ワクチンアジュバントの組み合わせ
水中油型エマルジョン、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性ポリマーを含む免疫学的アジュバントであって、ここで上記オリゴヌクレオチドおよび上記ポリマーは、理想的には、互いに会合して、複合体を形成する、免疫学的アジュバント。上記アジュバントは、ワクチンを調製するために、免疫原と合わせられ得る。上記オリゴヌクレオチドおよびポリマーの複合体は吸着性である。上記吸着性複合体の平均直径は上記エマルジョン中の油滴の平均直径より大きい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００８年９月１８日に出願された米国仮出願第６１／１９２，５７７号からの優先権を主張し、上記米国仮出願の全容は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ワクチンアジュバントおよびそれらの組み合わせの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
水中油型エマルジョンは、ワクチンアジュバントとしての使用について公知であり、ＦＬＵＡＤＴＭ製品は、水中スクアレン型「ＭＦ５９」アジュバントを含む。本発明の目的は、改変および改善されたエマルジョンアジュバントを提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の開示）
本発明は、水中油型エマルジョン、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む免疫学的アジュバントを提供する。上記オリゴヌクレオチドおよび上記ポリマーは、理想的には、互いに会合して、複合体を形成する。
【０００５】
本発明はまた、本発明の免疫学的アジュバントを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、水中油型エマルジョンと、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体とを混合する工程を包含する。
【０００６】
本発明はまた、（ｉ）本発明のアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を含む免疫原性組成物を提供する。
【０００７】
本発明はまた、（ｉ）本発明のアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を混合する工程を包含する、免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供する。
【０００８】
上記免疫原、エマルジョン、オリゴヌクレオチドおよびポリマーは、任意の順序で混合され得る。例えば、本発明は、本発明の免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）水中油型エマルジョン、および（ｉｉ）免疫原を混合する工程；ならびにその後、上記エマルジョン／免疫原混合物と、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーとを混合する工程を包含する。
【０００９】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマー（代表的には、複合体の形態にある）と、（ｉｉ）免疫原とを混合する工程；ならびにその後、上記オリゴヌクレオチド／ポリマー／免疫原複合体と、水中油型エマルジョンとを混合する工程を包含する。
【００１０】
本発明はまた、（ｉ）本発明のアジュバントを含む第１の容器；および（ｉｉ）免疫原および／もしくはさらなるアジュバントを含む第２の容器を含むキットを提供する。本発明はまた、（ｉ）水中油型エマルジョンを含む第１の容器；ならびに（ｉｉ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む第２の容器を含むキットを提供する。上記第１の容器および第２の容器のうちの一方もしくは両方は、免疫原を含み得る。従って、上記２つの容器の内容物は、（例えば、使用の時点で）組み合わされて、本発明のアジュバントもしくは免疫原性組成物を形成し得る。これらキットは、免疫原および／もしくはさらなるアジュバントを含む第３の容器を含み得る。
【００１１】
本発明はまた、水中油型エマルジョンおよび吸着性粒状アジュバントを含む免疫学的アジュバントを提供し、ここで上記吸着性粒状アジュバントにおける粒子の平均直径および上記エマルジョン中の油滴の平均直径はともに、２５０ｎｍ未満（例えば、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、≦１９０ｎｍ、≦１８０ｎｍ、≦１５０ｎｍ、≦１２０ｎｍ、≦１００ｎｍなど）である。上記粒状アジュバントが、ある直径の範囲を有する粒子を有する場合、これら直径は、油滴粒径と重なり合わない可能性がある（すなわち、最大の油滴は、最小のアジュバント粒子より小さいか、または最大のアジュバント粒子は、最小の油滴より小さい）。しかし、他の実施形態において、上記サイズ分布は、重なり合い得る。いくつかの実施形態において、上記アジュバント粒子の平均直径は、上記油滴の平均直径と実質的に同じであってもよいし、これら２つの直径は、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％などだけ異なっていてもよい。
【００１２】
本発明はまた、水中油型エマルジョンおよび吸着性粒状アジュバントを含む免疫学的アジュバントを提供し、ここで上記吸着性粒状アジュバントにおける粒子の平均直径は、上記エマルジョン中の油滴の平均直径より大きい。上記吸着性粒状アジュバントは、理想的には、（ｉ）不溶性アルミニウム塩もしくはカルシウム塩も、（ｉｉ）ポリマー微粒子も含まず、むしろ、好ましくは、（ｉｉｉ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体を含む。水中油型エマルジョンとこのような複合体との混合は、上記複合体の分析された平均直径を低減するために本明細書で示される。
【００１３】
本発明はまた、（ｉ）水中油型エマルジョンおよび吸着性粒状アジュバントを含む免疫学的アジュバント；ならびに（ｉｉ）免疫原を含む免疫原性組成物を提供する。上記のように、上記吸着性粒状アジュバントは、理想的には、不溶性アルミニウム塩もカルシウム塩も、ポリマー微粒子も含まず、好ましくは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体である。代表的には、上記免疫原は、上記吸着性粒状アジュバントに少なくとも部分的に吸着される。
【００１４】
本発明はまた、水中油型エマルジョンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫学的アジュバントを提供し、ここで上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１種のＣｐＩモチーフ（イノシンに結合したシトシンを含むジヌクレオチド配列）を含む。上記オリゴデオキシヌクレオチドは、１種より多い（例えば、２種、３種、４種、５種、６種以上）ＣｐＩモチーフを含み得、これらは、直接反復され得る（例えば、配列（ＣＩ）ｘを含み、ここでｘは、２、３、４、５、６以上である）か、または互いに分離され得る（例えば、配列（ＣＩＮ）ｘを含み、ここでｘは、２、３、４、５、６以上であり、各Ｎは、１種以上のヌクレオチドを独立して表す）。上記オリゴヌクレオチド中のシトシン残基は、理想的には、メチル化されていない。本発明はまた、この免疫学的アジュバントを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、水中油型エマルジョンと、ＣｐＩ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドとを混合する工程を包含する。本発明はまた、（ｉ）このアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を含む免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）このアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を混合する工程を含む。本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）水中油型エマルジョンおよび（ｉｉ）免疫原を混合する工程；ならびにその後、上記エマルジョン／免疫原混合物と、ＣｐＩ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドとを混合する工程を包含する。
【００１５】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）ＣｐＩ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび（ｉｉ）免疫原を混合する工程；ならびにその後、上記オリゴヌクレオチド／免疫原混合物と、水中油型エマルジョンとを混合する工程を包含する。
【００１６】
（水中油型エマルジョン）
本明細書で使用される水中油型エマルジョンは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）および生体適合性である。
【００１７】
上記エマルジョン中の油滴は、一般に、５μｍ直径未満であり、理想的には、サブミクロンの直径を有し、これら小さなサイズは、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）で達成され、安定なエマルジョンを提供する。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得るので、好ましい。いくつかの有用なエマルジョンにおいて、上記油滴のうちの少なくとも８０％（数で）は、５００ｎｍ未満の直径を有する。
【００１８】
上記エマルジョンは、油（例えば、動物（例えば、魚類）もしくは植物源に由来するもの）を含み得る。植物油供給源としては、堅果、種子および穀類が挙げられる。ラッカセイ油、大豆油、ココナツ油、およびオリーブ油（最も一般的に市販されている）は、上記堅果油の例である。ホホバ油が使用され得、例えば、ホホバ豆から得られ得る。種子油としては、サフラワー油、ココナツシード油、ヒマワリ油、ごま油などが挙げられる。穀類グループにおいて、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、他の穀物（ｃｅｒｅａｌ ｇｒａｉｎ）の油（例えば、小麦、オート麦、ライ麦、コメ、テフ、ライ小麦など）もまた、使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油中には天然に存在しないが、堅果油および種子油から生じる適切な物質の加水分解、分離およびエステル化によって、調製され得る。哺乳動物の乳汁に由来する脂肪および油は、代謝可能であり、従って、本発明の実施において使用され得る。分離、精製、鹸化および動物供給源から純粋な油を得るために必要な他の手段のための手順は、当該分野で周知である。大部分の魚類は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油（例えば、鯨ろう）は、本明細書で使用され得る魚油のうちのいくつかの例である。多くの分枝鎖の油は、５個の炭素のイソプレンユニットにおいて生化学的に合成され、一般に、テルペノイドといわれる。サメ肝油は、スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）として公知の分枝状の不飽和テルペノイドを含む。スクアラン（スクアレンの飽和アナログ）も、使用され得る。魚油（スクアレンおよびスクアランが挙げられる）は、商業的供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野で公知の方法によって得られ得る。スクアレンが好ましい。
【００１９】
他の有用な油は、トコフェロールであり、トコフェロールは、有利なことには、年配の被験体（例えば、６０歳以上）において使用するためのワクチン中に含まれる。なぜなら、ビタミンＥは、この被験体群において免疫応答に対して陽性の効果を有することが報告されたからである。トコフェロールはまた、エマルジョンの安定化の一助となり得る抗酸化特性を有する。種々のトコフェロールが存在する（α、β、γ、δ、εもしくは）が、αが通常使用される。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチンと適合性であり、水銀化合物の代替として有用な保存剤であることが公知である。
【００２０】
油の混合物が使用され得る（例えば、スクアレンおよびα−トコフェロール）。
【００２１】
２〜２０％（容積で）の範囲の油含有量が、代表的である。
【００２２】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類され得る。本発明で有用ないくつかの界面活性剤は、少なくとも１０、例えば、少なくとも１５もしくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、以下が挙げられるが、これらに限定されない界面活性剤とともに使用され得る：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（（一般に、Ｔｗｅｅｎといわれる）特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０）；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／もしくはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸＴＭ商品名の下で市販される）（例えば、直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；オクトキシノール（これは、反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変化し得る）（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）は、特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（レシチン））；ノニルフェノールエトキシレート（例えば、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ ＮＰシリーズ）；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般には、ＳＰＡＮとして公知）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレート。非イオン性界面活性剤が、好ましい。上記エマルジョン中に含めるための最も好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；Ｔｗｅｅｎ ８０）である。
【００２３】
界面活性剤の混合物が、使用され得る（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５の混合物）。ポリオキシエチレンソルビタンエステルとオクトキシノールとの組み合わせもまた、適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／もしくはオクトキシノールとを含む。
【００２４】
界面活性剤の有用な量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエスエル（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０） ０．０１〜１％（特に、約０．１％）；オクチルもしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、もしくはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤） ０．００１〜０．１％（特に、０．００５〜０．０２％）；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９） ０．１〜２０％（例えば、０．１〜１０％および特に、０．１〜１％もしくは約０．５％）である。
【００２５】
スクアレン含有エマルジョンが好ましく、特に、ポリソルベート８０を含むものが好ましい。
【００２６】
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
・スクアレン、ポリソルベート８０、およびソルビタントリオレエートのサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの容積での組成は、約５％ スクアレン、約０．５％ ポリソルベート８０および約０．５％ Ｓｐａｎ ８５であり得る。重量では、これら比は、４．３％ スクアレン、０．５％ ポリソルベート８０および０．４８％ Ｓｐａｎ ８５になる。このアジュバントは、引用文献４の第１０章および引用文献５の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［１〜３］。上記ＭＦ５９エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。
【００２８】
・スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート８０のサブミクロンエマルジョン。これらエマルジョンは、２〜１０％ スクアレン、２〜１０％ トコフェロールおよび０．３〜３％ ポリソルベート８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、≦１（例えば、０．９０）である。なぜなら、これは、より安定なエマルジョンを提供し得るからである。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容積比もしくは約１１：５の重量比で存在し得る。１種のこのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ ８０をＰＢＳ中に溶解して、２％溶液を与え、次いで、この溶液９０ｍｌと、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌ スクアレン）の混合物とを混合し、次いで、上記混合物をマイクロフルイダイズする（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅ）ことによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、例えば、１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロン油滴を有する。上記エマルジョンはまた、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ−ＭＰＬ）を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、ヒトの用量あたり、０．５〜１０ｍｇ スクアレン、０．５〜１１ｍｇ トコフェロール、および０．１〜４ｍｇ ポリソルベート８０を含み得る［６］。
【００２９】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（上記を参照のこと）を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
