｇ ＧＭ力価が５００ｍＩＵ／ｍｌ以上を有する。より好ましくは、１２ヶ月後に測定されたときこの力価が５００ｍＩＵ／ｍｌ以上である。
【０１５３】
十分な効力のために、小児のための代表的な免疫スケジュールは、２回以上の投薬を投与する工程を包含する。例えば、投薬が、０および６ヶ月目（時間０が第１の投薬）；０、１、２および６ヶ月目；０、２１日目および第３の投薬が６ヶ月と１２ヶ月の間；または０、１、２、６および１２ヶ月目であり得る。
【０１５４】
本発明の組成物は、例えば、腕または脚への筋肉内注射により投与され得る。
【０１５５】
本発明により産生されるワクチンは、別の肺炎球菌結合体ワクチン（例えば、ＰｒｅｖｎａｒＴＭ）と同時に患者に投与され得る。
【０１５６】
本発明の組成物が、アルミニウムベースのアジュバントを含む場合、成分の沈殿が貯蔵の間に生じ得る。それ故、この組成物は、患者への投与の前に振盪しなければならない。振盪された組成物は、不透明な白い懸濁液である。
【０１５７】
（好ましいワクチン）
本発明の特異的な多価免疫原性組成物は：
ＨＢｓＡｇおよびＨＡＶを含む２価の組成物。このワクチンは、水性の形態である。水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨｂｓＡｇは、リン酸アルミニウムに吸着される。ＨＡＶは、水酸化アルミニウムに吸着される。１ｍｌあたりの量：約７２０ＥＬＩＳＡ単位ＨＡＶ；約２０μｇ ＨＢｓＡｇ。用量：約１ｍｌ。事前に充填されたシリンジに与えられ得る。
【０１５８】
ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰａおよびＩＰＶを含む五価の組成物。このワクチンは水性形態である。これは、水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇは、リン酸アルミニウムに吸着される。Ｄ、ＴおよびＰａは、水酸化アルミニウムに吸着される。１ｍｌあたりの量：約５０Ｌｆジフテリアトキソイド；約２０Ｌｆ破傷風トキソイド；約５０μｇＰＴ；約５０μｇ ＦＨＡ；約１６μｇペルタクチン；約２０μｇ ＨＢｓＡｇ；約８０ＤＵ １型ポリオウイルス；約１６ＤＵ ２型ポリオウイルス；約６４ＤＵ ３型ポリオウイルス。用量：約０．５ｍｌ。事前に充填されたシリンジに与えられ得る。
【０１５９】
ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰａおよびＩＰＶを含む五価の組成物。このワクチンは水性形態である。これは、水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇは、リン酸アルミニウムに吸着される。Ｄ、ＴおよびＰａは、水酸化アルミニウムに吸着される。１ｍｌあたりの量：少なくとも６０ＩＵジフテリアトキソイド；少なくとも８０ＩＵ破傷風トキソイド；約５０μｇＰＴ；約５０μｇ ＦＨＡ；約１６μｇペルタクチン；約２０μｇ ＨＢｓＡｇ；約８０ＤＵ １型ポリオウイルス；約１６ＤＵ ２型ポリオウイルス；約６４ＤＵ ３型ポリオウイルス。用量：約０．５ｍｌ。事前に充填されたシリンジに与えられ得る。
【０１６０】
ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗを含む四価の組成物。この成分は水性形態である。これは、水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇは、リン酸アルミニウムに吸着される。ＤおよびＴは、水酸化アルミニウムに吸着される。この組成物はチメロサールを含むが、好ましくは２−フェノキシエタノールを含まない。１ｍｌあたりの量：少なくとも６０ＩＵジフテリアトキソイド；少なくとも１２０ＩＵ破傷風トキソイド；少なくとも８ＩＵ Ｐｗ；約２０μｇ ＨＢｓＡｇ。用量：約０．５ｍｌ。
【０１６１】
ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰｗおよびＨｉｂ−Ｔ結合体を含む五価の組成物。このＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗ成分は、水性形態であり；Ｈｉｂ−Ｔは凍結乾燥される。これは、水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＤおよびＴは、水酸化アルミニウムに吸着される。ＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ−Ｔは、リン酸アルミニウムに吸着される。凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔは乳糖を含む。この水性成分は、チメロサールを含み得る。１ｍｌあたりの量：少なくとも６０ＩＵジフテリアトキソイド；少なくとも１２０ＩＵ破傷風トキソイド（それに加えてＨｉｂ−Ｔ中のキャリアとして５〜２５μｇの間の破傷風トキソイド）；少なくとも８ＩＵ Ｐｗ；約２０μｇ ＨＢｓＡｇ；サッカリドとして測定され約５μｇ Ｈｉｂ−Ｔ。用量：約０．５ｍｌ。
【０１６２】
これらの組成物は、別々に使用され得るか、またはさらなるワクチンの成分として使用され得る。例えば、本発明は、上記の五価のＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＩＰＶ組成物に加え凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔ結合体を含む六価の組成物を提供する。この凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔは、好ましくは、アルミニウム塩に吸着されない。本発明はまた、上記の四価のＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ組成物に加え凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔ結合体を含む五価の組成物を提供する。本発明はまた、上記の四価のＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ組成物に加え凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔ結合体、ＭｅｎＡ結合体およびＭｅｎＣ結合体の混合物を含む七価の組成物を提供する。最終的なワクチンは、使用時に水性ＨＢｓＡｇ含有物質を用いて凍結乾燥された物質を再構成することにより調製され得、この凍結乾燥された成分および水性成分は、好ましくは上記のように一緒にキットに包装される。
【０１６３】
本発明の特異的な一価の免疫原性組成物は：