【００３０】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌ ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ α−トコフェロールスクシネート）の質量比でこれら３種の成分を含み得、これら濃度は、抗原由来のこれら成分の何らかの寄与を含むはずである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬを含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
【００３１】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ Ｌ１２１」）のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でトレオニル−ＭＤＰとともに使用されてきた［７］（０．０５〜１％ Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％ スクアラン、２．５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバントでのように［８］（５％ スクアラン、１．２５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）、上記Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用され得る。マイクロフルイダイゼーションは好ましい。
【００３２】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル（ｍａｎｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）もしくは「Ｓｐａｎ ８０」））を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または上記油滴のうちの少なくとも９０％（容積で）が、２００ｎｍ未満のサイズを有する［９］。上記エマルジョンはまた、アルジトール；凍結保護剤（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース））；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１種以上を含み得る。上記エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［１０］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。
【００３３】
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［１１］。アジュバント添加ワクチン中のこれら成分の最終濃度（重量）は、５％ スクアレン、４％ ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％ Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；トリカプリルグリセリド／トリカプリン酸グリセリル）である。
【００３４】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献１２に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。
【００３５】
・非代謝性の油（例えば、軽油）および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０もしくはＳｐａｎ ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体（例えば、参考文献１３に記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンを、デスアシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）に添加することにより生成されるＧＰＩ−０１００）、ジメチル（ｄｉｍｅｔｈｙｉ）ジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／もしくはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。
【００３６】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡもしくはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が螺旋状ミセルとして会合されるエマルジョン［１４］。
【００３７】
・ミネラルオイル、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン１５。
【００３８】
・ミネラルオイル、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［１５］。
【００３９】
上記のように、スクアレンを含む水中油型エマルジョンは、特に好ましい。いくつかの実施形態において、ワクチン用量における上記スクアレンの濃度は、５〜１５ｍｇの範囲（すなわち、０．５ｍｌ用量容積と仮定すると、濃度１０〜３０ｍｇ／ｍｌ）にあり得る。しかし、例えば、＜５ｍｇ／用量、またはさらに＜１．１ｍｇ／用量を含むように、スクアレンの濃度を低下させることは可能である［１６，１７］。例えば、ヒトの用量は、９．７５ｍｇ スクアレン／用量（ＦＬＵＡＤＴＭ製品における場合：０．５ｍｌ用量容積中、９．７５ｍｇ スクアレン、１．１７５ｍｇ ポリソルベート８０、１．１７５ｍｇ ソルビタントリオレエート）を含み得るか、またはその分数量（例えば、３／４、２／３、１／２、２／５、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、もしくは１／１０）を含み得る。例えば、組成物は、４．８７５ スクアレン／用量（従って、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートは各々０．５８８ｍｇ）、３．２５ｍｇ スクアレン／用量、２．４３８ｍｇ／用量、１．９５ｍｇ／用量、０．９７５ｍｇ／用量などを含み得る。上記ＦＬＵＡＤＴＭ−ストレングス（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）ＭＦ５９のこれら分数希釈のいずれかは、８．３：１：１（質量で）のスクアレン：ポリソルベート−８０：ソルビタン−トリオレエート比率を維持しながら、本発明とともに使用され得る。
【００４０】
（免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマー）
本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを使用する。これらは、理想的には、互いに会合されて、粒状複合体を形成し、この複合体は、有用なことには、ＴＬＲ９アゴニストである。
【００４１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、有用なアジュバントとして公知である。それらはしばしば、ＣｐＧモチーフ（グアノシンに結合した非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含み、それらのアジュバント効果は、参考文献１８〜２３において議論されている。ＴｐＧモチーフ、パリンドローム配列、複数の保存的チミジンヌクレオチド（例えば、ＴＴＴＴ）、複数の保存的シトシンヌクレオチド（例えば、ＣＣＣＣ）もしくはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドもまた、二本鎖ＲＮＡとして存在するので、公知の免疫刺激剤である。これら種々の免疫刺激性オリゴヌクレオチドのうちのいずれかが本発明とともに使用され得るが、デオキシイノシンおよび／もしくはデオキシウリジンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、ならびに理想的には、デオキシイノシンおよびデオキシシトシンを含むオリゴデオキシヌクレオチドを使用することが、好ましい。イノシン含有オリゴデオキシヌクレオチドは、ＣｐＩモチーフ（イノシンに結合されたシトシンを含むジヌクレオチド配列）を含み得る。上記オリゴデオキシヌクレオチドは、１つより多い（例えば、２個、３個、４個、５個、６個以上）ＣｐＩモチーフを含み得、これらは、直接反復されてもよいし（例えば、配列（ＣＩ）ｘを含み、ここでｘは、２、３、４、５、６以上である）、互いに分離していてもよい（例えば、配列（ＣＩＮ）ｘを含み、ここでｘは、２、３、４、５、６以上であり、各Ｎは、独立して、１個以上のヌクレオチドを表す）。シトシン残基は、理想的には、メチル化されていない。
【００４２】
上記オリゴヌクレオチドは、代表的には、１０〜１００ヌクレオチド、例えば、１５〜５０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、もしくは２５〜２８ヌクレオチドを有する。上記オリゴヌクレオチドは、代表的には、一本鎖である。
【００４３】
上記オリゴヌクレオチドは、もっぱら天然のヌクレオチドを含み得るか、もっぱら非天然のヌクレオチドを含み得るか、またはその両方の混合物を含み得る。例えば、上記ヌクレオチドは、１個以上のホスホロチオエート結合を含み得、および／もしくは１個以上のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を有し得る。
【００４４】
本発明での使用に好ましいオリゴヌクレオチドは、２６−ｍｅｒ配列 ５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号１）を含む一本鎖デオキシヌクレオチドである。このオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリカチオン性ポリマーと安定な複合体を形成して、良好なアジュバントを与える。
【００４５】
上記ポリカチオン性ポリマーは、理想的には、ポリカチオン性ペプチドである。上記ポリマーは、１個以上のロイシンアミノ酸残基および／もしくは１個以上のリジンアミノ酸残基を含み得る。上記ポリマーは、１個以上のアルギニンアミノ酸残基を含み得る。上記ポリマーは、これらアミノ酸のうちの１つの、少なくとも１個の直接反復（例えば、１個以上のＬｅｕ−Ｌｅｕジペプチド配列、１個以上のＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド配列、もしくは１個以上のＡｒｇ−Ａｒｇジペプチド配列）を含み得る。上記ポリマーは、少なくとも１個（および好ましくは、複数の（例えば、２個もしくは３個））のＬｙｓ−Ｌｅｕジペプチド配列および／もしくは少なくとも１個（および好ましくは、複数の（例えば、２個もしくは３個））のＬｙｓ-Ｌｅｕ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含み得る。
【００４６】
上記ペプチドは、配列Ｒｌ−ＸＺＸＺｘＸＺＸ−Ｒ２（ここで：ｘは、３、４、５、６もしくは７であり；各Ｘは、独立して、正に荷電した天然のアミノ酸残基および／もしくは天然でないアミノ酸残基であり；各Ｚは、独立して、アミノ酸残基Ｌ、Ｖ、Ｉ、ＦもしくはＷであり；そしてＲ１およびＲ２は、独立して、−Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＯＣＨ３、もしくは−ＣＯＨからなる群より選択される）を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｘ−Ｒ２は、上記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のアミド、エステルもしくはチオエステルであり得る。
【００４７】
ポリカチオン性ペプチドは、代表的には、５〜５０個のアミノ酸（例えば、６〜２０個のアミノ酸、７〜１５個のアミノ酸、もしくは９〜１２個のアミノ酸）を有する。
【００４８】
ペプチドは、もっぱら天然のアミノ酸、もっぱら非天然のアミノ酸、もしくはその両方の混合物を含み得る。上記ペプチドは、Ｌ−アミノ酸および／もしくはＤ−アミノ酸を含み得る。Ｌ−アミノ酸が代表的である。
【００４９】
ペプチドは、天然のＮ末端（ＮＨ２−）もしくは改変Ｎ末端（例えば、ヒドロキシル、アセチルなど）を有し得る。ペプチドは、天然のＣ末端（−ＣＯＯＨ）もしくは改変Ｃ末端（例えば、ヒドロキシル、アセチルなど）を有し得る。このような改変は、上記ペプチドの安定性を改善し得る。
【００５０】
本発明で使用するのに好ましいペプチドは、１１−ｍｅｒのＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２）（全てＬ−アミノ酸）である。そのＮ末端は、脱アミノ化され得、そしてＣ末端は、ヒドロキシル化され得る。好ましいペプチドは、Ｈ−ＫＬＫＬ５ＫＬＫ−ＯＨ（全てＬ−アミノ酸）である。このオリゴペプチドは、公知の抗菌剤［２４］であり、好中球アクチベーター［２５］であり、アジュバント［２６］であり、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと安定な複合体を形成して、良好なアジュバントを与える。
【００５１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの最も好ましい混合物は、ＩＣ３１ＴＭとして公知のＴＬＲ９アゴニストであり［２７〜２９］、これは、オリゴデオキシヌクレオチド（配列番号１）およびポリカチオン性オリゴペプチド（配列番号２）の吸着性複合体である。
【００５２】
上記オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドは、種々の比で一緒に混合され得るが、一般に、モル過剰で上記ペプチドと混合される。上記モル過剰は、少なくとも５：１（例えば、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０；１、３５：１、４０：１など）であり得る。約２５：１のモル比が理想的である［３０，３１］。この過剰な比での混合は、オリゴヌクレオチドとオリゴペプチドとの間の不溶性粒状複合体の形成を生じ得る。上記複合体は、水中油型エマルジョンと合わせられ得る。
【００５３】
上記オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドは、代表的には、水性条件下で混合され、例えば、上記オリゴヌクレオチドの溶液は、所望の比で上記オリゴペプチドの溶液と混合され得る。上記２つの溶液は、乾燥した（例えば、凍結乾燥した）物質を、水もしくは緩衝液中に溶解して、ストック溶液（これは、次いで、混合され得る）を形成することによって調製され得る。
【００５４】
上記複合体は、参考文献３２で開示される方法を使用して分析され得る。それらは、理想的には、上記エマルジョン中の油滴の平均直径より大きい平均直径を有する。１μｍ〜２０μｍの範囲の平均直径を有する複合体が、使用され得る。いくつかの実施形態において、上記エマルジョンのサイズ分布と上記複合体のサイズ分布との間に重なり合いはなく、すなわち、エマルジョン中の最大の液滴は、最小の複合体より小さい（もしくは最大の複合体は、最小の液滴より小さい）。しかし、他の実施形態において、液滴直径および複合体直径の範囲は、重なり合ってもよい。
【００５５】
ポリアルギニンおよびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、同様に、複合体を形成する［３３］。
【００５６】
上記複合体は、水性懸濁物において（例えば、水中もしくは緩衝液中）維持され得る。上記複合体とともに使用するための代表的な緩衝液は、リン酸緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、トリス緩衝液、トリス／ソルビトール緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液などである。代替として、複合体は、ときおり、凍結乾燥され得る。
【００５７】
水性懸濁物中の複合体は、バルク媒体からそれらを（例えば、吸引、デカントなどによって）分離するために、遠心分離され得る。次いで、これら複合体は、代替の媒体（例えば、水中油型エマルジョン）中で再懸濁され得る。
【００５８】
（エマルジョン、オリゴヌクレオチドおよびポリマーの混合）
本発明のアジュバント組成物は、通常、水中油型エマルジョンと、オリゴヌクレオチド／ポリマー複合体とを混合することによって調製される。上記エマルジョンは液体であり、上記複合体は、代表的には、液体形態で維持され、よって、本発明のアジュバントは、２つの液体を混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、上記液体のうちの一方もしくは両方は、上記混合が本発明の免疫原性組成物を提供するように、免疫原を含む。他の実施形態においては、何れの液体も免疫複合体を含まない。よって、上記混合生成物（すなわち、本発明のアジュバント組成物）は、後に免疫原と合わせられて、本発明の免疫原性組成物を提供し得る。
【００５９】
２つの液体が混合される場合、混合の容積比は、変動し得る（例えば、２０：１〜１：２０の間、１０：１〜１：１０の間、５：１〜１：５の間、２：１〜１：２の間など）が、理想的には、約１：１である。上記２つの液体中の成分の濃度は、所望の最終濃度が混合の後に達成されるように選択され得る（例えば、１：１混合が所望の最終濃度を提供するように、両方とも２×強度で調製され得る）。
【００６０】
他の実施形態において、上記複合体は、液体形態ではなく（例えば、それらは、遠心分離されたかもしくは凍結乾燥された）、そしてそれらは、エマルジョンと合わせられ（例えば、エマルジョン中に溶解され）得る。
【００６１】
オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの種々の濃度が使用され得る（例えば、参考文献２７、３０、もしくは３１において、または参考文献３４において使用される濃度のうちのいずれか）。例えば、ポリカチオン性オリゴペプチドは、１１００μＭ、１０００μＭ、３５０μＭ、２２０μＭ、２００μＭ、１１０μＭ、１００μＭ、１１μＭ、１０μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭなどで存在し得る。オリゴヌクレオチドは、４４ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭ、１４ｎＭ、４．４ｎＭ、４ｎＭなどで存在し得る。２０００ｎＭ未満のポリカチオン性オリゴペプチド濃度が、代表的である。配列番号１および配列番号２については、１：２５のモル比で混合され、本発明の３つの実施形態における濃度（ｍｇ／ｍＬ単位）は、よって、０．３１１および１．３２２、または０．１０９および０．４６３、または０．０３１および０．１３２であり得る。
【００６２】
水中スクアレン型エマルジョンと、ＩＣ３１の水性調製物との１：１容積比での混合は、１ｍｌあたり以下の成分の最終量を有する組成物を与えるために使用され得る：スクアレン，４．９ｍｇ；ポリソルベート８０，５８８μｇ；カチオン性オリゴペプチド，５００ｎｍｏｌもしくは５０ｎｍｏｌ；オリゴヌクレオチド，２０ｎｍｏｌもしくは２ｎｍｏｌ。
【００６３】
（薬学的組成物）
本発明のアジュバント組成物は、通常、上記エマルジョン、オリゴヌクレオチドおよびポリマーに加えて、成分を含み、例えば、本発明のアジュバント組成物は、代表的には、１種以上の薬学的に受容可能な成分を含む。このような成分はまた、本発明の免疫原性組成物中に存在し得、上記アジュバント組成物もしくは別の組成物のいずれかに由来する。このような成分の詳細な議論は、参考文献３５で入手される。
【００６４】
組成物は、チメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）もしくは２−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。好ましくは、ワクチンは、水銀物質を実質的に含まない（例えば、＜１０μｇ／ｍｌ）べきである（例えば、チメロサール非含有）。水銀を含まないワクチンは、より好ましい。保存剤非含有ワクチンは、特に好ましい。α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチン中に、水銀化合物の代替として含まれ得る。
【００６５】
張度を制御するために、組成物は、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）を含み得る。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、および／もしくは塩化マグネシウムなどが挙げられる。
【００６６】
組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間（例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間）の、場合によっては、２８０〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇもしくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内の重量オスモル濃度を有し得る。
【００６７】
組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より代表的には、６．０〜８．０の間（例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間）である。
【００６８】
組成物は、好ましくは、無菌である。組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ ＥＵ（エンドトキシン単位、標準尺度）、好ましくは、＜０．１ ＥＵ／用量を含む）。組成物は、好ましくは、グルテン非含有である。
【００６９】
免疫原性組成物は、１回の免疫処置のための物質を含んでいてもよいし、複数回の免疫処置のための物質を含んでいてもよい（すなわち、「複数用量」キット）。保存剤を含めることは、複数用量の準備において有用である。複数用量組成物中に保存剤を含める代替として（もしくはそれに加えて）、上記組成物は、物質の取り出しのための無菌アダプタを有する容器中に含まれ得る。
【００７０】
組成物は、一般に、投与の時点で水性形態である。ワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与容積で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、例えば小児に、ときおり投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、より高い用量（例えば、約１ｍｌ）で、例えば、２つの０．５ｍｌ容積を混合した後に、投与され得る。
【００７１】
（免疫原）
本発明のアジュバント組成物は、免疫応答を誘導するために、免疫原と組み合わせて動物に投与され得る。本発明は、広範な疾患を処置するためもしくはそれらから防御するために、広範な免疫原とともに使用され得る。上記免疫原は、ウイルス性疾患（例えば、エンベロープに包まれたウイルスもしくはエンベロープに包まれていないウイルスに起因する）、細菌性疾患（例えば、グラム陰性細菌もしくはグラム陽性細菌に起因する）、真菌性疾患、寄生生物性疾患、自己免疫疾患、または任意の他の疾患から防御する免疫応答を惹起し得る。上記免疫原はまた、免疫療法において、例えば、腫瘍／がん、アルツハイマー病、もしくは嗜癖を処置するために有用であり得る。
【００７２】
上記免疫原は、種々の形態（例えば、完全な生物、外膜小胞、タンパク質、サッカリド、リポサッカリド、結合体（例えば、キャリアおよびハプテンの、またはキャリアおよびサッカリドもしくはリポサッカリドの）など）をとり得る。
【００７３】
上記免疫原は、インフルエンザウイルス（インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスを含む）に対する免疫応答を惹起し得る。水中油型エマルジョンアジュバント（特に、スクアレンを含むもの）の存在は、季節性インフルエンザワクチン［３６］および汎発流行性インフルエンザワクチン［３７，３８］の免疫応答の株交叉反応性を増強することが示された。インフルエンザウイルス免疫原の種々の形態が、現在入手可能であり、代表的には、生ウイルスもしくは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。不活化ワクチンは、完全ビリオン、スプリットビリオン、もしくは精製表面抗原に基づき得る。インフルエンザ抗原はまた、ビロゾーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）の形態で示され得る。赤血球凝集素は、現在の不活化ワクチンにおいて主要な免疫原であり、ワクチン用量は、ＨＡレベルを参照して標準化され、代表的には、ＳＲＩＤによって測定される。既存のワクチンは、代表的には、約１５μｇのＨＡ／株を含むが、より低い用量が、例えば、小児のために、もしくは汎発流行の状況において、またはアジュバントを使用する場合に、使用され得る。分数用量（例えば、１／２（すなわち、７．５μｇ ＨＡ／株）、１／４および１／８）が使用されてきており、同様に、より高い用量（例えば、３×もしくは９×用量［３９，４０］）も使用されてきた。従って、組成物は、０．１〜１５０μｇの間のＨＡ／インフルエンザ株、好ましくは、０．１〜５０μｇの間（例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなど）を含み得る。特定の用量は、例えば、約４５／株、約３０／株、約１５／株、約１０／株、約７．５／株、約５／株、約３．８／株、約１．９／株、約１．５／株などを含む。例えば、各株についての上記ＨＡ質量が、平均ＨＡ質量／株の１０％以内、好ましくは、平均の５％以内となるように上記ワクチン中に含まれる各株について実質的に同じ質量のＨＡを含めることは通常のことである。生ワクチンについては、投与は、ＨＡ含有量ではなく、組織培養感染量中央値（ｍｅｄｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、１株あたり１０６〜１０８の間（好ましくは、１０６．５〜１０７．５の間）のＴＣＩＤ５０が代表的である。ウイルス増殖の基質としてＳＰＦ卵を使用するのではなく（鶏卵の感染した尿膜腔液からウイルスが採取される）、インフルエンザウイルスの複製を支える細胞株が、使用され得る。上記細胞株は、代表的には、哺乳動物起源である（例えば、ＭＤＣＫ）。インフルエンザＡウイルス免疫原は、任意の適切なＨＡサブタイプ株（例えば、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９など）に由来し得る（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２および／もしくはＨ５Ｎ１株）。
【００７４】
上記免疫原は、カンジダ真菌（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する免疫応答を惹起し得る。例えば、上記免疫原は、β−グルカン（これは、キャリアタンパク質に結合体化され得る）であり得る。上記グルカンは、β−１，３および／もしくはβ−１，６結合を含み得る。適切な免疫原としては、参考文献４１および４２に開示されるものが挙げられる。
【００７５】
上記免疫原は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓが挙げられる）に対する免疫応答を惹起し得る。例えば、上記免疫原は、莢膜サッカリド（これは、キャリアタンパク質に結合体化され得る）であり得る。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅについては、上記サッカリドは、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、および／もしくはＶのうちの１つ以上に由来し得る。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについては、上記サッカリドは、血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および／もしくは２３Ｆのうちの１つ以上に由来し得る。莢膜サッカリド免疫原に加えて（もしくはその代わりに）、ポリペプチド免疫原が、防御的抗連鎖球菌免疫応答を惹起するために使用され得る。
【００７６】
上記免疫原は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する免疫応答を惹起し得る。例えば、上記免疫原は、莢膜サッカリド（これは、キャリアタンパク質に結合体化され得る）であり得る。莢膜サッカリドおよびそれらの結合体は、髄膜炎菌血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／もしくはＹから防御するために特に有用である。莢膜サッカリド免疫原に加えて（もしくはその代わりに）、ポリペプチド免疫原および／もしくは外膜小胞が、防御的抗髄膜炎菌免疫応答を惹起するために、例えば、参考文献４３に開示されるように、特に、血清型Ｂに対して使用するために、使用され得る。
【００７７】
上記免疫原は、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび／もしくはＣ型肝炎ウイルス）に対する免疫応答を惹起し得る。例えば、上記免疫原は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）であり得る。
【００７８】
上記免疫原は、ＲＳウイルスに対する免疫応答を惹起し得る。免疫原は、グループＡ ＲＳＶおよび／もしくはグループＢ ＲＳＶに由来し得る。適切な免疫原は、例えば、参考文献４４および４５で開示されるように、Ｆおよび／もしくはＧ糖タンパク質またはそのフラグメントを含み得る。
【００７９】
上記免疫原は、クラミジア細菌（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが挙げられる）に対する免疫応答を惹起し得る。適切な免疫原としては、参考文献４６〜５２で開示されるものが挙げられる。
【００８０】
上記免疫原は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌（腸管外病原性株を含む）に対する免疫応答を惹起し得る。適切な免疫原としては、参考文献５３〜５５で開示されるものが挙げられる。
【００８１】
上記免疫原は、コロナウイルス（例えば、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス）に対する免疫応答を惹起し得る。適切な免疫原は、スパイク糖タンパク質を含み得る。
【００８２】
上記免疫原は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細菌に対する免疫応答を惹起し得る。適切な免疫原としては、ＣａｇＡ［５６〜５９］、ＶａｃＡ［６０，６１］、および／もしくはＮＡＰ［６２〜６４］が挙げられる。
【００８３】
上記免疫原は、狂犬病ウイルスに対する免疫応答を惹起し得る。適切な免疫原は、不活性化狂犬病ウイルスである［６５，ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ］。
【００８４】
上記免疫原は、ヒトパピローマウイルスに対する免疫応答を惹起し得る。有用な免疫原は、Ｌ１キャプシドタンパク質（これは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として公知の構造を形成するようにアセンブルし得る）である。上記ＶＬＰは、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてもしくは昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞（例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）もしくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞）において、Ｌ１の組換え発現によって生成され得る。酵母細胞については、プラスミドベクターが上記Ｌ１遺伝子を有し得；昆虫細胞については、バキュロウイルスベクターが上記Ｌ１遺伝子を有し得る。より好ましくは、上記組成物は、ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株の両方に由来するＬ１ ＶＬＰを含む。この二価組み合わせは、非常に効率的であることが示された［６６］。ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株に加えて、ＨＰＶ−６株およびＨＰＶ−１１株に由来するＬ１ ＶＬＰを含めることも可能である。
【００８５】
上記免疫原は、腫瘍抗原（例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３（ＭＡＧＥ−Ａ３）、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＴＲＰ−２など）に対する免疫応答を惹起し得る。上記免疫原は、肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がんなどに対する免疫療法的応答を惹起し得る。
【００８６】
上記免疫原は、キャリアタンパク質に結合体化されたハプテンに対する免疫応答を惹起し得る（上記ハプテンは、乱用薬物である［６７］）。例としては、アヘン剤、マリファナ、アンフェタミン、コカイン、バルビツレート、グルテチミド、メチプリロン、抱水クローラル、メタクワロン、ベンゾジアゼピン、ＬＳＤ、ニコチン、抗コリン作用性薬物、抗精神病薬、トリプタミン、他の精神作用薬、鎮静薬、フェンシクリジン、プシロシビン（ｐｓｉｌｏｃｙｂｉｎｅ）、揮発性ニトレート、ならびに身体的および／もしくは精神的依存性を誘導する他の薬物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
種々の他の免疫原が使用され得る。
【００８８】
免疫原性組成物が、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体を含む場合、免疫原は、通常、上記複合体に吸着されるが、これは、必要ではない。従って、抗原は、遠心分離後に、上記複合体と会合され得る（このことは、吸着を示す）。免疫原が、複合体に「少なくとも部分的に吸着される」と記載される場合、上記組成物中のその免疫原の総量のうちの少なくとも１０％（重量で）が、例えば、＞２０％、＞３０％、＞４０％以上が吸着されることが好ましい。免疫原が、複合体に「吸着される」と記載される場合、上記組成物中のその免疫原の総量のうちの少なくとも５０％（重量で）が、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％以上が吸着されることが好ましい。いくつかの実施形態において、免疫原は、完全に吸着される。すなわち、遠心分離して、バルク液体媒体から複合体を分離した後に、上清中で検出不可である。しかし、他の実施形態において、吸着は認められない。
【００８９】
（組成物もしくはキット成分のパッケージング）
本発明のアジュバント組成物、免疫原性組成物およびキット成分に適切な容器としては、バイアル、シリンジ（例えば、使い捨てシリンジ）などが挙げられる。これら容器は、滅菌であるべきである。上記容器は、（例えば、同じボックス中で）キットを形成するために一緒にパッケージされ得る。
【００９０】
成分がバイアル中に配置される場合、上記バイアルは、ガラス物質もしくはプラスチック物質から作製され得る。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が上記バイアルに添加される前に、滅菌される。ラテックス感受性被験体に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有ストッパーでシールされ、全てのパッケージング物質中にラテックスが存在しないことが好ましい。上記バイアルは、ワクチンの単一用量を含んでいてもよいし、１用量より多い用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含み得る。有用なバイアルは、無色ガラスから作製される。ホウケイ酸ガラスは、ソーダ石灰ガラスより好ましい。バイアルは、ブチルゴムから作製されるストッパーを有し得る。
【００９１】
バイアルは、シリンジがキャップに挿入され得るように適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有し得る。バイアルキャップは、シールもしくはカバーの内部に配置され得る。その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップに到達し得る前に除去されなければならない。バイアルは、特に、複数用量バイアルについては、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【００９２】
成分がシリンジにパッケージされる場合、上記シリンジは、これに取り付けられるニードルを有し得る。ニードルが取り付けられていない場合、別個のニードルが、組み立ておよび使用のために、上記シリンジと共に供給され得る。このようなニードルは、鞘に入れられ得る。シリンジにおけるプランジャーは、上記プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されてしまわないように、ストッパーを有し得る。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは、一般に、ニードルの取り付け前に、先端をシールするために先端キャップを有し、上記先端キャップは、ブチルゴムから作製され得る。上記シリンジおよびニードルが別個にパッケージされる場合、上記ニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドと適合させられる。有用なシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で市販されるものである。
【００９３】
容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半用量容積を示すために印が付けられ得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌ容積を示す印を有し得る。
【００９４】
被験体投与のために必要とされるよりも多くの材料を含むことは、複数成分の製品において通常である。その結果、完全な最終用量容積が、物質移動における任意の非効率にも拘わらず、得られる。従って、個々の容器は、例えば、５〜２０容積％の過剰分（ｏｖｅｒｆｉｌｌ）を含み得る。
【００９５】
（処置方法および免疫原性組成物の投与）
本発明の組成物は、ヒト被験体への投与に適しており、本発明は、被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、本発明の免疫原性組成物を上記被験体に投与する工程を包含する。
【００９６】
本発明はまた、被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、本発明のキットの容器（もしくはシリンジのチャンバ）の内容物を混合する工程、および上記混合した内容物を上記被験体に投与する工程を包含する。
【００９７】
本発明はまた、例えば、被験体における免疫応答を惹起することにおいて使用するために、医薬として使用するための本発明の組成物もしくはキットを提供する。
【００９８】