リン酸アルミニウムアジュバントおよび３Ｄ−ＭＰＬアジュバントと組み合わせたＨＢｓＡｇであり、ここでＨＢｓＡｇおよび３Ｄ−ＭＰＬの両方、リン酸アルミニウムに吸着される。１ｍｌあたりの量：約２０μｇ ＨＢｓＡｇ、約５０μｇ ３Ｄ−ＭＰＬ、約０．５ｍｇ Ａｌ３＋。
【０１６４】
本発明の特定のプロセスとしては、以下の工程を含むプロセスが挙げられる：
本発明による発現後のＨＢｓＡｇの精製；リン酸アルミニウムアジュバントにＨＢｓＡｇを吸着させる；水酸化アルミニウムアジュバントを有するチメロサールを含まない二価のＤ−Ｔ混合物を得る；Ｐａ成分としてＰＴ、ＦＨＡおよびペルタクチンを得る；プールされた１型、２型および３型として、好ましくはアルミニウム塩アジュバントなしのＩＰＶ抗原を得る；任意の順番でＤ−Ｔ、Ｐａ、ＩＰＶおよびＨＢｓＡｇを合わせ、最終的な五価の組合せを与える；必要に応じて、シリンジに包装する。
【０１６５】
本発明による発現後のＨＢｓＡｇの精製；リン酸アルミニウムアジュバントにＨＢｓＡｇを吸着させる；水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの、２−フェノキシエタノールを含まずチメロサールを含む三価のＤ−Ｔ−Ｐｗ混合物を得る；Ｄ−Ｔ−ＰｗおよびＨＢｓＡｇを合わせ、最終的な四価の組合せを与え；必要に応じて、シリンジに包装する；必要に応じて凍結乾燥された結合体成分（例えば、Ｈｉｂ−Ｔ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ）と組合せて包装する。
【０１６６】
本発明による発現後のＨＢｓＡｇの精製；リン酸アルミニウムアジュバントにＨＢｓＡｇを吸着する；水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの、２−フェノキシエタノールを含ずチメロサールを含む三価のＤ−Ｔ−Ｐｗ混合物を得る；凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔ結合体を得る；Ｄ−Ｔ−ＰｗおよびＨＢｓＡｇを合わせ、水性の四価の成分を与える；水性の四価の成分をガラスバイアルに包装する；凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔをガラスバイアルに包装する；２つのバイアルを合わせ、再構成のための１つのキットに与えられ、五価の組合せワクチンを与える；このガラスバイアルは、Ｉ型ガラスであり、ゴムのブチルストッパーを有し得る。
【０１６７】
本発明による発現後のＨＢｓＡｇの精製；リン酸アルミニウムアジュバントにＨＢｓＡｇを吸着する；水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの、２−フェノキシエタノールを含まずチメロサールを含む三価のＤ−Ｔ−Ｐｗ混合物を得る；プールされた１型、２型および３型として、好ましくはアルミニウム塩アジュバントなしのＩＰＶ抗原を得る；Ｄ−Ｔ−Ｐｗ、ＩＰＶおよびＨＢｓＡｇを任意の順番で合わせ、最終的な五価の組み合わせを与える；必要に応じて、シリンジに包装する；必要に応じて凍結乾燥された結合体成分（例えば、Ｈｉｂ−Ｔ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ）と組合せて包装する。
【０１６８】
さらなる成分は、任意の段階で加えられ得る（例えば、塩化ナトリウム、アジュバント、保存剤など）。例えば、上記のワクチンを調製するために、これらのプロセスが使用され得る。
【０１６９】
この異なるプロセスの工程は、実質的に同時に実施され得るか、または別々に実施され得る。これらは、同じ場所または異なる場所、異なる国でさえ実施され得る（例えば、ＨＢｓＡｇ発現がＨｉｂ−Ｔ結合体の凍結乾燥と異なる場所で実施され得る）。
【０１７０】
（結合体のためのキャリアタンパク質）
結合体化サッカリド抗原は、キャリアタンパク質を含み、このサッカリドは直接またはリンカーを介してのいずれかでこのキャリアタンパク質に共有結合される。結合体化技術についての一般的な情報は、参考文献１１６に見出され得る。
【０１７１】
種々のタンパク質は、キャリアとしての使用が公知であり、好ましいキャリアタンパク質は、バクテリアトキシンまたはバクテリアトキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。他の適したキャリアタンパク質としては、ジフテリアトキシンのＣＲＭ１９７変異体［１１７−１１９］、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質［１２０］、合成ペプチド［１２１、１２２］、熱ショックタンパク質［１２３、１２４］、百日咳タンパク質［１２５、１２６］、サイトカイン［１２７］、リンホカイン［１２７］、ホルモン［１２７］、成長因子［１２７］、種々の病原体から誘導された抗原由来の複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［１２８］（例えば、Ｎ１９［１２９］）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［１３０、１３１］、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ［１３２］、ニューモライシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）［１３３］、鉄取り込みタンパク質［１３４］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のトキシンＡまたはトキシンＢ［１３５］、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅタンパク質［１３６］などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
キャリアへのサッカリドの結合は、好ましくは−ＮＨ２基（例えば、キャリアタンパク質中のリシン残基の側鎖、またはアルギニン残基の側鎖）を介する。−ＳＨ基への結合（例えば、システインの側鎖）がまた可能である。
【０１７３】
１：５（すなわち、タンパク質過剰）および５：１（すなわち、サッカリド過剰）の間のサッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する結合体が好ましい。
【０１７４】
組成物は、少量の遊離キャリアを含み得る。別個の抗原として含まれるあらゆるキャリアを無視する場合、結合されないキャリアは、好ましくは全体として組成物中のキャリアタンパク質の総量の５％以下であり、より好ましくは２％重量未満である。
【０１７５】
組成物中に１つより多い型のキャリアタンパク質を含むことは可能である（例えば、キャリア抑制の危険を減少させる）。