本発明はまた、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、水中油型エマルジョン、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの使用を提供する。この医薬は、免疫原との組み合わせにおいて投与され得る。
【００９９】
本発明はまた、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、水中油型エマルジョン、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ポリカチオン性ポリマーおよび免疫原の使用を提供する。
【０１００】
これら方法および使用は、一般に、抗体応答、好ましくは、防御的抗体応答を引き起こすために使用される。
【０１０１】
本発明の組成物は、種々の方法において投与され得る。通常の免疫経路は、（例えば、腕もしくは脚への）筋肉内注射によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内経路、経口経路、口内経路、舌下経路、皮内経路、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）経路、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）経路などが挙げられる。
【０１０２】
本発明に従って調製される免疫原性組成物は、小児および成人両方を処置するためにワクチンとして使用され得る。被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受容するのに好ましい被験体は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院した被験体、ヘルスケア労働者、軍関係者および従軍者、妊娠女性、慢性疾患患者、免疫不全被験体、外国へ旅行するヒトなどである。ＩＣ３１ＴＭは、乳児集団において有効であることが示された［３４，６８］。しかし、上記ワクチンは、これらグループに対してのみ適切であるわけではなく、集団においてより一般に、使用され得る。
【０１０３】
処置は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによるものであり得る。複数用量は、初期刺激免疫スケジュールにおいておよび／もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路（例えば、初期刺激は非経口およびブースターは粘膜、初期刺激は粘膜およびブースターは非経口、など）によって与えられ得る。１より多い用量（代表的には、２用量）の投与は、免疫学的にナイーブな被験体において特に有用である。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。
【０１０４】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含み、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１０５】
語句「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まなくてもよい。必要であれば、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１０６】
数値ｘに関する用語「約」とは、任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１０７】
別段示されなければ、２種以上の成分を混合する工程を包含するプロセスは、いかなる特定の混合する順序も必要としない。従って、成分は、任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在する場合、２つの成分が、互いに合わされ得、次いで、その組み合わせが、第３の成分と合わせられ得るなど。
【０１０８】
動物（および特にウシ）の物質が、細胞培養において使用される場合、それら物質は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来物質が完全に存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。
【０１０９】
化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代わりに、適切なプロドラッグによって置換され得る。
【０１１０】
細胞基質が、再集合もしくは逆遺伝学手順のために、またはウイルス増殖のために使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ Ｅｕｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈａｐｔｅｒ ５．２．３におけるように、ヒトワクチン生成における使用のために承認されたものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、ＩＣ３１およびＭＦ５９の混合物における粒子直径を示す。ｙ軸は、体積（％）を示し、ｘ軸は、粒子直径（μｍ）を示す。
【図２】図２〜５は、（２）時間０；（３）３０分；（４）６時間；および（５）２４時間でのアジュバント添加Ｈ５Ｎ１抗原についての同じ分析を示す。
【図３】図２〜５は、（２）時間０；（３）３０分；（４）６時間；および（５）２４時間でのアジュバント添加Ｈ５Ｎ１抗原についての同じ分析を示す。
【図４】図２〜５は、（２）時間０；（３）３０分；（４）６時間；および（５）２４時間でのアジュバント添加Ｈ５Ｎ１抗原についての同じ分析を示す。
【図５】図２〜５は、（２）時間０；（３）３０分；（４）６時間；および（５）２４時間でのアジュバント添加Ｈ５Ｎ１抗原についての同じ分析を示す。
【図６】図６は、ＩＣ３１単独でアジュバント添加したＨ５Ｎ１抗原についての同じ分析を示す。
【図７】図７および図８は、注射の３日前から注射後５日までの経時的な体温（℃）を示す。
【図８】図７および図８は、注射の３日前から注射後５日までの経時的な体温（℃）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
（発明を実施するための様式）
（アジュバント）
水中スクアレン型エマルジョン（ＭＦ５９）を、参考文献４の第１０章で開示されるように調製した。ＩＣ３１を、参考文献３１で開示されるように、高濃度および低濃度（１０倍差）で調製した。アジュバント組み合わせを、ＭＦ５９と、ＩＣ３１ｈｉｇｈもしくはＩＣ３１ｌｏｗとを、１：１容積比もしくは５：１容積比のいずれかで混合することによって作製した。３つの個々のアジュバント（ＭＦ５９、ＩＣ３１ｈｉｇｈ、ＩＣ３１ｌｏｗ）、および２つの混合物（ＭＦ５９＋ＩＣ３１ｈｉｇｈ、ＭＦ５９＋ＩＣ３１ｌｏｗ）を、種々の免疫原と合わせ、それらの効力を評価するために、種々の哺乳動物に投与した。
【０１１３】
さらに、ＩＣ３１ｈｉｇｈおよびＩＣ３１ｌｏｗを、ＭＦ５９アジュバント添加インフルエンザワクチン（ＦＬＵＡＤＴＭ）と、１：１容積比で混合した。ヒト被験体については、上記混合を、免疫する直前に行った（「ベッドサイドミックス」）。
【０１１４】
（インフルエンザウイルス）
ＩＣ３１ｈｉｇｈもしくはＩＣ３１ｌｏｗのいずれかをＦＬＵＡＤＴＭに添加した後、上記インフルエンザ抗原は、上記ＩＣ３１複合体と迅速に会合（吸着）する。室温において、ＩＣ３１ｈｉｇｈの添加の３０分以内に、上記抗原のうちの少なくとも９８％が、上記ＩＣ３１粒子に吸着する。９６％吸着は、室温においてＩＣ３１ｌｏｗを添加した２時間後に認められた。より低い温度（４℃）で２４時間にわたって、９７％（ＩＣ３１ｈｉｇｈ）吸着もしくは９１％（ＩＣ３１ｌｏｗ）吸着が認められた。重量オスモル濃度およびｐＨは、ＩＣ３１ｈｉｇｈおよびＩＣ３１ｌｏｗの両方について、室温において２４時間にわたって実質的に一定のままであった。このことは、上記組み合わせが安定であることを示す。上記エマルジョンの粒径および上記ＩＣ３１複合体の粒径は、混合後、維持される。
【０１１５】
インフルエンザ抗原に、ＭＦ５９（ＦＬＵＡＤＴＭ）、ＩＣ３１（ＩＣ３１ｈｉｇｈもしくはＩＣ３１ｌｏｗのいずれか）、またはＭＦ５９＋ＩＣ３１の組み合わせ（等量の水性ＩＣ３１と混合した５０μＬ ＦＬＵＡＤＴＭ；両方のアジュバントは、２×強度で混合されて、希釈後に最終１×を与える）のいずれかをアジュバント添加した。種々の組成物の２用量をマウスに投与し、ＨＩ力価を評価した。単一のサンプルに基づき、インフルエンザＡウイルスのＨ１Ｎ１株に対する第２の用量後の力価は、以下のとおりであった。
【０１１６】
【表１】
３つの株全てについてプールされたサンプルを調べると、ＨＩ力価は、以下のとおりであった。
【０１１７】
【表２】
従って、ＭＦ５９およびＩＣ３１の組み合わせは、特に、インフルエンザＡウイルスについて、いずれのアジュバント単独よりＨＩ力価を増強し得る。
【０１１８】
ＣＤ４＋ Ｔ細胞を評価して、上記アジュバントが、Ｔｈ１タイプの応答を惹起したかもしくはＴｈ２タイプの応答を惹起したかを決定した。ＭＦ５９が、Ｔｈ２タイプ応答に偏った応答を与えたのに対して、ＩＣ３１は、Ｔｈ１タイプ応答に偏った（しかし、ＭＦ５９ほど偏ってはいない）応答を（両方の用量で）与えた。上記組み合わせたアジュバントは、Ｔｈ１タイプ応答とＴｈ２タイプ応答との間のバランスをより保った。
【０１１９】
ＩＣ３１の、ＦＬＵＡＤＴＭへの添加は、ＨＩ力価に対して大きな影響を有しないが、上記免疫応答のバランスをシフトさせる。
【０１２０】
（Ｃ型肝炎ウイルス）
Ｃ型肝炎ウイルスＥ１Ｅ２タンパク質を、マウスを免疫するために使用した。ＭＦ５９＋ＩＣ３１を使用して達成した抗体応答は、ＭＦ５９単独での応答と類似であったが、３用量後のＣＤ８１結合の最高の阻害を、ＭＦ５９＋ＩＣ３１ｌｏｗで認めた。
【０１２１】
（ＥｘＰＥＣ）
腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株に由来する抗原１２４に、ミョウバン、ＩＣ３１、ＭＦ５９もしくはＩＣ３１＋ＭＦ５９をアジュバント添加した。防御率は、以下のとおりであった。
【０１２２】
【表３】
（血清群Ｂ髄膜炎菌）
参考文献４３の髄膜炎菌血清群Ｂワクチンからの抗原に、ＭＦ５９、ＩＣ３１ｈｉｇｈ、ＩＣ３１ｌｏｗもしくはこれらの組み合わせをアジュバント添加した。上記ワクチンは、３つの組換え抗原（Ａｇ１、Ａｇ２およびＡｇ３）を含み、これらに対する総ＩｇＧレベルは、以下のとおりであった。
【０１２３】
【表４】
従って、抗原「Ａｇ３」を除いて、ＭＦ５９およびＩＣ３１の混合物を使用した場合に、最高のＩｇＧレベルを認めた。
【０１２４】
血清をまた、種々の髄膜炎菌株に対するそれらの殺菌活性について試験した。代表的結果は、以下を含む。
【０１２５】
【表５】
従って、いくつかの例外はあるが、ＭＦ５９およびＩＣ３１の混合物を使用した場合に、最高の殺菌力価を認めた。
【０１２６】
（髄膜炎菌の複数の血清群）
これら髄膜炎菌Ｂタンパク質抗原をまた、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ抗原に由来する結合体化サッカリド抗原と合わせ、同じアジュバント混合物で試験した。各血清群からの試験株に対する殺菌力価は、以下のとおりであった。
【０１２７】
【表６】
従って、血清群Ａを除いて、ＭＦ５９およびＩＣ３１の混合物を使用した場合、最高の殺菌力価を認めた。
【０１２８】
（汎発流行性インフルエンザ）
ＩＣ３１ｈｉｇｈを、ＭＦ５９もしくは緩衝液と１：１比で、またはＭＦ５９および緩衝液と１：０．５：０．５比で合わせた。このようにして、ＭＦ５９を、その通常の濃度もしくは半分の濃度で試験した。上記アジュバントを、インフルエンザウイルス（Ａ／ベトナム／１１９３／０４）のＨ５Ｎ１株に由来する表面抗原ワクチンと合わせた。上記組み合わせの安定性および免疫原性を、試験した。
【０１２９】
安定性を、室温の貯蔵の時間０、およびその後３０分もしくは６時間後に、ｐＨ、重量オスモル濃度、吸着、および粒径を試験することによって評価した。上記ｐＨは、７．２３〜７．２６の範囲において安定であった。重量オスモル濃度は、２８０〜２８６ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲で安定であった。上記吸着した抗原の割合は、６時間にわたって７６％から８０％まで上昇した（３０分の時点では、僅かに低下した）。これら数字は、ＭＦ５９を欠いているコントロール組成物に類似である。上記コントロール組成物は、僅かに低い重量オスモル濃度（２７３〜２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ）、僅かに高いｐＨ（７．３２〜７．３５）、および吸着した抗原の僅かに低い割合（５４〜６８％）を有した。
【０１３０】
時間０での、ＰＢＳ中のＩＣ３１ｈｉｇｈ：ＭＦ５９の１：１混合物の粒径を、図１に示す。上記エマルジョンの液滴（平均直径１６１ｎｍ）は、上記体積のうちの４６．４％を占め、ＩＣ３１複合体（平均直径１５．９μｍ）は、５３．６％を占めた。図２〜５は、室温において時間０から２４時間まで、Ｈ５Ｎ１抗原を含むアジュバント添加ワクチンについての類似の分析を示す。
【０１３１】
【表７】
ＭＦ５９単独と組み合わせたＨ５Ｎ１抗原（ＩＣ３１なし）は、１５１ｎｍの平均液滴直径を有した。ＩＣ３１ｈｉｇｈと組み合わせたＨ５Ｎ１抗原（しかしＭＦ５９なし）は、３８．４μｍの平均粒子直径を有した（図６）。従って、ＭＦ５９およびＩＣ３１の混合は、ＭＦ５９粒子の分析した直径を僅かに増大させ（その一方で、滅菌濾過はなお可能である）、上記ＩＣ３１複合体の直径を減少させる。しかし、全ての場合において、上記混合物は安定である。
【０１３２】
フェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ ｐｕｔｏｒｉｕｓ ｆｕｒｏ）モデルは、候補の汎発流行性インフルエンザワクチンの効力の証拠を提供するために好ましい動物モデルである。このようにして、アジュバント添加した、１μｇもしくは３．７５μｇ（赤血球凝集素用量）いずれかの抗原を有するワクチンを、フェレットの８つの群に投与した。フェレットに、初期刺激用量およびブースト用量を与え、次いで、異種Ｈ５Ｎ１株でチャレンジした。
【０１３３】
フェレットの体温を、チャレンジの前後でモニターした。図７および８は、２例のマウス（１匹は、群Ｄ（図７）および１匹は群Ｅ（図８））からの温度を示す。
【０１３４】
ＨＡＩ力価を、０日目、２１日目、４２日目および４９日目に、ワクチン株に対して評価した。平均力価は、以下のとおりであった。
【０１３５】
【表８】
従って、ＩＣ３１およびＭＦ５９（グループＢおよびグループＥ）の組み合わせは、最高の力価を与えた。
【０１３６】
予備データは、罹患した肺組織の割合（肉眼的な肺病変の面積の概算）および相対的肺重量（１．０未満は、健康な肺を示す）を調べた。１群あたりの平均結果は、以下のとおりであった。
【０１３７】
【表９】
ＩＣ３１およびＭＦ５９の組み合わせは、ＭＦ５９もしくはＩＣ３１単独と比較した場合、このモデルにおいて肺病理を改善した。
【０１３８】
従って、ＩＣ３１と上記ＭＦ５９水中油型エマルジョンアジュバントとの組み合わせは、安定であり、良好な免疫原性および汎発流行性インフルエンザウイルス株に対する防御をフェレットに提供した。
【０１３９】
（グループＡ連鎖球菌およびカンジダ）
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ抗原およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抗原にも、ＭＦ５９ＴＭ＋ＩＣ３１ＴＭをアジュバント添加した。
【０１４０】
本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、改変が行われ得るが、それは本発明の範囲および趣旨の範囲内にあることが理解される。
【０１４１】
（参考文献）
【０１４２】
【数１】
【０１４３】
【数２】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００８年９月１８日に出願された米国仮出願第６１／１９２，５７７号からの優先権を主張し、上記米国仮出願の全容は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ワクチンアジュバントおよびそれらの組み合わせの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
水中油型エマルジョンは、ワクチンアジュバントとしての使用について公知であり、ＦＬＵＡＤＴＭ製品は、水中スクアレン型「ＭＦ５９」アジュバントを含む。本発明の目的は、改変および改善されたエマルジョンアジュバントを提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の開示）
本発明は、水中油型エマルジョン、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む免疫学的アジュバントを提供する。上記オリゴヌクレオチドおよび上記ポリマーは、理想的には、互いに会合して、複合体を形成する。
【０００５】
本発明はまた、本発明の免疫学的アジュバントを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、水中油型エマルジョンと、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体とを混合する工程を包含する。
【０００６】
本発明はまた、（ｉ）本発明のアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を含む免疫原性組成物を提供する。
【０００７】
本発明はまた、（ｉ）本発明のアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を混合する工程を包含する、免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供する。
【０００８】
上記免疫原、エマルジョン、オリゴヌクレオチドおよびポリマーは、任意の順序で混合され得る。例えば、本発明は、本発明の免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）水中油型エマルジョン、および（ｉｉ）免疫原を混合する工程；ならびにその後、上記エマルジョン／免疫原混合物と、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーとを混合する工程を包含する。
【０００９】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマー（代表的には、複合体の形態にある）と、（ｉｉ）免疫原とを混合する工程；ならびにその後、上記オリゴヌクレオチド／ポリマー／免疫原複合体と、水中油型エマルジョンとを混合する工程を包含する。
【００１０】
本発明はまた、（ｉ）本発明のアジュバントを含む第１の容器；および（ｉｉ）免疫原および／もしくはさらなるアジュバントを含む第２の容器を含むキットを提供する。本発明はまた、（ｉ）水中油型エマルジョンを含む第１の容器；ならびに（ｉｉ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む第２の容器を含むキットを提供する。上記第１の容器および第２の容器のうちの一方もしくは両方は、免疫原を含み得る。従って、上記２つの容器の内容物は、（例えば、使用の時点で）組み合わされて、本発明のアジュバントもしくは免疫原性組成物を形成し得る。これらキットは、免疫原および／もしくはさらなるアジュバントを含む第３の容器を含み得る。
【００１１】