【０１７６】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ結合体に使用されるこのキャリアタンパク質は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＤタンパク質であり得る。このタンパク質は、参考文献１３７および１３８に詳細に記載され、結合体中キャリアタンパク質としてのその使用は参考文献１３９に記載される。用語「プロテインＤ」は、参考文献１３９に開示されるように天然の完全長タンパク質のフラグメント、および完全長プロテインＤまたはこれらのフラグメントのいずれかを含む融合タンパク質（例えば、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質のフラグメントとプロテインＤのフラグメントとの融合）を含む。これらのフラグメントは、それらに結合体化される場合、Ｔ非依存性のサッカリド抗原をＴ依存性の抗原に変換する能力を保持する。代表的なフラグメントは、プロテインＤのＮ末端の少なくとも１／３を含む。このタンパク質は、都合よくＥ．ｃｏｌｉに発現され得［１３８］、この組換え材料は、本発明での使用に好ましい［１３９］。
【０１７７】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１７８】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１７９】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１８０】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。それ故、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。
【０１８１】
抗原がアジュバントに「吸着される」と記載される場合、少なくとも５０％の抗原が吸着されることが好ましい（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上）。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドは両方とも完全に吸着されることが好ましい（すなわち、上清に検出されない）。ＨＢｓＡｇの完全な吸着がまた好ましい。
【０１８２】
イオン化可能な基は、明細書中の式に示される中性の形態で存在し得るか、または荷電した形態で存在し得る（例えば、ｐＨに依存して）ことが理解される。従って、ホスフェート基は、−Ｐ−Ｏ−（ＯＨ）２として示され得、この式は、単に代表的な中性ホスフェート基であり、他の荷電した形態は、本発明により包含される。同様に、糖環は、開いた形態または閉じた形態で存在し得、閉じた形態は、本明細書中の構造式で示されるが、開いた形態もまた、本発明により包含される。
【０１８３】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から取得しなければならない。
【０１８４】
【化１３】
【実施例】
【０１８５】
（本発明を実施するための様式）
（プラスミドの調製）
プラスミドは、以下の順で種々の要素を含み構成される：酵母ＧＡＰＤＨプロモーター；ＨＢｓＡｇコード配列；酵母ＡＲＧ３転写ターミネーターを含む領域；Ｅ．ｃｏｌｉベクターｐＢＲ３２７由来のＤＮＡ；ＬＥＵ２マーカーを有する酵母ＤＮＡ；Ｅ．ｃｏｌｉベクターｐＢＲ３２７由来のＤＮＡ；酵素２μプラスミド配列；Ｅ．ｃｏｌｉベクターｐＢＲ３２７由来のＤＮＡ。ｐＢＲ３２７配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能的なｏｒｉを含む。このプラスミドは、全体で１４６００ｂｐと１４７００ｂｐの間の長さである。
【０１８６】
ＧＡＰＤＨプロモーター配列は、以下の１０６０−マーを含む（配列番号１）：
【０１８７】
【化１４】
ＨＢｓＡｇコード配列は、以下のとおりであり（配列番号４）、オーカー終止コドンが続く：
【０１８８】
【化１５】
この配列は、以下の配列番号３のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする：
【０１８９】
【化１６】
このＡＲＧ３配列は、以下の６８９−マー配列（配列番号８）を下流領域またはＡＲＧ３由来の付加的な配列と一緒に含む：
【０１９０】
【化１７】
従って、このプラスミドは、発現カセット中、以下の２４３０−マーを含む（配列番号１３）：
【０１９１】
【化１８】
（プラスミドの要素の配列解析）
ＧＡＰＤＨプロモーター配列（配列番号１）は、いくつかの位置で参考文献４１で開示されるＧＡＰＤＨプロモーター配列（配列番号５）と異なる：
【０１９２】
【化１９】
配列番号１を、２００５年４月７日にフィルタリングなしで「すべてのＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ配列（ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、環境サンプルまたは第０相、１相または２相のＨＴＧＳ配列ではない）」に対して検索した。この検索において最大のヒットは、以下のように配列番号１とともに並べる：
【０１９３】
【化２０】
従って、配列番号１は、最も近い適合の逆方向相補体に比較して、２つのヌクレオチドで異なる。
【０１９４】
ＨＢｓＡｇコード配列（配列番号４）を、同様の方法でＧｎｅＢａｎｋ配列に対して解析した。配列番号４は、最も近いデータベース適合（ＡＹ５７６４２６．１）とヌクレオチド３５０（Ａ／Ｇ）でのみ異なる。この違いは、Ｓｅｒ／Ａｓｎコドン変化を生じる。
【０１９５】
このコードされた配列（配列番号３）を、２００５年４月４日に「環境性サンプルを除く非重複性ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ 翻訳＋ＰＤＢ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ＋ＰＲＦ」データベースを使用してフィルタリングなしでＢＬＡＳＴＰにより解析した。配列番号３は、最も近いデータベース適合とアミノ酸１１７で異なり、ＳｅｒよりもＡｓｎを有する。最大のヒットは、エントリーＣＡＡ８４７９２．１（配列番号１０）であった。
【０１９６】
【化２１】
ＡＲＧ３の下流配列（配列番号８）のＢＬＡＳＴＮ解析は、データーベースエントリーＭ２８３０１．１と１００％同一であることを明らかにするが、配列番号８のヌクレオチド７で始まる６８３マーしか重複しない。配列番号８の５’末端での７ヌクレオチドを含むこれら２つの配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを、以下に与える：
【０１９７】
【化２２】
（ＨＢｓＡｇ発現および吸着）
このプラスミドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母（ＤＣ５）のｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｈｉｓ３ ｃａｎ１−１１株を形質変換させるために使用される。この酵母は、精製アミノ酸（ロイシンを除く）ビタミンおよび適した塩を含む合成培地で培養される。発現したＨＢｓＡｇは、細胞の回収、沈降、限外濾過、ゲル浸透、イオン交換、超遠心および脱塩を包含する工程により精製される。
【０１９８】
精製した抗原は、グリコシル化されておらず、実質的に球状粒子の形態が見られ得る（平均直径約２０ｎｍ）。
【０１９９】
等張化生理食塩水中のリン酸アルミニウムの懸濁液は、精製したＨＢｓＡｇ濃縮物と混合される。ｐＨを５．２と６．０の間に調整後、この混合物を攪拌しながら１日、室温に放置する。アジュバントへの抗原の吸着は、このときに実施される。
【０２００】
（一価のワクチン）
一価のワクチンを作製するために、３Ｄ−ＭＰＬを吸着されたＨＢｓＡｇに添加し、２０μｇ／ｍｌの最終ＨＢｓＡｇ濃度を与えるための希釈を、注射用水および滅菌生理食塩水を使用して得る。次いでこの大量のワクチンを、バイアルまたは使い捨てシリンジのいずれかに個々の用量で包装する。
【０２０１】
（多価のワクチン）
組合せワクチンを作製するために、ＤＴＰｗ抗原の混合物をドイツ、マールブルクのＣｈｉｒｏｎ Ｂｅｈｒｉｎｇから得る。この混合物を吸着されたＨＢｓＡｇとともに混合し、四価のワクチン製品を与える。この４価の製品は、それ自身で使用され得るか、または（ａ）リン酸アルミニウムアジュバントに吸着される凍結乾燥されたＨｉｂ−Ｔ結合体または（ｂ）Ｈｉｂ、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣ由来の凍結乾燥された結合体の３価の混合物のいずれかを再構成するために使用され得る。
【０２０２】
本発明は、例系のみによって記載され、改変は、本発明の範囲および精神の中にあるままでもなされ得る。
【０２０３】
【化２３】
【０２０４】
【化２４】
【０２０５】
【化２５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主における発現後、ＨＢｓＡｇを精製することによりＨＢＶ成分を調製する工程であって、ここで該プラスミドは：（１）該ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）該ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、工程；
（ｂ）少なくとも１つの非ＨＢＶ成分を調製する工程；ならびに
（ｃ）多価組成物を得るために該ＨＢＶおよび非ＨＢＶを混合する工程
を包含する、多価免疫原性組成物を調製するためのプロセス。
【請求項２】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されたＨＢｓＡｇを含むＨＢＶ成分であって、該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、ＨＢＶ成分；
（ｂ）少なくとも１つの非ＨＢＶ成分
を含む、多価免疫原性組成物。
【請求項３】
前記組成物がまた、１つ以上のアジュバントを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記非ＨＢＶ成分がジフテリアトキソイドを含む、請求項１〜３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項５】
前記非ＨＢＶ成分が破傷風トキソイドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項６】
前記非ＨＢＶ成分が細胞性百日咳抗原を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項７】
前記非ＨＢＶ成分が非細胞性百日咳抗原を含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項８】
前記非ＨＢＶ成分がＡ型肝炎ウイルス抗原を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項９】
前記非ＨＢＶ成分が結合体化ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ莢膜サッカリドを含む、請求項１〜８のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１０】
前記非ＨＢＶ成分が不活化ポリオウイルスを含む、請求項１〜９のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１１】
前記非ＨＢＶ成分が血清群Ｃの結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１２】
前記非ＨＢＶ成分が血清群Ａの結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１３】
前記非ＨＢＶ成分が血清群Ｗ１３５の結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１４】
前記非ＨＢＶ成分が血清群Ｙの結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１５】
前記組成物が二価のＨＢＶ−ＨＡＶ組成物である、請求項１〜１４のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１６】
前記組成物が二価のＨＢＶ−Ｈｉｂ組成物である、請求項１〜１５のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１７】
前記組成物が三価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ組成物である、請求項１〜１６のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１８】
前記組成物が四価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ組成物である、請求項１〜１７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１９】
前記組成物が四価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ組成物である、請求項１〜１８のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２０】
前記組成物が四価のＨＢＶ−ＨＡＶ組成物である、請求項１〜１９のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２１】