本発明はまた、水中油型エマルジョンおよび吸着性粒状アジュバントを含む免疫学的アジュバントを提供し、ここで上記吸着性粒状アジュバントにおける粒子の平均直径および上記エマルジョン中の油滴の平均直径はともに、２５０ｎｍ未満（例えば、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、≦１９０ｎｍ、≦１８０ｎｍ、≦１５０ｎｍ、≦１２０ｎｍ、≦１００ｎｍなど）である。上記粒状アジュバントが、ある直径の範囲を有する粒子を有する場合、これら直径は、油滴粒径と重なり合わない可能性がある（すなわち、最大の油滴は、最小のアジュバント粒子より小さいか、または最大のアジュバント粒子は、最小の油滴より小さい）。しかし、他の実施形態において、上記サイズ分布は、重なり合い得る。いくつかの実施形態において、上記アジュバント粒子の平均直径は、上記油滴の平均直径と実質的に同じであってもよいし、これら２つの直径は、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％などだけ異なっていてもよい。
【００１２】
本発明はまた、水中油型エマルジョンおよび吸着性粒状アジュバントを含む免疫学的アジュバントを提供し、ここで上記吸着性粒状アジュバントにおける粒子の平均直径は、上記エマルジョン中の油滴の平均直径より大きい。上記吸着性粒状アジュバントは、理想的には、（ｉ）不溶性アルミニウム塩もしくはカルシウム塩も、（ｉｉ）ポリマー微粒子も含まず、むしろ、好ましくは、（ｉｉｉ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体を含む。水中油型エマルジョンとこのような複合体との混合は、上記複合体の分析された平均直径を低減するために本明細書で示される。
【００１３】
本発明はまた、（ｉ）水中油型エマルジョンおよび吸着性粒状アジュバントを含む免疫学的アジュバント；ならびに（ｉｉ）免疫原を含む免疫原性組成物を提供する。上記のように、上記吸着性粒状アジュバントは、理想的には、不溶性アルミニウム塩もカルシウム塩も、ポリマー微粒子も含まず、好ましくは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体である。代表的には、上記免疫原は、上記吸着性粒状アジュバントに少なくとも部分的に吸着される。
【００１４】
本発明はまた、水中油型エマルジョンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫学的アジュバントを提供し、ここで上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１種のＣｐＩモチーフ（イノシンに結合したシトシンを含むジヌクレオチド配列）を含む。上記オリゴデオキシヌクレオチドは、１種より多い（例えば、２種、３種、４種、５種、６種以上）ＣｐＩモチーフを含み得、これらは、直接反復され得る（例えば、配列（ＣＩ）ｘを含み、ここでｘは、２、３、４、５、６以上である）か、または互いに分離され得る（例えば、配列（ＣＩＮ）ｘを含み、ここでｘは、２、３、４、５、６以上であり、各Ｎは、１種以上のヌクレオチドを独立して表す）。上記オリゴヌクレオチド中のシトシン残基は、理想的には、メチル化されていない。本発明はまた、この免疫学的アジュバントを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、水中油型エマルジョンと、ＣｐＩ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドとを混合する工程を包含する。本発明はまた、（ｉ）このアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を含む免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）このアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を混合する工程を含む。本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）水中油型エマルジョンおよび（ｉｉ）免疫原を混合する工程；ならびにその後、上記エマルジョン／免疫原混合物と、ＣｐＩ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドとを混合する工程を包含する。
【００１５】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）ＣｐＩ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび（ｉｉ）免疫原を混合する工程；ならびにその後、上記オリゴヌクレオチド／免疫原混合物と、水中油型エマルジョンとを混合する工程を包含する。
【００１６】
（水中油型エマルジョン）
本明細書で使用される水中油型エマルジョンは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）および生体適合性である。
【００１７】
上記エマルジョン中の油滴は、一般に、５μｍ直径未満であり、理想的には、サブミクロンの直径を有し、これら小さなサイズは、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）で達成され、安定なエマルジョンを提供する。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得るので、好ましい。いくつかの有用なエマルジョンにおいて、上記油滴のうちの少なくとも８０％（数で）は、５００ｎｍ未満の直径を有する。
【００１８】
上記エマルジョンは、油（例えば、動物（例えば、魚類）もしくは植物源に由来するもの）を含み得る。植物油供給源としては、堅果、種子および穀類が挙げられる。ラッカセイ油、大豆油、ココナツ油、およびオリーブ油（最も一般的に市販されている）は、上記堅果油の例である。ホホバ油が使用され得、例えば、ホホバ豆から得られ得る。種子油としては、サフラワー油、ココナツシード油、ヒマワリ油、ごま油などが挙げられる。穀類グループにおいて、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、他の穀物（ｃｅｒｅａｌ ｇｒａｉｎ）の油（例えば、小麦、オート麦、ライ麦、コメ、テフ、ライ小麦など）もまた、使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油中には天然に存在しないが、堅果油および種子油から生じる適切な物質の加水分解、分離およびエステル化によって、調製され得る。哺乳動物の乳汁に由来する脂肪および油は、代謝可能であり、従って、本発明の実施において使用され得る。分離、精製、鹸化および動物供給源から純粋な油を得るために必要な他の手段のための手順は、当該分野で周知である。大部分の魚類は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油（例えば、鯨ろう）は、本明細書で使用され得る魚油のうちのいくつかの例である。多くの分枝鎖の油は、５個の炭素のイソプレンユニットにおいて生化学的に合成され、一般に、テルペノイドといわれる。サメ肝油は、スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）として公知の分枝状の不飽和テルペノイドを含む。スクアラン（スクアレンの飽和アナログ）も、使用され得る。魚油（スクアレンおよびスクアランが挙げられる）は、商業的供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野で公知の方法によって得られ得る。スクアレンが好ましい。
【００１９】
他の有用な油は、トコフェロールであり、トコフェロールは、有利なことには、年配の被験体（例えば、６０歳以上）において使用するためのワクチン中に含まれる。なぜなら、ビタミンＥは、この被験体群において免疫応答に対して陽性の効果を有することが報告されたからである。トコフェロールはまた、エマルジョンの安定化の一助となり得る抗酸化特性を有する。種々のトコフェロールが存在する（α、β、γ、δ、εもしくは）が、αが通常使用される。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチンと適合性であり、水銀化合物の代替として有用な保存剤であることが公知である。
【００２０】
油の混合物が使用され得る（例えば、スクアレンおよびα−トコフェロール）。
【００２１】
２〜２０％（容積で）の範囲の油含有量が、代表的である。
【００２２】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類され得る。本発明で有用ないくつかの界面活性剤は、少なくとも１０、例えば、少なくとも１５もしくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、以下が挙げられるが、これらに限定されない界面活性剤とともに使用され得る：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（（一般に、Ｔｗｅｅｎといわれる）特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０）；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／もしくはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸＴＭ商品名の下で市販される）（例えば、直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；オクトキシノール（これは、反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変化し得る）（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）は、特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（レシチン））；ノニルフェノールエトキシレート（例えば、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ ＮＰシリーズ）；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般には、ＳＰＡＮとして公知）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレート。非イオン性界面活性剤が、好ましい。上記エマルジョン中に含めるための最も好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；Ｔｗｅｅｎ ８０）である。
【００２３】
界面活性剤の混合物が、使用され得る（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５の混合物）。ポリオキシエチレンソルビタンエステルとオクトキシノールとの組み合わせもまた、適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／もしくはオクトキシノールとを含む。
【００２４】
界面活性剤の有用な量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエスエル（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０） ０．０１〜１％（特に、約０．１％）；オクチルもしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、もしくはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤） ０．００１〜０．１％（特に、０．００５〜０．０２％）；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９） ０．１〜２０％（例えば、０．１〜１０％および特に、０．１〜１％もしくは約０．５％）である。
【００２５】
スクアレン含有エマルジョンが好ましく、特に、ポリソルベート８０を含むものが好ましい。
【００２６】
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
・スクアレン、ポリソルベート８０、およびソルビタントリオレエートのサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの容積での組成は、約５％ スクアレン、約０．５％ ポリソルベート８０および約０．５％ Ｓｐａｎ ８５であり得る。重量では、これら比は、４．３％ スクアレン、０．５％ ポリソルベート８０および０．４８％ Ｓｐａｎ ８５になる。このアジュバントは、引用文献４の第１０章および引用文献５の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［１〜３］。上記ＭＦ５９エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。
【００２８】
・スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート８０のサブミクロンエマルジョン。これらエマルジョンは、２〜１０％ スクアレン、２〜１０％ トコフェロールおよび０．３〜３％ ポリソルベート８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、≦１（例えば、０．９０）である。なぜなら、これは、より安定なエマルジョンを提供し得るからである。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容積比もしくは約１１：５の重量比で存在し得る。１種のこのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ ８０をＰＢＳ中に溶解して、２％溶液を与え、次いで、この溶液９０ｍｌと、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌ スクアレン）の混合物とを混合し、次いで、上記混合物をマイクロフルイダイズする（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅ）ことによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、例えば、１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロン油滴を有する。上記エマルジョンはまた、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ−ＭＰＬ）を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、ヒトの用量あたり、０．５〜１０ｍｇ スクアレン、０．５〜１１ｍｇ トコフェロール、および０．１〜４ｍｇ ポリソルベート８０を含み得る［６］。
【００２９】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（上記を参照のこと）を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
【００３０】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌ ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ α−トコフェロールスクシネート）の質量比でこれら３種の成分を含み得、これら濃度は、抗原由来のこれら成分の何らかの寄与を含むはずである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬを含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
【００３１】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ Ｌ１２１」）のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でトレオニル−ＭＤＰとともに使用されてきた［７］（０．０５〜１％ Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％ スクアラン、２．５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバントでのように［８］（５％ スクアラン、１．２５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）、上記Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用され得る。マイクロフルイダイゼーションは好ましい。
【００３２】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル（ｍａｎｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）もしくは「Ｓｐａｎ ８０」））を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または上記油滴のうちの少なくとも９０％（容積で）が、２００ｎｍ未満のサイズを有する［９］。上記エマルジョンはまた、アルジトール；凍結保護剤（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース））；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１種以上を含み得る。上記エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［１０］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。
【００３３】
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［１１］。アジュバント添加ワクチン中のこれら成分の最終濃度（重量）は、５％ スクアレン、４％ ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％ Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；トリカプリルグリセリド／トリカプリン酸グリセリル）である。
【００３４】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献１２に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。
【００３５】
・非代謝性の油（例えば、軽油）および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０もしくはＳｐａｎ ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体（例えば、参考文献１３に記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンを、デスアシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）に添加することにより生成されるＧＰＩ−０１００）、ジメチル（ｄｉｍｅｔｈｙｉ）ジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／もしくはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。
【００３６】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡもしくはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が螺旋状ミセルとして会合されるエマルジョン［１４］。
【００３７】
・ミネラルオイル、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン１５。
【００３８】
・ミネラルオイル、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［１５］。
【００３９】
上記のように、スクアレンを含む水中油型エマルジョンは、特に好ましい。いくつかの実施形態において、ワクチン用量における上記スクアレンの濃度は、５〜１５ｍｇの範囲（すなわち、０．５ｍｌ用量容積と仮定すると、濃度１０〜３０ｍｇ／ｍｌ）にあり得る。しかし、例えば、＜５ｍｇ／用量、またはさらに＜１．１ｍｇ／用量を含むように、スクアレンの濃度を低下させることは可能である［１６，１７］。例えば、ヒトの用量は、９．７５ｍｇ スクアレン／用量（ＦＬＵＡＤＴＭ製品における場合：０．５ｍｌ用量容積中、９．７５ｍｇ スクアレン、１．１７５ｍｇ ポリソルベート８０、１．１７５ｍｇ ソルビタントリオレエート）を含み得るか、またはその分数量（例えば、３／４、２／３、１／２、２／５、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、もしくは１／１０）を含み得る。例えば、組成物は、４．８７５ スクアレン／用量（従って、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートは各々０．５８８ｍｇ）、３．２５ｍｇ スクアレン／用量、２．４３８ｍｇ／用量、１．９５ｍｇ／用量、０．９７５ｍｇ／用量などを含み得る。上記ＦＬＵＡＤＴＭ−ストレングス（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）ＭＦ５９のこれら分数希釈のいずれかは、８．３：１：１（質量で）のスクアレン：ポリソルベート−８０：ソルビタン−トリオレエート比率を維持しながら、本発明とともに使用され得る。
【００４０】
（免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマー）
本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを使用する。これらは、理想的には、互いに会合されて、粒状複合体を形成し、この複合体は、有用なことには、ＴＬＲ９アゴニストである。
【００４１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、有用なアジュバントとして公知である。それらはしばしば、ＣｐＧモチーフ（グアノシンに結合した非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含み、それらのアジュバント効果は、参考文献１８〜２３において議論されている。ＴｐＧモチーフ、パリンドローム配列、複数の保存的チミジンヌクレオチド（例えば、ＴＴＴＴ）、複数の保存的シトシンヌクレオチド（例えば、ＣＣＣＣ）もしくはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドもまた、二本鎖ＲＮＡとして存在するので、公知の免疫刺激剤である。これら種々の免疫刺激性オリゴヌクレオチドのうちのいずれかが本発明とともに使用され得るが、デオキシイノシンおよび／もしくはデオキシウリジンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、ならびに理想的には、デオキシイノシンおよびデオキシシトシンを含むオリゴデオキシヌクレオチドを使用することが、好ましい。イノシン含有オリゴデオキシヌクレオチドは、ＣｐＩモチーフ（イノシンに結合されたシトシンを含むジヌクレオチド配列）を含み得る。上記オリゴデオキシヌクレオチドは、１つより多い（例えば、２個、３個、４個、５個、６個以上）ＣｐＩモチーフを含み得、これらは、直接反復されてもよいし（例えば、配列（ＣＩ）ｘを含み、ここでｘは、２、３、４、５、６以上である）、互いに分離していてもよい（例えば、配列（ＣＩＮ）ｘを含み、ここでｘは、２、３、４、５、６以上であり、各Ｎは、独立して、１個以上のヌクレオチドを表す）。シトシン残基は、理想的には、メチル化されていない。
【００４２】
上記オリゴヌクレオチドは、代表的には、１０〜１００ヌクレオチド、例えば、１５〜５０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、もしくは２５〜２８ヌクレオチドを有する。上記オリゴヌクレオチドは、代表的には、一本鎖である。
【００４３】
上記オリゴヌクレオチドは、もっぱら天然のヌクレオチドを含み得るか、もっぱら非天然のヌクレオチドを含み得るか、またはその両方の混合物を含み得る。例えば、上記ヌクレオチドは、１個以上のホスホロチオエート結合を含み得、および／もしくは１個以上のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を有し得る。
【００４４】
本発明での使用に好ましいオリゴヌクレオチドは、２６−ｍｅｒ配列 ５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号１）を含む一本鎖デオキシヌクレオチドである。このオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリカチオン性ポリマーと安定な複合体を形成して、良好なアジュバントを与える。
【００４５】
上記ポリカチオン性ポリマーは、理想的には、ポリカチオン性ペプチドである。上記ポリマーは、１個以上のロイシンアミノ酸残基および／もしくは１個以上のリジンアミノ酸残基を含み得る。上記ポリマーは、１個以上のアルギニンアミノ酸残基を含み得る。上記ポリマーは、これらアミノ酸のうちの１つの、少なくとも１個の直接反復（例えば、１個以上のＬｅｕ−Ｌｅｕジペプチド配列、１個以上のＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド配列、もしくは１個以上のＡｒｇ−Ａｒｇジペプチド配列）を含み得る。上記ポリマーは、少なくとも１個（および好ましくは、複数の（例えば、２個もしくは３個））のＬｙｓ−Ｌｅｕジペプチド配列および／もしくは少なくとも１個（および好ましくは、複数の（例えば、２個もしくは３個））のＬｙｓ-Ｌｅｕ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含み得る。
【００４６】
上記ペプチドは、配列Ｒｌ−ＸＺＸＺｘＸＺＸ−Ｒ２（ここで：ｘは、３、４、５、６もしくは７であり；各Ｘは、独立して、正に荷電した天然のアミノ酸残基および／もしくは天然でないアミノ酸残基であり；各Ｚは、独立して、アミノ酸残基Ｌ、Ｖ、Ｉ、ＦもしくはＷであり；そしてＲ１およびＲ２は、独立して、−Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＯＣＨ３、もしくは−ＣＯＨからなる群より選択される）を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｘ−Ｒ２は、上記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のアミド、エステルもしくはチオエステルであり得る。
【００４７】
ポリカチオン性ペプチドは、代表的には、５〜５０個のアミノ酸（例えば、６〜２０個のアミノ酸、７〜１５個のアミノ酸、もしくは９〜１２個のアミノ酸）を有する。
【００４８】
ペプチドは、もっぱら天然のアミノ酸、もっぱら非天然のアミノ酸、もしくはその両方の混合物を含み得る。上記ペプチドは、Ｌ−アミノ酸および／もしくはＤ−アミノ酸を含み得る。Ｌ−アミノ酸が代表的である。
【００４９】
ペプチドは、天然のＮ末端（ＮＨ２−）もしくは改変Ｎ末端（例えば、ヒドロキシル、アセチルなど）を有し得る。ペプチドは、天然のＣ末端（−ＣＯＯＨ）もしくは改変Ｃ末端（例えば、ヒドロキシル、アセチルなど）を有し得る。このような改変は、上記ペプチドの安定性を改善し得る。
【００５０】
本発明で使用するのに好ましいペプチドは、１１−ｍｅｒのＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２）（全てＬ−アミノ酸）である。そのＮ末端は、脱アミノ化され得、そしてＣ末端は、ヒドロキシル化され得る。好ましいペプチドは、Ｈ−ＫＬＫＬ５ＫＬＫ−ＯＨ（全てＬ−アミノ酸）である。このオリゴペプチドは、公知の抗菌剤［２４］であり、好中球アクチベーター［２５］であり、アジュバント［２６］であり、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと安定な複合体を形成して、良好なアジュバントを与える。
【００５１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの最も好ましい混合物は、ＩＣ３１ＴＭとして公知のＴＬＲ９アゴニストであり［２７〜２９］、これは、オリゴデオキシヌクレオチド（配列番号１）およびポリカチオン性オリゴペプチド（配列番号２）の吸着性複合体である。
【００５２】
上記オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドは、種々の比で一緒に混合され得るが、一般に、モル過剰で上記ペプチドと混合される。上記モル過剰は、少なくとも５：１（例えば、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０；１、３５：１、４０：１など）であり得る。約２５：１のモル比が理想的である［３０，３１］。この過剰な比での混合は、オリゴヌクレオチドとオリゴペプチドとの間の不溶性粒状複合体の形成を生じ得る。上記複合体は、水中油型エマルジョンと合わせられ得る。
【００５３】
上記オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドは、代表的には、水性条件下で混合され、例えば、上記オリゴヌクレオチドの溶液は、所望の比で上記オリゴペプチドの溶液と混合され得る。上記２つの溶液は、乾燥した（例えば、凍結乾燥した）物質を、水もしくは緩衝液中に溶解して、ストック溶液（これは、次いで、混合され得る）を形成することによって調製され得る。
【００５４】
上記複合体は、参考文献３２で開示される方法を使用して分析され得る。それらは、理想的には、上記エマルジョン中の油滴の平均直径より大きい平均直径を有する。１μｍ〜２０μｍの範囲の平均直径を有する複合体が、使用され得る。いくつかの実施形態において、上記エマルジョンのサイズ分布と上記複合体のサイズ分布との間に重なり合いはなく、すなわち、エマルジョン中の最大の液滴は、最小の複合体より小さい（もしくは最大の複合体は、最小の液滴より小さい）。しかし、他の実施形態において、液滴直径および複合体直径の範囲は、重なり合ってもよい。
【００５５】
ポリアルギニンおよびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、同様に、複合体を形成する［３３］。
【００５６】
上記複合体は、水性懸濁物において（例えば、水中もしくは緩衝液中）維持され得る。上記複合体とともに使用するための代表的な緩衝液は、リン酸緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、トリス緩衝液、トリス／ソルビトール緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液などである。代替として、複合体は、ときおり、凍結乾燥され得る。
【００５７】
水性懸濁物中の複合体は、バルク媒体からそれらを（例えば、吸引、デカントなどによって）分離するために、遠心分離され得る。次いで、これら複合体は、代替の媒体（例えば、水中油型エマルジョン）中で再懸濁され得る。
【００５８】
（エマルジョン、オリゴヌクレオチドおよびポリマーの混合）
本発明のアジュバント組成物は、通常、水中油型エマルジョンと、オリゴヌクレオチド／ポリマー複合体とを混合することによって調製される。上記エマルジョンは液体であり、上記複合体は、代表的には、液体形態で維持され、よって、本発明のアジュバントは、２つの液体を混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、上記液体のうちの一方もしくは両方は、上記混合が本発明の免疫原性組成物を提供するように、免疫原を含む。他の実施形態においては、何れの液体も免疫複合体を含まない。よって、上記混合生成物（すなわち、本発明のアジュバント組成物）は、後に免疫原と合わせられて、本発明の免疫原性組成物を提供し得る。
【００５９】
２つの液体が混合される場合、混合の容積比は、変動し得る（例えば、２０：１〜１：２０の間、１０：１〜１：１０の間、５：１〜１：５の間、２：１〜１：２の間など）が、理想的には、約１：１である。上記２つの液体中の成分の濃度は、所望の最終濃度が混合の後に達成されるように選択され得る（例えば、１：１混合が所望の最終濃度を提供するように、両方とも２×強度で調製され得る）。
【００６０】
他の実施形態において、上記複合体は、液体形態ではなく（例えば、それらは、遠心分離されたかもしくは凍結乾燥された）、そしてそれらは、エマルジョンと合わせられ（例えば、エマルジョン中に溶解され）得る。
【００６１】
オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの種々の濃度が使用され得る（例えば、参考文献２７、３０、もしくは３１において、または参考文献３４において使用される濃度のうちのいずれか）。例えば、ポリカチオン性オリゴペプチドは、１１００μＭ、１０００μＭ、３５０μＭ、２２０μＭ、２００μＭ、１１０μＭ、１００μＭ、１１μＭ、１０μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭなどで存在し得る。オリゴヌクレオチドは、４４ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭ、１４ｎＭ、４．４ｎＭ、４ｎＭなどで存在し得る。２０００ｎＭ未満のポリカチオン性オリゴペプチド濃度が、代表的である。配列番号１および配列番号２については、１：２５のモル比で混合され、本発明の３つの実施形態における濃度（ｍｇ／ｍＬ単位）は、よって、０．３１１および１．３２２、または０．１０９および０．４６３、または０．０３１および０．１３２であり得る。
【００６２】
水中スクアレン型エマルジョンと、ＩＣ３１の水性調製物との１：１容積比での混合は、１ｍｌあたり以下の成分の最終量を有する組成物を与えるために使用され得る：スクアレン，４．９ｍｇ；ポリソルベート８０，５８８μｇ；カチオン性オリゴペプチド，５００ｎｍｏｌもしくは５０ｎｍｏｌ；オリゴヌクレオチド，２０ｎｍｏｌもしくは２ｎｍｏｌ。
【００６３】
（薬学的組成物）
本発明のアジュバント組成物は、通常、上記エマルジョン、オリゴヌクレオチドおよびポリマーに加えて、成分を含み、例えば、本発明のアジュバント組成物は、代表的には、１種以上の薬学的に受容可能な成分を含む。このような成分はまた、本発明の免疫原性組成物中に存在し得、上記アジュバント組成物もしくは別の組成物のいずれかに由来する。このような成分の詳細な議論は、参考文献３５で入手される。
【００６４】
組成物は、チメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）もしくは２−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。好ましくは、ワクチンは、水銀物質を実質的に含まない（例えば、＜１０μｇ／ｍｌ）べきである（例えば、チメロサール非含有）。水銀を含まないワクチンは、より好ましい。保存剤非含有ワクチンは、特に好ましい。α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチン中に、水銀化合物の代替として含まれ得る。
【００６５】
張度を制御するために、組成物は、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）を含み得る。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、および／もしくは塩化マグネシウムなどが挙げられる。
【００６６】
組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間（例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間）の、場合によっては、２８０〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇもしくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内の重量オスモル濃度を有し得る。
【００６７】
組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より代表的には、６．０〜８．０の間（例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間）である。
【００６８】
組成物は、好ましくは、無菌である。組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ ＥＵ（エンドトキシン単位、標準尺度）、好ましくは、＜０．１ ＥＵ／用量を含む）。組成物は、好ましくは、グルテン非含有である。
【００６９】
免疫原性組成物は、１回の免疫処置のための物質を含んでいてもよいし、複数回の免疫処置のための物質を含んでいてもよい（すなわち、「複数用量」キット）。保存剤を含めることは、複数用量の準備において有用である。複数用量組成物中に保存剤を含める代替として（もしくはそれに加えて）、上記組成物は、物質の取り出しのための無菌アダプタを有する容器中に含まれ得る。
【００７０】
組成物は、一般に、投与の時点で水性形態である。ワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与容積で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、例えば小児に、ときおり投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、より高い用量（例えば、約１ｍｌ）で、例えば、２つの０．５ｍｌ容積を混合した後に、投与され得る。
【００７１】
（免疫原）
本発明のアジュバント組成物は、免疫応答を誘導するために、免疫原と組み合わせて動物に投与され得る。本発明は、広範な疾患を処置するためもしくはそれらから防御するために、広範な免疫原とともに使用され得る。上記免疫原は、ウイルス性疾患（例えば、エンベロープに包まれたウイルスもしくはエンベロープに包まれていないウイルスに起因する）、細菌性疾患（例えば、グラム陰性細菌もしくはグラム陽性細菌に起因する）、真菌性疾患、寄生生物性疾患、自己免疫疾患、または任意の他の疾患から防御する免疫応答を惹起し得る。上記免疫原はまた、免疫療法において、例えば、腫瘍／がん、アルツハイマー病、もしくは嗜癖を処置するために有用であり得る。
【００７２】
上記免疫原は、種々の形態（例えば、完全な生物、外膜小胞、タンパク質、サッカリド、リポサッカリド、結合体（例えば、キャリアおよびハプテンの、またはキャリアおよびサッカリドもしくはリポサッカリドの）など）をとり得る。
【００７３】