前記組成物が五価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＩＰＶ組成物である、請求項１〜２０のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２２】
前記組成物が五価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−Ｈｉｂ組成物である、請求項１〜２１のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２３】
前記組成物が五価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−Ｈｉｂ組成物である、請求項１〜２２のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２４】
前記組成物が六価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−Ｈｉｂ−ＩＰＶ組成物である、請求項１〜２３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２５】
前記組成物が七価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＡ−ＭｅｎＣ組成物である、請求項１〜２４のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２６】
前記組成物が七価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−Ｈｉｂ−ＩＰＶ−ＭｅｎＣ組成物である、請求項１〜２５のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２７】
前記組成物が水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２８】
前記ＨＢｓＡｇがポリソルベート２０を含む、請求項１〜２７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２９】
前記ＨＢｓＡｇがホスファチジルイノシトールを含む、請求項１〜２８のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３０】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において発現後、ＨＢｓＡｇを精製することによりＨＢＶ成分を調製する工程であって、ここで該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子の上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、工程；
（ｂ）免疫原性組成物を得るためにＨＢｓＡｇをアジュバントと合わせる工程であって、ただし、ここで該アジュバントは水酸化アルミニウムアジュバントではない、工程
を包含する、一価の免疫原性組成物を調製するためのプロセス。
【請求項３１】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において発現後、ＨＢｓＡｇを精製することによりＨＢＶ成分を調製する工程であって、ここで該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、工程；
（ｂ）免疫原性組成物を得るためにＨＢｓＡｇをアジュバントと合わせる工程であって、ただし、ここで該アジュバントはアルミニウム塩のみから構成されない、工程
を包含する、一価の免疫原性組成物を調製するためのプロセス。
【請求項３２】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されるＨＢｓＡｇを含むＨＢＶ成分であって、ここで該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、ＨＢＶ成分；ならびに
（ｂ）水酸化アルミニウムではないアジュバント
を含む、一価の免疫原性組成物。
【請求項３３】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されるＨＢｓＡｇを含むＨＢＶ成分であって、ここで該プラスミドは：（１）該ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）該ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、ＨＢＶ成分；ならびに
（ｂ）アルミニウム塩のみから構成されないアジュバント
を含む、一価の免疫原性組成物。
【請求項３４】
前記アジュバントがリン酸アルミニウムアジュバントおよび３Ｄ−ＭＰＬアジュバントの混合物を含む、請求項３０または３１に記載のプロセスあるいは請求項３２または請求項３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記３Ｄ−ＭＰＬおよびＨＢｓＡｇの両方が前記リン酸アルミニウムに吸着される、請求項３４に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３６】
前記ＨＢｓＡｇがポリソルベート２０を含む、請求項３０〜３５のいずれか１つに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３７】
前記ＨＢｓＡｇがホスファチジルイノシトールを含む請求項３０〜３６のいずれか１つに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３８】
前記組成物が血液透析患者または血液透析前の患者において使用するためである、請求項３０〜３７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３９】
前記プラスミドはまた：（３）ＬＥＵ２選択マーカー；（４）２μプラスミド配列；および（５）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて機能的な複製起点；
を含む、請求項１〜３８のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４０】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主はロイシンの栄養要求株であるが、前記プラスミドＬＥＵ２マーカーはロイシン供給源の非存在下において該宿主を成長させる、請求項３９に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４１】
前記上流プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４０のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４２】
配列番号１の直後にＨＢｓＡｇの開始コドンが続く、請求項４１に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４３】
前記ＨＢｓＡｇが、配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４２のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４４】
ＨＢｓＡｇが、配列番号４のヌクレオチド配列により前記プラスミド中にコードされる、請求項１〜４３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４５】
配列番号４の直後にオーカー終止コドンが続く、請求項４４に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４６】
前記ＡＲＧ３ターミネーターが配列番号８のヌクレオチド配列を含む請求項１〜４５のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４７】
配列番号８が前記ＨＢｓＡｇコード配列の終止コドンのすぐ下流である、請求項４６に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４８】
前記組成物が、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有する、請求項１〜４７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４９】
請求項１〜４８に記載の組成物を患者に投与する工程を包含する、患者において免疫応答を惹起するための方法。
【請求項５０】
患者に投与するための医薬の製造において（ｉ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されるＨＢｓＡｇであって、ここで該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、ＨＢｓＡｇ；ならびに（ｉｉ）１つ以上の非ＨＢＶ抗原の、使用。
【請求項５１】
患者に投与するための医薬の製造において（ｉ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されるＨＢｓＡｇであって、ここで該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、ＨＢｓＡｇ；ならびに（ｉｉ）水酸化アルミニウム以外のアジュバントの、使用。
【請求項５２】
（１）配列番号３のアミノ酸配列をコードするＨＢｓＡｇコード配列；（２）該ＨＢｓＡｇコード配列の上流かつ該ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーターであって配列番号１のアミノ酸配列を含む、プロモーター；および
（３）該ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターであって配列番号８を含む、ターミネーター
を含むプラスミド。
【請求項５３】
１４５００と１５０００の間の塩基対を有する、請求項５２に記載のプラスミド。
【請求項５４】
請求項５２または請求項５３のプラスミドを保持する酵母。
【請求項１】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主における発現後、ＨＢｓＡｇを精製することによりＨＢＶ成分を調製する工程であって、ここで該プラスミドは：（１）該ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）該ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、工程；
（ｂ）少なくとも１つの非ＨＢＶ成分を調製する工程；ならびに
（ｃ）多価組成物を得るために該ＨＢＶおよび非ＨＢＶを混合する工程
を包含する、多価免疫原性組成物を調製するためのプロセス。
【請求項２】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されたＨＢｓＡｇを含むＨＢＶ成分であって、該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、ＨＢＶ成分；
（ｂ）少なくとも１つの非ＨＢＶ成分
を含む、多価免疫原性組成物。
【請求項３】
前記組成物がまた、１つ以上のアジュバントを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記非ＨＢＶ成分がジフテリアトキソイドを含む、請求項１〜３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項５】
前記非ＨＢＶ成分が破傷風トキソイドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項６】
前記非ＨＢＶ成分が細胞性百日咳抗原を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項７】
前記非ＨＢＶ成分が非細胞性百日咳抗原を含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項８】
前記非ＨＢＶ成分がＡ型肝炎ウイルス抗原を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項９】
前記非ＨＢＶ成分が結合体化ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ莢膜サッカリドを含む、請求項１〜８のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１０】
前記非ＨＢＶ成分が不活化ポリオウイルスを含む、請求項１〜９のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１１】
前記非ＨＢＶ成分が血清群Ｃの結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１２】
前記非ＨＢＶ成分が血清群Ａの結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１３】
前記非ＨＢＶ成分が血清群Ｗ１３５の結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１４】
前記非ＨＢＶ成分が血清群Ｙの結合体化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１５】