上記免疫原は、インフルエンザウイルス（インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスを含む）に対する免疫応答を惹起し得る。水中油型エマルジョンアジュバント（特に、スクアレンを含むもの）の存在は、季節性インフルエンザワクチン［３６］および汎発流行性インフルエンザワクチン［３７，３８］の免疫応答の株交叉反応性を増強することが示された。インフルエンザウイルス免疫原の種々の形態が、現在入手可能であり、代表的には、生ウイルスもしくは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。不活化ワクチンは、完全ビリオン、スプリットビリオン、もしくは精製表面抗原に基づき得る。インフルエンザ抗原はまた、ビロゾーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）の形態で示され得る。赤血球凝集素は、現在の不活化ワクチンにおいて主要な免疫原であり、ワクチン用量は、ＨＡレベルを参照して標準化され、代表的には、ＳＲＩＤによって測定される。既存のワクチンは、代表的には、約１５μｇのＨＡ／株を含むが、より低い用量が、例えば、小児のために、もしくは汎発流行の状況において、またはアジュバントを使用する場合に、使用され得る。分数用量（例えば、１／２（すなわち、７．５μｇ ＨＡ／株）、１／４および１／８）が使用されてきており、同様に、より高い用量（例えば、３×もしくは９×用量［３９，４０］）も使用されてきた。従って、組成物は、０．１〜１５０μｇの間のＨＡ／インフルエンザ株、好ましくは、０．１〜５０μｇの間（例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなど）を含み得る。特定の用量は、例えば、約４５／株、約３０／株、約１５／株、約１０／株、約７．５／株、約５／株、約３．８／株、約１．９／株、約１．５／株などを含む。例えば、各株についての上記ＨＡ質量が、平均ＨＡ質量／株の１０％以内、好ましくは、平均の５％以内となるように上記ワクチン中に含まれる各株について実質的に同じ質量のＨＡを含めることは通常のことである。生ワクチンについては、投与は、ＨＡ含有量ではなく、組織培養感染量中央値（ｍｅｄｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、１株あたり１０６〜１０８の間（好ましくは、１０６．５〜１０７．５の間）のＴＣＩＤ５０が代表的である。ウイルス増殖の基質としてＳＰＦ卵を使用するのではなく（鶏卵の感染した尿膜腔液からウイルスが採取される）、インフルエンザウイルスの複製を支える細胞株が、使用され得る。上記細胞株は、代表的には、哺乳動物起源である（例えば、ＭＤＣＫ）。インフルエンザＡウイルス免疫原は、任意の適切なＨＡサブタイプ株（例えば、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９など）に由来し得る（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２および／もしくはＨ５Ｎ１株）。
【００７４】
上記免疫原は、カンジダ真菌（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する免疫応答を惹起し得る。例えば、上記免疫原は、β−グルカン（これは、キャリアタンパク質に結合体化され得る）であり得る。上記グルカンは、β−１，３および／もしくはβ−１，６結合を含み得る。適切な免疫原としては、参考文献４１および４２に開示されるものが挙げられる。
【００７５】
上記免疫原は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓが挙げられる）に対する免疫応答を惹起し得る。例えば、上記免疫原は、莢膜サッカリド（これは、キャリアタンパク質に結合体化され得る）であり得る。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅについては、上記サッカリドは、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、および／もしくはＶのうちの１つ以上に由来し得る。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについては、上記サッカリドは、血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および／もしくは２３Ｆのうちの１つ以上に由来し得る。莢膜サッカリド免疫原に加えて（もしくはその代わりに）、ポリペプチド免疫原が、防御的抗連鎖球菌免疫応答を惹起するために使用され得る。
【００７６】
上記免疫原は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する免疫応答を惹起し得る。例えば、上記免疫原は、莢膜サッカリド（これは、キャリアタンパク質に結合体化され得る）であり得る。莢膜サッカリドおよびそれらの結合体は、髄膜炎菌血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／もしくはＹから防御するために特に有用である。莢膜サッカリド免疫原に加えて（もしくはその代わりに）、ポリペプチド免疫原および／もしくは外膜小胞が、防御的抗髄膜炎菌免疫応答を惹起するために、例えば、参考文献４３に開示されるように、特に、血清型Ｂに対して使用するために、使用され得る。
【００７７】
上記免疫原は、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび／もしくはＣ型肝炎ウイルス）に対する免疫応答を惹起し得る。例えば、上記免疫原は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）であり得る。
【００７８】
上記免疫原は、ＲＳウイルスに対する免疫応答を惹起し得る。免疫原は、グループＡ ＲＳＶおよび／もしくはグループＢ ＲＳＶに由来し得る。適切な免疫原は、例えば、参考文献４４および４５で開示されるように、Ｆおよび／もしくはＧ糖タンパク質またはそのフラグメントを含み得る。
【００７９】
上記免疫原は、クラミジア細菌（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが挙げられる）に対する免疫応答を惹起し得る。適切な免疫原としては、参考文献４６〜５２で開示されるものが挙げられる。
【００８０】
上記免疫原は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌（腸管外病原性株を含む）に対する免疫応答を惹起し得る。適切な免疫原としては、参考文献５３〜５５で開示されるものが挙げられる。
【００８１】
上記免疫原は、コロナウイルス（例えば、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス）に対する免疫応答を惹起し得る。適切な免疫原は、スパイク糖タンパク質を含み得る。
【００８２】
上記免疫原は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細菌に対する免疫応答を惹起し得る。適切な免疫原としては、ＣａｇＡ［５６〜５９］、ＶａｃＡ［６０，６１］、および／もしくはＮＡＰ［６２〜６４］が挙げられる。
【００８３】
上記免疫原は、狂犬病ウイルスに対する免疫応答を惹起し得る。適切な免疫原は、不活性化狂犬病ウイルスである［６５，ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ］。
【００８４】
上記免疫原は、ヒトパピローマウイルスに対する免疫応答を惹起し得る。有用な免疫原は、Ｌ１キャプシドタンパク質（これは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として公知の構造を形成するようにアセンブルし得る）である。上記ＶＬＰは、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてもしくは昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞（例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）もしくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞）において、Ｌ１の組換え発現によって生成され得る。酵母細胞については、プラスミドベクターが上記Ｌ１遺伝子を有し得；昆虫細胞については、バキュロウイルスベクターが上記Ｌ１遺伝子を有し得る。より好ましくは、上記組成物は、ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株の両方に由来するＬ１ ＶＬＰを含む。この二価組み合わせは、非常に効率的であることが示された［６６］。ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株に加えて、ＨＰＶ−６株およびＨＰＶ−１１株に由来するＬ１ ＶＬＰを含めることも可能である。
【００８５】
上記免疫原は、腫瘍抗原（例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３（ＭＡＧＥ−Ａ３）、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＴＲＰ−２など）に対する免疫応答を惹起し得る。上記免疫原は、肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がんなどに対する免疫療法的応答を惹起し得る。
【００８６】
上記免疫原は、キャリアタンパク質に結合体化されたハプテンに対する免疫応答を惹起し得る（上記ハプテンは、乱用薬物である［６７］）。例としては、アヘン剤、マリファナ、アンフェタミン、コカイン、バルビツレート、グルテチミド、メチプリロン、抱水クローラル、メタクワロン、ベンゾジアゼピン、ＬＳＤ、ニコチン、抗コリン作用性薬物、抗精神病薬、トリプタミン、他の精神作用薬、鎮静薬、フェンシクリジン、プシロシビン（ｐｓｉｌｏｃｙｂｉｎｅ）、揮発性ニトレート、ならびに身体的および／もしくは精神的依存性を誘導する他の薬物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
種々の他の免疫原が使用され得る。
【００８８】
免疫原性組成物が、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体を含む場合、免疫原は、通常、上記複合体に吸着されるが、これは、必要ではない。従って、抗原は、遠心分離後に、上記複合体と会合され得る（このことは、吸着を示す）。免疫原が、複合体に「少なくとも部分的に吸着される」と記載される場合、上記組成物中のその免疫原の総量のうちの少なくとも１０％（重量で）が、例えば、＞２０％、＞３０％、＞４０％以上が吸着されることが好ましい。免疫原が、複合体に「吸着される」と記載される場合、上記組成物中のその免疫原の総量のうちの少なくとも５０％（重量で）が、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％以上が吸着されることが好ましい。いくつかの実施形態において、免疫原は、完全に吸着される。すなわち、遠心分離して、バルク液体媒体から複合体を分離した後に、上清中で検出不可である。しかし、他の実施形態において、吸着は認められない。
【００８９】
（組成物もしくはキット成分のパッケージング）
本発明のアジュバント組成物、免疫原性組成物およびキット成分に適切な容器としては、バイアル、シリンジ（例えば、使い捨てシリンジ）などが挙げられる。これら容器は、滅菌であるべきである。上記容器は、（例えば、同じボックス中で）キットを形成するために一緒にパッケージされ得る。
【００９０】
成分がバイアル中に配置される場合、上記バイアルは、ガラス物質もしくはプラスチック物質から作製され得る。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が上記バイアルに添加される前に、滅菌される。ラテックス感受性被験体に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有ストッパーでシールされ、全てのパッケージング物質中にラテックスが存在しないことが好ましい。上記バイアルは、ワクチンの単一用量を含んでいてもよいし、１用量より多い用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含み得る。有用なバイアルは、無色ガラスから作製される。ホウケイ酸ガラスは、ソーダ石灰ガラスより好ましい。バイアルは、ブチルゴムから作製されるストッパーを有し得る。
【００９１】
バイアルは、シリンジがキャップに挿入され得るように適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有し得る。バイアルキャップは、シールもしくはカバーの内部に配置され得る。その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップに到達し得る前に除去されなければならない。バイアルは、特に、複数用量バイアルについては、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【００９２】
成分がシリンジにパッケージされる場合、上記シリンジは、これに取り付けられるニードルを有し得る。ニードルが取り付けられていない場合、別個のニードルが、組み立ておよび使用のために、上記シリンジと共に供給され得る。このようなニードルは、鞘に入れられ得る。シリンジにおけるプランジャーは、上記プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されてしまわないように、ストッパーを有し得る。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは、一般に、ニードルの取り付け前に、先端をシールするために先端キャップを有し、上記先端キャップは、ブチルゴムから作製され得る。上記シリンジおよびニードルが別個にパッケージされる場合、上記ニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドと適合させられる。有用なシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で市販されるものである。
【００９３】
容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半用量容積を示すために印が付けられ得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌ容積を示す印を有し得る。
【００９４】
被験体投与のために必要とされるよりも多くの材料を含むことは、複数成分の製品において通常である。その結果、完全な最終用量容積が、物質移動における任意の非効率にも拘わらず、得られる。従って、個々の容器は、例えば、５〜２０容積％の過剰分（ｏｖｅｒｆｉｌｌ）を含み得る。
【００９５】
（処置方法および免疫原性組成物の投与）
本発明の組成物は、ヒト被験体への投与に適しており、本発明は、被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、本発明の免疫原性組成物を上記被験体に投与する工程を包含する。
【００９６】
本発明はまた、被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、本発明のキットの容器（もしくはシリンジのチャンバ）の内容物を混合する工程、および上記混合した内容物を上記被験体に投与する工程を包含する。
【００９７】
本発明はまた、例えば、被験体における免疫応答を惹起することにおいて使用するために、医薬として使用するための本発明の組成物もしくはキットを提供する。
【００９８】
本発明はまた、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、水中油型エマルジョン、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの使用を提供する。この医薬は、免疫原との組み合わせにおいて投与され得る。
【００９９】
本発明はまた、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、水中油型エマルジョン、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ポリカチオン性ポリマーおよび免疫原の使用を提供する。
【０１００】
これら方法および使用は、一般に、抗体応答、好ましくは、防御的抗体応答を引き起こすために使用される。
【０１０１】
本発明の組成物は、種々の方法において投与され得る。通常の免疫経路は、（例えば、腕もしくは脚への）筋肉内注射によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内経路、経口経路、口内経路、舌下経路、皮内経路、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）経路、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）経路などが挙げられる。
【０１０２】
本発明に従って調製される免疫原性組成物は、小児および成人両方を処置するためにワクチンとして使用され得る。被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受容するのに好ましい被験体は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院した被験体、ヘルスケア労働者、軍関係者および従軍者、妊娠女性、慢性疾患患者、免疫不全被験体、外国へ旅行するヒトなどである。ＩＣ３１ＴＭは、乳児集団において有効であることが示された［３４，６８］。しかし、上記ワクチンは、これらグループに対してのみ適切であるわけではなく、集団においてより一般に、使用され得る。
【０１０３】
処置は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによるものであり得る。複数用量は、初期刺激免疫スケジュールにおいておよび／もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路（例えば、初期刺激は非経口およびブースターは粘膜、初期刺激は粘膜およびブースターは非経口、など）によって与えられ得る。１より多い用量（代表的には、２用量）の投与は、免疫学的にナイーブな被験体において特に有用である。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。
【０１０４】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含み、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１０５】
語句「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まなくてもよい。必要であれば、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１０６】
数値ｘに関する用語「約」とは、任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１０７】
別段示されなければ、２種以上の成分を混合する工程を包含するプロセスは、いかなる特定の混合する順序も必要としない。従って、成分は、任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在する場合、２つの成分が、互いに合わされ得、次いで、その組み合わせが、第３の成分と合わせられ得るなど。
【０１０８】
動物（および特にウシ）の物質が、細胞培養において使用される場合、それら物質は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来物質が完全に存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。
【０１０９】
化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代わりに、適切なプロドラッグによって置換され得る。
【０１１０】