前記組成物が二価のＨＢＶ−ＨＡＶ組成物である、請求項１〜１４のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１６】
前記組成物が二価のＨＢＶ−Ｈｉｂ組成物である、請求項１〜１５のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１７】
前記組成物が三価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ組成物である、請求項１〜１６のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１８】
前記組成物が四価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ組成物である、請求項１〜１７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１９】
前記組成物が四価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ組成物である、請求項１〜１８のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２０】
前記組成物が四価のＨＢＶ−ＨＡＶ組成物である、請求項１〜１９のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２１】
前記組成物が五価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＩＰＶ組成物である、請求項１〜２０のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２２】
前記組成物が五価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−Ｈｉｂ組成物である、請求項１〜２１のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２３】
前記組成物が五価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−Ｈｉｂ組成物である、請求項１〜２２のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２４】
前記組成物が六価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−Ｈｉｂ−ＩＰＶ組成物である、請求項１〜２３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２５】
前記組成物が七価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＡ−ＭｅｎＣ組成物である、請求項１〜２４のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２６】
前記組成物が七価のＨＢＶ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−Ｈｉｂ−ＩＰＶ−ＭｅｎＣ組成物である、請求項１〜２５のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２７】
前記組成物が水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２８】
前記ＨＢｓＡｇがポリソルベート２０を含む、請求項１〜２７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２９】
前記ＨＢｓＡｇがホスファチジルイノシトールを含む、請求項１〜２８のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３０】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において発現後、ＨＢｓＡｇを精製することによりＨＢＶ成分を調製する工程であって、ここで該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子の上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、工程；
（ｂ）免疫原性組成物を得るためにＨＢｓＡｇをアジュバントと合わせる工程であって、ただし、ここで該アジュバントは水酸化アルミニウムアジュバントではない、工程
を包含する、一価の免疫原性組成物を調製するためのプロセス。
【請求項３１】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主において発現後、ＨＢｓＡｇを精製することによりＨＢＶ成分を調製する工程であって、ここで該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、工程；
（ｂ）免疫原性組成物を得るためにＨＢｓＡｇをアジュバントと合わせる工程であって、ただし、ここで該アジュバントはアルミニウム塩のみから構成されない、工程
を包含する、一価の免疫原性組成物を調製するためのプロセス。
【請求項３２】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されるＨＢｓＡｇを含むＨＢＶ成分であって、ここで該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、ＨＢＶ成分；ならびに
（ｂ）水酸化アルミニウムではないアジュバント
を含む、一価の免疫原性組成物。
【請求項３３】
（ａ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されるＨＢｓＡｇを含むＨＢＶ成分であって、ここで該プラスミドは：（１）該ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）該ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、ＨＢＶ成分；ならびに
（ｂ）アルミニウム塩のみから構成されないアジュバント
を含む、一価の免疫原性組成物。
【請求項３４】
前記アジュバントがリン酸アルミニウムアジュバントおよび３Ｄ−ＭＰＬアジュバントの混合物を含む、請求項３０または３１に記載のプロセスあるいは請求項３２または請求項３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記３Ｄ−ＭＰＬおよびＨＢｓＡｇの両方が前記リン酸アルミニウムに吸着される、請求項３４に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３６】