細胞基質が、再集合もしくは逆遺伝学手順のために、またはウイルス増殖のために使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ Ｅｕｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈａｐｔｅｒ ５．２．３におけるように、ヒトワクチン生成における使用のために承認されたものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、ＩＣ３１およびＭＦ５９の混合物における粒子直径を示す。ｙ軸は、体積（％）を示し、ｘ軸は、粒子直径（μｍ）を示す。
【図２】図２〜５は、（２）時間０；（３）３０分；（４）６時間；および（５）２４時間でのアジュバント添加Ｈ５Ｎ１抗原についての同じ分析を示す。
【図３】図２〜５は、（２）時間０；（３）３０分；（４）６時間；および（５）２４時間でのアジュバント添加Ｈ５Ｎ１抗原についての同じ分析を示す。
【図４】図２〜５は、（２）時間０；（３）３０分；（４）６時間；および（５）２４時間でのアジュバント添加Ｈ５Ｎ１抗原についての同じ分析を示す。
【図５】図２〜５は、（２）時間０；（３）３０分；（４）６時間；および（５）２４時間でのアジュバント添加Ｈ５Ｎ１抗原についての同じ分析を示す。
【図６】図６は、ＩＣ３１単独でアジュバント添加したＨ５Ｎ１抗原についての同じ分析を示す。
【図７】図７および図８は、注射の３日前から注射後５日までの経時的な体温（℃）を示す。
【図８】図７および図８は、注射の３日前から注射後５日までの経時的な体温（℃）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
（発明を実施するための様式）
（アジュバント）
水中スクアレン型エマルジョン（ＭＦ５９）を、参考文献４の第１０章で開示されるように調製した。ＩＣ３１を、参考文献３１で開示されるように、高濃度および低濃度（１０倍差）で調製した。アジュバント組み合わせを、ＭＦ５９と、ＩＣ３１ｈｉｇｈもしくはＩＣ３１ｌｏｗとを、１：１容積比もしくは５：１容積比のいずれかで混合することによって作製した。３つの個々のアジュバント（ＭＦ５９、ＩＣ３１ｈｉｇｈ、ＩＣ３１ｌｏｗ）、および２つの混合物（ＭＦ５９＋ＩＣ３１ｈｉｇｈ、ＭＦ５９＋ＩＣ３１ｌｏｗ）を、種々の免疫原と合わせ、それらの効力を評価するために、種々の哺乳動物に投与した。
【０１１３】
さらに、ＩＣ３１ｈｉｇｈおよびＩＣ３１ｌｏｗを、ＭＦ５９アジュバント添加インフルエンザワクチン（ＦＬＵＡＤＴＭ）と、１：１容積比で混合した。ヒト被験体については、上記混合を、免疫する直前に行った（「ベッドサイドミックス」）。
【０１１４】
（インフルエンザウイルス）
ＩＣ３１ｈｉｇｈもしくはＩＣ３１ｌｏｗのいずれかをＦＬＵＡＤＴＭに添加した後、上記インフルエンザ抗原は、上記ＩＣ３１複合体と迅速に会合（吸着）する。室温において、ＩＣ３１ｈｉｇｈの添加の３０分以内に、上記抗原のうちの少なくとも９８％が、上記ＩＣ３１粒子に吸着する。９６％吸着は、室温においてＩＣ３１ｌｏｗを添加した２時間後に認められた。より低い温度（４℃）で２４時間にわたって、９７％（ＩＣ３１ｈｉｇｈ）吸着もしくは９１％（ＩＣ３１ｌｏｗ）吸着が認められた。重量オスモル濃度およびｐＨは、ＩＣ３１ｈｉｇｈおよびＩＣ３１ｌｏｗの両方について、室温において２４時間にわたって実質的に一定のままであった。このことは、上記組み合わせが安定であることを示す。上記エマルジョンの粒径および上記ＩＣ３１複合体の粒径は、混合後、維持される。
【０１１５】
インフルエンザ抗原に、ＭＦ５９（ＦＬＵＡＤＴＭ）、ＩＣ３１（ＩＣ３１ｈｉｇｈもしくはＩＣ３１ｌｏｗのいずれか）、またはＭＦ５９＋ＩＣ３１の組み合わせ（等量の水性ＩＣ３１と混合した５０μＬ ＦＬＵＡＤＴＭ；両方のアジュバントは、２×強度で混合されて、希釈後に最終１×を与える）のいずれかをアジュバント添加した。種々の組成物の２用量をマウスに投与し、ＨＩ力価を評価した。単一のサンプルに基づき、インフルエンザＡウイルスのＨ１Ｎ１株に対する第２の用量後の力価は、以下のとおりであった。
【０１１６】
【表１】
３つの株全てについてプールされたサンプルを調べると、ＨＩ力価は、以下のとおりであった。
【０１１７】
【表２】
従って、ＭＦ５９およびＩＣ３１の組み合わせは、特に、インフルエンザＡウイルスについて、いずれのアジュバント単独よりＨＩ力価を増強し得る。
【０１１８】
ＣＤ４＋ Ｔ細胞を評価して、上記アジュバントが、Ｔｈ１タイプの応答を惹起したかもしくはＴｈ２タイプの応答を惹起したかを決定した。ＭＦ５９が、Ｔｈ２タイプ応答に偏った応答を与えたのに対して、ＩＣ３１は、Ｔｈ１タイプ応答に偏った（しかし、ＭＦ５９ほど偏ってはいない）応答を（両方の用量で）与えた。上記組み合わせたアジュバントは、Ｔｈ１タイプ応答とＴｈ２タイプ応答との間のバランスをより保った。
【０１１９】
ＩＣ３１の、ＦＬＵＡＤＴＭへの添加は、ＨＩ力価に対して大きな影響を有しないが、上記免疫応答のバランスをシフトさせる。
【０１２０】
（Ｃ型肝炎ウイルス）
Ｃ型肝炎ウイルスＥ１Ｅ２タンパク質を、マウスを免疫するために使用した。ＭＦ５９＋ＩＣ３１を使用して達成した抗体応答は、ＭＦ５９単独での応答と類似であったが、３用量後のＣＤ８１結合の最高の阻害を、ＭＦ５９＋ＩＣ３１ｌｏｗで認めた。
【０１２１】
（ＥｘＰＥＣ）
腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株に由来する抗原１２４に、ミョウバン、ＩＣ３１、ＭＦ５９もしくはＩＣ３１＋ＭＦ５９をアジュバント添加した。防御率は、以下のとおりであった。
【０１２２】
【表３】
（血清群Ｂ髄膜炎菌）
参考文献４３の髄膜炎菌血清群Ｂワクチンからの抗原に、ＭＦ５９、ＩＣ３１ｈｉｇｈ、ＩＣ３１ｌｏｗもしくはこれらの組み合わせをアジュバント添加した。上記ワクチンは、３つの組換え抗原（Ａｇ１、Ａｇ２およびＡｇ３）を含み、これらに対する総ＩｇＧレベルは、以下のとおりであった。
【０１２３】
【表４】
従って、抗原「Ａｇ３」を除いて、ＭＦ５９およびＩＣ３１の混合物を使用した場合に、最高のＩｇＧレベルを認めた。
【０１２４】
血清をまた、種々の髄膜炎菌株に対するそれらの殺菌活性について試験した。代表的結果は、以下を含む。
【０１２５】
【表５】
従って、いくつかの例外はあるが、ＭＦ５９およびＩＣ３１の混合物を使用した場合に、最高の殺菌力価を認めた。
【０１２６】
（髄膜炎菌の複数の血清群）
これら髄膜炎菌Ｂタンパク質抗原をまた、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ抗原に由来する結合体化サッカリド抗原と合わせ、同じアジュバント混合物で試験した。各血清群からの試験株に対する殺菌力価は、以下のとおりであった。
【０１２７】
【表６】
従って、血清群Ａを除いて、ＭＦ５９およびＩＣ３１の混合物を使用した場合、最高の殺菌力価を認めた。
【０１２８】
（汎発流行性インフルエンザ）
ＩＣ３１ｈｉｇｈを、ＭＦ５９もしくは緩衝液と１：１比で、またはＭＦ５９および緩衝液と１：０．５：０．５比で合わせた。このようにして、ＭＦ５９を、その通常の濃度もしくは半分の濃度で試験した。上記アジュバントを、インフルエンザウイルス（Ａ／ベトナム／１１９３／０４）のＨ５Ｎ１株に由来する表面抗原ワクチンと合わせた。上記組み合わせの安定性および免疫原性を、試験した。
【０１２９】
安定性を、室温の貯蔵の時間０、およびその後３０分もしくは６時間後に、ｐＨ、重量オスモル濃度、吸着、および粒径を試験することによって評価した。上記ｐＨは、７．２３〜７．２６の範囲において安定であった。重量オスモル濃度は、２８０〜２８６ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲で安定であった。上記吸着した抗原の割合は、６時間にわたって７６％から８０％まで上昇した（３０分の時点では、僅かに低下した）。これら数字は、ＭＦ５９を欠いているコントロール組成物に類似である。上記コントロール組成物は、僅かに低い重量オスモル濃度（２７３〜２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ）、僅かに高いｐＨ（７．３２〜７．３５）、および吸着した抗原の僅かに低い割合（５４〜６８％）を有した。
【０１３０】
時間０での、ＰＢＳ中のＩＣ３１ｈｉｇｈ：ＭＦ５９の１：１混合物の粒径を、図１に示す。上記エマルジョンの液滴（平均直径１６１ｎｍ）は、上記体積のうちの４６．４％を占め、ＩＣ３１複合体（平均直径１５．９μｍ）は、５３．６％を占めた。図２〜５は、室温において時間０から２４時間まで、Ｈ５Ｎ１抗原を含むアジュバント添加ワクチンについての類似の分析を示す。
【０１３１】
【表７】
ＭＦ５９単独と組み合わせたＨ５Ｎ１抗原（ＩＣ３１なし）は、１５１ｎｍの平均液滴直径を有した。ＩＣ３１ｈｉｇｈと組み合わせたＨ５Ｎ１抗原（しかしＭＦ５９なし）は、３８．４μｍの平均粒子直径を有した（図６）。従って、ＭＦ５９およびＩＣ３１の混合は、ＭＦ５９粒子の分析した直径を僅かに増大させ（その一方で、滅菌濾過はなお可能である）、上記ＩＣ３１複合体の直径を減少させる。しかし、全ての場合において、上記混合物は安定である。
【０１３２】
フェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ ｐｕｔｏｒｉｕｓ ｆｕｒｏ）モデルは、候補の汎発流行性インフルエンザワクチンの効力の証拠を提供するために好ましい動物モデルである。このようにして、アジュバント添加した、１μｇもしくは３．７５μｇ（赤血球凝集素用量）いずれかの抗原を有するワクチンを、フェレットの８つの群に投与した。フェレットに、初期刺激用量およびブースト用量を与え、次いで、異種Ｈ５Ｎ１株でチャレンジした。
【０１３３】
フェレットの体温を、チャレンジの前後でモニターした。図７および８は、２例のマウス（１匹は、群Ｄ（図７）および１匹は群Ｅ（図８））からの温度を示す。
【０１３４】
ＨＡＩ力価を、０日目、２１日目、４２日目および４９日目に、ワクチン株に対して評価した。平均力価は、以下のとおりであった。
【０１３５】
【表８】
従って、ＩＣ３１およびＭＦ５９（グループＢおよびグループＥ）の組み合わせは、最高の力価を与えた。
【０１３６】
予備データは、罹患した肺組織の割合（肉眼的な肺病変の面積の概算）および相対的肺重量（１．０未満は、健康な肺を示す）を調べた。１群あたりの平均結果は、以下のとおりであった。
【０１３７】
【表９】
ＩＣ３１およびＭＦ５９の組み合わせは、ＭＦ５９もしくはＩＣ３１単独と比較した場合、このモデルにおいて肺病理を改善した。
【０１３８】
従って、ＩＣ３１と上記ＭＦ５９水中油型エマルジョンアジュバントとの組み合わせは、安定であり、良好な免疫原性および汎発流行性インフルエンザウイルス株に対する防御をフェレットに提供した。
【０１３９】
（グループＡ連鎖球菌およびカンジダ）
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ抗原およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抗原にも、ＭＦ５９ＴＭ＋ＩＣ３１ＴＭをアジュバント添加した。
【０１４０】
本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、改変が行われ得るが、それは本発明の範囲および趣旨の範囲内にあることが理解される。
【０１４１】
（参考文献）
【０１４２】
【数１】
【０１４３】
【数２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中油型エマルジョン、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む、免疫学的アジュバント。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドおよび前記ポリマーが複合体化されている、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドおよびポリマーの複合体が吸着性である、請求項２に記載のアジュバント。
【請求項４】
前記吸着性複合体の平均直径が前記エマルジョン中の油滴の平均直径より大きい、請求項３に記載のアジュバント。
【請求項５】
前記複合体が１〜２０μｍ範囲の平均直径を有する、請求項４に記載のアジュバント。
【請求項６】
前記油滴が平均直径＜２２０ｎｍを有する、請求項５に記載のアジュバント。
【請求項７】
前記エマルジョンのサイズ分布と前記複合体のサイズ分布との間に重なり合いがない、請求項４〜６のいずれか１項に記載のアジュバント。
【請求項８】
水中油型エマルジョンおよび吸着性粒状アジュバントを含む免疫学的アジュバントであって、ここで該吸着性粒状アジュバントにおける粒子の平均直径は、該エマルジョン中の油滴の平均直径より大きく、該吸着性粒状アジュバントは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体である、免疫学的アジュバント。
【請求項９】
水中油型エマルジョンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫学的アジュバントであって、ここで該免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＩモチーフを含む、免疫学的アジュバント。
【請求項１０】
水中油型エマルジョンおよび吸着性粒状アジュバントを含む免疫学的アジュバントであって、ここで該吸着性粒状アジュバントにおける粒子の平均直径および該エマルジョン中の油滴の平均直径はともに、２５０ｎｍ未満である、免疫学的アジュバント。
【請求項１１】
前述の請求項のいずれかに記載のアジュバントを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、水中油型エマルジョンと、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体とを混合する工程を包含する、プロセス。
【請求項１２】
（ｉ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を含む、免疫原性組成物。
【請求項１３】
免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、（ｉ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を混合する工程を包含する、プロセス。
【請求項１４】
前記免疫原が、宿主に投与された場合、ウイルス性疾患、細菌性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、もしくは自己免疫疾患から防御する免疫応答を誘発する、請求項１２に記載の組成物もしくは請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記免疫原が、インフルエンザＡウイルスもしくはインフルエンザＢウイルス、例えば、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザＡウイルスに対する免疫応答を誘発する、請求項１２に記載の組成物もしくは請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１】
水中油型エマルジョン、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む、免疫学的アジュバント。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドおよび前記ポリマーが複合体化されている、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドおよびポリマーの複合体が吸着性である、請求項２に記載のアジュバント。
【請求項４】
前記吸着性複合体の平均直径が前記エマルジョン中の油滴の平均直径より大きい、請求項３に記載のアジュバント。
【請求項５】
前記複合体が１〜２０μｍ範囲の平均直径を有する、請求項４に記載のアジュバント。
【請求項６】
前記油滴が平均直径＜２２０ｎｍを有する、請求項５に記載のアジュバント。
【請求項７】
前記エマルジョンのサイズ分布と前記複合体のサイズ分布との間に重なり合いがない、請求項４〜６のいずれか１項に記載のアジュバント。
【請求項８】
水中油型エマルジョンおよび吸着性粒状アジュバントを含む免疫学的アジュバントであって、ここで該吸着性粒状アジュバントにおける粒子の平均直径は、該エマルジョン中の油滴の平均直径より大きく、該吸着性粒状アジュバントは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体である、免疫学的アジュバント。
【請求項９】
水中油型エマルジョンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫学的アジュバントであって、ここで該免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＩモチーフを含む、免疫学的アジュバント。
【請求項１０】
水中油型エマルジョンおよび吸着性粒状アジュバントを含む免疫学的アジュバントであって、ここで該吸着性粒状アジュバントにおける粒子の平均直径および該エマルジョン中の油滴の平均直径はともに、２５０ｎｍ未満である、免疫学的アジュバント。
【請求項１１】
前述の請求項のいずれかに記載のアジュバントを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、水中油型エマルジョンと、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体とを混合する工程を包含する、プロセス。
【請求項１２】
（ｉ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を含む、免疫原性組成物。
【請求項１３】
免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、（ｉ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアジュバント、および（ｉｉ）免疫原を混合する工程を包含する、プロセス。
【請求項１４】
前記免疫原が、宿主に投与された場合、ウイルス性疾患、細菌性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、もしくは自己免疫疾患から防御する免疫応答を誘発する、請求項１２に記載の組成物もしくは請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記免疫原が、インフルエンザＡウイルスもしくはインフルエンザＢウイルス、例えば、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザＡウイルスに対する免疫応答を誘発する、請求項１２に記載の組成物もしくは請求項１３に記載のプロセス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１２−５０２９７２（Ｐ２０１２−５０２９７２Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２７４２７（Ｐ２０１１−５２７４２７）
【出願日】平成２１年９月１８日（２００９．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００７１１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３２１３８
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１８日（２００９．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００７１１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３２１３８
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
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