前記ＨＢｓＡｇがポリソルベート２０を含む、請求項３０〜３５のいずれか１つに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３７】
前記ＨＢｓＡｇがホスファチジルイノシトールを含む請求項３０〜３６のいずれか１つに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３８】
前記組成物が血液透析患者または血液透析前の患者において使用するためである、請求項３０〜３７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３９】
前記プラスミドはまた：（３）ＬＥＵ２選択マーカー；（４）２μプラスミド配列；および（５）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて機能的な複製起点；
を含む、請求項１〜３８のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４０】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主はロイシンの栄養要求株であるが、前記プラスミドＬＥＵ２マーカーはロイシン供給源の非存在下において該宿主を成長させる、請求項３９に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４１】
前記上流プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４０のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４２】
配列番号１の直後にＨＢｓＡｇの開始コドンが続く、請求項４１に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４３】
前記ＨＢｓＡｇが、配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４２のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４４】
ＨＢｓＡｇが、配列番号４のヌクレオチド配列により前記プラスミド中にコードされる、請求項１〜４３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４５】
配列番号４の直後にオーカー終止コドンが続く、請求項４４に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４６】
前記ＡＲＧ３ターミネーターが配列番号８のヌクレオチド配列を含む請求項１〜４５のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４７】
配列番号８が前記ＨＢｓＡｇコード配列の終止コドンのすぐ下流である、請求項４６に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４８】
前記組成物が、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有する、請求項１〜４７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４９】
請求項１〜４８に記載の組成物を患者に投与する工程を包含する、患者において免疫応答を惹起するための方法。
【請求項５０】
患者に投与するための医薬の製造において（ｉ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されるＨＢｓＡｇであって、ここで該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、ＨＢｓＡｇ；ならびに（ｉｉ）１つ以上の非ＨＢＶ抗原の、使用。
【請求項５１】
患者に投与するための医薬の製造において（ｉ）ＨＢｓＡｇコード配列を有するプラスミドを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現されるＨＢｓＡｇであって、ここで該プラスミドは：（１）ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む、ＨＢｓＡｇ；ならびに（ｉｉ）水酸化アルミニウム以外のアジュバントの、使用。
【請求項５２】
（１）配列番号３のアミノ酸配列をコードするＨＢｓＡｇコード配列；（２）該ＨＢｓＡｇコード配列の上流かつ該ＨＢｓＡｇコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーターであって配列番号１のアミノ酸配列を含む、プロモーター；および
（３）該ＨＢｓＡｇコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターであって配列番号８を含む、ターミネーター
を含むプラスミド。
【請求項５３】
１４５００と１５０００の間の塩基対を有する、請求項５２に記載のプラスミド。
【請求項５４】
請求項５２または請求項５３のプラスミドを保持する酵母。
【公表番号】特表２００８−５３６５１５（Ｐ２００８−５３６５１５Ａ）
【公表日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０７７６０（Ｐ２００８−５０７７６０）
【出願日】平成１８年４月１４日（２００６．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１４２４０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１３５２８
【国際公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（５０６３６１１００）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド (44)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１４日（２００６．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１４２４０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１３５２８
【国際公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（５０６３６１１００）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド (44)
【Ｆターム（参考）】
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